KR102627347B1 - 면역 요법을 위한 코어/쉘 구조 플랫폼 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 mRNA 분자 집단을 포유동물 세포로 전달하기에 적합한 생체 적합성 코어/쉘 조성물이 개시한다. 개시된 코어-쉘 구조화된 다중-성분 조성물은 하나 이상의 암-또는 종양-특이적 항원을 코딩하는 mRNA, 예를 들어 인간 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포를 포함하는 항원 제시 세포 집단에 전달하기 위해 최적화되어 있다. 암의 치료 백신으로서 이들 조성물을 사용하는 방법이 또한 개시되어있다.

Description

면역 요법을 위한 코어/쉘 구조 플랫폼
본 발명은 분자 생물학, 종양학 및 특히, mRNA 백신에 최적화된 다중-성분 조성물의 분야에 관한 것이다. 이들 조성물을 포함하는 제제 및 약제는 포유동물에 mRNA-기반 백신을 효율적으로 전달하는 방법뿐만 아니라, 포유동물에서 영향을 미치는 하나 또는 그 이상의 암 또는 종양의 증상을 치료 및/또는 개선하는 방법을 개시하고 있다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 발명은 PCT Int. Pat. Appl. No. PCT/US2018/015601 (출원중; Atty. Dkt. No. 37182.215WO01과 동시에 출원됨), 및 미국 Provisional Pat. Appl. No. 62/451,575, 01. 27, 2017일자로 출원된 (출원중; Atty. Dkt. No.37182.215PV01)에 대해 우선권을 주장했고, 그 전체 내용이 본 명세서에에 명백히 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 대한 진술
본 발명은 미국 국방부에 의해 수여된 허가 번호 W81XWH-12-1-0414; 및 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여된 허가 번호 1R01-CA193880-01A1 및 U43-CA210181에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
공동 연구 계약 당사자 이름
적용되는 사항 없음.
관련 기술의 설명
치료용 백신
백신은 일반적으로 신체의 면역계에 의해 인식될 수 있는 항원 및 신체의 면역 반응을 촉진 시킬 수 있는 하나 이상의 보조제(아쥬반트)로 구성된다. 그러나 치료용 암 백신은 감염성 질병을 예방하기 위해 사용되는 예방 백신과는 완전히 다르다. 치료용 백신은 병원체와 싸우는 항체를 생산하는 대신 암세포를 죽이는 면역 세포를 생성할 수 있을 만큼 강력해야 하기 때문이다. 치료용 백신은 암과 전염병을 포함한 여러 유형의 생명을 위협하는 질병의 치료에 큰 잠재력을 가지고있다. 암 예방 접종의 성공 여부를 결정하는 주요 문제는 선택한 항원에 대한 항 종양 반응의 강력한 유도이다. 단백질 펩티드 및 DNA 플라스미드는 전통적으로 백신 개발을 위한 항원으로 사용되어왔다 (Melero et al., 2014; Schwartzentruber et al., 2011; Kantoff et al., 2010). 단백질 및 펩티드는 비교적 제조하기 쉽고 대규모로 생산될 수 있다. 그러나 항원 펩티드의 선택은 환자의 고유한 유형의 주조직 적합성 복합체(MHC) 단백질에 의존하므로, 개별 환자와 일치하도록 맞춤화될 필요가 있다. 반면에 DNA 백신은 역가가 낮고 통제되지 않은 게놈 통합 위험이 있다 (McNamara et al., 2015).
mRNA -기반의 암 백신
mRNA는 최근 치료 암 백신을 위한 이상적인 항원 공급원으로 등장했다 (Sullenger and Nair, 2016). mRNA 분자는 다수의 항원을 암호화하고 항원 제시 세포에서 Toll-like receptor(TLR) 신호를 유발함으로써 보조제(아쥬반트) 역할을 할 수 있다 (Heil et al., 2004; Diebold et al., 2004). 또한, 핵 전좌 및 전사가 필요하지 않기 때문에 비 분열 세포에서 mRNA-매개 유전자 전달이 발생할 수 있으며, 플라스미드 DNA-매개 유전자 전달은 세포 분열에 주로 효과적이다 (McNamara et al., 2015; Kallen and Thess, 2014) ).
음으로 하전 된 mRNA 분자는 항원-제시 세포로 직접 들어갈 수 없기 때문에, mRNA-기반 백신은 일반적으로 전기 천공(electroporation)에 의해 mRNA 분자를 환자-유래 수지상 세포(DC)로 형질 감염시켜 제조된다(Van Tendeloo et al., 2001). 이어서, DC 백신을 종양 항원 합성, 가공 및 제시를 위해 환자에게 다시 도입한다. 많은 DC 백신이 임상 시험의 여러 단계에 도달했다 (Wilgenhof et al., 2013). 그러나, 치료 백신의 상용을 위한 대량 생산이 되지는 않았다.
mRNA 백신을 제조하기 위한 대안적인 접근법은 mRNA 분자를 나노 입자에 포집시키고 항원-제시 세포에 의해 백신이 흡수되는 체내로 직접 접종하는 것이다. 이 접근법은 항원-제시 세포의 높은 식작용 능력을 이용한다. 프로타민-축합 mRNA 백신은 이 그룹에서 중요한 부분을 구성하며, 이들 중 몇몇은 전임상 연구 및 임상 시험의 상이한 단계에 있다(Weide et al., 2009). 프로타민으로 mRNA를 패키징하면 백신 입자의 세포 흡수가 가능할 뿐만 아니라 숙주 세포에서 MyD88-의존적 TLR-7/ 8 신호의 자극이 촉진된다 (Scheel et al., 2005). 그러나, 어떤 것으로도 포집되지 않은 mRNA의 일부가 체액에 노출되고 혈장 및 조직 RNase에 의한 공격에 취약하기 때문에, mRNA 분해는 잠재적인 관심사이다. 또한, 비-항원 제시 세포에 mRNA 분자의 노출은 체내에서 부작용을 유발할 위험이 있다.
종래 기술의 결함
산업 및 학계는 효과적인 치료 암 백신을 개발하기 위해 오랫동안 노력해 왔지만 지금까지 거의 성공하지 못했다. 전임상 및 임상 연구에서 시험 되고 있는 치료 암 백신의 한 유형은 핵심 구조(~ 20 나노 미터에서 수백 나노 미터까지)로 응축된 mRNA 분자로 구성된 mRNA 백신이다. 일단 항원-제시 세포에 의해 mRNA 백신이 흡수되면, mRNA는 이들 세포 내로 방출된 후, 인코딩된 항원(들)을 생성하기 위한 주형으로서 사용된다. 이러한 백신의 예로는 CuraVac mRNA 백신이 있다.
이러한 백신의 주요 문제점은 1) mRNA 분자가 체액에 노출되어 조직, 세포 및/또는 혈장 효소에 의한 분해에 취약하다; 2) "어떤 것으로도 포집되지 않은 naked mRNA 분자는 모든 유형의 면역 세포와 상호 작용할 수 있으며, 이는 원치 않는 부작용(예: 높은 수준의 사이토카인 분비)을 유발할 수 있다; 3) 이러한 mRNA는 항원-제시 세포에 의해 매우 효과적으로 내재화되지 않는다.
종양 관련 신생 항원은 면역원성 종양 돌연변이를 예측하는 데 있어서 대량의 암 게놈 시퀀싱 노력 및 기술 발전의 결과로서 지속적으로 확인되고 있다(참조 : Schumacher and Schreiber, 2015; Shukla et al., 2015; Yadav et al. , 2014). 이 자료는 새롭고 개선된 암 백신을 개발할 수 있는 전례 없는 기회를 제공했다. 불행하게도, 암 백신을 위한 기술의 개발은 지연되었다.
그러나 본원에 개시된 것들과 같은 면역 요법은 암 치료제에 대한 새로운 길을 나타낸다. 이들 치료제는 특정 암세포의 독특한 유전적 특징에 기초할 수 있으므로, 통상적인 표준 치료 화학 요법 약물에 의한 불필요한 공격으로부터 신체를 보호할 수 있다. 본원에 개시된 mRNA-기반 백신은 동일한 컨스트럭트 내에 다수의 신생 항원을 포함하는 유연성을 가지며, 항원 펩티드(들)의 선택(들)은 개별 환자의 고유한 돌연변이 스펙트럼에 기초하여 "정밀화되거나 또는 "개인 맞춤화"될 수 있다.
발명의 요약
본원에 기술된 생체 적합한 쉘/코어 다중-성분 백신 전달 플랫폼은 일반적 의미에서 mRNA를 효과적으로 전달하고, 항암 면역을 자극하는 방법에서 항원 제시 세포(수지상 세포와 같은)에 의해 효과적으로 흡수되기 위한 조성물을 제공하여 당업계의 한계를 극복함에 있어서 중요한 진보를 나타낸다.
전체 및 일반적인 의미에서, 개시된 코어/쉘 조성물은 "코어" 구조 내에 패키징된 핵산 분자(예를 들어, 하나 이상의 암-또는 종양-특이적 항원을 코딩하는 mRNA를 포함하여)를 효율적으로 전달할 수 있고, 외부 친수성 지질 이중층-함유 "쉘"을 하나 이상의 선택된 포유동물 세포(예를 들어, 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포와 같은 하나 이상의 항원-제시 세포를 포함함)에 캡슐화하여 제한 없이 포함한다. 내부 소수성 코어를 캡슐화하는 친지질성(lipophilic) 쉘은 조직 효소에 의한 핵산의 분해 또는 다른 면역 세포와의 상호 작용으로부터 보호한다. 또한, 친지질성(lipophilic) 쉘은 항원-제시 세포에 의해 조성물의 내재화를 증가시키고, 통상적인 mRNA- 기반 치료 백신에 비해 강력한 항-종양 면역을 자극한다.
기존 기술보다 중요한 발전에서, 개시된 코어/쉘 다중-성분 백신 전달 시스템은 기존의 mRNA 기반 백신을 구성하는 단일-성분 "코어+핵산 만" 포함한 구조체보다 우수한 강력한 항-종양 면역을 자극함으로써 mRNA-기반 암 백신 개발에서 현재 "병목 현상"에 대한 대안을 제시한다. 이러한 다중-성분, 친수성/소수성 쉘/코어는 수지상 세포 성숙을 자극하는 데 있어서 통상적인 mRNA 백신보다 현저하게 더 강력한 mRNA 백신의 제조를 가능하게 하고, 따라서 항원 처리 및 제시를 용이하게 한다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 인터페론-β, 인터페론-α 및 인터루킨 -12를 자극하는데 있어서 통상적인 mRNA-코어 백신보다 현저하게 더 강력한 코어-쉘 구조화된 mRNA 백신을 제공한다. 이러한 다중-성분 mRNA-기반 종양 항원-암호화 치료 백신은 포유동물에서 하나 이상의 질병의 치료, 특히 포유동물 암의 하나 이상의 증상의 치료 및/또는 개선을 위한 약제의 제조에 특히 사용된다.
조성물은 적어도 제1 종양 항원을 인코딩하는 mRNA 분자 집단을 포함하는 치료 암 백신을 포함하며, 집단은 적어도 제1 양전하로 하전된 중합체를 포함하는 복수의 폴리플렉스 코어 입자 내에 포함되며, 여러 개의 폴리플렉스 코어 입자는 제1 생체 적합성 지질 이중층 쉘에 캡슐화된다.
바람직하게는, 제1 생체 적합성 지질 이중층 쉘은 제한 없이 인간 수지상 세포, 인간 대식세포 및 인간 B 세포를 포함하는 하나 이상의 포유동물 항원-제시 세포에 의해 복수의 폴리플렉스 코어 입자의 대음세포작용(macropinocytosis)를 용이하게 한다.
이러한 조성물은 또한 하나 이상의 보조제, 예컨대 CpG, 폴리(I:C), 명반, 사이클릭 GMP-AMP(cGAMP), 리포폴리사카라이드(LPS), 모노포스포릴 지질 A (MPLA) 또는 생체 적합성 지질 이중층 내에 캡슐화되거나, mRNA 코어 내에 함유되거나, 코어 입자와 이들을 둘러싸고/포괄하는 포위 친수성 인지질 이중층 사이의 공간 내에 포함되는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구체 예에서, 코어 입자를 제조하는데 사용되는 양으로 하전 된 제제는 하나 이상의 프로타민, 폴리에틸렌이민, 폴리-(B- 아미노 에스테르), 폴리-아르기닌, 폴리-리신 및 이들의 조합을 포함 할 것이다.
유사하게, 친수성 쉘 성분을 제조하는데 사용된 생체 적합성 인지질은 바람직하게는 1,2- 디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(EDOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올아민(DOPE); 1,2-디스테아르오일-sn-글리세로-3- 포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG); 1,2-디팔미토일 -sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올 아민(DPPE), O 에틸포스파티딜콜린(EDPPC), 콜레스테롤 및 이들의 조합의 하나 또는 하나 이상을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 생체 적합성 인지질 이중층은 바람직하게는 다음을 포함할 것이다 :
(a) 약 30% 내지 약 70%의 1,2- 디오레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린("EDOPC");
(b) 약 70% 내지 약 30%의 1,2- 디오레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올 아민("DOPE"); 또는
(c) 약 0.5 내지 약 5%의 1,2- 디스테아르오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올 아민­N-[아미노 (폴리에틸렌글리콜)-2000]("DSPE-PEG").
대안적으로, 생체 적합성 지질 이중층은 바람직하게는 다음을 포함할 수 있다 :
(a) 약 45% 내지 약 55%의 EDOPC;
(b) 약 55% 내지 약 45%의 DOPE; 및
(c) 약 1% 내지 약 2%의 DSPE-PEG.
본 발명의 실시에서, 본원에 개시된 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 포유동물 암 또는 종양 세포에 특이적인 하나 이상의 항원을 암호화하는 mRNA와 같은 핵산 분자 집단을 포함할 것이다. 예시적인 암 세포-특이적 항원은 종양-관련 항원, 예컨대 유방암-특이적 HER2 항원 E75 및 p66, 흑색종-특이 적 항원 TRP2, 및 유방암 및 폐암에서 엑손 20 [HER2YVMA]에 YVMA 삽입을 갖는 HER2, 및 암 게놈에서의 돌연변이의 결과로서 생성된 것들과 같은 종양 돌연변이 항원 [신생 항원]을 포함한다. 예시적인 암-및 종양-특이적 항원은 HER2E75, HER2p66, HER2YVMA 및 TRP2를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 조성물은 바람직하게는 적합한 포유동물 세포 내로 도입될 때 type I 인터페론(IFN-1) 발현 수준을 증가시키는데 적합하고; 바람직하게는 하나 이상의 IFN-α4, IFN-β 및 그의 하류 사이토카인, 예컨대 CCL-5의 발현을 증가시키는 데 적합하다.
특정 실시 양태에서, 개시된 조성물은 하나 이상의 유형의 포유동물 세포 집단으로 도입하기에 적합할 것이다. 이러한 세포는 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 암 세포 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 조성물은 예를 들어 면역 조절제, 항신생물제(antineoplastic agent), 신경 활성제, 세포 독성제, 세포 증식제, 항염증제, 항 지질제, 호르몬, 수용체 작용제, 수용체 길항제, 항 감염제, 단백질, 펩티드 항체, 항원 결합 단편, 효소, RNA, DNA, siRNA, mRNA, 리보자임, 호르몬, 보조 인자, 스테로이드, 안티센스 분자 또는 이들의 조합과 같은 제제의 하나 또는 그 이상의 추가 치료제를 이에 제한되지 않고 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 면역 조절제는 IL-12p70, 단백질, FLT3 리간드 [FLT3L], 및 인돌아민 2,3-디옥시게나제[IDO-1]의 작은 분자 억제제, 예컨대 GDC-0919 또는 INCB24360로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다.
