CN103920155A

CN103920155A - 具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备方法

Info

Publication number: CN103920155A
Application number: CN201410125041.3A
Authority: CN
Inventors: 葛慎光; 于京华; 颜梅; 葛磊; 张彦; 黄加栋; 孙国强
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2014-07-16

Abstract

本发明公开了一种具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子的制备方法。通过将氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠制备出发荧光的金簇纳米粒子，利用11-巯基十一烷酸和叠氮十一烷基硫醇功能化金簇表面；叶酸与炔丙胺通过N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺连接剂连接，形成炔基化叶酸；利用点击化学方法，炔基与叠氮基发生环加成反应，制备出叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子。叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子能够选择性识别叶酸过表达的K562细胞，对其进行荧光检测，在激发波长和发射波长分别为470nm和650nm下进行测定。

Description

具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备方法

技术领域

本发明属于材料制备，特别涉及具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备方法。

背景技术

金纳米团簇(AuNCs)是由几个至几十个 Au 原子组成的具荧光的分子级聚集体。其粒径一般小于 2 nm，介于原子与纳米颗粒之间。金纳米团簇特有的量子尺寸效应使其光学性质具有随粒径大小而变化的特性，这种特性使其荧光发射光谱从可见光到近红外光区范围内可调谐。由于贵金属具有化学惰性且生物相容性好，使得荧光金纳米团簇具有一系列引人注目的特性，包括超小的尺寸、毒副作用小和良好的生物相容性、斯托克斯位移（Stockes shift）较大以及出色的光稳定性，从而成为生物传感与成像的理想荧光探针。对于金纳米团簇，自身具有荧光，对金纳米团簇的表面进行功能化，能够具有检测的靶向性。

随着对肿瘤分子水平研究的不断深入，在肿瘤细胞表面发现一系列受体，这些受体在肿瘤组织中过度表达，但是在正常细胞中高度保守，特异性配体或抗体可以和这些受体进行结合，并被细胞内化进入到细胞内部。这些肿瘤特异性的受体为肿瘤检测及治疗提供了靶点。自从发现叶酸受体在绝大多数恶性肿瘤细胞中高度表达，而在正常细胞高度保守以来，叶酸/叶酸受体介导靶向传递成为该领域研究的热点。基于金簇纳米粒子具有荧光性能，且对其表面进行进行叶酸功能化，制备出具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备方法，所述的具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇是由叶酸和发荧光的金簇通过点击化学偶联所制备。

所述的叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备方法通过以下步骤制备得到：

1）将氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠溶液混合搅拌，得到发荧光的金簇纳米粒子；

2）将11-巯基十一烷酸和叠氮十一烷基硫醇加入到上述溶液中，放置、纯化；

3）向2）中加入炔基化叶酸，炔基化叶酸溶于1:1的水和二甲基亚砜混合溶液中；

4）向3）中加入CuSO₄和抗坏血酸催化下通过点击化学连接叠氮十一烷基硫醇和炔基化叶酸，实现叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备；

5）叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与叶酸过表达的K 562细胞进行孵育；

6）对叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与叶酸过表达的K 562细胞进行孵育前后荧光强度的测定。

所述的叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备方法具体通过以下步骤制备得到：

在步骤1）中，所述氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠溶液的体积比为10:10:1；所述氯金酸溶液浓度为0.25 mmol/L，所述柠檬酸三钠溶液浓度为0.25 mmol/L，所述的硼氢化钠溶液浓度为0.01 mol/L，所述的搅拌时间为30 s。

在步骤2）中，所述的11-巯基十一烷酸的浓度为100 mmol/L，所述的叠氮十一烷基硫醇10 mmol/L，所述的溶液在25℃下放置48小时，所述纯化采用分子量10 kDa 的半透膜进行透析60 min。

在步骤3）中，所述炔基化叶酸的制备过程是1.0 g 叶酸溶入 10 mL二甲基甲酰胺（DMF），待完全溶解后再加入0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺和 0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），得到的混合物在冰浴中继续搅拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入 0.124 g 炔丙胺的 DMF 溶液(5 mL)，得到的混合物在室温下搅拌 24 h，接着加入 100 mL蒸馏水，搅拌 40 min，产生沉淀，停止反应，过滤，得到桔黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，得炔基化叶酸。

