CA3041624A1 - Utilisation d'un sirna pour le traitement des cancers - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue, ainsi qu'un dispositif comprenant un tel mode d'administration.
Description
UTILISATION D'UN SIRNA POUR LE TRAITEMENT DES CANCERS
La présente invention concerne une nouvelle utilisation d'oligonucléotides double brin, et plus particulièrement une utilisation selon une nouvelle formulation et un nouveau mode d'administration.
Depuis la découverte du mécanisme d'ARN interférence en 1998, des efforts considérables ont été entrepris pour développer le potentiel thérapeutique de cet outil pour les maladies humaines. Les micro RNAs (miRNAs) sont des petits ARN codés par le génome de tous les organismes eucaryotes. Après transcription et maturation, ils sont chargés dans un complexe protéique : RNA Induced Silencing Complex (RISC). Lorsqu'ils s'hybrident avec un ARN messagers (ARNm) soit ils induisent sa coupure, conduisant à la dégradation de l'ARNm, soit ils inhibent sa traduction en protéine. Les ARN interférents ou Small Interfering RNA (siRNA) sont des oligoribonucléotides double brins synthétiques qui une fois introduits dans les cellules miment l'action des miRNAs et déclenchent le mécanisme d'ARN
interférence. Leur mécanisme d'action n'est donc comparable à aucun autre type d'o ligonucléotide.
Un oligonucléotide double brin dans ce qui suit s'entend plus particulièrement d'un siRNA. Plus précisément, lorsque l'oligonucléotide double brin est un siRNA, il est chargé
dans le complexe RISC. L'un des deux brins, dit "passager" est coupé puis dégradé, l'autre brin, dit "guide", reste dans le complexe RISC. Ce brin guide s'hybride avec une région d'un ARNm dont il est complémentaire. Cet ARNm est nommé "ARNm cible" du siRNA et par extension, le gène qui est transcrit pour générer cet ARN est appelé le "gène cible" du siRNA.
Cet ARNm cible peut être codant ou non codant. Un siRNA coupe l'ARNm cible avec lequel il s'hybride et entraîne sa dégradation, ou bien il en empêche sa traduction.
Ceci se traduit par une diminution de la quantité de l'ARNm cible, et/ou par une diminution de la quantité de protéine codée par l'ARNm si celui-ci est un ARNm codant. Ces effets d'un siRNA sont collectivement nommés dans la suite de la description "effet inhibiteur de l'expression génique".
L'obstacle majeur qu'il faut surmonter pour pouvoir utiliser un siRNA dans un but thérapeutique, en particulier chez l'homme, est d'obtenir que le siRNA pénètre dans le ou les tissus d'intérêt, qu'il s'y maintienne dans un état actif en concentration suffisante et
La présente invention concerne une nouvelle utilisation d'oligonucléotides double brin, et plus particulièrement une utilisation selon une nouvelle formulation et un nouveau mode d'administration.
Depuis la découverte du mécanisme d'ARN interférence en 1998, des efforts considérables ont été entrepris pour développer le potentiel thérapeutique de cet outil pour les maladies humaines. Les micro RNAs (miRNAs) sont des petits ARN codés par le génome de tous les organismes eucaryotes. Après transcription et maturation, ils sont chargés dans un complexe protéique : RNA Induced Silencing Complex (RISC). Lorsqu'ils s'hybrident avec un ARN messagers (ARNm) soit ils induisent sa coupure, conduisant à la dégradation de l'ARNm, soit ils inhibent sa traduction en protéine. Les ARN interférents ou Small Interfering RNA (siRNA) sont des oligoribonucléotides double brins synthétiques qui une fois introduits dans les cellules miment l'action des miRNAs et déclenchent le mécanisme d'ARN
interférence. Leur mécanisme d'action n'est donc comparable à aucun autre type d'o ligonucléotide.
Un oligonucléotide double brin dans ce qui suit s'entend plus particulièrement d'un siRNA. Plus précisément, lorsque l'oligonucléotide double brin est un siRNA, il est chargé
dans le complexe RISC. L'un des deux brins, dit "passager" est coupé puis dégradé, l'autre brin, dit "guide", reste dans le complexe RISC. Ce brin guide s'hybride avec une région d'un ARNm dont il est complémentaire. Cet ARNm est nommé "ARNm cible" du siRNA et par extension, le gène qui est transcrit pour générer cet ARN est appelé le "gène cible" du siRNA.
Cet ARNm cible peut être codant ou non codant. Un siRNA coupe l'ARNm cible avec lequel il s'hybride et entraîne sa dégradation, ou bien il en empêche sa traduction.
Ceci se traduit par une diminution de la quantité de l'ARNm cible, et/ou par une diminution de la quantité de protéine codée par l'ARNm si celui-ci est un ARNm codant. Ces effets d'un siRNA sont collectivement nommés dans la suite de la description "effet inhibiteur de l'expression génique".
L'obstacle majeur qu'il faut surmonter pour pouvoir utiliser un siRNA dans un but thérapeutique, en particulier chez l'homme, est d'obtenir que le siRNA pénètre dans le ou les tissus d'intérêt, qu'il s'y maintienne dans un état actif en concentration suffisante et
2 suffisemment longtemps pour y produire l'inhibition de l'expression génique recherchée. La méthode d'administration du siRNA doit de plus être cliniquement acceptable, non toxique et ne pas déclencher de réaction immunitaire indésirable. La méthode doit être utilisable pour délivrer tout type de siRNA, quel que soit l'ARNm cible du siRNA et son niveau d'expression.
Par le passé des méthodes ont été développées pour distribuer dans l'organisme d'autres types d'oligonucléotides tels que par exemple des oligodeoxynucléotides antisens (ODN), des ribozymes, des aptamères, des morpholinos, ou des oligonucléotides formant triple hélice.
Plusieurs de ces oligonucléotides pénètrent dans les cellules par un mécanisme d'endocytose médiée par un récepteur (Vlassov et al., 1994) mais de tels mécanismes n'ont pas été mis en évidence pour les siRNA. Les méthodes développées pour administrer des oligonucléotides simple brins ARN ou ADN, notamment en absence d'agents de vectorisation, ne sont donc pas transposables aux siRNA et d'autres méthodes ont dû être développées dans ce but (Tatiparti et al., 2017).
La plupart des utilisations thérapeutiques nécessitent que le siRNA soit délivré de façon systémique dans l'organisme. Dans ce qui suit, on entend par systémique le fait que le siRNA
est véhiculé dans l'organisme pour agir à distance de l'endroit où il est administré, par opposition à une administration locale ou loco-régionale, notamment par opposition à une administration intratumorale. La distribution de façon systémique dans l'organisme est obtenue par toute méthode qui entraîne un passage du siRNA dans les fluides extracellulaires comme par exemple le sang, la lymphe ou le liquide céphalo-rachidien, que le composé
contenant le siRNA soit ingéré (voie orale), ou injecté (voie parentérale), ou qu'il pénètre à
travers la peau ou les muqueuses.
Les acides nucléiques en général et les siRNAs en particulier sont chargés négativement.
Lorsqu'ils sont à l'extérieur des cellules, cette charge négative limite leur pénétration dans les cellules. Pour cette raison, de nombreuses méthodes, comme par exemple l'électroporation, des liposomes, des nanoparticules, des polymères de différentes natures, ont été développées pour faire pénétrer un siRNA dans une cellule en culture. Cependant ces outils ne sont pas applicables pour administrer un siRNA de façon systémique dans un organisme vivant. La charge négative des siRNA facilite leur association avec des molécules cationiques telles que des compositions lipidiques ou polymériques. Pour utiliser des siRNA dans des organismes vivants, les siRNA ont été chimiquement conjugués ou incorporés dans différents agents de vectorisation. Un agent de vectorisation dans ce qui suit s'entend d'un agent qui a pour but de véhiculer l'oligonucléotide dans les fluides biologiques du point d'administration jusqu'au
Par le passé des méthodes ont été développées pour distribuer dans l'organisme d'autres types d'oligonucléotides tels que par exemple des oligodeoxynucléotides antisens (ODN), des ribozymes, des aptamères, des morpholinos, ou des oligonucléotides formant triple hélice.
Plusieurs de ces oligonucléotides pénètrent dans les cellules par un mécanisme d'endocytose médiée par un récepteur (Vlassov et al., 1994) mais de tels mécanismes n'ont pas été mis en évidence pour les siRNA. Les méthodes développées pour administrer des oligonucléotides simple brins ARN ou ADN, notamment en absence d'agents de vectorisation, ne sont donc pas transposables aux siRNA et d'autres méthodes ont dû être développées dans ce but (Tatiparti et al., 2017).
La plupart des utilisations thérapeutiques nécessitent que le siRNA soit délivré de façon systémique dans l'organisme. Dans ce qui suit, on entend par systémique le fait que le siRNA
est véhiculé dans l'organisme pour agir à distance de l'endroit où il est administré, par opposition à une administration locale ou loco-régionale, notamment par opposition à une administration intratumorale. La distribution de façon systémique dans l'organisme est obtenue par toute méthode qui entraîne un passage du siRNA dans les fluides extracellulaires comme par exemple le sang, la lymphe ou le liquide céphalo-rachidien, que le composé
contenant le siRNA soit ingéré (voie orale), ou injecté (voie parentérale), ou qu'il pénètre à
travers la peau ou les muqueuses.
Les acides nucléiques en général et les siRNAs en particulier sont chargés négativement.
Lorsqu'ils sont à l'extérieur des cellules, cette charge négative limite leur pénétration dans les cellules. Pour cette raison, de nombreuses méthodes, comme par exemple l'électroporation, des liposomes, des nanoparticules, des polymères de différentes natures, ont été développées pour faire pénétrer un siRNA dans une cellule en culture. Cependant ces outils ne sont pas applicables pour administrer un siRNA de façon systémique dans un organisme vivant. La charge négative des siRNA facilite leur association avec des molécules cationiques telles que des compositions lipidiques ou polymériques. Pour utiliser des siRNA dans des organismes vivants, les siRNA ont été chimiquement conjugués ou incorporés dans différents agents de vectorisation. Un agent de vectorisation dans ce qui suit s'entend d'un agent qui a pour but de véhiculer l'oligonucléotide dans les fluides biologiques du point d'administration jusqu'au
3 tissu cible et de le faire pénétrer à l'intérieur de la cellule, soit en pénétrant avec l'oligonucléotide jusqu'à l'intérieur de la cellule, soit en fusionnant avec la membrane plasmique de la cellule et en libérant l'oligonucléotide à l'intérieur de celle-ci. Ces agents de vectorisation sont d'une part des composés contenant des macromolécules qui forment des complexes avec les oligonucléotides, sous forme d'une particule d'une taille supérieure à 20 nm, et d'autre part des conjugués chimiques associant par une liaison covalente l'un et/ou l'autre brin d'un siRNA à un composé destiné à le faire pénétrer dans la cellule, comme par exemple du cholestérol ou un peptide pénétrant. Les "peptides pénétrants" sont des peptides capables de pénétrer spontanément à l'intérieur des cellules et conservent cette propriété
lorsqu'ils sont conjugués avec une molécule, entraînant la traversée de cette dernière. Ainsi, les agents de vectorisation peuvent être composés de différents types de macromolécules, comme des lipides micellaires, du cholestérol, des liposomes, des polymères, des polyplexes, des chitosans, des quantum dots, des peptides pénétrants, des dendrimères, des dérivés de la polyéthylènimine, des nanoparticules, des sphères magnétiques ou supra magnatiques, ou des nanostructures inorganiques ou organiques.
Le consensus le plus général dans la communauté scientifique et médicale est de dire que les siRNA non vectorisés sont inefficaces, et qu'ils doivent être stabilisés et vectorisés pour être actifs (Scomparin et al., 2015). De très nombreux agents de vectorisation ont ainsi été développés pour les siRNA. Plusieurs sont utilisés dans des essais thérapeutiques chez l'homme, dans différentes indications. La mise en oeuvre de ces outils de vectorisation est généralement complexe, nécessitant des étapes successives et des processus bien contrôlés et/ou le couplage covalent de l'oligonucléotide à un autre composant. Il a été
montré que plusieurs classes d'agents de vectorisation, du fait de leur nature chimique ou structurale, ou du fait de leur association avec un oligonucléotide, présentaient des effets toxiques ou déclenchaient une réponse immunitaire indésirable chez l'animal ou les humains (Robbins et al., 2009) ce qui n'est pas le cas avec des siRNAs non vectorisés (Heidel et al., 2004). De plus, ces agents de vectorisation distribuent souvent préférentiellement les siRNAs dans certains organes, en particulier le foie, ce qui limite leur utilisation thérapeutique dans d'autres organes. Une méthode d'administration ne nécessitant pas d'ajouter des agents de vectorisation est donc avantageuse.
Différentes méthodes ont ainsi déjà été proposées pour administrer des siRNAs non vectorisés de façon systémique et inhiber l'expression d'un gène dans un tissu ou dans une tumeur. La première méthode proposée, dite hydrodynamique, a été d'injecter par voie
lorsqu'ils sont conjugués avec une molécule, entraînant la traversée de cette dernière. Ainsi, les agents de vectorisation peuvent être composés de différents types de macromolécules, comme des lipides micellaires, du cholestérol, des liposomes, des polymères, des polyplexes, des chitosans, des quantum dots, des peptides pénétrants, des dendrimères, des dérivés de la polyéthylènimine, des nanoparticules, des sphères magnétiques ou supra magnatiques, ou des nanostructures inorganiques ou organiques.
Le consensus le plus général dans la communauté scientifique et médicale est de dire que les siRNA non vectorisés sont inefficaces, et qu'ils doivent être stabilisés et vectorisés pour être actifs (Scomparin et al., 2015). De très nombreux agents de vectorisation ont ainsi été développés pour les siRNA. Plusieurs sont utilisés dans des essais thérapeutiques chez l'homme, dans différentes indications. La mise en oeuvre de ces outils de vectorisation est généralement complexe, nécessitant des étapes successives et des processus bien contrôlés et/ou le couplage covalent de l'oligonucléotide à un autre composant. Il a été
montré que plusieurs classes d'agents de vectorisation, du fait de leur nature chimique ou structurale, ou du fait de leur association avec un oligonucléotide, présentaient des effets toxiques ou déclenchaient une réponse immunitaire indésirable chez l'animal ou les humains (Robbins et al., 2009) ce qui n'est pas le cas avec des siRNAs non vectorisés (Heidel et al., 2004). De plus, ces agents de vectorisation distribuent souvent préférentiellement les siRNAs dans certains organes, en particulier le foie, ce qui limite leur utilisation thérapeutique dans d'autres organes. Une méthode d'administration ne nécessitant pas d'ajouter des agents de vectorisation est donc avantageuse.
Différentes méthodes ont ainsi déjà été proposées pour administrer des siRNAs non vectorisés de façon systémique et inhiber l'expression d'un gène dans un tissu ou dans une tumeur. La première méthode proposée, dite hydrodynamique, a été d'injecter par voie
4 intraveineuse une solution saline contenant le siRNA en quelques secondes et dans un grand volume : 1.8 mL chez la souris, correspondant à plus de la moitié de son volume sanguin (McCaffrey et al., 2002). Cette méthode est inapplicable à l'homme et aux animaux de grande taille.
D'autres auteurs ont utilisé une administration de siRNAs non vectorisés par voie intrapéritonéale chez la souris. Cette méthode est efficace et permet d'inhiber l'expression de la cible du siRNA, et d'inhiber la croissance de tumeurs xenogreffées chez des souris. Ceci est illustré dans la littérature (Delloye-Bourgeois et al., 2009; Pannequin et al., 2007).
L'injection intrapéritonéale de siRNAs dirigés contre le récepteur des androgènes (siAR-1) (Compagno et al., 2007) ou contre la thrombospondine-1 (siTSP1-1) (Firlej et al., 2011) inhibe efficacement la croissance de tumeurs prostatiques xenogreffées chez des souris.
La voie intrapéritonéale est efficace chez l'animal mais elle est complexe à
utiliser chez l'homme, surtout si elle doit être utilisée de façon répétée, notamment du fait de risques infectieux car elle nécessite la pose chirurgicale d'un cathéther et son usage est généralement restreint au traitement de pathologies se développant dans le péritoine ou dans des organes intrapéritonéeaux comme les ovaires. Même dans ces indications thérapeutiques, cette voie d'administration présente des obstacles importants qui en limitent l'usage et l'efficacité et il est donc nécessaire de disposer de solutions alternatives (Zeimet et al., 2009).
L'administration de siRNA non vectorisés par voie intraveineuse a également été testée.
Cependant, comme d'autres oligonucléotides, les siRNA injectés par voie intraveineuse sont éliminés par filtration rénale (van de Water et al., 2006).
Il n'existe donc pas à ce jour de mode d'administration de siRNA compatible avec un usage en clinique humaine, sans agent de vectorisation, permettant de les adresser efficacement dans de nombreux organes cibles, notamment dans la prostate, et/ou dans des tumeurs et/ou les métastases de tumeurs, dans le but de prévenir et/ou traiter des pathologies.
Il existe un réel besoin de fournir un tel moyen. L'un des buts de l'invention est ainsi de fournir des modes d'administration permettant de distribuer efficacement des siRNA dans de nombreux organes cibles, notamment dans la prostate, et/ou dans des tumeurs et/ou dans les métastases de ces tumeurs, afin de prévenir et/ou traiter des pathologies résultant directement ou indirectement de l'expression d'un gène, le siRNA ciblant l'ARNm transcrit à partir de ce gène.
Des solutions ont été décrites pour adresser des oligonucléotides vers des cellules particulières de l'organisme. Dans ce qui suit, une "molécule d'adressage" est une molécule
D'autres auteurs ont utilisé une administration de siRNAs non vectorisés par voie intrapéritonéale chez la souris. Cette méthode est efficace et permet d'inhiber l'expression de la cible du siRNA, et d'inhiber la croissance de tumeurs xenogreffées chez des souris. Ceci est illustré dans la littérature (Delloye-Bourgeois et al., 2009; Pannequin et al., 2007).
L'injection intrapéritonéale de siRNAs dirigés contre le récepteur des androgènes (siAR-1) (Compagno et al., 2007) ou contre la thrombospondine-1 (siTSP1-1) (Firlej et al., 2011) inhibe efficacement la croissance de tumeurs prostatiques xenogreffées chez des souris.
La voie intrapéritonéale est efficace chez l'animal mais elle est complexe à
utiliser chez l'homme, surtout si elle doit être utilisée de façon répétée, notamment du fait de risques infectieux car elle nécessite la pose chirurgicale d'un cathéther et son usage est généralement restreint au traitement de pathologies se développant dans le péritoine ou dans des organes intrapéritonéeaux comme les ovaires. Même dans ces indications thérapeutiques, cette voie d'administration présente des obstacles importants qui en limitent l'usage et l'efficacité et il est donc nécessaire de disposer de solutions alternatives (Zeimet et al., 2009).
L'administration de siRNA non vectorisés par voie intraveineuse a également été testée.
Cependant, comme d'autres oligonucléotides, les siRNA injectés par voie intraveineuse sont éliminés par filtration rénale (van de Water et al., 2006).
Il n'existe donc pas à ce jour de mode d'administration de siRNA compatible avec un usage en clinique humaine, sans agent de vectorisation, permettant de les adresser efficacement dans de nombreux organes cibles, notamment dans la prostate, et/ou dans des tumeurs et/ou les métastases de tumeurs, dans le but de prévenir et/ou traiter des pathologies.
Il existe un réel besoin de fournir un tel moyen. L'un des buts de l'invention est ainsi de fournir des modes d'administration permettant de distribuer efficacement des siRNA dans de nombreux organes cibles, notamment dans la prostate, et/ou dans des tumeurs et/ou dans les métastases de ces tumeurs, afin de prévenir et/ou traiter des pathologies résultant directement ou indirectement de l'expression d'un gène, le siRNA ciblant l'ARNm transcrit à partir de ce gène.
Des solutions ont été décrites pour adresser des oligonucléotides vers des cellules particulières de l'organisme. Dans ce qui suit, une "molécule d'adressage" est une molécule
5 adressant l'oligonucléotide vers un type cellulaire particulier, comme par exemple les cellules endothéliales ou les cellules cancéreuses. Une molécule d'adressage n'est pas destinée à faire pénétrer l'oligonucléotide à l'intérieur de la cellule ou à pénétrer avec l'oligonucléotide mais à
augmenter sa concentration à la membrane externe de la cellule d'intérêt. Par exemple et de façon non exhaustive, une molécule d'adressage peut être un aptamère, un anticorps, la transferrine, un peptide RGD, le ligand d'un récepteur, cette molécule d'adressage interagissant ou se liant à une molécule exprimée à la surface des cellules ciblées, comme par exemple un récepteur, une intégrine, un antigène membranaire comme par exemple le PSMA
(Prostate Specific Membrane Antigen).
La molécule d'adressage est usuellement soit couplée de façon covalente avec l'oligonucléotide, soit incorporée dans un agent de vectorisation, par exemple une nanoparticule ou un liposome contenant l'oligonucléotide, de façon à adresser l'agent de vectorisation vers la cellule ou le tissu cible. Il n'y a pas de solution décrivant le mélange d'un siRNA avec un composé dans une mise en oeuvre simple, notamment sans couplage covalent ou sans incorporation dans un agent de vectorisation, et permettant d'adresser un siRNA vers un type cellulaire particulier.
Le récepteur CD36 est un récepteur membranaire exprimé à la membrane des cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques et exprimé par de nombreux types de cellules, notamment des cellules tumorales, par exemple des cellules leucémiques. Le récepteur CD36 lie des molécules de différentes natures. C'est en particulier un récepteur des acides gras à
longues chaînes, en particulier des acides gras en C16 ou C18, un récepteur des lipoprotéines de basse densité oxydées, ou LDL oxydées, un récepteur des phospholipides oxydés, un récepteur de la Thrombospondine, un récepteur du peptide hexaréline, un récepteur de l'amyloide fibrillaire.
L'effet inhibiteur de l'expression génique d'un siRNA est transitoire :
lorsqu'un siRNA
pénètre dans une cellule, il inhibe l'expression de son gène cible pendant une durée qui est d'autant plus courte que les cellules se divisent fréquemment, ce qui est notamment le cas de la plupart des cellules cancéreuses. On observe ensuite une restauration de la quantité
d'ARNm transcrite à partir de ce gène cible et/ou de la proteine codée par cet ARNm, créant un effet de "pics et de vallées" (Bartlett and Davis, 2006).
augmenter sa concentration à la membrane externe de la cellule d'intérêt. Par exemple et de façon non exhaustive, une molécule d'adressage peut être un aptamère, un anticorps, la transferrine, un peptide RGD, le ligand d'un récepteur, cette molécule d'adressage interagissant ou se liant à une molécule exprimée à la surface des cellules ciblées, comme par exemple un récepteur, une intégrine, un antigène membranaire comme par exemple le PSMA
(Prostate Specific Membrane Antigen).
La molécule d'adressage est usuellement soit couplée de façon covalente avec l'oligonucléotide, soit incorporée dans un agent de vectorisation, par exemple une nanoparticule ou un liposome contenant l'oligonucléotide, de façon à adresser l'agent de vectorisation vers la cellule ou le tissu cible. Il n'y a pas de solution décrivant le mélange d'un siRNA avec un composé dans une mise en oeuvre simple, notamment sans couplage covalent ou sans incorporation dans un agent de vectorisation, et permettant d'adresser un siRNA vers un type cellulaire particulier.
Le récepteur CD36 est un récepteur membranaire exprimé à la membrane des cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques et exprimé par de nombreux types de cellules, notamment des cellules tumorales, par exemple des cellules leucémiques. Le récepteur CD36 lie des molécules de différentes natures. C'est en particulier un récepteur des acides gras à
longues chaînes, en particulier des acides gras en C16 ou C18, un récepteur des lipoprotéines de basse densité oxydées, ou LDL oxydées, un récepteur des phospholipides oxydés, un récepteur de la Thrombospondine, un récepteur du peptide hexaréline, un récepteur de l'amyloide fibrillaire.
L'effet inhibiteur de l'expression génique d'un siRNA est transitoire :
lorsqu'un siRNA
pénètre dans une cellule, il inhibe l'expression de son gène cible pendant une durée qui est d'autant plus courte que les cellules se divisent fréquemment, ce qui est notamment le cas de la plupart des cellules cancéreuses. On observe ensuite une restauration de la quantité
d'ARNm transcrite à partir de ce gène cible et/ou de la proteine codée par cet ARNm, créant un effet de "pics et de vallées" (Bartlett and Davis, 2006).
6 L'efficacité d'un siRNA est dépendante de sa concentration dans les cellules du tissu ciblé
et de son temps de résidence dans ce tissu. Cette concentration dépend elle-même de la dose de siRNA administrée, de la stabilité de celui-ci dans les milieux extracellulaires, de sa capacité à pénétrer dans les cellules des tissus cibles, de la cinétique de cette pénétration, et de celle de son élimination. L'un des buts de l'invention est de fournir des méthodes d'administration systémique de siRNA, et notamment des formulations, qui augmentent la concentration du siRNA dans le sérum et/ou dans les tissus et /ou prolongent la durée de ses effets en évitant les effets de pics et de vallées.
L'invention concerne ainsi une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA
s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue.
