CN102727907A - 一种小干扰rna药物的给药系统和制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种siRNA的给药系统和制剂，它的活性成分是聚合物和阳离子脂质形成的包载siRNA的纳米颗粒，该聚合物可为聚乙二醇-聚乳酸或聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)的两嵌段或三嵌段共聚物；该阳离子脂质可为N，N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵或(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵。这种纳米颗粒和制剂能够将siRNA很好的输运到细胞中，并有效沉默靶基因的表达。并且，此siRNA给药体系通过配体或者抗体修饰后，在细胞水平和动物水平都能够更好的沉默靶基因。因而此给药体系在siRNA和类似小核酸药物的给药用于疾病治疗中具有良好的前景。

Description

一种小干扰RNA药物的给药系统和制剂
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)两嵌段/三嵌段共聚物(两亲性高分子聚合物)和阳离子脂质材料共同制备的小干扰RNA(siRNA)的给药系统和制剂。
背景技术
小干扰RNA具有特异性抑制致病基因表达的能力以及高效、多样化的特征，近年来已经在肝炎、艾滋病、老年性黄斑病变、禽流感以及癌症等大量疾病的治疗中显示出良好的应用前景。例如Calendo制药公司研发的基于RNA干扰的CALAA-01制剂经系统给药后在一期临床试验中显示出治疗癌症的效果。有理由相信，基于siRNA的RNA干扰疗法在不久的将来就可能用于临床治疗。然而，在以治疗人类疾病为目的的体内siRNA给药方面面临着巨大挑战。由于siRNA分子本身穿透细胞膜的能力极差，也不具备靶向功能，而且在生理环境中极不稳定，因此目前siRNA药物研发的瓶颈在于siRNA的给药系统和技术。如何增强siRNA在体内的稳定性和穿透细胞膜的能力，以及增强疾病治疗的细胞和组织靶向性等都是siRNA给药系统急切需要解决的问题。因此siRNA的体内给药系统也已成为发展和实施RNA干扰疗法的一个关键所在。
目前用于siRNA给药系统构建的材料包括聚乙烯亚胺(PEI)、去了端肽的精制胶原、一些阳离子脂质体，和化学合成的各种阳离子高分子等。这些载体分子与siRNA溶液互混后通过电荷相互作用得到二者的复合物，从而实现传递siRNA的目的。这类给药系统面临难以放大规模的问题，重复性较差。除了通过电荷相互作用与siRNA形成复合物从而实现siRNA给药的系统和技术外，有部分研究报道了将siRNA包载在高分子中制备纳米尺度制剂的方法，来实现siRNA的体内给药。这类纳米颗粒一般利用聚乳酸、聚乙醇酸或者二者的共聚物来制备，不足之处在于siRNA的包封率非常低(低于30％)，载药量很低，难以满足临床应用的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种核酸药物给药载体，具体涉及一种利用两亲性高分子聚合物和阳离子脂质材料共同制备的核酸药物的给药载体、载体制备方法和药物组合物。这一给药载体组合物具有极高的siRNA包封率，载药量也大为提高。
本发明将siRNA加入到可降解两亲性高分子载体和阳离子脂质的溶液中，通过双乳化的方法将siRNA包埋在纳米颗粒中。加入的阳离子脂质将siRNA的包封率提高到90％以上。这种方法不但可以制备高效包载siRNA纳米颗粒，而且纳米颗粒能有效进入细胞，并从内涵体逃逸，从而有效沉默致病靶基因的表达，并在体内抑制乳腺癌的生长。
本发明所述的核酸药物给药载体由两亲性高分子共聚物和阳离子脂质材料共同制备而成。所述两亲性高分子聚合物是指在一个大分子链上同时含有亲水性和疏水性链段。所述两亲性嵌段共聚物中的亲水性链段可以是聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺类、聚甲基丙烯酸氨基酯类、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸中的一种或两种以上形成的任意均聚物或共聚物。所述两亲性嵌段共聚物中的疏水性链段可以是聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨基酸和聚磷腈中的一种或两种以上形成的任意均聚物或共聚物。在一种较佳的实施方式中，两亲性高分子共聚物为聚乙二醇-聚乳酸或聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)两嵌段/三嵌段共聚物，共聚物形式可以为PEG-PLA、PEG-PLGA、PLA-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLGA。这种嵌段共聚物能够在水介质中自组装成胶束或纳米粒，相对疏水性的PLA或PLGA聚集成疏水性的核，PEG嵌段组装成亲水性的壳，具有稳定胶束、有效躲避生物体内质网系统的捕捉和蛋白质吸附的作用。阳离子脂质在此给药系统中的主要作用是通过静电相互作用提高核酸药物在载体中的载药量和包封率。在一较佳的实施方案中，阳离子脂质材料优选为铵盐型的两亲性脂质材料，例如可以为二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1，2-二棕榈酰基-3一三甲基铵丙烷、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化铵、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰胺盐酸盐、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-O，O’-双-(1H，1H，2H，2H-全氟癸烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、O，O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N-{p-(w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L一谷氨酰胺盐酸盐、9-(w-三甲基铵基丁基)-3，6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-w-三甲基铵基癸酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-{p-(w-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-L一谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基铵基癸基氧基)-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-1-0810)，p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、O，O’，O”，-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷澳化物盐(TC-1-12)，1，2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱等。在本发明的更佳的实施方案中，阳离子脂质优选为N，N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(记为BHEM-Chol)、(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(记为DOTAP)等。
所述聚乙二醇单嵌段的数均分子量为550～10000g/mol，聚乳酸或聚(乳酸-乙醇酸)嵌段的数均分子量为4800～51000g/mol。
所述聚(乳酸-乙醇酸)嵌段中丙交酯/乙交酯单体的聚合度比例可为75/25～50/50。
所述阳离子脂质BHEM-Chol分子量为655.5g/mol，所述阳离子脂质DOTAP分子量为698.5g/mol，所述阳离子脂质DOTMA分子量为670.6g/mol。本发明基于这三种阳离子脂质，而不限于这三种脂质，类似阳离子脂质均可用于制备本发明所述的核酸药物给药载体，实现本发明的目的。
上述嵌段共聚物，可为PEG550-PLA28600、PEG2000-PLA12500、PEG5000-PLA5000、PEG5000-PLA25000、PEG5000-PLA51000、PEG10000-PLA15000、PEG10000-PLGA10000(50/50)、PEG10000-PLGA50000(75/25)、PLA6300-PEG1200-PLA6300、PLA4800-PEG5000-PLA4800、PLA4800-PEG10000-PLA4800，但不限于上述组成。
由上述两亲性高分子聚合物和阳离子脂质材料共同制备的给药载体能够形成纳米颗粒，所述纳米颗粒的直径为50-250nm。在较佳的实施方式中，本发明的纳米颗粒表面可进行化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。
本发明的核酸转运用载体组合物适用的核酸，对其种类或结构没有特殊的限定。作为该核酸的具体例，可以为siRNA，mRNA，tRNA，rRNA，cDNA，miRNA(微RNA)、核酶、反义寡核普酸、质粒DNA、肽核酸、三链形成型寡核普酸(Triplex Forming Oligonucleotide，TFO)、基因等。其中，本发明的核酸转运用载体组合物在将siRNA向细胞内转运方面特别有效。本发明的核酸转运用载体适用的核酸，可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸，另外，也可以是通过化学合成制备的核酸。进而，上述核酸可以是单链、双链、三链中的任一种，并且对其分子量也没有特殊的限定。另外，本发明中，核酸可以为被化学、酶或肽修饰的核酸。本发明中，核酸可以单独使用1种，也可以2种以上适当地组合使用。在一较佳的实施方式中，本发明的核酸转运用载体组合物优选转运小干扰核酸(siRNA)或其类似物。
本发明还提供了一种药物组合物，该组合物包含上述的核酸转运用载体组合物及核酸。药物组合物中适用的核酸，对其种类或结构没有特殊的限定。作为该核酸的具体例，可以为siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反义寡核普酸、质粒DNA、肽核酸、三链形成型寡核普酸(Triplex Forming Oligonucleotide，TFO)、基因等。在一较佳的实施方式中，优选为小干扰核酸(siRNA)。在药物组合物中，所述核酸、阳离子脂质、两亲性高分子聚合物的用量为0.2/1.0/25.0～1.8/1.0/25.0，优选为0.2/1.0/25.0。上述药物组合物中，除核酸类药物外，还可同时包载其它具有协同治疗作用或者降低毒副作用的药物。
本发明还提供了上述药物组合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：将两亲性嵌段共聚物和阳离子脂质溶于油相(氯仿等)中，加入siRNA水溶液后超声(80瓦，30秒)形成初始乳液，将初始乳液加入到水相中并再次超声(80瓦，2分钟)乳化，将乳液加入到水相中，减压(1000帕)下除去有机溶剂，离心(4℃，30000g，1h)收集纳米颗粒。
本发明还提供了一种核酸导入方法，通过使上述药物组合物与细胞接触，将核酸导入到细胞内。所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为病理状态下或非正常生理状态下的哺乳动物细胞，所述核酸优选为小干扰核酸(siRNA)。
本发明还提供了两亲性高分子聚合物和阳离子脂质的组合在制备核酸转运用载体组合物中的用途及核酸转运用载体组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤优选为乳腺肿瘤或者肝脏肿瘤。
本发明使用的嵌段共聚物具有良好的生物相容性和可降解性，其物理、化学性能可通过调节聚合物的组成而调节。例如，增加聚合物中PLA比例时，纳米颗粒输运siRNA进入细胞能力增加。
有益效果
