CN110283587A - 一种癌细胞检测功能的金纳米簇材料的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种癌细胞检测功能的金纳米簇材料的制备方法与应用。解决现有癌症诊断困难的问题。方法：一、将叶酸、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N‑N‑羟基琥珀酰亚胺及三乙胺溶解于无水二甲基亚砜中形成混合溶液在黑暗条件下搅拌，得溶液A；二、向溶液A加入牛血清白蛋白，用氢氧化钠调节pH值并进行搅拌，获得溶液B；三、将溶液B离心冻干溶解于氯金酸水溶液中超声处理，滴加氢氧化钠并在特定温度下搅拌，获得具有诊断癌症功能的荧光纳米簇探针。本发明的成本低，检测灵敏度高，检测靶向性强。本发明用于癌症诊断领域。

Description

一种癌细胞检测功能的金纳米簇材料的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种癌细胞检测功能的金纳米簇材料的制备方法与应用。
背景技术
癌症是世界医学难以攻克的难题之一。世界卫生组织最新公布数据表明，全球每年有880万人死于癌症，占全球死亡人数近六分之一。因癌症死亡的人数仍在不断增加，预计到2030年这一数字将增加到2100多万。2月4日是世界癌症日。中国癌症死亡人数已占世界四分之一，一方面因为中国人口庞大，另一方面也因我国癌症死亡率高于世界水平。“全国肿瘤登记地区恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌；死亡第一位的是肺癌，其次为肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌。”
癌症已成为威胁人类的头号杀手。对于治疗癌症来说诊断至关重要。癌症诊断是一种专门针对癌症早期患者的诊疗方法，其目的在于早发现早治疗，从而减轻患者痛苦和精神、经济负担。争取通过癌症诊断治疗让癌症患者早日康复。癌症是一大类恶性肿瘤的统称。癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗;癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状;癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等等。与之相对的有良性肿瘤，良性肿瘤则容易清除干净，一般不转移、不复发，对器官、组织只有挤压和阻塞作用，但癌症(恶性肿瘤)还可破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终由于器官功能衰竭而死亡。癌症诊断通过血芯片检测、基因检测、纳米检测、TTM、PET CT等一系列新式癌症体检方法对癌症患者的症状进行诊测，从而进一步了解病情，制定最佳治疗方案，实现早发现早治疗的目的。
癌症的诊断可通过血芯片检测、基因检测、细胞标记等。因此，细胞标记技术成为近年来人们关注的热点。有效的诊断可在发病初期检查出癌症，使治疗更有效，简单，并降低费用。诊断可通过生物成像的荧光标记来实现。如何区分标记肿瘤细胞与正常细胞是癌症诊断及治疗的一个重要问题。经科学家证明，肿瘤细胞表面存在数量较多的叶酸受体，其存在是由于肿瘤细胞的过度表达。而正常细胞和组织的表面几乎不存在叶酸受体。它的存在成为区分正常细胞与肿瘤细胞的重要手段。
发明内容
本发明是要解决现有癌症诊断成本昂贵，诊断灵敏度低的问题，提供一种荧光纳米簇探针的制备方法及其应用。
本发明荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、将叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺溶解于无水二甲基亚砜中，在室温下超声溶解，形成均匀的混合溶液，将混合溶液用磁力搅拌器进行搅拌，反应温度为室温下，反应20-60min结束，得到溶液A，即为活性酯中间体；其中叶酸原料与无水二甲基亚砜的体积比为（10-20）mL；
二、将步骤一得到的溶液A装入烧杯中，向其中加入牛血清白蛋白，并用氢氧化钠调节pH值，室温下搅拌20-30h，得到溶液B；
三、将步骤二得到的溶液B离心冻干，得到B粉末溶解于氯金酸水溶液中超声处理，滴加氢氧化钠并在特定温度下搅拌10-15h，获得具有癌症诊断功能的荧光纳米簇探针。
进一步的，步骤一所述原料为叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺。
进一步的，步骤一中超声功率为60~100W。
进一步的，步骤一中磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为20-60min，反应温度为18-25 ℃。
进一步的，步骤二中磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为20-30h，反应温度为18-25 ℃。
进一步的，步骤三中所述离心速率为2000r/min~15000r/min。
进一步的，步骤三中超声功率为60~100W。
进一步的，步骤三中磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为10-15h，反应温度为30-40 ℃。
上述方法制备的荧光纳米簇探针在癌症诊断中的应用。
本发明对癌症的诊断有着重大的作用。
本发明的原理：
本发明中荧光纳米簇探针诊断癌症原理主要是根据肿瘤细胞表面存在大量叶酸受体，这是由于肿瘤细胞的过度表达。 叶酸受体几乎不存在于正常细胞和组织的表面上。 它的存在已成为区分正常细胞和肿瘤细胞的重要手段。牛血清白蛋白作为还原剂与氯金酸反应形成金纳米团簇，而叶酸充当靶向剂。由于肿瘤细胞表面存在叶酸受体，FA-BSA修饰的金纳米簇可与癌细胞表面的叶酸受体相互作用，以区分肿瘤细胞和正常细胞。这种金纳米团簇具备荧光性能，从而能起到诊断癌细胞的作用。