Un siRNA selon la présente invention s'entend d'un couple de deux oligoribonucléotides qui s'hybrident entre eux, chaque oligoribonucléotide comprenant de 2 à 100, notamment 5 à
50, de préférence 13 à 25 et plus particulièrement 19, 20 ou 21 ribonucléotides. De 2 à
100 signifie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100.
Selon l'invention, et dans un aspect particulier, ledit siRNA peut présenter des modifications chimiques telles que des modifications chimiques sur le brin guide ou le brin passager, sur un ou plusieurs nucléotides situés aux extrémités terminales 3' ou 5', et/ou sur un ou plusieurs nucléotides constituant le squelette interne.
Lesdites modifications chimiques selon l'invention se situent sur le ribose et/ou la base et/ou l'acide phosphorique. Lesdites modifications chimiques selon l'invention comprennent au moins une substitution du groupement OH en 2' du ribose par un groupement 2'-0-methyl RNA (2'0Me) ou 2'-0-methoxyethyl (2'MOE) ou 2'-fluoro (2'F) ou 2'-fluoro-13-arabinonucleotide (FANA), une allylation de l'oxygène en 2' en aminoethyl-, guanidinoethyl-, cyanoethyl- ou alkyl, un remplacement du groupement phosphodiester par un
et de son temps de résidence dans ce tissu. Cette concentration dépend elle-même de la dose de siRNA administrée, de la stabilité de celui-ci dans les milieux extracellulaires, de sa capacité à pénétrer dans les cellules des tissus cibles, de la cinétique de cette pénétration, et de celle de son élimination. L'un des buts de l'invention est de fournir des méthodes d'administration systémique de siRNA, et notamment des formulations, qui augmentent la concentration du siRNA dans le sérum et/ou dans les tissus et /ou prolongent la durée de ses effets en évitant les effets de pics et de vallées.
L'invention concerne ainsi une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA
s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue.
Un siRNA selon la présente invention s'entend d'un couple de deux oligoribonucléotides qui s'hybrident entre eux, chaque oligoribonucléotide comprenant de 2 à 100, notamment 5 à
50, de préférence 13 à 25 et plus particulièrement 19, 20 ou 21 ribonucléotides. De 2 à
100 signifie 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100.
Selon l'invention, et dans un aspect particulier, ledit siRNA peut présenter des modifications chimiques telles que des modifications chimiques sur le brin guide ou le brin passager, sur un ou plusieurs nucléotides situés aux extrémités terminales 3' ou 5', et/ou sur un ou plusieurs nucléotides constituant le squelette interne.
Lesdites modifications chimiques selon l'invention se situent sur le ribose et/ou la base et/ou l'acide phosphorique. Lesdites modifications chimiques selon l'invention comprennent au moins une substitution du groupement OH en 2' du ribose par un groupement 2'-0-methyl RNA (2'0Me) ou 2'-0-methoxyethyl (2'MOE) ou 2'-fluoro (2'F) ou 2'-fluoro-13-arabinonucleotide (FANA), une allylation de l'oxygène en 2' en aminoethyl-, guanidinoethyl-, cyanoethyl- ou alkyl, un remplacement du groupement phosphodiester par un
7 PCT/FR2017/052214 phosphorothioate, une alkylation ou une thiolation de un ou plusieurs nucléotides du siRNA, le remplacement d'un ribonucléotide par un desoxyribonucléotide, ou le remplacement d'un nucléotide par un Locked Nucleic Acid (LNA).
Dans un autre aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique, et comporte deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Dans un autre aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique, et ne comporte pas deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
L'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit siRNA peut être n'importe quel type de siRNA. En effet, la formulation et la méthode d'administration, objet de la présente invention, ne dépend ni du siRNA administré
ni de la cible du siRNA comme illustré par les exemples 3 et 9.
Dans un aspect particulièrement préféré, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée (systémique et continue), dans laquelle au moins un siRNA
comprend ou est constitué par l'un des couples d'oligonucléotides tels que définis dans le Tableau 1.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit au moins un siRNA est l'un des siRNA
suivants: siAR-1, siAR- lb, siAR-2, siAR-2b, siAR-3, siAR-3b, siAR-4, siAR4b, siAR-5, siAR-5b, siVEGF-1, siVEGF-lb, siTSP1-1, siTSP1-1b, siTSP1-2, siTSP1-2b, siTSP1-3, siTSP1-3b, siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b, siFoxP3-1, siFoxP3-1b, siFoxP3-2, siFoxP3-2b, tels qu'indiqués dans le Tableau 1 et de sequences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 52.
La présente invention repose également sur les résultats inattendus des Inventeurs qui ont mis en évidence de nouveaux siRNA ciblant le facteur de transcription FoxP3.
Les siRNA ciblant FoxP3 sont plus particulièrement utilisés pour cibler les cellules suppressives ou immunosuppressives en particulier les lymphocytes T
suppresseurs également appelés lymphocytes T régulateurs, et en particulier dans tous les types de cancers ou dans les maladies auto immunes. Les oligonucléotides ciblant FoxP3 sont aussi utilisés pour cibler des cellules cancéreuses exprimant ce facteur de transcription.
Dans un autre aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique, et comporte deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Dans un autre aspect particulier, ledit siRNA est dépourvu de modification chimique, et ne comporte pas deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
L'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit siRNA peut être n'importe quel type de siRNA. En effet, la formulation et la méthode d'administration, objet de la présente invention, ne dépend ni du siRNA administré
ni de la cible du siRNA comme illustré par les exemples 3 et 9.
Dans un aspect particulièrement préféré, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée (systémique et continue), dans laquelle au moins un siRNA
comprend ou est constitué par l'un des couples d'oligonucléotides tels que définis dans le Tableau 1.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit au moins un siRNA est l'un des siRNA
suivants: siAR-1, siAR- lb, siAR-2, siAR-2b, siAR-3, siAR-3b, siAR-4, siAR4b, siAR-5, siAR-5b, siVEGF-1, siVEGF-lb, siTSP1-1, siTSP1-1b, siTSP1-2, siTSP1-2b, siTSP1-3, siTSP1-3b, siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b, siFoxP3-1, siFoxP3-1b, siFoxP3-2, siFoxP3-2b, tels qu'indiqués dans le Tableau 1 et de sequences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 52.
La présente invention repose également sur les résultats inattendus des Inventeurs qui ont mis en évidence de nouveaux siRNA ciblant le facteur de transcription FoxP3.
Les siRNA ciblant FoxP3 sont plus particulièrement utilisés pour cibler les cellules suppressives ou immunosuppressives en particulier les lymphocytes T
suppresseurs également appelés lymphocytes T régulateurs, et en particulier dans tous les types de cancers ou dans les maladies auto immunes. Les oligonucléotides ciblant FoxP3 sont aussi utilisés pour cibler des cellules cancéreuses exprimant ce facteur de transcription.
8 Dans un aspect particulier, la présente invention concerne également un siRNA
inhibant la synthèse du facteur de transcription FoxP3, dans lequel ledit siRNA est l'un des siRNA
suivants : siFoxP3-1, siFoxP3-1b, siFoxP3-2 ou siFoxP3-2b tels que définis dans le Tableau 1 pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un aspect particulier, dans ladite composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3, ledit siRNAprésente des modifications chimiques.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3, ledit siRNAest dépourvu de modification chimique.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3, ledit siRNAest dépourvu de modification chimique et comporte deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3, ledit siRNAest dépourvu de modification chimique et ne comporte pas deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siAR-1, siAR-lb, siAR-2, siAR-2b, siAR-3, siAR-3b, siAR-4, siAR-4b, siAR-5, siAR-5b sont collectivement dénommés famille des siRNA-AR.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siVEGF-1, siVEGF-lb sont collectivement dénommés famille des siRNA-VEGF.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siTSP1-1, siTSP1-1b, siTSP1-2, siTSP1-2b, siTSP1-3, siTSP1-3b, siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b sont collectivement dénommés famille des siRNA-TSP1.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siFOXP3-1, siFOXP3-lb, siFOXP3-2, siFOXP3-2b, sont collectivement dénommés famille des siRNA-FoxP3.
L'expression au moins 75% d'identité avec une séquence dans le Tableau 1 signifie 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
inhibant la synthèse du facteur de transcription FoxP3, dans lequel ledit siRNA est l'un des siRNA
suivants : siFoxP3-1, siFoxP3-1b, siFoxP3-2 ou siFoxP3-2b tels que définis dans le Tableau 1 pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un aspect particulier, dans ladite composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3, ledit siRNAprésente des modifications chimiques.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3, ledit siRNAest dépourvu de modification chimique.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3, ledit siRNAest dépourvu de modification chimique et comporte deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Dans un aspect particulier, ladite composition pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du facteur de transcription FoxP3, ledit siRNAest dépourvu de modification chimique et ne comporte pas deux désoxynucléotides débordant à l'extrémité 3', notamment deux désoxythymidines.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siAR-1, siAR-lb, siAR-2, siAR-2b, siAR-3, siAR-3b, siAR-4, siAR-4b, siAR-5, siAR-5b sont collectivement dénommés famille des siRNA-AR.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siVEGF-1, siVEGF-lb sont collectivement dénommés famille des siRNA-VEGF.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siTSP1-1, siTSP1-1b, siTSP1-2, siTSP1-2b, siTSP1-3, siTSP1-3b, siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b sont collectivement dénommés famille des siRNA-TSP1.
Tels que définis dans le Tableau 1, dans l'invention, les siRNA siFOXP3-1, siFOXP3-lb, siFOXP3-2, siFOXP3-2b, sont collectivement dénommés famille des siRNA-FoxP3.
L'expression au moins 75% d'identité avec une séquence dans le Tableau 1 signifie 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
9 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% et 100%, notamment 79%, 81%, 84%, 86%, 90%, 95% et 99%.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit au moins un siRNA est un mélange de siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mélange est un mélange de deux siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mélange est un mélange de trois siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mélange de siRNA comprend ou est constitué
des siRNA
suivants :
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siVEGF-1 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siTSP1-1 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siFoxP3-2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA
appartenant à la famille des siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siVEGF-1 et le siRNA siTSP1-1 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA appartenant à
la famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siVEGF-1 et le siRNA
siFoxP3-2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1 avec un siRNA
appartenant à la famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siTSP1-1 et le siRNA
siFoxP3-2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA
appartenant à la famille des siRNA-TSP1, et avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siVEGF-1 avec le siRNA siTSP1-1 et avec le siRNA siFoxP3-2 ; un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1, avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR, et en particulier le siRNA siVEGF-1 avec le siRNA siTSP1-1 et avec le siRNA siAR-1.
Un aspect avantageux de l'invention concerne une composition dans laquelle ledit siRNA
est le siAR-1, de SEQ ID NO 1 et 2, pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à
l'expression du
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit au moins un siRNA est un mélange de siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mélange est un mélange de deux siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mélange est un mélange de trois siRNA.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mélange de siRNA comprend ou est constitué
des siRNA
suivants :
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siVEGF-1 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siTSP1-1 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1 et le siRNA siFoxP3-2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA
appartenant à la famille des siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siVEGF-1 et le siRNA siTSP1-1 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA appartenant à
la famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siVEGF-1 et le siRNA
siFoxP3-2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1 avec un siRNA
appartenant à la famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siTSP1-1 et le siRNA
siFoxP3-2 ;
- un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA
appartenant à la famille des siRNA-TSP1, et avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-FoxP3, et en particulier le siRNA siVEGF-1 avec le siRNA siTSP1-1 et avec le siRNA siFoxP3-2 ; un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1, avec un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR, et en particulier le siRNA siVEGF-1 avec le siRNA siTSP1-1 et avec le siRNA siAR-1.
Un aspect avantageux de l'invention concerne une composition dans laquelle ledit siRNA
est le siAR-1, de SEQ ID NO 1 et 2, pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à
l'expression du
10 récepteur des androgènes, notamment pour la prévention et/ou le traitement du cancer de la prostate ou des métastases de ce cancer, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, selon un mode d'administration systémique continue.
Dans tous les aspects de la présente invention, la pathologie selon l'invention est une pathologie humaine ou animale.
Selon un aspect particulier de l'invention, la pathologie selon l'invention est plus particulièrement associée à l'expression de l'ARNm codant le récepteur des androgènes (AR), ou la Thrombospondine-1 (TSP1), ou le facteur de transcription FoxP3, ou le Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF).
La pathologie selon l'invention, qu'elle soit associée ou non à l'expression d'AR, ou de la TSP1, ou de FoxP3, ou du VEGF, est plus particulièrement une tumeur primaire, une tumeur métastatique, ou une pathologie associée à la présence de cellules suppressives ou immunosuppressives.
Une "tumeur primaire" selon l'invention est notamment et de façon non limitative un cancer de l'anus, de l'appendice, de la bouche, des bronches et/ou des voies aériennes supérieures, du canal biliaire, de la cavité nasale et paranasale, du cerveau, du coeur, du col de l'utérus, du colon, du corps de l'utérus, de l'estomac, du foie, des glandes salivaires, de la gorge, de la langue, des lèvres, du nasopharynx, de l'oesophage, des os, de l'ovaire, du pancréas, de la parathyroïde, du pénis, de la plèvre, du poumon, de la prostate, du rectum, du rein, du sein, des surrénales, des testicules, de la tête et du cou, du thymus, de la thyroïde, de l'urètre, du vagin, de la vésicule biliaire, de la vessie, de la vulve, un cancer gastro-intestinal, un lymphome, un mélanome ou un cancer de la peau hors mélanome, un myélome, un sarcome, une leucémie, un mésotheliome, un cholangiocarcinome, un ostéosarcome, un glioblastome, un astrocytome, un oligodendrogliome, un chondrosarcome, un liposarcome, un rhabdomyosarcome, ou un pheochromocytome, collectivement nommés tumeurs primaires dans la suite de la description, ou les métastases de n'importe laquelle de ces tumeurs primaires se développant dans d'autres organes. Les métastases représentent une complication fréquente et majeure des cancers et les échecs thérapeutiques en cancérologie sont majoritairement liés au développement de métastases. Une tumeur primaire peut se disséminer pour former une ou plusieurs métastases, dans un seul ou dans plusieurs types de tissus tels que les os, le foie, la rate, les ganglions ou le cerveau. Pour traiter les cancers avec
Dans tous les aspects de la présente invention, la pathologie selon l'invention est une pathologie humaine ou animale.
Selon un aspect particulier de l'invention, la pathologie selon l'invention est plus particulièrement associée à l'expression de l'ARNm codant le récepteur des androgènes (AR), ou la Thrombospondine-1 (TSP1), ou le facteur de transcription FoxP3, ou le Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF).
La pathologie selon l'invention, qu'elle soit associée ou non à l'expression d'AR, ou de la TSP1, ou de FoxP3, ou du VEGF, est plus particulièrement une tumeur primaire, une tumeur métastatique, ou une pathologie associée à la présence de cellules suppressives ou immunosuppressives.
Une "tumeur primaire" selon l'invention est notamment et de façon non limitative un cancer de l'anus, de l'appendice, de la bouche, des bronches et/ou des voies aériennes supérieures, du canal biliaire, de la cavité nasale et paranasale, du cerveau, du coeur, du col de l'utérus, du colon, du corps de l'utérus, de l'estomac, du foie, des glandes salivaires, de la gorge, de la langue, des lèvres, du nasopharynx, de l'oesophage, des os, de l'ovaire, du pancréas, de la parathyroïde, du pénis, de la plèvre, du poumon, de la prostate, du rectum, du rein, du sein, des surrénales, des testicules, de la tête et du cou, du thymus, de la thyroïde, de l'urètre, du vagin, de la vésicule biliaire, de la vessie, de la vulve, un cancer gastro-intestinal, un lymphome, un mélanome ou un cancer de la peau hors mélanome, un myélome, un sarcome, une leucémie, un mésotheliome, un cholangiocarcinome, un ostéosarcome, un glioblastome, un astrocytome, un oligodendrogliome, un chondrosarcome, un liposarcome, un rhabdomyosarcome, ou un pheochromocytome, collectivement nommés tumeurs primaires dans la suite de la description, ou les métastases de n'importe laquelle de ces tumeurs primaires se développant dans d'autres organes. Les métastases représentent une complication fréquente et majeure des cancers et les échecs thérapeutiques en cancérologie sont majoritairement liés au développement de métastases. Une tumeur primaire peut se disséminer pour former une ou plusieurs métastases, dans un seul ou dans plusieurs types de tissus tels que les os, le foie, la rate, les ganglions ou le cerveau. Pour traiter les cancers avec
11 un siRNA ou une combinaison de siRNA, il est donc particulièrement utile et avantageux de disposer de méthodes d'administration qui distribuent le ou les siRNAs dans plusieurs tissus.
L'expression pathologie associée à la présence de cellules suppressives ou immunosuppressives signifie que lesdites cellules suppressives ou immunosupressives facilitent le développement d'une pathologie et notamment l'initiation, l'implantation ou le développement d'une tumeur ou sa dissémination métastatique. Ce terme regroupe en particulier les lymphocytes T régulateurs, également appelés T suppresseurs, les lymphocytes Th17 et les MDSC (myeloid-derived suppressor cells).
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit siRNA est utilisée en association avec au moins un agent anti-angiogénique et/ou un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. L'expression séparée ou étalée dans le temps signifie également successives .
Selon l'invention, le terme agent anti-angiogénique signifie un agent destiné
à inhiber la formation de vaisseaux sanguins, notamment en inhibant l'expression ou la fonction de VEGF, FGF2, PDGF, HGF, MET, FLT3, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, KIT, TIE1, TIE2, RET, TRKB, AXL. De tels agents sont notamment Cilengitide, Vandetanib, Lenalidomide, Thalidomide, Arsenic Trioxide, Bevacizumab, ou encore des agents listés dans le Tableau 2.
Selon l'invention, un agent immunothérapeutique est un agent qui a pour objectif de stimuler, notamment par une vaccination, et/ou de rétablir une réponse immunitaire, notamment par l'inhibition des cellules immunosuppressives ou suppressives, et/ou par inhibition de l'anergie des lymphocytes. Les immunothérapies au sens de l'invention sont notamment les thérapies mettant en oeuvre l'administration de cytokines, d'anticorps ciblant les points de contrôle et de régulation du système immunitaire (check-point immunitaires, par exemple PD1, PDL1, CTLA4, Tigit), le traitement par des lymphocytes T, génétiquement modifiés (Car-T) ou non, ou par des cellules dendritiques, la vaccination, les traitements anti-helminthes. Un tel agent est notamment choisi parmi Ipilimumab, nivolimumab, T-Vec, Sipuleucel-T, Blinatumomab, Pembrolizumab, ou parmi les agents du Tableau 3.
Selon l'invention, un agent anti-tumoral ou chimiothérapeutique est un agent possédant des propriétés anti-cancéreuses choisi parmi : les agents alkylants, les agents anti-métabolites, les antibiotiques cytotoxiques, les inhibiteurs de topoisomérase I, les inhibiteurs
L'expression pathologie associée à la présence de cellules suppressives ou immunosuppressives signifie que lesdites cellules suppressives ou immunosupressives facilitent le développement d'une pathologie et notamment l'initiation, l'implantation ou le développement d'une tumeur ou sa dissémination métastatique. Ce terme regroupe en particulier les lymphocytes T régulateurs, également appelés T suppresseurs, les lymphocytes Th17 et les MDSC (myeloid-derived suppressor cells).
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit siRNA est utilisée en association avec au moins un agent anti-angiogénique et/ou un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. L'expression séparée ou étalée dans le temps signifie également successives .
Selon l'invention, le terme agent anti-angiogénique signifie un agent destiné
à inhiber la formation de vaisseaux sanguins, notamment en inhibant l'expression ou la fonction de VEGF, FGF2, PDGF, HGF, MET, FLT3, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, KIT, TIE1, TIE2, RET, TRKB, AXL. De tels agents sont notamment Cilengitide, Vandetanib, Lenalidomide, Thalidomide, Arsenic Trioxide, Bevacizumab, ou encore des agents listés dans le Tableau 2.
Selon l'invention, un agent immunothérapeutique est un agent qui a pour objectif de stimuler, notamment par une vaccination, et/ou de rétablir une réponse immunitaire, notamment par l'inhibition des cellules immunosuppressives ou suppressives, et/ou par inhibition de l'anergie des lymphocytes. Les immunothérapies au sens de l'invention sont notamment les thérapies mettant en oeuvre l'administration de cytokines, d'anticorps ciblant les points de contrôle et de régulation du système immunitaire (check-point immunitaires, par exemple PD1, PDL1, CTLA4, Tigit), le traitement par des lymphocytes T, génétiquement modifiés (Car-T) ou non, ou par des cellules dendritiques, la vaccination, les traitements anti-helminthes. Un tel agent est notamment choisi parmi Ipilimumab, nivolimumab, T-Vec, Sipuleucel-T, Blinatumomab, Pembrolizumab, ou parmi les agents du Tableau 3.
Selon l'invention, un agent anti-tumoral ou chimiothérapeutique est un agent possédant des propriétés anti-cancéreuses choisi parmi : les agents alkylants, les agents anti-métabolites, les antibiotiques cytotoxiques, les inhibiteurs de topoisomérase I, les inhibiteurs
12 de topoisomérase II, les antibiotiques anti-tumoraux, les agents génotoxiques, les inhibiteurs de la PARP, les agents anti-microtubules. Un tel agent est par exemple choisi parmi :
Bendamustine, Temozolomide, Mechlorethamine, Cyclophosphamide, Carmustine, Cisplatine, Busulfan, Thiotepa, Decarbazine, Pentostatine, Methotrexate, Pemetrexed, Floxuridine, Fluorouracil, Cytarabine, Mercaptopurine, Thiguanine, Rubitecan, Mitomycine C, Daunorubicin, Doxorubicine, Bleomycin, Plicamycin, Mitoxantrone HC1, Oxaliplatine, Vinorelbine, BMS 184476, Vincristine sulfate, Vinblastine, Taxotere, Taxol, ou encore les agents mentionnés dans le Tableau 4.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1 en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant à la famille des siRNA-FoxP3 en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans tous les aspects de la présente invention, ledit mode d'administration systémique selon l'invention est choisi parmi le groupe comprenant ou étant constitué de l'un des modes d'administration suivants: sous-cutané, intrapéritonéal, intraveineux, intra artériel, intracardiaque, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral, intrathécal, intra rachidien, épidural, respiratoire, cutanée, transdermique, transmuqueux.
Bendamustine, Temozolomide, Mechlorethamine, Cyclophosphamide, Carmustine, Cisplatine, Busulfan, Thiotepa, Decarbazine, Pentostatine, Methotrexate, Pemetrexed, Floxuridine, Fluorouracil, Cytarabine, Mercaptopurine, Thiguanine, Rubitecan, Mitomycine C, Daunorubicin, Doxorubicine, Bleomycin, Plicamycin, Mitoxantrone HC1, Oxaliplatine, Vinorelbine, BMS 184476, Vincristine sulfate, Vinblastine, Taxotere, Taxol, ou encore les agents mentionnés dans le Tableau 4.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant à la famille des siRNA-AR en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant à la famille des siRNA-VEGF en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant à la famille des siRNA-TSP1 en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition comprend un siRNA appartenant à la famille des siRNA-FoxP3 en association avec un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique et/ou un agent antiangiogénique.
Dans tous les aspects de la présente invention, ledit mode d'administration systémique selon l'invention est choisi parmi le groupe comprenant ou étant constitué de l'un des modes d'administration suivants: sous-cutané, intrapéritonéal, intraveineux, intra artériel, intracardiaque, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral, intrathécal, intra rachidien, épidural, respiratoire, cutanée, transdermique, transmuqueux.
13 Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition est formulée pour un mode d'administration à une dose thérapeutiquement efficace, et notamment à des doses de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment 0.01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour, et plus particulièrement de 0.01 mg/kg/jour à 2 mg/kg/jour chez l'homme.
De 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour s'entend de toutes les doses allant de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, par exemple 0.008 ; 0.01 ; 0.05 ; 0.1 ; 0.5; 1.0;
1.5; 10.0; 10.5;
De 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour s'entend de toutes les doses allant de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, par exemple 0.008 ; 0.01 ; 0.05 ; 0.1 ; 0.5; 1.0;
1.5; 10.0; 10.5;
14.0; 14.5 ; 20 ; 20.5 ; 25 ; 25.5 ; 29.5 mg/kg/jour.
Dans un premier aspect, la présente invention repose sur les résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels l'efficacité d'un siRNA administré par un mode d'administration systémique continue est meilleure que lorsque le même siRNA, formulé dans la même solution, est administré par un mode d'administration systémique en bolus, "en bolus" étant défini comme l'administration de la dose complète en une seule fois, cette dose pouvant être répétée au cours du traitement, par exemple chaque jour ou plusieurs fois par jour. Le mode d'administration continu est défini comme étant un mode qui évite les effets de pics et de vallées observés sur la concentration de siRNA dans le sang, le sérum et les différents organes lorsque ledit siRNA est administré en bolus. Le mode d'administration continu a pour objectif de maintenir sensiblement constante la concentration du siRNA dans le sang et les tissus périphériques pendant tout le temps d'administration du siRNA. L'expression maintenir sensiblement constante signifie que la concentration du siRNA dans le sang et les tissus périphériques peut légèrement varier selon le métabolisme de l'individu qui reçoit ladite composition.