本发明提供了一种利用两亲性嵌段聚合物通过双乳化的方法制备包载siRNA的给药系统和制剂。制备得到的纳米颗粒具有良好的稳定性，制备方法简单，siRNA包封率和载药量高，能保护siRNA免于降解，并能将核酸药物高效率地转运至细胞内。另外，由于本发明提供的核酸药物给药载体具有较高的生物相容性和可降解性，因此对生物体的潜在毒性较低，具有高的生物安全性。该给药系统和制剂主要适用于小干扰RNA和类似小核酸药物的给药制剂等领域。
本发明利用上述给药系统和制剂，输送特异性siRNA，在细胞和动物水平证明了其沉默靶基因表达的功效，以及沉默癌基因Plk1表达并抑制乳腺癌生长的效果。
附图说明
图1为聚合物和阳离子脂质通过双乳化方法制备得到的给药系统的生物相容性检测。
图2为包载FAM-siRNA的纳米颗粒与HepG2细胞培养2小时后在细胞内分布的激光共聚焦显微镜照片。其中细胞内红色荧光来源于Alexa 568-phalloidin标记的细胞骨架；绿色荧光来源于FAM-siRNA；蓝色荧光来源于DAPI标记的细胞核。
图3为包载siPlk1的纳米颗粒进入HepG2细胞后下调Plk1的mRNA水平的效果图。
图4为给药系统在动物水平的生物效应评价效果图。图(A)为尾静脉注射包载siLuci的给药系统抑制肝癌原位种植模型小鼠表达luciferase的效果图；图(B)为尾静脉注射包载siPlk1的给药系统抑制小鼠原位植入乳腺癌生长的效果图。
图5为半乳糖修饰的靶向给药系统的构建以及生物效应评价的效果图。图(A)为HOOC-PEG5000-PLA21030和Gal-PEG5000-PLA21030的1H NMR分析图谱；图(B)为流式细胞计数检验靶向给药系统在Hepa 1-6细胞的内吞；图(C)为包载siapoB的靶向给药系统进入Hepa1-6细胞后下调apoB的mRNA水平的效果图；图(D)为包载siapoB的靶向给药系统输运siRNA沉默小鼠肝细胞apoB蛋白表达的效果图。
图6为单链片段抗体修饰的靶向给药系统的构建以及生物效应评价的效果图。图(A)为Mal-PEG5000-PLA22070的1H NMR分析图谱；图(B)为流式细胞计数检验靶向给药系统在BT474细胞的内吞；图(C)为包载siPlk1的靶向给药系统进入BT474细胞后下调Plk1的mRNA水平的效果图；图(D)为尾静脉注射包载siPlk1的的靶向给药系统抑制小鼠原位植入乳腺癌生长的效果图。
具体实施方式
本发明所述的核酸药物给药载体由两亲性高分子共聚物(A成分)和阳离子脂质材料(B成分)共同制备而成。所述两亲性高分子聚合物是指在一个大分子链上同时含有亲水性和疏水性链段。所述两亲性嵌段共聚物中的亲水性链段可以是聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺类、聚甲基丙烯酸氨基酯类、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸中的一种或两种以上形成的任意均聚物或共聚物。所述两亲性嵌段共聚物中的疏水性链段可以是聚乳酸、聚己内酯、聚乙交酯、聚氨基酸和聚磷腈中的一种或两种以上形成的任意均聚物或共聚物。这种嵌段共聚物能够在水介质中自组装成胶束或纳米粒，相对疏水性链段聚集成疏水性的核，相对亲水性链段组装成亲水性的壳，具有稳定纳米颗粒、有效躲避生物体内质网系统的捕捉和蛋白质吸附的作用。阳离子脂质在此给药系统中的主要作用是通过静电相互作用提高核酸药物在载体中的载药量和包封效率。作为本发明的核酸转运用载体组合物中使用的铵盐型阳离子性脂质(以下，有时也表示为“B成分”)，只要在药理学上允许即可，没有特殊限制。作为其具体例，可以举出二甲基二(十八烷基)溴化铵盐(DDAB)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1，2-二棕榈酰基-3一三甲基铵丙烷、1，2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐(DMRIE)、二油酰氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵(DORIE)、二甲基二(十二烷基)溴化铵、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰胺盐酸盐、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-O，O’-双-(1H，1H，2H，2H-全氟癸烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、O，O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N-{p-(w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L一谷氨酰胺盐酸盐、9-(w-三甲基铵基丁基)-3，6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-w-三甲基铵基癸酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-{p-(w-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-L一谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基铵基癸基氧基)-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-1-0810)、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐(MC-3-0810)、O，O’，O”，-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷澳化物盐(TC-1-12)、1，2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱等。上述铵盐型阳离子性脂质可以单独使用1种，也可以任意组合2种以上使用。
另外，本发明的核酸转运用载体组合物中，对(A)成分和(B)成分的配合比率没有特殊的限制，从将核酸有效地转运至细胞内的观点考虑，相对于100重量份(A)成分，(B)成分可以为0-50重量份。另外，相对于本发明的核酸转运用载体的总量，(A)成分和(B)成分的总量例如可以为10-99.999重量％。
本发明的核酸转运用载体组合物，除上述(A)及(B)成分之外，还可以含有油性基剂(以下，有时也称为(C)成分)。配合油性基剂，利用其特性，由此能够控制核酸转运用载体组合物的核酸导入效率。例如通过配合油性基剂调整核酸转运用载体组合物的比重，可以控制细胞和核酸转运用载体组合物的接触性，改善体外的导入效率。另外，例如通过配合具有温度感受性功能的油剂作为油性基剂，能够在规定的温度条件下使核酸载体的芯破碎，诱发细胞表面的波动，提高核酸的导入效率。进而，例如通过配合具有外部刺激破碎性的油剂作为油性基剂，可以通过外部刺激使核酸载体组合物的芯破碎，诱发细胞表面的波动，提高核酸的导入效率。
作为本发明的核酸转运用载体组合物中配合的油性基材，例如可以举出，全氟化碳、全氟戊烷、溴代全氟辛烷、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、精制大豆油、氢化大豆油、大豆油非皂化物、角鲨烯、蓖麻油、丁香油、三油酸脱水山梨糖醇酯、松节油、红花油、红花油脂肪酸、油酸、棕榈油、菜子油、杂醇油、橄榄油、亚麻仁油、芝麻油、叶绿素油、巴豆油、佛手油、雪松油、橙油、茴香油、桉树油、玉米油、熏衣草油、马郁兰油、柠檬油、棉籽油、椰子油、蛋黄油、玫瑰花油、松油、杏仁油、花生油、山茶油、白樟油、春黄菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生姜油、罗马春黄菊油、蛇油、留兰香油、向日葵油、可可脂、小麦胚芽油、氧化锌油、氢化油、氢化植物油、轻质液体石蜡、液体石蜡、中链脂肪酸三甘油酯、貂油、苦橙油、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、聚氧乙烯氢化蓖麻油100、聚氧乙烯氢化蓖麻油20、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油5、聚氧乙烯氢化蓖麻油50、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚氧基35蓖麻油、操作油等。上述油性基剂中，全氟戊烷具有温度感受性，具有在29.5℃下通过沸腾气化的特性。另外，全氟己烷、溴代全氟辛烷、及全氟三丁基胺具有下述特性，即具有外部刺激破碎性，在由超声波照射产生的刺激等来自外部的刺激作用下，使载体组合物的芯产生空腔，使其破碎。
含有该油性基剂时，作为该油性基剂的比例，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特殊的限制，例如可以为下述比例，即相对于100重量份上述(A)成分及(B)成分的总量，该油性基材为0.1-50重量份，优选为1-30重量份，更优选为5-20重量份。
进而，本发明的核酸转运用载体组合物中根据需要也可以含有膜融合性脂质(辅助脂质)。通过含有上述膜融合性脂质，能够进一步提高核酸向细胞内的转运效率。作为上述膜融合性脂质，例如可以举出，二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱、反式磷脂酰基乙醇胺，1，2-双(10，12-二十三烷二酰基)-磷酸乙醇胺、1，2-二反油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二(十六烷基)磷酸乙醇胺、1，2-二己酰基磷酸乙醇胺、1，2-二月桂酰基磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1，2-二硬脂酰基磷酸乙醇胺，1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺，1-棕榈酰基-2-(10，12-二十三烷二酰基)磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N一己酰胺、N，N-二甲基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N，N-二甲基一1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺.N-十二烷酰基-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p一马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸盐]、二棕榈酰磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酸亚胺甲基)环己烷-羧酸盐]、1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酰胺]、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4(p-马来酰亚胺苯基)丁酸盐]、N-甲基-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-甲基-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐、1，2一-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶二硫)丙酸盐]、N-(琥珀酰)-1，2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-(琥珀酰)-1，2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。其中，在本发明的核酸转运用载体组合物中优选使用二油酰基磷脂酰乙醇胺。
含有该膜融合性脂质时，作为该膜融合性脂质的比例，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特殊的限制，可以举出下述比例，即相对于100重量份上述(A)成分及(B)成分的总量，该膜融合性脂质为1-500重量份，优选为10-250重量份，更优选为25-100重量份。
