CN104971361A - 一种叶酸受体靶向的敲除dnmt1基因的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸受体靶向的敲除DNMT1的药物组合物及其制备方法和用途。本发明利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分，将敲除DNMT1的Talen或cas9载体选择性投递到肿瘤部位，可提高DNMT1的敲除效率，且抑制癌细胞增长效果明显，为临床治疗癌症提供了一种新的选择。

Description

一种叶酸受体靶向的敲除DNMT1基因的药物组合物

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种叶酸受体靶向敲除DNMT1的药物组合物及其制备方法和用途。 

背景技术

癌症是当今世界各国面临的一个主要的公共健康难题。在发达国家，癌症是人口死亡的首要原因；而在发展中国家，癌症也是引起人口死亡的第二位原因。据最新癌症统计学数据，全球癌症患者每年新发病例1266万，死亡病例756万。在发达国家如美国，每年癌症新发病例约166万，因癌症死亡约58万，每4人中就有1人死于癌症。据《2012中国肿瘤登记年报》，我国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确证为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。 

虽然在过去的近20～30年间，传统治疗手段包括放射治疗、化学治疗和手术治疗不断发展，但是新的治疗药物以及新技术的应用依旧未能改进癌症患者生存质量和存活率。因此，新的治疗手段——基因治疗——的开发可能改变癌症的治疗现状。截止目前，肿瘤基因治疗临床试验已开展近20年，仍在开放的临床试验829例，占整个基因治疗临床试验的66.85%（829/1240）。 

表观遗传改变例如DNA甲基化涉及多种癌症的发生和进展。DNA甲基化反应是由DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）催化，在DNA的某个碱基上增加一个甲基；DNA甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶（CpG）。基因组中某些区域CpG比较聚集（密度比较高），这些区域常见于基因的启动子、第一个外显子和基因的3’-末端，这些区域被称之为CpG岛。在正常细胞，大多数CpG岛完全无甲基化。研究发现，肿瘤细胞中的抑癌基因启动子区域CpG岛过度甲基化，导致抑癌基因不表达，与肿瘤的发生、发展密切相关。目前发现的DNMT主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b，其中DNMT1在哺乳动物中的含量最高，是调节DNA甲基化最重要的酶，主要参与维持性甲基化，可以在甲基化的DNA模板指导下使新合成的DNA链发生甲基化。已经证明在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、宫颈癌、白血病等多种人恶性肿瘤中DNMT1的表达增高,并且通过DNMT1介导的基因失活促进肿瘤进展。因此，研究调控肿瘤DNMT1的策略已成为近年肿瘤治疗的热点和趋势。目前已有靶向DNMT1的小分子抑制如5-氮杂胞苷和地西他滨应用于临床治疗骨髓增生异常综合征。虽然这些小分子抑制剂在临床治疗中取得了一定疗效，但治疗过程中选择性差，毒性大及仅对小部分患者有效等问题促使需要开发疗效更确切的基因治疗药物。 

目前，基因编辑技术的迅速发展为基因治疗带来前所未有的机遇。其中Talen和cas9技术因制备简单、效率高，已成为基因编辑的首选方案。相比RNA干扰的瞬时效应，基因编辑技术可以稳定地导致基因失活，因而理论上该技术有广阔的应用前景。然而，将该技术应用于临床治疗、尤其是肿瘤治疗还罕见报道。其中一个重要的瓶颈是缺乏高效、特异的靶向传输系统。 

文献报道，多种上皮来源的肿瘤包括卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、脑癌、肺癌、头颈部癌以及结直肠癌等都有叶酸受体的高表达。利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分投递药物，可以实现肿瘤选择性的靶向给药，提高药物的抗肿瘤效果。 

发明人拟构建一种叶酸受体靶向的敲除DNMT1 基因的药物组合物，利用可靶向肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体成分，将敲除DNMT1基因的Talen或cas9载体投递到肿瘤部位，提高DNMT1的敲除效率，使其具有较好的抗肿瘤效果。 

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种叶酸受体靶向的敲除DNMT1基因的药物组合物，目的在于提高DNMT1的敲除效率，从而提高抗肿瘤效果。 