Le temps d'administration peut varier de quelques heures à plusieurs semaines suivant le dispositif utilisé pour administrer le siRNA. Ce dispositif peut être une pompe ou toute composition visant une libération lente et prolongée dans le temps du siRNA.
Dans cet aspect particulier, l'invention concerne ainsi une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue est délivré sans interruption de l'administration pendant une durée supérieure ou égale à 2 jours.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue est délivré sans que l'administration ne soit interrompue au delà du temps nécessaire pour recharger ou échanger le dispositif délivrant le siRNA, par exemple 4 heures, pendant une durée allant de 2 jours à 1 an, par exemple 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours, 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours, 13 jours, 14 jours, 15 jours, 3 semaines, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois, 1 an.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue est délivré par cycles successifs, interrompus par une période sans traitement allant de plus de 24 heures à quelques semaines, chaque cycle étant défini par l'administration systémique continue sans interruption supérieure au temps nécessaire pour recharger ou échanger le dispositif délivrant le siRNA, par exemple 4 heures, et pendant une durée allant de 2 jours à 1 mois.
Dans un aspect préféré selon l'invention, ledit mode d'administration systémique continue est sous-cutané.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition est formulée pour un mode d'administration, en continu et en sous-cutané, à une dose thérapeutiquement efficace, et notamment à des doses de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment 0.01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour et plus particulièrement de 0.01 mg/kg/jour à 2 mg/kg/jour.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle la séquence de l'un des brins dudit oligonucléotide est différente de:
- SEQ ID NO :53 (GGGUUAUGUCUAUGUUCAUUCUU), ou - SEQ ID NO :54 (GGAAUGGCCUGUGCUUUCUCAUU)
Dans un premier aspect, la présente invention repose sur les résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels l'efficacité d'un siRNA administré par un mode d'administration systémique continue est meilleure que lorsque le même siRNA, formulé dans la même solution, est administré par un mode d'administration systémique en bolus, "en bolus" étant défini comme l'administration de la dose complète en une seule fois, cette dose pouvant être répétée au cours du traitement, par exemple chaque jour ou plusieurs fois par jour. Le mode d'administration continu est défini comme étant un mode qui évite les effets de pics et de vallées observés sur la concentration de siRNA dans le sang, le sérum et les différents organes lorsque ledit siRNA est administré en bolus. Le mode d'administration continu a pour objectif de maintenir sensiblement constante la concentration du siRNA dans le sang et les tissus périphériques pendant tout le temps d'administration du siRNA. L'expression maintenir sensiblement constante signifie que la concentration du siRNA dans le sang et les tissus périphériques peut légèrement varier selon le métabolisme de l'individu qui reçoit ladite composition.
Le temps d'administration peut varier de quelques heures à plusieurs semaines suivant le dispositif utilisé pour administrer le siRNA. Ce dispositif peut être une pompe ou toute composition visant une libération lente et prolongée dans le temps du siRNA.
Dans cet aspect particulier, l'invention concerne ainsi une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue est délivré sans interruption de l'administration pendant une durée supérieure ou égale à 2 jours.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue est délivré sans que l'administration ne soit interrompue au delà du temps nécessaire pour recharger ou échanger le dispositif délivrant le siRNA, par exemple 4 heures, pendant une durée allant de 2 jours à 1 an, par exemple 2 jours, 3 jours, 4 jours, 5 jours, 6 jours, 7 jours, 8 jours, 9 jours, 10 jours, 11 jours, 12 jours, 13 jours, 14 jours, 15 jours, 3 semaines, 1 mois, 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois, 6 mois, 9 mois, 1 an.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue est délivré par cycles successifs, interrompus par une période sans traitement allant de plus de 24 heures à quelques semaines, chaque cycle étant défini par l'administration systémique continue sans interruption supérieure au temps nécessaire pour recharger ou échanger le dispositif délivrant le siRNA, par exemple 4 heures, et pendant une durée allant de 2 jours à 1 mois.
Dans un aspect préféré selon l'invention, ledit mode d'administration systémique continue est sous-cutané.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite composition est formulée pour un mode d'administration, en continu et en sous-cutané, à une dose thérapeutiquement efficace, et notamment à des doses de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment 0.01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour et plus particulièrement de 0.01 mg/kg/jour à 2 mg/kg/jour.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle la séquence de l'un des brins dudit oligonucléotide est différente de:
- SEQ ID NO :53 (GGGUUAUGUCUAUGUUCAUUCUU), ou - SEQ ID NO :54 (GGAAUGGCCUGUGCUUUCUCAUU)
15 Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mode d'administration systémique continue est l'un des modes d'administration suivants : intrapéritonéal, intraveineux, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral, intrathécal, ET ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mode d'administration systémique continue est sous-cutané et ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA
suivantes :
famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est n'importe laquelle des tumeurs primaires susmentionnées, ou des métastases d'une de ces tumeurs primaires se développant dans d'autres organes, et ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA
suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est un cancer du sein, ou un mélanome, ou un glioblastome, ou un cancer du rein, ou un cancer du foie, ou un cancer de la vessie, ou un cancer du colon ou des métastases d'un de ces cancers se développant dans d'autres organes, ou une leucémie ou un myélome, et ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA
siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-1, seuls ou en association deux à
deux ou trois à
trois.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est un cancer de la prostate ou des métastases de ce cancer se développant dans d'autres organes, et ledit au moins un siRNA
appartient à
l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA
siAR-1, ou le
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ledit mode d'administration systémique continue est sous-cutané et ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA
suivantes :
famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est n'importe laquelle des tumeurs primaires susmentionnées, ou des métastases d'une de ces tumeurs primaires se développant dans d'autres organes, et ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA
suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est un cancer du sein, ou un mélanome, ou un glioblastome, ou un cancer du rein, ou un cancer du foie, ou un cancer de la vessie, ou un cancer du colon ou des métastases d'un de ces cancers se développant dans d'autres organes, ou une leucémie ou un myélome, et ledit au moins un siRNA appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA
siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-1, seuls ou en association deux à
deux ou trois à
trois.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle ladite pathologie est un cancer de la prostate ou des métastases de ce cancer se développant dans d'autres organes, et ledit au moins un siRNA
appartient à
l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA
siAR-1, ou le
16 siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-2, seuls ou en association deux à deux ou trois à trois et plus particulièrement le siRNA siAR-1.
Dans un autre aspect, l'invention concerne également un dispositif fournissant un moyen d'administration systémique et continue d'une composition formulée pour un mode d'administration systémique continue comprenant au moins un siRNA ledit siRNA
s'hybridant avec un ARNm codant ou non codant dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle code ledit ARNm étant impliquée dans une pathologie, et la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie.
Dans un aspect particulier, ledit moyen d'administration systémique continu est notamment une pompe osmotique, une pompe-seringue, une pompe élastomérique, une pompe péristaltique, une pompe multi-canaux, une pompe contrôlée par le patient, une pompe intelligente , ou une pompe patch , ou une matrice polymérique ou un hydrogel, ou tout autre composé biodégradable visant à libérer de façon lente et continue le siRNA de telle sorte qu'il soit distribué de façon systémique dans l'organisme. Certains de ces dispositifs peuvent être utilisés dans d'autres indications thérapeutiques, pour délivrer un agent thérapeutique de façon discontinue, notamment en bolus. Dans le présent aspect, ils sont utilisés pour libérer la composition sus mentionnée avec un débit sensiblement constant et sans interruption pendant plusieurs jours à plusieurs semaines ou d'avantage. L'expression débit sensiblement constant signifie que le débit peut légèrement varier selon la précision du dispositif utilisé.
Par exemple, la variation peut être d'environ plus ou moins 10% par rapport au débit fixé.
Le dispositif peut être mécanique ou électronique. Il peut être porté à
l'extérieur ou implanté chirurgicalement, par exemple sous la peau, ou dans le péritoine, ou en intramusculaire. De façon non exhaustive ces dispositifs utilisables en clinique humaine sont :
des pompes osmotiques, composées d'un réservoir souple entouré d'un compartiment contenant un gel salin qui en s'hydratant compresse le réservoir interne en forçant l'expulsion du liquide. Ce mécanisme, qui est utilisé par exemple dans les pompes Duros de la société
Durect utilisées en clinique humaine, est similaire à celui des pompes Alzet qui sont uniquement autorisés pour une utilisation chez les animaux ;
- des seringues automatisées comme par exemple : McKinley T34 ou T60, Bodyguard 323, AD syringe driver (Cardinal health), MS drivers (Smiths Medical) ;
Dans un autre aspect, l'invention concerne également un dispositif fournissant un moyen d'administration systémique et continue d'une composition formulée pour un mode d'administration systémique continue comprenant au moins un siRNA ledit siRNA
s'hybridant avec un ARNm codant ou non codant dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle code ledit ARNm étant impliquée dans une pathologie, et la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie.
Dans un aspect particulier, ledit moyen d'administration systémique continu est notamment une pompe osmotique, une pompe-seringue, une pompe élastomérique, une pompe péristaltique, une pompe multi-canaux, une pompe contrôlée par le patient, une pompe intelligente , ou une pompe patch , ou une matrice polymérique ou un hydrogel, ou tout autre composé biodégradable visant à libérer de façon lente et continue le siRNA de telle sorte qu'il soit distribué de façon systémique dans l'organisme. Certains de ces dispositifs peuvent être utilisés dans d'autres indications thérapeutiques, pour délivrer un agent thérapeutique de façon discontinue, notamment en bolus. Dans le présent aspect, ils sont utilisés pour libérer la composition sus mentionnée avec un débit sensiblement constant et sans interruption pendant plusieurs jours à plusieurs semaines ou d'avantage. L'expression débit sensiblement constant signifie que le débit peut légèrement varier selon la précision du dispositif utilisé.
Par exemple, la variation peut être d'environ plus ou moins 10% par rapport au débit fixé.
Le dispositif peut être mécanique ou électronique. Il peut être porté à
l'extérieur ou implanté chirurgicalement, par exemple sous la peau, ou dans le péritoine, ou en intramusculaire. De façon non exhaustive ces dispositifs utilisables en clinique humaine sont :
des pompes osmotiques, composées d'un réservoir souple entouré d'un compartiment contenant un gel salin qui en s'hydratant compresse le réservoir interne en forçant l'expulsion du liquide. Ce mécanisme, qui est utilisé par exemple dans les pompes Duros de la société
Durect utilisées en clinique humaine, est similaire à celui des pompes Alzet qui sont uniquement autorisés pour une utilisation chez les animaux ;
- des seringues automatisées comme par exemple : McKinley T34 ou T60, Bodyguard 323, AD syringe driver (Cardinal health), MS drivers (Smiths Medical) ;
17 - des pompes en élastomère : le produit est contenu dans un réservoir compressible lui-même contenu dans un ballon exerçant une pression contrôlée sur le réservoir interne et forçant l'expulsion du liquide comme par exemple : Accufuser (WOO YOUNG
Medical), Dosi-fuser (spirit medical), Exacta (Gamastech), Myfuser ;
- des pompes péristaltiques : une tubulure flexible est comprimée mécaniquement pour délivrer le contenu comme par exemple : iPrecio, SP100 (APT instruments) ;
- des pompes multicanaux ou simple canal contrôlées par le patient comme par exemple :
Accucheck, one touch ping (Animas), Accufuser ;
- des pompes patch : le réservoir de produit adhère directement à la peau et contient un système intégré, sans tubulure, d'administration comme par exemple :
CeQurPaQ, Omnipod (Insulet), Finesse (Calibra), V-Go (Valeritas) ;
- des pompes dites intelligentes équipées de dispositifs de sécurité
qui modulent l'administration du produit en fonction de paramètres prédéfinis ou mesurés chez le patient comme par exemple : miniMed 530G, paradigm Veo (medtronics), Vibe (Animas);
- des pompes implantables comme par exemple : Replenish minipump, Medtronic, Duros Durect, Infusaid, promedos. Ces pompes permettent de délivrer de faibles volumes du produit thérapeutique, à des débits précis ou de façon automatique à des intervalles de temps prédéfinis.
Il peut également être envisagé de mettre les oligonucléotides secs dans un dispositif qui une fois mis sous la peau capture l'eau des tissus, et libère le siRNA qui est solubilisé dans les fluides extracellulaires. On peut également envisager d'incorporer le siRNA
dans une matrice polymérique, un gel ou tout autre composé qui libère le siRNA de façon lente et prolongée dans le temps. Ce dispositif peut être un comprimé adhérant à la muqueuse et libérant le siRNA à travers celle-ci.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA administré par le dispositif susmentionné est associé à une molécule d'adressage.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA administré par le dispositif susmentionné n'est pas associé à une molécule d'adressage.
Dans un aspect particulier, ledit au moins un oligonucléotide qui est administré par ledit dispositif comprend ou est constitué par l'un des siRNA appartenant aux familles de siRNA
suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1,
Medical), Dosi-fuser (spirit medical), Exacta (Gamastech), Myfuser ;
- des pompes péristaltiques : une tubulure flexible est comprimée mécaniquement pour délivrer le contenu comme par exemple : iPrecio, SP100 (APT instruments) ;
- des pompes multicanaux ou simple canal contrôlées par le patient comme par exemple :
Accucheck, one touch ping (Animas), Accufuser ;
- des pompes patch : le réservoir de produit adhère directement à la peau et contient un système intégré, sans tubulure, d'administration comme par exemple :
CeQurPaQ, Omnipod (Insulet), Finesse (Calibra), V-Go (Valeritas) ;
- des pompes dites intelligentes équipées de dispositifs de sécurité
qui modulent l'administration du produit en fonction de paramètres prédéfinis ou mesurés chez le patient comme par exemple : miniMed 530G, paradigm Veo (medtronics), Vibe (Animas);
- des pompes implantables comme par exemple : Replenish minipump, Medtronic, Duros Durect, Infusaid, promedos. Ces pompes permettent de délivrer de faibles volumes du produit thérapeutique, à des débits précis ou de façon automatique à des intervalles de temps prédéfinis.
Il peut également être envisagé de mettre les oligonucléotides secs dans un dispositif qui une fois mis sous la peau capture l'eau des tissus, et libère le siRNA qui est solubilisé dans les fluides extracellulaires. On peut également envisager d'incorporer le siRNA
dans une matrice polymérique, un gel ou tout autre composé qui libère le siRNA de façon lente et prolongée dans le temps. Ce dispositif peut être un comprimé adhérant à la muqueuse et libérant le siRNA à travers celle-ci.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA administré par le dispositif susmentionné est associé à une molécule d'adressage.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA administré par le dispositif susmentionné n'est pas associé à une molécule d'adressage.
Dans un aspect particulier, ledit au moins un oligonucléotide qui est administré par ledit dispositif comprend ou est constitué par l'un des siRNA appartenant aux familles de siRNA
suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1,
18 famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-2.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration .. systémique continue est dilué dans une solution aqueuse contenant 154mM de NaCl.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue par voie sous cutanée dilué dans une solution aqueuse contenant 154 mM de NaCl appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA
siFoxP3-1, seuls ou en association deux à deux ou trois à trois.
Dans un autre aspect, la présente invention repose sur les résultats inattendus des Inventeurs, selon lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, dans de nombreux tissus et/ou dans des tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par voie systémique en étant formulé dans une solution tampon à pH acide que lorsque ce même siRNA
est formulé
dans une solution aqueuse contenant 154 mM de NaCl. La présence de cations comme le Zn2+ ou le Mg2+ dans une solution aqueuse de siRNA conduit à leur dégradation et lorsque le siRNA est administré de façon systémique, la présence de tels cations dans la solution d'injection réduit la concentration du siRNA dans le sérum et dans les organes. De façon inattendue, les Inventeurs ont observé que l'addition de cations dans une solution tampon à
pH acide augmentait la concentration de siRNA dans le sérum, dans de nombreux tissus et/ou dans des tumeurs, lorsque ledit siRNA est administré par voie systémique.
Une solution tampon suivant la présente invention assure la stabilité du pH de la solution de dilution du siRNA. Des exemples de tels tampons sont donnés dans le Tableau 5.
Dans cet autre aspect, l'invention concerne ainsi une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une solution tampon à pH acide.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration .. systémique continue est dilué dans une solution aqueuse contenant 154mM de NaCl.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue par voie sous cutanée dilué dans une solution aqueuse contenant 154 mM de NaCl appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA
siFoxP3-1, seuls ou en association deux à deux ou trois à trois.
Dans un autre aspect, la présente invention repose sur les résultats inattendus des Inventeurs, selon lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, dans de nombreux tissus et/ou dans des tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par voie systémique en étant formulé dans une solution tampon à pH acide que lorsque ce même siRNA
est formulé
dans une solution aqueuse contenant 154 mM de NaCl. La présence de cations comme le Zn2+ ou le Mg2+ dans une solution aqueuse de siRNA conduit à leur dégradation et lorsque le siRNA est administré de façon systémique, la présence de tels cations dans la solution d'injection réduit la concentration du siRNA dans le sérum et dans les organes. De façon inattendue, les Inventeurs ont observé que l'addition de cations dans une solution tampon à
pH acide augmentait la concentration de siRNA dans le sérum, dans de nombreux tissus et/ou dans des tumeurs, lorsque ledit siRNA est administré par voie systémique.
Une solution tampon suivant la présente invention assure la stabilité du pH de la solution de dilution du siRNA. Des exemples de tels tampons sont donnés dans le Tableau 5.
Dans cet autre aspect, l'invention concerne ainsi une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une solution tampon à pH acide.
19 Dans un aspect préféré de l'invention, le pH de la solution tampon est acide, allant de pH
3 à pH 7, préférentiellement de pH 5 à pH 6.5 et préférentiellement à pH 6.
Dans un aspect préféré de l'invention la solution tampon est un tampon citrate ou histidine à pH 6.
La présente invention repose également sur des résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, dans de nombreux tissus et/ou dans des tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par voie systémique continue en étant formulé dans une solution tampon à pH acide contenant des cations provenant de sels minéraux ou organiques, que lorsque ce même siRNA est formulé dans une solution tampon à
pH acide sans cations ou dans une solution de NaCl 154mM. Ces cations au sens de l'invention ne sont pas des constituants de la solution tampon, ils ne sont pas destinés à
assurer un effet tampon, mais ils sont ajoutés à cette solution tampon. Ces cations sont par exemple et de façon non limitative des polyamines, notament la putrescine, et/ou la spermidine, et/ou la spermine, et/ou des sels dont le cation est choisi parmi les cations métalliques tels que par exemple Zn2+, Co2+, Cu2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, le contre ion pouvant être d'une nature quelconque, par exemple un ion chlorure, nitrate, sulfate, ou carbonate. Dans un aspect préféré de l'invention, la solution tampon contient du MgCl2, du ZnC12, du MnC12, ou un mélange deux à deux de ces sels, ou un mélange des trois sels.
Dans un aspect particulier, qu'ils soient utilisés seuls ou en combinaison, la concentration de chaque cation est comprise de 0.02 mM à 200 mM, préférentiellement de 0.05 à 100 mM
et préférentiellement de 1 à 50mM. Dans un aspect préféré de l'invention, les cations sont ajoutés à une solution tampon qui est un tampon citrate ou un tampon histidine. Dans un aspect préféré de l'invention, le pH de cette solution est de 6.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue est dilué dans un tampon citrate ou histidine à pH 6 contenant du MgCl2 à 10mM.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue, dilué dans un tampon acide contenant des cations appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA
3 à pH 7, préférentiellement de pH 5 à pH 6.5 et préférentiellement à pH 6.
Dans un aspect préféré de l'invention la solution tampon est un tampon citrate ou histidine à pH 6.
La présente invention repose également sur des résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, dans de nombreux tissus et/ou dans des tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par voie systémique continue en étant formulé dans une solution tampon à pH acide contenant des cations provenant de sels minéraux ou organiques, que lorsque ce même siRNA est formulé dans une solution tampon à
pH acide sans cations ou dans une solution de NaCl 154mM. Ces cations au sens de l'invention ne sont pas des constituants de la solution tampon, ils ne sont pas destinés à
assurer un effet tampon, mais ils sont ajoutés à cette solution tampon. Ces cations sont par exemple et de façon non limitative des polyamines, notament la putrescine, et/ou la spermidine, et/ou la spermine, et/ou des sels dont le cation est choisi parmi les cations métalliques tels que par exemple Zn2+, Co2+, Cu2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, le contre ion pouvant être d'une nature quelconque, par exemple un ion chlorure, nitrate, sulfate, ou carbonate. Dans un aspect préféré de l'invention, la solution tampon contient du MgCl2, du ZnC12, du MnC12, ou un mélange deux à deux de ces sels, ou un mélange des trois sels.
Dans un aspect particulier, qu'ils soient utilisés seuls ou en combinaison, la concentration de chaque cation est comprise de 0.02 mM à 200 mM, préférentiellement de 0.05 à 100 mM
et préférentiellement de 1 à 50mM. Dans un aspect préféré de l'invention, les cations sont ajoutés à une solution tampon qui est un tampon citrate ou un tampon histidine. Dans un aspect préféré de l'invention, le pH de cette solution est de 6.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue est dilué dans un tampon citrate ou histidine à pH 6 contenant du MgCl2 à 10mM.
Dans un aspect préféré de l'invention, le siRNA délivré suivant un mode d'administration systémique continue, dilué dans un tampon acide contenant des cations appartient à l'une des 4 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-AR, famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, famille des siRNA FoxP3, et en particulier le siRNA siAR-1, ou le siRNA
20 siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, ou le siRNA siFoxP3-1, seuls ou en association deux à
deux ou trois à trois.
Dans un autre aspect, la présente invention repose sur les résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, de nombreux tissus et/ou des tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par voie systémique continue contenant une molécule d'adressage.
Ainsi, selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition contient un agent d'adressage, en particulier, ladite composition contient un agent d'adressage non couplé de façon covalente au siRNA.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition ne contient pas d'agent d'adressage.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une solution tampon à pH acide, ladite composition contient un agent d'adressage, en particulier, ladite composition contient un agent d'adressage non couplé de façon covalente au siRNA.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une solution tampon à pH acide, ladite composition ne contient pas d'agent d'adressage.
Dans un aspect particulier de l'invention, cette molécule d'adressage est un ligand du récepteur CD36, par exemple des LDL oxydés, de l'hexareline ou un acide gras à
longue chaine (plus de 16 carbones), ou un mélange de ces composants deux à deux ou trois à trois.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée contient des LDL
oxydés dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et préférentiellement de 0.1 à 1, ou de l'hexaréline, dans un rapport poids:poids de 1 siRNA
pour 0.01 à 10 hexaréline, préférentiellement de 0.1 à 1.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée contient des LDL
oxydés dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et préférentiellement de 0.1 à 1, ou de l'hexaréline, dans un rapport poids:poids de 1 siRNA
deux ou trois à trois.
Dans un autre aspect, la présente invention repose sur les résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels la concentration de siRNA dans le sérum, de nombreux tissus et/ou des tumeurs est plus élevée lorsque le siRNA est administré par voie systémique continue contenant une molécule d'adressage.
Ainsi, selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition contient un agent d'adressage, en particulier, ladite composition contient un agent d'adressage non couplé de façon covalente au siRNA.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition ne contient pas d'agent d'adressage.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une solution tampon à pH acide, ladite composition contient un agent d'adressage, en particulier, ladite composition contient un agent d'adressage non couplé de façon covalente au siRNA.
Selon l'invention et dans un aspect particulier, ladite composition est formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une solution tampon à pH acide, ladite composition ne contient pas d'agent d'adressage.
Dans un aspect particulier de l'invention, cette molécule d'adressage est un ligand du récepteur CD36, par exemple des LDL oxydés, de l'hexareline ou un acide gras à
longue chaine (plus de 16 carbones), ou un mélange de ces composants deux à deux ou trois à trois.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée contient des LDL
oxydés dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et préférentiellement de 0.1 à 1, ou de l'hexaréline, dans un rapport poids:poids de 1 siRNA
pour 0.01 à 10 hexaréline, préférentiellement de 0.1 à 1.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée contient des LDL
oxydés dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et préférentiellement de 0.1 à 1, ou de l'hexaréline, dans un rapport poids:poids de 1 siRNA
21 pour 0.01 à 10 hexaréline, préférentiellement de 0.1 à 1 et est administrée par voie systémique continue.
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée est formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine, et ladite composition contient un agent d'adressage non couplé de façon covalente au siRNA, ledit agent d'adressage étant un ligand du récepteur CD36, ledit ligand au récepteur CD36 étant de préférence des LDL oxydés, de l'hexaréline, un acide gras à longue chaîne, ou un mélange de ces composant deux à deux ou trois à trois Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée est formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans un tampon citrate et ladite composition contient un agent d'adressage, ledit agent d'adressage étant des LDL oxydés Selon l'invention, ladite composition comprend au moins un siRNA, ledit siRNA
s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ledit siRNA étant dans une solution contenant ou ne contenant pas d'agent de vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition susmentionnée comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA étant dans une solution ne contenant pas d'agent de vectorisation ou dans laquelle ledit siRNA n'est pas associé à un agent de vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition susmentionnée comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA étant dans une solution contenant un agent de vectorisation.
