CN108707668A

CN108707668A - 一种长非编码rna snhg15及其在制备诊疗癌症药物中的应用

Info

Publication number: CN108707668A
Application number: CN201810577160.0A
Authority: CN
Inventors: 张宏权; 江浩; 战军
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2018-10-26

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种长非编码RNA SNHG15及其在制备诊疗癌症药物中的应用，其中所述癌症包括大肠癌、乳腺癌和肾癌等，在大肠癌、乳腺癌和肾癌病人的肿瘤组织中长非编码RNA SNHG15表达上调，高表达长非编码RNA SNHG15的患者预后较差。在大肠癌细胞系中敲低长非编码RNA SNHG15表达可以抑制细胞的侵袭、迁移和增殖能力。并且敲低长非编码RNA SNHG15可以增加大肠癌细胞系对抗肿瘤药物吉西他滨和顺铂的药物敏感性。

Description

一种长非编码RNA SNHG15及其在制备诊疗癌症药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长非编码RNA SNHG15及其在制备诊疗癌症药物中的应用。

背景技术

在世界范围内大肠癌是男性和女性中主要发生的恶性肿瘤之一，死亡率在所有肿瘤病人中排名第四。每年有超过120万人被诊断为大肠癌。尽管，内镜技术的应用使得大肠癌患者获得了早期诊断机会，而针对大肠癌新的治疗手段也逐步建立，但人们对大肠癌发生发展背后的具体分子机制的研究还并不完善，有许多问题等待进一步揭示。继蛋白质和小RNA之后，近几年的研究热点长非编码RNA也在大肠癌的发生发展中发挥着重要的调节功能。现今对于长非编码RNA并没有严格统一的定义，通常把转录本长度大于200个碱基，并且不具有编码蛋白质功能的RNA统称为长非编码RNA。

近几年对于长非编码RNA研究已经揭示了其参与到生命过程的各个方面，并在其中发挥着作用。相对于编码蛋白质的信使RNA，长非编码RNA有着表达丰度低，表达具有组织特异性等特点。在生物体内，长非编码RNA借助于与其他生物大分子相互作用而发挥功能，这其中包括染色体，蛋白质，RNA等，通过这些相互作用，长非编码RNA可以参与到基因转录和转录后修饰等调节过程中去。例如，长非编码RNA Xist可以与多种蛋白质相结合，招募其到X染色体上并介导X染色体的失活过程(X chromosome inactivation)。在肿瘤的发生发展过程中，常常伴随着长非编码RNA的表达异常。而其中的一些长非编码RNA在肿瘤的发生发展过程中发挥着肿瘤驱动基因的功能，促进肿瘤细胞的增殖，侵袭和转移。研究发现，长非编码RNA lncRNA-ATB可以诱导肿瘤细胞发生EMT过程，进一步的机制研究发现lncRNA-ATB可以作为RNA海绵吸附miR-200家族的小RNA进一步上调诱导EMT的转录因子ZEB1和ZEB2表达。然而，在肿瘤EMT过程中还有很多异常表达的长非编码RNA功能并不清楚，有待进一步研究来揭示他们在肿瘤中发挥的功能。

鉴于长非编码RNA在大肠癌中的重要性，我们通过对公共数据库中的高通量数据进行挖掘，找到了名为SNHG15的长非编码RNA，该长非编码RNA在病人的大肠癌中高表达并与病人的不良预后相关。长非编码RNA SNHG15在多种肿瘤中高表达并与病人的不良预后相关。研究发现长非编码RNA SNHG15通过阻止Slug蛋白进行泛素化-蛋白酶体途径的降解从而加强Slug蛋白的稳定性。进而促进大肠癌细胞的增值与转移。这些结果表明，长非编码RNA SNHG15是大肠癌的重要致癌因子，可以作为大肠癌病人诊断和预后的分子标记物且成为肿瘤治疗的一个靶点。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种长非编码RNA SNHG15及其在制备诊疗癌症药物中的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种用于判断包括大肠癌、乳腺癌、肾癌在内的癌症预后情况或作为癌症诊疗靶点的长非编码RNA SNHG15，所述长非编码RNA的核苷酸序列如Seq ID NO.1和Seq ID NO.2所示。

所述的长非编码RNA在作为筛选判断肿瘤预后情况的诊断试剂中的应用。

所述的长非编码RNA在作为筛选诊疗肿瘤的药物中的应用。

所述的长非编码RNA通过绑定Slug表观沉默下游靶基因E-cad表达的应用。

识别所述长非编码RNA的标记物在制备诊断癌症及判断癌症诊疗预后情况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于：

(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；

(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；

(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能的片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。

进一步的，所述引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

一种用于判断肿瘤诊疗预后情况的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含如上述的标记物。

针对所述的长非编码RNA的检测试剂在制备诊断癌症及筛选癌症预后情况的诊断试剂中的应用。

抑制所述的长非编码RNA的抑制剂在制备诊断或诊疗肿瘤的药物中的应用，所述抑制剂包括但不限于：

(1)抑制所述长非编码RNA的siRNA、shRNA或功能类似的小干扰RNA；

(2)抑制所述长非编码RNA的小分子化合物；

(2)抑制所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、高底物专一性的酶或其功能片段。

进一步的，所述抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

技术方案

细胞培养

人胚胎肾细胞系(HEK293T)，人大肠癌细胞系(SW480,SW1116,SW620,HCT116),人宫颈癌细胞系(HeLa)以上细胞均购自ATCC，由本室冻存。SW480、SW1116、SW620、HCT116细胞在RPMI 1640培养基中培养；HEK293T，HeLa细胞在DMEM培养基中培养。完全培养基中含有10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100毫克/毫升的链霉素的，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