특정 실시 양태에서, 치료제는 시클로포스파미드, 독소루비신, 5-플루오로 우라실, 도세탁셀, 파클리탁셀, 트라스투주맙, 메토트렉세이트, 에피루비신, 카보 플라틴, 비노렐빈, 카페시타빈, 젬시타빈, 미톡산트론, 이사베필론, 에리부린, 라파티닙, 카르무스틴, 질소 머스타드, 황 머스타드, 플라틴 테트라 니트레이트 (예를 들어, 시스플라틴), 빈블라스틴, 에토포시드, 캄프토테신 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
다른 구체 예에서, 조성물은 예를 들어 세포에 의해 개별적으로 (즉, 상이한 mRNA 분자로부터) 또는 함께 [즉, 하나의 mRNA 분자로부터] 생성되는 다수의 항원성 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항원, 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 항원 펩타이드 단편을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 이러한 항원은 가용성일 수 있으며, 여기서 코어의 외부에 의해 정의된 바와 같이 내강 또는 부피로 통합될 수 있고, 외부 지질 이중층의 내부 표면, 또는 불용성 항원의 경우 코어 내, 및/또는 지질 이중층 자체 내에 포함될 수 있다.
가용성 항원의 예는 p66 HER2 항원 펩티드(HER2p66), 및 이의 상동체 또는 항원성 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
약하게 가용성인 항원의 예는 E75 HER2 항원 펩티드(HER2E75), 및 이의 상 동체 또는 항원성 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 암 백신 전달 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 완충제, 희석제, 전달체 또는 부형제 또는 하나 이상의 계면 활성제, 리포좀, 니오좀, 에토좀, 트랜스퍼좀, 인지질, 스핑고좀, 엑소 좀 또는 세포 자체에 의해 생성되는 다른 유형의 소포와 혼합될 수 있다.
이러한 조성물은 바람직하게는 포유 \동물에의 전신 투여, 바람직하게는 피하 또는 정맥 내 투여, 근육 내, 복막 내, 결절 내 또는 안구 내 투여, 또는 대안 적으로, 인간에 대한 피부 패치, 특히 인간 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포를 포함 하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 항원-제시 세포와의 접촉 및 흡수를 위해 제형화된다.
특정 실시 양태에서, 개시된 mRNA-기반 백신 조성물은 조성물을 포함하는 치료용 키트의 일부로 이용 및 수정될 수 있으며, 인간 암 환자와 같이 포유동물에게 조성물의 투여를 위한 지침의 첫번째 세트가 필요할 수 있다. 이러한 키트는 암의 과증식성 장애, 또는 포유동물의 다른 질환, 기능 장애, 부상 또는 비정상 상태의 예방, 진단, 치료 또는 개선을 위한 요법의 일부로 이용될 수 있으며, 감염성 질환(예: 웨스트 나일 바이러스 및 샤 가스 백신), 심혈관 질환(예 : 심부전을 예방하기위한 HSP60 백신) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 개시 내용의 추가의 측면은 본 발명의 방법이 필요한 동물에서 암의 하나 이상의 증상을 치료 또는 개선하기 위한 방법이다. 전체적이고 일반적인 의미에서, 이러한 방법은 일반적으로 동물을 치료 또는 개선하기에 충분한 시간동안 유효량의 본원에 개시된 하나 이상의 mRNA-기반 치료 암 백신 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 적어도 포함한다. 동물에서 암 이상의 증상. 일부 실시 양태에서, 암은 내화성, 전이성, 재발 또는 치료 저항성 암으로 진단되거나 이를 식별할 수 있다.
이러한 암의 예는 유방암, 폐암, 대장암, 위암, 췌장암, 교모세포종, 두경부암, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 간암, 신장암, 방광암, 흑색종 및 영향을 받는 포유동물의 관련된 조건을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 실시 양태에서, 암은 전이성 유방암, 전이성 폐암, 전이성 흑색종 또는 전이성 대장암, 위암, 췌장암, 교모세포종, 두경부암, 간암, 신장암, 방광암, 또는 영향을 받는 포유동물의 관련된 조건과 같은 전이성 암일 수 있다.
이러한 방법은 임의로 단일 투여 또는 1일 이상, 1주 이상, 또는 1개월 이상 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 치료 유효량의 방사선 또는 추가 화학 요법제를 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 방법은 또한 임의로 제2의 화학 요법제 또는 제2의 다른 치료 암 백신을 치료중인 영향을 받는 포유동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 개시 내용은 또한 활성 제제, 특히 하나 이상의 항암 항원, 또는 이러한 항암 항원을 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 하나 이상의 세포 조직에 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 이를 필요로하는 포유동물 개체, 본원에 개시된 하나 이상의 조성물을 mRNA 백신을 세포 집단(예를 들어, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포)에 투여하기에 효과적인 양 및 시간으로 제공하는 단계를 포함한다. 상기 세포 집단은 피험자의 신체 내 또는 주위에 하나 이상의 선택된 조직, 기관, 시스템 또는 세포에 존재한다. 특히 바람직한 구체 예에서, 상기 개체는 인간이고, 조성물은 외부 지질 이중층 내에 포함된 폴리플렉스 코어 입자 집단 내에 함유된 mRNA 항원-암호화 성분을 포함한다.
개시된 조성물은 다양한 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 치료 요법에서 특별한 유용성을 발견하고, 이들은 단독으로, 또는 대안적으로, 제한 없이, 하나 이상의 항암 항원(들), 하나 이상의 항원 펩티드, 하나 이상의 진단 시약, 하나 이상의 치료제, 하나 이상의 세포 독성 시약, 하나 이상의 화학 요법제, 하나 이상의 보조제, 하나 이상의 면역 자극제, 하나 이상의 면역 조절제, 또는 이들의 임의의 조합을 제한 없이 포함하고, 하나 이상의 인간 암, 과다증식성 장애, 감염성 질환, 심장병 증상 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 치료 또는 개선을 포함하는 치료적 지시의 용도를 위한 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 개시된 백신 시스템은 하나 이상의 활성제, 예를 들어 하나 이상의 예방제, 하나 이상의 치료제, 하나 이상의 진단제, 하나 이상의 백신, 하나 이상의 영상화제, 하나 이상의 방사성 표지, 하나 이상의 보조제, 하나 이상의 화학 치료제, 하나 이상의 세포 독성제, 하나 이상의 체크 포인트 억제제 약물[예를 들어, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체 등], 또는 이들의 임의의 조합을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
관련된 실시예에서, 본 발명은 또한 전형적으로 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 하나 이상의 장치와 조합하여 본원에 개시된 하나 이상의 코어/쉘 기반 mRNA 백신 전달 시스템을 포함하는 치료 및/또는 치료 키트를 제공한다. 조성물을 원하는 대상에게 투여하기 위한 것뿐만 아니라, 암 등의 포유동물 질환의 진단 또는 치료에 조성물을 사용하기 위한 하나 이상의 지시 세트를 포함한다.
본 발명은 또한 mRNA 분자 집단을 포유류의 체내의 포유동물 세포 집단(예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, B 세포 또는 종양 세포 포함)에 효과적으로 전달하기 위한 전체적 및 일반적인 의미의 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 바람직하게는 개체에서 하나 이상의 질환 또는 비정상 상태를 치료 또는 개선하기에 효과적인 양 및 시간으로 포유동물 개체에게 투여된다. 특정 실시 양태에서, 개체는 예를 들어 하나 이상의 암 또는 다른 과증식성 장애를 포함하는 하나 이상의 비정상 세포 증식 상태를 가질 위험이 있거나, 진단되거나, 또는 의심되는 것으로 여겨진다.
본원에 언급된 바와 같이, 본 개시 내용의 조성물은 정맥 내, 피부, 피하, 또는 개체의 신체 내부 또는 주위의 하나 이상의 세포, 하나 이상의 조직, 기관 또는 종양에 직접 주사하는 것과 같은 임의의 하나 이상의 통상적인 투여 방법을 통해 개체에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 추가로 기재된 바와 같이, 특정 적용에서, 생체 외에서 개체로부터 수득된 세포 집단을 본원에 개시된 백신 조성물과 접촉시킨 후, 생성된 접촉된 세포를 개체의 체내로 재도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 생체 외 치료법은 특히 개시된 mRNA 백신을 인간 수지상 세포 집단에 도입하여 활성 성분을 세포와 접촉시킨 후 생성된 형질전환된 세포를 동물의 체내로 다시 도입하는 데 유용할 것으로 생각된다. 바람직하게는, 그러한 생체 외 조작에 사용하기 위해 추출된 수지상 세포는 치료를 받는 실제 환자의 세포일 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 mRNA 백신 조성물은 제약 투여, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위해 제제화 될 수있다. 이러한 조성물은 하나 이상의 추가의 치료제, 화학 요법제, 보조제 또는 제2의 별개의 mRNA 백신을 추가로 포함할 수있다.
본원에 개시된 mRNA 백신은 또한 시험관 내에서 사용되어 집단 종양 항원-특이적 T 세포를 확장시킬 수 있다. 적용의 예는 종양 항원-특이적 T 세포가 환자에게 다시 주입되기 전에 종양 항원-특이적 T 세포의 집단을 확장시키기 위해 인간 환자-유래 T 세포와 공동 배양하는 것이다.
또한, 개시된 mRNA 백신은 또한 T 세포 엔지니어링을 위한 종양 항원-특이 적 T 세포 수용체를 단리 하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA 백신-함유 수지상 세포와 인간 T 세포의 공동-배양 및 이로부터 높은 결합 능력을 갖는 T 세포를 단리 하는 것이 있다. T 세포가 분리되면, 그들의 T 세포 수용체는 시퀀싱에 의해 결정될 수 있고, TCR-T 세포(암 면역 요법의 또 다른 분지)를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 측면을 설명하기 위해 포함된다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 하나 이상의 도면을 포함한다. 이 특허 또는 컬러 응용 프로그램과 함께 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 비용을 지불하면 사무실에서 제공할 수 있다.
본 발명의 원리의 이해를 증진시키기 위해, 이제 도면에 도시된 실시예 또는 예를 참조할 것이며, 이를 설명하기 위해 특정 언어가 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 이에 의해 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해될 것이다. 설명 된 실시예에서의 임의의 변경 및 추가의 수정, 및 본 명세서에 설명된 본 발명의 원리의 임의의 추가 응용은 본 발명이 관련된 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 일어날 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명은 첨부 도면과 관련하여 다음의 설명을 참조하여 더 잘 이해 될 수 있으며, 도면에서 유사한 참조 번호는 유사한 요소를 식별한다:
도 1A, 도 1B, 도 1C, 도 1D, 도 1E, 도 1F, 도 1G, 도 1H, 도 1I, 도 1J, 도 1K 및 도 1L 은 리포 폴리플렉스 mRNA 백신의 구조 및 특성을 보여준다. 도 1A는 본 개시 내용의 한 측면에 따라 제조된 리포 폴리플렉스-mRNA 기반 백신의 개략도이다. 예시적인 백신은 양으로 하전 된 PbAE 중합체와 음으로 하전 된 mRNA 분자 사이의 정전기적 상호 작용을 통해 조립된 폴리 플렉스 소유성(lipophobic) "코어"로 구성된다. 이어서, 생성된 폴리플렉스-mRNA 코어는 친수성 지질 이중층 "쉘"로 캡슐화된다. 도 1B는 예시적인 폴리플렉스-mRNA 결합에 대한 겔 지연 분석을 보여준다. 샘플은 free mRNA, 10, 20, 30 및 40의 폴리플렉스/mRNA(wt./wt.) 순서로 로딩되었다. 도 1C, 도 1D 및 도 1E는 빈(empty) 리포좀 쉘(도 1C), 폴리플렉스/ mRNA 코어(wt./wt.=20)(도 1D) 및 리포 폴리플렉스/mRNA 코어-쉘 구조 (도 1E)의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 도시한 것이다. 도 1F, 도 1G, 도 1H, 도 1I, 도 1J 및 도 1K는 mRNA-패키징된 입자로 처리된 DC2.4 세포에서의 eGFP 발현을 예시한다. DC2.4 세포는 PBS 대조군(도 1F), PbAE/eGFP mRNA 코어(도 1G), EDOPC/DOPE 패키징된 PbAE/eGFP mRNA(도 1H), DOTAP/Chol 패키징된 PbAE/eGFP mRNA(도 1I), CHEMS/DOPE/R8-패키징된 PbAE/eGFP mRNA(도 1J) 또는 프로타민/eGFP mRNA 코어(도 1K)로 처리되었고, eGFP 발현은 24시간 후에 형광 현미경에 의해 검출되었다. 도 1L은 다양한 입자 유형으로 처리시 DC2.4 생존력을 도시하고 있다.
도 2는 포유동물 수지상 세포 집단에 의한 예시적인 리포 폴리플렉스/mRNA 코어-쉘 백신의 우선적인 섭취를 나타낸다. 세포 분류 전에 24시간 동안 리포 폴리플렉스/eGFP mRNA와 함께 배양된 DC2.4, MDA-MB-231 및 mDMEC 세포 후 GFP-양성 세포에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 생체 발광 이미지를 사용하여 LPP / Luc의 s.c. 주사 48시간 후 마우스에서 루시퍼라제 발현을 검출하였다. 왼쪽에는 대조군 마우스, 오른쪽은 LPP/Luc 처리 마우스이다.
도 3A, 도 3B, 도 3C, 도 3D, 도 3E, 도 3F, 도 3G 및 도 3H는 세포 진입 메커니즘을 보여준다. 도 3A-도 3F는 mock 대조군(도 3A), 아밀로라이드(도 3B), 클로로프로마진(도 3C), 클로로퀸(도 3D), 제니스테인(도 3E), 피모지드(도 3F) 존재하에 LPP/0.5㎍ FAM-표지된 eGFP mRNA로 처리된 DC2.4 세포의 이미지를 나타낸다. 도 3G는 FAM-양성 세포의 이미지 J 분석을 도시한 반면, 도 3H는 DC2.4 세포에 의한 LPP/FAM-표지된 eGFP mRNA의 시간 의존적 흡수를 예시한다. 오차 막대는 3회 실험의 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 4A, 도 4B 및 도 4C는 LPP/mRNA 백신에 의한 DC 자극을 나타낸다. 도 4A는 LPP/OVA(OVA mRNA 및 대조군으로 패키징된 EDOPC/DOPE/DSPE-PEG)로 처리된 BMDC에서의 사이토카인 분비를 나타내고; 도 4B는 TLR7/8 억제제 ODN2087에 의한 IL-12 및 IFNβ 발현의 억제를 나타낸다; 도 4C는 DC 자극에 대한 LPP/OVA mRNA와 LPP/ OVA 단백질을 비교한 것으로; DC 성숙 마커의 유세포 분석 결과를 나타내며, 오차 막대는 3회 실험의 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 5A, 도 5B 및 도 5C는 LPP/mRNA 백신에 의한 DC 항원 교차 제시의 자극을 보여준다. 도 5A는 H-2kb-OVA257-264 제시의 유세포 분석이다. 도 5B는 BMDC 처리 후 함께 배양한 후 OVA-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 시간-의존적 IL-2 분비를 보여준다. B3Z: OVA-특이적 CD8+ T 세포; DOBW: OVA-특이적 CD4+ T 세포. 도 5C는 DC2.4 세포의 처리 후 함께 배양한 후 OVA-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 시간-의존적 IL-2 분비를 나타내고; LPP/OVA mRNA 또는 LPP/OVA 단백질로 전처리 된 DC2.4 세포와 함께 배양한 후 OVA-특이적 CD8 T 세포에 의한 IL-2 분비의 비교가 도시되어 있다.
도 6A 및 도 6B는 시험관 내 및 생체 내에서 LPP/OVA로부터의 항 종양 활성을 나타낸다. 도 6A는 s.c LPP/OVA mRNA 백신 접종 3, 6 및 24시간 후 혈청 IFN-β 수준을 나타낸다. 도 6B는 LPP/OVA mRNA에 의한 B16-OVA 흑색종 폐 전이의 억제를 예시한다. 투여 스케줄(상부 패널) 및 투여 후 마우스의 폐의 제시된 이미지(중간 패널)를 나타냈고, 폐에서의 평균 종양 결절 수를 요약했다(하부 패널). 데이터는 평균±표준평균오차로 제시된다. 각 그룹에는 5마리의 마우스가 있다;
도 7은 증가하는 양의 중합체 (PbAE)와 mRNA 분자가 혼합되었고, 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 샘플이 분리되었음을 보여준다. 결합 되지 않은 mRNA 분자는 바닥으로 이동하고 결합된 mRNA 분자는 중합체와 함께 상부에 머물렀다. 레인 # 1: free mRNA, 레인 #2-5 : 증가하는 양의 중합체를 갖는 mRNA 분자;
도 8A 및 도 8B은 각각 비표적(untargeted) 및 표적화(targerted)된 mRNA 백신 나노 입자의 크기 분석을 보여준 것이다;
도 9A, 도 9B 및 도 9C는 본 발명 개시의 일 양태에 따른, 예시적인 빈 지질 쉘(왼쪽), mRNA 코어(중간) 및 전체 mRNA 백신 나노 입자의 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 각각 도시 한 것이다.