Dans autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il
Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée est formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans une solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine, et ladite composition contient un agent d'adressage non couplé de façon covalente au siRNA, ledit agent d'adressage étant un ligand du récepteur CD36, ledit ligand au récepteur CD36 étant de préférence des LDL oxydés, de l'hexaréline, un acide gras à longue chaîne, ou un mélange de ces composant deux à deux ou trois à trois Dans un aspect préféré de l'invention, la composition susmentionnée est formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA
est dans un tampon citrate et ladite composition contient un agent d'adressage, ledit agent d'adressage étant des LDL oxydés Selon l'invention, ladite composition comprend au moins un siRNA, ledit siRNA
s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ledit siRNA étant dans une solution contenant ou ne contenant pas d'agent de vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition susmentionnée comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA étant dans une solution ne contenant pas d'agent de vectorisation ou dans laquelle ledit siRNA n'est pas associé à un agent de vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition susmentionnée comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA étant dans une solution contenant un agent de vectorisation.
Dans autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il
22 code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue. Une administration en bolus unique ou répétée dans le temps ou une administration en infusion lente sur une durée allant de quelques minutes à quelques heures sont des exemples non limitatifs de mode d'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue de ladite composition comprenant au moins un siRNA
peut être associée à une administration systémique continue de ladite composition, de façon simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
Dans un aspect particulier, ladite composition peut être formulée pour un mode d'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue dans laquelle ledit au moins siRNA est dans une solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine.
Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue, la solution tampon à pH acide peut être additionnée de sels minéraux ou organiques, notamment de sel dont le cation est choisi parmi les polyamines, notamment choisi parmi la spermine, la spermidine ou la putrescine ou notamment de sel dont le cation est choisi parmi les cations métalliques, notamment choisi parmi les sels de zinc, cobalt, cuivre, manganèse, calcium, magnésium ou de fer, en particulier de manganèse, zinc, magnésium, seuls ou en combinaison deux à deux ou trois à trois Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue, ladite composition peut contenir un agent d'adressage, Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue, ladite composition contient un agent d'adressage, de préférence non couplé de façon covalente au siRNA.
Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue, ladite composition ne contient pas d'agent d'adressage.
Ladite molécule d'adressage peut, par exemple, être un ligand du récepteur CD36, tels que des LDL oxydés, de l'hexaréline, un acide gras à longue chaîne, ou un mélange de ces composant deux à deux ou trois à trois
Dans un aspect particulier de l'invention, l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue de ladite composition comprenant au moins un siRNA
peut être associée à une administration systémique continue de ladite composition, de façon simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
Dans un aspect particulier, ladite composition peut être formulée pour un mode d'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue dans laquelle ledit au moins siRNA est dans une solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine.
Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue, la solution tampon à pH acide peut être additionnée de sels minéraux ou organiques, notamment de sel dont le cation est choisi parmi les polyamines, notamment choisi parmi la spermine, la spermidine ou la putrescine ou notamment de sel dont le cation est choisi parmi les cations métalliques, notamment choisi parmi les sels de zinc, cobalt, cuivre, manganèse, calcium, magnésium ou de fer, en particulier de manganèse, zinc, magnésium, seuls ou en combinaison deux à deux ou trois à trois Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue, ladite composition peut contenir un agent d'adressage, Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue, ladite composition contient un agent d'adressage, de préférence non couplé de façon covalente au siRNA.
Dans un aspect particulier de l'administration systémique autre qu'un mode d'administration continue, ladite composition ne contient pas d'agent d'adressage.
Ladite molécule d'adressage peut, par exemple, être un ligand du récepteur CD36, tels que des LDL oxydés, de l'hexaréline, un acide gras à longue chaîne, ou un mélange de ces composant deux à deux ou trois à trois
23 Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dans une solution ne contenant pas d'agent de vectorisation ou dans laquelle ledit siRNA n'est pas associé à un agent de vectorisation.
Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dans une solution contenant un agent de vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation selon un mode d'administration systémique, dans laquelle ledit siRNA est utilisé en association avec au moins un agent anti-angiogénique et/ou un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
Dans un autre aspect, la présente invention repose également sur les résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels l'administration de siRNA ciblant la Thrombospondine-1 ou le VEGF, par un mode d'administration continue, en intracérébral ou en intrathécal, permet également de délivrer efficacement lesdits siRNA et d'inhiber ainsi l'expression génique du gène cible di siRNA.
Ainsi, et dans cet aspect, la présente invention concerne une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm codant ou non codant dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration continue, en intracérébral ou en intrathécal.
Dans un aspect de l'invention, ladite composition pour son utilisation susmentionnée en continue et en intracérébral, est notamment utilisée pour la prévention et/ou le traitement d'un cancer du cerveau, notamment un glioblastome. Lorsque la pathologie est un cancer du cerveau, notamment un glioblastome, les siRNA sont plus particulièrement choisis parmi l'une des 2 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, seuls ou en association.
Dans un aspect particulier de l'invention, ladite composition pour son utilisation susmentionnée, est formulée pour un mode d'administration à une dose thérapeutiquement efficace en intracérébral ou intrathécal continue, en particulier à des doses de 0,01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour, notamment 0,01 mg/kg/jour à 2 mg/kg/jour
Dans un aspect particulier, ledit siRNA est dans une solution contenant un agent de vectorisation.
Dans un aspect particulier, l'invention concerne une composition pour son utilisation selon un mode d'administration systémique, dans laquelle ledit siRNA est utilisé en association avec au moins un agent anti-angiogénique et/ou un agent anti-tumoral et/ou un agent immunothérapeutique, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
Dans un autre aspect, la présente invention repose également sur les résultats inattendus des Inventeurs selon lesquels l'administration de siRNA ciblant la Thrombospondine-1 ou le VEGF, par un mode d'administration continue, en intracérébral ou en intrathécal, permet également de délivrer efficacement lesdits siRNA et d'inhiber ainsi l'expression génique du gène cible di siRNA.
Ainsi, et dans cet aspect, la présente invention concerne une composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm codant ou non codant dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration continue, en intracérébral ou en intrathécal.
Dans un aspect de l'invention, ladite composition pour son utilisation susmentionnée en continue et en intracérébral, est notamment utilisée pour la prévention et/ou le traitement d'un cancer du cerveau, notamment un glioblastome. Lorsque la pathologie est un cancer du cerveau, notamment un glioblastome, les siRNA sont plus particulièrement choisis parmi l'une des 2 familles de siRNA suivantes : famille des siRNA-VEGF, famille des siRNA-TSP1, et en particulier le siRNA siVEGF-1, ou le siRNA siTSP1-1, seuls ou en association.
Dans un aspect particulier de l'invention, ladite composition pour son utilisation susmentionnée, est formulée pour un mode d'administration à une dose thérapeutiquement efficace en intracérébral ou intrathécal continue, en particulier à des doses de 0,01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour, notamment 0,01 mg/kg/jour à 2 mg/kg/jour
24 Dans autre aspect, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant comme substance active au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, ledit au moins siRNA étant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable dans une solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine, additionnée ou non de sels minéraux ou organiques, notamment de sel dont le cation est choisi parmi les polyamines, notamment choisi parmi la spermine, la spermidine ou la putrescine ou notamment de sel dont le cation est choisi parmi les cations métalliques, notamment choisi parmi les sels de zinc, cobalt, cuivre, manganèse, calcium, magnésium ou de fer, en particulier de manganèse, zinc, magnésium, seuls ou en combinaison deux à deux ou trois à
trois Dans un aspect particulier, ledit au moins un siRNA est dans une solution ne contenant pas d'agent de vectorisation et est associé à une molécule d'adressage, ou est dans une solution contenant un agent de vectorisation et est associé à une molécule d'adressage, ou est dans une solution contenant un agent de vectorisation et n'est pas associé à
une molécule d'adressage, ou est dans une solution ne contenant pas d'agent de vectorisation et n'est pas associé à une molécule d'adressage
trois Dans un aspect particulier, ledit au moins un siRNA est dans une solution ne contenant pas d'agent de vectorisation et est associé à une molécule d'adressage, ou est dans une solution contenant un agent de vectorisation et est associé à une molécule d'adressage, ou est dans une solution contenant un agent de vectorisation et n'est pas associé à
une molécule d'adressage, ou est dans une solution ne contenant pas d'agent de vectorisation et n'est pas associé à une molécule d'adressage
25 Tableau 1: Couples d'oligonucléotides constituant les siRNA selon la présente invention c) _______________________________________________________________________________ _________________________________________ I.) o SEQ
eo¨
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ce ID NO èce;::_e, ce F1,;.;
siAR-1 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO: 1 ou une GACUCAGCUGCCCCAUCCA [ dT ] [ d un 1 r, so, Si, siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 1 T ]
c et de siAR-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 2 ou une UGGAUGGGGCAGCUGAGUC [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 2 T ]
h, siAR-1 Brin lb, dont la séquence est: SEQ ID NO : 3 ou une 3 GACUCAGCUGCCCCAUCCA r, so, si, siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 3 c lb P
et de siAR-1 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 4 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 4 o _______________________________________________________________________________ ___________________________________________ , h, siAR-2 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO : 5 ou une GACUCAGCUGCCCCAUCCACG [ dT ]
5 r, so, si, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 5 [ dT ] .
siRNA- siAR-2 c à
' AR et de siAR-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 6 ou une CGUGGAUGGGGCAGCUGAGUC [ dT ]
N) séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 6 [ dT ]
h, siAR-2 Brin lb, dont la séquence est: SEQ ID NO : 7 ou une siAR- 7 GACUCAGCUGCCCCAUCCACG r, so, si, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 7 2b c et de siAR-2 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 8 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 8 ________________________________________________________ so n siAR-3 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO : 9 ou une UCCCCAAGCCCAUCGUAGA [ dT ] [ d siAR-3 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 9 T ]
et de siAR-3 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 10 ou une UCUACGAUGGGCUUGGGGA [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 10 T ] o _______________________________________________________________________________ _________________________________________ un I.) siAR- siAR-3 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 11 ou une "
3b séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID
NO: 11 I
eo¨
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ce ID NO èce;::_e, ce F1,;.;
siAR-1 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO: 1 ou une GACUCAGCUGCCCCAUCCA [ dT ] [ d un 1 r, so, Si, siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 1 T ]
c et de siAR-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 2 ou une UGGAUGGGGCAGCUGAGUC [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 2 T ]
h, siAR-1 Brin lb, dont la séquence est: SEQ ID NO : 3 ou une 3 GACUCAGCUGCCCCAUCCA r, so, si, siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 3 c lb P
et de siAR-1 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 4 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 4 o _______________________________________________________________________________ ___________________________________________ , h, siAR-2 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO : 5 ou une GACUCAGCUGCCCCAUCCACG [ dT ]
5 r, so, si, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 5 [ dT ] .
siRNA- siAR-2 c à
' AR et de siAR-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 6 ou une CGUGGAUGGGGCAGCUGAGUC [ dT ]
N) séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 6 [ dT ]
h, siAR-2 Brin lb, dont la séquence est: SEQ ID NO : 7 ou une siAR- 7 GACUCAGCUGCCCCAUCCACG r, so, si, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 7 2b c et de siAR-2 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 8 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 8 ________________________________________________________ so n siAR-3 Brin 1, dont la séquence est: SEQ ID NO : 9 ou une UCCCCAAGCCCAUCGUAGA [ dT ] [ d siAR-3 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 9 T ]
et de siAR-3 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 10 ou une UCUACGAUGGGCUUGGGGA [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 10 T ] o _______________________________________________________________________________ _________________________________________ un I.) siAR- siAR-3 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 11 ou une "
3b séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID
NO: 11 I
26 SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ID NO èce et de siAR-3 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 12 ou I.) o une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
12 UCUACGAUGGGCUUGGGGA --, oe -a-, oe siAR-4 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO: 13 ou une GUAGUUGUGAGUAUCAUGA [ dT ] [ d I.) siAR-4 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 13 T ]
et de siAR-4 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 14 ou une UCAUGAUACUCACAACUAC [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 14 T ]
siAR-4 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 15 ou une 15 GUAGUUGUGAGUAUCAUGA h siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 15 4b et de siAR-4 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO :
16 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
P
c, ., .
siAR-5 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO: 17 ou une GCAUCAGUUCGCUUUUGAC [ dT ] [ d .
, 17 h siAR-5 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 17 T ] .
N) .
et de siAR-5 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 18 ou une GUCAAAAGCGAACUGAUGC [ dT ] [ d , ' 18 .
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 18 T ] .
, _______________________________________________________________________________ __________________________________________ N) siAR-5 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 19 ou une 19 GCAUCAGUUCGCUUUUGAC h siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 19 5b et de siAR-5 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO :
20 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
h, siVEGF-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 21 ou une AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA [ dT ] e'd 21 r, so, .n siVEG séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 21 [ dT ]
c siRNA- et de siVEGF-1 Brin 2, dont la séquence est: SEQ ID NO:
22 ou UUCUUUGGUCUGCAUUCACAU [ dT ]
VEGF une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ
ID NO: 22 [ dT ]
o un siVEG siVEGF-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 23 ou une ['Id F-lb séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID
NO : 23 .1-r, so, s., I
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ID NO èce et de siAR-3 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 12 ou I.) o une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
12 UCUACGAUGGGCUUGGGGA --, oe -a-, oe siAR-4 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO: 13 ou une GUAGUUGUGAGUAUCAUGA [ dT ] [ d I.) siAR-4 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 13 T ]
et de siAR-4 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 14 ou une UCAUGAUACUCACAACUAC [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 14 T ]
siAR-4 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 15 ou une 15 GUAGUUGUGAGUAUCAUGA h siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 15 4b et de siAR-4 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO :
16 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
P
c, ., .
siAR-5 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO: 17 ou une GCAUCAGUUCGCUUUUGAC [ dT ] [ d .
, 17 h siAR-5 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 17 T ] .
N) .
et de siAR-5 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 18 ou une GUCAAAAGCGAACUGAUGC [ dT ] [ d , ' 18 .
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 18 T ] .
, _______________________________________________________________________________ __________________________________________ N) siAR-5 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO: 19 ou une 19 GCAUCAGUUCGCUUUUGAC h siAR- séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 19 5b et de siAR-5 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO :
20 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
h, siVEGF-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 21 ou une AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA [ dT ] e'd 21 r, so, .n siVEG séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 21 [ dT ]
c siRNA- et de siVEGF-1 Brin 2, dont la séquence est: SEQ ID NO:
22 ou UUCUUUGGUCUGCAUUCACAU [ dT ]
VEGF une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ
ID NO: 22 [ dT ]
o un siVEG siVEGF-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 23 ou une ['Id F-lb séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID
NO : 23 .1-r, so, s., I
27 SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ID NO èce et de siVEGF-1 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO: 24 ou c une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
oe -.1 24 UUCUUUGGUCUGCAUUCACAU ce I.) I.) un h, siTSP1-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 25 ou une CCUUGACAACAACGUGGUG [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d 25 'identité avec ladite SEQ ID NO : 25 T] r, so, si, siTSP1 c -1 et de siTSP1-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 26 ou CACCACGUUGUUGUCAAGG [ dT ] [ d une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
T ]
h, siTSP1-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 27 ou une P
27 CCUUGACAACAACGUGGUG r, so, si, .
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 27 siTSP1 c g ,-, -lb et de siTSP1-1 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO: 28 ou 0, une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ID NO èce et de siVEGF-1 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO: 24 ou c une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
oe -.1 24 UUCUUUGGUCUGCAUUCACAU ce I.) I.) un h, siTSP1-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 25 ou une CCUUGACAACAACGUGGUG [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d 25 'identité avec ladite SEQ ID NO : 25 T] r, so, si, siTSP1 c -1 et de siTSP1-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO: 26 ou CACCACGUUGUUGUCAAGG [ dT ] [ d une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
T ]
h, siTSP1-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 27 ou une P
27 CCUUGACAACAACGUGGUG r, so, si, .
séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 27 siTSP1 c g ,-, -lb et de siTSP1-1 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO: 28 ou 0, une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
28 CACCACGUUGUUGUCAAGG
.
, .
, siRNA- ' , TSP1 siTSP1-2 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 29 ou une UACCCGAGACGAUUGUAUG [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d
.
, .
, siRNA- ' , TSP1 siTSP1-2 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 29 ou une UACCCGAGACGAUUGUAUG [ dT ] [ d séquence ayant au moins 75% d
29 h' identité avec ladite SEQ ID NO : 29 T ]
siTSP1 et de siTSP1-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 30 ou -2 CAUACAAUCGUCUCGGGUA [ dT ] [ d une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
siTSP1 et de siTSP1-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 30 ou -2 CAUACAAUCGUCUCGGGUA [ dT ] [ d une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
30 T ]
siTSP1-2 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 31 ou une
siTSP1-2 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 31 ou une
31 UACCCGAGACGAUUGUAUG h séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 31 siTSP1 so et de siTSP1-2 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 32 ou n -2b ,-3 une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
32 CAUACAAUCGUCUCGGGUA
siTSP1 siTSP1-3 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 33 ou une GCCAGAACUCGGUUACCAU [ dT ] [ d --4 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 33 T ]
un I.) I.) --, .1-SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ID NO
èce et de siTSP1-3 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 34 ou I.) AUGGUAACCGAGUUCUGGC [ dT ] [ d ID
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 34 T]
oe -.1 oe siTSP1-3 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 35 ou une I.) I.) GCCAGAACUCGGUUACCAU s Un séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 35 siTSP1 et de siTSP1-3 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 36 ou -3b une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 36 AUGGUAACCGAGUUCUGGC
siTSP1-4 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 37 ou une CCAACAAACAGGUGUGCAA [ dT ] [ d h séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 37 T]
siTSP1 et de siTSP1-4 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 38 ou UUGCACACCUGUUUGUUGG [ dT ] [ d P
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 38 T]
.
,-, 0, siTSP1-4 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 39 ou une CCAACAAACAGGUGUGCAA h e séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 39 c, siTSP1 , et de siTSP1-4 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 40 ou c, -4b .
, une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 40 UUGCACACCUGUUUGUUGG
siTSP1-5 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 41 ou une GCAACUACCUGGGUCACUA [ dT ] [ d so séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 41 T]
siTSP1 et de siTSP1-5 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 42 ou -5 UAGUGACCCAGGUAGUUGC [ dT ] [ d une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 42 T]
so n siTSP1-5 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 43 ou une GCAACUACCUGGGUCACUA s---séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 43 0=1 siTSP1 et de siTSP1-5 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 44 ou -5b une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 44 o un I.) I.) ,¨, 4¨
SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ID NO
èce siFoxP3-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 45 ou une CACAACAUGGACUACUUCA [ dT ] [ d ID
r, so, !,e, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 45 T]
siFoxP
c ce 3-1 et de siFoxP3-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 46 ou I.) UGAAGUAGUCCAUGUUGUG [ dT ] [ d "
un une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
T]
h, siFoxP3-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 47 ou une CACAACAUGGACUACUUCA r, so, si, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 47 siFoxP
c 3-lb et de siFoxP3-1 Brin 2b, dont la séquence est : SEQ ID
NO : 48 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
siRNA- 48 P
FoxP3 h siFoxP3-2 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 49 ou une CAUGGACUACUUCAAGUUC [ dT ] [ d , r, so, si, g séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 49 T] r., siFoxP
c .
N) 3-2 et de siFoxP3-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 50 ou .
, GAACUUGAAGUAGUCCAUG [ dT ] [ d une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
50 ..
T ]
r., .
h, siFoxP3-2 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 51 ou une CAUGGACUACUUCAAGUUC r, so, si, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 51 siFoxP
c 3-2b et de siFoxP3-2 Brin 2b, dont la séquence est : SEQ ID
NO : 52 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
so n , - q ; =1-Pour chacune des séquences (SE ID NO) numérotées de 1 à 52 du Tableau 1 :
ui I.) I.) - La première colonne indique la famille à laquelle appartient le siRNA. .1-- La deuxième colonne indique la dénomination de l'oligonucléotide.
-La troisième colonne indique la composition du siRNA, constitué par l'association d'un oligonucléotide de type brin 1 (respectivement c2, o lb) ou d'un oligonucléotide dont la séquence présente au moins 75% d'identité
avec cet oligonucléotide de type brin 1 et d'un 5:0, tl oligonucléotide de type brin 2 (respectivement 2b) ou d'un oligonucléotide dont la séquence présente au moins 75% d'identité avec cet oligonucléotide de type brin 2 (respectivement 2b).
- La quatrième colonne indique la numérotation de l'oligonucléotide telle que déposée - La cinquième colonne indique la séquence dans l'orientation 5' vers 3'.
La notation [dT][dT] est utilisée pour indiquer la présence de deux désoxythymidines débordantes.
P
La sixième colonne indique si le siRNA constitué par l'association des deux oligonucléotides dont la séquence est à 100% identique à celle .
, inscrite en colonne 5 s'hybride avec un ARNm humain (h), de rat (r), de souris (s), de singe (si) ou de chien (c). La conservation de la séquence rõ
cible d'un siRNA entre l'homme et d'autres espèces animales est avantageuse car elle augmente fortement la probabilité que les résultats des ,9 , études précliniques, notamment celles de toxicologie, soient prédictives des effets chez l'humain. , rõ
Lorsque les siRNA indiqués dans le Tableau 1 sont constitués de deux oligonucléotides simple brin dont la séquence est à 100% identique à
celle inscrite dans le Tableau, ces siRNA ont de plus les caractéristiques suivantes :
-Le siRNA siAR-2 est décrit dans la demande PCT/FR2002/003843. La séquence cible (c'est-à-dire la séquence de l'ARNm à laquelle le .0 n brin guide de ce siRNA s'hybride) de ce siRNA est présente chez l'homme dans tous les ARNm codant pour le récepteur des androgènes, que ce -=1.-récepteur soit sauvage, muté, ou qu'il présente des variations d'épissage conduisant à la délétion partielle ou totale du domaine de liaison des e, hormones (variant AR-V7 par exemple). Le siRNA siAR-1 correspond au siAR-2 délété de 2 nucléotides à l'extrémité 3'. o ui I.) "
.1-- Les séquences cibles des siRNA siAR-1, siAR- lb, siAR-2, siAR-2b sur l'ARNm codant le récepteur des androgènes sont conservées chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien. o I.) -La sequence cible des siRNA siAR-3 et siAR-3b est située sur l'ARNm humain codant pour le récepteur des androgènes. Cette séquence e -,..--, cible n'est que partiellement conservée chez les autres espèces.
ce I.) I.) - La sequence cible des siRNA siAR-4 et siAR-4b est située sur l'ARNm humain codant pour le variant V7 du récepteur des androgenes ' exprimé notamment dans les cancers de la prostate résistants à la castration.
Cette séquence cible n'est que partiellement conservée chez les autres espèces.
- Le siRNA AR-5 est décrit dans la demande PCT/FR2002/003843. La séquence cible de ce siRNA et du siRNA AR-5b est située sur l'ARNm humain codant pour le récepteur des androgènes présentant la mutation T877A fréquemment retrouvée dans les cancers de la prostate.
P
Cette séquence cible n'est que partiellement conservée chez les autres espèces.
5' ..
-Le siRNA siVEGF-1 est décrit dans la demande de brevet PCT/FR2002/003843. La séquence cible des siRNA
siVEGF-1, siVEGF-lb g sur l'ARNm codant le VEGF est conservée chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien.
,9 -Les siRNA siTSP1-1, siTSP1-1b, siTSP1-2 et siTSP1-2b ont été décrits dans la demande PCT/EP2010/061156.
La séquence cible des o'r siRNA siTSP1-1, siTSP1-lb sur l'ARNm codant la Thrombospondine-1 est conservée chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien.
- La séquence cible des siRNA siTSP1-2 et le siTSP1-2b sur l'ARNm humain codant la Thrombospondine-1 est partiellement conservée chez les autres espèces.
-Les siRNA siTSP1-3, siTSP1-3b, siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b sont les siRNA correspondant aux shRNAs mentionnés '(ej ,-q dans la demande de brevet US2011/0166199.
- Les siRNA siFOXP3-1, siFoxP3-1b, siFOXP3-2 et siFoxP3-2b sont nouveaux et sont décrits pour la première fois dans la présente 77;
o demande de brevet. Les séquences cible de ces siRNA sont situées sur l'ARNm humain codant le facteur de transcription FoxP3 et sont ;?4' .1-conservées chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien.
cq cn
siTSP1 siTSP1-3 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 33 ou une GCCAGAACUCGGUUACCAU [ dT ] [ d --4 séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 33 T ]
un I.) I.) --, .1-SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ID NO
èce et de siTSP1-3 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 34 ou I.) AUGGUAACCGAGUUCUGGC [ dT ] [ d ID
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 34 T]
oe -.1 oe siTSP1-3 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 35 ou une I.) I.) GCCAGAACUCGGUUACCAU s Un séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 35 siTSP1 et de siTSP1-3 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 36 ou -3b une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 36 AUGGUAACCGAGUUCUGGC
siTSP1-4 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 37 ou une CCAACAAACAGGUGUGCAA [ dT ] [ d h séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 37 T]
siTSP1 et de siTSP1-4 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 38 ou UUGCACACCUGUUUGUUGG [ dT ] [ d P
une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 38 T]
.
