JP2024515107A - 抗腫瘍免疫療法としての免疫機能担体、使用方法及び組成物 - Google Patents

抗腫瘍免疫療法としての免疫機能担体、使用方法及び組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2024515107A
JP2024515107A JP2023564458A JP2023564458A JP2024515107A JP 2024515107 A JP2024515107 A JP 2024515107A JP 2023564458 A JP2023564458 A JP 2023564458A JP 2023564458 A JP2023564458 A JP 2023564458A JP 2024515107 A JP2024515107 A JP 2024515107A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ptx
tumor
sipd
cells
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023564458A
Other languages
English (en)
Inventor
ユン・ヨー
ジアンピン・ワン
ファンフェイ・メン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Purdue Research Foundation
Original Assignee
Purdue Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Purdue Research Foundation filed Critical Purdue Research Foundation
Publication of JP2024515107A publication Critical patent/JP2024515107A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本開示は、概して、がん治療のための組成物及び方法に関する。特に、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体、化学療法薬、及びマイクロRNA、メッセンジャーRNA、プラスミドDNA、siRNA、オリゴヌクレオチド又は環状ジヌクレオチド等の任意選択の成分を含む、抗腫瘍免疫療法としての組成物。がんの緩和を必要とする対象にポリエチレンイミン誘導体と、抗腫瘍剤とを含む治療有効量の組成物を投与することによって前記がんを有する対象を治療する方法も本開示の範囲内である。

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、2021年4月20日に出願された米国仮出願第63/177,150号に関連し、その優先権の利益を主張し、その内容はその全体が参照により本開示に組み込まれる。
政府支援条項
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたCA232419及びCA258737の下で政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列表の記述
配列表のコンピューター可読形式(CRF)は、本出願と同時に提出される。2kbのサイズを有する、69447-02_Seq_Listing_ST25_txtというタイトルのファイルは、2022年3月30日に作成されている。出願人は、コンピューター可読形式の内容は同じであり、コンピューター可読形式に記録された情報は記載されている配列表と同一であることを述べる。
技術分野
本開示は、概して、がん治療のための組成物及び方法に関する。特に、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体、化学療法薬、及びマイクロRNA、siRNA、又はオリゴヌクレオチド、核酸、又は環状ジヌクレオチドの任意選択の成分を含む、抗腫瘍免疫療法としての組成物。
背景及び要旨
この節は、本開示のより良い理解を促すのに役立ち得る態様を紹介する。したがって、これらの記述はこの観点から読まれるべきであり、何が先行技術であるか又は先行技術でないかについての承認として理解されるべきではない。
免疫チェックポイント阻害剤(ICB)1及びキメラ抗原受容体T細胞療法２の成功以来、過去数年で数十を超える免疫療法が承認され、現在数千の免疫療法薬が開発パイプラインにある３。しかしながら、免疫療法は、特定された腫瘍抗原及び/又はアクセスしやすい腫瘍を有するがん患者のごく一部にしか利益をもたらさない4。新たな治療戦略が、到達困難な未特定の腫瘍を有する、より広範な患者集団における免疫療法薬の有効性を改善するために必要とされる。
免疫腫瘍学のコミュニティにおいて関心を集めているアプローチは、位置を特定でき、アクセス可能な腫瘍を局所的に治療し、離れた腫瘍に対して全身的な効果を発揮するようにin situで抗腫瘍免疫を刺激することである5、6。局所免疫療法の理論的根拠は、適切に治療された腫瘍細胞が腫瘍抗原の貯蔵所として機能し、循環免疫細胞を介して腫瘍に対して全身免疫応答を誘導することである6。治療薬を腫瘍内に制限することによって、局所免疫療法は、従来のアプローチの有用性を限定していた免疫関連有害事象等の全身性副作用を回避できる7。この前提に基づいて、局所免疫療法の試験の数は過去10年で指数関数的に増加し、40を超える初期段階の臨床試験が進行中である8。
効果的な局所免疫療法に関して、腫瘍関連抗原(TAA)のin-situ生成、抗原提示細胞(APC)の活性化、腫瘍微小環境(TME)への免疫細胞の浸潤及び免疫活性TMEの維持を含む、いくつかの事象を一貫して調整する必要がある。抗腫瘍免疫応答の複雑性により、異なる作用機序を有する薬剤の組合せが要求される。例えば、化学療法薬は、免疫原性細胞死（ICD）を誘導してTAAを生成し、ダメージ関連分子パターン（DAMP）を放出するために使用され9、10、これにより、死にかけている細胞がAPCの取り込みに対して脆弱になる9。核酸及びヌクレオチドはそれらの多様な機能のために頻繁に利用される:小さなヌクレオチドは強力な免疫アジュバントとして機能することができ11、siRNAは免疫チェックポイントを遮断するために使用することができ12、マイクロRNAは炎症性サイトカイン産生を調節することができる13。
がん治療における複数の免疫療法薬の局所送達に関して、担体の選択が少なくとも3つの態様において重要である。第1に、担体は腫瘍における治療剤の薬理効果を最大化するために免疫療法を局所的に保持し、全身性副作用を阻止するのに役立ち得る14。第2に、担体は複数の薬剤の共局在化を確保できる15。例えば、ICDを誘導するパクリタキセル（PTX）9及び免疫チェックポイントを標的とするsiRNAを、機能を補完するために組み合わせることができる。適切に設計された担体は、物理化学的特徴をほとんど共有せず、別様で共局在化することが困難である2つの薬剤を同時に送達することができる。第3に、免疫アジュバント機能により操作された担体は、治療薬の免疫刺激効果と相乗作用する、抗腫瘍免疫の誘発に能動的な役割を果たすことができる16、17。それにもかかわらず、複数の薬物の免疫活性な局所担体を開発することは簡単ではなく、この目標を達成するための以前の取り組みは、成分の少なくとも1つの予備製剤化18又はプロドラッグ形成に依存しており19、これは個々の薬物に合わせて調整する必要がある。
ここで、本発明者らは、免疫細胞を活性化し、疎水性免疫原性細胞死誘導剤及び免疫調節性核酸/ヌクレオチドを同時送達するポリエチレンイミン誘導体(2E')を開発する。2E'、又はパクリタキセル及びPD-L1 siRNA若しくは環状ジヌクレオチドとのその組合せの単回局所投与は、強力な抗腫瘍免疫を誘導し、その結果として、異なるモデルにおいて、大きな確立された腫瘍の即時退縮、無腫瘍生存、並びに再チャレンジ及び転移に対する耐性がもたらされる。この研究は、抗腫瘍免疫の効果的なin-situ誘導が遠隔及び再発疾患からの全身防御につながる可能性があり、2E'が免疫療法の単純で汎用性の高い担体として複数の役割を果たすことを裏付ける。
Zhang, P.ら、J. Integr. Bioinform. 2019 Sep;16(3):20190027
本発明の上記及び他の目的、特徴及び利点は、以下の説明及び図面と併せて考慮するとより明らかになり、図面に共通する同一の特徴を示すために可能な場合には同一の参照番号が使用されている。
図１。図１Ａ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。LCA-PEIコンジュゲート(2E')の構造。 図１Ｂ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。水中で構築された2E'のTEM画像。スケールバー:100nm。 図１Ｃ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。BMDC、CT26及びB16F10細胞における2E'のin vitro細胞傷害性。(代表的なバッチのn=3又は6の反復、平均±標準偏差、SD)。 図１Ｄ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。PEI及び2E'(7μg/mL)との24時間のインキュベーション後のJAWSII DC上の成熟マーカーの発現。(代表的なバッチのn=3の反復、平均±SD)。 図１Ｅ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。2E'及びPEIとの24時間のインキュベーション後のBMDCによるTNF-α及びIL-1β分泌（代表的なバッチのn=3又は4の反復、平均±SD）。 図１Ｆ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。分泌された胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)の産生によって示される2E'及びPEIによるTLR-5レポーター細胞活性化（代表的なバッチのn=3又は4の反復、平均±SD）。 図１Ｇ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。CT26及びB16F10細胞に対する2E'及びPEI誘発CRT曝露(代表的なバッチのn=3の反復、平均±SD)。 図１Ｈ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。食作アッセイのスケジュール。 図１Ｉ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。7μg/mLの2E'なし（-）又はあり（+）のBMDCによるCT26細胞の食作のフローサイトメトリー分析。%CT26+ BMDC:CT26細胞を取り込んだBMDCの割合;貪食されたCT26の%:BMDCによって取り込まれたCT26細胞の割合(代表的なバッチのn=4又は5の反復、平均±SD)。2つの割合の計算のため。 図１Ｊ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示すの図である。7μg/mLの2E’なし（-）又はあり（+）でBMDCとインキュベートしたCT26細胞の代表的な共焦点画像（左）、並びにCT26細胞及びBMDCの共局在化を示す、計算されたピアソン相関係数（右）。CT26細胞はCellTracker Green(緑)で染色し、BMDC細胞はCellTracker DeepRed(赤)で染色した。スケールバー:50μm。矢印の先端はCT26細胞及びBMDCの共局在化を示す。5つの画像を2つの複製ウェルから撮影した。 図１Ｋ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。異なる質量比を有する2E'/PTXのTEM画像。スケールバー:200nm。 図１Ｌ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。0.2%のTween-80を含む水溶液中の2E'/PTXからのPTX放出プロファイル(代表的なバッチのn=3の反復、平均±SD)。 図１Ｍ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。上側:2E'のsiPD-L1に対する様々な質量比での2E'/siPD-L1複合体のゲル電気泳動。全てのレーンは、1μgのsiRNAに相当する複合体を含む。下側:2.66μg/mLのsiPD-L1に相当する用量での2E'/Cy3で標識したsiPDL-1(1.5:1、w/w)との4時間のインキュベーション後のCT26細胞の共焦点画像(青:核、緑:リソソーム、赤:siPD-L1)、スケールバー:10μm。 図１Ｎ。2E'の特性評価及び免疫刺激活性を示す図である。上側:PD-L1サイレンシングアッセイのスケジュール。下側:2E'/siNeg又は2E'/siPD-L1(4μg/mLの2E'及び2.66μg/mLのsiPD-L1)による処理後のIFN-γ活性化B16F10及びCT26細胞におけるPD-L1発現のウェスタンブロット(n=3の独立した試験、平均±SD)。p値は、通常の一元配置分散分析(d)後のテューキーの多重比較検定、二元配置分散分析(e、f、g)又は一元配置分散分析(n)後のシダックの多重比較検定、及び対応のない両側t検定(i、j、n)によって計算した。 図１の続き。 図１の続き。 図２。図２Ａ。2E'/PTX/siPD-L1の特性評価を示す図である。2E'/PTXのsiPD-L1に対する様々な質量比での2E'/PTX/siPD-L1複合体のゲル電気泳動。全てのレーンは1μgのsiPD-L1に相当する複合体を含む。 図２Ｂ。2E'/PTX/siPD-L1の特性評価を示す図である。2E’/PTX/siPD-L1のTEM画像。スケールバー:200nm。 図２Ｃ。2E'/PTX/siPD-L1の特性評価を示す図である。CT26細胞、BMDC及び脾細胞に対する2E'、PTX、2E'/PTX及び2E'/PTX/siPD-L1の細胞傷害性。代表的なバッチのn=4～6の反復、平均±SD。p値は、二元配置分散分析後のシダックの多重比較検定によって計算した。CT26腫瘍に対する2E'/PTX/siPD-L1の抗腫瘍効果。 図２Ｄ。2E'/PTX/siPD-L1の特性評価を示す図である。Balb/cマウスにおけるCT26腫瘍接種、処置注射及び再チャレンジのスケジュール。 図２Ｅ。2E'/PTX/siPD-L1の特性評価を示す図である。腫瘍内(IT)注射により、1mgの2E'、0.2mg/mLのPTX及び0.67mgのsiRNAからなる2E'、2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg又は2E'/PTX/siPD-L1で処置した腫瘍の個々の成長曲線(群当たりn=8)。 図２Ｆ。2E'/PTX/siPD-L1の特性評価を示す図である。単回腫瘍内注射後の無腫瘍マウスにおける1回目の再チャレンジ腫瘍の個々の成長曲線。 図２Ｇ。2E'/PTX/siPD-L1の特性評価を示す図である。1回目の腫瘍チャレンジに抵抗した無腫瘍マウスにおける2回目の再チャレンジ腫瘍の個々の成長曲線。CR:完全退縮。 図２の続き。 図２の続き。 図３。図３Ａ。B16F10腫瘍の成長及び免疫表現型に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果を示す図である。C57BL/6マウスにおけるB16F10腫瘍接種及び処置注射のスケジュール。 図３Ｂ。