该药物组合物含有叶酸受体靶向成分和敲除DNMT1基因表达的Talen和cas9载体，可添加其他药学上可接受的成分，也可不添加其他成分。 

该药物组合物中的叶酸受体靶向成分包括但不限于叶酸受体的抗体、叶酸、叶酸衍生物、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物。其中，叶酸受体的抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和人源化抗体中的一种或多种，例如：Farletuzumab（MORAb-003）或其他公开的叶酸受体的抗体；叶酸衍生物包括但不限于四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸、5,10-二脱氮四氢叶酸中的一种或多种。 

该药物组合物中的敲除DNMT1基因的基本成分是Talen或cas9，其靶向的DNA序列是针对DNMT1基因的DNA碱基序列而设计。Talen或cas9可以不用载体，直接与叶酸受体靶向成分形成组合物；也可选择性构建在包括但不限于质粒、病毒、噬菌体、脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或几种载体中。其中，病毒包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒中一种或多种。 

该药物组合物中叶酸受体靶向成分与敲除DNMT1的Talen或cas9的组装方式包括但不限于以下方式中的一种或多种：叶酸受体靶向成分直接与Talen或cas9偶联，或叶酸受体靶向成分修饰在Talen或cas9的表面。 

具体地，利用Talen和cas9在线序列设计软件，例如ZIFIT PARTNERS，设计敲除DNMT1基因的靶序列，再与 GeneBank 序列比对，设计序列不能与人体其他基因存在高度同源性。依据此设计的序列，构建Talen和cas9序列。利用上述方法，已验证了2个Talen序列和4个cas9序列，编号为Talen1、Talen2和cas9-1、cas9-2、cas9-3、cas9-4。 

Talen1序列为： 

Talen1L：CCACAGTGTTCACA，Talen1R：GACCAGCTTCAGCA。

Talen2序列为： 

Talen2L：ACCACGCAGACATCAACCT，Talen2R: CCACCACGGCCTCCT。

cas9-1序列为：GGGCCATCGAGATGTGGGACCCTGCGGCCC； 

cas9-2序列为：GGAGATGCTGTGCGGCGGGCCGCCCTGCCA；

cas9-3序列为：GGTGGAGCAGGTGGAGAGTTATGACGAGGC；

cas9-4序列为：GGGCAGCTTGATCTCTATCTCTGGCTCGCT。

敲除DNMT1基因的序列，可以是通过上述原则设计的其他任何序列，并不限于以上所列的具体序列。 

Talen和cas9载体可直接与叶酸受体靶向成分偶联形成组合物。具体地，Talen和cas9载体的羟基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酯化复合物。或者，Talen和cas9载体还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接；具体地，叶酸受体靶向成分可先与生物素偶联，再加入链霉亲和素和Talen和cas9载体，即形成Talen和cas9载体与叶酸受体靶向成分的组合物。Talen和cas9载体与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。 

敲除DNMT1基因表达的Talen和cas9可以构建于质粒、病毒、噬菌体在内的一种载体。其中，病毒包括但不限于腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒中一种或多种。具体构建方法为常规方法，具体参照分子克隆实验室指南（第三版，科学出版社，2002）中所述方法，或者按照所用试剂盒的生产厂商所建议的条件。具体的质粒、病毒、噬菌体表达载体可以是商品化的载体也可以是构建的新型载体。 

敲除DNMT1基因的Talen和cas9载体也可以装载入脂质体、胶束、纳米粒在内的一种载体或多种载体。具体装载方式为：脂质体、胶束或纳米粒静电吸附、物理包裹中的一种或多种直接转载Talen和cas9载体。具体地，脂质体选自阳离子脂质体、中性脂质体、阴性脂质体；胶束载体材料可选用商品化的辅料如泊洛沙姆、磷脂等，或者文献已经报道的载体如PEG与聚酯类的嵌段共聚物（包括：PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA- PEG-PLGA），或者新设计合成的聚合物载体，或新设计的载体以及内源性成分的衍生物中的一种或几种；纳米粒载体材料可选用商品化的辅料如PLGA、PLA、壳聚糖、透明质酸、PEI等，或者文献已经报道的载体如PLGA、PLA、壳聚糖、透明质酸或PEI的衍生物，或者PEG与聚酯类的嵌段共聚物（包括：PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA- PEG-PLGA），或者新设计合成的聚合物载体，或新设计的载体以及内源性成分的衍生物中的一种或几种。 