도 10A, 도 10B, 도 10C, 도 10D, 도 10E 및 도 10F는 mRNA 코어 형태(PbAE/mRNA 코어 또는 프로타민/mRNA 코어) 또는 패키징된 지질 껍질(우리의 mRNA 백신, DOTAP/콜레스테롤-캡슐화된 mRNA, 또는 CHEMS/DOPE/R8-캡슐화된 mRNA)에서 동일한 양의 EGFP(녹색 형광 단백질) mRNA와 공동 배양된 DC2.4 수지상 세포를 나타낸다. EGFP 발현을 24시간 후에 형광 현미경으로 모니터링 하였다;
도 11은 어떤 것으로도 포집 되지 않은 naked mRNA 또는 패키징된 mRNA와 함께 배양된 DC2.4 세포를 나타내며, 세포 생존능은 24시간 후 측정되었다.
도 12A 및 도 12B는 Cy5-표지된 mRNA가 비 표적화 또는 표적화 백신으로 패키징 되었음을 보여준다. 이어서, 형광 백신 입자를 DC2.4 세포와 함께 4시간 동안 배양 하였다. 형광 mRNA 백신 입자로 내재화된 세포의 백분율(도 12A) 및 총 형광을 갖는 세포(도 12B)를 측정하였다;
도 13은 mRNA 백신에 의한 수지상 세포 성숙의 자극을 예시한다. 골수 유래 수지상 세포(BMDC)를 mRNA 백신 또는 백신의 개별 성분으로 처리하고, I 형 인터페론 사이토카인 인터페론-β(IFN-β) 및 수지상 세포 성숙 마커 IL-12p70의 분비를 효소-면역측정법(ELISA)으로 측정한 것이다;
도 14는 TLR7/8 억제제 ODN2095에 의한 mRNA 백신-매개 수지상 세포 자극의 억제를 입증한다. BMDC는 오브알부민 단백질 (OVA), TLR7/8 억제제 ODN2095, OVA를 발현하는 mRNA 백신, 또는 mRNA 백신과 ODN2095의 조합으로 처리되었고, 및 I형 인터페론 사이토카인 인터페론 -β(IFN-β) 및 수지상 세포의 성숙 마커 IL-12p70의 분비는 ELISA로 측정하였다;
도 15는 PBS 음성 대조군, 프로타민/mRNA 코어, 또는 OVA-특이적 mRNA 백신 (OVA 단백질을 발현하는 mRNA 백신)으로 처리 된 BMDC를 나타내고; 이어서 유동 세포 측정법을 적용하여 MHCI-OVA 에피토프를 나타내는 CD11c 양성 수지상 세포를 검출하였다;
도 16A는 BMDC 세포를 나타내고, 도 16B는 OVA-특이적 CD4 T 세포(DOBW) 및 CD8 T 세포(B3Z)와 24 또는 48시간 동안 공동 배양된 OVA mRNA 백신으로 처리된 DC2.4 세포를 나타낸다. 이어서, T 세포에 의한 IL-2의 발현을 검출하고 ELISA에 의해 정량화하였다;
도 17은 OVA mRNA 백신이 IDO1 억제제 INCB024360과 함께 패키징되고 BMDC를 치료하기 위해 적용된 것을 보여준다. 이어서 BMDC를 OVA-특이적 T 세포와 함께 배양하고, IL-2 분비를 ELISA에 의해 측정하였다;
도 18A 및 도 18B는 C57BL6 마우스를 PBS, OVA 단백질 또는 OVA mRNA 백신으로 3회 처리하고 비장 및 림프절로부터의 세포(활성화된 T 세포 포함)를 단리하고 적용하여 T 세포 자극 상태 및 종양 세포 사멸 활성을 시험함을 나타낸다. 도 18A에 나타낸 바와 같이, 세포 단리 후 인터페론-γ 분비에 OTI 및 OTII OVA-특이 적 항원 펩타이드가 도전(즉, 동시 배양)되었다. 도 18B에서, 단리된 T 세포와 B16-OVA 종양 세포를 동시 배양하고, 세포 생존력을 측정하였다;
도 19는 B16-OVA 종양 폐 전이를 갖는 C57BL6 마우스가 OVA mRNA 백신(3, 7, 10 일에)으로 3회 처리되었음을 보여준다. 마우스를 18일에 안락사시키고, 폐의 종양 결절을 계수하였다. 상단 타임 라인은 치료 일정을 보여준다. PBS 대조군 및 OVA mRNA 백신 처리군으로부터의 대표적인 폐가 도면의 중간에 나타나고; 비교를 위해 폐의 종양 결절 수에 기초한 정량화를 보여준다;
도 20은 본 개시 내용의 하나의 특정 측면에 따른 백신 구조의 예시적 개요를 도시한다. 그것에서, (1) 중앙의 mRNA 코어, (2)외부의(표적 모이어티를 갖거나 갖지 않는) 지질 껍질, 및 (3) 사이의 작은 분자 및/또는 단백질로 구성된 mRNA 백신 나노 입자의 개요로 시각화된다;
도 21은 IL12p70을 암호화하는 mRNA의 공동-패키징이 단일 항원 백신 단독과 비교하여 mRNA 백신 활성을 추가로 촉진한다는 것을 보여준다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 야 TP53 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이고, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다;
서열 번호 2는 돌연변이 TP53 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이고, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다;
서열 번호 3은 야생형 TP53 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이며, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다;
서열 번호 4는 돌연변이 TP53 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이고, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다;
서열 번호 5는 야생형 PIK3CA 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이고, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다;
서열 번호 6은 돌연변이 PIK3CA 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이며, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다;
서열 번호 7은 야생형 PIK3CA 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이고, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다;
서열 번호 8은 돌연변이 PIK3CA 펩티드로부터 유래 된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이고, 본 발명의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다;
서열 번호 9는 야생형 PTEN 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이고, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다; 및
서열 번호 10은 돌연변이 PTEN 펩티드로부터 유래된 예시적인 세포 독성 T 세포 에피토프(epitope)이며, 본 개시의 하나 이상의 측면에 따라 유용하다.
예시적인 실시예의 설명
본 발명의 예시적인 실시예들이 아래에서 설명된다. 명확성을 위해, 실제 구현의 모든 특징들이 본 명세서에서 설명되는 것은 아니다. 물론, 그러한 실제 실시 예의 개발에서, 시스템 관련 및 비즈니스 관련 제약의 준수와 같은 개발자의 특정 목표를 달성하기 위해 다수의 구현에 특정한 결정이 이루어져야 한다는 것이 이해될 것이다. 더욱이, 그러한 개발 노력은 복잡하고 시간 소모적일 수 있지만, 본 개시의 이점을 갖는 당업자에게는 일상적인 업무일 것이다.
암
암은 틀림없이 공중 보건에 대한 가장 큰 세계적인 위협 중 하나이다. 암 전이는 악성 종양의 주요 특징이며, 90% 이상의 고형 종양 관련 사망에 기여한다. 암 전이의 메커니즘이 잘 알려지지 않았기 때문에, 종양 전이를 효율적으로 제어하기 위해 이용할 수 있는 진단/예후에 특징적인 치료법이 없다. 실제로, 전이는 일부 종양 세포가 1차 병변을 떠나 원위 부위에 체류하는 잘 조정된 일련의 사건을 포함하는 복잡한 과정이다. 원발성 종양의 모든 세포가 전이할 수 있는 능력을 갖지 않기 때문에, 전이성 암세포는 암의 유용한 치료적 표적이 될 수 있음을 추론할 수 있다.
mRNA -기반의 치료용 암 백신
mRNA- 기반 치료용 암 백신은 DNA 백신으로부터의 게놈 통합의 잠재적 위험 또는 펩티드 백신으로부터의 항원 선택의 제한 없이 강력한 항암 면역을 유발하는 이점을 갖는다. 그러나 양으로 하전 된 단백질 코어 구조에서 축합 mRNA 분자로 구성된 통상적인 mRNA 백신은 항원 제시 세포에 의해 효과적으로 내재화되지 않으므로, 혈장 및 조직 효소에 의한 분해로부터 mRNA 분자에 대한 충분한 보호를 제공 할 수 없다.
mRNA 포집을 위한 리포 폴리플렉스 조성물
한 측면에서, 본 개시 내용은 핵산 분자(예를 들어, mRNA를 포함함)를 중합체 폴리플렉스 "코어"로 포집하도록 설계된 리포 폴리플렉스-(LPP) 및 단백질 기반 쉘/코어 전달 시스템을 제공한다. 이어서 인지질 이중층으로 구성된 "쉘"구조로 로딩된다. 예시적인 시스템이 도 1에 도시되어있다. 도 1A 및 이러한 백신 전달 시스템에 대한 일반화 된 개략도가 도 20에 도시되어있다. 이들 조성물은 소수성 폴리 플렉스 코어 구조 내부의 mRNA 분자를 RNAse에 의한 공격 및 후속 분해로부터 보호 할 수 있을 뿐만 아니라, 코어를 둘러싸는 인지질 이중층 쉘 구조의 존재는 또한 항원-제시 세포(대식세포, B 세포, 수지상 세포 등을 포함 하나 이에 제한되지 않음)에 의해 벡터를 보다 효율적으로 내재화시키는 역할을 하고, 소포 시스템을 통한 입자 수송 및 코딩된 항원(들)의 생산을 용이하게 하기 위해 코어 구조로부터 시토졸로 mRNA 분자의 최종 방출을 촉진한다.
실시예 1에서, 특정 LPP의 조성 및 형태는 체계적으로 특성 규명되었으며, DC에 의한 LPP/mRNA의 세포 흡수 및 코딩된 펩티드 항원의 DC에서 생성된 단백질 합성 또한 연구되었다. 오브알부민(OVA)을 항원 모델로서 적용함으로써, LPP/OVA mRNA 백신에 대한 면역반응을 세포 배양에서 조사하고, 항종양 면역을 OVA-발현 B16 흑색종 세포로 확립된 흑색종 폐 전이의 쥐과의(murine) 동물 모델에서 평가 하였다.
약학적 제제
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 진단, 예방 및/또는 치료 양태와 조합하여 동물의 하나 이상의 세포 또는 조직에 투여하기 위한 약학적으로 허용되는 제제로 준비된 백신 전달 조성물에 관한 것이다. 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 캐리어 용액의 조성은 다양한 진단 및 암 예후 예측 요법으로 여기에 설명된 특정 LPP-mRNA 기반 백신 조성물을 사용하기 위한 적절한 투여 및 치료 요법을 개발하는 것과 마찬가지로 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다.
특정 상황에서, 개시된 중합체 폴리플렉스 코어/인지질 이중층 쉘-기반 백신 전달 시스템은 하나 이상의 표준 전달 장치에 의해 알맞게 제제화된 약학적 운반체(vehicle)에 전달하는 것이 바람직할 것이다. 상기 표준 전달 장치는 피하, 비경구, 정맥 내, 근육 내, 경막 내, 종양 내, 복강 내, 경피, 국소, 경구 또는 비강 흡입, 또는 동물의 신체 내 또는 주변, 바람직하게는 인간의 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관에 직접 주사함으로써 투여 될 수있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
투여 방법은 또한 미국 특허 제5,543,158 호; 5,641,515 및 5,399,363을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 명백히 참고로 포함된다. 유리 염기(free base) 또는 약학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 멸균수에서 제조될 수 있고, 하나 이상의 계면 활성제, 예컨대 하이드록시프로필 셀룰로스와 적절히 혼합될 수있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 오일 또는 이들의 혼합물로 제조될 수있다. 일반적인 보관 및 사용 조건에서 이러한 제제는 미생물의 성장을 막기 위해 방부제를 함유한다.
주사 가능한 수용액의 투여를 위해, 제한 없이, 용액은 필요한 경우 적절하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코오스와 등장성이 되게 한다. 이들 특정 수용액은 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피, 피하 및/또는 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 본 발명의 조성물은 예를 들어 멸균 수성 매질, 완충제, 희석제 등을 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 운반체(vehicle)로 제형 화 될 수 있다(예를 들어, "레밍턴의 약학과학"15 판, pp. 1035 참조).-1038 및 1570-1580). 치료되는 피험자의 상태, 치료의 범위 및 투여 부위에 따라 투여량의 변화가 필연적으로 발생하지만, 투여를 담당하는 사람은 그럼에도 불구하고 의학 및 제약 분야의 일반적인 지식을 사용해 개별 피험자에 적합한 정확한 투여 요법을 결정할 수 있을 것이다.
멸균 주사 가능한 조성물은 상기 개시된 열거된 백신 조성물을 필요에 따라 상기 열거된 몇몇 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수있다. 일반적으로, 분산액은 선택된 멸균된 활성 성분 (들)을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 운반체(vehicle)에 혼입함으로써 제조될 수있다. 본원에 개시된 백신 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제형화 될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노기(free amino group)로 형성됨)을 포함하며, 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델릭 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유리 카르복실기(free carboxyl group)로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철 및 이소프로필아민, 트리메틸 민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수있다. 제제화시, 용액은 투여량 제제와 양립 가능한 방식으로, 의도된 적용에 효과적인 양으로 투여될 것이다. 본 발명의 화합물의 제제는 다양한 투여 형태, 예컨대 주사용 용액, 국소 제제, 서방성 캡슐을 포함한 경구 제제, 하이드로겔, 콜로이드, 점성 겔, 경피 시약, 비강 내 및 흡입 제제 등으로 투여될 수 있다.
본원에 개시된 백신 조성물의 양, 투여 요법, 제제 및 투여는 본 교시의 이점을 갖는 통상의 기술자의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 진단적으로 유효한 (즉, 약학적으로 유효한) 양의 하나 이상의 개시된 mRNA-기반 백신 조성물의 투여는 단일 투여, 예를 들어, 제한 없이, 충분한 양의 전달된 제제의 단일 주사는 이를 필요로 하는 환자에게 원하는 이점을 제공한다. 대안적으로, 일부 상황에서, 이러한 조성물의 투여를 감독하는 의사에 의해 결정될 수 있는 바와 같이, 개시된 조성물의 비교적 짧은 또는 심지어 연장된 기간에 걸쳐 다수의 또는 연속적인 투여를 제공하는 것이 바람직 할 수 있다.
전형적으로, 본원에 기술된 하나 이상의 중합체성 폴리플렉스 코어/인지질 이중층 쉘 기반 백신 전달 시스템의 제제는 적어도 유효량의 제1 활성제를 함유할 것이다. 바람직하게는, 제형은 활성 성분(들)의 백분율은 물론 다양하고 편리하게 존재할 수 있지만, 각각의 활성 성분의 약 0.001 % 이상, 바람직하게는 활성 성분의 약 0.01 % 이상을 함유할 수 있다. 총 제형을 기준으로 약 0.01 내지 약 90중량 % 또는 부피 %, 또는 약 0.1 내지 약 80중량 % 또는 부피%, 또는 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 약 60중량 % 또는 부피 %의 양으로 사용될 수 있다. 당연히, 각 조성물에서 활성 화합물(들)의 양은 임의의 주어진 단위 용량의 화합물에서 적합한 투여량이 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체 이용률, 생물학적 t1/2, 투여 경로, 제품 저장 수명 및 기타 약리학적 고려 사항과 같은 인자는 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 수 있으며, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직 할 수있다. 바람직한 구체 예에서, 활성제는 내부 폴리플렉스 내에 포함된 mRNA 백신 성분이다.