根据使用形态，本发明的核酸转运用载体组合物可以含有等渗剂、赋形剂、稀释剂、增稠剂、稳定剂、缓冲剂、保存剂等各种添加剂。上述添加剂的配合量，可以根据核酸转运用载体的使用形态适当地设定。
本发明的核酸转运用载体组合物通过混合上述(A)成分、(B)成分、及根据需要混合其他成分而制造。
本发明的核酸转运用载体组合物适用的核酸，对其种类或结构没有特殊的限定。作为该核酸的具体例，可以为siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反义寡核普酸、质粒DNA、肽核酸、三链形成型寡核酸(Triplex Forming Oligonucleotide，TFO)、基因等。其中，本发明的核酸转运用载体组合物在将siRNA向细胞内转运方面特别有用。本发明的核酸转运用载体适用的核酸，可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸，另外，也可以是通过化学合成制备的核酸。进而，上述核酸可以是单链、双链、三链中的任一种，并且对其分子量也没有特殊的限定。另外，本发明中，核酸可以为被化学、酶或肽修饰的核酸。本发明中，核酸可以单独使用1种，也可以2种以上适当地组合使用。
聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)或其三嵌段聚合物具有两亲性，和阳离子脂质通过双乳化方法形成纳米尺度的颗粒，这类纳米颗粒具有亲水性的聚乙二醇外壳，而且颗粒的尺寸与共聚物的组成相关，可以调控。有意义的是，加入阳离子脂质显著提高siRNA的包封率和载药量。采用这种纳米颗粒作为载体实现了包载siRNA纳米颗粒的内吞，并达到基因沉默的效果。
包载siRNA的纳米颗粒通过双乳化的方法制备：将两嵌段共聚物和阳离子脂质溶于油相(例如氯仿)中，加入siRNA溶液后超声下形成初始乳液后，将初始乳液加入到1％PVA水溶液中并再次超声乳化，将乳液加入到0.3％PVA水溶液中，减压下(1000pa)除去有机溶剂，离心收集纳米颗粒。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
实施例中所用原料来源及处理方法：
外消旋丙交脂(d，l-LA)，纯度≥99％，使用前减压下升华纯化。
PEG550-PLA28600、PEG2000-PLA12500、PEG10000-PLA15000、PLA6300-PEG1200-PLA6300、PLA4800-PEG5000-PLA4800、PLA4800-PEG10000-PLA4800购于Polymer Source公司。PEG5000-PLA25000、PEG5000-PLA51000购于Alkermes公司。PEG5000-PLA5000购于Aldrich公司。PEG10000-PLGA10000(50/50)、PEG10000-PLGA50000(75/25)购于济南岱罡公司。一端基为羧基一端基为羟基的异官能团的PEG(Mn为5000g/mol，HOOC-PEG5000-OH)，一端基为马来酰亚胺另一端基为羟基的异官能团的PEG(Mn为5000g/mol，Mal-PEG5000-OH)购于Creative PEGWorks公司。
N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)购于国药集团化学试剂有限公司。
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、氨基半乳糖(Gal-NH2)、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购于Aldrich公司。
聚乙烯醇(PVA，88％hydrolyzed，Mw＝22000)购于Acros Organics公司。
DOTAP和DOTMA购于Avanti Polar Lipids公司。
BHEM-Chol为本发明合成，具体合成步骤如下：在500毫升单口瓶加入2-溴乙胺氢溴酸盐(17.4g，85.0mmol)、氯甲酸胆固醇酯(34.7g，77.3mmol)，溶解于-30℃的氯仿溶液中，然后将三乙胺(24mL，172mmol)滴加到上述溶液中。在室温下反应过夜后，用1M盐酸的饱和氯化钠溶液(150mL)洗涤三次并用饱和氯化钠溶液洗涤一次(150mL)。有机相用无水硫酸镁干燥并在减压下除去有机溶剂。粗产物用乙醇和丙酮各重结晶(结晶条件)一次后得到产物N-(2-溴乙基)氨基甲酸胆固醇酯，产率为73％。将得到的N-(2-溴乙基)氨基甲酸胆固醇酯(4.8g，7.8mmol)和N-甲基二乙醇胺(1.2g，9.7mmol)加入到50毫升干燥的甲苯中，回流过夜。反应溶液沉淀到大量的乙醚中，过滤后收集沉淀并真空干燥。粗产物在乙醇中重结晶(结晶条件)两次后得到白色固体，产率为62％。
异辛酸亚锡(国药集团化学试剂有限公司)，先用对二甲苯共沸两次，然后再减压蒸馏，收集152℃(20～40Pa)的馏分用于聚合反应。
Alexa 568-phalloidin、Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。RNeasymini-kits购于Qiagen公司。RimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis kit、
Figure BDA0000055207950000101
 PremixEx Taq购于Takara公司。脂蛋白B(apoB)定量检测试剂盒购于R&D systems公司。D-luciferin购于Xenogen公司。
稳定表达luciferase的HepG2细胞、MDA-MB-435s、BT474细胞(HER2受体高表达细胞系)细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
siRNA是一种由二十多个核苷酸组成的双链小分子RNA，带有负电荷。
以下实验使用中的siPlk1，对应反义链序列为：UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT。
siLuci1，对应反义链序列为：CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT。
siapoB，对应反义链序列为：AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACACdTdT
对照阴性siRNA(siN.C.)，对应反义链序列为：AACCACUCAACUUUUUCCCAAdTdT。
FAM-siRNA为荧光染料FAM标记的siN.C.。
以上siRNA均由苏州瑞博制药技术有限公司合成。
未经说明的其它试剂直接使用。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、siRNA给药系统和制剂的制备
通过利用两亲性嵌段聚合物和阳离子脂质通过双乳化方法制备包载siRNA的纳米颗粒。使用的聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)两嵌段/三嵌段共聚物为上述的聚合物PEG550-PLA28600、PEG2000-PLA12500、PEG5000-PLA5000、PEG5000-PLA25000、PEG5000-PLA51000、PEG10000-PLA15000、PEG10000-PLGA10000(50/50)、PEG10000-PLGA50000(75/25)、PLA6300-PEG1200-PLA6300、PLA4800-PEG5000-PLA4800、PLA4800-PEG10000-PLA4800(下标为分子量和比例)。使用的阳离子脂质分别为上述的BHEM-Chol、DOTAP、DOTMA。通过改变加入的阳离子脂质质量、加入的siRNA质量、使用的聚合物种类、使用的阳离子脂质种类来制备得到具有不同性质的siRNA给药系统。
1、阳离子脂质BHEM-Chol质量对包载siRNA纳米颗粒的影响
通过双乳化的方法使用不同质量的阳离子脂质BHEM-Chol制备包载siRNA的纳米颗粒。其中，使用的聚合物为25mg的PEG5000-PLA25000和siRNA为0.2mg作为实例。制备时，加入的阳离子脂质质量分别为0.0mg、0.1mg、0.5mg、1.0mg、2.5mg、5.0mg，以研究加入不同质量的阳离子脂质对制备得到的包载siRNA纳米颗粒的性能影响。
通过双乳化的方法制备包载siRNA的纳米颗粒，具体方法为：将聚合物PEG5000-PLA25000(25mg)和不同质量BHEM-Chol溶于0.5mL氯仿中，加入siRNA(0.025mL，0.2mg)溶液后超声下(80瓦，30秒)形成初始乳液后，将初始乳液加入到1.5mL 1％PVA水溶液中并再次超声乳化(80瓦，2分钟)，将乳液加入到25mL的0.3％PVA水溶液中，减压下(1000帕)挥发有机溶剂，离心(4℃，30000g，1h)收集纳米颗粒；并用水重悬2次并离心收集以除去PVA，样品冻干。
a)siRNA包封率的测定
将制备的包载FAM-siRNA纳米颗粒的离心后，收集并精确定量上清液体积，记为V上 清。通过高效液相色谱(HPLC)来检测上清液中FAM-siRNA的浓度，记为C上清。HPLC由Waters1525双向泵、Waters 2475荧光检测器、1500柱温箱及C18分离柱组成，流动相为乙腈/三乙胺乙酸缓冲液(0.1M，pH 7.4)，流动相比例为28∶72(v/v)，流速为0.5mL min-1，检测器温度30℃，荧光检测器激发波长为485nm，发射波长为535nm。通过Breeze软件对结果进行分析，各组成纳米颗粒的载药率与载药效率见表1。
包封率(100％)＝(1-C上清×V上清/M总siRNA)×100％
载药量(100％)＝(M总siRNA-C上清×V上清)/M纳米颗粒×100％
M总siRNA表示制备中加入的总的siRNA的质量，M纳米颗粒表示纳米颗粒的总质量。
从表1可见，不加入阳离子脂质时，siRNA的包封率仅为26.2％，而加入阳离子脂质后，siRNA包封率明显增加。譬如，加入1.0mg BHEM-Chol时，siRNA包封率增加到95.7％。继续增加阳离子脂质时，siRNA包封率保持在95％以上。
b)纳米颗粒的粒径和zeta电势
利用型号为Malvern Zetasizer Nanao ZS90的动态光散射仪检测包载siRNA的纳米颗粒的粒径与粒径分布，纳米颗粒浓度为0.1mg/mL。
从表1可见，改变加入的siRNA和阳离子脂质的量时，制备得到的纳米颗粒的粒径基本不变，在160nm-180nm之间。
表1.不同BHEM-Chol制备的包载siRNA纳米颗粒各个组份具体组成及性质
Figure BDA0000055207950000122
Figure BDA0000055207950000131
从表1可见，加入的siRNA和聚合物量固定时，zeta电势随着加入的阳离子脂质的量增加。纳米颗粒的电势会影响纳米颗粒在体内的循环，纳米颗粒的电势接近中性能够更有效的避免被体内的免疫系统清除，从而能够更好的富集到肿瘤部位。因此，从表1可知，通过调节加入的阳离子脂质的质量，此给药系统能够优化出合适的体系用于siRNA给药。
从表1可知，当阳离子脂质的量为1.0mg时，siRNA基本被包载在纳米颗粒中。但是增加阳离子脂质的量，载药量降低，因此siRNA/BHEM-Chol/PEG5000-PLA25000＝0.2/1.0/25.0是BHEM-Chol和PEG5000-PLA25000固定为1.0mg和25.0mg时比较理想的siRNA载药体系。
2、不同的阳离子脂质制备包载siRNA的纳米颗粒制备
通过双乳化的方法使用不同种类的阳离子脂质制备包载siRNA的纳米颗粒。其中，使用聚合物PEG5000-PLA25000(25mg)和siRNA(0.2mg)作为实例。制备时，加入的阳离子脂质质量为1.0mg，使用的阳离子脂质分别为BHEM-Chol、DOTAP、DOTMA。
具体方法为：将聚合物PEG5000-PLA25000(25mg)和阳离子脂质(1.0mg)溶于0.5mL氯仿中，加入siRNA(0.025mL，0.2mg)溶液后超声下(80瓦，30秒)形成初始乳液后，将初始乳化加入到1.5mL 1％PVA水溶液中并再次超声乳化(80瓦，2分钟)，将乳液加入到25mL的0.3％PVA水溶液中，减压下(1000帕)挥发有机溶剂，离心(4℃，30000g，1h)收集纳米颗粒；并用水重悬2次并离心收集以除去PVA，样品冻干后备用。
