CN113122628A - Clec5a基因作为标志物在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌中诊断及治疗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，尤其涉及CLEC5A基因作为标志物在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌中诊断及治疗的应用。CLEC5A基因可作为胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌诊断生物标志物或者制备用于癌症诊断产品的应用。CLEC5A基因在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌肿瘤中呈特异性高表达现象，而在正常组织中没有这种特异性高表达现象；通过检测受试者体内的CLEC5A基因表达，可以快速、准确及清楚的确定胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌的发生。CLEC5A基因作为胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌的诊断标志，为临床治疗胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌提供了新的靶点，可应用于抗肿瘤的药物的制备。

Description

CLEC5A基因作为标志物在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢 癌中诊断及治疗的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，尤其涉及CLEC5A基因作为标志物在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌中诊断及治疗的应用。

背景技术

胃癌（gastric carcinoma）是指原发于胃的上皮源性恶性肿瘤。在我国胃癌发病率仅次于肺癌居第二位，死亡率排第三位。全球每年新发胃癌病例约 120 万，中国约占其中的 40%。我国早期胃癌占比很低，仅约 20%，大多数发现时已是进展期，总体 5 年生存率不足 50%。近年来随着胃镜检查的普及，早期胃癌比例逐年增高。

结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，近年来，中国的结直肠癌发病率呈明显上升趋势。结直肠癌由于发现晚，复发率高，导致患者死亡率也较高， 其５年生存率高度依赖于确诊时的肿瘤分期。结直肠癌的早期发现对于患者提高临床疗效及延长生存期至关重要。同时，淋巴结转移亦是影响患者预后和生存的重要因素，结直肠癌术前淋巴结状态的精准预测则是制定合理治疗方案的关键。然而，目前临床应用的影像学、实验室检查、肠镜等传统检测方法通常具有敏感性和特异性低，或花费高、有创、给患者带来不适等缺点。因此，临床亟需发展敏感、特异、经济、无创的方法，以方便结直肠癌的筛查，提高疾病诊断效率和术前淋巴结转移预测效能。此外，作为预测结直肠癌患者生存期最常用方法的ＴＮＭ分期系统也存在不足，即便是同一分期的病人也存在高度复杂的异质性，其对于临床预后提供的信息非常有限。挖掘新型标志物，用于建立优于TOM分期系统的结直肠癌预后评估方法，将有助于为患者制定合理的个体化治疗方案，因而具有重要临床价值。

子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤，发生率有逐年上升趋势。由于该病通常早期即表现为阴道异常流血，容易得到及时的诊断，经过全子宫双附件切除＋淋巴结切除的标准治疗后，再加上必要时的术后辅助放疗或化疗，多预后良好。但是，尽管手术、放化疗手段在不断提高，但复发性或晚期子宫内膜癌患者的预后仍较差，治疗上也面临更少的选择，中位生存期仅 7～10个月，新的治疗方式亟待发掘。对于标准治疗后出现进展的恶性肿瘤，目前，有希望的治疗方法是靶向治疗，针对已经明确的致癌位点发挥作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织，从而在发挥抗肿瘤活性的同时，减少对正常细胞的毒副反应。随着对肿瘤发生机制的深入研究，针对癌细胞生存分子通路治疗靶点的药物陆续得以研制，涉及血管生成、DNA 修复和凋亡等诸多方面。对肿瘤基因通路的分子靶向药物，也可能在子宫内膜癌的治疗中具有用武之地。

卵巢癌（OC）是女性生殖系统中相对常见的恶性肿瘤，并且具有最高的妇科恶性疾病死亡率。已知有许多类型的OC，其中上皮性卵巢癌（EOC）是最常见的。EOC在早期阶段没有明显症状，大多数患者在初步诊断时处于晚期，治疗效果差，5年生存率极低。临床上若能早期发现并诊断OC，并且及时合理地行根治性手术或靶向分子药物治疗等综合治疗手段，能够极大地提高OC患者的生存率、生存质量和延长生存时间。因此，深入研究OC的相关分子及信号传导通路机制具有十分重要的临床意义。

虽然不同组织来源的肿瘤有其特异性，但同为腺癌，它们在生物学行为及发生机制中也有一定共性。我们在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌中寻找发挥作用的基因及蛋白，对寻求此类疾病的共同诊断及治疗靶点具有重要作用。