전신 투여가 본 발명의 많은 구체예에서 효과적인 것으로 고려되지만, 본원에 개시된 제제는 신체의 하나 이상의 기관, 조직 또는 세포 유형으로의 직접 주사에 적합한 것으로 고려된다. 개시된 조성물을 신체 내의 특정의 신중한 위치로, 또는 종양 또는 암 조직에 직접 투여하는 것은, 예를 들어 관련 의학 종양학 분야의 당업자에게 공지된 적합한 수단을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 약제학적 제형은 포유동물 세포, 특히 인간 세포와의 접촉 및/또는 인간 환자와 같은 포유동물 개체, 예를 들어 투여를 위해 특히 제형화 된 하나 이상의 부형제, 완충제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 임의로 하나 이상의 진단제 또는 예후제를 포함할 수 있고, 및/또는 마이크로스피어(microsphere), 미세 입자, 나노 스피어(nanosphere) 또는 나노 입자 집단 내에서 제제화될 수 있고, 하나 이상의 세포, 조직, 기관 또는 특히 인간의 신체에 투여하기 위해 제제화될 수 있다.
약학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형은 본원에 기술된 특정 조성물을 다양한 방식으로 사용하기에 적합한 투여, 진단 및/또는 치료 요법의 개발과 같이 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 경구, 비경구, 정맥 내, 비강 내, 종양 내 및 근육 내 투여 경로를 제한 없이 포함한다.
개시된 백신 제형을 사용하는 조성물에 사용되는 특정 양의 조성물, 및 특정 투여 시간, 또는 투여 요법은 본 교시의 이점을 갖는 당업자의 범위 내에 있을 것이다. 그러나 개시된 제제의 투여는 이러한 치료를 받는 환자에게 원하는 이점을 제공하기에 효과적인 시간동안 하나 이상의 용량의 제제의 투여에 의해 달성될 수 있다. 이러한 투여 요법은 특정 상태 또는 환자, 투여되는 요법의 정도 또는 기간 등에 따라 화합물의 투여를 감독하는 의사에 의해 결정될 수 있다.
본원에 개시된 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 약학적 제제는 인간, 또는 영장류 또는 포유동물에만 사용되는 것으로 제한되지 않는다. 특정 실시 양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 조류, 양서류, 파충류 또는 다른 동물 종을 사용하여 사용될 수 있다. 그러나 바람직한 구체 예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 암세포의 전이 가능성을 조절하기 위한 다양한 요법으로 포유동물, 특히 인간에게 투여하기 위해 제형화 된다. 상기 언급된 바와 같이, 이러한 조성물은 인간에게만 사용하도록 제한되지 않으며, 선택된 가축, 이국적 또는 길들여진 동물, 반려 동물(애완 동물 등을 포함함), 인간 영장류뿐만 아니라 동물학 또는 다른 표본의 수의학적 투여를 위해 제형화 되었다.
의약의 제조를 위한 조성물
본 발명의 다른 중요한 측면은 예를 들어 척추동물을 포함하는 동물의 하나 이상의 질병, 기능 장애, 비정상 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 진단, 치료 및/또는 개선하기 위한 약제의 제조에 개시된 조성물(및 이들을 포함하는 제형)을 사용하는 방법에 관한 것이다. 개시된 조성물의 사용은 암의 진단 및/또는 예후, 암 전이의 검출 또는 예측, 또는 그 정도의 모니터링 및/또는 하나 이상의 암 세포 유형의 전이 가능성의 억제에 특히 고려된다.
이러한 용도는 일반적으로 하나 이상의 개시된 백신 조성물을 필요로 하는 포유동물에게, 암의 하나 이상의 증상을 진단, 치료, 감소 또는 개선 시키기에 충분한 양 및 시간으로 투여하는 것을 포함한다.
하나 이상의 개시된 mRNA-기반 백신 조성물을 포함하는 제약 제제는 또한 본 발명의 일부를 형성하고, 특히 영향을 받은 포유동물에서 하나 이상의 암의 증상의 치료 및/또는 개선에 사용하기 위한 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물이다.
예시적인 정의
본 발명에 따르면, 폴리뉴클레오티드, 핵산 분절, 핵산 서열 등은 DNA(게놈 또는 extragenomic DNA 포함), 유전자, 펩티드 핵산(PNA), RNA(rRNA, mRNA 및 tRNA를 포함 하나 이에 제한되지 않음), 뉴클레오사이드 및 천연 공급원으로부터 수득되거나 화학적으로 합성, 변형 또는 전체적으로 또는 부분적으로 사람에 의해 제조 또는 합성된 적합한 핵산 분절를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기 참고 문헌은 당업자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다 : Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology , (2nd Ed.) J. Stenesh (Ed.), Wiley-Interscience (1989); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (3rd Ed.), P. Singleton and D. Sainsbury (Eds.), Wiley-Interscience (2007); Chambers Dictionary of Science and Technology (2nd Ed.), P. Walker (Ed.), Chambers (2007); Glossary of Genetics (5th Ed.), R. Rieger et al. (Eds.), Springer-Verlag (1991); and The HarperCollins Dictionary of Biology, W.G. Hale and J.P. Margham, (Eds.), HarperCollins (1991).
본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 조성물이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 조성물이 본원에 기술되어있다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어는 명확성 및 참조 용이성을 위해 하기에 정의된다 :
특허법 관습에 따르면, 청구범위를 포함하여 본 출원에서 사용될 때 "a" 및 "an"이라는 단어는 "하나 이상"을 나타낸다.
본원에 사용 된 용어 "약" 및 "대략"은 상호 교환 가능하며, 일반적으로 주어진 수 주위의 수의 범위뿐만 아니라 언급된 수의 범위 내의 모든 수를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다 (예를 들어, "약 5 내지 15"는 달리 언급되지 않는 한 "약 5 내지 약 15"를 의미한다). 또한, 본원의 모든 수치 범위는 그 범위 내의 각각의 정수 전체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 "항원성 폴리펩티드"또는 "면역원성 폴리펩티드"는 척추동물에 도입될 때 척추동물의 면역계 분자와 반응하는, 즉 항원성 및/또는 면역 반응 즉, 면역원성을 유도하는 폴리펩티드이다.
"생체 적합성"은 살아있는 세포에 노출될 때 예를 들어 세포의 생애주기의 변화, 세포 증식 속도의 변화 또는 세포 독성 효과와 같은 세포의 바람직하지 않은 영향을 일으키지 않은 세포의 적절한 세포 활성을 지지하는 물질을 지칭한다.
"생물학적-기능적 등가물"이라는 용어는 당업계에서 잘 이해되고, 본 명세서에서 더 상세하게 정의된다. 따라서, 약 85% 내지 약 90%를 갖는 서열; 또는 더욱 바람직하게는 약 91% 내지 약 95%; 또는 더욱더 바람직하게는 약 96% 내지 약 99%; 본원에 제공된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 기능적으로 동등한 뉴클레오티드의 경우, 본 출원에 제시된 방법 및 조성물의 실시에 특히 유용한 것으로 고려된다.
본원에 사용된 용어 "완충액"은 완충제를 포함하는 용액 또는 조성물에 산 또는 알칼리가 첨가될 때 pH의 변동에 저항하는 하나 이상의 조성물 또는 이의 수용액을 포함한다. pH 변화에 대한 이러한 저항은 이러한 용액의 완충 특성에 기인하며, 조성물에 포함된 하나 이상의 특정 화합물의 기능 일 수 있다. 따라서, 완충 활성을 나타내는 용액 또는 다른 조성물을 완충액 또는 완충 용액 이라고한다. 완충액은 일반적으로 용액 또는 조성물의 pH를 유지하는 무제한 능력을 갖지 않으며; 오히려, 이들은 전형적으로 특정 범위, 예를 들어 약 5 내지 7의 pH 내에서 pH를 유지할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "담체"는 관련 동물에 투여하기에 약학적으로 허용되거나, 또는 치료 또는 진단 목적으로 허용되는 임의의 용매(들), 분산 매질, 코팅(들), 희석제(들), 완충제(들), 등장제(들), 용액(들), 현탁액(들), 콜로이드(들), 불활성(들) 등 또는 이들의 조합을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "DNA 분절"은 특정 종의 전체 게놈 DNA가 없는 단리된 DNA 분자를 지칭한다. 따라서, 본원에 개시된 조성물 중 하나를 사용하여 생물학적 샘플로부터 수득된 DNA 분절은 이들이 수득 되는 특정 종의 총 게놈 DNA로부터 분리되거나 정제되지 않은 하나 이상의 DNA 분절을 지칭한다. 용어 "DNA 분절" 내에는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등을 포함하는 재조합 벡터뿐만 아니라 DNA 분절 및 이러한 분절의 더 작은 단편이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 질환 또는 상태를 치료 또는 개선할 수 있거나 의도된 치료 효과를 나타낼 수있는 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "에피토프(epitope)"는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정된 소정의 면역원성 물질에 대한 면역반응이 장착된 숙주 면역계의 항체 또는 세포-표면 수용체의 표적이 되는, 주어진 면역원성 물질의 일부분을 지칭한다. 또한, 에피토프는 당업계에서 이용 가능한 임의의 방법에 의해 결정된 바와 같이, 동물에서 항체 반응을 유도하거나 T 세포 반응을 유도하는 면역원성 물질의 일부로서 정의될 수 있다(예를 들어, Geysen et al., 1984). 에피토프는 임의의 면역원성 물질, 예컨대 단백질, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 유기 또는 무기 화학 물질 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 용어 "에피토프"는 또한 "항원 결정기" 또는 "항원 결정기 부위"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예를 들어"는 의도적으로 제한되지 않고 단지 예로서 사용되며, 본 명세서에서 명시적으로 열거된 항목만을 언급하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 사용된 바와 같이, "비상동성(heterologous)"은 미리 결정된 참조 핵산 서열과 관련하여 정의된다. 예를 들어, 구조적 유전자 서열과 관련하여, 비상동성 프로모터는 참조된 구조적 유전자에 인접하여 자연적으로 발생하지 않지만 실험실 조작에 의해 위치되는 프로모터로서 정의된다. 마찬가지로, 비상동성 유전자 또는 핵산 분절은 참조된 프로모터 및/또는 인핸서 요소에 인접하여 자연적으로 발생하지 않는 유전자 또는 분절로 정의된다.
본원에 사용된 "상동(homologous)"은 폴리뉴클레오티드를 언급할 때 상이한 기원으로부터 발생하더라도 동일한 필수 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열을 의미한다. 전형적으로, 상동 핵산 서열은 하나 이상의 실질적으로 유사한 게놈 서열을 갖는 밀접하게 관련된 유전자 또는 유기체로부터 유래 된다. 대조적으로, "상사성(analoguos)" 폴리뉴클레오티드는 상이한 종 또는 유기체로부터의 폴리뉴클레오티드와 동일한 기능을 공유하지만, 유사한 기능을 수행하거나 유사한 생물학적 특성을 갖는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 상당히 다른 1차 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는 것이다. 상사성 폴리뉴클레오티드는 종종 밀접하게 관련되지 않은(예를 들어, 유전적으로 또는 계통 발생적으로) 둘 이상의 유기체로부터 유래 될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상동성(homology)"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 상보성 정도를 지칭한다. 제1 핵산 또는 아미노산 서열이 제2 핵산 또는 아미노산 서열과 정확히 동일한 1차 서열을 갖는 경우, "동일성(identity)"이라는 단어는 "상동성(homology)"이라는 단어를 대체할 수 있다. 서열 상동성 및 서열 동일성은 당업계에 공지된 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 둘 이상의 서열을 분석함으로써 결정될 수 있다. 이러한 방법은 주어진 서열이 다른 선택된 서열과 동일한지 또는 상동적 인지를 평가하는데 사용될 수 있다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일하거나 특정 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다. 이는 이하에 기술된 서열 비교 알고리즘 중 하나(또는 당업자에게 이용 가능한 다른 알고리즘)를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 때 최대 대응성을 위해 비교되고 정렬될 때 동일하다.
본원에 사용된 "치료가 필요한"이라는 문구는 환자가 치료를 필요로 하는 (또는 하나 이상의 방식으로 혜택을 받을) 의사 또는 수의사와 같은 간병인에 의해 이루어진 판단을 지칭한다. 이러한 판단은 간병인의 전문 지식의 영역에 있는 다양한 요인에 기초하여 이루어질 수 있으며, 하나 이상의 화합물 또는 약학적 조성물, 예컨대 본 명세서에 기재된 것들로 치료될 수 있는 병의 상태의 결과로서 환자가 아프다는 지식을 포함할 수 있다.
"단리된" 또는 "생물학적으로 순수한"이라는 문구는 본래 상태에서 발견되는 바와 같이 물질을 정상적으로 수반하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 따라서, 본 개시 내용에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 천연 또는 현장 환경에서 이들 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 일반적으로 관련된 물질을 함유하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "키트"는 본 발명의 하나 이상의 시약, 성분 또는 약학적으로 제조된 조성물 세트를 포함하는 휴대용, self-contained enclosure의 변형을 설명하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 이러한 키트는 예를 들어 실험실 또는 임상 적용과 같은 밀폐된 조성물의 사용을 위한 하나 이상의 설명서 세트를 포함할 수 있다.
"링크" 또는 "결합"은 재조합 융합, 공유 결합, 이황화 결합, 이온 결합, 수소 결합, 정전기 결합 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 단백질, 펩티드, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 기능적으로 연결하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 지칭한다.
대상에 적용되는 본원에 사용된 용어 "자연 발생"은 대상이 본질적으로 발견 될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 본질적으로 공급원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람의 손에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연적으로 발생한다. 본원에 사용된 바와 같이, 고전 유전학에 따라 선택적으로 사육될 수 있는 설치류의 실험실 균주는 자연 발생 동물로 간주 된다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 하나 이상의 유형의 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유) 및 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기(염기성 부위 포함)의 N-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 또한 전형적으로 서브 유닛 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해, 그러나 몇몇 경우에는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등에 의해 공유결합된 리보 뉴클레오사이드 또는 데옥시리보뉴클레오사이드의 중합체를 포함한다. "핵산"은 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA뿐만 아니라 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA를 포함한다. 예시적인 핵산은 gDNA; hnRNA; mRNA; rRNA, tRNA, 마이크로 RNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), small nuclear RNA (snORNA), small nuclear RNA (snRNA) 및 small temporal RNA (stRNA) 등 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 연결된 핵산 서열이 전형적으로 연속적이거나 실질적으로 연속적이며, 필요한 경우 두 개의 단백질 코딩 영역에 인접하고 판독 프레임에 결합하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 일반적으로 여러 킬로베이스에 의해 프로모터로부터 분리될 때 기능 하고, 인트론 서열은 가변 길이일 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동 가능하게 연결될 수 있지만 연속적이지는 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "환자"(또한 "수여자" "숙주" 또는 "개체"로 상호 교환 적으로 지칭됨)는 논의된 바와 같은 하나 이상의 혈관 접근 장치의 수용자로서 기능 할 수 있는 임의의 숙주를 지칭한다. 여기에. 특정 측면에서, 수여자는 임의의 동물종(및 바람직하게는 인간과 같은 포유동물 종)을 나타내도록 의도된 척추동물 일 것이다. 특정 실시 양태에서, "환자"는 인간 및 비인간 영장류, 조류, 파충류, 양서류, 소, 개, 염소, 소, corvines, epines, 말, 고양이, hircines, 토끼, leporines, lupines, 쥐, 양, 돼지, racines, 여우 등을 포함하나 이에 제한되지 않고, 가축 떼 지어다니는 또는 철새 동물, 조류, 외래종 또는 동물 표본, 반려 동물, 애완동물, 및 수의사의 보살핌을 받는 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"약제학적으로 허용되는"이란 어구는 인간에게 투여될 때, 특히 인간의 눈에 투여될 때 알레르기성 또는 유사한 미지의 반응을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사용으로 제조된다. 대안적으로, 이들은 주사하기 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산 부가염; 및 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 파모산(및 엠보산), 알긴산, 나프토산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 술폰산, 나프탈렌 디술폰산, 폴리 갈락투론산과 같은 유기산으로 형성된 염; 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온을 갖는 염; N, N '디 벤질 에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온으로 형성된 염; 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 유전 물질(즉, 핵산)로 구성된 유전자 컨스트럭트를 지칭한다. 전형적으로, 플라스미드 또는 벡터는 대장균과 같은 박테리아 숙주 세포에서 기능적인 복제 기점 및 플라스미드를 포함하는 박테리아 숙주 세포를 검출하기 위한 선택 마커를 포함한다. 본 발명의 플라스미드 및 벡터는 삽입된 코딩 서열이 적합한 발현 세포에서 전사되고 번역될 수 있도록 배열 된 본원에 기재된 하나 이상의 유전자 요소를 포함할 수 있다. 또한, 플라스미드 또는 벡터는 하나 이상의 천연 및/또는 인공으로부터 수득되거나 유래된 분절을 포함하는 하나 이상의 핵산 분절, 유전자, 프로모터, 인핸서, 활성화제, 다중 클로닝 영역 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 단일 "폴리펩티드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드"를 포함하는 것으로 의도되며, 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 임의의 사슬을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 용어는 "펩티드", "디펩티드", "트리펩티드", "단백질", "효소", "아미노산 사슬" 및 "연속 아미노산 서열"은 모두 "폴리펩티드"의 정의 및 "폴리펩티드"라는 용어에 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, "폴리펩티드"의 용어는 이들 용어 중 임의의 용어 대신 또는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 유도체화, 단백질 분해 절단, 번역 후 처리와 같은 전사 후 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 또는 하나 이상의 비 천연 아미노산의 포함에 의한 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 번역 후 변형 (들)을 겪은 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 구조에 대한 종래의 명명법이 당업계에 존재한다.