B16F10腫瘍の成長及び免疫表現型に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果を示す図である。腫瘍内(IT)注射による1mgの2E'、0.2mgのPTX及び0.67mgのsiRNAからなるD5W(n=4)、2E'(n=5)、2E'/PTX(n=5)、2E'/PTX/siNeg(n=4)又は2E'/PTX/siPD-L1(n=5)で処置した腫瘍の個々の成長曲線並びに処置後の体重変化。 図３Ｃ。B16F10腫瘍の成長及び免疫表現型に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果を示す図である。処置後7日目のTMEにおける免疫細胞(CD11c+DC、CD11c+CD40+、CD11c+CD86+成熟DC、F4/80+マクロファージ、CD80+M1様マクロファージ、CD206+M2様マクロファージ、Ly6C+単球及びLy6G+好中球MDSC及びT細胞)集団。 図３Ｄ。B16F10腫瘍の成長及び免疫表現型に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果を示す図である。TMEにおける腫瘍細胞(CD45-細胞)、リンパ球(CD45+細胞)、マクロファージ(CD45+F4/80+)及びMDSC(CD11b+Ly6C+又はCD11b+Ly6G+)上でのPD-L1発現。 図３Ｅ。B16F10腫瘍の成長及び免疫表現型に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果を示す図である。5μg/mLの黒色腫特異抗原Trp2ペプチド(SVYDFFVWL、配列番号5)の刺激なし(-)又はあり(+)のD5W(n=3)、2E'/PTX/siNeg(n=4)又は2E'/PTX/siNeg(n=4)で処置したC57BL/6マウスにおけるB16F10の脾細胞からのIFN-γ分泌。各対は個々のマウスを示す。 図３Ｆ。B16F10腫瘍の成長及び免疫表現型に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果を示す図である。脾臓CD3+細胞におけるTrp2(SVYDFFVWL、配列番号5)特異的CD8+T細胞の頻度。処置後7日目に脾臓を採取した(e、f)。p値は、一元配置分散分析(c、d)後のダネットの多重比較検定、二元配置分散分析(e)後のシダックの多重比較検定及び一元配置分散分析(f)後のテューキーの多重比較検定によって計算した。データ:平均±SD。 図３の続き。 図３の続き。 CT57BL/6腫瘍でのB16F10モデルにおける全身性抗腫瘍効果(a)及び免疫記憶に対する2E’/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果(b/c)のを示す図である。C57BL/6マウスにおける両側B16F10腫瘍接種及び処置注射のスケジュール;D5W(n=6)、2E'/siPD-L1+PTX NC(n=8)、2E'/PTX/siNeg(n=9)又は2E'/PTX/siPD-L1(n=9)の単回処置後の処置した及び未処置の腫瘍の処置後11日目の腫瘍成長曲線及び腫瘍サイズ;平均±SD。p値は、一元配置分散分析後のダネットの多重比較検定によって計算した。2E'/PTX/siPD-L1で処置したマウスの一部は、小さい腫瘍サイズにもかかわらず、腫瘍潰瘍形成により安楽死させたことに留意されたい。 CT57BL/6腫瘍でのB16F10モデルにおける全身性抗腫瘍効果(a)及び免疫記憶に対する2E’/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果(b/c) を示す図である。C57BL/6マウスにおけるB16F10腫瘍接種、処置注射及び再チャレンジのスケジュール;D5W(n=4)及び2E’/PTX/siPD-L1(n=11)で処置した腫瘍の個々の成長曲線;生存曲線（p値:ログランク(マンテル-コックス)検定による対D5W）;並びに処置後の体重変化。CR:完全退縮。 CT57BL/6腫瘍でのB16F10モデルにおける全身性抗腫瘍効果(a)及び免疫記憶に対する2E’/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射の効果(b/c) を示す図である。週齢を一致させたナイーブマウスにおける腫瘍の個々の成長曲線;ナイーブ及び腫瘍再チャレンジマウスの生存曲線（p値:ログランク(マンテル-コックス)検定による対ナイーブ)。処置は、1mgの2E'、0.2mgのPTX及び0.67mgのsiPD-L1(又はsiNeg)を含んだ。 4T1腫瘍の成長及び転移に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回投与の効果を示す図である。Balb/cマウスにおける4T1腫瘍接種、処置注射及び再チャレンジのスケジュール;D5W(n=5)、外科的切除(n=5)、2E'/PTX/siNeg(n=9)又は2E'/PTX/siPD-L1(n=8)による処置後の4T1腫瘍担持Balb/cマウスの生物発光イメージング。複合体は、1mgの2E'、0.2mgのPTX及び0.67mgのsiRNAからなった。赤い矢印の先端は肺転移を示す。黄色の円内のシグナルは、隣接するマウスの強いシグナルの反映である。 4T1腫瘍の成長及び転移に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回投与の効果を示す図である。異なる処置に応答する4T1腫瘍の個々の成長曲線;処置後19日目の腫瘍のサイズ(平均±SD;クラスカル・ウォリス分散分析後のダンの多重比較検定によるp値);生存曲線（p値:ログランク（マンテル-コックス）検定による対D5W);及び処置後の体重変化。CR:完全退縮。 4T1腫瘍の成長及び転移に対する2E'/PTX/siPD-L1の単回投与の効果を示す図である。生4T1細胞の再チャレンジ後の週齢を一致させたナイーブマウス及び2E'/PTX/siPD-L1処置した無腫瘍マウスの生物発光イメージング;(再)チャレンジ後の無腫瘍マウスのパーセンテージ(p値:ログランク（マンテル-コックス）検定による対ナイーブ);生4T1細胞による再チャレンジ後47日目の肺の代表的な画像。 CT26腫瘍の成長及び抗腫瘍免疫の発達に対する2E'/PTX/CDNの単回腫瘍内注射の効果を示す図である。Balb/cマウスにおけるCT26腫瘍接種、処置注射及び再チャレンジのスケジュール;D5W(n=5)、PTX NC+CDN(n=8)、2E’/PTX(n=7)及び2E’/PTX/CDN(n=7)で処置した腫瘍の個々の成長曲線;生存曲線（p値:ログランク（マンテル-コックス）検定による対D5W);並びに処置後の体重変化。複合体は、1mgの2E'、0.2mgのPTX及び20μgのCDNからなった。CR:完全退縮。 CT26腫瘍の成長及び抗腫瘍免疫の発達に対する2E'/PTX/CDNの単回腫瘍内注射の効果を示す図である。左:週齢を一致させたナイーブマウスにおけるCT26腫瘍の個々の成長曲線;CT26細胞による(再)チャレンジ後の無腫瘍マウスのパーセンテージ(p値:ログランク(マンテル-コックス)検定による対ナイーブ）。右:生存している無腫瘍マウスに接種された4T1（非血縁）腫瘍の成長曲線(年齢を一致させたナイーブマウス:n=5、2E'/PTX処置:n=3、2E'/PTX/CDN処置:n=6）、平均値±SD、n.s.:有意ではない;4T1細胞によるチャレンジ後の無腫瘍マウスのパーセンテージ。 図７。図７Ａ。2E'又は2E'/PTXの単回腫瘍内注射が、両側腫瘍を有するBalb/cでのCT26モデルにおける迅速な腫瘍退縮及び抗腫瘍免疫応答を誘導することを示す図である。Balb/cマウスにおけるCT26腫瘍接種及び処置注射のスケジュール。 図７Ｂ。2E'又は2E'/PTXの単回腫瘍内注射が、両側腫瘍を有するBalb/cでのCT26モデルにおける腫瘍及び抗腫瘍免疫応答の迅速な退縮を誘導することを示す図である。D5W、2E'(0.5mg)、2E'(1mg)又は2E'/PTX(1mg:0.2mg)で処置した腫瘍の個々の成長曲線及び処置後10日目の処置した腫瘍のサイズ(群当たりn=5)。CR:完全退縮。 図７Ｃ。2E'又は2E'/PTXの単回腫瘍内注射が、両側腫瘍を有するBalb/cでのCT26モデルにおける腫瘍及び抗腫瘍免疫応答の迅速な退縮を誘導することを示す図である。未処置の遠隔腫瘍の個々の成長曲線及び原発腫瘍の処置後10日目の遠隔腫瘍のサイズ(群当たりn=5)。平均±SD;p値は、クラスカル・ウォリス一元配置分散分析後のダンの多重比較検定によって計算した。 図７の続き。 図８。図８Ａ。2E'又は2E'/PTXの単回腫瘍内注射が、遅延させた2回目の腫瘍チャレンジによるBalb/cでのCT26モデルにおいて腫瘍の迅速な退縮及び抗腫瘍免疫応答を誘導することを示す図である。Balb/cマウスにおけるCT26腫瘍接種及び処置注射のスケジュール。 図８Ｂ。2E'又は2E'/PTXの単回腫瘍内注射が、遅延させた2回目の腫瘍チャレンジによるBalb/cでのCT26モデルにおいて腫瘍の迅速な退縮及び抗腫瘍免疫応答を誘導することを示す図である。D5W(n=4)、2E'(2.7mg)(n=7)又は2E'/PTX(2.7mg:0.4mg)(n=7)で処置した腫瘍の個々の成長曲線及び処置後22日目の処置した腫瘍のサイズ。平均±SD;p値は、クラスカル・ウォリス一元配置分散分析後のダンの多重比較検定によって計算した。 図８Ｃ。2E'又は2E'/PTXの単回腫瘍内注射が、遅延させた2回目の腫瘍チャレンジによるBalb/cでのCT26モデルにおいて腫瘍の迅速な退縮及び抗腫瘍免疫応答を誘導することを示す図である。未処置の遠隔腫瘍の個々の成長曲線。CR:完全退縮。 図８の続き。 図９。図９Ａ。CT26腫瘍に対する2E'/PTXの抗腫瘍効果を示す図である。Balb/cマウスにおけるCT26腫瘍接種、処置注射及び再チャレンジのスケジュール。 図９Ｂ。CT26腫瘍に対する2E'/PTXの抗腫瘍効果を示す図である。D5W、2E’(1.4mg)又は2E’/PTX(1.4mg:0.2mg)の単回IT注射後の腫瘍の個々の成長曲線及び処置したマウスの生存曲線(群当たりn=5)。p値:ログランク(マンテル-コックス)検定による対D5W。 図９Ｃ。CT26腫瘍に対する2E'/PTXの抗腫瘍効果を示す図である。単回処置後の無腫瘍マウスにおける再チャレンジした腫瘍の個々の成長曲線及び再チャレンジ後の無腫瘍マウスのパーセンテージ。CR:完全退縮。 図９の続き。 図１０。図１０Ａ。Balb/cでの同所性4T1モデルにおける原発腫瘍の不完全な外科的除去後の2'E/PTXの単回腫瘍内注射が腫瘍の再発及び肺転移を減少させることを示す図である。処置したマウスの生存曲線。 図１０Ｂ。2E’/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射が、CT26腫瘍を有するBalb/cマウスのTDLNにおける腫瘍退縮及び免疫表現型変化を誘導することを示す図である。1mgの2E'、0.2mg/mLのPTX及び0.67mgのsiRNAからなるD5W(n=4)、2E'(n=4)、2E'/PTX(n=4)、2E'/PTX/siNeg(n=4)又は2E'/PTX/siPD-L1(n=5)で処置した腫瘍の個々の成長曲線。 図１０Ｃ。2E’/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射が、CT26腫瘍を有するBalb/cマウスのTDLNにおける腫瘍退縮及び免疫表現型変化を誘導することを示す図である。処置後7日目のTDLN内のT細胞及びDC細胞集団。平均±SD;p値は、一元配置分散分析後のダネットの多重比較検定によって計算した。 図１０の続き。 疎水性薬物の多用途の担体としての2E'を示す図である。2E'は、ICD誘導剤[カーフィルゾミブ（CFZ、選択的プロテアソーム阻害剤）及びカンプトテシン（CPT、DNAトポイソメラーゼ阻害剤)]等の様々な疎水性化合物;疎水性蛍光色素:DiR(DiIC18(7);1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド);ニフルム酸(関節痛及び筋肉痛に使用される薬物);プロブコール（抗高脂血症薬）と会合すると球状粒子を形成する。 核酸の担体としての2E’を示す図である。2E'/PTXに対するpDNAの様々な質量比での2E'/PTX/pDNA複合体のゲル電気泳動。 核酸の担体としての2E’を示す図である。2E'/PTX/pDNAのTEM画像(1:0.4:0.7)。スケールバー:200nm。 核酸の担体としての2E’を示す図である。2E'のmRNAに対する様々な質量比での2E'/mRNA複合体のゲル電気泳動。全てのレーンは、1μgのpDNA又はmRNAに相当する複合体を含む。 図１３。図１３Ａ。両側腫瘍を有するC57BL/6マウスでのB16F10における2E’/PTX/siPD-L1の抗腫瘍効果を示す図である。処置した腫瘍の個々の成長曲線。 図１３Ｂ。両側腫瘍を有するC57BL/6マウスでのB16F10における2E’/PTX/siPD-L1の抗腫瘍効果を示す図である。未処置の腫瘍の個々の成長曲線。 図１３Ｃ。両側腫瘍を有するC57BL/6マウスでのB16F10における2E’/PTX/siPD-L1の抗腫瘍効果を示す図である。以下の単回処置後の生存曲線及び体重変化(平均±SD):D5W(n=6);2E'/siPD-L1+PTX NC(n=8);2E'/PTX/siNeg(n=9);又は2E'/PTX/siPD-L1(n=9)。2E'/PTX/siPD-L1で処置したマウスの一部は、小さい腫瘍サイズにもかかわらず、腫瘍潰瘍形成により安楽死させたことに留意されたい。
本開示の概念は、本明細書の図面及び説明において例示され、詳細に記載されているが、図面及びそれらの説明における結果は、例示的であり、特徴を限定するものではないと考慮されるべきであり、例示的な実施形態のみが示され、記載されていること、並びに本開示の趣旨に含まれる全ての変更及び修正は保護されることが望ましいことを理解されたい。
本明細書で使用される場合、以下の用語及び語句は、以下に示す意味を有するものとする。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。
本開示において、「約」という用語は、値又は範囲のある程度の変動、例えば、記載された値又は記載された範囲の限界の10%以内、5%以内又は1%以内を許容することができる。本開示において、「実質的に」という用語は、値又は範囲のある程度の変動、例えば、記載された値又は記載された範囲の限界の90％以内、95％以内、99％、99.5％、99.9％、99.99％、若しくは少なくとも約99.999％、又はそれ以上を許容することができる。
本文書では、文脈上明らかに別段の指示がない限り、「1つの(a)」、「1つの(an)」又は「その」という用語は、1つ又は1つより多くを含むために使用される。「又は」という用語は、別段の指示がない限り、非排他的な「又は」を指すために使用される。更に、本明細書で利用され、他に定義されていない表現又は用語は、説明のみを目的としており、限定を目的とするものではないことを理解されたい。節の見出しの使用はいずれも、文書を読みやすくすることを目的としており、限定として解釈されるべきではない。更に、節の見出しに関連する情報は、その特定の節の内部又は外部に存在する場合がある。更に、本文書で参照される全ての刊行物、特許及び特許文書は、あたかも個別に参照により組み込まれるかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本文書と、参照によりこのように組み込まれた文書との間で使用法が一致しない場合、組み込まれた参照での使用法は、本文書の使用法を補足するものとみなされるべきであり、相いれない矛盾については、本文書での使用法が優先される。