本发明的有益效果：
本发明方法以叶酸、牛血清白蛋白及氯金酸为原材料，采用化学还原法，制备出荧光金纳米簇。因此，可以利用本发明的荧光纳米簇探针对癌症进行诊断。
由于金纳米簇具有良好的化学稳定性，可以稳定地分散在水溶液中，展现优异的颜色荧光，因此本发明的荧光纳米簇探针具有良好的稳定性和荧光性能。将荧光纳米簇探针置于300W的紫外灯下辐照12 h，未发生很大的猝灭现象，表明所制备的荧光纳米簇探针具有良好的荧光稳定性。
本发明通过化学还原法合成，制备方法简单、原料来源广泛，操作简单。由于氯金酸经过化学还原的过程，形成金纳米簇，因此具有较好的荧光强度，荧光效率可达57%~68%。随着pH值的降低或升高，荧光强度变化不明显。以上表明荧光纳米簇探针具有很好的实用性和在广阔的应用前景。
本方法所制备的金纳米簇粒子尺寸均一、分散性，其合成方法简单，原料易得、成本较低，无毒，具有较好的荧光性能，其对癌症的诊断具有荧光检测功能。在生物成像，癌症诊断和靶向药物载体等具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的荧光纳米簇探针过程中叶酸与牛血清白蛋白中间体的傅里叶红外光谱图；
图2是实施例1制备的荧光纳米簇探针的紫外吸收光谱图、荧光激发谱图和荧光发射光谱图；
图3为实施例1制备的荧光纳米簇探针的透射电镜图像 ；
图4为实施例1制备的荧光纳米簇探针在不同离子存在下的荧光光谱图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、将叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺溶解于无水二甲基亚砜中，在室温下超声溶解，形成均匀的混合溶液，将混合溶液用磁力搅拌器进行搅拌，反应温度为室温下，反应20-60min结束，得到溶液A，即为活性酯中间体；其中叶酸原料与无水二甲基亚砜的体积比为（10-20）mL；
二、将步骤一得到的溶液A装入烧杯中，向其中加入牛血清白蛋白，并用氢氧化钠调节pH值，室温下搅拌20-30h，得到溶液B；
三、将步骤二得到的溶液B离心冻干，得到B粉末溶解于氯金酸水溶液中超声处理，滴加氢氧化钠并在特定温度下搅拌10-15h，获得具有癌症诊断功能的荧光纳米簇探针。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述原料为叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中超声功率为60~100W。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为20-60min，反应温度为18-25 ℃。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中其中叶酸原料与无水二甲基亚砜的体积比为（10-20）mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为20-30h，反应温度为18-25 ℃。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中所述离心速率为2000r/min~15000r/min。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中所述超声功率为60~100W。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三中所述磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为10-15h，反应温度为30-40 ℃。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式荧光纳米簇探针在癌症诊断中的应用。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
一、将10mg叶酸、27.71mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、13.02mgN-N-羟基琥珀酰亚胺及50μL三乙胺溶解于20mg无水二甲基亚砜中，在室温下100W超声溶解，形成均匀的混合溶液，将混合溶液用750 r/min磁力搅拌器进行搅拌，反应温度为室温下，反应30min结束，得到溶液活性酯中间体FA-NHS，其中叶酸原料与无水二甲基亚砜的体积比为（10-20）mL；
二、将步骤一得到的溶液FA-NHS装入烧杯中，向其中加入46mg牛血清白蛋白，并用氢氧化钠调节pH值调至10，室温下750 r/min磁力搅拌器进行搅拌24h，得到FA-BSA溶液；
三、将步骤二得到的FA-BSA溶液10000r/min离心冻干，得到FA-BSA粉末。并将50μL氯金酸溶解于4mg去离子水中，加入FA-BSA粉末100W超声处理，滴加3ml氢氧化钠并在37℃温度下750 r/min磁力搅拌器进行搅拌12h，获得具有癌症诊断功能的荧光纳米簇探针。
图1是本实施例制备的荧光纳米簇探针过程中叶酸与牛血清白蛋白中间体的傅里叶红外光谱图，可以看出所制备的荧光纳米簇探针过程中叶酸与牛血清白蛋白中间体成功合成。
图2为本实施例制备的荧光纳米簇探针的紫外吸收光谱图、荧光激发谱图和荧光发射光谱图所制备的荧光纳米簇探针在紫外吸收光谱图中无吸收区。荧光激发峰在480nm，荧光发射峰在650nm。在自然光照下的荧光纳米簇探针呈浅棕色水溶液状态，在365 nm紫外光照下的荧光纳米簇探针展现红色的荧光。
图3为本实施例制备的荧光纳米簇探针的透射电镜图像，由图3所示，所制备的金纳米簇粒子的粒径尺寸比较均一，分散性良好。