RNA提取和定量PCR分析

根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用Promega公司操作说明书进行。逆转录试剂盒对lug总RNA进行逆转录，最终体积为20μ1。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。数据分析采用ΔΔCt法。

质粒构建

人长非编码SNHG15全长cDNA序列合成并插入到pcDNA3.1载体中。长非编码SNHG15的异位过表达是通过pcDNA3.1-SNHG15转染获得的，以一个空的pcDNA载体为对照。48小时后qRT-PCR检测长非编码SNHG15的表达水平。

细胞转染(以六孔板为例)

(a)提前一天将细胞种植到六孔板中，20～24小时后转染。转染时细胞密度应为60％-80％，且位于对数生长期；

(b)用培养液洗涤培养板中的细胞1～2遍，最后每孔留下1ml培养液；

(c)配制转染混合溶液：溶液A，将3μg DNA加入200μl Opti-MEM培养基中混匀；溶液B，将6μl PEI加入200μl Opti-MEM培养基中，室温放置5min；

(d)将两者混匀，室温放置10min；

(e)将混合溶液加到细胞培养皿中，并与培养基混匀后继续培养4～6小时；

(f)将培养基换为新鲜的含10％FBS的培养基继续培养至48小时。

Transwell实验

1.消化细胞与细胞传代步骤一样，最后一遍PBS重悬离心得到细胞，用Adhesionbuffer重悬细胞；

Adhesion buffer配方：CaCl₂：1mM

MgCl₂：1mM

MnCl₂：0.2mM

BSA：0.5％

RPMI 1640培养基溶解；

2.细胞计数：一般将细胞稀释2-10倍后计数，保证每次4个大方格总数为50-200个；

3.调整细胞浓度，细胞浓度调整为3×10⁴个/ml；

4.细胞迁移实验中在tranwell小室的下室加入含10g/ml collagen的培养基，上室加入100l细胞(数量为3×10³个)；

5.细胞穿过6-8h后，取出transwell小室，用棉签轻轻旋转擦拭细胞接种面，去除未穿膜细胞；

6.加入800μl/孔4％多聚甲醛固定15min，用棉签轻轻旋转擦拭细胞接种面；

7.用硼酸钠配置的结晶紫溶液染色，600μl/孔，染色15min，用棉签轻轻旋转擦拭细；

8.胞接种面。超纯水漂洗，用棉签轻轻旋转擦拭细胞接种面，倒置显微镜下观察并采图。

RNA免疫共沉淀(RIP)实验

1.收集1⁰⁷细胞，用预冷PBS洗涤细胞两次；

2.使用500μl新配置的RIP buffer重悬细胞沉淀；

RIP buffer配方：

Tris：25mM，PH7.4

KCl：150mM

DTT：0.5mM

NP-40:：0.5％

EDTA：5mM

蛋白酶抑制剂

RNA酶抑制剂；

3. 4℃离心，12,000rpm 15min，上清为细胞裂解液；

4.向细胞裂解液中加入相应的蛋白抗体(2-10μg)，4℃孵育2h；

5.向上述裂解液中加入Proein A/G珠子(40μl)，4℃摇床1h；

6. 4℃离心，弃上清，4,000rpm 1min，用RIP buffer洗三遍；

7.Trizol试剂加入到洗脱液中制备RNA样品。

裸鼠成瘤实验

1.SPF级NU/NU裸鼠，4-6周龄。由北京大学医学部SPF级动物中心饲养；

2.生长状态良好的各组细胞用胰酶消化并计数，用无血清的RPMI1640培养基；

3.调整细胞浓度为5×10⁷/ml；

4.在裸鼠腋下注射细胞100l；

5.每隔2-3天观察一次，用游标卡尺测量肿瘤宽，高，并计算肿瘤体积＝(长×宽2)/2；

6.约3周后，采用断颈法处死动物，剥离肿瘤组织称重；

7.提组织蛋白，RNA等，检测相关指标。

HE和免疫组化试验

1.HE染色

(a)依次按照以下步骤进行石蜡切片脱蜡水化：二甲苯两次各10min，100％酒精两次各10min，95％酒精5min，90％酒精5min，80％酒精5min，70％酒精5min，超纯水5min；

(b)Harry`s苏木精液染色15min，水洗；

(c)酒精酸中漂洗两遍，自来水冲洗10min；

(d)伊红中染色10min；

(e)逐级脱水：超纯水5min，70％酒精5min，80％酒精5min，90％酒精5min，95％；

(f)酒精5min，100％酒精两次各10min，二甲苯两次各10min，中性树脂封片，镜检。

2.免疫组化染色

(b)3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，室温下30min。结束后PBS冲洗3遍，每次5min；