예를 들어, 1문자 및 3문자 약어는 아미노산을 설명하기 위해 널리 사용된다 : 알라닌(A; Ala), 아르기닌(R; Arg), 아스파라긴(N; Asn), 아스파르트산(D; Asp), 시스테인(C; Cys), 글루타민(Q; Gln), 글루타민산(E; Glu), 글리신(G; Gly), 히스티딘(H; His), 이소류신(I; Ile), 류신(L; Leu), 메티오닌(M; Met), 페닐알라닌(F; Phe), 프롤린(P; Pro), 세린(S; Ser), 트레오닌(T; Thr), 트립토판(W; Trp), 티로신(Y; Tyr), 발린(V; Val) 및 리신(K; Lys). 본원에 기재된 아미노산 잔기는 "l" 이성질체 형태인 것이 바람직하다. 그러나, "d" 이성질체 형태의 잔기는 폴리펩티드의 원하는 특성이 유지된다면 l-아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "억제하다", "억제하는" 및 "억제"는 질병 상태의 임의의 증상이 발병하기 전에 화합물을 단독으로 또는 약학적 조성물에 포함된 것으로 투여하여 병의 증상, 측면 또는 특성을 예방하는 것을 지칭한다. 이러한 예방 및 억제가 의학적으로 유용한 것으로 절대적일 필요는 없다.
"단백질"은 본원에서 "펩티드" 및 "폴리펩티드"와 상호 교환적으로 사용되며, 핵산 염기서열이 숙주 동물이나 인간 주체에 투여된 후 생체내에서 표현된 합성, 재결합 또는 시험관 내 및 펩타이드와 폴리펩타이드 모두를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 바람직하게는 길이가 약 2 내지 약 20개의 아미노산 잔기의 짧은 펩티드, 길이가 약 10 내지 약 100개의 아미노산 잔기의 올리고 펩티드 및 약 100 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 더 긴 폴리펩티드를 포함하는 임의의 아미노산 사슬 길이를 의미하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 또한 효소, 즉 하나 이상의 아미노산 중합체를 포함하는 기능성 생체 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 폴리펩티드 및 단백질은 또한 번역 후 변형되거나 변형된 폴리펩티드 및 단백질을 포함하고, 골격 아미노산 사슬에 첨가된 임의의 당 또는 다른 유도체(들) 또는 접합체(들)를 포함한다.
본원에 사용된 "정제된"은 많은 다른 화합물 또는 실체로부터 분리된 것을 의미한다. 화합물 또는 실체는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제되거나 순수한 것일 수 있다. 화합물 또는 실체가 실질적으로 모든 다른 화합물 또는 실체로부터 즉 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99% 이상 제거될 때, 순수한 것으로 간주 된다. 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 화합물 또는 실체는 그것이 자연적으로 발견되는 물질, 예를 들어 세포 단백질 및/또는 핵산과 같은 세포 물질의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 또는 적어도 80%에서 제거될 수 있다.
용어 "재조합"은 물질(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)이 인간의 개입에 의해 인공적으로 또는 합성적으로(비 자연적으로) 변경되었음을 의미한다. 자연 환경 또는 고유 상태 내에서 또는 그로부터 제거된 물질에 대해 변형이 수행될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 프로모터 서열은 인공적으로 조작된 핵산 분절의 발현에 의해 생성될 때 "재조합"된 것이다. 예를 들어, "재조합 핵산"은 예를 들어 클로닝, DNA 셔플링 또는 다른 절차 동안, 또는 화학적 또는 다른 돌연변이 유발에 의해 핵산을 재조합함으로써 제조되고; "재조합 폴리펩티드" 또는 "재조합 단백질"은 재조합 핵산의 발현에 의해 생성되는 폴리펩티드 또는 단백질이고; "재조합 바이러스", 예를 들어 재조합 AAV 바이러스는 재조합 핵산의 발현에 의해 생성된다.
본원에 사용된 용어 "조절 인자"는 전사를 조절하는 핵산 서열의 영역 또는 영역을 지칭한다. 예시적인 조절 인자는 인핸서, 전사 후 조절 인자, 전사 제어 서열 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "RNA 분절"은 특정 종의 총 세포 RNA가 없는 단리된 RNA 분자를 지칭한다. 따라서, RNA 분절은 다른 RNA로부터 분리되거나 다른 RNA로부터 분리되지 않은 하나 이상의 RNA 분절(천연 또는 합성 유래)를 지칭할 수 있다. 용어 "RNA 분절"에는 RNA 분절 및 이러한 분절의 더 작은 단편이 포함된다.
아미노산을 지칭할 때, 용어 "서열"은 주어진 아미노산 사슬, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질 내의 아미노산의 선형 N- 말단에서 C- 말단 순서의 전부 또는 일부; "서열"은 서열 내에서 아미노산의 임의의 연속 신장, 예를 들어 주어진 단백질 또는 폴리펩티드 서열 내에서 3개 이상의 연속 아미노산을 의미한다. 뉴클레오타이드 사슬과 관련하여, "서열" 및 "서브시퀀스"는 뉴클레오티드의 5 '내지 3'순서와 관련하여 유사한 의미를 갖는다.
용어 "서열 번호 X에 기본적으로 명시된 서열"은 서열이 서열 번호 X의 일부에 실질적으로 상응하고, 서열 번호 X의 뉴클레오티드(또는 폴리펩티드 서열의 경우 아미노산)와 동일하지 않거나, 생물학적으로 기능적 등가물인 뉴클레오티드(또는 폴리펩티드 서열의 경우 아미노산)가 상대적으로 적은 것을 의미한다. "생물학적 기능적 등가물"이라는 용어는 본 기술 분야에서 잘 이해되고, 본 명세서에서 더 상세하게 정의된다. 따라서, 약 85% 내지 약 90%를 갖는 서열; 또는 더욱 바람직하게는 약 91% 내지 약 95%; 또는 더욱더 바람직하게는 약 96% 내지 약 99%; 본원에 제공된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 기능적으로 동등한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드가 본 발명의 실시에 특히 유용한 것으로 고려된다.
본 발명에 사용하기 위한 핵산에 적합한 표준 혼성화 조건은 예를 들어 50% 포름아미드, 5×덴하르트 용액, 5×SSC, 25mM 인산 나트륨, 0.1% SDS 및 42℃에서 16시간 동안 변성된 연어 정자 DNA 100㎍/mL에서의 혼성화를 포함한다. 이어서 60℃에서 0.1×SSC, 0.1 % SDS 용액으로 1시간 동안 순차적으로 세척하여 원하는 양의 배경 신호를 제거하였다. 본 발명의 보다 엄격한 혼성화 조건은 예를 들어 35% 포름아미드에서, 5×덴하르트 용액, 5×SSC, 25mM 인산 나트륨, 0.1% SDS 및 100㎍/mL의 42℃에서 16시간 동안 변성된 연어 정자 DNA 또는 대장균 DNA에서의 혼성화를 포함한다. 이어서 55℃에서 0.8×SSC, 0.1% SDS로 순차적으로 세척하였다. 당업자는 이러한 혼성화 조건이 특정 용도에 대해 원하는 수준의 엄격성을 얻기 위해 용이하게 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
본원에 사용된 용어 "구조 유전자"는 일반적으로 암호화된 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 리보자임, 촉매 RNA 분자 또는 안티센스 분자를 생성하도록 발현되는 유전자와 같은 폴리뉴클레오티드를 설명한다.
본원에 사용된 용어 "개체"는 본 발명에 따른 조성물로의 치료가 제공될 수있는 영장류와 같은 포유동물을 포함하는 유기체를 의미한다. 개시된 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물 종은 유인원; 침팬지; 오랑우탄; 인간; 원숭이; 개와 고양이와 같은 길들여진 동물; 말, 소, 돼지, 양, 염소 및 닭과 같은 가축; 마우스, 랫트, 기니피그 및 햄스터와 같은 다른 동물.
아미노산 또는 핵산 서열을 정의하는데 사용될 때 용어 "실질적으로 상보 적"은 예를 들어 올리고뉴클레오티드 서열과 같은 특정 개체의 서열이 선택된 서열의 전부 또는 일부에 실질적으로 상보적임을 의미하고, 따라서 선택된 서열을 인코딩하는 mRNA의 일부에 특이적으로 결합할 것이다. 이와 같이, 전형적으로 서열은 mRNA "표적" 서열에 대해 매우 상보적이고, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10 이하의 서열의 상보적인 부분에서의 염기 불일치를 가질 것이다. 많은 경우에, 서열이 정확하게 일치하는 것, 즉 올리고 뉴클레오티드가 특이적으로 결합하는 서열에 완전히 상보적인 것이 바람직할 수 있으며, 따라서 상보적 신장을 따라 불일치가 전혀 없다. 이와 같이, 고도로 상보적인 서열은 전형적으로 mRNA의 표적 서열 영역에 상당히 특이적으로 결합할 것이고, 따라서 표적 mRNA 서열의 폴리펩티드 생성물로의 번역을 감소 및/또는 심지어 억제하는데 매우 효율적일 것이다.
실질적으로 상보적인 핵산 서열은 핵산이 특이적으로 결합하는 상응하는 핵산 표적 서열에 대해 약 80% (또는 "정확한 % 일치")보다 큰 비율로 상보적일 것이고, 더욱 바람직하게는 핵산이 특이적으로 결합하는 상응하는 표적 서열에 약 85%보다 큰 비율로 상보적일 것이다. 특정 측면에서, 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 실시에 사용하기 위해 훨씬 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 갖는 것이 바람직할 것이며, 이러한 경우에 핵산에 특이적으로 결합하는 표적 서열에 대해 약 90% 초과하여 상보적일 것이고, 특정 구체예에서 핵산이 특이적으로 결합하는 상응하는 표적 서열에 약 95% 초과하여 상보적이고, 심지어 설계된 핵산에 특이적으로 결합하는 표적 서열의 전부 또는 일부분에 약 96%, 약 97%, 약98%, 약 99%, 및 심지어 약 100%로 정확하게 일치하는 상보적인 것을 포함한다.
개시된 핵산 서열 중 임의의 것의 유사성 또는 상보성 백분율은, 예를 들어 Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)으로부터 입수 가능한 GAP 컴퓨터 프로그램, version 6.0을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. GAP 프로그램은 Needleman과 Wunsch(1970)의 정렬 방법을 사용합니다. 간단히 말하면, GAP 프로그램은 유사성을 정렬된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수로 두 서열 중 짧은 수의 총 기호 수로 나눈 유사성을 정의한다. GAP 프로그램의 선호되는 기본 매개 변수에는 다음이 포함된다 : (1) 뉴클레오티드에 대한 단항 비교 행렬 (ID에 값 1을 포함하고 비 ID에 0을 포함) 및 Gribskov and Burgess (1986)의 가중 비교 매트릭스, (2) 각 갭에 대해 3.0의 페널티 및 각 갭에 있는 각 기호에 대해 추가 0.10 페널티; 그리고 (3) 끝 간격에 대한 페널티가 없다.
당연히, 본 발명은 본원에 구체적으로 제시된 하나 이상의 특정 뉴클레오티드 서열에 상보적, 본질적으로 상보적 및/또는 실질적으로 상보적인 핵산 분절을 포함한다. "상보적인" 핵산 서열은 표준 왓슨-크릭 상보성 규칙에 따라 염기쌍을 형성할 수있는 것들이다. 본원에 사용된 용어 "상보적 서열"은 상기 제시된 동일한 뉴클레오티드 비교에 의해 평가될 수 있거나 하나 이상의 특정 핵산 분절에 혼성화 할 수 있는 것으로 정의된 바와 같이 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 의미한다. 본 명세서에서 바로 위에 기술된 조건과 같은 비교적 엄격한 조건하에서 본 명세서에 개시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 성분의 양과 관련하여 용어 "실질적으로 없는" 또는 "본질적으로 없는"은 바람직하게는 약 10중량 % 미만, 바람직하게는 약 5중량 % 미만, 및 더 바람직하게는 약 1중량 % 미만의 화합물을 함유하는 조성물을 지칭한다. 바람직한 구체 예에서, 이들 용어는 약 0.5중량 % 미만, 약 0.1중량 % 미만, 또는 약 0.01중량 % 미만을 지칭한다.
본 발명에 사용하기 위한 프로브 및 프라이머는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 잔기는 1, 두 번째 잔기는 2 등의 숫자 값을 서열에 할당함으로써 주어진 서열에 포함된 모든 프로브 또는 프라이머를 정의하는 알고리즘을 제안할 수 있다:
n 내지 n+y (여기서, n은 1 내지 마지막 서열 수의 정수이고, y는 프로브 또는 프라이머의 길이에서 1을 뺀 값이다. 여기서 n + y는 서열의 마지막 수를 초과하지 않음). 따라서, 25- 염기쌍 프로브 또는 프라이머(즉, "25 mer")의 경우, 프로브 또는 프라이머의 수집은 염기 1 내지 25, 염기 2 내지 26, 염기 3 내지 27, 염기 4 내지 28에 상응하고, 따라서 서열의 전체 길이에 걸칠 수 있다. 유사하게, 35- 염기쌍 프로브 또는 프라이머(즉, "35-mer")의 경우, 예시적인 프라이머 또는 프로브 서열은 염기 1 내지 35, 염기 2 내지 36, 염기 3 내지 37, 염기 4 내지 38에 상응하는 서열을 전체 길이에 걸쳐 마찬가지로 제한 없이 포함한다. 이와 유사하게 40-mer의 경우, 이러한 프로브 또는 프라이머는 제1 염기쌍 내지 염기쌍 40, 서열의 제2 bp 내지 bp 41, 제3 bp 내지 bp 42 등의 뉴클레오티드에 상응하는 반면, 50 -mer, 이러한 프로브 또는 프라이머는 bp 1 내지 bp 50, bp 2 내지 bp 51, bp 3 내지 bp 52, bp 4 내지 bp 53 등으로 연장되는 뉴클레오티드 서열에 해당할 수있다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 상응하는", "실질적으로 상동성" 또는 "실질적인 동일성"은 핵산 또는 아미노산 서열의 특성을 나타내며, 여기서 선택된 핵산 또는 아미노산 서열은 선택된 기준 핵산 또는 아미노산 서열과 비교하여 약 70 또는 약 75% 이상의 서열 동일성을 나타내고, 보다 전형적으로, 선택된 서열 및 기준 서열은 약 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 심지어 85% 이상의 서열 동일성을 가지며, 보다 바람직하게는 약 86, 87 이상, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95% 서열 동일성을 가지고, 더욱 바람직하게는, 매우 상동성인 서열은 종종 선택된 서열과 이것이 비교된 기준 서열 사이에서 적어도 약 96, 97, 98 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유한다.
본원에 사용된 "합성"은 물질이 인간 또는 동물 기원이 아님을 의미한다.
