CN103571843A - 一种抑制胚胎着床的包裹有微小rna的纳米颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制胚胎着床的包裹有微小RNA的纳米颗粒，属于分子细胞学技术领域。本发明首次确定了mir-181对LIF蛋白表达的抑制作用，并验证了其可用于抑制胚胎着床，进一步利用纳米材料聚乙二醇-聚乳酸制备了包裹有上述微小RNA的纳米颗粒，所得纳米颗粒在小鼠体内稳定性好并成功抑制了胚胎着床。本发明所提供的制备方法简单，所得到的避孕产品通过非激素方式来抑制胚胎着床达到避孕效果，不会产生激素改变对人体所产生的副作用，在体内稳定好，避孕效果非常明显。

Description

一种抑制胚胎着床的包裹有微小RNA的纳米颗粒

技术领域

本发明涉及一种抑制胚胎着床的包裹有微小RNA的纳米颗粒，尤其是一种通过抑制LIF蛋白表达从而抑制胚胎着床的包裹有微小RNA mir-181的纳米颗粒，属于分子细胞学技术领域。

背景技术

利用人工合成的雌激素，孕激素来实现避孕，其客观存在的问题是只能通过激素的方式来抑制排卵或者改变子宫颈液的粘稠度达到避孕效果，并且改变激素会产生某些风险，例如血栓风险增加，乳腺癌等。利用小分子RNA技术，来专一实现通过抑制LIF蛋白对于胚胎着床的促进作用，从而实现避孕，解决利用激素类避孕药物对身体带来的副作用。

LIF蛋白是一种能够抑制细胞分化的细胞因子，能够促进胚胎的着床。MicroRNAs（miRNAs）是是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控，在细胞分化，生物发育以及疾病发生进程中发挥巨大作用。在胚胎着床过程中，有众多miRNA水平发生变化，但是尚未发现有具体的miRNA调控胚胎着床。本发明旨在通过利用非激素刺激的方式来抑制胚胎着床达到避孕效果。

本发明要解决的问题是提供一种能够抑制LIF蛋白表达的miRNA，并利用纳米材料聚乙二醇-聚乳酸将其制备成纳米颗粒。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种抑制LIF蛋白表达的微小RNA。

所述微小RNA为mir-181b或mir-181a，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

本发明要解决的第二个问题是提供一种抑制胚胎着床的包裹有所述微小RNA的纳米颗粒及其制备方法，是利用纳米材料聚乙二醇-聚乳酸包裹小分子mir-181，形成直径大约为90-100nm的纳米颗粒，得到的纳米颗粒具有避孕效果。

具体地，是将5mg PEG₅₀₀₀-PLA₂₅₀₀₀和1mg BHEM-Chol溶于0.5mL氯仿中，加入5ODmiRNA溶液后在探头式超声波破碎仪超声下形成初始乳液，将0.5mL初始乳液加入到1.5mL1%（w/v）的聚乙烯醇水溶液中，并再次超声乳化，将乳液加入到25mL的0.3%（w/v）PVA水溶液中，减压下使有机溶剂挥发，离心，收集纳米颗粒，并用超纯水重悬2次，离心洗涤，收集样品冻干得到纳米颗粒。

本发明首次确定了SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示微小RNA对LIF蛋白表达的抑制作用，并进一步确定其可用于抑制胚胎着床，并制备了包裹有上述微小RNA的纳米颗粒。本发明所提供的制备方法简单，所得到的避孕产品通过非激素方式来抑制胚胎着床达到避孕效果，不会产生激素改变对人体所产生的副作用，在体内稳定好，避孕效果非常明显。

附图说明

图1纳米材料包裹mirRNA后的稳定性检测；1为PBS包裹的miRNA，2为用纳米材料包裹的miRNA，3为不用纳米材料包裹的miRNA。

图2不同小鼠体内LIF蛋白表达水平；1为怀孕4d的小鼠+注射了control RNA，2为未怀孕小鼠（作阴性对照），3为怀孕4d的小鼠+注射mir-181a，4为怀孕4d的小鼠+注射mir-181b。

具体实施方式

生物及细胞样品：小鼠，细胞样品为Jurkat或者EL4细胞。

培养基：RPMI1640培养基。

其他材料与方法：纳米材料聚乙二醇-聚乳酸。

其中mir-181为小RNA，有两条核苷酸序列：

（1）mir-181b:aacauucauugcugucggugggu（SEQ ID NO.1）；

（2）mir-181a：aacauucaacgcugucggugagu（SEQ ID NO.2）。

实施例1纳米材料聚乙二醇-聚乳酸包裹小分子mir-181

将PEG_5000-PLA₂₅₀₀₀和BHEM-Chol溶于0.5mL氯仿中，加入miRNA溶液后在探头式超声波破碎仪超声（输出功率80瓦，采用超声10秒暂停2秒的频率超声2分钟）下形成初始乳液，将初始乳液加入到1.5mL1%（w/v）聚乙烯醇水溶液中，并再次超声（同上）乳化，将乳液加入到25mL的0.3%（w/v）PVA水溶液中，减压下使有机溶剂挥发，离心，收集纳米颗粒，并用超纯水重悬2次，离心洗涤，收集样品冻干。