(c)加入抗原热修复液柠檬酸盐缓冲液，水浴锅煮沸25min，之后自然冷却到室温。结束后PBS洗3遍，每次5min；

(d)孵育一抗4℃过夜，第二天早上室温再孵育半小时。结束后PBS洗3遍，每次5min；

(e)孵育相应二抗，室温孵育30-60min。结束后PBS洗3遍，每次5min；

(f)DAB显色，显色后置于自来水中，再静置与超纯水中5min，Mayer`s苏木精复染细胞核，用自来水冲洗返蓝，时间越久越好，直至细胞核呈现明显蓝色；

(g)逐级脱水：超纯水5min，70％酒精5min，80％酒精5min，90％酒精5min，95％；

(h)酒精5min，100％酒精两次各10min，二甲苯两次各10min，中性树脂封片，最后镜检。

本发明相比现有技术的有益效果为：

本发明所述的长非编码RNA SNHG15，是通过分析筛选获得的在大肠癌、乳腺癌、肾癌组织中高表达的长非编码RNA分子，高表达长非编码RNA SNHG15的患者预后较差。在大肠癌细胞系中敲低长非编码RNA SNHG15表达可以抑制细胞的侵袭、迁移和增殖能力。并且敲低长非编码RNA SNHG15可以增加大肠癌细胞系对抗肿瘤药物吉西他滨和顺铂的药物敏感性。

附图说明

图1在人大肠癌中差异表达的长非编码RNA，其中(A)维恩图代表了三种比较中有显著差异表达的长非编码RNA及其之间重叠的基因。其中包括在我们在转移灶(MC)与正常肠上皮(NC)中有显著差异表达的长非编码RNA(绿色)。原位癌(PC)与正常肠上皮(NC)中有显著差异表达的长非编码RNA(红色)。转移灶(MC)与原位癌(PC)中有显著差异表达的长非编码RNA(蓝色)。(B)热图显示的是绿圈与红圈共同拥有的长非编码RNA，每排代表着基因，每列代表着所检测的组织。(C)最终筛选出的12个长非编码在三种不同组织中的表达情况。柱状图显示的是这些长非编码RNA在不同组织中的的表达值(RPKM)。

图2长非编码RNA SNHG15在大肠癌、乳腺癌与肾透明细胞癌中的表达，其中(A)大肠癌(B)乳腺癌和(C)肾透明细胞癌中进行的长非编码RNA SNHG15启动子区DNA甲基化位点(cg16459265)的TCGA数据分析和长非编码RNA SNHG15在肿瘤与正常组织中的表达情况以及将SNHG15分为高表达(High)与低表达(Low)组的生存分析。

图3长非编码RNA SNHG15增加大肠癌细胞的迁移能力以及长非编码RNA SNHG15对EMT相关基因的影响，其中(A-C)大肠癌细胞HCT116，SW480和SW1116通过感染包含有SNHG15表达载体的病毒及其对照成为稳转细胞系。细胞迁移实验，用以检测长非编码RNA SNHG15对大肠癌细胞运动能力的影响。统计分析采用Student's t-test法，*代表p<0.05,**代表p<0.01,***代表p<0.001。(D)大肠癌稳转SNHG15细胞系HCT116，SW480和SW1116细胞全蛋白裂解物进行Western blot实验，使用抗E-cadherin,抗Slug或抗Actin抗体进行蛋白检测。(E)文氏图显示的是在大肠癌细胞系HCT116中，做敲低SNHG15试验后两条siRNA共同上调或者下调的基因统计。(F)热图显示的是对HCT116细胞系使用两条不同siRNA进行敲低SNHG15试验后，两条siRNA所共同调节的573个基因的聚类分析。(G)GO和(H)KEGG信号通路分析在大肠癌细胞系HCT116中两条不同siRNA进行敲低SNHG15试验后所共同下调的241个基因。(I)GSEA分析在HCT116细胞系中敲低SNHG15后基因表达变化与公共数据库中的EMT数据集相关性比较。

图4长非编码RNA SNHG15与Slug相互作用，其中(A)使用MS2-RNApull-down方法进行RNA-蛋白质相互作用的模式图。(B)HCT116细胞中转染SNHG15-MS2或者其反义链的antisense-SNHG15-MS2质粒，全细胞裂解液与纯化好的MBP-MS2和amylose共同孵育，随后使用抗Slug和抗SIRT1抗体。SIRT1作为阴性对照。(C)293T细胞中共同转染F-Slug与SNHG15-MS2或者其反义链的antisense-SNHG15-MS2质粒，全细胞裂解液与纯化好的MBP-MS2和amylose共同孵育，随后使用抗Flag抗体进行检测。(D)Slug蛋白结构示意图(上)。RNApull-down实验使用HeLa细胞系共同转染Slug的分段及相应质粒。免疫印迹实验使用了抗Flag抗体(下)。(E)长非编码RNASNHG15分段示意图(上)，RNA pull-down实验使用生物素标记的SNHG15反向全长以及分段与HCT116细胞内源的Slug相互作用。免疫印迹实验使用了抗Slug抗体(下)(F)使用293T细胞进行RIP实验，在细胞中共转相应质粒随后进行qPCR分析检测长非编码RNA SNHG15水平。GAPDH mRNA用作阴性对照，结果使用平均值±标准误(n＝3)。