CLEC5A基因编码C型凝集素/ C型凝集素样结构域（CTL / CTLD）超家族的成员。该家族的成员具有共同的蛋白质折叠并具有多种功能，例如细胞粘附，细胞 - 细胞信号传导，糖蛋白转换以及炎症和免疫应答中的作用。 编码的II型跨膜蛋白与dnax活化蛋白12相互作用并且可能在细胞活化中起作用。此外，发明人发现CLEC5A基因在多种恶性肿瘤（包括胃癌、肠癌、卵巢癌和内膜癌）中呈现异常高表达，其可能在恶性肿瘤发生发展中具有关键作用。但其在肿瘤中的作用仍未清楚，且无相关文献报道该基因的作用，寻找到有效的早期发病的生物标志物，以及相关的分子机制对指导胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌临床诊治、治疗及预后有重要意义。总体而言，运用分子生物学方法研究鉴定有效的分子标志物，是辅助现有临床诊断、指导临床干预和癌前预警的关键手段，进一步研究CLEC5A基因在恶性肿瘤特别是在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌发生发展中的作用，对于胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌的早期诊断、治疗以及预后都具有非常重要的帮助。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，为寻找胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌的诊断分子标志物及治疗靶点，本发明的目的是提供CLEC5A基因作为标志物在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌中诊断及治疗的应用，本发明公开的一种新的胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌诊断标志物，能够明确清楚地表征胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌的发生发展，该标志物在人临床胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌组织中相比对应正常组织呈现特异性高表达现象。CLEC5A基因作为胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌的诊断标志，为胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌治疗的提供分子靶点，可应用于抗肿瘤的药物的制备。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种癌症标志物，所述癌症标志物为CLEC5A基因。

进一步地，所述癌症包括胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢中的任意一种。

CLEC5A基因作为癌症诊断标志物或者制备用于癌症诊断产品的应用。

进一步地，CLEC5A基因作为癌症诊断标志物或者制备用于癌症诊断产品的应用，所述癌症包括胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢中的任意一种。

进一步地，所述的癌症诊断产品选自制剂、芯片或试剂盒。

进一步地，所述的癌症诊断产品包括用来扩增特异性识别CLEC5A基因核酸序列的引物对。

具体地，引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQID No.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

一种抗癌药物，其有效成分为CLEC5A基因抑制剂，所述抑制剂为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体等的一种或多种。

进一步地，所述的CLEC5A基因抑制剂为siRNA，其序列如下：5′-GUGUUCAAUGGCAAUGUUA-3′。

CLEC5A基因在制备治疗胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌药物的应用。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

本发明首次发现CLEC5A基因可作为胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌诊断生物标志物，其在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌肿瘤中呈特异性高表达现象，而在正常组织中没有这种特异性高表达现象；通过检测受试者体内的CLEC5A基因表达，可以快速、准确及清楚的确定胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌的发生。本发明通过检测胃癌细胞系(MGC-803、SGC7901)、肠癌细胞系（HCT116、SW480、SW620）、子宫内膜癌细胞系（H1C-1A、H1C-1B、Ishikuwa）、卵巢癌细胞系（A2780、CAOV3、OVCAR3、SKOV3、HO8910）中CLEC5A的表达水平，并在以上4种恶性肿瘤中分别选择一个高表达CLEC5A的细胞株进行相关肿瘤表型研究，与对照组相比，明显抑制细胞增殖能力明显受到抑制；抑制细胞迁移；明显抑制肿瘤细胞侵袭能力；增加肿瘤细胞的凋亡水平。为临床治疗胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌提供了新的靶点，可应用于抗肿瘤的药物的制备。

附图说明

图1是CLEC5A基因在上述4种恶性肿瘤中各细胞系表达水平的实验结果。

图2是在卵巢癌细胞系HO8910、子宫内膜癌细胞系Ishikawa、胃癌细胞系MGC-803及肠癌细胞系HCT116中通过MTT法测定肿瘤细胞增殖的实验结果。

图3是在卵巢癌细胞系HO8910中通过细胞划痕实验测定肿瘤细胞迁移能力的实验结果。

图4是在子宫内膜癌细胞系Ishikawa中通过细胞划痕实验测定肿瘤细胞迁移能力的实验结果。

图5是在胃癌细胞系MGC-803中通过细胞划痕实验测定肿瘤细胞迁移能力的实验结果。

图6是在卵巢癌细胞系HO8910中通过Transwell法测定肿瘤细胞的侵袭能力实验结果。

图7是在子宫内膜癌细胞系Ishikawa通过Transwell法测定肿瘤细胞的侵袭能力实验结果。

图8是在胃癌细胞系MGC-803中通过Transwell法测定肿瘤细胞的侵袭能力实验结果。

图9是在肠癌细胞系HCT116中通过Transwell法测定肿瘤细胞的侵袭能力实验结果。

图10是在卵巢癌细胞系HO8910中通过流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡情况。

图11是在子宫内膜癌细胞系Ishikaw中通过流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡情况。