siRNA包封率的测定、纳米颗粒的粒径和zeta电势的测定方法如上所述，结果列入表2中。
从表2可见，加入不同质量的阳离子脂质时，siRNA包封率基本在95％左右。而且制备得到的纳米颗粒的粒径基本不变，在160nm-170nm之间，并且包载siRNA的纳米颗粒的电势接近。
从表2可知，阳离子脂质的种类对包载siRNA的纳米颗粒性质影响不大。阳离子脂质在此给药系统中的主要作用是通过静电相互作用提高核酸药物在载体中的载药量和包封效率。而使用的这三类阳离子脂质的分子量接近和电荷一致，所以得到的包载siRNA的纳米颗粒性质类似。同样，这也说明此给药系统阳离子脂质不限于此这几种，其他阳离子脂质同样使用于此体系。
表2.不同的阳离子脂质制备的包载siRNA纳米颗粒各个组份具体组成及性质
3、siRNA的质量对包载siRNA的纳米颗粒的影响
通过双乳化的方法使用不同质量的siRNA制备包载siRNA的纳米颗粒制备。其中，使用的聚合物和阳离子脂质分别以PEG5000-PLA25000(25mg)和BHEM-Chol(1.0mg)作为实例。制备时，加入的siRNA质量分别为0.0mg、0.2mg、0.6mg、1.8mg，以研究加入不同质量的siRNA对制备得到的包载siRNA纳米颗粒的性能影响。
具体方法为：将聚合物PEG5000-PLA25000(25mg)和BHEM-Chol(1.0mg)溶于0.5mL氯仿中，加入siRNA(0.025mL，0.2mg)溶液后超声下(80瓦，30秒)形成初始乳液后，将初始乳液加入到1.5mL 1％PVA水溶液中并再次超声乳化(80瓦，2分钟)，将乳液加入到25mL的0.3％PVA水溶液中，减压下(1000帕)挥发有机溶剂，离心(4℃，30000g，1h)收集纳米颗粒；并用水重悬2次并离心收集以除去PVA，样品冻干后备用。
siRNA包封率的测定、纳米颗粒的粒径和zeta电势的测定方法如上所述，结果列入表3中。
从表3可见，BHEM-Chol和聚合物PEG5000-PLA25000如上所述固定时，包封率随着加入的siRNA的质量增加而略有降低。当加入的siRNA的质量低于0.2mg时，siRNA包载效率高于95％。但是继续增加siRNA质量，siRNA包封率降低，但是载药量增加。
从表3可见，改变加入的siRNA量时，制备得到的纳米颗粒的粒径基本不变。
从表3可见，加入1.0mg BHEM-Chol和25.0mg聚合物PEG5000-PLA25000固定时，得到的包载siRNA纳米颗粒的zeta电势从随着加入的siRNA的质量增加而降低。纳米颗粒的电势会影响纳米颗粒在体内的循环，纳米颗粒的电势接近中性能够更有效的避免被体内的免疫系统清除，从而能够更好的富集到肿瘤部位。因此，从表1和表3可知，通过调节加入的阳离子脂质和siRNA的质量的质量，此给药系统能够优化出合适的体系用于siRNA给药。
表3.包载不同质量的siRNA纳米颗粒各个组份具体组成及性质
Figure BDA0000055207950000151
Figure BDA0000055207950000161
4、使用不同分子量和组成的聚合物制备包载siRNA的纳米颗粒
使用不同的聚乙二醇-聚乳酸或聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)两嵌段/三嵌段共聚物制备包载siRNA的纳米颗粒。
通过双乳化的方法制备包载siRNA的纳米颗粒，具体方法为：将聚合物(25mg)和BHEM-Chol(1.0mg)溶于0.5mL氯仿中，加入siRNA(0.025mL，0.2mg)溶液后超声下(80瓦，30秒)形成初始乳液后，将初始乳化加入到1.5mL 1％PVA水溶液中并再次超声乳化(80瓦，2分钟)，将乳液加入到25mL的0.3％PVA水溶液中，减压下(1000帕)挥发有机溶剂，离心(4℃，30000g，1h)收集纳米颗粒；并用水重悬2次并离心收集以除去PVA，样品冻干后备用。
其中，制备时，使用的聚合物为PEG550-PLA28600、PEG2000-PLA12500、PEG5000-PLA5000、PEG5000-PLA25000、PEG5000-PLA51000、PEG10000-PLA15000、PEG10000-PLGA10000(50/50)、PEG10000-PLGA50000(75/25)、PLA6300-PEG1200-PLA6300、PLA4800-PEG5000-PLA4800、PLA4800-PEG10000-PLA4800。
siRNA包封率的测定、纳米颗粒的粒径和zeta电势的测定方法如上所述，结果列入表4中。
从表4可见，加入1.0mg BHEM-Chol和25.0mg聚合物固定时，siRNA基本包载在纳米颗粒中，包封率基本在90％以上。但是，当PEG比例较高时，siRNA包载效率会有一定程度下降。例如当使用的聚合物PEG10000-PLGA10000(50/50)或PLA4800-PEG10000-PLA4800时，siRNA包载效率下降到85％左右。
从表4可见，得到的包载siRNA纳米颗粒的zeta电势随聚合物不同，而有所变化。从上述实施例可知，纳米颗粒的电势会影响纳米颗粒在体内的循环，纳米颗粒的电势接近中性能够更有效的避免被体内的免疫系统清除，从而能够更好的富集到肿瘤部位。因此，从表1、表3以及表4可知，通过调节加入的阳离子脂质和siRNA的质量的质量以及使用的聚合物，此给药系统能够优化出合适的体系用于siRNA给药。
从表4可见，改变加入的聚合物时，制备得到的纳米颗粒的粒径变化较大，在82nm-227nm之间。制备时使用的聚合物疏水链段对制备得到的包载siRNA纳米颗粒的粒径影响较大。例如使用疏水链段增长的聚合物PEG5000-PLA5000、PEG5000-PLA25000和PEG5000-PLA51000时。得到的包载siRNA纳米颗粒粒径分别为82、167、225nm。
表4.使用不同嵌段聚合物制备的包载siRNA纳米颗粒的性质
Figure BDA0000055207950000171
Figure BDA0000055207950000181
从上述实施例可知，包载siRNA的纳米颗粒的电势可以通过加入的阳离子脂质的量或者加入的siRNA量来调节；包载siRNA的纳米颗粒的粒径可以通过使用的聚合物来调控。因此，可以根据疾病的不同，来调节不同因素来制备理想的给药系统。
实施例2、此给药系统在细胞水平的效应评价
根据实施例1可知，siRNA/阳离子脂质/聚合物＝0.2/1.0/25.0时，得到的siRNA给药系统具有较高的siRNA包封率和载药量。故以此实例来说明此给药系统的生物学效应。使用的聚合物为PEG550-PLA28600、PEG2000-PLA12500、PEG5000-PLA5000、PEG5000-PLA25000、PEG5000-PLA51000、PEG10000-PLA15000、PEG10000-PLGA10000(50/50)、PEG10000-PLGA50000(75/25)、PLA6300-PEG1200-PLA6300、PLA4800-PEG5000-PLA4800、PLA4800-PEG10000-PLA4800，使用的阳离子脂质为BHEM-Chol。
1、不同聚合物制备的纳米颗粒生物相容性评价
用实施例1中所述方法制备未包载siRNA的纳米颗粒。通过MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)比色法检测纳米颗粒对人肝癌细胞HepG2的毒性。
制备未包载siRNA的纳米颗粒具体方法为：将聚合物(25mg)和BHEM-Chol(1.0mg)溶于0.5mL氯仿中，加入蒸馏水(0.025mL)溶液后超声下(80瓦，30秒)形成初始乳液后，将初始乳液加入到1.5mL 1％PVA水溶液中并再次超声乳化(80瓦，2分钟)，将乳液加入到25mL的0.3％PVA水溶液中，减压下(1000帕)挥发有机溶剂，离心(4℃，30000g，1h)收集纳米颗粒；并用水重悬2次并离心收集以除去PVA，样品冻干后备用。
使用的聚合物为PEG550-PLA28600、PEG2000-PLA12500、PEG5000-PLA5000、PEG5000-PLA25000、PEG5000-PLA51000、PEG10000-PLA15000、PEG10000-PLGA10000(50/50)、PEG10000-PLGA50000(75/25)、PLA6300-PEG1200-PLA6300、PLA4800-PEG5000-PLA4800、PLA4800-PEG10000-PLA4800得到的不包载siRNA纳米颗粒为NP(PEG550-PLA28600)、NP(PEG2000-PLA12500)、NP(PEG5000-PLA5000)、NP(PEG5000-PLA25000)、NP(PEG5000-PLA51000)、NP(PEG10000-PLA15000)、NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))、NP(PEG10000-PLGA50000(75/25))、NP(PLA6300-PEG1200-PLA6300)、NP(PLA4800-PEG5000-PLA4800)、NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)。
MTT比色法检测上述制备的纳米颗粒对人肝癌细胞HepG2的毒性。具体方法如下：首先在96孔板上每孔种10000个细胞/100μL DMEM培养基(10％初生牛血清)，在CO2培养箱中(37℃，CO2浓度为5％)培养24小时后，分别将浓度为1/4、1/2、1、2g L-1的上述纳米颗粒与HepG2细胞共培养24小时后测细胞活力。结果见图1。由图可见，当纳米颗粒浓度为2g L-1时，90％以上的细胞仍存活，证明这种脂质聚合物共同制备的纳米颗粒具有良好的生物相容性。
2、不同聚合物制备的包载siRNA纳米颗粒进入细胞的能力
用实施例1中所述方法制备包载FAM-siRNA的纳米颗粒来研究此给药系统的细胞内吞行为。其中，siRNA/阳离子脂质/聚合物＝0.2/1.0/25.0。使用FAM标记的siRNA(FAM-siRNA)，阳离子脂质为BHEM-Chol，聚合物为使用的聚合物为PEG550-PLA28600、PEG2000-PLA12500、PEG5000-PLA5000、PEG5000-PLA25000、PEG5000-PLA51000、PEG10000-PLA15000、PEG10000-PLGA10000(50/50)、PEG10000-PLGA50000(75/25)、PLA6300-PEG1200-PLA6300、PLA4800-PEG5000-PLA4800、PLA4800-PEG10000-PLA4800，得到的包载FAM-siRNA纳米颗粒为NP(PEG550-PLA28600)、NP(PEG2000-PLA12500)、NP(PEG5000-PLA5000)、NP(PEG5000-PLA25000)、NP(PEG5000-PLA51000)、NP(PEG10000-PLA15000)、NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))、NP(PEG10000-PLGA50000(75/25))、NP(PLA6300-PEG1200-PLA6300)、NP(PLA4800-PEG5000-PLA4800)、NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)。
将包载FAM-siRNA纳米颗粒(FAM-siRNA终浓度为200nM)与人肝癌HepG2细胞(24孔板，5×104细胞/孔)在37℃共同培养2小时后，使用4％多聚甲醛固定细胞15min。以PBS洗涤三遍后，用丙酮对细胞穿膜(-20℃，5min)；最后用Alexa 568-phalloidin对细胞骨架进行染色，用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行复染，封片后使用型号为Zeiss LSM 710的激光共聚焦显微镜进行观察。结果见图2。
图2中，细胞内红色荧光来源于Alexa 568-phalloidin标记的细胞骨架；绿色荧光来源于FAM-siRNA；蓝色荧光来源于DAPI标记的细胞核。通过三种颜色叠加的结果可知2小时培养后，纳米颗粒均能有效进入细胞胞浆中，呈现出颗粒状分布。