图5长非编码RNA SNHG15调节Slug蛋白降解，其中(A)在大肠癌细胞中长非编码RNA SNHG15上调Slug蛋白，但并不影响Slug的mRNA水平。SW480细胞瞬转SNHG15表达质粒，48小时后提取mRNA和蛋白分别做qPCR和Western blot分析。左上图：用qPCR分析Slug的mRNA水平。左下图：Western blot分析Slug蛋白水平。右图：qPCR检测长非编码RNASNHG15的mRNA水平。(B)SW620细胞转染敲低SNHG15表达的siRNA，48小时后提取mRNA和蛋白分别做qPCR和Western blot分析。左上图：用qPCR分析Slug的mRNA水平。左下图：Western blot分析Slug蛋白水平。右图：qPCR检测长非编码RNA SNHG15的mRNA水平。(C)HCT116细胞转染能够敲低SNHG15表达的siRNA，48小时后提取mRNA和蛋白分别做qPCR和Western blot分析。左上图：用qPCR分析Slug的mRNA水平。左下图：Western blot分析Slug蛋白水平。右图：qPCR检测长非编码RNA SNHG15的mRNA水平。(D)长非编码RNA SNHG15通过蛋白酶体途径调节Slug蛋白降解。293T细胞共同转染Flag-Slug和SNHG15表达质粒。48小时后细胞中加入MG132或者其对照溶剂，6小时后收集细胞。使用免疫印迹方法分析，抗Flag抗体或抗Actin抗体。(E)SW620细胞转染敲低SNHG15表达的siRNA。48小时后细胞中加入MG132或者其对照溶剂，6小时后收集细胞。使用免疫印迹方法分析，抗Flag抗体或抗Actin 抗体。(F)SW620细胞转染敲低SNHG15表达的siRNA，然后在指示时间点加入CHX。使用Western blot分析Slug蛋白降解。(上)(G)SW480细胞系共同转染Flag-Slug和SNHG15表达载体。24小时后在指定时间点加入CHX。Western blot分析结果，使用抗Flag抗体和抗Actin 抗体(上)。条带灰度值由Image J获得，并做曲线。(H)长非编码RNA SNHG15阻止Slug泛素化。在293T细胞中按照标注共转HA-UB，Flag-Slug和SNHG15/空载。24小时后在细胞中加入MG132培养6小时，然后使用抗Flag抗体进行co-IP试验。免疫印迹使用抗Flag或抗HA 抗体。(I)敲低长非编码RNA SNHG15表达使Slug泛素化增强。SW620细胞转染敲低SNHG15表达的siRNA。48小时后细胞中加入MG132或者其对照溶剂，6小时后收集细胞。使用免疫印迹方法分析，抗Slug抗体或抗泛素抗体。(J)在大肠癌细胞系HCT116中敲低BTRC 48小时后收集细胞。使用免疫印迹方法分析，抗BTRC抗体，抗Slug或抗Actin抗体。(K)HCT116中转染BTRC以及相应的SNHG15表达质粒或者空载48小时后收集细胞。使用免疫印迹方法分析，抗HA抗体，抗Slug或抗Actin抗体。(L和M)在293T细胞中转染相应的质粒，收集细胞裂解液加入抗Flag或抗HA抗体进行免疫共沉淀反应。使用免疫印迹方法分析，使用抗HA抗体，抗Slug以及抗Flag抗体进行检测。

图6(A)稳定表达SNHG15或其空载的HCT116细胞，被皮下注射到了裸鼠的两侧腋下区(数量＝6)右侧：长非编码RNA SNHG15过表达细胞；左侧：表达空载细胞。肿瘤体积分析采用Student’s t test(下)。(B)切除后的肿瘤组织称重并进行比较，采用Student’s t test(p＝0.015)(下)。(C)肿瘤组织切片进行H&E染色，并通过免疫组化分析肿瘤组织切片，检测Ki-67,N-cadherin和Slug指标。

图7吉西他滨和放线菌酮可以诱导长非编码RNA SNHG15表达并且敲低长非编码RNA SNHG15可以增加大肠癌细胞系对药物的敏感性，其中(A)HCT116细胞转染Flag-Slug表达质粒及其空载。qPCR分析Slug(左)和SNHG15(右)的mRNA水平。(B)SW480细胞转染Flag-Slug表达质粒及其空载。qPCR分析Slug(左)和SNHG15(右)的mRNA水平。(C)HCT116和SW480细胞中加入放线菌酮(CHX,100μg/ml)，24小时后qPCR分析SNHG15的mRNA水平。(D)HCT116和SW480细胞中加入吉西他滨5μM或者10μM，24小时后qPCR分析SNHG15的mRNA水平。(E)HCT116和SW480细胞中加入顺铂5μM或者10μM，24小时后qPCR分析SNHG15的mRNA水平。(F和G)大肠癌细胞系HCT116中加入吉西他滨(10μM，A)和顺铂(10μM，B)24小时后，使用染色质免共疫沉淀实验检测SNHG15启动子区组蛋白修饰变化。使用抗H3K4me3，抗H3K27ac，或者抗IgG抗体作为对照。定量qPCR分析使用靶向SNHG15启动子区的引物，实验重复三次，使用平均数±标准误(*代表p<0.05,**代表p<0.01,***代表p<0.001)。(H和I)大肠癌细胞系SW480中加入吉西他滨(10μM，C，D)和顺铂(10μM，E)24小时后使用染色质免疫沉淀实验检测SNHG15启动子区组蛋白修饰变化。使用抗H3K4me3，抗H3K27ac，抗RPB1或者抗IgG抗体作为对照。(J和K)通过加药实验在大肠癌细胞系HCT116中检测敲低长非编码RNA SNHG15后对抗肿瘤药物吉西他滨(A)和顺铂(B)药物敏感性的变化。实验重复三次，使用平均数±标准误(*代表p<0.05,**代表p<0.01,***代表p<0.001)(L)模式图描述了长非编码RNA SNHG15稳定Slug并促进大肠癌进展。吉西他滨、顺铂和放线菌酮可以在大肠癌中诱导长非编码RNA SNHG15的表达。长非编码RNA SNHG15与Slug的C端相结合，并遮蔽其泛素化位点阻碍Slug泛素化和通过蛋白酶体途径的降解。最终，累积的Slug发挥了诱导肿瘤细胞EMT，药物抵抗或肿瘤侵袭转移的功能。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法一般性说明：基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded ·黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的细胞株、慢病毒干扰载体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例1通过数据挖掘寻找差异表达的长非编码RNA