图12是在胃癌细胞系MGC-803中通过流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡情况。

图13是肠癌细胞系HCT116中通过流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本技术领域常规操作方，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例 CLEC5A基因在恶性肿瘤（包括胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌）细胞系中的表达情况及相关细胞功能实验检测方法。

实施例中涉及的细胞株来源：胃癌细胞系(MGC-803、SGC7901)、肠癌细胞系（HCT116、SW480、SW620）、子宫内膜癌细胞系（H1C-1A、H1C-1B、Ishikuwa）、卵巢癌细胞系（A2780、CAOV3、OVCAR3、SKOV3、HO8910）广州吉妮欧生物科技有限公司。

1、胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌细胞系中CLEC5AmRNA水平的鉴定。

1.1利用Trizol试剂提取肿瘤细胞的总RNA，加入 Trizol 1/5体积量的氯仿，剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化后，室温静置5分钟；4℃条件下，12000g离心处理20分钟，吸取上清液转移至另一个新的离心管中，向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在30℃下静置10分钟；4℃条件下，12000g离心处理20分钟，弃去上清，沿管壁加入lml的75％的乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，4℃条件下12,000g离心处理10分钟后，弃去乙醇，室温干燥沉淀5-10分钟，加入适量（10-20ul）的RNase-free水溶解沉淀后，用UV-2800A型紫外可见分光光度计测定RNA浓度和纯度（定量RNA浓度1ug/ul， OD260/OD2801.8-2.0之间表示RNA纯度较高）。

1.2逆转录合成cDNA。

采用Promega GoScript 反转录系统（A5000、A5001），按照以下操作步骤进行反转录得到的 cDNA。

第一步：取一定量模板 RNA 加入引物。

RNA ( 1µg/ul) 5 μl。

Random Primers (0.5 µg /ul) 1 μl。

Oligo(dT)15 Primer (0.5 µg/ul) 1 μl。

Nuclease-Free Water (加至 10 μl) 3 μl。

第二步：将模板 RNA 与反转录引物（ Random Primers和Oligo(dT)15 Primer）的混合物进行 70℃、5 min 预变性，完成后取出置于冰上。

第三步：配制 RT-Mix，向每个样品管加入 10 μl。

第四步：设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步（退火25℃ 5min，延伸42℃ 60 min，失活70℃ 15 min，4℃ + ∞。程序完成后得到 cDNA。

1.3 Real-time PCR。

（1）按下列配置PCR反应混合液（反应液配置可在室温进行），并分至各反应管，然后加入2ul模板。

（2）采用ABI PRISM®7500 Real-Time PCR System，两步法进行PCR标准扩增程序。

（3）导出数据，Realtime PCR结果用2-△△CT法进行分析。

2、特异性siRNA与引物的制备。

本实验所用的siRNA是基于Rosetta siRNA Design Algorithm来设计，采用化学合成法，购自Sigma Aldrich Shanghai Trading Co. Ltd（中国上海）。本实验所用引物采用固相亚磷酰胺三酯法合成，购自北京六合华大基因科技有限公司。

3、肿瘤细胞增殖能力检测(MTT法)。

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔3000个细胞铺于96孔板，每孔体积为100微升，边缘孔加PBS溶液以防实验组液体蒸发，待细胞贴壁后使用特异性siRNA转染细胞，并在转染后测定0h、24h、48h、72h细胞增殖情况。每孔加入20微升MTT溶液，继续培养4小时，后吸干培养基，每孔加入150微升二甲基亚砜，震荡6分钟，酶标仪上测量吸光度。记录数据，绘制细胞成活力曲线。

4、肿瘤细胞迁移测定（细胞划痕实验）。

选择生长状态良好的细胞加入6孔板中培养，以每孔5×10⁵个细胞为宜，正常培养过夜，第二日用同一个200μl枪头在每个孔中划痕，然后用PBS清洗2-3次，以去除划下的细胞，用特异性siRNA转染细胞，并加入5ml无血清培养液继续培养。显微镜下分别观察划伤细胞生长迁移状况，并在转染后0，24h，48h分别拍照，拍照选取同一位置，拍照前可用PBS清洗去除死细胞，最后使用Image J软件 (National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA）测量裸区。划痕愈合率=（原始划痕面积 - 实际划痕在不同时间的面积）/原始划痕面积×始划痕％。