在步骤4）中，所述的CuSO₄和抗坏血酸的浓度分别为0.01 mol/L和0.05 mol/L。

在步骤5）中，所述叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与K 562 细胞孵育时间30 min。

在步骤6）中，所述对叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与叶酸过表达的K 562细胞进行孵育前后溶液在激发波长和发射波长分别为470 nm和650 nm下进行测定。

本发明的有益效果：

本发明所述一种叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子能够特异性识别表面有高水平叶酸受体表达的细胞，可作为检测肿瘤细胞的分子探针，在肿瘤细胞检测中具有重要的应用价值。

（1）叶酸可以与癌细胞表面的叶酸受体特异性的结合，从而内化进入细胞内部，对癌症的诊断起到重要的作用。

（2）金簇纳米粒子具有非常高的稳定性，在生理环境下能够稳定存在；叶酸通过“点击化学”反应可以与金簇形成共价键，连接牢固；叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子具有很好的生物相容性，

（3）由于所用的叶酸分子小，更有利于细胞对其的摄取；具有良好的叶酸受体靶向性，并且金簇具有发射荧光功能，所以叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子可作为检测肿瘤细胞的探针，用于荧光成像，实现对肿瘤细胞的定位检测。

附图说明

图1为叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子的制备示意图。

图2为叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子紫外可见吸收光谱图和荧光光谱图。

具体实施方式

实施例1叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备及检测细胞的应用

1叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备

1）将20 mL 0.25 mmol/L氯金酸溶液、20mL 0.01 mol/L柠檬酸三钠溶液和2mL 0.01 mol/L硼氢化钠溶液混合，搅拌30 s。

2）向1）中加入100 μL 100 mmol/L 11-巯基十一烷酸，100 μL 10 mmol/L 叠氮十一烷基硫醇，溶液在25℃下放置48小时，采用分子量 10 kDa 的半透膜进行透析60min。

3）秤取1.0 g 叶酸溶入 10 mL二甲基甲酰胺（DMF），待完全溶解后再加入0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺和 0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），得到的混合物在冰浴中继续搅拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入 0.124 g 炔丙胺的 DMF 溶液(5 mL)，得到的混合物在室温下搅拌 24 h，接着加入 100 mL蒸馏水，搅拌 40 min，产生沉淀。停止反应，过滤，得到桔黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，得炔基化叶酸。

4）配制3）制备的炔基化叶酸溶液浓度为0.02g/mL，向2）中加入1mL。

5）向溶液中加入1mL 0.01 M CuSO₄溶液和1mL 0.05 M抗坏血酸溶液。

2 K562细胞的培养

RPMI-1640培养液：称取 RPMI-1640 粉 10.4 g，溶于三蒸水1000 mL，加入 2 g NaHCO₃，调节 pH 值至7.4，用 0.22 μm 的微孔滤膜正压过滤除菌，用之前加入10 %胎牛血清(FBS)，青霉素 100 U/mL，链霉素 100 μg/mL，1 mmol/L L-谷氨酰胺，4 ℃保存备用。

从液氮中取出冻存管后立即置于 38 ℃恒温水浴中解冻，取出冻存管，用 75 %酒精清洁管口，将冻存细胞转移到大玻璃培养瓶，加入 20 mL 新鲜培养液培养，复苏次日更换培养液。K562细胞在含有 10 %灭活胎牛血清(FBS)、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 μg/mL的 RPMI-1640 培养液中，于 37 ℃、5 % CO₂、水饱和湿度条件下培养。

3 K562细胞的测定

1）叶酸受体靶向与荧光双功能金簇与K 562细胞，A 549细胞、MCF-7细胞和H9c2细胞共培养2h，激光共聚焦显微镜观察细胞的变化发现。K 562细胞和A 549细胞表面具有许多红色荧光物（即为叶酸受体靶向和荧光双功能的金簇纳米粒子）吸附，部分K 562细胞和A 549细胞内也可见绿色荧光物，而作为对照的MCF-7细胞和H9c2细胞表面和细胞内基本上没有出现红色荧光物。由此可以看出，是由于K 562细胞和A 549细胞中的叶酸受体高表达，而MCF-7细胞和H9c2细胞中的叶酸受体低表达。叶酸受体靶向和荧光双功能的金簇纳米粒子能够与K 562细胞和A 549细胞高表达的叶酸受体特异性结合，并且K 562细胞和A 549细胞表面被荧光物覆盖，表明了叶酸受体靶向和荧光双功能的金簇纳米粒子与叶酸受体高表达的肿瘤细胞存在很好的结合，故可以作为该类肿瘤细胞早期诊断的工具。同时上述结果还表明，被修饰在金簇纳米粒子表面的叶酸的活性并没有受到影响，主要由于叶酸与金簇纳米粒子通过点击化学反应形成共价键，在与叶酸过表达的肿瘤细胞孵育时，可以特异性地和叶酸受体靶向的荧光双功能金簇纳米粒子相结合，使得靶细胞被金簇纳米粒子所识别。结果表明制备的叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子对叶酸高表达的细胞具有优越的靶向性。