从图2中绿色荧光强度对比可知，NP(PEG5000-PLA5000)、NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))、NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)三组的荧光强度最低。而上述三个纳米颗粒使用的siRNA量和阳离子脂质量均一样，不同的是使用的聚合物分别为PEG5000-PLA5000、PEG10000-PLGA10000(50/50)、和PLA4800-PEG10000-PLA4800，这三个聚合物中PEG均较高(50％)。PEG可能降低纳米颗粒被内吞的能力。
3、包载siRNA的纳米颗粒沉默靶基因的表达
用实施例1中所述方法制备包载siRNA的纳米颗粒来研究此给药系统的沉默靶基因表达的效果。其中，siRNA/阳离子脂质/聚合物＝0.2/1.0/25.0。使用的siRNA分别为siPlk1和si N.C.，阳离子脂质为BHEM-Chol，聚合物为PEG550-PLA28600、PEG2000-PLA12500、PEG5000-PLA5000、PEG5000-PLA25000、PEG5000-PLA51000、PEG10000-PLA15000、PEG10000-PLGA10000(50/50)、PEG10000-PLGA50000(75/25)、PLA6300-PEG1200-PLA6300、PLA4800-PEG5000-PLA4800、PLA4800-PEG10000-PLA4800，得到的包载FAM-siRNA纳米颗粒为NP(PEG550-PLA28600)、NP(PEG2000-PLA12500)、NP(PEG5000-PLA5000)、NP(PEG5000-PLA25000)、NP(PEG5000-PLA51000)、NP(PEG10000-PLA15000)、NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))、NP(PEG10000-PLGA50000(75/25))、NP(PLA6300-PEG1200-PLA6300)、NP(PLA4800-PEG5000-PLA4800)、NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)。
Plk1有助于促进和加速哺乳动物细胞有丝分裂，并在多种肿瘤细胞中高表达。通过沉默其表达，可以抑制肿瘤生长。
将HepG2细胞以1×105细胞/孔的密度接种于6孔板，37℃培养24小时后，分别进行如下处理，每个处理组设置1个复孔：
处理1(对照组)：加入等体积PBS溶液。
处理2(Lipofectamine组)：用载siPlk1的Lipofectamine 2000溶液处理细胞，siPlk1终浓度为50nM，Lipofectamine 2000所用体积为1.25μL。
处理3(裸siPlk1组)：加入等体积siPlk1溶液，siPlk1终浓度为200nM。
处理4(NP(PEG550-PLA28600)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG550-PLA28600)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理5(NP(PEG550-PLA28600)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG550-PLA28600)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理6(NP(PEG2000-PLA12500)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG2000-PLA12500)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理7(NP(PEG2000-PLA12500)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG2000-PLA12500)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理8(NP(PEG5000-PLA5000)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA5000)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理9(NP(PEG5000-PLA5000)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA5000)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理10(NP(PEG5000-PLA25000)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理11(NP(PEG5000-PLA25000)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理12(NP(PEG5000-PLA51000)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA51000)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理13(NP(PEG5000-PLA51000)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA51000)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理14(NP(PEG10000-PLA15000)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG10000-PLA15000)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理15(NP(PEG10000-PLA15000)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG10000-PLA15000)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理16(NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理17(NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理18(NP(PEG10000-PLGA50000(75/25))组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG10000-PLGA50000(75/25))处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理19(NP(PEG10000-PLGA50000(75/25))组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG10000-PLGA50000(75/25))处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理20(NP(PLA6300-PEG1200-PLA6300)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PLA6300-PEG1200-PLA6300)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理21(NP(PLA6300-PEG1200-PLA6300)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PLA6300-PEG1200-PLA6300)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理22(NP(PLA4800-PEG5000-PLA4800)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PLA4800-PEG5000-PLA4800)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理23(NP(PLA4800-PEG5000-PLA4800)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PLA4800-PEG5000-PLA4800)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理24(NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)组)：用包载siPlk1的纳米颗粒NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理25(NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)组)：用包载siN.C.的纳米颗粒NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
在转染培养24h后，用RNeasy mini-kits(Qiagen，Valencia，CA)提取细胞中的总RNA，用紫外分光光度计测定提取的RNA样品的OD280和OD260的吸光度，并利用公式：RNA浓度(μg/μL)＝0.04×OD260×稀释倍数，计算RNA样品的浓度，然后用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，Dalian，China)合成cDNA，每个样品使用2μg总mRNA。在合成cDNA后，按照Premix Ex TaqTM(Takara)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。其中Plk1和甘油三磷酸脱氢酶GAPDH基因的PCR引物如下：
Plk1-上游引物5’-AGCCTGAGGCCCGATACTACCTAC-3’，
Plk1-下游引物5’-ATTAGGAGTCCCACACAGGGTCTTC-3’；
GAPDH-上游引物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’，
GAPDH-下游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’。
PCR反应如下：
PCR反应：
1)95℃加热变性30秒。
2)95℃加热变性5秒。
3)60℃加热退火30秒。30个循环
4)95℃加热变性15秒。
5)95℃加热变性60秒。
6)60℃加热退火15秒。
利用2-ΔΔCT对不同实验组中Plk1基因表达差异进行了分析，其中以GAPDH为内参，分析不同实验组中Plk1基因表达水平。以PBS实验组为100％，其他实验组表达表示为相对于PBS组表达量，实验结果见图3。
图3中，不经过处理的PBS组细胞内Plk1表达量高，包载siPlk1的实验组均可以有效抑制Plk1基因的表达，而所有包载siN.C.的实验对照组对细胞中Plk1基因表达没有明显影响。说明Plk1表达下调时由于序列特异性的基因沉默造成。
同时，从实验结果可知，NP(PEG5000-PLA5000)、NP(PEG10000-PLGA10000(50/50))、NP(PLA4800-PEG10000-PLA4800)三组沉默效果较差，结合上述实施例推测，这三个实验组内吞效果较差造成。而NP(PEG5000-PLA25000)实验组沉默效果最佳，能够将Plk1基因的表达下调到PBS实验组的45％。
实施例3、此给药系统在动物水平的生物效应评价