"치료-실용 기간(therapuetically-practical period"이라는 용어는 하나 이상의 활성제가 치료효과를 발휘하는 데 필요한 기간을 의미한다. "치료적으로 효과적"이라는 용어는 하나 이상의 증상의 심각도 및/또는 빈도의 감소, 하나 이상의 증상 및/또는 근본적인 원인 제거, 증상 및/또는 그 근본 원인 발생의 방지, 그리고 손상의 개선 또는 교정조치를 의미한다.
"치료제"는 개체의 표적 부위에서 원하는 생물학적 효과를 생성할 수 있는 임의의 생리학적 또는 약리학적 활성 물질 일 수 있다. 치료제는 화학 요법제, 면역 억제제, 사이토카인, 세포 독성제, 핵산 분해성 화합물, 방사성 동위 원소, 수용체 및 전구 약물 활성화 효소 일 수 있으며, 이는 자연적으로 발생하거나 합성 또는 재조합 방법 또는 이들의 임의의 조합에 의해 생성될 수 있다. 빈카 알칼로이드 (예 : 빈블라스틴 및 빈크리스틴), 안트라사이클린 (예 : 독소루비신 및 다우 노루비신), RNA 전사 억제제 (예 : 악티노마이신-D) 및 미세 소관 안정화 약물(예 : 파클리탁셀)과 같은 고전적인 다중 약물 내성에 영향을 받는 약물은 치료제로서 특히 유용할 수 있다. 사이토카인이 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 암 화학 요법제는 바람직한 치료 제일 수 있다. 항암제 및 다른 치료제에 대한보다 상세한 설명을 위해, 당업자는 의사의 책상 참조 및 Goodman and Gilman's “Pharmacological Basis of Therapeutics” tenth edition, Hardman et al. (Eds.) (2001).을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 많은 수의 설명서를 참조한다.
본원에 사용된 "전사 인자 인식 부위" 및 "전사 인자 결합 부위"는 폴리뉴클레오티드 서열(들) 또는 서열 모티프(들)을 지칭하며, 이는 서열-특이적 상호 작용을 위한 부위인 것으로 식별된다. 종종 직접 단백질-DNA 결합 형태를 취하는 하나 이상의 전사 인자. 전형적으로, 전사 인자 결합 부위는 DNA footprinting, 겔 이동성 이동 분석 등에 의해 식별될 수 있고/있거나 공지된 컨센서스 서열 모티프 또는 당업자에게 공지된 다른 방법에 기초하여 예측될 수 있다.
"전사 조절 요소"는 전사를 단독으로 또는 하나 이상의 다른 핵산 서열과 조합하여 활성화 시키는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 전사 조절 요소는 예를 들어 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 반응 요소, 하나 이상의 음성 조절 요소 및/또는 하나 이상의 인핸서를 포함할 수 있다.
"전사 단위"는 적어도 제1 시스-작용 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 제1 구조적 유전자를 포함하고 선택적으로 효율적으로 필요한 하나 이상의 다른 시스-작용 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열, 및 구조 유전자 서열의 전사, 및 프로모터 및/또는 인핸서 요소의 제어하에 작동 가능하게 위치된 구조 유전자 서열의 적절한 조직 특이적 및 발달 전사에 필요할 수 있는 적어도 제1 원위 조절 요소뿐만 아니라 효율적인 전사 및 번역 (예를 들어, 폴리아데닐화 부위(들), mRNA 안정성 제어 서열(들) 등)에 필요한 임의의 추가 시스-서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형질 전환"은 일반적으로 외인성 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 재조합 DNA 또는 RNA 분자)을 숙주 세포 또는 원형질체 내로 도입하는 과정을 설명하고자 한다. 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 적어도 제1 염색체에 포함되거나 형질전환 된 숙주 세포 내에서 자율 복제될 수 있다. 형질 감염, 전기 천공 및 "naked" 핵산 흡수는 모두 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 기술의 예를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "형질전환 된 세포"는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 그 세포 내로 도입함으로써 핵산 상보체가 변경된 숙주 세포를 의미하고자한다.
본원에 사용된 "치료하는" 또는 "-의 치료"는 개체에게 임의의 유형의 의료 또는 수술 관리를 제공하는 것을 지칭한다. 치료는 치료제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. "치료하는"은 질환, 장애 또는 질병의 치료, 역전, 완화, 중증도 감소, 진행 억제 또는 가능성과 같은 목적을 위해 본 발명의 화합물 또는 조성물을 대상에게 투여 또는 적용하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 조성물은 또한 예방적으로, 즉 그러한 예방이 필요한 상태의 증상 또는 증상의 발생 전에 예방적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 이러한 경우에, 대상은 가족력, 의학적 기록, 또는 그러한 질병 또는 장애를 계속 발전시키는 경향을 나타내는 하나 이상의 진단 또는 예후의 완료로 인해 이러한 질환 또는 장애가 "위험에 처한" 것으로 진단된 대상일 것이다.
본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포에서 복제될 수 있고/있거나 다른 핵산 분절이 연결된 분절의 복제를 발생시키기 위해 작동 가능하게 연결될 수 있는 핵산 분자(전형적으로 DNA로 구성됨)를 지칭한다. 코스미드 또는 바이러스는 예시적인 벡터이다.
개시된 백신 전달 조성물로부터 활성제의 방출 동역학에 적용되는 표현 "제로-오더"또는 "제로-제로-오더"는 조성물의 투여 후 치료적으로 실제적인 기간으로서, 활성제의 치료적으로 효과적인 혈장 농도가 달성되는 동안 제어된 방식으로 활성제의 방출 속도를 포함하도록 의도된다.
특정 실시 양태에서, 표지된 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하는 경우와 같이 혼성화 분석에서 주어진 표적 서열의 존재를 결정하는데 있어 적절한 검출 가능한 마커(즉, "표지")와 조합하여 본 발명의 하나 이상의 핵산 분절을 사용하는 것이 유리할 것이다. 적합한 분석에서 검출을 가능하게 하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브를 표지하기 위한 다양한 적합한 표지 화합물 및 조성물의 예로 형광, 방사성, 효소 또는 다른 리간드, 예컨대 아비딘/비오틴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이는 당업계에 공지되어있다. 특정 실시 양태에서, 방사성 또는 다른 환경적으로 바람직하지 않은 시약 대신에 하나 이상의 형광 표지 또는 우레아제, 알칼리 포스파타제 또는 퍼옥시다제와 같은 효소 태그를 사용할 수도 있다.
효소 태그의 경우, 하나 이상의 상보적 또는 실질적으로 상보적인 핵산 서열을 함유하는 샘플과의 특이적 혼성화를 확인하기 위해 육안으로 볼 수 있는 샘플을 검출하는 방법, 또는 신티그라피, 형광 분석법, 분광 광도법과 같은 분석적 방법을 제공하는 비색법, 발색법 및 형광법의 표지자 기질이 공지되어 있다. 2개 이상의 라벨링 된 프로브가 동시에 또는 순차적으로 검출되는 소위 "멀티플렉싱" 분석의 경우, 제1 검출 특성 또는 파라미터를 갖는 제1 라벨로 제1 올리고 뉴클레오티드 프로브를 라벨링하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어, 방출 및/또는 여기 스펙트럼 최대치임), 이는 또한 상이한 제2 검출 특성 또는 파라미터를 갖는 제2 라벨(예를 들어, 제1 라벨과는 별개이거나 식별 가능한)을 갖는 제2 라벨로 제2 올리고 뉴클레오티드 프로브를 라벨링 할 수 있다. 멀티플렉싱 분석의 사용, 특히 유전자 증폭/검출 프로토콜의 맥락은 분자 유전학 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
생물학적 기능적으로 등가물
변형 및 변화는 핵산의 구조, 또는 이를 포함하는 벡터, 및 이들에 의해 코딩된 mRNA, 폴리펩티드 또는 치료제에서 이루어질 수 있고 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는 치료제를 포함하는 기능성 백신 전달 시스템을 수득할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 하나 이상의 돌연변이를 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 도입하는 것이 종종 바람직하다. 특정 상황에서, 생성된 암호화된 폴리펩티드 서열은 이 돌연변이에 의해 변경되거나, 다른 경우에, 폴리펩티드의 서열은 암호화 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 변하지 않는다.
동등하거나 심지어 개선된 2세대 분자를 생성하기 위해 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하는 것이 바람직한 경우, 표 1에 따르면 아미노산 변화는 암호화 DNA 서열의 하나 이상의 코돈을 변경함으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 특정 아미노산은 예를 들어 항체의 항원 결합 영역 또는 기질 분자 상의 결합 부위와 같은 구조체와의 상호적인 결합 능력의 상당한 손실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정의하는 것이 단백질의 상호 작용 능력 및 성질이기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환은 단백질 서열, 및 물론 이의 기본 DNA 코딩 서열에서 이루어질 수 있지만 그럼에도 불구하고 유사한 속성의 단백질을 얻을 수 있다. 따라서, 생물학적 조성물 또는 활성의 상당한 손실 없이 상기 펩티드를 인코딩하는 개시된 조성물의 펩티드 서열 또는 상응하는 DNA 서열에서 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 본 발명자들에 의해 고려된다.
아미노산 코돈
알라닌 Ala A GCA GCC GCG GCU
시스테인 Cys C UGC UGU
아스파르트산 Asp D GAC GAU
글루탐산 Glu E GAA GAG
페닐알라닌 Phe F UUC UUU
글리신 Gly G GGA GGC GGG GGU
히스티딘 His H CAC CAU
이소류신 Ile I AUA AUC AUU
라이신 Lys K AAA AAG
류신 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
메티오닌 Met M AUG
아스파라긴 Asn N AAC AAU
프롤린 Pro P CCA CCC CCG CCU
글루타민 Gln Q CAA CAG
아르기닌 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
세린 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
트레오닌 Thr T ACA ACC ACG ACU
발린 Val V GUA GUC GUG GUU
트립토판 Trp W UGG
티로신 Tyr Y UAC UAU
이러한 변경에서, 아미노산의 hydropathy 지수(친수성 아미노산 지수)가 고려될 수 있다. 단백질에 대한 상호 생물학적 기능을 부여함에 있어서 친수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에 이해되어있다(Kyte and Doolittle, 1982, 본 명세서에 참고로 포함됨). 아미노산의 상대적인 친수성 특성은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원, 등. 각 아미노산에는 소수성 및 전하 특성에 기초하여 수치 지수가 지정되어 있다(Kyte and Doolittle, 1982). 이 값은 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트산(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5) 이다.
특정 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 생성하는 것, 즉 여전히 생물학적 기능적으로 동등한 단백질을 얻는다는 것이 공지되어있다. 이러한 변화를 행함에 있어서, 친수성 지수가 2 이내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하고, 1 이내에 있는 것이 특히 바람직하고, 0.5 이내에 있는 것이 더욱 특히 바람직하다. 또한, 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수있는 것으로 이해된다. 미국 특허 제 4,554,101 호(특별히 본원에 명시적으로 참고로 포함됨)는 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 관련이 있다고 언급하고 있다.
미국 특허 제 4,554,101 호에 상세히 기재된 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르트산(+3.0 ±1); 글루탐산(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신 (0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있고 생물학적으로 동등한, 특히 면역학적으로 동등한 단백질을 여전히 얻을 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내에 있는 것이 바람직하고, ±0.5 이내에 있는 것이 훨씬 더 바람직하다.
전술한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 이의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 전술한 특성 중 하나 이상을 고려하는 예시적인 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루탐산 및 아스파르트산; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
본 명세서 전체적으로 사용된 부분의 제목은 단지 정리를 위한 것이며, 기술 된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원에 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부(특허, 특허 출원, 기사, 서적 및 논문을 포함하지만 이에 제한되지 않음)는 본 명세서에 명백히 참고로 포함된다. 하나 이상의 통합된 문헌 및 유사한 자료가 본 출원에서 해당 용어의 정의와 상반되는 방식으로 용어를 정의하는 경우, 본 출원이 우선한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 예시적인 구체예를 설명하기 위해 포함된다. 이들 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 것으로 밝혀진 기술을 나타내고, 따라서 그의 바람직한 실시 방식을 구성하는 것으로 간주 될 수 있음을 당업자는 인식해야 한다. 그러나 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 실시 예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 유사하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 인식해야한다.
실시예 1- 리포플렉스 잠재적인 mRNA -기반의 백신의 항-종양 면역
이 실시예에서, 1,2- 디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린/1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올아민/1,2-디스테아르오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000(EDOPC/DOPE/DSPE-PEG) 지질 쉘에 캡슐화된 폴리-(β-아미노에스테르) 폴리머 mRNA 코어로 구성된 리포폴리플렉스 mRNA 백신이 기술되어있다. 이 코어-쉘 구조화된 mRNA 백신은 대음세포작용(macropinocytosis)을 통해 수지상 세포로 들어간다. 그것은 Toll-like receptor 7/8 신호를 통해 수지상 세포에서 인터페론-α와 인터루킨-12 발현을 강력하게 자극함으로써 고유의 보조제(아쥬반트) 활성을 나타냈다. mRNA 백신으로 처리된 수지상 세포는 향상된 항원 제시 능력을 나타냈다. 오브알부민 항원을 발현하는 폐 전이성 B16-OVA 종양을 갖는 마우스를 리포폴리플렉스 mRNA로 처리하고, 종양 결절의 90% 초과 감소가 관찰되었다. 종합적으로, 이 코어-쉘 구조는 포유동물 세포에 mRNA 백신을 전달하기 위한 우수한 시스템을 제공한다.
도 1A는 본 발명의 한 측면에 따른 예시적인 쉘/코어-mRNA 리포폴리플렉스 백신 조성물의 합성을 개략적으로 도시한다. 쉘/코어-mRNA 백신에서, 음으로 하전 된 mRNA는 양으로 하전된 중합체 내에서 응축되었으며, 이는 수 나노 미터 내지 수백 나노 미터 직경의 단단한 폴리플렉스 "코어" 구조를 함께 형성했다. 이어서, 이 폴리플렉스 코어를 수지상 세포에 의한 흡수를 향상시키고, 내부 코어 내의 mRNA 분자가 세포성 뉴클레아제에 의해 분해되는 것을 방지하는 친수성 인지질 이중층 "쉘"에 의해 캡슐화되었다. 생성된 3성분 쉘/코어/RNA 조성물은 또한 하나 이상의 가용성 보조제를 폴리플렉스-mRNA 내부 코어와 외부 지질 쉘 사이의 공간에 로딩하여 항종양 면역성을 추가로 향상시킴으로써 추가로 변형 될 수 있다.
본원에 기재된 결과는 통상적인 압축 코어-mRNA 백신과 비교하여 개시된 쉘/ -mRNA-폴리플렉스 구조 백신 시스템의 여러 장점을 나타낸다. 폴리플렉스 코어 -mRNA 입자를 인지질 외부 쉘 내로 캡슐화하는 것은 코어 mRNA 분자의 분해로부터 보호할뿐만 아니라 항원-제시 수지상 세포에 의해 백신 입자의 흡수를 상당히 개선 시켰다(도 1A). 또한, 코어를 캡슐화하는 지질 쉘 구조의 존재는 코어-mRNA 분자가 비-DC 면역 세포와 상호 작용하는 것을 막았으며, 이는 잠재적으로 바람직하지 않은 부작용을 제한하였다. 또한, 본원에 개시된 LPP-mRNA 백신 조성물은 IFN-α 및 IL-12 (DC 성숙 촉진을 통한 항종양 면역의 매개에 중요한 역할을 하는 사이토카인)의 발현을 자극하는데 있어서 통상적인 "naked" mRNA-코어 백신보다 더 강력하였다(도 4A). 또한, LPP-mRNA 백신은 종양 세포 사멸을 매개하는데 매우 강력 하였다. 마지막으로, 본원에 기재된 쉘/코어/mRNA 다중 성분 백신 조성물은 또한 항원-제시 세포의 활성을 추가로 향상시킬 필요가 있을 때마다 지질 쉘에서 가용성 보조제 또는 다른 자극 분자를 캡슐화 하기위한 효과적인 옵션을 제공하였다. 이러한 모든 특성은 빠르게 진화하는 정밀 의학 시대에 새로운 면역 치료제를 만드는 데 이 치료 백신 플랫폼의 유용성을 강조한다.