聚乙二醇-聚乳酸共聚物的亲水性链段PEG可提高载体与药物的相容性和分散性，疏水性链段PLA则控制药物的释放速率；对于疏水性药物，聚乙二醇-聚乳酸共聚物中疏水段PLA与疏水性药物间具有疏水相互作用，提高载药率，亲水段PEG则可增加药物的稳定性和溶解性其中PEG为聚乙二醇，PLA为聚乳酸，BHEM-chol为阳离子脂质。

利用纳米材料聚乙二醇-聚乳酸包裹小分子mir-181，所形成直径大约为90-100nm大小的纳米颗粒，通过静脉注射被细胞所吸收。

实施例2纳米颗粒miRNA的稳定性监测

在利用腹腔注射将miRNA注射入小鼠体内后，利用麻醉气体使小鼠在检测的过程中始终处于麻醉状态，采用小动物活体成像仪来观测小鼠体内的荧光强度来监测miRNA的稳定性。所用miRNA上结合有红色荧光标记cy5，荧光强度直接反应miRNA的稳定性，一旦小RNA降解，则cy5荧光消失；在大量的实验中我们已证实不被降解基本与活性保持一致。如图1所示，实时监测随着时间变化的miRNA的稳定性，结果表明采用纳米材料包裹的miRNA可以在体内存在72h以上，说明纳米材料包裹可以明显延缓miRNA在体内的降解速度。

实施例3mir-181a、mir-181b对胚胎着床的抑制作用

在小鼠怀孕2d时分别注射纳米材料包裹的negative RNA、mir-181a或mir-181b颗粒，注射3天，从腹腔注射，每天注射一次（达到一个最高程度miRNA在体内的维持），每次注射的药物量为1-2OD，注射的浓度为5μM,注射体积为500μL。然后在怀孕7d时检测小鼠子宫中的胚胎数目，发现当注射了mir-181a、mir-181b后胚胎无法着床，无法形成胚胎，说明纳米颗粒包裹的mir-181a、mir-181b可以明显抑制胚胎的着床。

实施例4mir-181通过抑制LIF蛋白表达阻碍胚胎着床

小分子mir-181可以通过上述的纳米材料包裹，可以在4℃保存一周左右，可以通过腹腔注射或者静脉注射的方式进行，常温注射即可，注射量为多少1OD，注射入小鼠体内的小分子mir-181可以在体内3天发挥作用，主要作用方式是通过腹腔注射随着血液流动到达子宫，通过对子宫中的LIF蛋白进行抑制，由于LIF在胚胎着床上有很重要的作用，当子宫中的LIF受到抑制后，胚胎不能着床，从而达到避孕效果。

如图2所示，LIF蛋白在注射negative RNA（control RNA）的小鼠体内的表达量最高，未怀孕的小鼠体内没有表达，在注射了mir-181的小鼠体内LIF表达量现在下降，说明mir-181能够很好通过抑制LIF蛋白表达阻碍胚胎着床达到避孕效果，避免通过激素方式来避孕，也避免了一些因为改变激素对人体所产生的副作用。

实施例5过表达mir-181的小鼠

分别采用野生型小鼠、过表达mir-181a的小鼠、过表达mir-181b的小鼠进行实验，怀孕7d取子宫发现在mir-181a、mir-181b过表达的小鼠中胚胎数目明显小于野生型小鼠。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种抑制LIF蛋白表达的微小RNA，其特征在于，所述微小RNA的核苷酸序列如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的任意一种。

2.一种抑制胚胎着床的纳米颗粒，其特征在于，含有权利要求1所述的微小RNA。

3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，是用纳米材料聚乙二醇-聚乳酸包裹微小RNA，形成直径90-100nm的纳米颗粒。

4.一种制备权利要求3所述纳米颗粒的方法，其特征在于，将PEG₅₀₀₀-PLA₂₅₀₀₀和BHEM-Chol溶于氯仿中，加入miRNA溶液后在探头式超声波破碎仪超声下形成初始乳液，将初始乳液加入到1%聚乙烯醇水溶液中，并再次超声乳化，将乳液加入到0.3%的PVA水溶液中，减压下使有机溶剂挥发，离心，收集纳米颗粒，并用超纯水重悬，离心洗涤，收集样品冻干得到纳米颗粒。

5.权利要求1所述的微小RNA在制备避孕产品中的应用。

6.权利要求2-3任一所述纳米颗粒在制备避孕产品中的应用。

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