「薬学的に許容される担体」という用語は、当該技術分野で認識されており、任意の対象組成物又はその成分の担持又は輸送に関与する、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料等の薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクルを指す。各担体は、対象組成物及びその成分と適合し、患者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、(1)ラクトース、グルコース及びスクロース等の糖、(2)コーンスターチ及びジャガイモデンプン等のデンプン、(3)カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース等のセルロース及びその誘導体、(4)粉末トラガカント、(5)麦芽、(6)ゼラチン、(7)タルク、(8)ココアバター及び座薬ワックス等の賦形剤、(9)落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油等の油、(10)プロピレングリコール等のグリコール、(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール等のポリオール、(12)オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル、(13)寒天、(14)水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤、(15)アルギン酸、(16)パイロジェンフリー水、(17)等張食塩水、(18)リンゲル液、(19)エチルアルコール、(20)リン酸緩衝液、並びに(21)医薬製剤に利用される他の非毒性の適合性物質が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、経口(po)、静脈内(iv)、筋肉内(im)、皮下(sc)、経皮、吸入、口腔、眼、舌下、膣、直腸等を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載される化合物及び組成物を患者に導入する全ての手段を含む。本明細書に記載される化合物及び組成物は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント及びビヒクルを含む単位剤形及び/又は製剤で投与され得る。
経口投与のための例示的な形式には、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ等が含まれる。非経口投与のための例示的な経路には、静脈内、動脈内、腹腔内、硬膜外、尿道内、胸骨内、筋肉内及び皮下、並びに任意の他の当該技術分野で認識されている非経口投与経路が含まれる。
非経口投与の例示的な手段には、針(マイクロニードルを含む)注射器、無針注射器及び注入技術、並びに当該技術分野で認識されている非経口投与の任意の他の手段が含まれる。非経口製剤は典型的には、塩、炭水化物及び緩衝剤(好ましくは約3～約9の範囲のpH)等の賦形剤を含有し得る水溶液であるが、いくつかの用途に関して、それらは、滅菌非水性溶液として、又は滅菌パイロジェンフリー水等の好適なビヒクルとともに使用される乾燥形態として、より好適に製剤化され得る。例えば凍結乾燥による、無菌条件下での非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術を使用して容易に達成され得る。化合物の非経口投与は、実例として、生理食塩水の形態で、又はリポソームに組み込まれた化合物を用いて実施される。化合物自体が十分に可溶性でないために溶解し難い場合には、エタノール等の可溶化剤が適用され得る。
特許請求される組合せの各化合物の投与量は、投与方法、治療される状態、状態の重症度、状態が治療されるべきか又は予防されるべきか、並びに治療されるヒトの年齢、体重及び健康を含む、いくつかの要因に依存する。更に、特定の患者に関する薬理ゲノミクス(治療薬の薬物動態、薬力学又は有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響)情報が、使用される投与量に影響を与える場合がある。
本明細書に記載される方法において、同時投与又は組合せの個々の成分は、任意の適切な手段によって、同時に、一斉に、連続して、別々に、又は単一の医薬製剤中で投与され得ることを理解されたい。同時投与される化合物又は組成物が別個の剤形で投与される場合、各化合物について1日当たりに投与される投与の数は同じであってもよいか、又は異なっていてもよい。化合物又は組成物は、同じ又は異なる投与経路を介して投与され得る。化合物又は組成物は、同時又は交互のレジメンに従って、治療過程の間の同じ又は異なる時間に、分割又は単一の形態で同時に投与され得る。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、組織系、動物又はヒトにおいて、研究者、獣医、医師又は他の臨床医によって求められる、治療される疾患又は障害の症状の軽減を含む、生物学的又は医学的応答を生じさせる活性化合物又は薬剤の量を指す。一態様では、治療有効量は、任意の医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット/リスク比で疾患又は疾患の症状を治療又は軽減し得る量である。しかしながら、本明細書で記載される化合物及び組成物の総1日量は、健全な医学的判断の範囲内で、主治医によって決定され得ることを理解されたい。任意の特定の患者毎の具体的な治療有効用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度;採用される特定の化合物の活性;採用される特定の組成物;患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食生活;採用される特定の化合物の投与時間、投与経路及び排泄速度;治療期間;採用される特定の化合物と組み合わせて又は同時に使用される薬物;並びに研究者、獣医、医師又は通常の技術を有する他の臨床医に周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存するであろう。
投与経路に応じて、約1μg/kg～約1g/kgの範囲内の用量を含む、広範囲の許容投与量が本明細書において企図される。投与量は単回であってもよいか、又は分割であってもよく、q.d.(1日に1回)、b.i.d.(1日に2回)、t.i.d.(1日に3回)、又は更に隔日、週に1回、月に1回、四半期に1回等を含む、多種多様なプロトコールに従って投与され得る。これらの場合の各々において、本明細書に記載される治療有効量は、投与の実例、又は代替として投与プロトコールによって決定される、毎日、毎週、毎月若しくは四半期ごとの総用量に対応することを理解されたい。
本明細書に記載される例示的な投与量及び投薬プロトコールに加えて、本明細書に記載される化合物のいずれか1つ又は混合物の有効量は、公知の技術の使用により及び/又は類似の状況下で得られた結果を観察することにより担当の診断医又は医師によって決定され得ることを理解されたい。有効量又は用量を決定する際に、担当の診断医又は医師によって、ヒトを含む哺乳動物の種、その大きさ、年齢及び全身の健康状態、関与する特定の疾患又は障害、疾患又は障害の程度又は関与又は重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与様式、投与される調製物のバイオアベイラビリティ特性、選択される用量レジメン、併用薬の使用、並びに他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多くの要因が考慮される。
「患者」又は「対象」という用語は、ヒト並びに伴侶動物(イヌ及びネコ等)及び家畜動物等の非ヒト動物を含む。家畜動物は食糧生産のために飼育される動物である。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
本明細書に開示されるように、低分子干渉RNA(siRNA)は、RNA干渉に関与する20～25塩基対を有する二本鎖RNA分子を指す特有の用語である。これらの他のRNAに対する定義は、Zhang, P.ら、J. Integr. Bioinform. 2019 Sep;16(3):20190027に見出され得る。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体と、化学療法薬又は疎水性分子とを含む、抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関する。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関し、前記組成物は、マイクロRNA、メッセンジャーRMA、プラスミドDNA、低分子干渉RNA(siRNA)、オリゴヌクレオチド又は環状ジヌクレオチドを更に含む。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関し、前記siRNAはPD-L1 siRNAである。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関し、前記化学療法薬又は疎水性分子は、パクリタキセル、ソラフェニブ、イトラコナゾール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、カンプトテシン、シスプラチン、オキサリプラチン、シタラビン、ビンクリスチン、イリノテカン、アンホテリシン、ニフルム酸、プロブコール、インドメタシン、ゲムシタビン若しくはそれらの薬学的に許容される塩、又は疎水性色素若しくはその塩である。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関し、前記疎水性色素は、DiR';DiIC18(7)(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド）、シアニン7、シアニン5又はそれらの許容される塩を含む疎水性蛍光色素である。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関し、前記ポリエチレンイミン誘導体は、リトコール酸(LCA)、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸又はそれらの許容される塩による修飾/コンジュゲートポリエチレンイミンである。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関し、前記ポリエチレンイミンは、約2,500Da～約250,000Daの分子量範囲を有する。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関し、前記組成物は腫瘍内に投与される。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示される抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物に関し、前記組成物は全身投与される。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、1つ又は複数の希釈剤、賦形剤又は担体と共に、本明細書に開示される組成物を含む医薬組成物に関する。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法に関する。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法に関し、前記方法は、マイクロRNA、メッセンジャーRNA、プラスミドDNA、低分子干渉RNA(siRNA)、オリゴヌクレオチド又は環状ジヌクレオチドを更に含む。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法に関し、前記siRNAはPD-L1 siRNAである。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法に関し、前記化学療法薬は疎水性化学療法分子である。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法に関し、前記疎水性化学療法薬は、パクリタキセル、ソラフェニブ、イトラコナゾール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、カンプトテシン、シスプラチン、オキサリプラチン、シタラビン、ビンクリスチン、イリノテカン、アンホテリシン、ニフルム酸、プロブコール、インドメタシン、ゲムシタビン又はそれらの薬学的に許容される塩を含む。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法に関し、前記ポリエチレンイミン誘導体は、リトコール酸(LCA)、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸又はそれらの許容される塩による修飾/コンジュゲートポリエチレンイミンである。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法に関し、前記ポリエチレンイミンは、約2,500Da～約250,000Daの分子量範囲を有する。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法に関し、前記組成物は腫瘍内又は全身に投与される。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体及び抗腫瘍剤を含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、がんを有する対象を治療する方法に関し、前記組成物はフィラメント形態を取ることができる。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、ポリエチレンイミン誘導体及び疎水性色素を含む、診断目的のための組成物に関する。
一部の他の例示的な実施形態では、本開示は、ポリエチレンイミン誘導体及び疎水性色素を含む、診断目的のための組成物に関し、前記疎水性色素は、DiR';DiIC18(7)(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド）、シアニン7、シアニン5又はそれらの許容される塩を含む。
効果的な局所免疫療法に関して、腫瘍関連抗原(TAA)のin-situ生成、抗原提示細胞(APC)の活性化、腫瘍微小環境(TME)への免疫細胞の浸潤及び免疫活性TMEの維持を含む、いくつかの事象が一貫して調整するために必要とされる。抗腫瘍免疫応答の複雑性により、異なる作用機序を有する薬剤の組合せが要求される。例えば、化学療法薬は、免疫原性細胞死（ICD）を誘導してTAAを生成し、ダメージ関連分子パターン（DAMP）を放出するために使用され9、10、これにより、死にかけている細胞がAPCの取り込みに対して脆弱になる9。核酸及びヌクレオチドはそれらの多様な機能のために頻繁に利用される:小さなヌクレオチドは強力な免疫アジュバントとして機能することができ11、siRNAは免疫チェックポイントを遮断するために使用することができ12、マイクロRNAは炎症性サイトカイン産生を調節することができる13。