5、肿瘤细胞侵袭测定（Transwell实验）。

首先用无血清培养液稀释基质胶（1:10）30-40μl均 匀 铺 入 小 室 ， 放 入 37℃ 孵 育 4h。计数取5×10＾4 个细胞，铺板，上室为无血清培养液稀释的细胞200μl，下室加入正常10%FBS的培养液600μl，同时用特异性siRNA转染细胞。继续培养48h后进行染色，将含细胞的小室用PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定15min或保存于4℃较长时间，弃掉甲醛，再用PBS洗3次，每次5min，0.1%结晶紫染色15min，再用PBS洗3次，每次5min，用棉签擦掉上室内的基质胶，刀片轻轻切下膜，含有细胞的一面向上，干燥后，树脂胶封片，正置显微镜下拍照计数，观察测定细胞的侵袭能力。

6、肿瘤细胞凋亡测定（流式细胞术检测）。

计数取3×10⁵ 个细胞，铺于6孔板中，待细胞贴壁后转染。48h后用无EDTA胰蛋白酶消化细胞，胰蛋白酶消化时间应适当，以防止假阳性。1500 r离心5 min后，细胞用预冷的PBS收集和清洗两次。细胞再悬浮于100μL 1×结合缓冲液中，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染色液。20分钟后在室温黑暗条件下，再加入1×结合缓冲液的200μL。流式细胞术检测细胞凋亡率。

7、实验结果。

如图1所示，16株恶性肿瘤细胞系中CLEC5A基因表达水平，其中CLEC5A在A2780、SKOV3、HEC-1A、MGC-803、HCT116这5株细胞系高表达，在CAOV3、OVCAR3、HEC-1B、SW480、SGC7901这5株细胞系中低表达。

如图2所示，在卵巢癌细胞系HO8910、子宫内膜癌细胞系Ishikawa、胃癌细胞系MGC-803及肠癌细胞系HCT116中使用特异性siRNA敲低SMCO2表达水平后，与对照组相比，细胞增殖能力明显受到抑制。

如图3-5所示，在卵巢癌细胞系HO8910、子宫内膜癌细胞系Ishikawa、胃癌细胞系MGC-803中使用特异性siRNA敲低SMCO2表达水平后，与对照组相比，抑制了细胞迁移。

如图6-9所示，在卵巢癌细胞系HO8910、子宫内膜癌细胞系Ishikawa、胃癌细胞系MGC-803及肠癌细胞系HCT116中使用特异性siRNA敲低SMCO2表达水平后，明显抑制肿瘤细胞侵袭能力。

如图10-13所示，在卵巢癌细胞系HO8910、子宫内膜癌细胞系Ishikawa、胃癌细胞系MGC-803及肠癌细胞系HCT116中使用特异性siRNA敲低SMCO2表达水平后，与对照组相比，肿瘤细胞的凋亡水平增加。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>广州医科大学附属第三医院(广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院)

<120> CLEC5A基因作为标志物在胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌中诊断及治疗的应用

<160>3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211>16

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400>1

TCTGGGCTTATTGTGG 16

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400>2

AAGTCCCTGC TTTCATT 17

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>(人工序列)

<400>3

GUGUUCAAUG GCAAUGUUA 19

Claims (10)

1.一种癌症标志物，所述癌症标志物为CLEC5A基因。

2.如权利要求1所述的癌症标志物，其特征在于，所述的癌症包括胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢中的任意一种。

3.CLEC5A基因作为癌症诊断标志物或者制备用于癌症诊断产品的应用。

4.如权利要求3所述的CLEC5A基因作为癌症诊断标志物或者制备用于癌症诊断产品的应用，其特征在于，所述的癌症包括胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢中的任意一种。

5.如权利要求3所述的CLEC5A基因作为癌症诊断标志物或者制备用于癌症诊断产品的应用，其特征在于，所述的癌症诊断产品选自制剂、芯片或试剂盒。

6.如权利要求3所述的CLEC5A基因作为癌症诊断标志物或者制备用于癌症诊断产品的应用，所述的癌症诊断产品包括用来扩增特异性识别CLEC5A基因核酸序列的引物对。

7.如权利要求3所述的CLEC5A基因作为癌症诊断标志物或者制备用于癌症诊断产品的应用，其特征在于所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

8.一种抗癌药物，其特征在于，其有效成分为CLEC5A基因抑制剂，所述抑制剂为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体的一种或多种。

9.如权利要求8所述的抗癌药物，其特征在于，CLEC5A基因抑制剂为siRNA，其序列如下：5′-GUGUUCAAUGGCAAUGUUA-3′。

10.CLEC5A基因在制备治疗胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌及卵巢癌药物的应用。

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