从细胞水平实验可知，用实施例1中所述方法制备包载siRNA的纳米颗粒时，当各组分比例为siRNA/阳离子脂质/聚合物＝0.2/1.0/25.0、使用的阳离子脂质为BHEM-Chol、使用的聚合物为PEG5000-PLA25000时，制备得到包载siRNA的纳米颗粒能够有效进入细胞，并且能够显著沉默靶基因的表达，以此配方来制备包载siRNA的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)作为实例来研究此给药系统在动物水平的生物效应。
1、包载siLuci纳米颗粒对肝原位植入肿瘤细胞表达萤火虫荧光素酶表达的抑制
Luciferase是萤火虫荧光素酶，能够催化通过腹腔注射的底物发出可见光，根据酶的反应均一性，可定性测定Luciferase基因的表达。稳定表达luciferase的HepG2细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
将HepG2-luciferase细胞(密度达到2.0×107/mL，25μL)悬液和25μL Matrigel(BD Biosciences)混合均匀后，注射至裸鼠肝叶，饲养10天左右可形成肿瘤，按照下面的处理方法进行给药，尾静脉注射，每天一次，共注射2次：
处理1(PBS对照组)：250μL PBS，作为对照。
处理2(裸siLuci组)：250μL裸siLuci。siLuci剂量为20μg。
处理3(NP(PEG5000-PLA25000)/si N.C.组)：包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)，siN.C.剂量为20μg。
处理4(NP(PEG5000-PLA25000)/siLuci组)：包载siLuci的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)，siLuci剂量为20μg。
在小鼠腹腔注射200μL萤火虫荧光素酶底物D-luciferin(15mg/mL，Xenogen)，通过Xenogen
Figure BDA0000055207950000241
Lumina system(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)小动物活体成像仪检测肝部位luciferase在给药前后的表达，结果如图4(A)。
如图4(A)所示，从给药前(Day 0)图像可知，小鼠肝部萤火虫荧光素酶表达明显，表达水平基本相当。给药两天后(Day 2)，阴性对照组(PBS、裸siLici、NP(PEG5000-PLA25000)/siN.C.对照组)中萤火虫荧光素酶表达均有增加，源于HepG2-luciferase在肝部位的增殖。使用NP(PEG5000-PLA25000)/siLuci给药组的裸鼠肝部位萤火虫荧光素酶表达明显降低，说明NP(PEG5000-PLA25000)/siLuci沉默肝癌细胞中的萤火虫荧光素酶表达。
2、包载siPlk1纳米颗粒对乳腺癌生长抑制
在裸鼠第二个乳腺的脂肪垫下原位接种MDA-MB-435s细胞(0.5×107)，14天左右形成可见肿瘤，肿瘤体积约50mm3，随机分成五组，进行尾静脉注射治疗，每两天注射一次。肿瘤的体积按公式计算：V＝0.5×a×b2计算，其中a指肿瘤长径，b指肿瘤短径。
处理1(PBS对照组)：每只裸鼠注射250μL PBS。
处理2(裸siPlk1组)：每只裸鼠注射250μL裸siPlk1，siPlk1剂量为20μg。
处理3(NP(PEG5000-PLA25000)组)：每只裸鼠注射空白纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)，纳米颗粒的质量为2.70mg。
处理4(NP(PEG5000-PLA25000)/siN.C.组)：每只裸鼠注射包载siN.C.的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)，siN.C.剂量为20μg，纳米颗粒的质量为2.70mg。
处理5(NP(PEG5000-PLA25000)/siPlk1组)：每只裸鼠注射包载siPlk1的纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)，siPlk1剂量为20μg，纳米颗粒的质量为2.70mg。
在治疗开始后，每隔一天对肿瘤体积进行测量。实施例结果如图16所示，所有阴性对照组中肿瘤生长速度均较快，而在使用包载siPlk1纳米颗粒NP(PEG5000-PLA25000)治疗组中，肿瘤生长速度与阴性对照组相比受到明显抑制。说明本发明提供的包载siRNA纳米颗粒在体内能够有效沉默致癌基因，从而抑制肿瘤生长。
从实施例3可知，此siRNA给药系统在动物水平能够有效沉默肿瘤部位靶基因的表达，而且这种靶基因表达的下调时由于序列特异性的基因沉默造成。
实施例4、此给药系统的靶向修饰以及生物效应的评价
1、半乳糖修饰、包载siRNA的纳米颗粒构建肝靶向的siRNA给药系统
为了提高该siRNA给药系统在疾病治疗应用中的潜力，本发明在这种纳米颗粒表面修饰了靶向基团，将此给siRNA药系统发展成为一种具有靶向性的siRNA给药系统。半乳糖基团是一种靶向性配体能够特异性的识别去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R，一种哺乳动物肝细胞表面过量表达的糖蛋白)，因此本发明通过这一实例说明在纳米颗粒表面修饰半乳糖基团，可制备靶向给药系统。
半乳糖修饰、包载siRNA的纳米颗粒是利用氨基半乳糖修饰的PEG-PLA(Gal-PEG-PLA)和阳离子脂质通过双乳化方法包载siRNA而制备。其中，Gal-PEG-PLA是以端基分别为羧基和羟基的异官能团的聚乙二醇为引发剂，在本体条件下利用聚乙二醇端羟基引发丙交酯单体单体聚合得到HOOC-PEG-PLA，再将氨基半乳糖键合到PEG链段上从而得到。通过调节聚乙二醇与丙交酯投料比，理论上可以得到不同分子量的Gal-PEG-PLA。异辛酸亚锡因其高催化效率及无毒性，是被最广泛应用的内酯及交酯环状单体开环聚合反应的催化剂，已被美国FDA批准作为食品添加剂。
具体合成步骤如下：首先，将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空干燥和充氮气处理后，放入手套箱。然后，HOOC-PEG5000-OH/丙交酯/Sn(Oct)2＝1/320/0.09的摩尔配比进行投料。向烧瓶中加入HOOC-PEG5000-OH、单体和异辛酸亚锡，在130℃搅拌下反应。反应24小时后，将产物移出手套箱，用少量的CH2Cl2溶解，将溶液沉淀到冷的乙醚中，反复两次，收集沉淀物，用油泵抽干至恒重为止，即得产物(HOOC-PEG-PLA)。
以合成得到的HOOC-PEG-PLA进一步键合氨基半乳糖得到氨基半乳糖修饰的聚乙二醇-聚乳酸(Gal-PEG-PLA)。具体试验如下：1g的HOOC-PEG5000-PLA21030溶解在5mL的二氯甲烷中，并加入N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和氨基半乳糖(Gal-NH2)，加入的按HOOC-PEG5000-OH/DCC/NHS/Gal-NH2＝1/2/2/2的摩尔配比进行投料。室温下反应12小时后，将溶液过滤后收集得到的滤液并沉淀到冷的乙醚中，收集沉淀物，用油泵抽干至恒重为止，即得产物(Gal-PEG-PLA)。
图5(A)为合成得到的HOOC-PEG5000-PLA21030和Gal-PEG5000-PLA21030(下标为分子量)核磁共振氢谱结果，分析如下：字母a到d标记了归属PEG-PLA的质子信号。聚乳酸的分子量通过5.17ppm的多重峰(归属于聚乳酸的-C(O)OCH-)与3.63ppm的单峰(归属于聚乙二醇的-CH2CH2-)的积分面积比计算得到。对比图5(A)中HOOC-PEG5000-PLA21030和Gal-PEG5000-PLA21030核磁共振氢谱可知，键合后d信号峰消失，因为键合后化学环境变化导致其信号峰和3.63ppm的单峰(归属于聚乙二醇的-CH2CH2-)重合。从核磁谱图可以推断成功合成得到Gal-PEG5000-PLA21030聚合物。
用实施例1中所述方法制备包载siRNA的纳米颗粒来研究此给药系统的生物效应。其中，siRNA/阳离子脂质/聚合物＝0.2/1.0/25.0，使用的siRNA分别为siPlk1和siN.C.，阳离子脂质为BHEM-Chol。使用的聚合物为HOOC-PEG5000-PLA21030和Gal-PEG5000-PLA21030制备得到的包载siRNA的纳米颗粒分别为NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)和NP(Gal-PEG5000-PLA21030)。
a)流式细胞检测包载FAM-siRNA靶向纳米颗粒的细胞内吞
以上述体系制备包载FAM-siRNA的NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)和NP(Gal-PEG5000-PLA21030)来研究此靶向给药体系的细胞内吞。将Hepa 1-6细胞以5×104细胞/孔的密度接种于24孔板，37℃培养24小时后，分别进行如下处理：
处理1(PBS)：加入等体积PBS溶液。
处理2(FAM-siRNA)：加入等体积FAM-siRNA溶液，FAM-siRNA终浓度为200nM。
处理3(NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)组)：包载FAM-siRNA的纳米颗粒NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)，FAM-siRNA终浓度为200nM。
处理4(NP(Gal-PEG5000-PLA21030)组)：包载FAM-siRNA的纳米颗粒NP(Gal-PEG5000-PLA21030)，FAM-siRNA终浓度为200nM。
处理5(NP(Gal-PEG5000-PLA21030)+Gal-NH2组)：包载FAM-siRNA的纳米颗粒NP(Gal-PEG5000-PLA21030)，并加入靶向抑制剂Gal-NH2(终浓度60mM)，FAM-siRNA终浓度为200nM。
在细胞经过以上几种条件处理2小时后，消化收集各组细胞，用流式细胞仪(FACS，BDBioscience，Bedford，MA)方法分析细胞吞噬纳米颗粒，结果见图5(B)。
从图5(B)为可知，FAM-siRNA基本不能够进入细胞，靶向给药体系NP(Gal-PEG5000-PLA21030)和非靶向给药体系NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)均可以将FAM-siRNA成功输运到细胞中。其中，靶向给药体系实验组检测到细胞内的FAM-siRNA荧光信号明显强于非靶向给药体系，说明该半乳糖修饰的纳米颗粒能够更好的将siRNA输运到肝癌细胞。同时，加入靶向抑制剂Gal-NH2(终浓度60mM)的实验组(NP(Gal-PEG5000-PLA21030)+Gal-NH2组)，荧光信号较低，和非靶向实验组NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)相当。这一现象说明这种半乳糖修饰的纳米颗粒是通过纳米颗粒表面的半乳糖配体与肝细胞表面ASGP-R特异性结合介导纳米颗粒的内吞，加入靶向抑制剂Gal-NH2后，纳米颗粒不能够通过ASGP-R特异性结合介导纳米颗粒的内吞，所以输运的FAM-siRNA降低，导致荧光信号降低。
从细胞内吞结果可知，这种经过配体修饰后聚合物制备的包载siRNA纳米颗粒具有靶向能力。同样，这种配体修饰可以是半乳糖修饰而不限于此，例如叶酸、含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的短肽等。
b)靶向纳米颗粒输运siRNA在细胞水平沉默靶基因表达
apoB是肝细胞中胆固醇转运相关蛋白，已广泛被用作肝脏基因沉默的模式靶基因；本发明通过沉默Hepa 1-6细胞apoB基因表达来评价该半乳糖修饰的靶向纳米颗粒可以更好的输运siRNA进入肝癌细胞，并成功释放siRNA，沉默靶基因的表达。以上述体系制备包载siapoB和siN.C.的NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)和NP(Gal-PEG5000-PLA21030)来研究此靶向给药体系在细胞水平沉默靶基因的效果。