がん治療における複数の免疫療法薬の局所送達に関して、担体の選択が少なくとも3つの態様において重要である。第1に、担体は腫瘍における治療剤の薬理効果を最大化するために免疫療法を局所的に保持し、全身性副作用を阻止するのに役立ち得る14。第2に、担体は複数の薬剤の共局在化を確保できる15。例えば、ICDを誘導するパクリタキセル（PTX）9及び免疫チェックポイントを標的とするsiRNAを、機能を補完するために組み合わせることができる。適切に設計された担体は、物理化学的特徴をほとんど共有せず、別様で共局在化することが困難である2つの薬剤を同時に送達することができる。第3に、免疫アジュバント機能により操作された担体は、治療薬の免疫刺激効果と相乗作用する、抗腫瘍免疫の誘発に能動的な役割を果たすことができる16、17。それにもかかわらず、複数の薬物の免疫活性な局所担体を開発することは簡単ではなく、この目標を達成するための以前の取り組みは、成分の少なくとも1つの予備製剤化18又はプロドラッグ形成に依存しており19、これは個々の薬剤に合わせて調整する必要がある。
ここで、本発明者らは、ポリエチレンイミン(PEI)の両親媒性修飾、高分子遺伝子担体20及びトール様受容体(TLR)-5アゴニスト21に基づいて、局所適用のための免疫療法薬の新規担体を開発した。本発明者らは、APC22に対する免疫刺激効果を有する疎水性胆汁酸であるリトコール酸（LCA）をPEIの側面にコンジュゲートさせて、疎水性薬を収容し、免疫アジュバント機能を増強した。本発明者らは、PEI-LCAコンジュゲート（2E’）が水中で超分子集合体を形成し、単純な混合によって疎水性薬及び核酸の両方をロードし、APCを刺激して活性成分の活性を補完することを実証する。CT26腫瘍モデルにおいて、PTXと共に2E'を単回腫瘍内投与すると、腫瘍の即時退縮が誘導され、抗腫瘍免疫が生成される。PD-L1(siPD-L1)又は環状ジヌクレオチド(CDN)を標的とするsiRNAを更に組み込むと、免疫刺激効果が更に増強され、単回投与後の複数のモデルにおいて大きな確立された腫瘍の退縮及び無腫瘍生存がもたらされる。抗腫瘍免疫の局所的誘導は、全身の抗腫瘍免疫及び免疫記憶を活性化して、生存動物を腫瘍再チャレンジ及び転移から防御する。この免疫活性複合体の強力な抗腫瘍活性は、合理的に設計された薬物担体の重要性を実証し、効果的な局所免疫療法によって到達困難な腫瘍を治療する実現可能性を支持する。
結果
2E’(ポリエチレンイミン-リトコール酸コンジュゲート)は、樹状細胞(DC)に対して毒性が低く、がん細胞に対して選択的に毒性があり、PEIよりもin vivoで安全である。
2E'(図1a)を、カルボニルジイミダゾールを介してLCAをPEIに2:1のモル比でコンジュゲートすることによって合成した23。水性媒体中で、2E'は、2.6μg/mLの臨界集合体濃度で、LCA部分に起因してナノ粒子集合体を形成した（図1b）。2E'は、骨髄由来DC（BMDC）よりもCT26及びB16F10細胞に対して毒性が強かった（図1c）。がん細胞は正常細胞よりも比較的多くのアニオン性表面を示す傾向があるため24、25、2E'の選択毒性は、電荷の差に基づくがん細胞に対する親和性によって説明され得る。文献は、がん細胞に対する選択毒性がカチオン性ポリマーの共通の特徴であることを支持しており(26、27)、実際に、2E'及びPEIの両方は、正常な脾細胞よりもCT26細胞に対して大きな毒性を示した。細胞傷害性プロファイルの類似性にもかかわらず、2E'及びPEIは腫瘍内注射時に顕著な違いを示した。2.74mg/マウスでPEIを投与された全てのマウス（7/7）は48時間以内に死亡したが、2E'処置群（2.74mg/マウスの2E’）では死亡しなかった（0/7）。PEIは、全身投与されると、肺損傷に伴うショックを引き起こすことが知られている26。異なるin vivo毒性がそれらの全身吸収の程度に起因するかどうかを試験するために、本発明者らは、Cy7で標識したPEI及び2E'をCT26腫瘍の腫瘍内に投与し、全身蛍光イメージングによってそれらの保持をモニタリングした。2E'は、おそらくナノ粒子構造に起因して、PEIよりもゆっくりと注射部位から消失した（図1b）。比較的遅い吸収のため、腫瘍内に注射された2E'のin vivo毒性が弱まった可能性がある。
2E'は免疫アジュバントとして機能し、APCによるがん細胞の取り込みを増強し、PTX及びsiPD-L1を担持し、Balb/cでのCT26モデル及びBalb/cでの4T1モデルにおいて抗腫瘍応答を誘導する。
PEIは、TLR-521及びNlrp3インフラマソーム17、27の公知のアゴニストである。2E’がPEIの免疫刺激効果を保持しているかどうかを試験するために、本発明者らは、骨髄由来骨髄細胞及びJAWSII DCに2E’を適用した。2E'は、BMDC及びJAWSII DCの成熟を誘導し（図1d）、BMDC及びBMDMから、インフラマソーム活性化の指標である28、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)及びインターロイキン-1β(IL-1β)の産生を促進した(図1e)。TLRレポーター細胞株を用いた比色分析により、2E'がTLR-5シグナル伝達を活性化することが示された（図1f）。2E'もPEIも、エンドトキシン汚染の潜在的なアーチファクトを除いて、同等の濃度でTLR-4シグナル伝達を活性化しなかった。更に、2E'で処理したCT26及びB16F10細胞は、ICDの兆候である29、細胞表面カルレティキュリン（CRT）を曝露した（図1g）。全ての試験において、2E'はPEIよりも大きな応答を誘導し、これは、LCAペンダントの免疫刺激活性に起因する可能性がある22。本発明者らは、LCAが用量依存的にBMDC成熟を刺激することを確認し、LCAが、PEIと組み合わせるとPEIの免疫刺激効果を増加させることが示された。それにもかかわらず、PEIと2E'の差がPEIとLCA+PEIの差よりも大きかったため、LCA及びPEIの相加効果が、2E'の免疫刺激効果を改善したことを完全には説明しない。2E'の優れた活性はまた、水不溶性LCAの可溶化及び細胞取り込みを促進するNP構造の形成に起因する可能性もある。2E'の免疫刺激活性に基づいて、本発明者らは、2E'が、腫瘍抗原（例えば、ICDを受けている腫瘍細胞30、31）を取り込むAPCの能力を増強するかどうかを試験した。本発明者らは、DC又はBMDMを、2E'を伴って又は伴わずに、I型ICD誘導剤である9、30、32、PTXで前処理したCT26又はB16F10細胞と共培養し(図1h)、フローサイトメトリーによってがん細胞のAPC取り込みを定量した。がん細胞を取り込むDC又はBMDMの割合、及びDC又はBMDMによって取り込まれたがん細胞は、2E'で大幅に増加した（図1i、1j）。これらの結果は、2E'が免疫アジュバントとして機能し、腫瘍抗原のAPC取り込みを増強することによって、抗腫瘍免疫応答の初期段階を促進することを示唆している。
LCA側面の疎水性及びPEI骨格の正電荷に起因して、2E'はPTXを封入し、siPD-L1と複合体化した。PTXを封入した2E'(2E'/PTX)粒子は球形で、2E'と同様に直径が約20nmであると測定された(図1k)。1:0.4(2E':PTX)の質量比で、2E'/PTXは、23.4±6.3wt%(使用したPTX全体の81.9%)の平均PTX負荷を有し、水溶液中に封入されたPTXの32%を72時間にわたって放出した(図1l)。2E'含有量がより多い2E'/PTX（1:0.2、w/w）は、よりゆっくりとPTXを放出し(72時間で21%)、疎水性LCAクラスターがPTX放出を制御していることが示唆された。2E'の一部はsiPD-L1の0.67部の量と複合体化し、臭化エチジウムを排除した完全な複合体を形成した（図1m）。2E'/siPD-L1は、リポフェクタミン2000/siPD-L1複合体（L2k/siPD-L1）と同程度に効率的にCT26細胞に侵入し、インターフェロン-γ(IFN-γ）で刺激されたB16F10及びCT26細胞上のPD-L1発現を阻害した（図1n）。
本発明者らは、局所投与された2E'又は2E'/PTXが抗腫瘍効果を有し、全身性抗腫瘍免疫を誘導するかどうかを試験するために一連のin vivo研究を実施した。第1に、本発明者らは、Balb/cマウスの両側CT26腫瘍の1つに2E'又は2E'/PTXを投与し、処置した及び未処置の遠隔腫瘍に対する効果(アブスコパル効果)を観察した（図7a）。2E'(マウス当たり1mg)又は2E'/PTX(マウス当たり1mgの2E'+0.2mgのPTX)の単回腫瘍内注射により、処置した腫瘍の顕著な減弱又は根絶が誘導され、各群のマウスの60%が処置した腫瘍の完全退縮(CR)を示した(図7b)。未処置の遠隔腫瘍については、2E'又は2E'/PTX群は5％のデキストロース（D5W）ビヒクル群よりも明らかに遅い腫瘍成長を示したが、その差はわずかであった（図7c）。第2に、本発明者らは、より長いモニタリングにより、より高い用量(マウス当たり2.7mgの2E'又は2.7mgの2E'+0.4mgのPTX)で2E'及び2E'/PTXを試験した(図8a)。このときに、本発明者らは、抗腫瘍免疫が発現する前の過度の成長を避けるために、原発腫瘍の処置から6日後に遠隔腫瘍に接種した。2E'及び2E'/PTXの両方は、マウスの57%で原発腫瘍の成長を阻害したが、D5W処置群では腫瘍退縮を示したマウスは存在しなかった。2E'と2E'/PTXとの間では、後者は明らかに遅い腫瘍成長を示し、その結果、処置後22日目の腫瘍サイズにおいてD5W対照との有意差が生じた（図8b）。未処置の遠隔腫瘍では、2E'及び2E'/PTX群はそれぞれ57％及び71％のマウスにおいて腫瘍成長を示さなかったが、ナイーブマウスの86％では腫瘍が成長した（図8c）。
しかしながら、おそらく、原発腫瘍が二次腫瘍に対して抑制効果を有することを示す現象である33、付随する腫瘍耐性に起因して、D5W群の4匹のマウス全ても腫瘍成長を示さなかったため、観察されたCRは必ずしも全身性抗腫瘍免疫を示さない。第3に、本発明者らは、2E'/PTXが腫瘍の免疫学的記憶を確立するかどうかを試験した（図9a）。単回腫瘍内注射後、2E'/PTX（マウス当たり1.4mgの2E'+0.2mgのPTX）は、動物の60％において処置した腫瘍のCRを誘導し、2'Eでは40%で誘導した(図9b)。CRで生存している動物を、最初の処置から17日目に生CT26細胞で対側に再チャレンジした。全てのナイーブマウスは2週間で腫瘍を成長させたが、2匹の無腫瘍マウスのうち1匹では2E'が腫瘍成長を阻止し、3匹のうちの2匹では2E'/PTXが阻止した（図9c）。最後に、2E’/PTXを、Balb/cマウスの同所性ルシフェラーゼ発現4T1(4T1-Luc)乳房腫瘍を用いて試験した(図10)。腫瘍を外科的に除去し、残存塊をD5W又は2E'/PTX（マウス当たり0.2mgの2E'+0.2mgのPTX）で局所的に処置した(図10a)。D5W群の5匹のマウスは全て、17日目に腫瘍の再発及び肺転移を示し、処置後25日では生存動物は残らなかった(図10b、10c)。対照的に、2E'/PTX群の5匹のマウスのうち2匹は原発部位及び肺に腫瘍シグナルを示さず、少なくとも50日間(観察期間)生存した。これらの結果は、免疫刺激剤としての2E'が腫瘍成長を抑制し、抗腫瘍免疫を活性化する可能性が高く、追加のPTXが効果を増強することを示唆している。
2E'はPTX及びsiPD-L1を同時に担持する。
本発明者らは、免疫チェックポイント相互作用を遮断することによって抗腫瘍免疫を更に増強するために、2E'/PTXにsiPD-L1を添加した。2E’/PTX/siPD-L1の組合せは、1:0.2:0.67の質量比で完全な複合体を形成した(図2a)。2E'/PTX/siPD-L1のゼータ電位(+28.9±1.0mV)は2E'/PTXのゼータ電位(+44.6±0.3mV)よりも低く、siPD-L1の添加を反映している。三元複合体は50nmの平均直径を有する球状を示した(図2b)。2E'/PTX/siPD-L1は2E'/PTXよりも大きく見え（図1b）、siPD-L1が複数の2E'/PTXと複合体を形成したことが示唆される。動的光散乱によって測定された2E'/PTX/siPD-L1(1/0.2/0.67、w/w/w)(264.4nm)のz平均は、TEM測定(50nm)よりも約5倍大きく、水性媒体中に懸濁された複合体がある程度の凝集を起こすことを示している。2E'/PTX/siPD-L1及び2E'/PTXは、2E'又はPTX単独よりもCT26細胞に対して毒性が高く(図2c)、2E'及びPTXの相乗効果を示している(全ての試験したレベルで2E'/PTX及び2E'/PTX/siPD-L1に対して1未満の組合せ指数（CI))。しかしながら、2E'/PTX/siPD-L1及びPTX又は2E'/PTXは、PTX2μg/mL以下(及び2E'10μg/mL）でBMDC及び脾細胞に対して有意な細胞傷害性を示さなかった(図2c)。この結果は、2E'の異なる細胞相互作用及び細胞傷害性(図1c)並びにPTXに対する免疫細胞の既知の耐性と一致する34。水性媒体中でのsiRNA媒介性複合体形成の兆候及び軽度の凝集にもかかわらず、2E'/PTX/siPD-L1はがん細胞に侵入し、がん細胞の70%を死滅させ、生き残ったIFN-γで刺激されたCT26及びB16F10細胞におけるPD-L1発現を阻害した。2E'/PTX/siPD-L1は、BMDC及びBMDMからのTNF-α及びIL-1βの分泌を誘導した。siPD-L1を対照siRNA(siNeg)に置き換えると、siRNA配列の役割を除いて、ある濃度以外ではサイトカイン分泌に対する影響は無視できた。2E'/PTX/siPD-L1はまた、CT26及びB16F10細胞でのCRTの曝露も誘導した。これらの結果は、2E'がPTX及びsiPD-L1を同時に担持し、各成分の活性を維持して、がん細胞に選択的毒性を与え、APCを刺激し、PD-L1発現を抑制できることを裏付ける。
2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射は腫瘍退縮を誘導し、Balb/cでのCT26モデルにおいて反復的な腫瘍チャレンジから動物を防御する。
本発明者らは、2E’/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射が抗腫瘍免疫の発達に役立つかどうかを試験した。第1に、Balb/cマウスにおけるCT26腫瘍を、2E'、2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg又は2E'/PTX/siPD-L1で処置した(図2d)。以前の結果と一致して、2E'群はマウスの50%においてCRを示し、2E'/PTXは75%において示した。2E'/PTX/siPD-L1もまた、マウスの75%においてCRを示したが、2E'/PTX/siNeg群は無腫瘍マウスで37%であった(図2e)。腫瘍のない動物を、処置の30日後に対側に105個の生CT26細胞を再チャレンジした。2E’/PTX/siNeg群の1匹を除く全てが再チャレンジに抵抗し、2E'の単回処置及びPTXとの全ての組合せが、抗腫瘍免疫の発達に役立つことが示された(図2f)。しかしながら、2E’/PTX/siPD-L1で処置した無腫瘍マウスは、20倍を超える生CT26細胞(2×106)で2回目に再チャレンジしたとき、最高の能力を発揮した。2E'、2E'/PTX及び2E'/PTX/siNeg群の動物の少なくとも一部は、2回目のチャレンジ後10～15日で指数関数的な腫瘍成長を示したが、2E'/PTX/siPD-L1で処置したマウスは、腫瘍を成長させなかったか(CR:50%)、又は他と比較して成長を減弱させた(図2g)。これらの結果は、試験した全ての複合体が抗腫瘍免疫記憶を発達させたことを実証し、それらの中で、2E'/PTX/siPD-L1は最も強力な防御免疫を示し、生腫瘍細胞の複数回の再チャレンジを受けた生存マウスにおい腫瘍成長を阻害するのに十分であった。2E'/PTX/siNegは、原発腫瘍制御及び再チャレンジに対する耐性において2E'/PTXよりも明らかに劣っていた。本発明者らは、siNegのみが2E'の正電荷を減少させたと推測し、これは、機能的活性を有さず、免疫刺激効果にとって重要である35～37。反復研究において、本発明者らは、処置後7日目に、処置に応答するDC成熟及びT細胞増殖を観察するのに最適な時間枠である腫瘍免疫環境を調べた38。処置を受けたCT26腫瘍はこの時点では分析するには小さすぎるため、本発明者らは、腫瘍流入リンパ節(TDLN)を分析した。2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg及び2E'/PTX/siPD-L1処置群は、D5W処置対照と比較して、CD8+T細胞及び成熟DCの明らかな増加、並びにCD4+T細胞の減少を示した(図10b/10c)。これらの結果は、2E’（図1）及びPTX（図10b/10c）の免疫刺激効果、並びに以前の研究で見られた抗腫瘍免疫記憶（図2f、2g）と一致する。