之前的研究而已经表明长非编码RNA可以参与到多种生物学过程中，其中包括生物体的发育以及肿瘤的进展过程。为了探求长非编码RNA在人类大肠癌发展过程中发挥作用的及其分子机制，我们决定通过对已有的公共数据库中的RNA-seq数据进行数据挖掘和分析。我们找到并下载了公共数据库GEO(Gene Expression Omnibus)中编号为GSE50760的RNA-seq数据集。该数据集来源于18个病人的组织RNA测序结果。其中每个病人都包含有三种不同的组织类型样本，包括正常的肠上皮组织(距离肿瘤组织边缘大于5cm)(NC)，大肠原位癌组织(PC)和肝中的大肠癌转移灶组织(MC)，共含有54个RNA-seq数据。所有样本中基因的表达水平已经由Fragments per kilobase of transcript per million fragmentsmapped(FPKM)方法进行了估算，并且已经进行了以下处理：使用分位法进行了标准化(Normalized by the quantile method)，log2转换，基因间和样本间的中位标准化(Mediancentred across genes and samples)。在进行过数据整理后，我们使用R语言软件包MyGene's annotation对所包含的基因进行了注释。在23505个基因中，有2335个基因被注释为长非编码RNA。为了能降低背景干扰并找到在大肠癌进展中真正发挥功能的长非编码RNA我们对基因的表达情况进行了三种不同的比较：1.原位癌(PC)与正常肠上皮(NC)进行比较；2.转移灶(MC)与正常肠上皮(NC)进行比较；3.转移灶(MC)与原位癌(PC)进行比较。为了在每种比较中找到有显著差异表达的长非编码RNA，我们应用了两种选择尺度：1.伪发现率(False discovery rate，FDR)<0.05(Wilcoxon paired test)；2.基因表达变化倍数(Gene expression fold change)>2。在应用了以上两种选择方法后，我们在转移灶(MC)与正常肠上皮(NC)进行比较中找到了75个有显著差异表达的长非编码RNA，原位癌(PC)与正常肠上皮(NC)进行比较中有28个，转移灶(MC)与原位癌(PC)进行比较中有28个(图1A)。我们选择了在转移灶(MC)与正常肠上皮(NC)比较中和原位癌(PC)与正常肠上皮(NC)比较中共同的具有明显差异表达的长非编码RNA。其中有14个长非编码RNA在肿瘤中下调，而12个在肿瘤中上调。通过热图的绘制展示了这26个长非编码RNA的表达模式，提示它们可能在肿瘤中分别扮演了抑癌和促癌基因的角色(图1B)。考虑到长非编码RNA与具有编码蛋白质功能的信使RNA相比表达量较低。我们决定进行进一步筛选，选择那些在肿瘤组织中高表达且表达值大于1FPKM的长非编码RNA和在肿瘤组织中低表达且在正常组织中表达值大于1FPKM的长非编码RNA。我们又进一步排除了与已知编码基因公用外显子的长非编码RNA。最终，我们选出了12个长非编码RNA，而其中有些已经有关于在肿瘤中发挥功能的报道，例如H19，UCA1，HOXD-AS1和LINC00152(图1C)。

实施例2长非编码RNA SNHG15的高表达与肿瘤不良预后相关

为了检测长非编码RNA SNHG15在肿瘤中的表达情况，使用了TCGA和UCSC CancerGenomics数据库的信息。我们从Cancer Browser(https://genome-cancer.ucsc.edu/)上下载了以下数据：Pancan normalized(Gene expression was produced via RNA-seq andmean-normalized across all TCGA cohorts)基因表达数据集，其中包括大肠癌(Colonadenocarcinoma，COAD，样本量＝329),乳腺癌(Invasive breast carcinoma，BRAC，样本量＝1215)和肾透明细胞癌(Kidney clear cell carcinoma，KIRC，样本量＝606)。我们还下载了DNA甲基化芯片的数据(Methylation450k)，其中包含有：大肠癌(COAD，样本量＝329),乳腺癌(BRCA，样本量＝872)和肾透明细胞癌(KIRC，样本量＝480)。样本比较采用了Student’s t test进行分析。总生存期数据来源于配套的临床数据。生存曲线由Kaplan-Meier法绘制，并采用Fleming-Harrington test(p＝1,q＝1)法获取p值。实验结果表明，在大肠癌中长非编码RNA SNHG15的启动子区DNA甲基化水平较正常大肠组织低，与之相对应的是，SNHG15的表达值在大肠癌组织中较正常组织升高(图2A)。这提示长非编码RNASNHG15在大肠癌中可能扮演促进肿瘤发生发展的角色。这一趋势也在TCGA Pancan数据库中的其他肿瘤中得到验证，长非编码RNA SNHG15在乳腺癌中恶性程度高的基底样细胞亚型中高表达(图2B)。在肾透明细胞癌中，癌组织中的SNHG15表达水平也高于正常组织(图2C)。更为重要的是，通过对临床数据的分析发现，在大肠癌和肾透明细胞癌中高表达长非编码RNA SNHG15会缩短病人的总生存期(图2A和C)。综上所述，我们的发现表明长非编码RNASNHG15在某些人类肿瘤中高表达，并与患者的不良预后相关。