재료 및 방법
폴리 -(β- 아미노 에스테르) 중합체 ( PbAE )의 합성. PbAE (분자량 ~ 4kDa)는 앞서 기술한 바와 같이 two-step 반응 과정에서 합성되었다(Kamat et al., 2013). 제1 단계에서, 1,4-부탄디올 디아크릴레이트(Sigma-Aldrich)와 5-아미노-1-펜탄올 (Sigma-Aldrich)을 1.2:1의 몰비로 혼합하여 베이스 폴리머를 합성하였다. 테플론 교반 막대를 갖는 유리 섬광 바이알에서 반응을 90℃에서 24시간 동안 유지시켰다. 베이스 폴리머를 건조 시킨 후, 최종 농도 167 mg/mL에서 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켰다. 두 번째 단계에서, 480㎕의 베이스 폴리머 용액을 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에서 320㎕의 0.5mol/L(PEO) 4-비스-아민(Molecular Biosciences, 미국 콜로라도 주 볼더)과 혼합하고, 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 폴리머 혼합물을 먼저 투석 튜브(MWCO 3,500 Da)에서 milli-Q water에 대해 투석하여 대량의 free reagent을 제거한 다음, 4배 부피의 에틸에테르(Sigma-Aldrich)와 혼합하고 격렬하게 볼텍싱 한 다음 원심분리 하였다. 상청액에서 미반응 단량체를 추가로 제거하기 위해 4,000rpm에서 5분 동안. 정제된 폴리머를 진공 건조 시킨 후, pH 5.2의 25 mM 아세트산 나트륨에 용해시켰다.
PbAE / mRNA 폴리플렉스의 준비. PbAE / mRNA 폴리플렉스는 1 부피의 PbAE 폴리머를 2 부피의 mRNA 분자(Trilink Biotechnologies, San Diego, CA, USA)와 혼합함으로써 제조되었다. 20℃에서 20분 동안 배양 한 후, Malvern Zetasizer Nano ZS 동적 광산란기구(Malvern Instruments, Inc., Worcestershire, United Kingdom)를 사용하여 크기 분포 및 제타 전위에 대해 폴리플렉스를 분석하였다. PbAE/mRNA 폴리 플렉스는 또한 겔 지연 분석에서 분석되었다. 간단히, 250ng mRNA를 함유하는 폴리플렉스 샘플을 각각의 웰에 로딩하고 1x TBE 완충제(BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 0.7 % 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분리하였다. RNA 밴드를 Gelred nucleic acid gel stain(Biotium, Hayward, CA, USA)으로 염색하고 GelDoc 시스템 (BioRad, Hercules, CA, USA)으로 시각화 하였다.
LPP / mRNA 백신의 준비 및 특성 분석. 지질 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3- 에틸포스포콜린(EDOPC), 1,2- 디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올아민 (DOPE), 1,2- 디스테아르오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000(DSPE-PEG-2000), 콜레스테릴 헤미숙시네이트(CHEMS) 및 1,2-디올 레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)은 Avanti Polar Lipids(버밍엄, AL, 미국)로부터 구입하였다. 콜레스테롤은 Sigma-Aldrich(미국 미주리 주 세인트루이스)에서 얻었다. 시약을 최종 농도 20 mg/mL의 클로로포름에 용해시키고 Buchi Rotavapor(올드햄, 영국)에서 회전식 증발에 의해 부분 진공하에 얇은 지질 필름을 제조하였다. 얇은 지질 필름은 49% EDOPC, 49% DOPE 및 2% DSPE-PEG로 구성되었다. 지질 필름을 PbAE/mRNA 폴리플렉스를 함유하는 용액으로 재수화하여 리포폴리플렉스 mRNA 백신을 제조하였다. LPP/mRNA 백신의 크기 분포 및 제타 전위를 DLS 및 투과 전자 현미경(TEM)으로 측정하였다. 동일한 절차를 적용하여 CHEMS/DOPE/옥타 아르기닌(CHEMS/DOPE/R8) 및 DOTAP/콜레스테롤/DSPE-PEG-2000(DOTAP/Chol/DSPE-PEG-2000) 리포폴리플렉스를 제조하였다. 프로타민/mRNA 폴리플렉스를 제조하기 위해, 프로타민 설페이트(그레이드 X, Sigma-Aldrich)를 10mM Tris-HCL 완충액에서 2:1의 중량비로 mRNA와 혼합 한 다음, 실온에서 30분 동안 배양 하였다.
인 비트로에서 LPP / mRNA 백신의 세포 흡수. 불멸화된 DC2.4(쥐 골수 유래 수지상 세포주)세포를 적용하여 LPP/mRNA 백신으로부터 단백질 발현을 시험하였다. 간략하게, 세포를 1.5×105 cells/well의 밀도로 24- 웰 플레이트에 도말하고, 1mL RPMI-1640 완전 배지(10% 우태아혈청[FBS, Atlas Biological, Fort Collins, CO, USA], 1% 페니실린/스트렙토마이신[10,000 페니실린 및 10mg 스트렙토마이신, Sigma-Aldrich] 및 0.1% β- 머캅토에탄올 [Sigma-Aldrich])에 유지하였다. 세포를 24시간 동안 0.5㎍ eGFP mRNA (LPP/eGFP mRNA)로 패키징된 LPP와 함께 배양하고, Eclipse TE2000-S 형광 현미경(Nikon Corporation, Tokyo, JAPAN)을 사용하여 eGFP 발현을 시각화하였다. Accuri C6 유세포 분석기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 GFP-양성 세포의 백분율을 측정하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 인간 MDA-MB-231 유방암 세포(American Type Culture Collection; 미국 버지니아 주 매너서스) 및 뮤린 mDMEC 피부 내피 세포에서 각각 LPP/eGFP mRNA와 배양 된 후 eGFP 발현을 측정하기 위해 동일한 절차를 적용하였다.
LPP/mRNA 백신의 세포 내재화 경로를 결정하기 위해, DC2.4 세포를 24-웰 플레이트에 1.5 x 105 cells/well의 밀도로 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양 하였다. 그런 다음 LPP(LPP/FAM-mRNA)에 패키징된 FAM-표지 mRNA와 다음과 같은 소분자 억제제 중 하나인 아밀로라이드(0.2mM), 클로로퀸(100mM), 제니스테인(50μM), 클로르프로마진(15μM) 또는 pimozide(10μM)으로 처리했다. 세포를 차가운 PBS로 세척하기 전에 세포를 4시간 동안 성장시키고 형광 현미경을 통한 입자 흡수를 결정하기 위해 적용하였다.
인 비트로에서 LPP / mRNA의 세포 생존능 . LPP/mRNA 백신으로부터의 잠재적 세포 독성을 시험하기 위해, DC2.4, MDA-MB-231 및 내피세포를 96 웰 플레이트에 3 × 104 cells/well의 밀도로 도말하고 LPP/0.1㎍ mRNA로 처리하였다. 제조사의 지시에 따라 테트라졸륨-기반 CellTiter 96®; Aqueous One Solution Cell Proliferation (MTS) 분석(Promega, Inc., Madison, WI, USA)으로 24시간 후에 세포 생존능을 측정하였다.
골수- 유래된 수지상 세포( BMDCs )의 준비. BMDCs는 이전에 기재된 바와 같이 C57BL/6 마우스로부터 제조되었다(Xia et al., 2015). 간단히, 대퇴골 및 경골로부터의 골수 세포를 주사기를 사용하여 2% FBS-함유 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척하였다. 세포를 500×g에서 4분 동안 원심 분리하고, ACK 용해 완충액(Lonza, Inc.)으로 처리하여 적혈구를 제거하고, 10% FBS, 0.5% β-머캅토 에탄올, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 20ng/mL 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 및 20ng/mL 인터류킨-4(IL-4)이 보충된 RPMI-1640 배양 배지에 재현탁시켰다. 이들은 1×106 cells/mL의 밀도로 6-웰 플레이트에 도말되었고, 성장 배지는 격일로 변경되었다. 비부착성 수지상 세포를 5일째에 수확하였다.
전- 염증적 사이토카인의 측정. BMDCs를 24-웰 플레이트에 3×105 cells/well의 밀도로 도말하고 LPP/0.5㎍ 오브알부민 mRNA로 처리하였다. LPP/mRNA 백신(리포좀 쉘 및 폴리플렉스 코어)의 분해된 성분은 음성 대조군으로서 작용하였다. 24시간의 배양 후, 상청액을 수집하고, 사이토카인 측정을 위한 ELISA 키트 (eBioscience, San Diego, CA, USA)로 IL-6, TNF-α, IFN-β 및 IL-12 농도를 측정 하였다.
TLR7 /8 억제. DC2.4 세포를 1.5×105 cells/ 1mL RPMI-1640 완전 배지의 밀도로 24 웰 플레이트에 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 1시간 동안 2.5마이크로몰의 최종 농도로 TLR7/8 억제제 ODN 2087(미국 캘리포니아 주 샌디에고 소재의 밀리엔 바이오텍 (Militenly Biotec))로 처리하였다. 이어서, LPP/0.5㎍ OVA mRNA를 배양물에 첨가하고, 세포 배양 배지를 사이토카인 분석을 위해 수집하기 전에 추가 24시간 동안 세포 성장을 유지시켰다. TLR 억제제 처리가 없는 수지상 세포는 양성 대조군으로서 작용하였고, LPP/OVA mRNA 처리가 없는 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다.
수지상 세포 성숙의 평가. DC2.4 세포를 1.5×105 cells/well의 밀도로 24- 웰 플레이트에 1mL RPMI 완전 배지와 함께 도말하였다. LPP/0.5㎍ mRNA로 처리하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, CD11c, CD40, CD86 및 MHC II(BD Bioscience)에 특이적인 항체로 염색하고, BD Accuri C6 유세포 분석기 (Becton Dickinson, Inc., Franklin Lakes, NJ, 미국)에 적용하였다.
MHC Ⅰ 및 Ⅱ-제한된 항원 제시 분석. 항원 제시를 측정하기 위해, LPP/OVA mRNA로 처리된 BMDC를 OVA257-264-H-2Kb 복합체(H-2Kb / SIINFEKL, BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 인식하는 펜타머로 실온에서 10분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 항-CD11c 항체(BD Bioscience)로 30분 동안 염색하고 Accuri C6 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
T 세포 활성화를 결정하기 위해, BMDC 및 DC2.4 세포를 24시간 동안 LPP/0.5㎍ OVA mRNA로 처리하였다. 세포를 PBS로 세척하고 1:1의 DC/T 세포 비율에서 B3Z OVA-특이적 CD8 T 세포 또는 DOBW OVA-특이적 CD4 T 세포와 공동 배양하였다. 활성화된 T 세포에 의한 IL-2 분비를 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 모든 샘플을 3회 측정하였다.
세포독성 T 세포에 의한 B16-OVA 흑색종 세포의 인 비트로 사멸. DC2.4를 24-웰 플레이트에 1.5×105 cells/well의 밀도로 도말하였다. 밤새 배양 한 후, 세포를 37℃에서 24시간 동안 LPP/0.5㎍ OVA mRNA로 처리하였다. 이들 DC2.4 세포는이어서 1:2의 DC2.4/T 세포 비율에서 B3Z T 세포와 공동 배양되었다. 24시간의 배양 후, 활성화된 T 세포를 37℃에서 4, 8 또는 24시간 동안 5:1의 T 세포/종양 세포 비율로 B16 흑색종 세포와의 공동 배양에 적용하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 MTS 포르마잔 생존력 분석(Promega, Inc., Madison, WI, USA)을 사용하여 종양 세포 생존력을 측정하였다. 비활성화된 T 세포 또는 HER2 유방암 항원 펩티드로 활성화된 T 세포로 처리된 종양 세포는 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 샘플을 3 회 측정하였다.
폐 전이성 흑색종의 쥐 모델에서의 효능 시험. 8주령 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥 주사에 의해 2.5×105개의 B16-OVA 흑색종 종양 세포를 접종하여 전술 한 프로토콜에 따라 폐 전이성 종양을 확립시켰다(Overwijk and Restifo, 2001). 종양 접종 3일 후, 마우스에 LPP/OVA mRNA(1㎍)를 피하 백신으로 접종하였다. 예방 접종은 7일과 10일에 2회 더 접종하여 강화시켰다. 마우스를 18일에 안락사시키고, 폐를 수집하여 4% 파라 포름알데히드로 고정 시켰다. 해부 현미경으로 폐 전이성 종양 결절의 수를 세었다.
살아있는 생쥐에서의 생체발광 이미지. BALB/c 마우스에 LPP(LPP/Luc mRNA)에 로딩된 10㎍의 루시퍼라제 mRNA를 피하 투여하였다. 24시간 또는 48시간 후에 30㎍의 RediJect D- 루시페린 울트라(Perkin-Elmer)를 마우스에 복강 내 주사하고, Xenogen IVIS-200 이미징 시스템에서 생체 발광을 측정 하였다.
폐 전이성 흑색종의 쥐 모델에서의 효능 시험. 8주령 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥 주사에 의해 2.5×105개의 B16-OVA 흑색종 종양 세포를 접종하여 폐 전이성 종양을 확립하였다. 종양 접종 3일 후, 마우스에 LPP/OVA mRNA(1 mg)를 피하 백신 접종하였다. 예방 접종은 7일과 10일에 2회 더 접종하여 강화되었습니다. 마우스를 18일에 안락사시키고, 폐를 수확하고 4% 파라 포름알데히드로 고정시켰다. 해부 현미경으로 폐 전이성 종양 결절의 수를 세었다.
인 비보 T 세포 활성화 분석. T 세포 활성화 상태를 결정하기 위해, C57BL/6 마우스를 2.5mg LPP/OVA mRNA로 면역시켰다. 표면 마커에 의한 T 세포 활성화를 결정하기 위해, 마우스를 24시간 후에 안락사시키고, 비장 및 림프절을 수집, 처리하고, 항-쥐(murine) CD3, CD4, CD8 또는 CD69 항체(Ebioscience)로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 BD Accuri C6 유세포 분석기(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하여 유세포 측정법으로 분석하였다. IFN-β 분비에 의한 T 세포 활성화를 측정하기 위해, C57BL/6 마우스를 s.c로 면역시켰다. 1일, 4일 및 7일에 LPP/OVA mRNA 또는 LPP/TRP2 mRNA를 사용하여 최종 면역화 1주일 후, 비장, 림프절 및 PBMC를 수집하고 단일 세포 분석을 위해 처리하였다. 세포를 37℃에서 48시간 동안 OT-1(OVA257-264), OT-II(OVA323-339) 또는 PMA-이오노마이신으로 재자극시켰다. IFN-β 분비는 ELISA(eBioscience)에 의해 분석되었다.
통계적 분석. 실험 그룹 간의 비교를 위해 two-tailed Student's t-test 검정을 사용하였다. P <0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
리포 폴리플렉스 -기반 mRNA 백신은 수지상 세포 흡수 및 단백질 발현에 최적이다. 지질 이중층 막에 패키징된 PbAE/mRNA 폴리플렉스 코어 구조를 포함하는 mRNA-기반 백신에 대한 플랫폼이 기술되어있다(도 1A). 양이온성 PbAE 폴리머에 대한 mRNA 결합능을 조사하기 위해 아가로스 겔 전기영동을 수행하였고, PbAE/mRNA 비율 (wt./wt.)이 20 이상일 때 mRNA가 PbAE 내로 완전히 캡슐화된 것으로 결정되었다(도 1B). 결과적으로, 나머지 연구에서 LPP mRNA 백신을 제조하기 위해 PbAE/mRNA 비율이 20으로 선택되었다. TEM 분석은 EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000 지질 쉘(도 1D, 도 1E 및 도 1F)로 둘러싸인 50nm PbAE/mRNA 폴리플렉스 코어(도 1C)를 검출하였다.