叶酸受体靶向的敲除DNMT1 基因的Talen或cas9载体药物组合物，其叶酸受体靶向成分与敲除DNMT1基因的Talen和cas9载体的组装方式除叶酸受体靶向成分直接与Talen和cas9载体偶联外，还包含叶酸受体靶向成分修饰在Talen和cas9载体表面的方式。 

叶酸受体靶向成分直接修饰在Talen和cas9载体表面。具体地，Talen和cas9载体表面的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，质粒还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链（分子量200～5000Da的聚乙二醇均可）、氨基己酸等。质粒与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。 

叶酸受体靶向成分直接修饰在病毒、噬菌体、细菌、真菌表面。具体地，病毒、噬菌体、细菌、真菌表面蛋白的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，病毒、噬菌体、细菌、真菌还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链（分子量200～5000Da的聚乙二醇均可）、氨基己酸等。病毒、噬菌体、细菌、真菌与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。 

叶酸受体靶向成分直接修饰在脂质体、胶束、纳米粒表面。具体地，脂质体、胶束、纳米粒表面的氨基可与叶酸受体靶向成分包括叶酸受体的抗体、叶酸及其衍生物、甲氨蝶呤及其衍生物的羧基直接偶联，形成酰胺化复合物。或者，脂质体、胶束、纳米粒还可通过一定的间隔基与叶酸受体靶向成分连接，间隔基包括聚乙二醇链（分子量200～5000Da的聚乙二醇均可）、氨基己酸等。脂质体、胶束、纳米粒与叶酸受体靶向成分直接偶联形成组合物的方法，可包括多种其他任何能让二者相连的方法，并不限于以上所列方法。 

本发明提供的叶酸受体靶向的敲除DNMT1 基因的Talen或cas9载体的药物组合物，可以特异性与肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体结合，并通过叶酸受体介导的高效内吞作用提高DNMT1的敲除效率，从而提高抗肿瘤效果。 

叶酸受体靶向的敲除DNMT1 基因的Talen或cas9载体的脂质体包含磷脂和胆固醇两类脂质材料，也可添加其他任何药学上可接受的成分。磷脂种类很多，可采用制剂领域常用于制备脂质体的磷脂类型；胆固醇也可采用制剂领域常用于制备脂质体的胆固醇类型。具体地，制备叶酸受体靶向的敲除DNMT1 基因的Talen或cas9载体的脂质体时，采用的脂质为中性脂质，负电荷脂质或正电荷脂质材料，包括：磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵（DDAB）、 sn-甘油1,2 - 二油酰-3 - 磷酸胆碱(DOPC)、1,2 - 二油酰基-3 - 三甲基铵丙烷（氯化物盐）（DOTAP）、1,2 – 二十八烷基-SN-甘油-3 - 磷酸乙醇胺（DSPE）、胆固醇、[N-（N'，N'-二甲基氨基乙烷） - 氨基甲酰基]胆甾醇盐酸盐（DC-胆固醇）。 

其中，磷脂（包括磷脂衍生物）与胆固醇 （包括胆固醇衍生物）摩尔比为0.5 : 1～10 : 1，PEG修饰脂质占总脂质摩尔数的0.01～15%，叶酸占总脂质摩尔数的 0.01～2.5%，PEG 分子量为200～5000。 

  

具体实施方式

以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。 

实施例1  敲除DNMT1的cas9序列设计 

利用在线设计软件（http://zifit.partners.org/zifit/csquare9nuclease.aspx）设计敲除DNMT1的cas9作用序列，再与 GeneBank 序列比较，筛选出不与人体其他任何 DNA 存在高度同源性的序列，如下：

GGGCCATCGAGATGTGGGACCCTGCGGCCC；

GGAGATGCTGTGCGGCGGGCCGCCCTGCCA； 

GGTGGAGCAGGTGGAGAGTTATGACGAGGC； 

GGGCAGCTTGATCTCTATCTCTGGCTCGCT。

实施例2  敲除DNMT1的talen序列设计 

利用在线设计软件（ http://zifit.partners.org/zifit/ChoiceMenu.aspx）设计敲除DNMT1的Talen作用序列，再与 GeneBank 序列比较，筛选出不与人体其他任何 DNA 存在高度同源性的序列，如下：