实施例3长非编码RNA SNHG15促进肿瘤细胞转移

为了探索长非编码RNA SNHG15在肿瘤进展中发挥的作用，我们进行了细胞功能方面的实验。我们通过病毒感染方式，把病毒中包含的SNHG15表达载体导入到了大肠癌细胞系HCT116，SW1116和SW480中。随后的功能试验显示，过表达长非编码RNA SNHG15可以促进大肠癌细胞的转移能力(图3A-C)。

根据上述实验，我们推测长非编码RNA SNHG15可能参与到了肿瘤侵袭转移的过程中。于是，我们通过Western blot方法对HCT116，SW1116和SW480的稳转细胞系中与肿瘤EMT相关的分子表达进行了检测。实验结果表明，过表达长非编码RNA SNHG15还可以上调HCT116，SW1116和SW480细胞中EMT相关转录因子Slug的表达(图3D)。

鉴于SNHG15与肿瘤病人不良预后相关，并且过表达SNHG15促进肿瘤细胞迁移能力，我们想进一步在大肠癌细胞系HCT116中探究敲低长非编码RNASNHG15后对细胞转录组的影响。我们设计了两条靶向SNHG15的mRNA的siRNA序列。经过对HCT116细胞48小时的敲低后，进行了RNA转录组的测序(每组有两个重复)。为了避免siRNA的脱靶效应，我们集中关注于在两条不同siRNA敲低作用下，基因的mRNA水平发生共同升高或者降低基因(图3E)。如图3F中所示，在大肠癌细胞系HCT116中敲低SNHG15后有332个基因上调，而有241个基因下调(|log2FoldChange|>0.5；adjusted p<0.05)。进一步，我们又对下调的241个基因进行了功能注释。通过在线网站Enrichr，我们进行了Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes(KEGG)分析。结果表明，HCT116细胞系中敲低SNHG15的表达后影响了细胞周期、凋亡和多条肿瘤相关的信号通路的激活(图3G和H)。为了概括在HCT116细胞中敲低SNHG15后基因变化是否与上皮向间质样转化的基因变化相类似，我们使用上面的测序数据进行了基因富集分析(GSEA analysis)。结果表明，敲低SNHG15后基因变化趋势与已知的MSigDB(Molecular Signature Database)数据库中EMT相关数据集表达谱相类似(图3I)。

实施例4长非编码RNA SNHG15与Slug相互作用

简要介绍我们RNA pull-down实验：我们在HCT116细胞中转染SNHG15-MS2或者其反义链的antisense-SNHG15-MS2质粒，48小时后收集全细胞液并与纯化好的MBP-MS2蛋白孵育。随后加入识别MBP的amylose磁珠用来捕获RNA-蛋白质复合体。经过数小时的孵育后，对磁珠进行严格的清洗然后洗脱RNA-蛋白质复合体，使用Western blot和qPCR方法进行下游分析(图4A)。结果显示，与阴性对照去乙酰化酶Sirtuin 1相比，长非编码RNA SNHG15可以特异性结合内源性Slug蛋白(图4B)。与此同时，我们又使用293T细胞同时过表达F-Slug和SNHG15-MS2/antisense-SNHG15-MS2进行外源分析。结果显示，长非编码RNA SNHG15也可以结合外源表达的Slug蛋白(图4C)。为了验证上述结果，我们又进行了RNAimmunoprecipitation(RIP)实验。试验中，我们在293T细胞中共转了Flag-Slug和长非编码RNA SNHG15表达质粒，然后使用抗Falg或者抗鼠IgG的抗体进行免疫沉降，沉降产物随后用做qPCR分析。结果显示，Flag-Slug与外源表达的长非编码RNA SNHG15相互作用，但不与阴性对照GAPDH的mRNA相互作用(图4F)。为了找到长非编码RNA SNHG15与Slug蛋白相互作用的结构域，我们对Slug基因进行了分段并构建了两种表达载体质粒，分别包含有Slug的N端(1-128氨基酸)和C端(128-268氨基酸)结构域(图4D上)。随后我们应用了RNA pull-down实验，结果表明长非编码RNA SNHG15与Slug蛋白的锌指结构域相互作用(图4D下)。而进一步的长非编码RNA SNHG15分段表明，其1-260nt和261-522nt段参与到与Slug相互作用中(4E)。上述结果表明，长非编码RNA SNHG15在哺乳动物细胞中通过其1-260nt和261-522nt段与Slug蛋白锌指结构域相互作用。

实施例5长非编码RNA SNHG15通过阻止Slug泛素化稳定其表达

上述数据第一次揭示了长非编码RNA SNHG15在哺乳动物细胞内与转录因子Slug存在相互作用。因此，我们不禁要问长非编码RNA SNHG15对Slug蛋白产生了什么样的影响？以及发挥了怎样的生物学功能？之前的研究已经表明，转录因子Slug在多种生物学功能中扮演重要角色，这其中包括EMT过程，肿瘤干细胞形成以及肿瘤侵袭转移。然而，Slug蛋白本身并不稳定，并且在体内降解迅速。我们因此想检测长非编码RNA SNHG15是否影响Slug蛋白的稳定性。为了这一目的我们首先要排除长非编码RNA SNHG15是否影响Slug的转录。我们在大肠癌细胞系SW480中瞬时表达长非编码RNA SNHG15，发现内源性Slug蛋白量增多，然而通过检测发现Slug的mRNA水平并没有明显变化(图5A)。为了验证长非编码RNA SNHG15对Slug的这种调控作用，我们在大肠癌细胞系SW620和HCT116中使用siRNA对长非编码RNASNHG15进行了敲低实验。结果显示，Slug蛋白水平在长非编码RNA SNHG15敲低明显降低，而Slug的mRNA水平并没有明显变化(图5B和C)。