2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射は、免疫原性の低いB16F10腫瘍において免疫活性表現型を誘導し、維持する。
本発明者らは、免疫原性の低いB16F10黒色腫モデルを使用して、処置した腫瘍の免疫表現型を調べた。分析に十分なサイズを得るために、腫瘍が約150mm3(CT26腫瘍よりも少なくとも3倍大きい）まで成長したときに処置を行った（図3a）。再び、2E'/PTX/siPD-L1処置群が最も効果的であった(図3b)。D5W群の腫瘍は処置後7日で既にエンドポイントに近づいたが、2E'/PTX/siPD-L1処置群の腫瘍は、この時間の間、ほとんど成長又は縮小しなかった。処置したマウスのいずれも、体重の有意な変化（図3b）又は実質器官の病変を示さず、7日間で局所投与された複合体の安全性が示唆された。
処置の7日後に採取した腫瘍をフローサイトメトリー(図3)及び免疫組織化学(IHC)によって分析した。2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg又は2E'/PTX/siPD-L1で処置した腫瘍は、D5Wで処置した腫瘍と比較して、炎症誘発性CD80+M1様表現型に偏った、明らかにより成熟したDC及びマクロファージを有した(図3c)。興味深いことに、2E'/PTX及び2E'/PTX/siNegは、D5W群と比較して腫瘍内の骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)のパーセンテージを増加させた。しかしながら、2E'/PTX/siPD-L1処置群はMDSCの割合の増加を示さなかった。2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg及び2E'/PTX/siPD-L1は、腫瘍へのCD8+T細胞浸潤を増加させた（図3c）。CD4+T細胞も同様にこれらの群において増加した。しかしながら、2E'/PTX/siPD-L1で処置した腫瘍は、CD4+T細胞において調節性T細胞(Treg)の割合が最も少なく、D5W対照群よりも有意に高いCD8+/Treg比を示した。これらの結果により、2E'/PTX/siPD-L1が最も免疫活性な表現型を維持し、免疫抑制細胞の流入に抵抗していることが示唆される。本発明者らはまた、腫瘍微小環境におけるPD-L1発現も測定した（図3d）。2E'/PTX又は2E'/PTX/siNegで処置した腫瘍は、D5Wで処置した腫瘍よりも有意に高いPD-L1発現を示した。腫瘍細胞並びにマクロファージ及びMDSCを含む免疫細胞の両方はPD-L1発現の増加の傾向を示し、これは、2E'/PTX媒介性免疫刺激に対する負のフィードバックを示唆している。PD-L1発現は、免疫抑制性MDSCへの未熟骨髄細胞の変換を誘導し39、Tregの分化及び機能を増強することが報告されている40。2E'/PTX及び2E'/PTX/siNegで処置した腫瘍におけるPD-L1発現の増加は、MDSC及びTregの集団の増加と一致する（図3c）。対照的に、2E'/PTX/siPD-L1はPD-L1の過剰発現を阻止した（図3d）。したがって、比較的低いレベルのMDSC及びTregを維持する2E'/PTX/siPD-L1処置群の能力は、siPD-L1のサイレンシング効果に起因する可能性がある。PD-L1発現プロファイル及び免疫細胞集団は総合すると、2E'/PTX/siPD-L1が免疫刺激性TMEを誘導しただけでなく(2E'及びPTXに基づく)、それを維持した(siPD-L1に基づく)ことも示される。RNAシークエンシングは、腫瘍成長及び免疫表現型検査の結果と一致した傾向を示した(図3)。2E'/PTX/siNeg及び2E'/PTX/siPD-L1処置は、D5W対照と比較して、IL-6、LIF、IL-10、TNF、IL-1a等の腫瘍支持サイトカインの発現を抑制した。また、RNAシークエンシングにより、2E'/PTX/siNegで処置した腫瘍ではPD-L1コード遺伝子であるCd274のレベルの上昇が裏付けられたが、2E'/PTX/siPD-L1で処置した腫瘍ではそうではなかった。
2E'/PTX/siPD-L1の単回腫瘍内注射は、B16F10腫瘍における全身性抗腫瘍免疫及び免疫記憶を刺激する。
局所抗腫瘍免疫の活性化が全身性抗腫瘍免疫に変換されたかどうかを試験するために、本発明者らは、処置の7日後にB16F10腫瘍担持マウスの脾細胞を採取し、B16F10黒色腫関連抗原であるTrp2ペプチドでそれらを刺激して41、IFN-γ産生を測定した(図3e)。2E'/PTX/siPD-L1で処置したマウスの脾細胞は、D5W又は2E'/PTX/siNegで処置した群よりも多くのIFN-γを産生し、全身性抗腫瘍免疫の活性化を示した。この活性化がCD8+T細胞に関与しているかどうかを試験するために、本発明者らは、MHCI-Trp2ペプチド四量体複合体に結合しているCD8+T細胞を定量した。2E'/PTX/siPD-L1は、D5W又は2E'/PTX/siNegと比較してTrp2+CD8+T細胞の有意な増加を誘導し（図3f）、腫瘍特異的T細胞応答を裏付けた。
全身性抗腫瘍免疫の証拠に基づいて、本発明者らは、2E'/PTX/siPD-L1が、D5W及び2E'/PTX/siNegと比較して、C57BL/6マウスの両側B16F10腫瘍における未処置の遠隔腫瘍に対してアブスコパル効果を有するかどうかを試験した(図4a、図13)。全身に吸収されたPTXが何らかの役割を果たしている可能性を排除するために、2E'/siPD-L1及びPTXの混合物も比較した(低い水溶性のために、PTXはナノ結晶として混合物に含まれ42、43、これは、B16F10モデルにおいて市販のPTX製剤(アブラキサン)よりも優れていた43)。腫瘍抗原特異的T細胞の全身活性化と一致して（図3e、3f）、2E'/PTX/siPD-L1は、処置した及び未処置の遠隔腫瘍の両方において、2E'/PTX/siNeg及び2E'/siPD-L1+PTX混合物よりも良好に腫瘍成長を遅延させ、処置後11日目に両側で最小の腫瘍サイズを生じた(全ての群が生存していた最後の時点)。2E'/PTX/siPD-L1及び2E'/siPD-L1+PTX混合物の比較は、PTXが2E'に封入された(2E'/PTX/siPD-L1)場合、未処置の遠隔腫瘍が良好に抑制されることを示唆しており、すなわち、遠隔腫瘍に対する効果は、全身的に吸収されたPTXの機能ではなく、PTXの保持が有益な局所的な事象の結果である。
次に、本発明者らは、2E'/PTX/siPD-L1処置がB16F10腫瘍において抗腫瘍免疫記憶を生成するかどうかを調べた（図4b、4c）。本発明者らは、B16F10担持マウスをD5W及び2E'/PTX/siPD-L1で処置し、再現可能な初期腫瘍成長パターンを確認した(図3)。D5W群における全てのマウスは、処置後8日以内にエンドポイントに達した。しかしながら、2E'/PTX/siPD-L1で処置した動物は、処置から31日の生存期間中央値を示し、マウスの27%においてCRを誘導した。生存している無腫瘍マウスに、処置後54日目に対側に105個の生B16F10細胞を再チャレンジした。全ての年齢を一致させたナイーブマウスは、接種後14日で腫瘍を発症し、33日でエンドポイントに達した。2E'/PTX/siPD-L1処置群の3匹の無腫瘍マウスのうち、1匹は腫瘍を成長させずに再チャレンジ後16日目に原因不明で死亡し、もう1匹は、再チャレンジ後18日目に腫瘍を示し、48日でエンドポイントまで成長し、3匹目は、再チャレンジ後105日(観察期間)で腫瘍を発症しなかった。再チャレンジした腫瘍の成長の遅延又は成長がないことにより、2E'/PTX/siPD-L1による局所処置がB16F10腫瘍の免疫記憶を確立することが示唆される。
2E'/PTX/siPD-L1の腫瘍内注射は4T1腫瘍の成長及び転移を阻害する。
2E'/PTX/siPD-L1の広範な有用性を評価するために、本発明者らは、それを、リンパ節、血液、肺、肝臓、脳及び骨を含む、複数の遠隔部位に自然に転移するが、原発腫瘍はヒトの乳房腫瘍として存在する46、別の免疫原性の低い腫瘍モデルある44、45、同所性4T1-Luc腫瘍において試験し、3つの対照群(D5W、2E'/PTX/siNeg及び臨床シナリオを模倣するために完全な外科的切除)と比較した(図5)。D5W群では、腫瘍は指数関数的に成長し、全ての動物が広範囲な転移を伴って19日以内に生理学的エンドポイントに達した。手術群では、80％が手術から13日以内に手術部位で腫瘍再発を示し、全てが17日以内に肺転移を示し、25日以内にエンドポイントに達した。対照的に、2E'/PTX/siNeg及び2E'/PTX/siPD-L1で処置した群は、処置後、即座の発光シグナルの喪失(1日以内)及び腫瘍の縮小(2日以内)を示したが、それらのほとんどは後の時間で再成長した。これらの処置により肺転移の発生も減少し、2E'/PTX/siNeg群では55%、及び2E'/PTX/siPD-L1群では88%が、処置後17日までに肺において発光シグナルを示さなかった。生存期間中央値は、30日(2E'/PTX/siNeg)及び35日(2E'/PTX/siPD-L1)であった。2E'/PTX/siNegで処置した群はCRを示さなかったのに対して、2E'/PTX/siPD-L1群は25%のCRを示した。2E'/PTX/siPD-L1群における2匹の無腫瘍マウスに、対側に4T1-Luc細胞を再チャレンジした。いずれも再チャレンジから47日（観察期間）では腫瘍は成長しなかったが、年齢を一致させたナイーブマウスの全ては、11日以内で成長した(図5C)。これらの結果は、2E'/PTX/siPD-L1の単回処置が、原発腫瘍及び転移の両方の管理において臨床的ベンチマーク処置である外科的除去より優れており、生存動物において抗腫瘍免疫記憶を確立することを実証する。
STINGアゴニストである環状ジヌクレオチド(CDN)と組み合わせた2E'/PTXは、Balb/cでのCT26モデルにおいて確立された腫瘍を除去し、抗腫瘍免疫を発現する。
他の薬物を担持する2E'の適用性を試験するために、本発明者らは、siPD-L1を、インターフェロン遺伝子刺激因子(STING)経路のアゴニストである47、CDN(2'3'-c-di-AMPのビスホスホロチオエート類似体)と置き換え、それを、3つの対照群(D5W、PTXナノ結晶+CDN混合物、2E'/PTX)と共にCT26モデルにおいて試験した(図6)。PTX+CDN混合物は、D5W対照と比較して腫瘍の成長を遅延させ、生存期間中央値を24日から35日に延長し、13%のCRを達成した。2E'/PTXはPTX+CDN混合物よりも有効であり、45日の生存期間中央値及び43%のCR率であった。2E'/PTX/CDNは最高の抗腫瘍効果を示し、処置したマウスの86%は、単回処置後、腫瘍がなく生存した。生CT26細胞で再チャレンジすると、無腫瘍マウスのいずれも再チャレンジした腫瘍を66日間（観察期間）成長させなかったが、年齢を一致させたナイーブマウスの全ては、11日以内に成長し、34日以内に死亡した。これらの結果は、2E'/PTX/CDNの単回の腫瘍内処置が強力な抗腫瘍免疫応答を誘導し、確立された腫瘍を根絶し、治癒した動物を腫瘍の再浸潤から防御したことを示す。2E'/PTX又は2E'/PTX/CDN処置を受けた生存動物は、非血縁の同系4T1腫瘍を拒絶せず（図6b）、抗腫瘍免疫が腫瘍特異的であったことを示す。
考察
免疫療法はがん治療において劇的な転帰を示しているが、現在の奏効率の上限は改善されたアプローチの必要性を示している。ここで、本発明者らは、PTX及びsiPD-L1又はCDNを担持する免疫活性ナノ粒子である2E’が、単回の局所投与により確立された腫瘍の即時退縮を誘導し、抗腫瘍免疫の活性化を増強し、生存動物の全身性で長期間の防御をもたらすことを示す。各成分は、抗腫瘍免疫を活性化するために異なる役割を果たし、2E'は免疫アジュバント効果に起因して腫瘍に対する自然免疫を刺激し(図1d～1j)、PTX及び2E'はICD（すなわち、腫瘍抗原のin situ生成）を誘導し（図2c)、次いでこれは腫瘍に対するT細胞免疫を活性化する。siPD-L1は、別様では免疫チェックポイント相互作用並びにMDSC及びTregの動員に関与するPD-L1の腫瘍発現を阻止することによって後の段階に寄与した（図3c～f）。CDNは自然免疫応答の活性化に2E'及びPTXを活用した48。これらの三元複合体は、同様の腫瘍モデルにおいて最近報告された局所免疫療法よりも優れているか、又は同等であった19、49。例えば、2E'/PTX/siPD-L1(図4、図5)は、単回腫瘍内投与後、処置からの生存期間中央値(B16F10モデルでは31日対21日49及び4T1モデルでは35日対24日49)及びCR%(B16F10モデルでは27%対0%49及び4T1モデルでは25%対0%49)においてSTINGアゴニスト49を担持する微細加工されたポリ乳酸-グリコール酸共重合体粒子に勝るとも劣らない。2E'/PTX/siPD-L1(図2及び図5)及び2E'/PTX/CDN(図6)はまた、確立されたCT26腫瘍の退縮を誘導した、STINGアゴニストを担持するカンプトテシンプロドラッグベースのヒドロゲルに匹敵し、単回の腫瘍内注射後の4T1腫瘍の成長及び転移を遅らせ19、広範な適用性の更なる利点を有する。更に、2E'/PTX/CDNは20μgのCDNを含有し、文献の用量（4×10μg49、1×40μg49、又は3×20μg50）の1/2又は1/3であったが、単回投与後、86%のCR及び腫瘍特異的免疫を達成した。