将Hepa 1-6细胞以1×105细胞/孔的密度接种于6孔板，37℃培养24小时后，分别进行如下处理，每个处理组设置1个复孔：
处理1(PBS)：加入等体积PBS溶液。
处理2(Free siapoB组)：加入等体积siapoB溶液，siapoB终浓度为200nM。
处理3(Lipofectamine组)：用载siapoB的Lipofectamine 2000溶液处理细胞，siapoB终浓度为50nM，Lipofectamine 2000所用体积为1.25μL。
处理4(NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)/siN.C.组)：用包载siN.C.的靶向纳米颗粒NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理5(NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)/siapoB组)：用包载siapoB的非靶向纳米颗粒NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)处理细胞，siapoB的终浓度为200nM。
处理6(NP(Gal-PEG5000-PLA21030)/siN.C.组)：用包载siN.C.的靶向纳米颗粒NP(Gal-PEG5000-PLA21030)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理7(NP(Gal-PEG5000-PLA21030)/siapoB组)：用包载siapoB的靶向纳米颗粒NP(Gal-PEG5000-PLA21030)处理细胞，siapoB的终浓度为200nM。
在转染培养24h后，用RNeasy mini-kits(Qiagen，Valencia，CA)提取细胞中的总RNA，用紫外分光光度计测定提取的RNA样品的OD280和OD260的吸光度，并利用公式：RNA浓度(μg/μL)＝0.04×OD260×稀释倍数，计算RNA样品的浓度，然后用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，Dalian，China)合成cDNA，每个样品使用2μg总mRNA。在合成cDNA后，按照
Figure BDA0000055207950000291
Premix Ex TaqTM(Takara)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。其中apoB和甘油三磷酸脱氢酶GAPDH基因的PCR引物如下：
apoB-上游引物5’-TTCCAGCCATGGGCAACTTTACCT-3’
apoB-下游引物5’-TACTGCAGGGCGTCAGTGACAAAT-3’
GAPDH-上游引物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’，
GAPDH-下游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’。
PCR反应如下：
PCR反应：
1)95℃加热变性30秒。
2)95℃加热变性5秒。
3)60℃加热退火30秒。30个循环
4)95℃加热变性15秒。
5)95℃加热变性60秒。
6)60℃加热退火15秒。
利用2-ΔΔCT对不同实验组中apoB基因表达差异进行了分析，其中以GAPDH为内参，分析不同实验组中apoB基因表达水平。以PBS实验组为100％，其他实验组表达表示为相对于PBS组表达量，实验结果见图5(C)。
图5(C)中，以不经过处理的PBS组细胞内apoB mRNA表达量作为100％，NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)/siapoB实验组和NP(Gal-PEG5000-PLA21030)/siapoB实验组均可以有效抑制apoB mRNA的表达，但在相同剂量的siapoB(200nM)情况下，Gal-NP/siapoB组可以成功沉默apoB基因表达高达80％，明显优于NP/siapoB实验组(39％沉默效率)。而所有包载siN.C.的实验对照组对细胞中apoB mRNA表达没有明显影响。说明apoB表达下调时由于序列特异性的基因沉默造成。
c)靶向纳米颗粒输运siRNA沉默小鼠肝细胞靶基因的表达
通过将siapoB的靶向给药系统和非靶向给药系统经尾静脉注入小鼠体内，通过体内实验观察该载体作为肝靶向siRNA载体的有效性和靶向性。
将如上所述的靶向给药系统和非靶向给药系统经尾静脉注入C57BL/6小鼠体内，siRNA剂量为4mg/kg，48小时后眼球取血法处死小鼠，凝血后收集血清，使用小鼠载脂蛋白B(apoB)定量检测试剂盒(ELISA；R&D systems，Minneapolis，MN，USA)检测血清中apoB蛋白水平。每组6只小鼠，实验组设置如下：
处理1(PBS对照组)：每只裸鼠注射400μ L PBS。
处理2(Free siapoB组)：每只裸鼠注射400μL裸siapoB，siapoB剂量为80μg。
处理3(NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)/siN.C.组)：每只裸鼠注射包载siN.C.的纳米颗粒NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)，siN.C.剂量为80μg。
处理4(NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)/siapoB组)：每只裸鼠注射包载siapoB的纳米颗粒NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)，siapoB剂量为80μg。
处理5(NP(Gal-PEG5000-PLA21030)/siN.C.组)：每只裸鼠注射包载siN.C.的纳米颗粒NP(Gal-PEG5000-PLA21030)，siN.C.剂量为80μg。
处理6(NP(Gal-PEG5000-PLA21030)/siapoB组)：每只裸鼠注射包载siapoB的纳米颗粒NP(Gal-PEG5000-PLA21030)，siapoB剂量为80μg。
血清中apoB蛋白水平检测结果如图5(D)，所有包载siN.C.的实验对照组对细胞中apoB mRNA表达没有明显影响，而NP(Gal-PEG5000-PLA21030)/siapoB可以高效下调apoB蛋白表达量70％，而NP(HOOC-PEG5000-PLA21030)/siapoB实验组靶基因表达只能下调35％，说明apoB表达下调时由于序列特异性的基因沉默造成。说明本发明提供的siRNA靶向纳米颗粒在体内能够更有效沉默肝细胞基因的表达，具有应用潜力。
2、抗体修饰、包载siRNA的纳米颗粒构建靶向的siRNA给药系统
如上所述，为了提高该siRNA给药系统在疾病治疗应用中的潜力，本发明进一步利用单链片段抗体修饰来发展另一种可以靶向的siRNA给药系统。单链片段抗体(Anti-Her2scFv-cys)能够特异性的识别乳腺癌细胞表面的HER2受体，因此本发明通过在纳米颗粒表面修饰这种单链片段抗体，从而制备一种靶向给药系统。
单链片段抗体修饰、包载siRNA的纳米颗粒是利用马来酰亚胺基团修饰的PEG-PLA(Mal-PEG-PLA)和阳离子脂质通过双乳化方法包载siRNA纳米颗粒、然后再将单链片段抗体键合到纳米颗粒表面的马来酰亚胺基团而得到靶向的给药系统。
其中，Mal-PEG-PLA是以端基分别为马来酰亚胺基团和羟基的异官能团的聚乙二醇为引发剂，在本体条件下利用聚乙二醇端羟基引发丙交酯单体单体聚合得到Mal-PEG-PLA。通过调节聚乙二醇与丙交酯投料比，理论上可以得到不同分子量的Gal-PEG-PLA。异辛酸亚锡因其高催化效率及无毒性，是被最广泛应用的内酯及交酯环状单体开环聚合反应的催化剂，已被美国FDA批准作为食品添加剂。
具体合成步骤如下：首先，将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空干燥和充氮气处理后，放入手套箱。然后，Mal-PEG5000-OH/丙交酯/Sn(Oct)2＝1/360/0.1的摩尔配比进行投料。向烧瓶中加入HOOC-PEG5000-OH、单体和异辛酸亚锡，在130℃搅拌下反应。反应24小时后，将产物移出手套箱，用少量的CH2Cl2溶解，将溶液沉淀到冷的乙醚中，反复两次，收集沉淀物，用油泵抽干至恒重为止，即得产物(Mal-PEG-PLA)。
图6(A)为合成得到的Mal-PEG5000-PLA22070(下标为分子量)核磁共振氢谱结果，分析如下：字母a到d标记了归属PEG-PLA的所有质子信号，聚乳酸的分子量通过5.17ppm的多重峰(归属于聚乳酸的-C(O)OCH-)与3.63ppm的单峰(归属于聚乙二醇的-CH2CH2-)的积分面积比计算得到。
如实施例3和4可知，当各组分比例为siRNA/阳离子脂质/聚合物＝0.2/1.0/25.0、使用的阳离子脂质为BHEM-Chol时，制备得到的siRNA给药系统能够很好地将siRNA输运到组织细胞中，并发挥作用。因此，本发明同样以此配方来来研究此靶向给药系统的生物效应。其中，siRNA/阳离子脂质/聚合物＝0.2/1.0/25.0，使用的siRNA分别为siPlk1和siN.C.，阳离子脂质为BHEM-Chol。使用的聚合物为Mal-PEG5000-PLA22070制备得到的包载siRNA的纳米颗粒为NP(Mal-PEG5000-PLA22070)。
得到包载siRNA的纳米颗粒为NP(Mal-PEG5000-PLA22070)再进一步单链片段抗体键合到纳米颗粒表面的马来酰亚胺基团而得到靶向的siRNA给药系统NP(scFv-PEG5000-PLA22070)。具体实验步骤如下：向1.5mL离心管中加入6.25μg Anti-Her2scFv-cys和1.0mg包载siRNA纳米颗粒NP(Mal-PEG5000-PLA22070)，其中Anti-Her2scFv-cys中的巯基基团和纳米颗粒表面的马来酰亚胺基团投料摩尔比为1/10，反应体系为pH＝6.8的PB缓冲液，终体积为1.0mL。室温下以40rpm的转速在旋转式混匀仪上反应。反应4小时后，5000rpm离心20min。收集上清，并使用1.0mL pH＝6.8的PB(0.01M)缓冲液重悬沉淀，得到的包载siRNA的纳米颗粒NP(scFv-PEG5000-PLA22070)。
a)流式细胞检测包载FAM-siRNA靶向纳米颗粒的细胞内吞
以上述体系制备包载FAM-siRNA的NP(Mal-PEG5000-PLA22070)和NP(scFv-PEG5000-PLA22070)来研究此靶向给药体系的细胞内吞。将BT474细胞(HER2受体高表达细胞系，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)以5×104细胞/孔的密度接种于24孔板，37℃培养2小时后，分别进行如下处理：
处理1(PBS)：加入等体积PBS溶液。
处理2(FAM-siRNA)：加入等体积FAM-siRNA溶液，FAM-siRNA终浓度为200nM。
处理3(NP(Mal-PEG5000-PLA22070)组)：包载FAM-siRNA的纳米颗粒NP(Mal-PEG5000-PLA22070)，FAM-siRNA终浓度为200nM。
处理4(NP(scFv-PEG5000-PLA22070)组)：包载FAM-siRNA的纳米颗粒NP(scFv-PEG5000-PLA22070)，FAM-siRNA终浓度为200nM。
处理5(NP(scFv-PEG5000-PLA22070)+Anti-Her2scFv-cys组)：包载FAM-siRNA的纳米颗粒NP(scFv-PEG5000-PLA22070)，并加入靶向抑制剂Anti-Her2scFv-cys(终浓度7μM)，FAM-siRNA终浓度为200nM。
在细胞经过以上几种条件处理1小时后，消化收集各组细胞，用流式细胞仪(FACS，BDBioscience，Bedford，MA)方法分析细胞吞噬纳米颗粒，结果见图6(B)。