,-, 0, siTSP1-4 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 39 ou une CCAACAAACAGGUGUGCAA h e séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 39 c, siTSP1 , et de siTSP1-4 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 40 ou c, -4b .
, une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 40 UUGCACACCUGUUUGUUGG
siTSP1-5 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 41 ou une GCAACUACCUGGGUCACUA [ dT ] [ d so séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 41 T]
siTSP1 et de siTSP1-5 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO : 42 ou -5 UAGUGACCCAGGUAGUUGC [ dT ] [ d une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 42 T]
so n siTSP1-5 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 43 ou une GCAACUACCUGGGUCACUA s---séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 43 0=1 siTSP1 et de siTSP1-5 Brin 2b, dont la séquence est: SEQ ID NO : 44 ou -5b une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO: 44 o un I.) I.) ,¨, 4¨
SEQ
esp I
Famille siRNA composé de:
Séquence 5 - 3' ID NO
èce siFoxP3-1 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 45 ou une CACAACAUGGACUACUUCA [ dT ] [ d ID
r, so, !,e, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 45 T]
siFoxP
c ce 3-1 et de siFoxP3-1 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 46 ou I.) UGAAGUAGUCCAUGUUGUG [ dT ] [ d "
un une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
T]
h, siFoxP3-1 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 47 ou une CACAACAUGGACUACUUCA r, so, si, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 47 siFoxP
c 3-lb et de siFoxP3-1 Brin 2b, dont la séquence est : SEQ ID
NO : 48 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
siRNA- 48 P
FoxP3 h siFoxP3-2 Brin 1, dont la séquence est : SEQ ID NO : 49 ou une CAUGGACUACUUCAAGUUC [ dT ] [ d , r, so, si, g séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 49 T] r., siFoxP
c .
N) 3-2 et de siFoxP3-2 Brin 2, dont la séquence est : SEQ ID NO
: 50 ou .
, GAACUUGAAGUAGUCCAUG [ dT ] [ d une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO:
50 ..
T ]
r., .
h, siFoxP3-2 Brin lb, dont la séquence est : SEQ ID NO : 51 ou une CAUGGACUACUUCAAGUUC r, so, si, séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO : 51 siFoxP
c 3-2b et de siFoxP3-2 Brin 2b, dont la séquence est : SEQ ID
NO : 52 ou une séquence ayant au moins 75% d'identité avec ladite SEQ ID NO :
so n , - q ; =1-Pour chacune des séquences (SE ID NO) numérotées de 1 à 52 du Tableau 1 :
ui I.) I.) - La première colonne indique la famille à laquelle appartient le siRNA. .1-- La deuxième colonne indique la dénomination de l'oligonucléotide.
-La troisième colonne indique la composition du siRNA, constitué par l'association d'un oligonucléotide de type brin 1 (respectivement c2, o lb) ou d'un oligonucléotide dont la séquence présente au moins 75% d'identité
avec cet oligonucléotide de type brin 1 et d'un 5:0, tl oligonucléotide de type brin 2 (respectivement 2b) ou d'un oligonucléotide dont la séquence présente au moins 75% d'identité avec cet oligonucléotide de type brin 2 (respectivement 2b).
- La quatrième colonne indique la numérotation de l'oligonucléotide telle que déposée - La cinquième colonne indique la séquence dans l'orientation 5' vers 3'.
La notation [dT][dT] est utilisée pour indiquer la présence de deux désoxythymidines débordantes.
P
La sixième colonne indique si le siRNA constitué par l'association des deux oligonucléotides dont la séquence est à 100% identique à celle .
, inscrite en colonne 5 s'hybride avec un ARNm humain (h), de rat (r), de souris (s), de singe (si) ou de chien (c). La conservation de la séquence rõ
cible d'un siRNA entre l'homme et d'autres espèces animales est avantageuse car elle augmente fortement la probabilité que les résultats des ,9 , études précliniques, notamment celles de toxicologie, soient prédictives des effets chez l'humain. , rõ
Lorsque les siRNA indiqués dans le Tableau 1 sont constitués de deux oligonucléotides simple brin dont la séquence est à 100% identique à
celle inscrite dans le Tableau, ces siRNA ont de plus les caractéristiques suivantes :
-Le siRNA siAR-2 est décrit dans la demande PCT/FR2002/003843. La séquence cible (c'est-à-dire la séquence de l'ARNm à laquelle le .0 n brin guide de ce siRNA s'hybride) de ce siRNA est présente chez l'homme dans tous les ARNm codant pour le récepteur des androgènes, que ce -=1.-récepteur soit sauvage, muté, ou qu'il présente des variations d'épissage conduisant à la délétion partielle ou totale du domaine de liaison des e, hormones (variant AR-V7 par exemple). Le siRNA siAR-1 correspond au siAR-2 délété de 2 nucléotides à l'extrémité 3'. o ui I.) "
.1-- Les séquences cibles des siRNA siAR-1, siAR- lb, siAR-2, siAR-2b sur l'ARNm codant le récepteur des androgènes sont conservées chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien. o I.) -La sequence cible des siRNA siAR-3 et siAR-3b est située sur l'ARNm humain codant pour le récepteur des androgènes. Cette séquence e -,..--, cible n'est que partiellement conservée chez les autres espèces.
ce I.) I.) - La sequence cible des siRNA siAR-4 et siAR-4b est située sur l'ARNm humain codant pour le variant V7 du récepteur des androgenes ' exprimé notamment dans les cancers de la prostate résistants à la castration.
Cette séquence cible n'est que partiellement conservée chez les autres espèces.
- Le siRNA AR-5 est décrit dans la demande PCT/FR2002/003843. La séquence cible de ce siRNA et du siRNA AR-5b est située sur l'ARNm humain codant pour le récepteur des androgènes présentant la mutation T877A fréquemment retrouvée dans les cancers de la prostate.
P
Cette séquence cible n'est que partiellement conservée chez les autres espèces.
5' ..
-Le siRNA siVEGF-1 est décrit dans la demande de brevet PCT/FR2002/003843. La séquence cible des siRNA
siVEGF-1, siVEGF-lb g sur l'ARNm codant le VEGF est conservée chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien.
,9 -Les siRNA siTSP1-1, siTSP1-1b, siTSP1-2 et siTSP1-2b ont été décrits dans la demande PCT/EP2010/061156.
La séquence cible des o'r siRNA siTSP1-1, siTSP1-lb sur l'ARNm codant la Thrombospondine-1 est conservée chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien.
- La séquence cible des siRNA siTSP1-2 et le siTSP1-2b sur l'ARNm humain codant la Thrombospondine-1 est partiellement conservée chez les autres espèces.
-Les siRNA siTSP1-3, siTSP1-3b, siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b sont les siRNA correspondant aux shRNAs mentionnés '(ej ,-q dans la demande de brevet US2011/0166199.
- Les siRNA siFOXP3-1, siFoxP3-1b, siFOXP3-2 et siFoxP3-2b sont nouveaux et sont décrits pour la première fois dans la présente 77;
o demande de brevet. Les séquences cible de ces siRNA sont situées sur l'ARNm humain codant le facteur de transcription FoxP3 et sont ;?4' .1-conservées chez de nombreuses espèces dont l'homme, le rat, la souris, le singe, le chien.
cq cn
33 Tableau 2 : Exemples d'agents anti-angiogéniques (Drug name) pouvant être utilisés dans la présente invention =
tete nem Meoiâeeree %tete! uee lieeeireme .....................................................
exeiteets. teeene. s."ieee4e: . ReX":, = =
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34 PCT/FR2017/052214 Tableau 3 : Exemples d'agents nTirri= unothérapeutiques (colonne "Modality,, ) pouvant être utilises dans la présente invention _.,.,.,.:.:.:...:.:............................................................
........................................................ . .
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?,,tc,i .::::ze ereg.e0.¨:: :?µ..etee *eeete,*.:NY=ezem,e,tless=rAwk,exice,ckeice; e.e=%. ".z eece .:>:=1 :lee).kee.ece"ie=Miy, I.: ,-r..e."..sze..,:bee iot=sepeet>=== ,"e.e: z=*'>".i:)..ekzq>.i=ti .4t eleeeetheeey ee:emx.e.e.liieee i .oc .8 .e.k.
Tableau 4: Exemples d'agents anti-tumoraux (Drtig Name) pouvant être utilisés dans la présente invention WO 2018/(178225 35 IN1:::.444;i:e:ggi.:..U:=..e:410gekeikeeg{:ig::=:M!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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maleate (pK1) 1.2-2.6 1.97 phosphate (pK1) 1.7-2.9 2.15 CABS 10.0-11.4 10.7 piperidine 10.5-12.0 11.12 glycine (pK1) 2.2-3.6 2.35 citrate (pK1) 2.2-6.5 3.13 glycylglycine (pK1) 2.5-3.8 3.14 malate (pK1) 2.7-4.2 3.4 formate 3.0-4.5 3.75 citrate (pK2) 3.0-6.2 4.76 succinate (pK1) 3.2-5.2 4.21 acetate 3.6-5.6 4.76 propionate 3.8-5.6 4.87 malate (pK2) 4.0-6.0 5.13 pyridine 4.9-5.9 5.23 piperazine (pK1) 5.0-6.0 5.33 cacodylate 5.0-7.4 6.27 succinate (pK2) 5.5-6.5 5.64 MES 5.5-6.7 6.1 riniori :. Whe deea: A>Ka 2ve citrate (pK3) 5.5-7.2 6.4 maleate (pK2) 5.5-7.2 6.24 histidine 5.5-7.4 1.70, 6.04, 9.09 bis-tris 5.8-7.2 6.46 phosphate (pK2) 5.8-8.0 7.2 ethanolamine 6.0-12.0 9.5 ADA 6.0-7.2 6.59 carbonate (pK1) 6.0-8.0 6.35 ACES 6.1-7.5 6.78 PIPES 6.1-7.5 6.76 MOPSO 6.2-7.6 6.87 imidazole 6.2-7.8 6.95 BIS-TRIS propane 6.3-9.5 6.80, 9.00 BES 6.4-7.8 7.09 MOPS 6.5-7.9 7.14 HEPES 6.8-8.2 7.48 TES 6.8-8.2 7.4 MOBS 6.9-8.3 7.6 DIPSO 7.0-8.2 7.52 TAPSO 7.0-8.2 7.61 triethanolamine (TEA) 7.0-8.3 7.76 0.91, 2.10, 6.70, pyrophosphate 7.0-9.0 9.32 HEPPSO 7.1-8.5 7.85 POPSO 7.2-8.5 7.78 tricine 7.4-8.8 8.05 hydrazine 7.5-10.0 8.1 glycylglycine (pK2) 7.5-8.9 8.25 Trizma (tris) 7.5-9.0 8.06 EPPS, HEPPS 7.6-8.6 8 BICINE 7.6-9.0 8.26 HEPBS 7.6-9.0 8.3 TAPS 7.7-9.1 8.4 2-amino-2-methy1-1,3-propanediol 7.8-9.7 8.8 (AMPD) TABS 8.2-9.6 8.9 AMPSO 8.3-9.7 9 taurine (AES) 8.4-9.6 9.06 9.23, 12.74, borate 8.5-10.2 13.80 CHES 8.6-10.0 9.5 2-amino-2-methy1-1-propanol (AMP) 8.7-10.4 9.69 glycine (pK2) 8.8-10.6 9.78 ammonium hydroxide 8.8-9.9 9.25 CAPSO 8.9-10.3 9.6 carbonate (pK2) 9.5-11.1 10.33 methylamine 9.5-11.5 10.66 piperazine (pK2) 9.5-9.8 9.73 CAPS 9.7-11.1 10.4 phosphate (pK3) 12.33 Références :
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L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes.
Les exemples ci-après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas vise à restreindre la portée de l'invention.
Légende des figures :
Figure 1: Représentation schématique de la méthode de quantification d'un siRNA par RT-qPCR. Exemple de gamme de référence.
Figure 2 : L'injection intraveineuse du siRNA siAR-1 ne permet pas d'inhiber la croissance d'une tumeur prostatique xénogreffée chez la souris.
Croissance des tumeurs 22RV1 xenogreffées sur des souris traitées quotidiennement par voie intraveineuse par un siRNA contrôle (cont; courbe grise) ou par siAR-1 à
0.12 mg/kg (courbe noire). Moyenne SEM, n=4 souris par groupe.
Figure 3 : L'administration systémique continue d'un siRNA Luciférase (siLuc), qui ne cible pas d'ARNm exprimé chez la souris, permet sa distribution dans le sérum et différents organes.
Concentration moyenne (moles/L) du siRNA siLuc dans le sérum et différents organes de souris (n=3) ayant reçu par administration sous cutanée continue pendant 3 jours le siLuc à la dose de 2mg/kg/jour dilué dans une solution de NaCl 154mM.
Figure 4 : Les siRNA FoxP3-1 et FoxP3-2 inhibent l'expression de FoxP3 dans des cellules tumorales. Les cellules prostatiques C4-2 ont été transfectées par siFoxP3-1 ou par siFoxP3-2 ou par un siRNA contrôle (cont). Deux jours après transfection, la quantité
d'ARNm FoxP3 dans les cellules, rapportée à la quantité de l'ARNm de la Cyclophiline A
considérée comme invariable (méthode delta-delta CT) a été mesurée et rapportée à la valeur mesurée dans la condition contrôle.
Figure 5 : le siRNA siFoxP3-2 administré de façon systémique par voie sous cutanée se distribue dans le sérum et différents organes. Concentration (moles/L, moyenne SEM, n=4 souris par groupe) dans le sérum et différents organes du siRNA siFoxP3-2 chez des souris ayant reçu quotidiennement pendant 4 jours consécutifs le siRNA siFoxP3-2 dilué dans un tampon citrate contenant 10mM de MgCl2, administré à la dose de 0.12mg/kg en bolus par voie sous cutanée.
Figure 6 : l'administration quotidienne du siRNA siFoxP3-2 pendant 3 jours consécutifs à
des souris mâles réduit la quantité d'ARNm codant FoxP3 dans les testicules.
Quantification de l'ARNm codant FoxP3, rapporté à la quantité d'ARNm codant la cyclophiline A
dans les testicules des souris traitées quotidiennement pendant 4 jours consécutifs en bolus par voie sous cutanée par le siRNA siFoxP3-2 dilué soit dans un tampon citrate contenant 10mM de MgCl2, administré à la dose de 0.12mg/kg (noté siFoxP3-2), soit par le véhicule (noté
"cont").
Figure 7 : L'administration simultanée de 3 siRNAs permet leur distribution dans le sérum et différents organes. Concentration des siRNA siAR-1 (barres noires), siTSP1-1 (barres gris foncé) et siLuc (barres gris clair) dans le sérum, la prostate et les os 10 minutes après injection sous cutanée d'un mélange de ces 3 siRNA dilués dans un tampon citrate 10mM à pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Pour chaque siRNA, la concentration sérique a été
considérée comme ayant une valeur 1 et les concentrations dans les organes ont été rapportées à cette valeur dans le sérum.
Figure 8 : L'administration continue pendant 4 semaines du siAR-1 permet de maintenir sensiblement constante sa concentration sérique chez des singes. Concentration au cours du temps du siAR-1 formulé en NaCl 154mM administré de façon continue par voie sous cutanée pendant 4 semaines à des singes (n=4) à la dose de 0.05 mg/kg/jour. La concentration sérique moyenne mesurée à la fin de la seconde, troisième et quatrième semaine de traitement est rapportée à la moyenne de celle mesurée à la fin de la première semaine de traitement.
Figure 9 : Comparaison de la pharmacocinétique dans le sérum d'un siRNA après administration sous cutanée en bolus ou en continu.
Vingt-quatre heures avant implantation des pompes osmotiques comme décrit à la figure 8, les mêmes animaux ont reçu une injection sous cutanée unique en bolus de 0.05 mg/kg de siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154 mM) et la concentration a été
mesurée au cours du temps. Le trait continu indique la moyenne des valeurs reportées dans la figure 8. On observe que la concentration sérique de siRNA augmente rapidement après l'injection en bolus puis que le siRNA est rapidement éliminé, indétectable dès la 3ème heure.
Figure 10 : L'administration systémique continue par voie sous cutanée d'un siRNA
formulé en solution saline inhibe l'expression de sa cible dans les tissus plus efficacement qu'avec une administration en bolus.
Des pompes osmotiques délivrant une dose de siRNA siTSP1-1 de 0.12mg/kg/jour formulé en solution saline (NaCl 154mM) ont été implantées en sous cutané
pendant 1 semaine chez des souris (groupe "continu", barres noires). Un autre groupe de souris a reçu chaque jour pendant 7 jours une injection sous cutanée en bolus de siRNA TSP1-1 à la dose de 0.12mg/kg formulé en solution saline (groupe "bolus", barres grises) (n=5 souris par groupe). En fin de traitement, dans chaque groupe, le siRNA siTSP1-1 a été
quantifiés dans différents tissus (panneau A) et l'ARNm codant la TSP1 mesuré dans la prostate (panneau B).
Dans le panneau A, pour chaque organe, les concentrations moyennes de siTSP1-1 mesurées dans le groupe "bolus" ont été rapportées à la moyenne de celles mesurées dans le groupe "continu" considérées comme ayant la valeur 1. Panneau B : L'expression de l'ARNm codant la TSP1 mesurée par RT-qPCR dans les différents organes et dans les groupes "continu"
(barres grises) ou bolus (barres noires) a été rapportée à celle mesurée dans les organes d'un groupe de souris traitées par la solution de NaCl 154m1IV1 ne contenant pas le siRNA (groupe "véhicule", barres blanches).
Figure 11 : Effet de l'administration de siRNA en bolus ou en continu sur la croissance tumorale. Des souris Nude ont été greffées avec des cellules prostatiques C4-2. Une fois la prise tumorale constatée, les souris ont été traitées par le siRNA siAR-1.
Panneau A: Mesure au cours du temps du volume des tumeurs (moyenne SEM, n=
animaux par groupe) chez les souris ayant reçu le siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154 mM) et administré par voie sous cutanée quotidiennement à la dose de 0.12mg/kg/jour (symboles noirs, traits discontinus) ou de lmg/kg (symboles noirs, traits continus). Un groupe contrôle (symboles blancs) a reçu une injection quotidienne du véhicule (NaCl 154mM).
Panneau B : Des pompes osmotiques implantables Alzet ont été remplies soit avec une solution saline (groupe véhicule, 154mM NaCl, losanges blancs), soit avec le siRNA siAR-1 formulé en solution saline (154 mM NaCl). La concentration du siRNA a été
ajustée en fonction du débit de la pompe pour délivrer une dose quotidienne de 0.02 mg/kg/jour (losanges gris clair), 0.2 mg/kg/jour (losanges gris foncés) ou 2 mg/kg/jour (losanges noirs).
Les pompes ont été implantées en sous cutané chez les animaux et les tumeurs mesurées au cours du temps (moyenne SEM, n= 8 animaux par groupe).
Figure 12 : Inhibition des métastases osseuses de cancers de la prostate par administration systémique continue de siAR-1.
Panneau de gauche : Niveau d'expression de l'ARNm de AR humain, dans le tibia de souris nude porteuses de tumeurs prostatiques humaines 22RV1 chez des souris traitées par le véhicule (NaCl 154 mM, barre noire) ou par le siAR-1 dilué dans ce véhicule (barre grise) et administré par voie sous cutanée de façon continue pendant 3 semaines (moyenne SEM, n=7 valeurs rapportées à la valeur de la moyenne du groupe NaCl).
Panneau de droite : Charge métastatique dans l'os, mesurée par l'expression de l'ARNm de l'HPRT humain dans les deux groupes d'animaux. Chaque barre représente la charge métastatique osseuse dans une souris. "0" indique que l'ARNm de l'HPRT n'a pas été détecté
chez cet animal.
Figure 13 : Immunodétection du récepteur des androgènes dans la prostate de souris traités par siAR-1 par administration sous cutanée continue pendant 1 mois. De gauche à
droite les photos sont représentatives des prostates de groupes de souris (n=10) traitées par le véhicule (NaCl 154 mM), ou siAR-1 aux doses de 0.2 mg/kg/jour, 2 mg/kg/jour, mg/kg/jour.
Figure 14 : Immunodétection du récepteur des androgènes dans la prostate de rats traités par siAR-1 par administration sous cutanée continue pendant 2 semaines. Les photos sont représentatives des prostates de rats traitées par le véhicule (NaCl 154 mM) "cont", ou siAR-1 aux doses de 0.1 mg/kg/jour ou 0.9 mg/kg/jour.
Figure 15 : Quantification de siAR-1 dans différents organes de singes ayant reçu une administration continue sous cutanée de ce siRNA pendant un mois à la dose de 5 mg/kg/jour (n=4 animaux). La concentration de siAR-1 dans les organes a été rapportée à
la concentration mesurée dans le sérum.
Figure 16 : Quantification du PSA (Prostate Specific Antigen) dans le sérum de singes Cynomolgus (n=6 par groupe) avant traitement, ou après traitement pendant 1 mois par administration sous cutanée continue d'une solution saline (NaCl 154mM) ou de siAR-1 dans solution saline à la dose de 5 mg/kg/jour. Ordonnée : PSA sanguin en pg/ml. La limite de détection du test ELISA (LLOQ ou lower limit of quantification) indiquée par un trait pointillé, est de 120 pg/ml. Les valeurs inférieures à cette valeur sont arbitrairement indiquées comme 119 pg/ml.
Figure 17 : Immunodétection de la TSP1 et des vaisseaux sanguins (marquage CD31) dans des tumeurs de glioblastome U87 implantées dans le cerveau de souris nude traitées pendant 15 jours par administration intracérébrale continue, de siTSP1-1 (noté
siRNA TSP1) ou d'un siRNA contrôle (siRNA-cont), le cathéther délivrant le siRNA étant implanté à
distance de la tumeur.
Figure 18 : Analyse par électrophorèse en gel d'acrylamide de l'intégrité d'un siRNA
incubé dans différentes conditions. Pistes 1, 5, et 7 : siTSP1-1 en solution aqueuse; Piste 2 :
mélange (1:1, poids:poids) de siTSP1-1 et de LDL oxydés; Piste 3 : mélange (1:10, poids:poids) de siTSP1-1 et de LDL oxydés ; Piste 4 : mélange (1:1, poids:poids) de siTSP1-1 et d'hexaréline ; Piste 6 : siTSP1-1 dans une solution aqueuse ajustée à pH 6 contenant 0.1 mM de ZnC12; Piste 8 : siTSP1-1 en tampon citrate 10 mM pH 6 ; Piste 9-11:
siTSP1-1 en tampon citrate 10 mM pH 6 additionné de 1 mM de ZnC12 incubé à 37 C pendant 10 minutes (piste 9), lheure (piste 10) ou 6h (piste 11). M : marqueur de poids moléculaire (25 pb DNA
ladder Invitrogen).
Figure 19 : Concentration de siTSP1-1 dans le sérum et la prostate après administration de ce siRNA par voie sous cutanée en bolus ; Effet de la formulation.
Des groupes de souris adultes ont reçu une administration en bolus par voie sous cutanée du siRNA siTSP-1 à la dose de 0.12 mg/kg formulé soit dans une solution contenant 154 mM
de NaCl (groupe contrôle barres grises), soit dans une solution aqueuse contenant 0.165 mM
de ZnC12 (barres noires). La concentration de siRNA mesurée dans le sérum et la prostate de ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes après injection et rapportée à la valeur du groupe contrôle considérée comme 1.
Figure 20 : Concentration du siAR-1 dans le sérum et différents organes en fonction de la formulation du siRNA administré.
Concentration de siAR1 dans le sérum ou les tissus de souris ayant été
injectés par voie sous cutanée avec le siRNA siAR-1 formulé dans l'une des solutions suivantes :
NaC1154mM
(NaCl, groupe contrôle) ; tampon citrate 10mM pH 6 (Cit) ; tampon citrate 10mM
pH 6 additionné de 0.1mM de MnC12 (Cit/Mn), ou de 0.1 mM de MgCl2 (Cit/Mg), ou de 0.1 mM
de ZnC12 (Cit/Zn), ou de 0.1mM de ZnC12 et de 0.1 mM de MnC12 (Cit/ZnMn), ou de 0.1mM
de ZnC12 et de 0.1mM de MnC12 et de 0.1mM de MgCl2 (Cit/ZnMnMg), ou de 10 mM
de ZnC12 (Cit/Zn10) ou de 0.05 mM de spermidine (Cit/Sperm).
Panneau A : valeurs mesurées dans le sérum d'animaux mâles ayant reçu le traitement indiqué.
Panneau B : valeurs mesurées dans la prostate (barres gris foncé) ou la rate (barres gris clair) d'animaux mâles ayant reçu le traitement indiqué.
Panneau C : valeurs mesurées dans la rate d'animaux femelles ayant reçu le traitement indiqué.