2E'は、がんの局所免疫療法に比類なく適するようにするいくつかの優れた特徴を有する。第1に、担体自体が免疫活性であり、これは、親ポリマーPEI17、21及びコンジュゲートしたLCA22の固有の特性に起因する。両親媒性PEI誘導体の自己集合によるナノ粒子形成（図1b）もまた、ポリマーとAPCとの相互作用を増強した可能性がある。第2に、2E'は免疫細胞（BMDC及び脾細胞）と比較してがん細胞に対して選択的毒性を有し、罹患したがん細胞にICD表現型（CRT曝露）を引き起こす（図1g）。がん細胞はエネルギー産生のために異常な解糖経路を経て、それによって大量の乳酸を分泌し、細胞膜を正常細胞よりも負に帯電させる24。高密度の負電荷は2E'との相互作用を促進することができ、BMDCと比較してCT26及びB16F10細胞に対する2E'の選択的毒性を説明している。がん細胞に対する免疫活性及び毒性に基づいて、2E'単独は処置された腫瘍を減弱又は抑制した。しかしながら、PTX、siPD-L1又はCDNを組み込むと、抗腫瘍効果が更に増加し、強力な抗腫瘍免疫記憶の確立に役立った（図2～図6）。したがって、2E’の3番目の特徴は、疎水性抗がん薬、及び相補的な機能をもたらすが、担体なしでは同時送達することが難しい負に帯電した核酸又はヌクレオチドの両方とのその適合性である。2E’、PTX及びsiPDL-1を組み合わせると、2E’及びPTXの相乗効果（図2c）並びにsiPD-L1の細胞内送達を含む、有利な転帰が得られる。本発明者らは、2E'が免疫活性剤の様々な組合せの送達に適していると想定している。2E’は、疎水性LCAコア及びカチオン性PEI骨格のそれぞれを介してPTX及びsiPD-L1を担持し、したがって、PTXを他の疎水性ICD誘導剤と置き換え（図11）、siPD-L1を異なるsiRNA、CDN等のヌクレオチド（図6）、又は他の核酸（図12）と置き換えることが可能である。2E'のモジュール性及び核酸治療薬の多用途の機能により、担体又は薬物の再設計を必要とせずに、腫瘍の種類に応じた包括的な組合せの開発が可能になる。2E'のこれらの特徴により、この研究は、同様のPEI-LCAコンジュゲートを単純な薬物担体として使用した他の研究51、又は異なる担体内で組み合わせたPTX及びsiPD-L118と区別される。
要約すると、本発明者らは、疎水性薬物及び核酸/ヌクレオチドの免疫刺激担体である2E'を開発した。2E'並びにPTX及びsiPD-L1又はCDNとのその組合せは、単回局所投与によって強力な抗腫瘍免疫を誘導し、複数の腫瘍モデルにおいて大きな確立された腫瘍の即時退縮及び腫瘍のない生存を引き起こす。処置した動物は、TME及び腫瘍特異的T細胞応答において免疫活性表現型を示し、転移又は再チャレンジに抵抗し、全身性抗腫瘍免疫及び免疫記憶の誘導が示された。この研究は、抗腫瘍免疫の効果的なin situ誘導が、遠隔及び再発疾患からの全身防御をもたらし得ることを裏付け、2E'は、抗腫瘍免疫に関与する複数の事象に対処する化学療法薬及び核酸の組合せに対応することにより、局所免疫療法のための単純で多用途のプラットフォームを提供する。
材料及び方法
材料
直鎖状ポリエチレンイミン塩基形態(PEI塩基形態、MW:2.5kDa)及びポリエチレンイミン塩酸塩(PEI塩形態、2.5kDaのPEI塩基形態に相当するMW4kDa)は、Polysciences社(Warrington、PA)から購入した。1,1'-カルボニルジイミダゾール(CDI)、リトコール酸(LCA、≧97%)及びEtBr(10mg/mL)は、Sigma-Aldrich社(St.Louis、MO)から購入した。D-ルシフェリンカリウム塩は、Gold Biotechnology社(St.Louis、MO、USA)から購入した。マウスpdcd1lg1 mRNAに特異的なsiRNA、センス、5'-CCCACAUAAAAAACAGUUGTT-3'、配列番号1;アンチセンス、5'-CAACUGUUUUUUAUGUGGGTT-3'、配列番号２;ネガティブsiRNA(センス、5'-UGAAGUUGCACUUGAAGUCdTdT-3'、配列番号3;アンチセンス、5'-GACUUCAAGUGCAACUUCAdTdT-3'、配列番号4)及びCy5で標識したネガティブsiRNAは、IDT社(Coralville、Iowa、USA)から購入した。iTAg四量体/APC-H-2 Kb TRP2(SVYDFFVWL)は、MBL International社(Woburn、MA)から購入した。環状ジヌクレオチド(CDN)-2'3'-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)は、InvotroGen社(San Diego、CA)から購入した。ホタルルシフェラーゼ発現プラスミドDNA(pLuc)は、以前に報告されているようにDH5-αコンピテント大腸菌(Escherichia coli)で複製した52。CleanCap(登録商標) EGFP mRNA(mRNA)は、TriLink BioTechnologies社(San Diego、CA)から購入した。
2E'の合成及び特性評価
以前の報告２３に記載されているように2E'を合成した。簡潔に述べると、8.7mg(50μmol)のCDI及び15.8mgのLCA(40μmol)を、撹拌しながら2.7mLのクロロホルムに溶解した。1時間後、混合物を、50mgのPEI塩基（2.5kDa）（20μmol）を含有する10mLのクロロホルム溶液に60℃でゆっくり添加し、撹拌しながら24時間反応させた。LCA-PEIコンジュゲート(2E')を、95%エタノール、続いて酸性脱イオン(DI)水に対する透析(分子量カットオフ(MWCO):1000Da)によって精製した。2E'又はPEIの蛍光標識のために、20mgの2E'又はPEIを、スルホ-cy5-NHS(1mg)を含有する無水エタノール(0.5mL)に分散させた。反応溶液を暗所で24時間撹拌し、1kDaの分子量カットオフを有する透析バッグを使用してDI水に対して透析した。2E'及びPEI塩基をDMSOに溶解し、BBFOプローブを備えたBruker DRX500-2 NMR分光計によって分析した。
2E'の臨界集合体濃度（CAC）の測定
2E'をDI水に2mg/mLまで溶解し、DI水によって段階的に1.5×10-5mg/mLまで希釈した。0.5mLの各溶液に、アセトン中の5μLのナイルレッド溶液(2mg/mL)を添加して、552nmでの励起よる636nmでの発光スペクトルを記録した。
2E'の細胞間相互作用
メスのBalb/cマウスから得たCT26細胞及び脾細胞を、3×105の密度でNunc（商標）ガラス底皿(Thermo Scientific社)に播種し、1時間インキュベートした。細胞をすすぎ、4%パラホルムアルデヒドで固定し、5μg/mLの小麦胚芽凝集素-Alexa Fluor(商標)647コンジュゲートで10分間染色し、Nikon A1R共焦点顕微鏡によって画像化した。
2E'/PTX及び2E'/PTX/siPD-L1の調製及び特性評価
2E'及びPTXの二元複合体(2E'/PTX)を調製するために、2E'及びPTXを、丸底フラスコ内のクロロホルム/エタノール混合物(3:1、v/v)中で異なる質量比で混合し、ロータリーエバポレーションによって乾燥させてフラスコの壁に薄膜を形成し、バス超音波処理によって5分間DI水中で水和させた。2E'/siPDL-1二元複合体を、室温で30分間、質量比を変えながらヌクレアーゼフリー水中で2E'及びsiPD-L1の同時インキュベーションによって調製した。2E'、PTX及びsiPD-L1の三元複合体(2E'/PTX/siPD-L1)を、室温で30分間、2E'/PTXをsiRNAとインキュベートすることによって調製した。三元複合体の形成を、1.1%のアガロースゲル電気泳動によって確認した。全ての複合体のサイズ及びゼータ電位を、Malvern Zetasizer Nano ZS90(Worcestershire、UK)によって測定した。それらの形態を、1%の酢酸ウラニルでネガティブ染色した後、FEI Tecnai T20透過型電子顕微鏡(Hillsboro、OR)によって調べた。
2E'/PTXからのPTXのin vitro放出
200μgのPTXに相当する1ミリリットルの2E'/PTX(2.5:1、w/w)又は2E'/PTX(5:1、w/w)を透析カセット(MWCO:10kDa)に入れ、15mLの0.2%のTween 80水溶液に入れ、一定の撹拌下で25℃にてインキュベートした。定期的な間隔で、放出培地全体を新鮮な培地と交換した。各時点でサンプリングした培地中のPTXの量を、Ascentis C18カラム(25cm×4.6mm、粒径5mm)を備えたAgilent 1100 HPLCシステム(Palo Alto、CA)によって分析した。移動相は水及びアセトニトリル(50:50)から構成され、1mL/分で流した。PTXを227nmの波長でUV検出器によって検出した。
腫瘍細胞におけるCRT発現
2×105個のCT26又はB16F10細胞を6ウェルプレートに一晩播種した。細胞培養培地を、様々な濃度で2E'、PEI、PTX、2E'/PTX又は2E'/PTX/siPD-L1を含有する培地と交換した。6時間又は24時間後、細胞を採取し、染色緩衝剤に再懸濁し、抗マウスCD16/32抗体とインキュベートして、Fc受容体への免疫グロブリンの非特異的結合を遮断し、Alexa Fluor 488コンジュゲート抗CRTモノクローナル抗体(ab196158、アブカム)で染色した。BD Accuri C6フローサイトメーターで分析する前に、細胞を0.5μg/mLのヨウ化プロピジウムと1分間インキュベートした。CRT曝露を視覚化するために、2×105個のCT26又はB16F10細胞を共焦点皿に播種し、異なる処理で24時間インキュベートし、洗浄し、上記と同じように染色し、4%のパラホルムアルデヒドで固定した。固定細胞の共焦点画像を、2μg/mLのHoechst 33342で簡単に染色した後、Nikon A1R共焦点顕微鏡(Nikon America社、Melville、NY)で撮影した。
BMDC及びBMDMの分化
骨髄由来樹状細胞(BMDC)及び骨髄由来マクロファージ(BMDM)をマウス骨髄細胞から分化させた。メスのBalb/c又はオスのC57BL/6マウス(7週齢)の大腿骨から骨髄を採取し、数回ピペッティングし、100及び40μmのセルストレーナーに通して単一細胞懸濁液を得た。500rcfでの8分間の遠心分離によって細胞を収集し、ACK溶解緩衝剤で処理し、すすぎ、100単位/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、10mMのβ-メルカプトエタノール、20ng/mLのマウスGM-CSF及び20%のウシ胎仔血清を補足したアルファ最小必須培地（MEM-アルファ、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、4mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム）中で培養した。7日後、浮遊細胞又は緩く付着した細胞を遠心分離によって収集し、APC抗マウスCD11c抗体標識によってBMDCとして同定した。付着細胞は、FITC抗マウスF4/80抗体標識によってBMDMとして同定した。
BMDC及びBMDMの刺激
BMDC又はJAWSII DC(ATCC)を、非組織培養物で処理した6ウェルプレートにウェル当たり2×105個でプレーティングし、3μg/mL又は7μg/mLで2E'又はPEIとインキュベートした。24時間のインキュベーション後、細胞を収集し、染色緩衝剤に再懸濁し、4℃で15分間、Fc遮断抗体とインキュベートし、4℃で20分間、抗マウスCD11c、CD86、CD40及びMHC-II抗体で標識し、BD Accuri C6フローサイトメーターによって分析した。処理したBMDC及びBMDMからのサイトカイン産生を測定するために、細胞を、ウェル当たり15,000個の細胞の密度で96ウェルプレートにプレーティングし、2E、PEI、2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg又は2E'/PTX/siPD-L1で処理した。24時間後、製造業者のプロトコールに従ってELISA(Invitrogen社、Carlsbad、CA)によって培地をIL-1β及びTNF-αについて分析した。
TLR-4及びTLR-5活性化アッセイ
2E'又はPEIによるTLR-4活性化を、THP1-XBlue(商標)-MD2-CD14細胞、TLR-4レポーター細胞(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を用いて評価した。TLR-5活性化を、HEK-Blue(商標)mTLR5細胞、TLR-5レポーター細胞(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を用いて試験した。TLR-4レポーター細胞を、RPMI培地中でウェル当たり100,000個の細胞の密度で96ウェルプレートにプレーティングした。TLR-5レポーター細胞を、HEK-Blue(商標)検出培地中でウェル当たり25,000個の細胞の密度で96ウェルプレートにプレーティングした。2E'、PEI、LCA又はリポ多糖(LPS)を様々な濃度で細胞に添加し、5%のCO2において37℃で24時間インキュベートした。分泌型胎児性アルカリホスファターゼ(SEAP)アッセイのために上清を収集した。SEAPの吸光度は620nmで測定した。
in vitro貪食
CT26又はB16F10がん細胞を、Cell Tracker Green(Invitrogen社、Carlsbad、CA)で１時間染色し、5μg/mLのPTXで24時間処理した。PTXで処理したがん細胞を収集し、計数し(2×105個)、7μg/mLの2E'を伴って又は伴わずに、Cell-Tracker Deep Red(Invitrogen社、Carlsbad、CA)で染色したBMDC、JAWSII DC又はBMDM(2×105個)と更に24時間共培養した。共培養した細胞を収集し、染色緩衝剤に再懸濁し、BD Accuri C6フローサイトメーター又はBD LSRFortessaフローサイトメーター(San Jose、CA、USA)によって分析した。PTXで処理したがん細胞を取り込むDC(がん細胞+DC又はマクロファージ)を、Cell-Tracker Deep Redで染色したBMDC、JAWSII DC又はBMDMにおける二重陽性細胞のパーセンテージとして、及び貪食したがん細胞を、Cell Tracker Greenで染色したがん細胞における二重陽性細胞のパーセンテージとして定量した。in vitroでのがん細胞貪食を可視化するために、PTXで処理したがん細胞(2×105個)を、7μg/mLの2E'を伴って又は伴わずに、Cell-Tracker Deep Redで染色したBMDC又はBMDM(2×105個)と24時間共培養し、Nikon A1R共焦点顕微鏡で画像化した。
細胞傷害性
CT26細胞、B16F10細胞、BMDC又は脾細胞を、ウェル当たり8,000個の細胞(CT26、B16F10)又はウェル当たり15,000個の細胞(BMBC、脾細胞）の密度で96ウェルプレートに播種した。24時間のインキュベーション後、細胞培養培地を、異なる濃度の2E、PEI、2E'/PTX又は2E'/PTX/siPD-L1処理物を含有する新鮮な完全培地と置き換えた。更に24時間のインキュベーション後、MTTアッセイ(CT26、B16F10)又はヨウ化プロピジウム(PI)染色(BMDC、脾細胞)によって細胞の細胞傷害性を測定した。MTTアッセイのために、処理物を100μLの新鮮な完全培地及び15μLの5mg/mLのMTT溶液と置き換えた。4時間のインキュベーション後、100μLの停止/可溶化溶液を細胞に添加し、一晩インキュベートした。溶解したホルマザンの吸光度を、SpectraMax M3マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社、Sunnyvale、CA)により560nmで読み取った。PI染色のために、処理物を除去し、細胞をPBSですすぎ、収集し、100μLの細胞染色緩衝剤に再懸濁した。BD Accuri C6フローサイトメーターによる分析の直前に、5マイクロリットル(40ng)のPI染色溶液を各試料に添加した。組合せ指数(CI)を、Compusyn(Combosyn社、Paramus、NJ)によって決定した。CI<1、CI=1及びCI>1の値は、それぞれ、相乗作用、相加作用、及び拮抗作用を表す53。
ゲル遅延度アッセイ