Talen1序列为：

Talen1L：CCACAGTGTTCACA，Talen1R：GACCAGCTTCAGCA。

Talen2序列为： 

Talen2L：ACCACGCAGACATCAACCT，Talen2R: CCACCACGGCCTCCT。

实施例3   cas9-DNMT1表达质粒载体构建 

首先设计并合成编码对应靶序列的的DNA模板上下游引物；分别以30 μL退火缓冲液，溶解引物上下游片段（1 OD）。各取2 μL上述溶液+16 μL退火缓冲液混匀，加热至94℃后自然退火冷却至室温。取1 μL退火产物+99 μL水做100倍稀释。将cas9质粒表达载体以Bbs1限制性内切酶进行酶切，酶切产物以1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒大片段。DNMT1退火片段与cas9质粒线性化连接。连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌，涂布于含氨苄霉素抗性（终浓度为50 μg/mL）的LB琼脂糖培养基平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。进行小规模质粒抽提，测序鉴定。经测序结果分析阳性克隆质粒经Qiagen公司大抽试剂盒（Plasmid extraction and purification EndoFree Plasmid Giga Kits）大规模制备，即得cas9-DNMT1。

实施例4  包装有cas9-DNMT1的质粒直接与叶酸受体靶向成分偶联形成组合物 

将0.05微摩尔NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和0.1微摩尔EDC（1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺）加入1ml叶酸单克隆抗体Farletuzumab溶液（5mg/ml），室温搅拌15分钟；再加入1ml cas9-DNMT1溶液（5mg/ml）中4 C孵育过夜，再置于透析袋中，用10mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）在4 C透析12h，即得Farletuzumab-cas9-DNMT1复合物。

实施例5～10  以α-羧基-ω-氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸修饰脂质 

具体投料如下：

具体操作为：取α-羧基-ω-氨基聚乙二醇（氨基末端保护）0.5mmol，脂质材料（胆固醇或磷脂）0.75mmol，4-二甲氨基吡啶0.75mmol和1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺0.75mmol溶于100ml二氯甲烷中，反应约72~96h。减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥得氨基聚乙二醇胆固醇粗产品。称取叶酸1mmol、N-羟基琥珀酰亚胺2.5mmol、1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺2.5mmol和三乙胺10mmol溶于50ml无水DMSO中，加入约0.5mmol氨基聚乙二醇胆固醇粗产品，25~30℃反应约72~96h，反应液转入透析袋（MWCO=3500 Da），分别以20%（v/v）DMSO和水为透析介质透析，透析7天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂（即叶酸修饰脂质）。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。

实施例11～16  以双氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸修饰脂质 

具体投料如下：

具体操作为：将脂质（胆固醇或磷脂）(10 mmol) ，丁二酸酐(50mmol) ，DMAP(5mmol)溶于50 mL 二氯甲烷中，45 ℃剧烈回流，搅拌48 h，得丁二酰化脂质（胆固醇或磷脂）。取丁二酰化脂质（4mmol），1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺（10mmol），N-羟基琥珀酰亚胺（10mmol）溶于少量二氯甲烷中，滴加至100ml的双氨基聚乙二醇（5mmol）二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应约72h~96h。反应液用60目~80目硅胶拌样，300目~400目硅胶湿法装柱，干法上样。以二氯甲烷-甲醇体系为洗脱剂，比例从80:1，60:1，40:1到20:1（体积比，v/v），收集含有目标产物的洗脱液，合并浓缩除去有机溶剂，得氨基聚乙二醇-胆固醇。将叶酸（0.42mmol）、NHS（0.5mmol）、EDCI（0.5mmol）和三乙胺（4mmol）溶于5ml无水二甲亚砜中，滴加氨基聚乙二醇-胆固醇（0.21mmol）的DMSO溶液。25℃~30℃反应约120h~144h后，将反应液转入透析袋（MWCO=1000Da），分别以20%（v/v）DMSO和水为透析介质透析，透析14天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇或叶酸-聚乙二醇-磷脂（即叶酸修饰脂质）。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。

实施例17～22  叶酸修饰的质粒/脂质体组合物制备 

取叶酸修饰脂质，先用5%葡萄糖溶液溶解，制得1mg/ml的叶酸修饰脂质的胶束溶液。再取20mg脂质材料，加入氯仿使溶解，37℃减压除去氯仿，时间为1h，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60℃，时间1h；脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60℃，超声15min，0.22μm微孔滤膜过滤，滤液与cas9-DNMT1按质量比混合，室温孵育 30min，记为P-LP/cas9-DNMT1。取叶酸修饰脂质的胶束溶液与P-LP/cas9-DNMT1按上表摩尔比混合，并置于37℃恒温空气浴振荡器中，100rpm振摇1h后，即得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/cas9-DNMT1。