已有报道称Slug蛋白是通过蛋白酶体途径降解的。因此，我们想知道长非编码RNASNHG15是否通过该途径影响Slug的稳定性。为此，我们在细胞培养过程中加入蛋白酶体抑制剂MG132，以此来抑制细胞中Slug的降解。只在细胞中加入MG132与在细胞中高表达SNHG15都会使Flag-Slug表达上升，而在MG132和长非编码RNA SNHG15同时存在时，Slug蛋白升高并不明显(图5D)。该实验说明长非编码RNA SNHG15是通过与MG132相同的途径提高Flag-Slug蛋白水平的。与之相反，在SNHG15被敲低的细胞中内源性Slug蛋白明显下降，而加入MG132可以挽救这种趋势，使得Flag-Slug蛋白水平又得到恢复(图5E)。以上结果表明，长非编码RNA SNHG15对Slug的调节是通过影响Slug的蛋白酶体途径的降解而实现的。

为了进一步了解长非编码RNA SNHG15对Slug稳定性的影响，我们在细胞中过表达SNHG15和Flag-Slug并对Flag-Slug的半衰期进行检测。结果显示，过表达长非编码RNASNHG15可以延长Slug降解的半衰期(图5G)。而在细胞中敲低SNHG15表达，则会缩短Slug降解半衰期(图5F)。以上结果表明，在细胞中长非编码RNA SNHG15可以减缓Slug蛋白的降解。之前的研究已表明，Slug是通过泛素-蛋白酶体途径降解的。于是我们想知道长非编码RNASNHG15是否影响Slug蛋白的泛素化。为此，我们在293T细胞中共同转染HA-UB,Flag-Slug或SNHG15。用抗Flag抗体进行co-IP后，用抗HA抗体识别泛素化的Slug。结果表明，Slug蛋白的泛素化在过表达SNHG15后显著下降了(图5H)。相反，在SW620细胞中敲低SNHG15表达后Slug蛋白的泛素化水平增高(图5I)。综上所述，长非编码RNA SNHG15在细胞内通过阻止Slug蛋白泛素化，达到提高Slug蛋白稳定性的作用。

之前已经有报道泛素连接酶BTRC，FBXL14，STUB1和MDM2通过泛素化Slug，促进其通过蛋白酶体途径降解。为了进一步了解长非编码RNA SNHG15如何在与Slug相互作用后，阻止Slug通过泛素-蛋白酶体途经降解的。我们在大肠癌细胞系HCT116中敲低了泛素连接酶BTRC的表达，结果表明在siRNA作用下BTRC的蛋白水平下降而Slug的蛋白水平上升(图5J)。这一结果说明BTRC在大肠癌中靶向Slug促进其通过泛素-蛋白酶体途径降解。与此相吻合的是，在HCT116细胞中过表达BTRC，Slug的蛋白水平下降，而进一步过表达SNHG15可以使Slug的表达回升(图5K)。更重要的是，通过免疫共沉淀实验我们发现过表达长非编码RNASNHG15可以在293T细胞中减弱外源性BTRC与Slug的相互作用(图5L，M)。上述结果表明长非编码RNA SNHG15可能通过阻碍泛素连接酶BTRC与其底物Slug相互作用，从而减少Slug通过泛素-蛋白酶体途径降解，在大肠癌细胞系内稳定Slug表达。

实施例6长非编码RNA SNHG15在体内促进肿瘤生长

为了检测长非编码RNA SNHG15在体内对大肠癌细胞的影响，我们建立了稳定表达SNHG15的大肠癌细胞系HCT116和SW620。稳定表达SNHG15或其空载的HCT116细胞，通过皮下注射的方法打入到了裸鼠的两侧腋下区。高表达SHNG15的HCT116细胞在裸鼠的皮下成瘤较对照组更为快速(图6A)。随后，肿瘤被切除称重，过表达SNHG15的肿瘤组织相较对照组表现为体积更大，重量更重(图6B)。此外，我们还对肿瘤组织进行了切片，免疫组织化学实验结果显示：在SNHG15过表达的肿瘤组织中，与细胞增殖相关的标志物Ki-67，间质样细胞标志物N-Cadherin和EMT激活转录因子Slug的表达均比对照组表达升高(图6C)。组织学分析显示，长非编码RNASNHG15不仅加强了肿瘤细胞的增值能力，还促进了肿瘤侵袭标志侵袭前缘的形成(图6C箭头)。上述结果提示，长非编码RNASNHG15在大肠癌发生发展中扮演了促癌基因的角色。