Figure 21: Un mélange des 3 siRNA suivants : siAR-1, siTSP1-1 et siLuc a été
préparé
soit en solution saline (NaCl 154mM), soit en tampon citrate 10mM pH 6 contenant 7.5 mM
de MgCl2 et administré par voie sous-cutanée continue pendant 3 jours à des souris porteuses de tumeurs 4T1, chaque siRNA étant délivré à raison de 2mg/kg/jour. Le siRNA a été dosé
dans le sérum et différents organes, y compris les tumeurs 4T1. Les concentrations de chaque siRNA, mesurées dans le sérum, les organes (panneau A) et les tumeurs (panneau B), ont été
rapportées à celle mesurée pour le siRNA considéré dans le sérum des souris du groupe contrôle (NaCl 154mM). Barres noires : siAR-1, barres gris foncé, siTSP1-1, barres gris clair : siLuc.
Figure 22 : Le siRNA siRNA siAR-1, à la dose de 0.12 mg/kg, formulé dans une solution de 154 mM de NaCl (groupe contrôle, noté NaCl) ou dans un tampon citrate 10 mM
pH 6 additionné soit de (siRNA:hexaréline, 1:0,2 poids:poids) Cit/Hexarelin), soit de LDL oxydés (siRNA:LDL oxydés, 1:1: poids:poids) (Cit/LDL) a été administré par voie sous cutanée à
des groupes de souris adultes. La concentration du siRNA mesurée dans le sérum (panneau A), dans la prostate (panneau B, barres gris foncé) ou la rate (panneau B, barres gris clair) de ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes après injection et rapportée à celle du groupe contrôle (NaCl).
Figure 23 : La concentration dans le sérum, les tissus et tumeurs d'un siRNA
administré
de façon systémique et continue par voie sous cutanée est augmentée lorsqu'il est formulé
dans un tampon citrate contenant des LDL oxydés. Des pompes osmotiques ont été
implantées en sous cutanée sur des souris porteuses de tumeur 22RV1 afin de délivrer de façon systémique et continue pendant 3 jours 2mg/kg/jour de siAR-1 et 0.2 mg/kg/jour de LDL oxydés, formulés soit dans du NaCl 154mM soit dans un tampon citrate 10mM
à pH 6.
Les concentrations de siAR-1 dans le sérum, les organes et les tumeurs mesurées après injection de la composition en tampn citrate ont été rapportées à celles mesurées après injection de la composition en NaCl.
EXEMPLES
Exemple 1: Matériel et Méthodes 1. Quantification de siRNA par une méthode de RT-PCR quantitative modifiée Pour quantifier un siRNA dans les échantillons biologiques, les inventeurs ont développé
une méthode de réverse transcription suivie d'une PCR quantitative (RT-qPCR).
Pour chaque siRNA, une amorce tige-boucle spécifique, présentant 8 nucléotides débordants est synthétisée, les 8 nucléotides étant complémentaires des 8 nucléotides de l'extrémité 3' du brin guide (antisens) du siRNA. Après une étape de reverse transcription, le produit obtenu est amplifié par PCR à l'aide de deux amorces, l'une s'hybridant avec la région correspondant à
la boucle de l'amorce de reverse transcription. Les 12 nucléotides en 3' de la seconde amorce ayant une séquence ADN correspondant aux 12 nucléotides de l'extrémité 5' du cDNA
nouvellement synthétisé après reverse transcription du brin guide du siRNA. La détection de l'amplification est réalisée de façon continue par la dégradation d'une sonde fluorescente Taqman ou par incorporation de SybrGreen.
Une gamme de siRNA double brins, de 103 à 109 copies dans la réaction de RT, diluées dans de l'eau est réalisée et traitée en même temps que les échantillons par RT-qPCR. La Figure 1 représente schématiquement la méthode de RT-qPCR et un exemple de gamme montrant la relation entre le nombre de copies présentes dans la réaction et le CT (cycle threshold ou seuil d'amplification) obtenu.
Les échantillons biologiques dans lesquels les siRNA sont quantifiés sont de différentes origines :
- Des ARN totaux extraits à partir de fragments de tissus de poids connu supposés contenir le siRNA. Ces ARN sont extraits par des méthodes conventionnelles telles que par la méthode au phénol-chloroforme (extraction au trizol). Après extraction, ils sont dilués dans de l'eau ;
- Du sérum. Dans ce cas, un volume connu de sérum est dilué dans de l'eau contenant un inhibiteur de RNAse au 1/1000 ou davantage dilué si la concentration de siRNA
est très élevée.
Les valeurs des CT obtenus pour chaque échantillon sont comparées à celles obtenues pour la gamme. Ceci permet de calculer le nombre de copies de siRNA présent dans l'échantillon dosé. Les valeurs sont alors rapportées d'abord à la quantité
d'ARN total réverse transcrit, puis au poids de tissu dont les ARN ont été extraits ou au volume de sérum, et les résultats finaux sont exprimés en moles/L (M) en considérant que la densité de tous les tissus est de 1g/cm3.
2. Lignées cellulaires Les lignées cellulaires utilisées dans les exemples sont des lignées cellulaires issues de tumeurs de prostate chez l'homme, résistantes à la castration et exprimant le récepteur des androgènes (lignées C4-2 et 22RV1), de tumeurs mammaires de souris (4T1), ou de glioblastome humain U87.
3. Greffe de cellules tumorales chez les souris Les tumeurs sont obtenues par injection sous cutanée de cellules tumorales dans le flanc de souris Nude (tumeurs 22RV1, C4-2) ou de souris BalB/C (tumeurs 4T1). Seuls les animaux sur lesquels la prise tumorale est constatée sont inclus dans l'étude et randomisés pour recevoir le traitement ou le traitement contrôle. Les injections de siRNA
en bolus sont effectuées à raison de 1 fois par jour, 5 jours par semaine. Dans d'autres expériences, les cellules U87 ont été implantées dans le parenchyme cérébral de souris Nude par injection stéréotaxique.
Tous les siRNA sont dilués dans de l'eau contenant 154m1M de NaCl ou dans le tampon indiqué. Lorsqu'elles sont utilisées, les pompes osmotiques (par exemple pompes Alzet) sont implantées en sous cutané sur le dos des souris, du côté opposé à la tumeur si la souris en porte une. Dans le cas des tumeurs U87 implantées en orthotopique, la pompe osmotique est implantée sous la peau et un cathéter placé à la sortie de la pompe est relié
à un dispositif fixé
sur la boite cranienne par un ciment et délivrant le composé dans le cerveau, à distance de la tumeur implantée précédemment.
Le volume des tumeurs sous cutanées est estimé en mesurant à l'aide d'un pied à coulisse le plus grand (D) et le plus petit (d) diamètre des tumeurs. Le volume est calculé par la formule V= Dxdxdx0.5.
En fin d'expérience, les animaux sont sacrifiés, le sérum, les tumeurs et différents tissus sont disséqués, les ARN extraits et les siRNA présents dans ces ARN sont quantifiés.
Tous les protocoles expérimentaux utilisés ont été validés par les comités d'éthique et autorités réglementaires françaises. Ils sont mis en oeuvre de façon à limiter le nombre d'animaux utilisés et à éviter toute souffrance inutile.
4. siRNA utilisés Les siRNA utilisés dans les exemples sont ceux du Tableau 1.
Dans certaines expériences un siRNA ne s'hybridant avec aucun ARNm connu (siRNA
Contrôle) a été utilisé. La séquence de ce siRNA est :
SEQ ID NO 55: 5'UAGCAAUGACGAAUGCGUA[dT][dT]
SEQ ID NO 56: 5'UACGCAUUCGUCAUUGCUA[dT][dT]
Un siRNA ciblant la luciférase, gène qui n'existe pas chez les mammifères, a également été utilisé. La séquence de ce siRNA est:
SEQ ID NO 57: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA[dT][dT]
SEQ ID NO 58: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAG[dT][dT]
5. Préparation des pompes osmotiques Les siRNA sont dilués en solution saline (eau pour injection additionnée de 154mM de NaCl) ou dans le tampon indiqué à la concentration nécessaire pour atteindre l'administration de la quantité désirée sur une période de 24h. Cette concentration est calculée en tenant compte du volume horaire délivré par la pompe, comme indiqué par le fabricant (Alzet). La pompe est remplie stérilement et implantée sous la peau des animaux traités (souris, rats, singes). Le cathéther placé en sortie de la pompe libère son contenu soit sous la peau, soit dans une autre localisation afin d'obtenir une administration intrathécale ou intracérébrale. Les pompes sont maintenues en place, de quelques jours et jusqu'à 4 semaines suivant le protocole indiqué.
Une étude préalable a montré que des solutions stériles de siRNA sont stables pendant au moins 4 semaines à 37 C.
Exemple 2 : Absence d'inhibition de la croissance tumorale par des siRNA
injectés par voie intraveineuse en bolus.
Des souris nude mâles de 9 semaines ont été xénogreffées en sous cutané sur le flanc avec des cellules 22RV1. Après constation de la prise tumorale et randomisation, les souris ont reçu une injection intraveineuse quotidienne de siRNA contrôle ou de siAR-1 à
la dose de 0.12 mg/kg pendant 13 jours. Le volume tumoral a été mesuré quotidiennement.
Les résultats sont présentés dans la Figure 2. On constate que l'injection IV du siAR-1 est sans effet sur la croissance des tumeurs.
Exemple 3 : Il n'est pas nécessaire que le siRNA cible un ARNm exprimé dans l'organisme pour qu'il se distribue. Un siRNA dirigé contre la luciferase de luciole siLuc, à la dose de 2mg/kg/jour, formulé dans une solution de NaCl 154mM a été administré
à des souris par voie sous cutanée continue pendant 3 jours à l'aide de pompes osmotiques implantées. La quantification du siRNA siLuc dans le serum et différents organes présentée dans la figure 3 montre qu'il s'y distribue efficacement de façon systémique alors même qu'il n'y a pas d'ARNm cible de ce siRNA dans ces tissus.
Exemple 4 : Identification de siRNA inhibant FoxP3 et se distribuant dans les tissus in vivo.
1. Inhibition de l'expression du facteur de transcription FoxP3 dans les cellules C4-2.
Des cellules C4-2 ont été transfectées par un siRNA contrôle ou par les siRNA
siFoxP3-1 ou siFoxP3-2. 48h après transfection, les cellules ont été lysées, les ARN
extraits et l'expression de FoxP3 mesurée par RT-qPCR. Les valeurs sont normalisées par l'expression de l'ARN codant pour la cyclophiline-A (méthode delta delta CT). Les résultats sont présentés dans la Figure 4 qui montre que les deux siRNA FoxP3-1 et FoxP3-2 inhibent l'expression de FoxP3.
2. Le siRNA siFoxP3-2 se distribue dans le sérum et différents organes et inhibe l'expression de FoxP3.
Des souris (4 par groupe) ont recu quotidiennement pendant 4 jours consécutifs par voie .. sous cutanée soit 0.12 mg/kg du siRNA siFoxP3-2 formulé dans du tampon citrate à pH 6 contenant 10mM de MgCl2, soit seulement ce tampon (groupe contrôle). La figure 5 montre que le siFoxP3-2 se distribue de façon systémique dans le sérum et dans différents organes et la Figure 6 montre que dans les testicules, le siFoxP3-2 inhibe fortement l'expression de l'ARNm codant FoxP3 par rapport au groupe contrôle.
Administré en absence d'agent de vectorisation, le siRNA siFoxP3-2 est donc capable de se distribuer in vivo de façon systémique et d'inhiber l'expression de son gène cible.
Exemple 5 : L'administration simultanée de 3 siRNAs permet leur distribution systémique dans le sérum et différents organes. Les siRNA siAR-1, siTSP1-1 et siLuc ont été
dilués dans un tampon citrate 10mM à pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Le mélange a été
administré par voie sous cutanée à des souris de telle sorte que les souris recoivent une dose de 0.12mg/kg de chacun des 3 siRNA. Les souris ont été sacrifiées 10 minutes après injection et chaque siRNA a été dosé séparément dans le sérum et différents tissus. On observe que les 3 siRNA sont présents dans le sérum et dans les différents organes testés (Figure 7).
L'administration d'un cocktail de plusieurs siRNAs permet donc leur distribution systémique simultanée dans différents tissus.
Exemple 6 : Administration d'un siRNA formulé en solution saline par voie sous cutanée continue. Dans cet exemple, les siRNAs sont formulés en solution saline (NaCl 154 mM).
1. La concentration sérique d'un siRNA administré de façon continue reste sensiblement constante.
Des pompes osmotiques délivrant une dose de siRNA siAR-1 de 0.05mg/kg/jour formulé
en solution de NaCl 154mM ont été implantées en sous cutané pendant 4 semaines chez des singes Cynomolgus. La concentration sérique du siRNA a été mesurée chaque semaine pendant toute la durée du traitement. On observe que la concentration sérique varie de moins de 20% par rapport à la première mesure (considérée comme ayant la valeur 1) (Figure 8).
Vingt-quatre heures avant implantation des pompes osmotiques, les animaux ont reçu une injection sous cutanée unique en bolus de 0.05 mg/kg de siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154 mM) et la concentration a été mesurée au cours du temps. Par comparaison avec l'administration systémique continue, l'injection par voie sous cutanée en bolus de la dose de 0.05 mg/kg aboutit à une élimination rapide (Figure 9) qui, si elle est répétée dans le temps, par exemple quotidiennement, aboutit à un effet de pics et de vallées qui est évité par l'administration continue.
2. L'administration par voie sous cutanée continue est plus efficace que la voie sous cutanée en bolus pour inhiber l'expression du gène cible du siRNA.
Des souris ont reçu une injection sous cutanée quotidienne pendant 4 jours du siRNA
siTSP1-1 à la dose de 0.12 mg/kg/jour, formulé en solution saline (NaCl 154mM), ou le même siRNA formulé dans la même solution mais administré de façon continue pendant 4 jours par une pompe osmotique, à la dose de 0.2 mg/kg/jour. On observe que le siRNA
siTSP1-1 se distribue dans plusieurs organes à des niveaux comparables après administration par voie sous cutanée de façon continue ou en bolus (Figure 10A).
L'administration du siTSP1-1 produit une meilleure inhibition dans les tissus de l'expression de l'ARNm de la TSP1, lorsque le siRNA est administré en continu que lorsqu'il est administré
en bolus (Figure 10B).
3. L'administration par voie sous cutanée continue est plus efficace que la voie sous cutanée en bolus pour inhiber la croissance tumorale Des cellules C4-2 ont été greffées chez des souris. Une fois la prise tumorale constatée, les souris ont été traitées par administration du siRNA siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154mM) à différentes doses ou par le véhicule. Le siRNA a été administré
par voie sous cutanée, soit de façon discontinue, par une injection quotidienne, soit de façon continue, par implantation d'une pompe osmotique pendant 1 mois. On observe que la croissance de tumeurs C4-2 chez des souris n'est pas inhibée par l'administration par voie sous cutanée en bolus du siRNA siAR-1 à la dose de 0.12 mg/kg/jour ou même de 1 mg/kg/jour répétée quotidiennement (Figure 11A), alors qu'elle est inhibée lorsque le même siRNA
est administré par voie sous cutanée de façon continue par implantation d'une pompe osmotique, délivrant la dose de 0.2 mg/kg/jour. L'inhibition n'est pas améliorée en augmentant la dose administrée d'un facteur 10 (2 mg/kg/jour) (Figure 11B). L'administration systémique d'un même siRNA est donc plus efficace pour inhiber la croissance tumorale lorsque ce siRNA est administré de façon continue que de façon discontinue.
4. Inhibition de metastases osseuses d'une tumeur Des cellules 22RV1 ont été implantées chez des souris Nude. Une fois la prise tumorale constatée, des pompes Alzet administrant 0.2 mg/kg/jour du siRNA siAR-1 fomulé
dans une solution saline (NaC1154mM), ou le véhicule seul ont été implantées pendant 3 semaines. En fin de traitement, les os (tibia) ont été récupérés pour y quantifier le siAR-1, et les ARNm d'origine humaine codant pour le récepteur des androgènes et l'HPRT.
L'administration du siRNA siAR-1 par voie sous cutanée continue à des souris porteuses de tumeurs prostatiques humaines 22RV1 permet d'inhiber l'expression du récepteur des androgènes dans les os des souris (Figure 12 panneau de gauche). Cette inhibition s'accompagne d'une diminution du nombre de souris développant spontanément des métastases osseuses de ces tumeurs et d'une diminution de la taille de ces tumeurs, évaluée par le niveau d'expression d'un ARNm humain (HRPT) dans les os (Figure 12 panneau de droite).
L'administration systémique continue d'un siRNA permet donc de le délivrer dans les métastases d'un cancer se développant dans l'os, d'inhiber l'expression du gène cible du siRNA dans l'os et de limiter l'implantation et/ou le développement des métastases.
5. Inhibition de l'expression du récepteur des androgènes dans la prostate de souris et de rats Des pompes osmotiques délivrant le siRNA siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154m1IV1) ont été implantées en sous cutané chez souris pendant 1 mois ou chez des rats pendant 2 semaines. Cette administration, à des souris à une dose supérieure ou égale à 0.2 mg/kg (Figure 13) ou à des rats à une dose supérieure ou égale à 0.1 mg/kg (Figure 14) inhibe efficacement l'expression protéique du récepteur des androgènes dans la prostate de ces animaux.
6. Distribution d'un siRNA dans les tissus chez le singe Des singes mâles adultes ont reçu pendant 4 semaines une injection sous-cutanée continue de siAR-1 formulé en solution saline (NaC1154mM) à la dose de 5 mg/kg/jour, à
l'aide d'une pompe osmotique. Les animaux ont été sacrifiés et siAR-1 quantifié dans différents organes.
Les résultats sont présentés à la Figure 15. Il est constaté que le siRNA siAR-1 se distribue efficacement de façon systémique dans les différents organes analysés.
7. Inhibition de la production de PSA chez des singes L'antigène Spécifique de la Prostate ou PSA est détecté dans le sérum de singes mâles matures, même en l'absence de pathologie prostatique. L'administration par voie sous cutanée continue du siRNA siAR-1 pendant 4 semaines à la dose de 5mg/kg/jour conduit à
une diminution de l'expression du PSA dans le sérum des animaux, sous le seuil de détection du test ELISA utilisé pour le dosage (Figure 16). L'administration par voie sous cutanée continue d'un siRNA chez les singes permet donc de le distribuer de façon systémique dans de nombreux organes où il exerce son effet inhibiteur de l'expression génique.
Exemple 7 : Inhibition de l'expression de la TSP1 dans un glioblastome par administration intracérébrale continue de siRNA formulés en solution saline (NaC1154mM).
Des souris nude femelles ont été greffées en orthotopique avec des cellules de glioblastome U87. Les animaux ont été implantés avec une pompe osmotique placée en sous cutané dans le dos, la sortie de la pompe étant reliée à un cathéther délivrant dans le cerveau, à distance de la tumeur, un siRNA contrôle ou le siRNA siTSP1-1 contenu dans la pompe, à
raison de 2mg/kg de poids de cerveau/jour. Après 8 jours, les souris ont été
sacrifiées, et l'expression de la TSP1 détectée par immunofluorescence sur coupes des cerveaux. Les résultats sont présentés dans la Figure 17.
On observe une forte diminution de l'expression de la TSP1 chez les animaux traités par rapport aux contrôles. La TSP1 est une protéine qui inhibe la formation des vaisseaux sanguins (angiogenèse). On observe chez les animaux traités une augmentation de la densité
des vaisseaux sanguins détectés sur une coupe adjacente par immunomarquage de l'antigène CD31.
L'administration intracérébrale continue d'un siRNA permet donc d'inhiber efficacement l'expression du gène cible du siRNA dans une tumeur se développant dans cet organe et d'y produire les effets biologiques attendus.
Exemple 8: Un tampon acide évite la dégradation d'un siRNA en présence de cations.
1.
Un siRNA est dégradé en présence de ZnCl2 dans une solution aqueuse dont le pH a été ajusté à 6. Un tampon citrate à pH 6 préserve le siRNA.
La dégradation du siRNA siTSP1-1 a été mesurée après formulation de ce siRNA
dans différentes conditions. L'intégrité du siRNA siTSP1-1, a été vérifiée par dépôt sur un gel d'acrylamide d'une quantité équivalente à 300 ng de siRNA à partir d'une solution de siRNA
ayant subi les traitements suivants :
- mélange (1:1, poids:poids) de siTSP1-1 et d'hexaréline ;
- mélange (1:1 ou 1:10, poids:poids dans de l'eau) de siTSP1-1 et de LDL
oxydés ;
incubation 4h à 37 C.
- incubation 1 heure à température ambiante de siTSP1-1 dans une solution aqueuse de 0.164 mM de ZnC12 - incubation 10 minutes, lheure ou 6heures à 37 C de siTSP1-1 dans une solution de 1 mM de ZnC12 dans un tampon 10mM Citrate à pH 6.
On constate sur la Figure 18 que le siRNA est dégradé lorsqu'il est incubé
dans une solution aqueuse de ZnC12. Cette dégradation ne se produit pas dans un tampon citrate à pH 6 contenant jusqu'à 6 fois plus de ZnC12. Aucune dégradation du siRNA n'est constatée lorsqu'il est mélangé dans de l'eau avec des LDL oxydés ou de l'hexareline.
La présence d'un tampon à pH acide permet donc de maintenir l'intégrité d'un siRNA en présence de cations.
2. La formulation d'un siRNA dans une solution aqueuse contenant du ZnCl2 réduit sa concentration dans le sérum et sa distribution dans les tissus.
Le siRNA siTSP1-1 formulé soit dans du NaCl 154m1IVl, soit dans de l'eau contenant 0.165 mM de ZnC12 et administré par voie sous cutané à des souris à la dose de 0.12 mg/kg.
La concentration du siRNA mesurée dans le sérum et les tissus est réduite lorsque le siRNA
est formulé dans une solution aqueuse contenant des cations par rapport aux résultats obtenus lorsque le même siRNA est administré à la même dose et de la même façon mais formulé en solution saline (154 mM NaCl) (Figure 19).
Exemple 9 : Formulations améliorant la biodistribution d'un siRNA in vivo 1. La concentration dans le sérum et les tissus d'un siRNA administré de façon systémique est augmentée lorsqu'il est formulé dans un tampon citrate et plus encore dans un tampon citrate contenant différents cations.
Le siRNA siAR-1 à la dose de 0.12 mg/kg, formulé dans différentes solutions a été
administré par voie sous cutanée à des souris. La concentration de siAR-1 mesurée dans le sérum ou organes de ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes après injection et comparée à celle du groupe contrôle, consitué d'animaux ayant reçu le siRNA
dilué dans une solution aqueuse contenant 154 mM de NaCl (noté NaCl).
En comparaison avec une formulation dans une solution saline (NaCl 154 mM), la formulation du siRNA siAR-1 dans un tampon Citrate 10mM pH 6 augmente la concentration de ce siRNA dans le sérum (Figure 20A). Cette concentration est encore augmentée dans le sérum et les tissus lorsque le tampon citrate 10mM pH 6 est additionné de ZnC12, MnC12, MgCl2, ou d'une combinaison de ces sels (Figure 20B).
2. Dans le sérum les tissus et tumeur, la concentration d'un siRNA
administré de façon systémique et continue est augmentée lorsqu'il est formulé dans un tampon citrate contenant des cations.
Un mélange de 3 siRNA, siAR-1, siTSP1-1 et siLuc, a été administré par voie sous cutanée continue pendant 3 jours à des souris porteuses de tumeurs mammaires murines 4T1 à
l'aide d'une pompe osmotique implantée en sous cutané. Chaque siRNA a été
administré à la dose de 2mg/kg/jour. Le mélange a été formulé soit dans une solution de NaCl 154mM soit dans un tampon Citrate 10mM pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Après 3 jours, la concentration de chaque siRNA dans le sérum, les tumeurs et différents organes a été mesurée et les valeurs mesurées lorsque le siRNA avait été formulé en tampon citrate-MgCl2 a été
rapporté aux valeurs mesurées avec administration du siRNA formulé en solution saline (NaCl 154mM) dans le même tissu. Les résultats reportés dans les figures 21A
et 21B
montrent que la formulation des siRNA dans le tampon citrate-MgCl2 augmente d'un facteur allant jusqu'à plus de 250 leur distribution systémique dans les tissus par rapport à leur formulation en solution saline.
Exemple 10: Ciblage d'un siRNA par ajout d'un ligand de CD36 Des souris ont reçu une injection sous cutanée de siAR-1 à la dose de 0.12mg/kg formulé
soit en solution saline (NaCl 154mM) soit en tampon citrate 10mM pH 6 contenant de l'hexaréline, (rapport siRNA:Hexaréline ; poids/poids; 1:0,2), soit en tampon citrate 10mM
pH6 contenant des LDL oxydés (rapport siRNA:LDL oxydés ; poids:poids ; 1:1).
La concentration de siAR-1 a été mesurée et rapportée à la concentration mesurée lorsque le siRNA était formulé en solution saline (NaCl 154m1IV1) dans le même tissu. Les résultats observés dans le sérum sont reportés dans la figure 22A, dans la prostate et la rate dans la figure 22B. Ils montrent que l'ajout d'hexaréline ou de LDL oxydés augmentent la concentration du siRNA dans le sérum ou les tissus.