实施例23～28  叶酸修饰的质粒/脂质体组合物制备 

取脂质材料于茄形烧瓶中，氯仿-甲醇混合溶剂溶解，37℃减压除去有机溶剂，时间为1h，然后于室温、高真空条件下保持6h以上，葡萄糖溶液水化脱膜，水浴温度60℃，时间1h；脱膜后的混悬液转入西林瓶中，趁热水浴超声，水浴温度60℃，超声1min，0.22μm微孔滤膜过滤，制得叶酸靶向空白脂质体，记为F-P-LP。F-P-LP与cas9-DNMT1按上表质量比混合，室温孵育30min，即制得叶酸修饰的质粒/脂质体组合物，记为F-P-LP/cas9-DNMT1。

试验例1 用人卵巢癌细胞SKOV3体外评价叶酸受体靶向的敲除DNMT1的药物组合物对细胞增殖的抑制效果 

将人卵巢癌细胞SKOV3接种于96孔板，接种密度约5×103个每孔，次日，加入非靶向药物组合（P-LP/cas9-DNMT1：制备方法同实施例25，仅将其中的0.25％的叶酸-聚乙二醇-胆固醇用0.25％的单甲氧基聚乙二醇胆固醇酯替代）和叶酸靶向药物组合（F-P-LP/cas9-DNMT1：用的是实施例25的组合物），第四天，开始逐日进行MTT法检测存活细胞的相对数量。结果表明靶向敲除DNMT1药物组合对细胞增殖的抑制率达50%，显著优于非叶酸受体靶向敲除DNMT1药物组合(30%)。

试验例2 用人卵巢癌腹腔瘤模型评价叶酸受体靶向的敲除DNMT1的药物组合物治疗效果 

将Balb/C雌性裸鼠饲养于无特定病原体（SPF）屏障环境中。4~6周龄健康小鼠腹腔接种约1×10⁷个SKOV-3细胞/只，接种3天后按照体重随机分组（每组8只）并给药，具体分组为：对照组（Control）、非靶向组（P-LP/cas9-DNMT1：制备方法同实施例25，仅将其中的0.25％的叶酸-聚乙二醇-胆固醇用0.25％的单甲氧基聚乙二醇胆固醇酯替代）和叶酸靶向组（F-P-LP/cas9-DNMT1：用的是实施例25的组合物）。给药方式为腹腔注射，每三天注射1次，给药剂量为每只小鼠5μg质粒/200μl，连续给药10次。

处死裸鼠，解剖后记录腹水体积、肿瘤结节的个数及肿瘤的重量，叶酸受体靶向的敲除DNMT1的药物组合物（F-P-LP/CLDN3）组跟非靶向组相比，显著提高了DNMT1的敲除效率，达到了较为理想的抗肿瘤效果。与对照组比较，叶酸受体靶向的敲除DNMT1的药物组合物抑瘤率达85%，显著优于非叶酸受体靶向的敲除DNMT1的药物组合物（60%）（p<0.001）。 

  

Claims (8)

1.一种叶酸受体靶向的敲除DNMT1基因的药物组合物，其特征在于：含有叶酸受体靶向成分和敲除DNMT1基因的cas9或Talen载体。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的叶酸受体靶向成分包括：叶酸受体的抗体、叶酸、叶酸衍生物、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的叶酸衍生物包括四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、10-甲酰四氢叶酸、5,10-二脱氮四氢叶酸。

4.根据权利要求1～3所述的药物组合物，其特征在于敲除DNMT1基因的Talen或cas9载体可构建在包括质粒和病毒中。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于病毒包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、溶瘤病毒、牛痘病毒、改良安卡拉牛痘病毒、仙台病毒、单纯性疱疹病毒、麻疹病毒、新城鸡瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、RNA病毒。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于细菌包括大肠杆菌、长双歧杆菌、乳酸乳球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、变异链球菌、霍乱弧菌。

7.根据权利要求1～6所述的药物组合物，其特征在于叶酸受体靶向成分可以直接与Talen或cas9载体偶联，也可修饰在Talen或cas9载体的表面。

8.权利要求1~6任一项所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。