2E’/siPD-L1、2E'/PTX/siPD-L1又は2E'/PTX/pDNA複合体の形成を、アガロースゲル遅延度アッセイによって試験した。2E'又は2E'/PTXのsiPD-L1又はpDNAに対する質量比を変化させて複合体を調製した。1μgのsiRNA又はpDNAに相当する量の0.5μg/mLの臭化エチジウムを含有する1.1％のアガロースゲルに複合体をロードし、1×TAE緩衝剤中で60Vにて1時間流した。siRNA又はpDNAバンドを、Azure C300(Dublin、CA、USA)を使用して302nmで検出した。
PD-L1サイレンシング
CT26及びB16F10細胞を、2mLの培地を用いてプレート当たり105個の細胞の密度で6ウェルプレートにプレーティングし、24時間インキュベートした。PD-L1発現をIFN-γによって誘導した。PD-L1発現に最適なインキュベーション時間を決定するために、細胞を、IFN-γを添加してから、0、12、24、36及び48時間後に収集し、染色緩衝剤に再懸濁し、Fc遮断抗体とインキュベートし、抗マウスPD-L1抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
siPD-L1複合体のサイレンシング効果を評価するために、PD-L1発現に最適な条件で細胞をインキュベートし(25ng/mLのIFN-γと共にB16F10細胞を4時間、及び100ng/mLのIFN-γと共にCT26細胞を12時間)、PBS、血清含有培地中で2.66μg/mLのsiRNAに相当する、2E'/siPD-L1、2E'/siNeg（PD-L1サイレンシングに無関係なsiRNA）、2E'/PTX/siPD-L1又は2E'/PTX/siNegで12時間処理した。次いで、処理物を新鮮な培地と交換し、更に36時間インキュベートし、PD-L1発現をウェスタンブロットによって測定した。細胞を細胞溶解緩衝剤（Invitrogen社、Carlsbad、CA）によって溶解し、溶解物を4℃で、12,000gで20分間遠心分離して上清を分離した。上清中の総タンパク質含有量をBCAアッセイによって定量し、10mgのタンパク質に相当する試料をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲルローディング緩衝剤と混合し、95℃で5分間加熱した。試料を10%のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ウェル当たり100μgのタンパク質)によって分離し、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。膜を、5%の脱脂粉乳(pH7.4、20mMのTris、150mMのNaCl及び0.05%のTween 20)を含有するTBST緩衝剤中で室温にて遮断した。1時間後、供給業者の推奨に従って、膜を抗マウスPD-L1及びGAPDH抗体と4℃で24時間インキュベートした。膜を3回洗浄し、二次抗IgG-HRP抗体と室温で1時間インキュベートした。二次抗体とのインキュベーション後、膜を3回洗浄し、Azure C300(Dublin、CA)によってタンパク質バンドを検出した。
細胞取り込み
siPD-L1複合体の細胞取り込みを調べるために、2E’/siPD-L1、リポフェクタミン/siPD-L1及び2E'/PTX/siPD-L1を、Cy3で標識したsiPD-L1を用いて調製した。CT26細胞を、2×105の密度でNunc(商標)ガラス底皿(Thermo Scientific社)に播種し、24時間インキュベートした。血清含有培地中の66μg/mLのsiRNAに相当する、2E'/siPD-L1、Lipo/siPD-L1又は2E'/PTX/siPD-L1を、細胞と4時間又は6時間インキュベートした。細胞を洗浄し、4%のパラホルムアルデヒドで固定し、200nMのLysoTracker Green及び2μg/mLのHoechst 33342で染色し、Nikon A1R共焦点顕微鏡によって画像化した。
動物の購入及び管理
全ての動物手順は、実験動物の管理及び使用に関するNIHガイドラインに従って、Purdue動物実験委員会によって承認された。メスのBalb/cマウス(5～6週齢)及びオスのC57BL/6(5～6週齢)を、Envigo社(Indianapolis、IN、USA)から購入し、手順の前に1週間順応させた。
2E'-Cy7及びPEI-Cy7の腫瘍滞留
腫瘍内注射された2E'-Cy7及びPEI-Cy7の滞留をCT26モデルにおいて評価した。CT26腫瘍細胞(5×105個)を、Balb/cマウスの右後肢の上側腹部に皮下接種した。腫瘍が平均で100mm3まで成長すると、マウスに40μLの75μg/mLの2E'-Cy7又はPEI-Cyを腫瘍内注射した。2E'-Cy7及びPEI-Cy7の蛍光強度を、Spectral Ami Optical Imaging System(Spectral Instruments社、Tucson、AZ)によってモニタリングした。
両側CT26腫瘍を有するBalb/cマウスにおける抗腫瘍効果
2E’/PTX/siPD-L1の抗腫瘍効果を、側腹部に両側CT26腫瘍を保有するBalb/cマウスにおいて評価した。腫瘍を皮下接種によって両方の側腹部に同時に確立した。同じマウスの右後肢の側腹部に1×106個のCT26細胞を接種し、左側腹部に3×105個のCT26細胞を接種した。右側の腫瘍が平均で30～50mm3に達すると、マウスを、腫瘍内注射によって右側の腫瘍内に5%のデキストロース(D5W)、2E'、2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg又は2E'/PTX/siPD-L1を投与する異なる群に無作為に割り当てた。左側の処置した腫瘍及び未処置の腫瘍のサイズを、デジタルノギスで1日置きに測定し、腫瘍体積を(幅2×長さ)/2として計算した。
CT26腫瘍を有するBalb/cマウス及び生細胞の遅延させた再チャレンジにおける抗腫瘍効果
CT26腫瘍細胞(5×105個)を、Balb/cマウスの右後肢の上側腹部に皮下接種した。腫瘍サイズが平均で30～50mm3に達すると、マウスを、D5W、2E'、2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg又は2E'/PTX/siPD-L1の腫瘍内注射で処置した。腫瘍成長を上記のようにモニタリングした。抗腫瘍免疫が確立されているかどうかを試験するために、処置から30日までに腫瘍を完全に寛解した生存しているマウスに、対側の側腹部に1×105個の生CT26細胞を再チャレンジした。最初の再チャレンジに耐性があるマウスに、処置から60日目に2×106個の生CT26細胞を再びチャレンジした。2つの別々の実験では、生存しているBalb/cマウスを、処置後6日目又は17日目に一度再チャレンジした。
2E'/PTX/CDNを、CT26腫瘍を有するBalb/cマウスで試験した。腫瘍が平均で50～100mm3に成長すると、D5W、パクリタキセルナノ結晶及び遊離CDN混合物、並びに2E'/PTX又は2E'/PTX/CDNを腫瘍内注射によって投与し、腫瘍成長を80日にわたってモニタリングした。無腫瘍マウスに、処置後82日目又は140日目に対側の側腹部に1×105個の生CT26細胞又は4T1細胞を再チャレンジした。
C57BL/6マウスのB16F10腫瘍における抗腫瘍効果
B16F10腫瘍細胞(1×106個)を、C57BL/6マウスの右後肢の上側腹部に皮下接種した。腫瘍サイズが約150mm3に達すると、マウスを、D5W、2E'、2E'/PTX、2E'/PTX/siNeg又は2E'/PTX/siPD-L1の腫瘍内注射で処置した。腫瘍の成長を、サイズを測定することによってモニタリングした。無腫瘍マウスに、対側の側腹部に1×105個の生B16F10細胞を再チャレンジした。
両側B16F10腫瘍を有するC57BL/6マウスにおける抗腫瘍効果
1×106個及び1×105個のB16F10腫瘍細胞を、それぞれ、右及び左後肢の上側腹部に皮下接種した。右側の腫瘍が65～100mm3に成長すると、それを、D5W(n=6)、2E'/siPD-L1+PTX NC(n=8)、2E'/PTX/siNeg(n=9)及び2E'/PTX/siPD-L1(n=9)の単回腫瘍内注射で処置した。処置した腫瘍及び未処置の腫瘍の成長を、サイズを測定することによってモニタリングした。
Balb/cマウスの4T1同所性腫瘍における抗腫瘍効果
4T1-Luc細胞株は、Purdue UniversityのMichael Wendt教授から寄贈された。2.5×104個の4T1-LucをメスのBalb/cマウスの乳房脂肪体に接種した。腫瘍サイズが約50mm3に達すると、D5W、2E'/PTX/siNeg若しくは2E'/PTX/siPD-L1を腫瘍内注射によって投与したか、又は腫瘍を部分的若しくは完全な外科的切除によって除去した。腫瘍の成長を、サイズを測定することによってモニタリングした。更に、全身イメージングを、Spectral Ami Optical Imaging System(Spectral Instruments社、Tucson、AZ)によって実施して、腫瘍の成長の代わりにルシフェラーゼ発現を測定した。無腫瘍マウスに、対側の乳腺に2.5×103個の生4T1-Luc細胞を再チャレンジした。
脾細胞の単離
脾臓を健康なマウス又は腫瘍担持マウスから採取して脾細胞を単離した。採取した脾臓を小片に切断し、70μm及び40μmのセルストレーナーを通して連続的に濾過して単一細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を1mLの塩化アンモニウム-カリウム(ACK)溶解緩衝剤と3分間インキュベートして赤血球を除去した。
腫瘍特異的免疫
脾細胞の単一細胞懸濁液をゾンビ染料(zombie dye)で染色し、抗マウスCD16/32抗体とインキュベートして、Fc受容体への免疫グロブリンの非特異的結合を遮断し、次いで蛍光色素コンジュゲート抗体:iTAg四量体/APC-H-2 Kb TRP2(SVYDFFVWL、配列番号5)、FITC抗マウスCD8抗体(KT15)及びPE抗マウスCD3抗体(17A2)で標識した。標識した細胞をBD LSRFortessaフローサイトメーターによって分析した。
B16F10腫瘍担持マウスから採取した脾細胞を、MHC-I制限ペプチド抗原Trp2180-188(SVYDFFVWL、配列番号5)でチャレンジして応答を測定した。脾細胞を、100単位/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、10mMのβ-メルカプトエタノール、20ng/mLのマウスGM-CSF、及び20%のウシ胎仔血清を補足したMEM-アルファ培地に懸濁し、96ウェルプレートにウェル当たり1×106個の細胞で播種し、1～5μg/mLのTrp2ペプチドで刺激した。48時間のインキュベーション後、細胞を500rcfで8分間遠心分離して上清を収集した。各上清中のIFN-γ濃度をELISA(Biolegend社、San Diego、CA、USA)によって測定し、同じマウスから採取した非チャレンジ細胞の濃度と比較した。
腫瘍及びリンパ器官の免疫表現型検査
処置後7日目にB16F10腫瘍を有するC57BL/6マウスから腫瘍を採取し、2mg/mLのコラゲナーゼIV型、0.2mg/mLのDNase I及び0.2mg/mLのヒアルロニダーゼにより37℃で2時間処理し、シリンジプランジャーのゴム端で粉砕した。細胞懸濁液を、70μm及び40μmのセルストレーナーを通して連続的に濾過し、500×gで8分間遠心分離した。赤血球をACK溶解緩衝剤で除去した。単一細胞懸濁液をゾンビ染料で染色し、抗マウスCD16/32抗体とインキュベートしてFc受容体への免疫グロブリンの非特異的結合を遮断し、次いで蛍光色素コンジュゲート抗体:FITC抗マウスCD3抗体(17A2)、PE抗マウスCD4抗体(RM4-5)、APC抗マウスCD8a抗体(53-6.7)、FITC抗マウスCD11c抗体(N418)、APC抗マウスCD86抗体(GL-1)、APC抗マウスCD40抗体(3/23)、APC抗マウスMHC-II抗体(M5/114.15.2)又はFITC抗マウスF4/80抗体(BM8)で標識した。標識した細胞を、BD Accuri C6フローサイトメーター又はBD LSRFortessaフローサイトメーターによって分析した。
RNAシークエンシングアッセイ
ライブラリーの生成及びシークエンシング:C57BL/6マウスのB16F10腫瘍が約150mm3まで成長すると、マウスにD5W、2E'/PTX/siNeg又は2E'/PTX/siPD-L1の腫瘍内注射を投与した（0日目）。腫瘍を0日目に未処置動物から又は7日目に処置した動物から採取し、単一細胞懸濁液に消化した。細胞ペレットを2mLのTRK溶解緩衝剤に溶解し、全ての試料が収集されるまで凍結保存した。各TRK溶解物700μLを、RNeasy抽出キット(Qiagen社)を使用してRNA単離に進めた。NanodropによってRNA濃度を測定した。製造業者の使用説明書に従って、Universal Plus mRNA-Seqキット(Tecan社)を用いて、1マイクログラムのRNAを使用してライブラリーを生成した。単一のIllumina NovaSeq 6000 S4 300サイクル、v1.5ケミストリーのレーンを、ライブラリーのプールを用いてクラスター化し、ペアエンド2×150塩基リードを生成した。
リードのアダプター及びクオリティトリミング:プログラムfastp v.0.12.5を使用して、クオリティスコアに基づいてリードを更にトリミングし、アダプター配列を除去した54。最小クオリティスコアを30に設定し、トリミング後に50塩基より短いか、又は対にならなかったリードを廃棄した。0から開始するためにBAMアラインメントファイルにおいてタグHIを変更した、twopassMode Basicを使用してリードをアンサンブルハツカネズミ(Ensemble Mus musculus)ゲノムデータベースバージョンGRCm38.p6と整列させるためにSTAR v.2.5.4bを使用し、非標準スプライスジャンクションを除去した55。遺伝子にマッピングしたリードを、アンサンブルハツカネズミゲノムアノテーションを使用して遺伝子カウントマトリクスに一覧にするためにストランドモードでSubread v.2.0.2ソフトウェアモジュールfeatureCountsを使用した56。
統計解析:BioconductorパッケージedgeR v.3.24.3を使用して、疑似尤度の負の二項一般化対数線形モデルをカウントデータに適合させ、続いてジーンワイズ(genewise)統計的検定を行って、差次的に発現した遺伝子を特定した57、58。Benjamini-Hochberg誤検出率補正を使用して、多重検定のためにp値を補正した59。BioconductorパッケージBiomaRt v.2.38.060及びClusterProfiler v3.10.161を、遺伝子のアノテーションにおいて、並びに差次的に発現された遺伝子に対する経路及び遺伝子オントロジーエンリッチメント解析を実施する際に使用した(調整されたp値が0.05未満である場合、結果を有意であるとみなした)。
組織学
B16F10腫瘍を有するC57BL/6マウスからの臓器(心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び腫瘍）を、処置の7日後に採取し、10%の中性緩衝ホルマリン中で固定し、4μmの厚さに切片化した。心臓、肝臓、脾臓、肺及び腎臓の切片をH&Eで染色し、腫瘍切片をラット抗マウスCD8aモノクローナル抗体(eBioscience社、クローン4SM15)、続いてヤギ抗ラット二次抗体(Vector Labs社、MP-5444)、又はウサギ抗マウスPD-L1抗体(Novus biologicals社、クローン2096A)、続いてウマ抗ウサギ二次抗体(Vector Labs社、MP-5401)で染色した。スライドを、Tween(登録商標)20を含むトリス緩衝生理食塩水で2回すすぎ、ベクターimmPACT red(Vector Labs社、SK-5105)を20分間適用し、ヘマトキシリン対比染色、脱水及びカバースリップのためにLeica Autostainer XLに移した。画像を、Leica Versa8ホールスライドスキャナーを使用して撮影した。