从图6(B)为可知，FAM-siRNA基本不能够进入细胞，靶向给药体系NP(scFv-PEG5000-PLA22070)和非靶向给药体系NP(Mal-PEG5000-PLA22070)均可以将FAM-siRNA成功输运到细胞中。其中，靶向给药体系实验组检测到细胞内的FAM-siRNA荧光信号明显强于非靶向给药体系，说明该单链片段抗体Anti-Her2scFv-cys修饰的纳米颗粒能够更好的将siRNA输运到HER2受体高表达的乳腺癌细胞系BT474。同时，加入靶向抑制剂Anti-Her2scFv-cys(终浓度7μM)的实验组(NP(scFv-PEG5000-PLA22070)+Anti-Her2scFv-cys组)，荧光信号较低，和非靶向实验组NP(Mal-PEG5000-PLA22070)相当。这一现象说明这种单链片段抗体Anti-Her2scFv-cys修饰的纳米颗粒是通过纳米颗粒表面的片段抗体与癌细胞表面HER2受体特异性结合介导纳米颗粒的内吞，加入靶向抑制剂Anti-Her2scFv-cys后，纳米颗粒不能够通过抗体与受体特异性结合介导纳米颗粒的内吞，所以输运的FAM-siRNA降低，导致荧光信号降低。
从细胞内吞结果可知，这种经过单链片段抗体修饰后聚合物制备的包载siRNA纳米颗粒具有靶向能力。同样，这种配体修饰可以是单链片段抗体修饰而不限于此，例如转铁蛋白等。
b)靶向纳米颗粒输运siRNA在细胞水平沉默靶基因表达
Plk1有助于促进和加速哺乳动物细胞有丝分裂，并在多种肿瘤细胞中高表达。通过沉默其表达，可以抑制肿瘤生长；本发明通过沉默BT474细胞Plk1基因表达来评价该单链片段抗体Anti-Her2scFv-cys修饰的靶向纳米颗粒可以更好的输运siRNA进入乳腺癌细胞，并成功释放siRNA，沉默靶基因的表达。以上述体系制备包载siPlk1和siN.C.的NP(Mal-PEG5000-PLA22070)和NP(scFv-PEG5000-PLA22070)来研究此靶向给药体系在细胞水平沉默靶基因的效果。
将BT474细胞以1×105细胞/孔的密度接种于6孔板，37℃培养24小时后，分别进行如下处理，每个处理组设置1个复孔：
处理1(PBS)：加入等体积PBS溶液。
处理2(Free siPlk1组)：加入Free siPlk1溶液，siPlk1终浓度为200nM。
处理3(Lipofectamine组)：用载siPlk1的Lipofectamine 2000溶液处理细胞，siPlk1终浓度为50nM，Lipofectamine 2000所用体积为1.25μL。
处理4(NP(Mal-PEG5000-PLA22070)/siN.C.组)：用包载siN.C.的靶向纳米颗粒NP(Mal-PEG5000-PLA22070)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理5(NP(Mal-PEG5000-PLA22070)/siPlk1组)：用包载siPlk1的非靶向纳米颗粒NP(Mal-PEG5000-PLA22070)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
处理6(NP(scFv-PEG5000-PLA22070)/siN.C.组)：用包载siN.C.的靶向纳米颗粒NP(scFv-PEG5000-PLA22070)处理细胞，siN.C.的终浓度为200nM。
处理7(NP(scFv-PEG5000-PLA22070)/siPlk1组)：用包载siPlk1的靶向纳米颗粒NP(scFv-PEG5000-PLA22070)处理细胞，siPlk1的终浓度为200nM。
在转染培养24h后，用RNeasy mini-kits(Qiagen，Valencia，CA)提取细胞中的总RNA，用紫外分光光度计测定提取的RNA样品的OD280和OD260的吸光度，并利用公式：RNA浓度(μg/μL)＝0.04×OD260×稀释倍数，计算RNA样品的浓度，然后用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，Dalian，China)合成cDNA，每个样品使用2μg总mRNA。在合成cDNA后，按照
Figure BDA0000055207950000341
Premix Ex TaqTM(Takara)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。其中Plk1和甘油三磷酸脱氢酶GAPDH基因的PCR引物如下：
Plk1-上游引物5’-AGCCTGAGGCCCGATACTACCTAC-3’，
Plk1-下游引物5’-ATTAGGAGTCCCACACAGGGTCTTC-3’；
GAPDH-上游引物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’，
GAPDH-下游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’。
PCR反应如下：
PCR反应：
1)95℃加热变性30秒。
2)95℃加热变性5秒。
3)60℃加热退火30秒。30个循环
4)95℃加热变性15秒。
5)95℃加热变性60秒。
6)60℃加热退火15秒。
利用2-ΔΔCT对不同实验组中Plk1基因表达差异进行了分析，其中以GAPDH为内参，分析不同实验组中Plk1基因表达水平。以PBS实验组为100％，其他实验组表达表示为相对于PBS组表达量，实验结果见图6(C)。
图6(C)中，不经过处理的PBS组细胞内Plk1表达量高，包载siPlk1的实验组均可以有效抑制Plk1基因的表达。但是，在相同剂量的siPlk1(200nM)情况下，NP(scFv-PEG5000-PLA22070)/siPlk1组可以成功沉默Plk1基因表达高达70％，明显优于NP(Mal-PEG5000-PLA22070)/siPlk1实验组(40％沉默效率)。而所有包载siN.C.的实验对照组对细胞中Plk1mRNA表达没有明显影响。说明Plk1表达下调时由于序列特异性的基因沉默造成。
c)靶向纳米颗粒输运siRNA对乳腺癌生长抑制
通过将siPlk1的靶向给药系统和非靶向给药系统经尾静脉注入小鼠体内，通过体内实验观察该载体作为靶向siRNA给药系统的有效性和靶向性。
在裸鼠第二个乳腺的脂肪垫下原位接种BT474细胞(0.5×107)，10天左右形成可见肿瘤，肿瘤体积约50mm3，随机分成六组，每组8只，进行尾静脉注射治疗，没三天给药一次，给药方法如下：
处理1(PBS对照组)：每只裸鼠注射250μL PBS。
处理2(裸siPlk1组)：每只裸鼠注射250μL裸siPlk1，siPlk1剂量为20μg。处理1(PBS对照组)：每只裸鼠注射400μL PBS。
处理3(NP(Mal-PEG5000-PLA22070)/siN.C.组)：每只裸鼠注射包载siN.C.的纳米颗粒NP(Mal-PEG5000-PLA22070)，siN.C.剂量为20μg。
处理4(NP(Mal-PEG5000-PLA22070)/siPlk1组)：每只裸鼠注射包载siPlk1的纳米颗粒NP(Mal-PEG5000-PLA22070)，siPlk1剂量为20μg。
处理5(NP(scFv-PEG5000-PLA22070)/siN.C.组)：每只裸鼠注射包载siN.C.的纳米颗粒(NP(scFv-PEG5000-PLA22070)，siN.C.剂量为20μg。
处理6(NP(scFv-PEG5000-PLA22070)/siPlk1组)：每只裸鼠注射包载siPlk1的纳米颗粒NP(scFv-PEG5000-PLA22070)，siPlk1剂量为20μg。
在治疗开始后，每隔一天对肿瘤体积进行测量。实施例结果如图6(D)所示，所有PBS组以及所有阴性对照组中肿瘤生长速度均较快，而在使用包载siPlk1纳米颗粒NP(Mal-PEG5000-PLA22070)和NP(scFv-PEG5000-PLA22070)治疗组中，肿瘤生长速度与阴性对照组相比受到明显抑制，但是NP(scFv-PEG5000-PLA22070)治疗组能够更显著的抑制肿瘤的生长，说明单链片段抗体修饰的siRNA靶向给药系统能够更有效的治疗HER2阳性的乳腺癌。所有包载siN.C.的实验对照组肿瘤的生长速度并未受到影响。对肿瘤生长的抑制是由于序列特异性的基因沉默造成。
从实施例4可知，此给药系统可以利用靶向修饰嵌段聚合物和阳离子脂质通过双乳化的方法制备靶向的siRNA给药系统，也可以利用嵌段聚合物和阳离子脂质通过双乳化的方法先制备出siRNA纳米颗粒后，再进行靶向修饰而制备靶向的siRNA给药系统。并且靶向基团可以是小分子的靶向基团如半乳糖、叶酸、含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的短肽等，也可以是片段抗体、转铁蛋白抗体等。

Claims (23)

1.一种核酸转运用载体组合物，含有两亲性高分子聚合物和阳离子脂质。
2.根据权利要求1所述的核酸转运用载体组合物，其中阳离子脂质为铵盐型的阳离子脂质。
3.根据权利要求1或2任一项所述的核酸转运用载体组合物，其特征在于两亲性高分子聚合物和阳离子脂质的含量范围为：
两亲性高分子聚合物  100重量份
阳离子脂质          0-20重量份。
4.根据权利要求3所述的核酸转运用载体组合物，其特征在于两亲性高分子聚合物和阳离子脂质的含量范围为：
两亲性高分子聚合物  100重量份
阳离子脂质          0.001-10重量份。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸转运用载体组合物，其中阳离子脂质选自N，N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵、(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵中的至少一种。
6.根据权利要求1-4任一项所述的核酸转运用载体组合物，其中两亲性高分子聚合物选自聚乙二醇-聚乳酸两嵌段或三嵌段共聚物或聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)两嵌段或三嵌段共聚物中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的核酸转运用载体组合物，所述聚乙二醇嵌段分子量范围为550～10000。
8.根据权利要求6所述的核酸转运用载体组合物，聚乳酸嵌段数均分子量范围为4800～51000g/mol。
9.根据权利要求6所述的核酸转运用载体组合物，聚(乳酸乙醇酸)嵌段数均分子量范围为10000～50000g/mol。
10.根据权利要求1-9任一项所述的核酸转运用载体组合物，其特征在于所述组合物形成直径为50-250纳米的纳米颗粒。
11.根据权利要求10所述的核酸转运用载体组合物，其特征在于所述纳米颗粒表面进行化学修饰、抗体修饰或配体修饰。
12.根据权利要求1-11任一项所述的核酸转运用载体组合物，所述核酸为小干扰核酸(siRNA)。
13.一种药物组合物，含有核酸及上述权利要求任一项所述的核酸转运用载体组合物。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于核酸、阳离子脂质、两亲性高分子 聚合物的质量比为0.04/0.0/100.0～7.2/20.0/100.0。
15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，所述核酸为小干扰核酸(siRNA)。
16.根据权利要求13-15任一项所述的药物组合物，还含有其他药物。
17.权利要求14所述药物组合物的制备方法，将两亲性嵌段共聚物和阳离子脂质溶于油相中，加入siRNA水溶液后超声(80瓦，30秒)形成初始乳液，将初始乳液加入到水相中并再次超声(80瓦，2分钟)乳化，将乳液加入到水相中，减压(1000帕)下除去有机溶剂，离心(4℃，30000g，1h)收集纳米颗粒。
18.一种核酸导入方法，其特征在于，通过使权利要求13-15任一项所述的药物组合物与细胞接触，使核酸导入到细胞内。
19.权利要求18所述的核酸导入方法，其特征在于所述核酸为小干扰核酸(siRNA)。
20.两亲性高分子聚合物及阳离子脂质的组合在制备核酸转运用载体组合物中的用途。
21.权利要求20所述的两亲性高分子聚合物及阳离子脂质的组合的用途，其特征在于所述核酸为小干扰核酸(siRNA)。
22.权利要求1-12任一项所述核酸转运用载体组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于所述肿瘤为肝脏肿瘤或乳腺肿瘤。 
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