Dans une autre expérience, des pompes osmotiques ont été implantées chez des souris porteuses de tumeurs 22RV1, les pompes délivrant pendant 3 jours de façon continue 2mg/kg/jour de siAR-1 formulé en solution saline (NaC1154mM), ou 2mg/kg/jour de siAR-1 et 0.2 mg/kg/jour de LDL oxydés formulés en tampon citrate 10mM pH 6. Dans ce dernier cas, le siRNA et les LDL oxydés ont été simplement mélangés dans le tampon citrate, sans manipulation additionnelle. Les concentrations du siAR-1 formulé en tampon citrate contenant des LDL oxydés mesurées dans le sérum, les tissus ou les tumeurs ont été rapportée à la valeur mesurée dans le même tissu lorsque le siRNA était formulé en solution saline (NaCl 154mM). On constate sur la figure 23 que la présence de LDL oxydés augmente la concentration du siAR-1 dans le sérum les tissus et les tumeurs.
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Tableau 4: Exemples d'agents anti-tumoraux (Drtig Name) pouvant être utilisés dans la présente invention WO 2018/(178225 35 IN1:::.444;i:e:ggi.:..U:=..e:410gekeikeeg{:ig::=:M!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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maleate (pK1) 1.2-2.6 1.97 phosphate (pK1) 1.7-2.9 2.15 CABS 10.0-11.4 10.7 piperidine 10.5-12.0 11.12 glycine (pK1) 2.2-3.6 2.35 citrate (pK1) 2.2-6.5 3.13 glycylglycine (pK1) 2.5-3.8 3.14 malate (pK1) 2.7-4.2 3.4 formate 3.0-4.5 3.75 citrate (pK2) 3.0-6.2 4.76 succinate (pK1) 3.2-5.2 4.21 acetate 3.6-5.6 4.76 propionate 3.8-5.6 4.87 malate (pK2) 4.0-6.0 5.13 pyridine 4.9-5.9 5.23 piperazine (pK1) 5.0-6.0 5.33 cacodylate 5.0-7.4 6.27 succinate (pK2) 5.5-6.5 5.64 MES 5.5-6.7 6.1 riniori :. Whe deea: A>Ka 2ve citrate (pK3) 5.5-7.2 6.4 maleate (pK2) 5.5-7.2 6.24 histidine 5.5-7.4 1.70, 6.04, 9.09 bis-tris 5.8-7.2 6.46 phosphate (pK2) 5.8-8.0 7.2 ethanolamine 6.0-12.0 9.5 ADA 6.0-7.2 6.59 carbonate (pK1) 6.0-8.0 6.35 ACES 6.1-7.5 6.78 PIPES 6.1-7.5 6.76 MOPSO 6.2-7.6 6.87 imidazole 6.2-7.8 6.95 BIS-TRIS propane 6.3-9.5 6.80, 9.00 BES 6.4-7.8 7.09 MOPS 6.5-7.9 7.14 HEPES 6.8-8.2 7.48 TES 6.8-8.2 7.4 MOBS 6.9-8.3 7.6 DIPSO 7.0-8.2 7.52 TAPSO 7.0-8.2 7.61 triethanolamine (TEA) 7.0-8.3 7.76 0.91, 2.10, 6.70, pyrophosphate 7.0-9.0 9.32 HEPPSO 7.1-8.5 7.85 POPSO 7.2-8.5 7.78 tricine 7.4-8.8 8.05 hydrazine 7.5-10.0 8.1 glycylglycine (pK2) 7.5-8.9 8.25 Trizma (tris) 7.5-9.0 8.06 EPPS, HEPPS 7.6-8.6 8 BICINE 7.6-9.0 8.26 HEPBS 7.6-9.0 8.3 TAPS 7.7-9.1 8.4 2-amino-2-methy1-1,3-propanediol 7.8-9.7 8.8 (AMPD) TABS 8.2-9.6 8.9 AMPSO 8.3-9.7 9 taurine (AES) 8.4-9.6 9.06 9.23, 12.74, borate 8.5-10.2 13.80 CHES 8.6-10.0 9.5 2-amino-2-methy1-1-propanol (AMP) 8.7-10.4 9.69 glycine (pK2) 8.8-10.6 9.78 ammonium hydroxide 8.8-9.9 9.25 CAPSO 8.9-10.3 9.6 carbonate (pK2) 9.5-11.1 10.33 methylamine 9.5-11.5 10.66 piperazine (pK2) 9.5-9.8 9.73 CAPS 9.7-11.1 10.4 phosphate (pK3) 12.33 Références :
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L'invention sera mieux illustrée par les exemples et les figures suivantes.
Les exemples ci-après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas vise à restreindre la portée de l'invention.
Légende des figures :
Figure 1: Représentation schématique de la méthode de quantification d'un siRNA par RT-qPCR. Exemple de gamme de référence.
Figure 2 : L'injection intraveineuse du siRNA siAR-1 ne permet pas d'inhiber la croissance d'une tumeur prostatique xénogreffée chez la souris.
Croissance des tumeurs 22RV1 xenogreffées sur des souris traitées quotidiennement par voie intraveineuse par un siRNA contrôle (cont; courbe grise) ou par siAR-1 à
0.12 mg/kg (courbe noire). Moyenne SEM, n=4 souris par groupe.
Figure 3 : L'administration systémique continue d'un siRNA Luciférase (siLuc), qui ne cible pas d'ARNm exprimé chez la souris, permet sa distribution dans le sérum et différents organes.
Concentration moyenne (moles/L) du siRNA siLuc dans le sérum et différents organes de souris (n=3) ayant reçu par administration sous cutanée continue pendant 3 jours le siLuc à la dose de 2mg/kg/jour dilué dans une solution de NaCl 154mM.
Figure 4 : Les siRNA FoxP3-1 et FoxP3-2 inhibent l'expression de FoxP3 dans des cellules tumorales. Les cellules prostatiques C4-2 ont été transfectées par siFoxP3-1 ou par siFoxP3-2 ou par un siRNA contrôle (cont). Deux jours après transfection, la quantité
d'ARNm FoxP3 dans les cellules, rapportée à la quantité de l'ARNm de la Cyclophiline A
considérée comme invariable (méthode delta-delta CT) a été mesurée et rapportée à la valeur mesurée dans la condition contrôle.
Figure 5 : le siRNA siFoxP3-2 administré de façon systémique par voie sous cutanée se distribue dans le sérum et différents organes. Concentration (moles/L, moyenne SEM, n=4 souris par groupe) dans le sérum et différents organes du siRNA siFoxP3-2 chez des souris ayant reçu quotidiennement pendant 4 jours consécutifs le siRNA siFoxP3-2 dilué dans un tampon citrate contenant 10mM de MgCl2, administré à la dose de 0.12mg/kg en bolus par voie sous cutanée.
Figure 6 : l'administration quotidienne du siRNA siFoxP3-2 pendant 3 jours consécutifs à
des souris mâles réduit la quantité d'ARNm codant FoxP3 dans les testicules.
Quantification de l'ARNm codant FoxP3, rapporté à la quantité d'ARNm codant la cyclophiline A
dans les testicules des souris traitées quotidiennement pendant 4 jours consécutifs en bolus par voie sous cutanée par le siRNA siFoxP3-2 dilué soit dans un tampon citrate contenant 10mM de MgCl2, administré à la dose de 0.12mg/kg (noté siFoxP3-2), soit par le véhicule (noté
"cont").
Figure 7 : L'administration simultanée de 3 siRNAs permet leur distribution dans le sérum et différents organes. Concentration des siRNA siAR-1 (barres noires), siTSP1-1 (barres gris foncé) et siLuc (barres gris clair) dans le sérum, la prostate et les os 10 minutes après injection sous cutanée d'un mélange de ces 3 siRNA dilués dans un tampon citrate 10mM à pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Pour chaque siRNA, la concentration sérique a été
considérée comme ayant une valeur 1 et les concentrations dans les organes ont été rapportées à cette valeur dans le sérum.
Figure 8 : L'administration continue pendant 4 semaines du siAR-1 permet de maintenir sensiblement constante sa concentration sérique chez des singes. Concentration au cours du temps du siAR-1 formulé en NaCl 154mM administré de façon continue par voie sous cutanée pendant 4 semaines à des singes (n=4) à la dose de 0.05 mg/kg/jour. La concentration sérique moyenne mesurée à la fin de la seconde, troisième et quatrième semaine de traitement est rapportée à la moyenne de celle mesurée à la fin de la première semaine de traitement.
Figure 9 : Comparaison de la pharmacocinétique dans le sérum d'un siRNA après administration sous cutanée en bolus ou en continu.
Vingt-quatre heures avant implantation des pompes osmotiques comme décrit à la figure 8, les mêmes animaux ont reçu une injection sous cutanée unique en bolus de 0.05 mg/kg de siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154 mM) et la concentration a été
mesurée au cours du temps. Le trait continu indique la moyenne des valeurs reportées dans la figure 8. On observe que la concentration sérique de siRNA augmente rapidement après l'injection en bolus puis que le siRNA est rapidement éliminé, indétectable dès la 3ème heure.
Figure 10 : L'administration systémique continue par voie sous cutanée d'un siRNA
formulé en solution saline inhibe l'expression de sa cible dans les tissus plus efficacement qu'avec une administration en bolus.
Des pompes osmotiques délivrant une dose de siRNA siTSP1-1 de 0.12mg/kg/jour formulé en solution saline (NaCl 154mM) ont été implantées en sous cutané
pendant 1 semaine chez des souris (groupe "continu", barres noires). Un autre groupe de souris a reçu chaque jour pendant 7 jours une injection sous cutanée en bolus de siRNA TSP1-1 à la dose de 0.12mg/kg formulé en solution saline (groupe "bolus", barres grises) (n=5 souris par groupe). En fin de traitement, dans chaque groupe, le siRNA siTSP1-1 a été
quantifiés dans différents tissus (panneau A) et l'ARNm codant la TSP1 mesuré dans la prostate (panneau B).
Dans le panneau A, pour chaque organe, les concentrations moyennes de siTSP1-1 mesurées dans le groupe "bolus" ont été rapportées à la moyenne de celles mesurées dans le groupe "continu" considérées comme ayant la valeur 1. Panneau B : L'expression de l'ARNm codant la TSP1 mesurée par RT-qPCR dans les différents organes et dans les groupes "continu"
(barres grises) ou bolus (barres noires) a été rapportée à celle mesurée dans les organes d'un groupe de souris traitées par la solution de NaCl 154m1IV1 ne contenant pas le siRNA (groupe "véhicule", barres blanches).
Figure 11 : Effet de l'administration de siRNA en bolus ou en continu sur la croissance tumorale. Des souris Nude ont été greffées avec des cellules prostatiques C4-2. Une fois la prise tumorale constatée, les souris ont été traitées par le siRNA siAR-1.
Panneau A: Mesure au cours du temps du volume des tumeurs (moyenne SEM, n=
animaux par groupe) chez les souris ayant reçu le siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154 mM) et administré par voie sous cutanée quotidiennement à la dose de 0.12mg/kg/jour (symboles noirs, traits discontinus) ou de lmg/kg (symboles noirs, traits continus). Un groupe contrôle (symboles blancs) a reçu une injection quotidienne du véhicule (NaCl 154mM).
Panneau B : Des pompes osmotiques implantables Alzet ont été remplies soit avec une solution saline (groupe véhicule, 154mM NaCl, losanges blancs), soit avec le siRNA siAR-1 formulé en solution saline (154 mM NaCl). La concentration du siRNA a été
ajustée en fonction du débit de la pompe pour délivrer une dose quotidienne de 0.02 mg/kg/jour (losanges gris clair), 0.2 mg/kg/jour (losanges gris foncés) ou 2 mg/kg/jour (losanges noirs).
Les pompes ont été implantées en sous cutané chez les animaux et les tumeurs mesurées au cours du temps (moyenne SEM, n= 8 animaux par groupe).
Figure 12 : Inhibition des métastases osseuses de cancers de la prostate par administration systémique continue de siAR-1.
Panneau de gauche : Niveau d'expression de l'ARNm de AR humain, dans le tibia de souris nude porteuses de tumeurs prostatiques humaines 22RV1 chez des souris traitées par le véhicule (NaCl 154 mM, barre noire) ou par le siAR-1 dilué dans ce véhicule (barre grise) et administré par voie sous cutanée de façon continue pendant 3 semaines (moyenne SEM, n=7 valeurs rapportées à la valeur de la moyenne du groupe NaCl).
Panneau de droite : Charge métastatique dans l'os, mesurée par l'expression de l'ARNm de l'HPRT humain dans les deux groupes d'animaux. Chaque barre représente la charge métastatique osseuse dans une souris. "0" indique que l'ARNm de l'HPRT n'a pas été détecté
chez cet animal.
Figure 13 : Immunodétection du récepteur des androgènes dans la prostate de souris traités par siAR-1 par administration sous cutanée continue pendant 1 mois. De gauche à
droite les photos sont représentatives des prostates de groupes de souris (n=10) traitées par le véhicule (NaCl 154 mM), ou siAR-1 aux doses de 0.2 mg/kg/jour, 2 mg/kg/jour, mg/kg/jour.
Figure 14 : Immunodétection du récepteur des androgènes dans la prostate de rats traités par siAR-1 par administration sous cutanée continue pendant 2 semaines. Les photos sont représentatives des prostates de rats traitées par le véhicule (NaCl 154 mM) "cont", ou siAR-1 aux doses de 0.1 mg/kg/jour ou 0.9 mg/kg/jour.
Figure 15 : Quantification de siAR-1 dans différents organes de singes ayant reçu une administration continue sous cutanée de ce siRNA pendant un mois à la dose de 5 mg/kg/jour (n=4 animaux). La concentration de siAR-1 dans les organes a été rapportée à
la concentration mesurée dans le sérum.
Figure 16 : Quantification du PSA (Prostate Specific Antigen) dans le sérum de singes Cynomolgus (n=6 par groupe) avant traitement, ou après traitement pendant 1 mois par administration sous cutanée continue d'une solution saline (NaCl 154mM) ou de siAR-1 dans solution saline à la dose de 5 mg/kg/jour. Ordonnée : PSA sanguin en pg/ml. La limite de détection du test ELISA (LLOQ ou lower limit of quantification) indiquée par un trait pointillé, est de 120 pg/ml. Les valeurs inférieures à cette valeur sont arbitrairement indiquées comme 119 pg/ml.
Figure 17 : Immunodétection de la TSP1 et des vaisseaux sanguins (marquage CD31) dans des tumeurs de glioblastome U87 implantées dans le cerveau de souris nude traitées pendant 15 jours par administration intracérébrale continue, de siTSP1-1 (noté
siRNA TSP1) ou d'un siRNA contrôle (siRNA-cont), le cathéther délivrant le siRNA étant implanté à
distance de la tumeur.
Figure 18 : Analyse par électrophorèse en gel d'acrylamide de l'intégrité d'un siRNA
incubé dans différentes conditions. Pistes 1, 5, et 7 : siTSP1-1 en solution aqueuse; Piste 2 :
mélange (1:1, poids:poids) de siTSP1-1 et de LDL oxydés; Piste 3 : mélange (1:10, poids:poids) de siTSP1-1 et de LDL oxydés ; Piste 4 : mélange (1:1, poids:poids) de siTSP1-1 et d'hexaréline ; Piste 6 : siTSP1-1 dans une solution aqueuse ajustée à pH 6 contenant 0.1 mM de ZnC12; Piste 8 : siTSP1-1 en tampon citrate 10 mM pH 6 ; Piste 9-11:
siTSP1-1 en tampon citrate 10 mM pH 6 additionné de 1 mM de ZnC12 incubé à 37 C pendant 10 minutes (piste 9), lheure (piste 10) ou 6h (piste 11). M : marqueur de poids moléculaire (25 pb DNA
ladder Invitrogen).
Figure 19 : Concentration de siTSP1-1 dans le sérum et la prostate après administration de ce siRNA par voie sous cutanée en bolus ; Effet de la formulation.
Des groupes de souris adultes ont reçu une administration en bolus par voie sous cutanée du siRNA siTSP-1 à la dose de 0.12 mg/kg formulé soit dans une solution contenant 154 mM
de NaCl (groupe contrôle barres grises), soit dans une solution aqueuse contenant 0.165 mM
de ZnC12 (barres noires). La concentration de siRNA mesurée dans le sérum et la prostate de ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes après injection et rapportée à la valeur du groupe contrôle considérée comme 1.
Figure 20 : Concentration du siAR-1 dans le sérum et différents organes en fonction de la formulation du siRNA administré.
Concentration de siAR1 dans le sérum ou les tissus de souris ayant été
injectés par voie sous cutanée avec le siRNA siAR-1 formulé dans l'une des solutions suivantes :
NaC1154mM
(NaCl, groupe contrôle) ; tampon citrate 10mM pH 6 (Cit) ; tampon citrate 10mM
pH 6 additionné de 0.1mM de MnC12 (Cit/Mn), ou de 0.1 mM de MgCl2 (Cit/Mg), ou de 0.1 mM
de ZnC12 (Cit/Zn), ou de 0.1mM de ZnC12 et de 0.1 mM de MnC12 (Cit/ZnMn), ou de 0.1mM
de ZnC12 et de 0.1mM de MnC12 et de 0.1mM de MgCl2 (Cit/ZnMnMg), ou de 10 mM
de ZnC12 (Cit/Zn10) ou de 0.05 mM de spermidine (Cit/Sperm).
Panneau A : valeurs mesurées dans le sérum d'animaux mâles ayant reçu le traitement indiqué.
Panneau B : valeurs mesurées dans la prostate (barres gris foncé) ou la rate (barres gris clair) d'animaux mâles ayant reçu le traitement indiqué.
Panneau C : valeurs mesurées dans la rate d'animaux femelles ayant reçu le traitement indiqué.
Figure 21: Un mélange des 3 siRNA suivants : siAR-1, siTSP1-1 et siLuc a été
préparé
soit en solution saline (NaCl 154mM), soit en tampon citrate 10mM pH 6 contenant 7.5 mM
de MgCl2 et administré par voie sous-cutanée continue pendant 3 jours à des souris porteuses de tumeurs 4T1, chaque siRNA étant délivré à raison de 2mg/kg/jour. Le siRNA a été dosé
dans le sérum et différents organes, y compris les tumeurs 4T1. Les concentrations de chaque siRNA, mesurées dans le sérum, les organes (panneau A) et les tumeurs (panneau B), ont été
rapportées à celle mesurée pour le siRNA considéré dans le sérum des souris du groupe contrôle (NaCl 154mM). Barres noires : siAR-1, barres gris foncé, siTSP1-1, barres gris clair : siLuc.
Figure 22 : Le siRNA siRNA siAR-1, à la dose de 0.12 mg/kg, formulé dans une solution de 154 mM de NaCl (groupe contrôle, noté NaCl) ou dans un tampon citrate 10 mM
pH 6 additionné soit de (siRNA:hexaréline, 1:0,2 poids:poids) Cit/Hexarelin), soit de LDL oxydés (siRNA:LDL oxydés, 1:1: poids:poids) (Cit/LDL) a été administré par voie sous cutanée à
des groupes de souris adultes. La concentration du siRNA mesurée dans le sérum (panneau A), dans la prostate (panneau B, barres gris foncé) ou la rate (panneau B, barres gris clair) de ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes après injection et rapportée à celle du groupe contrôle (NaCl).
Figure 23 : La concentration dans le sérum, les tissus et tumeurs d'un siRNA
administré
de façon systémique et continue par voie sous cutanée est augmentée lorsqu'il est formulé
dans un tampon citrate contenant des LDL oxydés. Des pompes osmotiques ont été
implantées en sous cutanée sur des souris porteuses de tumeur 22RV1 afin de délivrer de façon systémique et continue pendant 3 jours 2mg/kg/jour de siAR-1 et 0.2 mg/kg/jour de LDL oxydés, formulés soit dans du NaCl 154mM soit dans un tampon citrate 10mM
à pH 6.
Les concentrations de siAR-1 dans le sérum, les organes et les tumeurs mesurées après injection de la composition en tampn citrate ont été rapportées à celles mesurées après injection de la composition en NaCl.
EXEMPLES
Exemple 1: Matériel et Méthodes 1. Quantification de siRNA par une méthode de RT-PCR quantitative modifiée Pour quantifier un siRNA dans les échantillons biologiques, les inventeurs ont développé
une méthode de réverse transcription suivie d'une PCR quantitative (RT-qPCR).
Pour chaque siRNA, une amorce tige-boucle spécifique, présentant 8 nucléotides débordants est synthétisée, les 8 nucléotides étant complémentaires des 8 nucléotides de l'extrémité 3' du brin guide (antisens) du siRNA. Après une étape de reverse transcription, le produit obtenu est amplifié par PCR à l'aide de deux amorces, l'une s'hybridant avec la région correspondant à
la boucle de l'amorce de reverse transcription. Les 12 nucléotides en 3' de la seconde amorce ayant une séquence ADN correspondant aux 12 nucléotides de l'extrémité 5' du cDNA
nouvellement synthétisé après reverse transcription du brin guide du siRNA. La détection de l'amplification est réalisée de façon continue par la dégradation d'une sonde fluorescente Taqman ou par incorporation de SybrGreen.
Une gamme de siRNA double brins, de 103 à 109 copies dans la réaction de RT, diluées dans de l'eau est réalisée et traitée en même temps que les échantillons par RT-qPCR. La Figure 1 représente schématiquement la méthode de RT-qPCR et un exemple de gamme montrant la relation entre le nombre de copies présentes dans la réaction et le CT (cycle threshold ou seuil d'amplification) obtenu.
Les échantillons biologiques dans lesquels les siRNA sont quantifiés sont de différentes origines :
- Des ARN totaux extraits à partir de fragments de tissus de poids connu supposés contenir le siRNA. Ces ARN sont extraits par des méthodes conventionnelles telles que par la méthode au phénol-chloroforme (extraction au trizol). Après extraction, ils sont dilués dans de l'eau ;
- Du sérum. Dans ce cas, un volume connu de sérum est dilué dans de l'eau contenant un inhibiteur de RNAse au 1/1000 ou davantage dilué si la concentration de siRNA
est très élevée.
Les valeurs des CT obtenus pour chaque échantillon sont comparées à celles obtenues pour la gamme. Ceci permet de calculer le nombre de copies de siRNA présent dans l'échantillon dosé. Les valeurs sont alors rapportées d'abord à la quantité
d'ARN total réverse transcrit, puis au poids de tissu dont les ARN ont été extraits ou au volume de sérum, et les résultats finaux sont exprimés en moles/L (M) en considérant que la densité de tous les tissus est de 1g/cm3.
2. Lignées cellulaires Les lignées cellulaires utilisées dans les exemples sont des lignées cellulaires issues de tumeurs de prostate chez l'homme, résistantes à la castration et exprimant le récepteur des androgènes (lignées C4-2 et 22RV1), de tumeurs mammaires de souris (4T1), ou de glioblastome humain U87.
3. Greffe de cellules tumorales chez les souris Les tumeurs sont obtenues par injection sous cutanée de cellules tumorales dans le flanc de souris Nude (tumeurs 22RV1, C4-2) ou de souris BalB/C (tumeurs 4T1). Seuls les animaux sur lesquels la prise tumorale est constatée sont inclus dans l'étude et randomisés pour recevoir le traitement ou le traitement contrôle. Les injections de siRNA
en bolus sont effectuées à raison de 1 fois par jour, 5 jours par semaine. Dans d'autres expériences, les cellules U87 ont été implantées dans le parenchyme cérébral de souris Nude par injection stéréotaxique.
Tous les siRNA sont dilués dans de l'eau contenant 154m1M de NaCl ou dans le tampon indiqué. Lorsqu'elles sont utilisées, les pompes osmotiques (par exemple pompes Alzet) sont implantées en sous cutané sur le dos des souris, du côté opposé à la tumeur si la souris en porte une. Dans le cas des tumeurs U87 implantées en orthotopique, la pompe osmotique est implantée sous la peau et un cathéter placé à la sortie de la pompe est relié
à un dispositif fixé
sur la boite cranienne par un ciment et délivrant le composé dans le cerveau, à distance de la tumeur implantée précédemment.
Le volume des tumeurs sous cutanées est estimé en mesurant à l'aide d'un pied à coulisse le plus grand (D) et le plus petit (d) diamètre des tumeurs. Le volume est calculé par la formule V= Dxdxdx0.5.
En fin d'expérience, les animaux sont sacrifiés, le sérum, les tumeurs et différents tissus sont disséqués, les ARN extraits et les siRNA présents dans ces ARN sont quantifiés.
Tous les protocoles expérimentaux utilisés ont été validés par les comités d'éthique et autorités réglementaires françaises. Ils sont mis en oeuvre de façon à limiter le nombre d'animaux utilisés et à éviter toute souffrance inutile.
4. siRNA utilisés Les siRNA utilisés dans les exemples sont ceux du Tableau 1.
Dans certaines expériences un siRNA ne s'hybridant avec aucun ARNm connu (siRNA
Contrôle) a été utilisé. La séquence de ce siRNA est :
SEQ ID NO 55: 5'UAGCAAUGACGAAUGCGUA[dT][dT]
SEQ ID NO 56: 5'UACGCAUUCGUCAUUGCUA[dT][dT]
Un siRNA ciblant la luciférase, gène qui n'existe pas chez les mammifères, a également été utilisé. La séquence de ce siRNA est:
SEQ ID NO 57: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA[dT][dT]
SEQ ID NO 58: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAG[dT][dT]
5. Préparation des pompes osmotiques Les siRNA sont dilués en solution saline (eau pour injection additionnée de 154mM de NaCl) ou dans le tampon indiqué à la concentration nécessaire pour atteindre l'administration de la quantité désirée sur une période de 24h. Cette concentration est calculée en tenant compte du volume horaire délivré par la pompe, comme indiqué par le fabricant (Alzet). La pompe est remplie stérilement et implantée sous la peau des animaux traités (souris, rats, singes). Le cathéther placé en sortie de la pompe libère son contenu soit sous la peau, soit dans une autre localisation afin d'obtenir une administration intrathécale ou intracérébrale. Les pompes sont maintenues en place, de quelques jours et jusqu'à 4 semaines suivant le protocole indiqué.