图4为本实施例制备的荧光纳米簇探针对当含有不同离子时的荧光稳定性。
实施例2：
一、将10mg叶酸、27.71mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、10mgN-N-羟基琥珀酰亚胺及40μL三乙胺溶解于20mg无水二甲基亚砜中，在室温下80W超声溶解，形成均匀的混合溶液，将混合溶液用700 r/min磁力搅拌器进行搅拌，反应温度为室温下，反应30min结束，得到溶液活性酯中间体FA-NHS，其中叶酸原料与无水二甲基亚砜的体积比为（10-20）mL；
二、将步骤一得到的溶液FA-NHS装入烧杯中，向其中加入35mg牛血清白蛋白，并用氢氧化钠调节pH值调至10，室温下700 r/min磁力搅拌器进行搅拌30h，得到FA-BSA溶液；
三、将步骤二得到的FA-BSA溶液8000r/min离心冻干，得到FA-BSA粉末。并将50μL氯金酸溶解于4mg去离子水中，加入FA-BSA粉末80W超声处理，滴加3ml氢氧化钠并在37℃温度下700 r/min磁力搅拌器进行搅拌12h，获得具有癌症诊断功能的荧光纳米簇探针。
本实施例荧光纳米簇探针置于300W的紫外灯下辐照0-12 h，探针的荧光强度随着辐照时间的延长，并未发生很大的猝灭现象，表明所制备的荧光纳米簇探针具有良好的荧光稳定性。
实施例3：
一、将10mg叶酸、22.65mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、10mgN-N-羟基琥珀酰亚胺及40μL三乙胺溶解于20mg无水二甲基亚砜中，在室温下60W超声溶解，形成均匀的混合溶液，将混合溶液用650 r/min磁力搅拌器进行搅拌，反应温度为室温下，反应40min结束，得到溶液活性酯中间体FA-NHS，其中叶酸原料与无水二甲基亚砜的体积比为（10-20）mL；
二、将步骤一得到的溶液FA-NHS装入烧杯中，向其中加入40mg牛血清白蛋白，并用氢氧化钠调节pH值调至10，室温下650 r/min磁力搅拌器进行搅拌20h，得到FA-BSA溶液；
三、将步骤二得到的FA-BSA溶液7000r/min离心冻干，得到FA-BSA粉末。并将40μL氯金酸溶解于4mg去离子水中，加入FA-BSA粉末60W超声处理，滴加3ml氢氧化钠并在37℃温度下650 r/min磁力搅拌器进行搅拌12h，获得具有癌症诊断功能的荧光纳米簇探针。
本实施例荧光纳米簇探针置于300W的紫外灯下辐照0-12 h，探针的荧光强度随着辐照时间的延长，并未发生很大的猝灭现象，表明所制备的荧光纳米簇探针具有良好的荧光稳定性。

Claims (10)

1.一种癌细胞检测功能的金纳米簇材料的制备方法与应用，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、将叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-N-羟基琥珀酰亚胺及三乙胺溶解于无水二甲基亚砜中，在室温下超声溶解，形成均匀的混合溶液，将混合溶液用磁力搅拌器进行搅拌，反应温度为室温下，反应20-60min结束，得到溶液A，即为活性酯中间体；其中叶酸原料与无水二甲基亚砜的体积比为（10-20）mL；
二、将步骤一得到的溶液A装入烧杯中，向其中加入牛血清白蛋白，并用氢氧化钠调节pH值，室温下搅拌20-30h，得到溶液B；
三、将步骤二得到的将溶液B离心冻干溶解于氯金酸水溶液中超声处理，滴加氢氧化钠并在特定温度下搅拌10-15h，获得具有癌症诊断功能的荧光纳米簇探针。
2.根据权利要求1所述的一种荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于：步骤一所述原料为叶酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-N-羟基琥珀酰亚胺、三乙胺、牛血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于：步骤一中超声功率为60~100W。
4.根据权利要求1所述的一种荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于：步骤一中磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为20-60min，反应温度为18-25 ℃。
5.根据权利要求1所述的一种荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于：步骤一中叶酸原料与无水二甲基亚砜的体积比为（10-20）mL。
6.根据权利要求1所述的一种荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于：步骤二中磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为20-30h，反应温度为18-25 ℃。
7.根据权利要求1所述的一种荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于：步骤三中所述离心速率为2000r/min~15000r/min。
8.根据权利要求1所述的一种荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于：步骤三中所步骤四中所超声功率为60~100W。
9.根据权利要求1所述的一种荧光纳米簇探针的制备方法，其特征在于：步骤三中磁力搅拌为600-800 r/min，反应时间为10-15h，反应温度为30-40 ℃。
10.如权利要求1所述方法制备的荧光纳米簇探针在癌症诊断中的应用。
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