統計解析
GraphPad Prism 9(La Jolla、CA)を用いて全ての統計解析を実施した。一元配置又は二元配置分散分析検定を用いて全てのデータを解析して、種々の群間の平均の統計的差異を決定し、続いて推奨される多重比較検定を行った。p<0.05の値は統計的に有意であるとみなした。
当業者は、上記の特定の実装に対して多数の修正を行うことができることを認識するであろう。この実装は、記載されている特定の制限に限定されるべきではない。他の実装も可能であり得る。
本発明を図面及び前述の説明で詳細に例示し、説明してきたが、これは例示的であり、特徴を限定するものではないとみなされるべきであり、特定の実施形態のみが、示され、記載されていること、並びに本発明の趣旨の範囲内にある全ての変更及び修正は、保護されることが望ましいことを理解されたい。本発明の方法及び組成物の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義されることが意図される。しかしながら、本開示は、その趣旨又は範囲から逸脱することなく、具体的に説明及び例示されたもの以外でも実施できることは理解されなければならない。以下の特許請求の範囲に定義される趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される実施形態に対する様々な代替案を、特許請求の範囲を実施する際に採用できることは当業者により理解されるべきである。
［参考文献］
Figure 2024515107000002
Figure 2024515107000003
Figure 2024515107000004
Figure 2024515107000005
Figure 2024515107000006

Claims (21)

  1. 免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体と、化学療法薬又は疎水性分子とを含む、抗腫瘍免疫療法又は診断ツールとしての組成物。
  2. マイクロRNA、メッセンジャーRNA、プラスミドDNA、低分子干渉RNA(siRNA)、オリゴヌクレオチド又は環状ジヌクレオチドを更に含む、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記siRNAがPD-L1 siRNAである、請求項2に記載の組成物。
  4. 前記化学療法薬又は疎水性分子が、パクリタキセル、ソラフェニブ、イトラコナゾール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、カンプトテシン、シスプラチン、オキサリプラチン、シタラビン、ビンクリスチン、イリノテカン、アンホテリシン、ニフルム酸、プロブコール、インドメタシン、ゲムシタビン若しくはそれらの薬学的に許容される塩、又は疎水性色素若しくはその塩である、請求項1に記載の組成物。
  5. 前記疎水性色素が、DiR';DiIC18(7)(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド）、シアニン7、シアニン5又はそれらの許容される塩を含む疎水性蛍光色素である、請求項4に記載の組成物。
  6. 前記ポリエチレンイミン誘導体が、リトコール酸(LCA)、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸又はそれらの許容される塩による修飾/コンジュゲートポリエチレンイミンである、請求項1に記載の組成物。
  7. 前記ポリエチレンイミンが、約2,500Da～約250,000Daの分子量範囲を有する、請求項1に記載の組成物。
  8. 腫瘍内に投与される、抗腫瘍免疫療法としての請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 全身投与される、抗腫瘍免疫療法としての請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物を、1つ又は複数の希釈剤、賦形剤又は担体と共に含む、医薬組成物。
  11. 免疫アジュバントとしてのポリエチレンイミン誘導体と、抗腫瘍剤とを含む治療有効量の組成物を、がんの緩和を必要とする対象に投与する工程を含む、前記がんを有する対象を治療する方法。
  12. マイクロRNA、メッセンジャーRNA、プラスミドDNA、低分子干渉RNA(siRNA)、オリゴヌクレオチド又は環状ジヌクレオチドを更に含む、請求項11に記載の方法。
  13. 前記siRNAがPD-L1 siRNAである、請求項12に記載の方法。
  14. 前記化学療法薬が疎水性化学療法分子である、請求項11に記載の方法。
  15. 前記疎水性化学療法薬が、パクリタキセル、ソラフェニブ、イトラコナゾール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、カンプトテシン、シスプラチン、オキサリプラチン、シタラビン、ビンクリスチン、イリノテカン、アンホテリシン、ニフルム酸、プロブコール、インドメタシン、ゲムシタビン若しくはそれらの薬学的に許容される塩を含む、請求項14に記載の方法。
  16. 前記ポリエチレンイミン誘導体が、リトコール酸(LCA)、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸又はそれらの許容される塩による修飾/コンジュゲートポリエチレンイミンである、請求項11に記載の方法。
  17. 前記ポリエチレンイミンが、約2,500Da～約250,000Daの分子量範囲を有する、請求項11に記載の方法。
  18. 抗腫瘍免疫療法としての請求項11から17のいずれか一項に記載の方法であって、前記組成物が腫瘍内に投与される、方法。
  19. 抗腫瘍免疫療法としての請求項11から17のいずれか一項に記載の方法であって、前記組成物が全身投与される、方法。
  20. 前記組成物がフィラメント形態で存在する、請求項1に記載の組成物。
  21. ポリエチレンイミン誘導体と、疎水性色素とを含む、診断目的のための組成物。
JP2023564458A 2021-04-20 2022-04-12 抗腫瘍免疫療法としての免疫機能担体、使用方法及び組成物 Pending JP2024515107A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163177150P 2021-04-20 2021-04-20
US63/177,150 2021-04-20
PCT/US2022/024332 WO2022225737A1 (en) 2021-04-20 2022-04-12 Immunofunctional carrier, methods of uses, and composition matters as an antitumor immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024515107A true JP2024515107A (ja) 2024-04-04

Family

ID=83722560

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023564458A Pending JP2024515107A (ja) 2021-04-20 2022-04-12 抗腫瘍免疫療法としての免疫機能担体、使用方法及び組成物

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4326328A1 (ja)
JP (1) JP2024515107A (ja)
KR (1) KR20230172544A (ja)
WO (1) WO2022225737A1 (ja)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10065710A1 (de) * 2000-12-29 2002-07-04 Bayer Ag Arzneimittel enthaltend ein Polyamin als Wirksubstanz
CN100532459C (zh) * 2004-02-18 2009-08-26 财团法人川村理化学研究所 有机无机复合纳米纤维、有机无机复合结构体以及它们的制备方法
US7964571B2 (en) * 2004-12-09 2011-06-21 Egen, Inc. Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases
KR101460204B1 (ko) * 2013-01-08 2014-11-10 한국과학기술원 친수성 핵산 유전자를 유기용매에 가용화시키고, 이를 소수성 미립자에 봉입한 제어방출형 유전자 전달용 복합체와 이의 제조방법
CA2987519A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Yale University Delivery vehicles
KR102450367B1 (ko) * 2015-07-01 2022-10-04 포항공과대학교 산학협력단 형광성 나노입자 복합체 및 이를 이용한 세포 표지 방법
FR3058061A1 (fr) * 2016-10-27 2018-05-04 Selexel Nouvelle utilisation d'oligonucleotides double brin

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230172544A (ko) 2023-12-22
EP4326328A1 (en) 2024-02-28
WO2022225737A1 (en) 2022-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Rational design of polymeric hybrid micelles to overcome lymphatic and intracellular delivery barriers in cancer immunotherapy
KR102627347B1 (ko) 면역 요법을 위한 코어/쉘 구조 플랫폼
WO2021021634A1 (en) Nanomaterials containing constrained lipids and uses thereof
Wang et al. Polymer-lipid hybrid nanovesicle-enabled combination of immunogenic chemotherapy and RNAi-mediated PD-L1 knockdown elicits antitumor immunity against melanoma
WO2018067302A2 (en) Therapeutic effects of cellular delivery of small molecules and macromolecules with liposomal spherical nucleic acids
US20220054633A1 (en) Nanoparticles, controlled-release dosage forms, and methods for delivering an immunotherapeutic agent
EP2599866B1 (en) Novel nucleic acid having adjuvant activity and use thereof
Yan et al. A redox‐responsive nanovaccine combined with a2a receptor antagonist for cancer immunotherapy
Tang et al. A simple self-assembly nanomicelle based on brain tumor-targeting peptide-mediated siRNA delivery for glioma immunotherapy via intranasal administration
JP2021509674A (ja) 治療を強化するための細胞会合免疫アジュバント
Levy et al. Multi-immune agonist nanoparticle therapy stimulates type I interferons to activate antigen-presenting cells and induce antigen-specific antitumor immunity
JP2022541586A (ja) 多層ｒｎａナノ粒子
Xue et al. A transformable nanoplatform with multiple therapeutic and immunostimulatory properties for treatment of advanced cancers
CN112898579B (zh) 一种高分子材料、混合胶束及其制备方法和应用
Qu et al. Drug-drug conjugates self-assembled nanomedicines triggered photo−/immuno-therapy for synergistic cancer treatments
CN113197860A (zh) 聚合物囊泡纳米sting激动剂及其制备方法与应用
JP2023512707A (ja) Ｒｎａ負荷ナノ粒子およびがんの治療のためのそれらの使用
Gou et al. Non‐Pore Dependent and MMP‐9 Responsive Gelatin/Silk Fibroin Composite Microparticles as Universal Delivery Platform for Inhaled Treatment of Lung Cancer
JP2024515107A (ja) 抗腫瘍免疫療法としての免疫機能担体、使用方法及び組成物
US20240180849A1 (en) Immunofunctional carrier, methods of uses, and composition matters as an antitumor immunotherapy
JP6358661B2 (ja) 界面活性剤様化合物
US20230147733A1 (en) Oxidized tumor cell lysates encapsulated in liposomal spherical nucleic acids as potent cancer immunotherapeutics
Li et al. Multifunctional liposomes remodeling tumor immune microenvironment for tumor chemoimmunotherapy
US11446390B2 (en) Antigen capturing nanoparticles for use in cancer immunotherapy
WO2020158863A1 (ja) アントラサイクリン系化合物を含むミセル剤と免疫賦活剤との組み合わせ医薬