Une étude préalable a montré que des solutions stériles de siRNA sont stables pendant au moins 4 semaines à 37 C.
Exemple 2 : Absence d'inhibition de la croissance tumorale par des siRNA
injectés par voie intraveineuse en bolus.
Des souris nude mâles de 9 semaines ont été xénogreffées en sous cutané sur le flanc avec des cellules 22RV1. Après constation de la prise tumorale et randomisation, les souris ont reçu une injection intraveineuse quotidienne de siRNA contrôle ou de siAR-1 à
la dose de 0.12 mg/kg pendant 13 jours. Le volume tumoral a été mesuré quotidiennement.
Les résultats sont présentés dans la Figure 2. On constate que l'injection IV du siAR-1 est sans effet sur la croissance des tumeurs.
Exemple 3 : Il n'est pas nécessaire que le siRNA cible un ARNm exprimé dans l'organisme pour qu'il se distribue. Un siRNA dirigé contre la luciferase de luciole siLuc, à la dose de 2mg/kg/jour, formulé dans une solution de NaCl 154mM a été administré
à des souris par voie sous cutanée continue pendant 3 jours à l'aide de pompes osmotiques implantées. La quantification du siRNA siLuc dans le serum et différents organes présentée dans la figure 3 montre qu'il s'y distribue efficacement de façon systémique alors même qu'il n'y a pas d'ARNm cible de ce siRNA dans ces tissus.
Exemple 4 : Identification de siRNA inhibant FoxP3 et se distribuant dans les tissus in vivo.
1. Inhibition de l'expression du facteur de transcription FoxP3 dans les cellules C4-2.
Des cellules C4-2 ont été transfectées par un siRNA contrôle ou par les siRNA
siFoxP3-1 ou siFoxP3-2. 48h après transfection, les cellules ont été lysées, les ARN
extraits et l'expression de FoxP3 mesurée par RT-qPCR. Les valeurs sont normalisées par l'expression de l'ARN codant pour la cyclophiline-A (méthode delta delta CT). Les résultats sont présentés dans la Figure 4 qui montre que les deux siRNA FoxP3-1 et FoxP3-2 inhibent l'expression de FoxP3.
2. Le siRNA siFoxP3-2 se distribue dans le sérum et différents organes et inhibe l'expression de FoxP3.
Des souris (4 par groupe) ont recu quotidiennement pendant 4 jours consécutifs par voie .. sous cutanée soit 0.12 mg/kg du siRNA siFoxP3-2 formulé dans du tampon citrate à pH 6 contenant 10mM de MgCl2, soit seulement ce tampon (groupe contrôle). La figure 5 montre que le siFoxP3-2 se distribue de façon systémique dans le sérum et dans différents organes et la Figure 6 montre que dans les testicules, le siFoxP3-2 inhibe fortement l'expression de l'ARNm codant FoxP3 par rapport au groupe contrôle.
Administré en absence d'agent de vectorisation, le siRNA siFoxP3-2 est donc capable de se distribuer in vivo de façon systémique et d'inhiber l'expression de son gène cible.
Exemple 5 : L'administration simultanée de 3 siRNAs permet leur distribution systémique dans le sérum et différents organes. Les siRNA siAR-1, siTSP1-1 et siLuc ont été
dilués dans un tampon citrate 10mM à pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Le mélange a été
administré par voie sous cutanée à des souris de telle sorte que les souris recoivent une dose de 0.12mg/kg de chacun des 3 siRNA. Les souris ont été sacrifiées 10 minutes après injection et chaque siRNA a été dosé séparément dans le sérum et différents tissus. On observe que les 3 siRNA sont présents dans le sérum et dans les différents organes testés (Figure 7).
L'administration d'un cocktail de plusieurs siRNAs permet donc leur distribution systémique simultanée dans différents tissus.
Exemple 6 : Administration d'un siRNA formulé en solution saline par voie sous cutanée continue. Dans cet exemple, les siRNAs sont formulés en solution saline (NaCl 154 mM).
1. La concentration sérique d'un siRNA administré de façon continue reste sensiblement constante.
Des pompes osmotiques délivrant une dose de siRNA siAR-1 de 0.05mg/kg/jour formulé
en solution de NaCl 154mM ont été implantées en sous cutané pendant 4 semaines chez des singes Cynomolgus. La concentration sérique du siRNA a été mesurée chaque semaine pendant toute la durée du traitement. On observe que la concentration sérique varie de moins de 20% par rapport à la première mesure (considérée comme ayant la valeur 1) (Figure 8).
Vingt-quatre heures avant implantation des pompes osmotiques, les animaux ont reçu une injection sous cutanée unique en bolus de 0.05 mg/kg de siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154 mM) et la concentration a été mesurée au cours du temps. Par comparaison avec l'administration systémique continue, l'injection par voie sous cutanée en bolus de la dose de 0.05 mg/kg aboutit à une élimination rapide (Figure 9) qui, si elle est répétée dans le temps, par exemple quotidiennement, aboutit à un effet de pics et de vallées qui est évité par l'administration continue.
2. L'administration par voie sous cutanée continue est plus efficace que la voie sous cutanée en bolus pour inhiber l'expression du gène cible du siRNA.
Des souris ont reçu une injection sous cutanée quotidienne pendant 4 jours du siRNA
siTSP1-1 à la dose de 0.12 mg/kg/jour, formulé en solution saline (NaCl 154mM), ou le même siRNA formulé dans la même solution mais administré de façon continue pendant 4 jours par une pompe osmotique, à la dose de 0.2 mg/kg/jour. On observe que le siRNA
siTSP1-1 se distribue dans plusieurs organes à des niveaux comparables après administration par voie sous cutanée de façon continue ou en bolus (Figure 10A).
L'administration du siTSP1-1 produit une meilleure inhibition dans les tissus de l'expression de l'ARNm de la TSP1, lorsque le siRNA est administré en continu que lorsqu'il est administré
en bolus (Figure 10B).
3. L'administration par voie sous cutanée continue est plus efficace que la voie sous cutanée en bolus pour inhiber la croissance tumorale Des cellules C4-2 ont été greffées chez des souris. Une fois la prise tumorale constatée, les souris ont été traitées par administration du siRNA siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154mM) à différentes doses ou par le véhicule. Le siRNA a été administré
par voie sous cutanée, soit de façon discontinue, par une injection quotidienne, soit de façon continue, par implantation d'une pompe osmotique pendant 1 mois. On observe que la croissance de tumeurs C4-2 chez des souris n'est pas inhibée par l'administration par voie sous cutanée en bolus du siRNA siAR-1 à la dose de 0.12 mg/kg/jour ou même de 1 mg/kg/jour répétée quotidiennement (Figure 11A), alors qu'elle est inhibée lorsque le même siRNA
est administré par voie sous cutanée de façon continue par implantation d'une pompe osmotique, délivrant la dose de 0.2 mg/kg/jour. L'inhibition n'est pas améliorée en augmentant la dose administrée d'un facteur 10 (2 mg/kg/jour) (Figure 11B). L'administration systémique d'un même siRNA est donc plus efficace pour inhiber la croissance tumorale lorsque ce siRNA est administré de façon continue que de façon discontinue.
4. Inhibition de metastases osseuses d'une tumeur Des cellules 22RV1 ont été implantées chez des souris Nude. Une fois la prise tumorale constatée, des pompes Alzet administrant 0.2 mg/kg/jour du siRNA siAR-1 fomulé
dans une solution saline (NaC1154mM), ou le véhicule seul ont été implantées pendant 3 semaines. En fin de traitement, les os (tibia) ont été récupérés pour y quantifier le siAR-1, et les ARNm d'origine humaine codant pour le récepteur des androgènes et l'HPRT.
L'administration du siRNA siAR-1 par voie sous cutanée continue à des souris porteuses de tumeurs prostatiques humaines 22RV1 permet d'inhiber l'expression du récepteur des androgènes dans les os des souris (Figure 12 panneau de gauche). Cette inhibition s'accompagne d'une diminution du nombre de souris développant spontanément des métastases osseuses de ces tumeurs et d'une diminution de la taille de ces tumeurs, évaluée par le niveau d'expression d'un ARNm humain (HRPT) dans les os (Figure 12 panneau de droite).
L'administration systémique continue d'un siRNA permet donc de le délivrer dans les métastases d'un cancer se développant dans l'os, d'inhiber l'expression du gène cible du siRNA dans l'os et de limiter l'implantation et/ou le développement des métastases.
5. Inhibition de l'expression du récepteur des androgènes dans la prostate de souris et de rats Des pompes osmotiques délivrant le siRNA siAR-1 formulé en solution saline (NaCl 154m1IV1) ont été implantées en sous cutané chez souris pendant 1 mois ou chez des rats pendant 2 semaines. Cette administration, à des souris à une dose supérieure ou égale à 0.2 mg/kg (Figure 13) ou à des rats à une dose supérieure ou égale à 0.1 mg/kg (Figure 14) inhibe efficacement l'expression protéique du récepteur des androgènes dans la prostate de ces animaux.
6. Distribution d'un siRNA dans les tissus chez le singe Des singes mâles adultes ont reçu pendant 4 semaines une injection sous-cutanée continue de siAR-1 formulé en solution saline (NaC1154mM) à la dose de 5 mg/kg/jour, à
l'aide d'une pompe osmotique. Les animaux ont été sacrifiés et siAR-1 quantifié dans différents organes.
Les résultats sont présentés à la Figure 15. Il est constaté que le siRNA siAR-1 se distribue efficacement de façon systémique dans les différents organes analysés.
7. Inhibition de la production de PSA chez des singes L'antigène Spécifique de la Prostate ou PSA est détecté dans le sérum de singes mâles matures, même en l'absence de pathologie prostatique. L'administration par voie sous cutanée continue du siRNA siAR-1 pendant 4 semaines à la dose de 5mg/kg/jour conduit à
une diminution de l'expression du PSA dans le sérum des animaux, sous le seuil de détection du test ELISA utilisé pour le dosage (Figure 16). L'administration par voie sous cutanée continue d'un siRNA chez les singes permet donc de le distribuer de façon systémique dans de nombreux organes où il exerce son effet inhibiteur de l'expression génique.
Exemple 7 : Inhibition de l'expression de la TSP1 dans un glioblastome par administration intracérébrale continue de siRNA formulés en solution saline (NaC1154mM).
Des souris nude femelles ont été greffées en orthotopique avec des cellules de glioblastome U87. Les animaux ont été implantés avec une pompe osmotique placée en sous cutané dans le dos, la sortie de la pompe étant reliée à un cathéther délivrant dans le cerveau, à distance de la tumeur, un siRNA contrôle ou le siRNA siTSP1-1 contenu dans la pompe, à
raison de 2mg/kg de poids de cerveau/jour. Après 8 jours, les souris ont été
sacrifiées, et l'expression de la TSP1 détectée par immunofluorescence sur coupes des cerveaux. Les résultats sont présentés dans la Figure 17.
On observe une forte diminution de l'expression de la TSP1 chez les animaux traités par rapport aux contrôles. La TSP1 est une protéine qui inhibe la formation des vaisseaux sanguins (angiogenèse). On observe chez les animaux traités une augmentation de la densité
des vaisseaux sanguins détectés sur une coupe adjacente par immunomarquage de l'antigène CD31.
L'administration intracérébrale continue d'un siRNA permet donc d'inhiber efficacement l'expression du gène cible du siRNA dans une tumeur se développant dans cet organe et d'y produire les effets biologiques attendus.
Exemple 8: Un tampon acide évite la dégradation d'un siRNA en présence de cations.
1.
Un siRNA est dégradé en présence de ZnCl2 dans une solution aqueuse dont le pH a été ajusté à 6. Un tampon citrate à pH 6 préserve le siRNA.
La dégradation du siRNA siTSP1-1 a été mesurée après formulation de ce siRNA
dans différentes conditions. L'intégrité du siRNA siTSP1-1, a été vérifiée par dépôt sur un gel d'acrylamide d'une quantité équivalente à 300 ng de siRNA à partir d'une solution de siRNA
ayant subi les traitements suivants :
- mélange (1:1, poids:poids) de siTSP1-1 et d'hexaréline ;
- mélange (1:1 ou 1:10, poids:poids dans de l'eau) de siTSP1-1 et de LDL
oxydés ;
incubation 4h à 37 C.
- incubation 1 heure à température ambiante de siTSP1-1 dans une solution aqueuse de 0.164 mM de ZnC12 - incubation 10 minutes, lheure ou 6heures à 37 C de siTSP1-1 dans une solution de 1 mM de ZnC12 dans un tampon 10mM Citrate à pH 6.
On constate sur la Figure 18 que le siRNA est dégradé lorsqu'il est incubé
dans une solution aqueuse de ZnC12. Cette dégradation ne se produit pas dans un tampon citrate à pH 6 contenant jusqu'à 6 fois plus de ZnC12. Aucune dégradation du siRNA n'est constatée lorsqu'il est mélangé dans de l'eau avec des LDL oxydés ou de l'hexareline.
La présence d'un tampon à pH acide permet donc de maintenir l'intégrité d'un siRNA en présence de cations.
2. La formulation d'un siRNA dans une solution aqueuse contenant du ZnCl2 réduit sa concentration dans le sérum et sa distribution dans les tissus.
Le siRNA siTSP1-1 formulé soit dans du NaCl 154m1IVl, soit dans de l'eau contenant 0.165 mM de ZnC12 et administré par voie sous cutané à des souris à la dose de 0.12 mg/kg.
La concentration du siRNA mesurée dans le sérum et les tissus est réduite lorsque le siRNA
est formulé dans une solution aqueuse contenant des cations par rapport aux résultats obtenus lorsque le même siRNA est administré à la même dose et de la même façon mais formulé en solution saline (154 mM NaCl) (Figure 19).
Exemple 9 : Formulations améliorant la biodistribution d'un siRNA in vivo 1. La concentration dans le sérum et les tissus d'un siRNA administré de façon systémique est augmentée lorsqu'il est formulé dans un tampon citrate et plus encore dans un tampon citrate contenant différents cations.
Le siRNA siAR-1 à la dose de 0.12 mg/kg, formulé dans différentes solutions a été
administré par voie sous cutanée à des souris. La concentration de siAR-1 mesurée dans le sérum ou organes de ces différents groupes de souris a été mesurée 20 minutes après injection et comparée à celle du groupe contrôle, consitué d'animaux ayant reçu le siRNA
dilué dans une solution aqueuse contenant 154 mM de NaCl (noté NaCl).
En comparaison avec une formulation dans une solution saline (NaCl 154 mM), la formulation du siRNA siAR-1 dans un tampon Citrate 10mM pH 6 augmente la concentration de ce siRNA dans le sérum (Figure 20A). Cette concentration est encore augmentée dans le sérum et les tissus lorsque le tampon citrate 10mM pH 6 est additionné de ZnC12, MnC12, MgCl2, ou d'une combinaison de ces sels (Figure 20B).
2. Dans le sérum les tissus et tumeur, la concentration d'un siRNA
administré de façon systémique et continue est augmentée lorsqu'il est formulé dans un tampon citrate contenant des cations.
Un mélange de 3 siRNA, siAR-1, siTSP1-1 et siLuc, a été administré par voie sous cutanée continue pendant 3 jours à des souris porteuses de tumeurs mammaires murines 4T1 à
l'aide d'une pompe osmotique implantée en sous cutané. Chaque siRNA a été
administré à la dose de 2mg/kg/jour. Le mélange a été formulé soit dans une solution de NaCl 154mM soit dans un tampon Citrate 10mM pH 6 contenant 10mM de MgCl2. Après 3 jours, la concentration de chaque siRNA dans le sérum, les tumeurs et différents organes a été mesurée et les valeurs mesurées lorsque le siRNA avait été formulé en tampon citrate-MgCl2 a été
rapporté aux valeurs mesurées avec administration du siRNA formulé en solution saline (NaCl 154mM) dans le même tissu. Les résultats reportés dans les figures 21A
et 21B
montrent que la formulation des siRNA dans le tampon citrate-MgCl2 augmente d'un facteur allant jusqu'à plus de 250 leur distribution systémique dans les tissus par rapport à leur formulation en solution saline.
Exemple 10: Ciblage d'un siRNA par ajout d'un ligand de CD36 Des souris ont reçu une injection sous cutanée de siAR-1 à la dose de 0.12mg/kg formulé
soit en solution saline (NaCl 154mM) soit en tampon citrate 10mM pH 6 contenant de l'hexaréline, (rapport siRNA:Hexaréline ; poids/poids; 1:0,2), soit en tampon citrate 10mM
pH6 contenant des LDL oxydés (rapport siRNA:LDL oxydés ; poids:poids ; 1:1).
La concentration de siAR-1 a été mesurée et rapportée à la concentration mesurée lorsque le siRNA était formulé en solution saline (NaCl 154m1IV1) dans le même tissu. Les résultats observés dans le sérum sont reportés dans la figure 22A, dans la prostate et la rate dans la figure 22B. Ils montrent que l'ajout d'hexaréline ou de LDL oxydés augmentent la concentration du siRNA dans le sérum ou les tissus.
Dans une autre expérience, des pompes osmotiques ont été implantées chez des souris porteuses de tumeurs 22RV1, les pompes délivrant pendant 3 jours de façon continue 2mg/kg/jour de siAR-1 formulé en solution saline (NaC1154mM), ou 2mg/kg/jour de siAR-1 et 0.2 mg/kg/jour de LDL oxydés formulés en tampon citrate 10mM pH 6. Dans ce dernier cas, le siRNA et les LDL oxydés ont été simplement mélangés dans le tampon citrate, sans manipulation additionnelle. Les concentrations du siAR-1 formulé en tampon citrate contenant des LDL oxydés mesurées dans le sérum, les tissus ou les tumeurs ont été rapportée à la valeur mesurée dans le même tissu lorsque le siRNA était formulé en solution saline (NaCl 154mM). On constate sur la figure 23 que la présence de LDL oxydés augmente la concentration du siAR-1 dans le sérum les tissus et les tumeurs.
Claims (17)
1. Composition comprenant au moins un siRNA, ledit siRNA s'hybridant avec un ARNm, codant ou non codant, dont il induit la dégradation ou dont il inhibe la traduction, l'expression dudit ARNm ou de la protéine pour laquelle il code étant impliquée dans une pathologie, la composition étant utilisée pour la prévention et/ou le traitement de ladite pathologie, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue.
2. Composition pour son utilisation selon la revendication 1, ladite composition étant formulée pour un mode d'administration systémique continue dans laquelle ledit au moins siRNA est dans une solution tampon à pH acide, notamment dans un tampon citrate ou histidine.
3. Composition pour son utilisation selon la revendication 2, dans laquelle ledit au moins siRNA est dans une solution tampon à pH acide, additionnée de sels minéraux ou organiques, notamment de sel dont le cation est choisi parmi les polyamines, notamment choisi parmi la spermine, la spermidine ou la putrescine ou notamment de sel dont le cation est choisi parmi les cations métalliques, notamment choisi parmi les sels de zinc, cobalt, cuivre, manganèse, calcium, magnésium ou de fer, en particulier de manganèse, zinc, magnésium, seuls ou en combinaison deux à deux ou trois à trois
4. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ladite composition contenant ou ne contenant pas d'agent d'adressage, de préférence contenant un agent d'adressage non couplé de façon covalente au siRNA
5. Composition pour son utilisation selon la revendication 4, ladite molécule d'adressage étant un ligand du récepteur CD36, ledit ligand au récepteur CD36 étant de préférence des LDL
oxydés, de l'hexaréline, un acide gras à longue chaîne, ou un mélange de ces composant deux à deux ou trois à trois, lesdits LDL oxydés étant dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et préférentiellement de 0.1 à 1, ou ladite hexaréline étant dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 hexaréline, préférentiellement de 0.1 à 1.
oxydés, de l'hexaréline, un acide gras à longue chaîne, ou un mélange de ces composant deux à deux ou trois à trois, lesdits LDL oxydés étant dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 LDL oxydés et préférentiellement de 0.1 à 1, ou ladite hexaréline étant dans un rapport poids:poids de 1 siRNA pour 0.01 à 10 hexaréline, préférentiellement de 0.1 à 1.
6. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit au moins un siRNA est dans une solution contenant un agent de vectorisation
7. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ledit au siRNA est dans une solution ne contenant pas d'agent de vectorisation
8. Dispositif fournissant un moyen d'administration systémique et continue d'une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit moyen d'administration systémique et continue étant notamment une pompe osmotique, une pompe-seringue, une pompe élastomérique, une pompe péristaltique, une pompe intelligente , une pompe patch , ou une matrice polymérique ou un hydrogel, ou tout autre composé
biodégradable visant à libérer de façon lente et continue le siRNA de telle sorte qu'il soit distribué de façon systémique dans l'organisme.
biodégradable visant à libérer de façon lente et continue le siRNA de telle sorte qu'il soit distribué de façon systémique dans l'organisme.
9. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite pathologie est associée à l'expression de l'ARNm codant le récepteur des androgènes, la Thrombospondine-1 (TSP1), le facteur de transcription FoxP3 ou le Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF).
10. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit au moins un siRNA est l'un des siRNA suivants : siAR-1, siAR- 1b, siAR-2, siAR-2b, siAR-3, siAR-3b, siAR-4, siAR4b, siAR-5, siAR-5b, siVEGF-1, siVEGF-1b, siTSP1-1, siTSP1-1b, siTSP1-2, siTSP1-2b, siTSP1-3, siTSP1-3b, siTSP1-4, siTSP1-4b, siTSP1-5, siTSP1-5b, siFoxP3-1, siFoxP3-1b, siFoxP3-2, siFoxP3-2b, de SEQ ID
NO 1 à 52.
NO 1 à 52.
11. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle ledit siRNA est l'un des siRNA suivants: siFoxP3-1, siFoxP3-1b, siFoxP3-2 ou siFoxP3-2b, de SEQ ID NO 45 à 52, pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à
l'expression du facteur de transcription FoxP3 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
l'expression du facteur de transcription FoxP3 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
12. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle ledit siRNA est le siAR-1, de SEQ ID NO 1 et 2, pour son utilisation comme médicament ou pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie associée à l'expression du récepteur des androgènes, notamment pour la prévention et/ou le traitement du cancer de la prostate, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
13. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit au moins un siRNA est dépourvu de modifications chimiques ou présente des modifications chimiques
14. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit siRNA est utilisé en association avec au moins un agent anti-angiogénique ou un agent anti-tumoral ou un agent immunothérapeutique ou avec une combinaison de ces différentes classes d'agents.
15. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lesquelles ledit mode d'administration systémique est choisi parmi le groupe comprenant ou étant constitué du mode d'administration sous-cutané, intrapéritonéal, intraveineux, intra artériel, intracardiaque, intramusculaire, intradermique, intranasal, intravaginal, intrarectal, sublingual, oral, intrathécal, intra rachidien, épidural, respiratoire, cutanée, transdermique, transmuqueux
16. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite composition est formulée pour un mode d'administration à
une dose thérapeutiquement efficace, et notamment de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment de 0,01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour et plus particulièrement de 0.01 mg/kg/jour à
2 mg/kg/jour.
une dose thérapeutiquement efficace, et notamment de 0.005 mg/kg/jour à 30 mg/kg/jour, notamment de 0,01 mg/kg/jour à 10 mg/kg/jour et plus particulièrement de 0.01 mg/kg/jour à
2 mg/kg/jour.
17. Composition pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite pathologie est une tumeur primaire, une tumeur métastatique, ou une pathologie associée à la présence de cellules suppressives ou immunosuppressives, et est notamment un cancer de l'anus, de l'appendice, de la bouche, des bronches et/ou des voies aériennes supérieures, du canal biliaire, de la cavité nasale et paranasale, du cerveau, du coeur, du col de l'utérus, du colon, du corps de l'utérus, de l'estomac, du foie, des glandes salivaires, de la gorge, de la langue, des lèvres, du nasopharynx, de l'oesophage, des os, de l'ovaire, du pancréas, de la parathyroïde, du pénis, de la plèvre, du poumon, de la prostate androgéno-indépendant, du rectum, du rein, du sein, des surrénales, des testicules, de la tête et du cou, du thymus, de la thyroïde, de l'urètre, du vagin, de la vésicule biliaire, de la vessie, de la vulve, un cancer gastro-intestinal, un lymphome, un mélanome ou un cancer de la peau hors mélanome, un myélome, un sarcome, une leucémie, un mésotheliome, un cholangiocarcinome, un ostéosarcome, un glioblastome, un astrocytome, un oligodendrogliome, un chondrosarcome, un liposarcome, un rhabdomyosarcome, ou un pheochromocytome, ou les métastases de ces cancers se développant dans d'autres organes, et est notamment le cancer de la prostate.
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Effective date: 20231107 |