2）取0.5 mL 10 nmol/L的叶酸受体靶向和荧光双功能的金簇溶液置于 1.0 mL的离心管中，向其中加入0.2 mL 不同浓度的K 562细胞溶液，轻微震荡混匀后，在4℃的条件下孵育30 min。

3）孵育完成后，在转速为1000 rpm离心5min，收集上清液，用荧光光度计记录在最大激发波长为470 nm，最大发射波长650 nm出的荧光光度值。空白组为含有叶酸受体靶向和荧光双功能的金簇的RPMI-1640培养基，未加细胞。计算叶酸受体靶向和荧光双功能的金簇溶液离心后与离心前在最大发射波长650 nm处的荧光强度的变化值（ΔI）。随着K 562细胞浓度的增加，ΔI的值也随之变大，表明结合在细胞表面的叶酸受体靶向的荧光双功能金簇就越多，因此离心后，上清液中的叶酸受体靶向的荧光双功能金簇就越少。而叶酸受体低表达的成纤维细胞中，随着浓度的增加，ΔI的值并没有发生多大的变化，这是因为叶酸受体靶向的荧光双功能金簇并不能有效地、稳定地吸附在细胞表面，不能随着细胞的浓度增加而减少上清液中叶酸受体靶向的荧光双功能金簇的量。随着K562细胞检测浓度的降低，K562细胞浓度为100-10000 cells/mL时，叶酸受体靶向的荧光双功能金簇与K562细胞呈现良好的线性关系，其线性回归方程为ΔI=54.01+0.083c，R=0.9976。因此，基于叶酸受体靶向的荧光双功能金簇检测肿瘤细胞的检测限为50个/mL，这种方法能够简便的用于检测叶酸受体过表达的细胞。

Claims

1.叶酸受体靶向和荧光双功能金簇的制备方法及应用，其特征是包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述在步骤1）中，所述氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠溶液的体积比为10:10:1；所述氯金酸溶液浓度为0.25 mmol/L，所述柠檬酸三钠溶液浓度为0.25 mmol/L，所述的硼氢化钠溶液浓度为0.01 mol/L，所述的搅拌时间为30 s。

3.根据权利要求1所述在步骤2）中，所述的11-巯基十一烷酸的浓度为100 mmol/L，所述的叠氮十一烷基硫醇10 mmol/L，所述的溶液在25℃下放置48小时，所述纯化采用分子量10 kDa 的半透膜进行透析60 min。

4.根据权利要求1所述在步骤3）中，所述炔基化叶酸的制备过程是1.0 g 叶酸溶入 10 mL二甲基甲酰胺（DMF），待完全溶解后再加入0.26 g N-羟基琥珀酰亚胺和 0.44 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），得到的混合物在冰浴中继续搅拌，直至得到白色沉淀，然后再向其中加入 0.124 g 炔丙胺的 DMF 溶液(5 mL)，得到的混合物在室温下搅拌 24 h，接着加入 100 mL蒸馏水，搅拌 40 min，产生沉淀，停止反应，过滤，得到桔黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，得炔基化叶酸。

5.根据权利要求1所述在步骤4）中，所述的CuSO₄和抗坏血酸的浓度分别为0.01 mol/L和0.05 mol/L。

6.根据权利要求1所述在步骤5）中，所述叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与K 562 细胞孵育时间30 min。

7.根据权利要求1所述在步骤6）中，所述对叶酸受体靶向和荧光双功能金簇与叶酸过表达的K 562细胞进行孵育前后溶液在激发波长和发射波长分别为470 nm和650 nm下进行测定。