实施例6吉西他滨和放线菌酮诱导长非编码RNASNHG15在大肠癌中表达

之前的研究已经发现长非编码RNA可以与其调节的蛋白形成相互调节模式，例如，长非编码RNADINO(Damage inducednon-coding)稳定p53蛋白并且促进p53下游基因表达，反过来DINO的表达也需要p53的存在。Slug与p53都属于转录因子，具有调节基因转录的能力，因此我们想知道长非编码RNASNHG15是否受到Slug的调节。我们向大肠癌细胞系HCT116和SW480中转染Flag-Slug质粒并检测长非编码RNASNHG15的表达。结果显示，在HCT116和SW480细胞系中过表达Slug对长非编码RNASNHG15的mRNA水平并没有影响(图7A和B)，提示长非编码RNASNHG15的转录并不受Slug的调控。于是，我们想问长非编码RNA SNHG15在大肠癌中是怎样被调控的？已有报道发现长非编码RNASNHG15的表达在HeLa细胞中受到顺铂(Cisplatin)，放线菌酮(Cycloheximide)和氧化汞(Mercury(II)oxide)刺激后会上调。我们想知道在大肠癌治疗中应用的药物是否会诱导长非编码RNASNHG15的表达？为此，我们使用吉西他滨和放线菌酮两种药物对大肠癌细胞HCT116和SW480细胞系进行了加药处理。如图所示，与之前在HeLa细胞中报道的实验结果相一致，顺铂和放线菌酮也可以在大肠癌细胞系HCT116和SW480中诱导长非编码RNASNHG15的表达(图7C和E)，而抗肿瘤药物吉西他滨也可以上调长非编码RNA SNHG15的表达。并且，SNHG15的表达量随着抗肿瘤药物顺铂和吉西他滨加药浓度的升高而升高，表现出剂量依赖性趋势(图7D和E)。综上所述，我们的发现提示肿瘤治疗药物可以上调长非编码RNA SNHG15的表达。

为了进一步了解抗肿瘤药物对长非编码RNA SNHG15调节的机制，我们又进行了染色质免疫共沉淀实验来检测加药过后SNHG15启动子区域组蛋白修饰的变化。结果表明，对大肠癌细胞HCT116加入吉西他滨(10μM)和顺铂(10μM)24小时后，与基因表达激活相关的组蛋白标识H3K27ac和H3K4me3在SNHG15的启动子区富集显著增多(图7F，G)。同样的变化也发生在顺铂(10μM)加入后的SW480细胞系中(图7I)。我们进一步使用以DNA为模板的RNA聚合酶复合体(RNAPII)的亚基RPB1进行染色质免疫共沉淀实验，结果表明RNAPII复合体在SNHG15启动子区的富集增多(图7H)。以上结果表明，抗肿瘤药物吉西他滨和顺铂可能通过改变长非编码RNA SNHG15启动子区组蛋白修饰，进而在大肠癌中调节SNHG15的表达。已经有报道转录因子Slug参与到肿瘤对于吉西他滨和顺铂的药物抵抗过程中，并且我们前面的工作已经表明长非编码RNA SNHG15可以上调Slug蛋白水平。因此我们假设，敲低SNHG15表达可以降低Slug蛋白水平，进而增加大肠癌细胞对吉西他滨和顺铂的药物敏感性。为了检验这一假设，我们在大肠癌细胞系HCT116中敲低SNHG15，观察到由吉西他滨和顺铂所有诱导的细胞死亡增加(图7J和K)。上述结果说明，减弱长非编码RNA SNHG15的表达可以增加大肠癌细胞对吉西他滨和顺铂两种抗肿瘤药物的敏感性。

综上所述，我们发现了稳定Slug蛋白的新机制，并证明了在大肠癌细胞中长非编码RNA SNHG15通过与Slug蛋白的C端锌指结构域相结合，阻止Slug蛋白的泛素化和降解(图7L)。长非编码RNA SNHG15的高表达促进大肠癌进展，并与大肠癌病人的不良预后相关。我们的发现为将来以癌基因SNHG15为靶点，针对大肠癌病人的治疗方法提供了理论依据。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种长非编码RNA SNHG15及其在制备诊疗癌症药物中的应用

<150> 2018102714714

<151> 2018-03-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 784

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

<210> 2

<211> 1094

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 5

UUUUUU 6

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 6

UUUU 4

Claims

1.一种用于判断包括大肠癌、乳腺癌、肾癌在内的癌症预后情况或作为癌症诊疗靶点的长非编码RNA SNHG15，其特征在于，所述长非编码RNA的核苷酸序列如Seq ID NO.1 和Seq ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的长非编码RNA在作为筛选判断肿瘤预后情况的诊断试剂中的应用。

3.权利要求1所述的长非编码RNA在作为筛选诊疗肿瘤的药物中的应用。

4.权利要求1所述的长非编码RNA通过绑定Slug表观沉默下游靶基因E-cad表达的应用。

5.识别权利要求1所述的长非编码RNA的标记物在制备诊断癌症及判断癌症诊疗预后情况的诊断产品中的应用，其特征在于，所述的标记物包括但不限于：

（1）结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；

（2）结合所述长非编码RNA的小分子化合物；

（3）结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能的片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

7.一种用于判断肿瘤诊疗预后情况的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含如权利要求5或6所述的标记物。

8.针对权利要求1所述的长非编码RNA的检测试剂在制备诊断癌症及筛选癌症预后情况的诊断试剂中的应用。

9.抑制权利要求1所述的长非编码RNA的抑制剂在制备诊断或诊疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂包括但不限于：

（1）抑制所述长非编码RNA的siRNA、shRNA或功能类似的小干扰RNA；

（2）抑制所述长非编码RNA的小分子化合物；

（2）抑制所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、高底物专一性的酶或其功能片段。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。