LPP/mRNA 백신에 대한 지질 쉘을 EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000, DOTAP/Chol/ DSPE-PEG-2000 및 CHEMS/DOPE/R8 사이에서 비교하였다. DOTAP/Chol/DSPE-PEG-2000은 양이온성 지질 쉘을 형성하고, CHEMS/DOPE/R8은 활성 표적화 모이어티를 갖는 지질 쉘이고; 둘 다 이전에 RNA 전달에 적용되었다(Wang et al., 2013; Hayashi et al., 2015). DC2.4는 항원 제시 세포로서 작용하였고 eGFP 단백질을 암호화하는 mRNA 분자를 적용하여 폴리플렉스 코어를 제조하였다. PbAE/mRNA 코어와 함께 배양 된 세포는 검출 가능한 수준의 eGFP를 발현하지 않았다(도 1G). EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000 및 DOTAP/Chol/DSPE-PEG-2000 패키지 입자로 처리된 세포는 밝은 eGFP 단백질을 발현하지만, CHEMS/DOPE/R8로 패키징된 폴리플렉스와 함께 배양된 세포는 검출 가능한 수준의 eGFP를 발현하지 않았다(도 1H, 도 1I 및 도 1J). 흥미롭게도, 프로타민/eGFP로 처리된 세포는 높은 수준의 eGFP 발현을 갖지 않았지만(도 1K), 그럼에도 불구하고 프로타민-기반 mRNA 백신은 임상 시험의 상이한 단계에 있다allen and Thess, 2014). 또한, DSPE-PEG-2000 제형으로부터 높은 수준의 세포 독성이 검출되었다(도 1L). 결과적으로, 모든 후속 연구에서 LPP/mRNA 백신 제조를 위해 EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000이 선택되었다.
LPP/mRNA 백신은 대음세포작용(macropinocytosis)을 통해 수지상 세포로 들어간다. 상이한 세포 유형에 의한 LPP/mRNA 백신 입자의 흡수가 조사되었다. PbAE/eGFP mRNA로 패키징된 동일한 양의 EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000 입자를 DC 2.4 세포, MDA-MB-231 인간 유방암 세포 또는 mDMEC 쥐 내피세포의 배양에 첨가하고, eGFP를 발현하는 세포는 24시간 후에 측정되었다. DC가 포식 작용 가능성이 높은 가장 효과적인 항원-제시 세포라는 개념에 따라(Banchereau and Steinman, 1998), 모든 DC2.4 세포는 백신 입자를 내재화하고 녹색 형광 단백질을 발현 하였다; 비교하면, MDA-MB-231 세포의 약 절반은 GFP 양성이었고, 내피세포의 작은 부분 만이 GFP를 합성했다 (도 2).
세포 내 흡수 메커니즘은 내포 작용, 대음세포작용 및 포식 작용의 억제제로 DC2.4 세포를 처리함으로써 검사하였다. 대음세포작용의 억제제인 아밀로라이드로의 처리(Koivusalo et al., 2010)는 EDOPC/DOPE/DSPE-PEG-2000 패키지된, FAM 형광 염료 표지 mRNA(LPP / FAM-mRNA)의 세포 흡수를 70%까지 감소시켰다. 이에 비해, 입자의 세포 흡수는 카베올린-매개 내포 작용 억제제인 제니스테인; 클라스린-매개 내포 작용 억제제인 클로르프로마진; 또는 포식 작용 억제제인 피모지드에 의해 크게 영향을 받지 않았다(도 3A, 도 3B, 도 3C, 도 3D, 도 3E, 도 3F 및 도 3G 참조).
이들 결과는 대음세포작용이 개시된 LPP mRNA-기반 백신에 대한 주요 세포 진입 경로임을 시사하였다. 유의하게도, 엔도좀 산성화 및 성숙을 방지하는 시약 인 클로로퀸은 mRNA 축적에 영향을 미치지 않았다(도 3A, 도 3B, 도 3C, 도 3D, 도 3E, 도 3F 및 도 3G). 클로로퀸 처리된 세포의 시간-의존적 모니터링은 배양 후 120분에 도달한 피크 강도와 함께 형광 강도의 지연된 증가를 보여 주었다(도 3H). 이 결과는 mRNA 분자가 엔도좀에서 성공적으로 빠져나와 세포질로 들어갔음을 나타낸다.
LPP mRNA 백신이 DC 성숙을 촉진한다. 과발현된 오브알부민(OVA)을 갖는 쥐 종양 모델은 암 백신의 효과를 시험하기 위해 광범위하게 적용되었다(Kim et al., 2015; Avci et al., 2011; Uhlig et al., 2015). 치료 mRNA 백신(LPP/OVA)을 조립하기 위해 OVA mRNA를 적용하고, 시험관 내 및 생체 내 항종양 면역을 조사하였다. 시험관 내 환경에서, 골수 유래 DC(BMDC)를 LPP/OVA 또는 대조군과 함께 배양하고, 세포 성장 배지에서 사이토카인 수준을 측정하였다. 흥미롭게도, 폴리플렉스/OVA 코어 및 LPP/OVA는 프로타민/OVA와 함께 상당한 TNF-α 발현을 유발할 수 있었다(도 4A). TNF-α-의존성 DC 성숙이 바이러스 감염에 대한 적응성 면역 반응을 활성화시키고(Trevejo et al., 2001) 항종양 면역에 중요하다는 것이 이전에 보고된 바있다(Brunner et al., 2000). 그러나, 폴리플렉스/OVA 또는 프로타민/OVA는 IFN-β 및 IL-12 발현을 자극하는데 LPP/OVA만큼 강력하지 않았다(도 4A). I 형 인터페론 IFN-β는 DC 성숙, 항원 처리 및 제시 및 T 세포 클론 확장의 자극을 촉진하는 것으로 이전에 밝혀졌다(Xia et al., 2015). 마찬가지로 IL-12는 Th1 사이토카인 중 하나이며(Mills and Ley, 2014), IL-12를 생산하는 DC는 I 형 CD8+ T 세포 면역을 촉진한다(Carreno et al., 2013; Carreno et al., 2015). 상기 결과는 백신으로부터 보조제(아쥬반트) 효과를 최대화하기 위해 폴리플렉스/mRNA 코어 및 지질 쉘이 모두 필요하다는 것을 나타낸다. LPP/mRNA-매개 보조제 효과는 프로타민-응축된 mRNA 입자(Scheel et al., 2005; Fotin-Mleczek et al., 1997)에 따라 TLR-7/8 신호의 활성화를 통해 매개되었다. 짧은 단일 가닥 올리고 디옥시뉴클레오티드 TLR7/8 억제제인 ODN2087은 LPP/OVA-자극된 IL-12 및 IFN-β 발현을 완전히 억제 하였다(도 4B).
DC 성숙 마커는 또한 LPP/OVA-처리된 DC2.4 세포에서 검사되었다. 처리 후 세포는 MHC II 발현 수준이 극적으로 증가 된 것으로 나타났다(도 4C). DC는 활성화 시 원형질막에서 항원으로부터 유래된 펩티드가 로딩된 높은 수준의 MHC II를 발현하는 것으로 보고되었다(Trombetta and Mellman, 2005). 또한, 다른 DC 성숙 마커, CD40 및 CD86의 수준은 또한 처리된 세포에서 더 높았다 (도 4C).
LPP mRNA 백신이 항원 제시를 자극시킨다. 항원 처리 및 제시는 LPP/OVA로 처리된 BMDCS에서 분석되었다. 유세포 분석은 세포 표면에 MHCI-OVA 에피토프를 또한 나타내는 CD11c+ DC를 검출하였다(도 5A). 후 처리된 세포가 OVA-특이적 CD4+ 또는 CD8+ T 세포와 함께 배양될 때, 본 발명자들은 항원-특이적 T 세포(도 5B)에 의한 IL-2 분비의 유의한 증가를 감지하여 성공적으로 DC가 처리되고 T 세포에 의해 인식될 수 있는 OVA 에피토프가 제시되었음을 나타낸다. 이들 결과는 BMDC가 mRNA 항원을 적절히 번역할뿐만 아니라 항원 에피토프를 처리하고 제시할 수 있음을 입증하였다. 별도의 연구에서, DC2.4 세포 처리 후 이와 유사한 효과가 관찰되었다 (도 5C).
LPP mRNA 백신은 유력한 항-종양 활성을 나타낸다. 시험관 내 종양 세포 사멸을 시험하기 위해, 활성화된 OVA-특이적 T 세포를 이펙터 T 세포/종양 세포 비율 5:1에서 B16-OVA 흑색종 세포와 공동 배양하고 시간-의존적 종양 세포 사멸을 조사하였다. B16-OVA 종양 세포 생존율의 현저한 감소는 동시 배양 4시간 후에 일찍 관찰되었고, 대부분의 종양 세포는 24시간 시점에 의해 사멸되었다(도 6A).
대조적으로, 나이브(naive) T 세포로 처리된 종양 세포는 유의한 세포 사멸을 나타내지 않았다. 항원-특이적 종양 세포 사멸을 확인하기 위해, B16-OVA 세포를 HER2 유방암 항원에 특이적이지만, OVA에 특이적이지 않은 T 세포와 함께 배양한 결과, 세포 사멸은 관찰되지 않았다.
B16-OVA 흑색종 폐 전이 모델에서 항종양 활성을 추가로 평가하였다. 마우스에 LPP/OVA의 피하 주사로 3회 처리하고, 폐에서의 종양 성장을 조사하기 위해 마지막 처리 8일 후에 안락사시켰다. PBS 대조군의 마우스는 광범위한 폐 전이를 나타내었다. 이에 비해, LPP/OVA mRNA로 처리된 것들은 폐에서 종양 결절의 수가 96% 감소한 것으로 나타났으며(도 6B), 전이성 종양을 치료할 때 LPP mRNA 백신의 힘을 입증하였다.
별도의 연구에서, B16 흑색종을 갖는 C57BL6 마우스를 TRP2(LPP/TRP2 mRNA)를 표적으로 하는 다른 mRNA 백신으로 처리하였다. 백신 접종된 마우스에서 PBMC에 의한 상당한 수준의 IFNγ 발현이 검출되었다. 약 4%의 총 PBMC는 TRP2-특이적 CD8T T 세포였다. 이러한 결과는 LPP/mRNA 플랫폼이 단지 하나의 특정 mRNA로 제한되지 않고 암에 대한 광범위한 적용에 대한 잠재력을 나타내는 것으로 입증되었다.
실험예 2- 리포플렉스 잠재적인 mRNA -기반 백신의 항종양 면역
도 8A 및 8B는 비표적화된 및 표적화된 백신 입자의 크기 분포를 보여준다. 표적화된 mRNA 백신은 지질 껍질의 표면에 만노스를 갖는다. 수지상 세포는 만노스 수용체를 발현하고 높은 결합 친화도로 표면상에 만노스 모이어티를 갖는 입자에 결합하는 경향이 있다. 이는 비표적화된 mRNA 백신과 동일한 절차에 따라 제조하였다. 쉘의 지질 조성물은 49% EDOPC, 49% DOPE, 1% DSPE-PEG 및 1% DSPE-PEG-만노스이다. 비표적화된 및 표적화된 mRNA 백신 입자는 모두 40-200 nm 범위 내에 있고, 표적화 입자의 중간 크기는 비 표적화 입자보다 크다.
도 12a 및 도 12B는 수지상 세포가 비표적화된 mRNA 백신보다 표적화 된 mRNA 백신을 더 효과적으로 흡수함을 보여준다. 표적화된 mRNA 백신은 지질 껍질의 표면에 만노스를 갖는다. 이는 비표적화된 mRNA 백신과 동일한 절차에 따라 제조 하였다. 쉘의 지질 조성물은 49% EDOPC, 49% DOPE, 1% DSPE-PEG 및 1% DSPE-PEG- 만노스이다. Cy5 형광 염료로 표지된 mRNA 분자를 비표적화된 또는 표적화된 백신으로 포장하였다. 백신을 DC2.4 세포(불멸화된 수지상 세포주)와 4시간 동안 배양하고, 형광 백신 입자를 흡수한 세포를 검출하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 형광 mRNA 백신으로 내재화된 DC2.4 세포의 백분율이 도 12A에 도시되어있다. 한편, 도 12B는 DC2.4 세포에서의 총 형광 강도를 나타낸다. 이들 결과는 친화성 모이어티(즉, 만노스)의 표면 결합이 백신 입자의 수지상 세포 흡수를 향상시키는 효과적인 접근법임을 나타낸다.
도 17은 IDO1 억제제가 수지상 세포에 의한 항원 제시를 향상시키는 것을 보여준다. 지질 백신 내부에 OVA mRNA 코어 및 IDO1 억제제 INCB024360을 모두 캡슐화하여 mRNA 백신을 제조하였다. INCB024360의 유무에 관계없이 mRNA 백신을 사용하여 BMDC를 치료 한 다음, BMDC를 B3Z OVA-특이적 T 세포와 함께 배양하기 위해 적용하였다. 자극된 T 세포는 IL-2를 성장 배지로 분비하고, ELISA를 적용하여 IL-2 수준을 측정하였다. 결과에 기초하여, IDO1 억제제의 포함은 T 세포 활성화를 추가로 자극할 수 있다.
도 18a 및 도 18B는 OVA mRNA 백신으로부터의 항종양 면역 반응을 보여준다. C57BL6 마우스를 1, 4 및 7일에 OVA 단백질 또는 OVA mRNA 백신으로 처리하였다. 마지막 처리 1주일 후, 마우스를 안락사시키고, 비장, 림프절 및 말초 혈액 샘플을 수집하였다(도 18A). 비장 및 림프절로부터 제조된 단일 세포를 48시간 동안 OTI (OVA257-2640 또는 OTII(OVA323-339) 펩타이드로 재자극하고, 배지에서 분비된 인터페론 -β 수준을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다(도 18B). 말초 혈액으로부터의 T 세포를 B16-OVA 종양 세포와 함께 배양하고, 24시간 후에 세포 생존력을 측정한 결과, OVA 단백질이 아닌 OVA mRNA 백신으로의 처리가 항원-발현 종양 세포를 사멸 시키는데 효과적인 OVA 항원-특이적인 T 세포의 생성을 촉진한다는 것을 나타내었다.
실시예 3- mRNA 백신 플랫폼의 일반적인 설명
도 20은 본원에 개시된 mRNA 백신 플랫폼의 전체적인 설명을 예시한다. 백신은 바람직하게는 복수의 소수성 "코어" 구조(각각 관심 항원을 코딩하는 하나 이상의 mRNA를 포함함)로 구성되며, 이는 친수성 "쉘" 구조(리포좀 이중층으로 구성되고 효과적으로 코어 구조체를 캡슐화하도록 제형화됨)안에 구성되어 있다. 소수성 "코어"는 바람직하게는 음으로 하전된 mRNA 분자 및 양으로 하전 된 폴리플렉스 (예를 들어, PbAE) 또는 단백질(예를 들어, 프로타민) 분자의 집단을 포함하는 반면, 친수성 "쉘"은 바람직하게는 지질 및/또는 또는 미리 선택된 최적화된 비율의 인지질. 특정 구체예에서, 하나 이상의 친화성 모이어티(예를 들어, 만노스, 결합 단백질, 또는 하나 이상의 DC-발현 에피토프에 특이적인 항체와 같은 당 모이어티)을 접합시킴으로써 지질 쉘의 표면을 "기능화" 하는 것이 바람직할 수 있다. 백신 코어/쉘 복합체에 의해 표적화 될 백신 입자와 항원-제시 세포(예컨대 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포) 사이의 상호 작용을 향상시키고/시키거나 결합을 증가시킨다. mRNA를 함유하는 내부 코어와 외부 리포좀 이중층 쉘 사이에 형성된 "세포질 성"공간은 또한 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, CpG), 단백질(예를 들어, FLT3L) 또는 소분자(예를 들어, 면역조절제, 예를 들어 IDO-1 억제제)에 의해, 선택된 세포 및 환자에서 백신의 활성을 추가로 증진/연장시킨다.
바람직한 구체 예에서, 본원에 개시된 치료 조성물 쉘/코어 전달 컨스트럭트를 준비할 때 ≥20:1 비율의 중합체 대 mRNA 분자(또는 대안적으로, ≥1:1 프로타민 대 mRNA 분자)의 비율이 가장 바람직한 결과를 제공하는 것으로 결정되었다. 마찬가지로, 대략 1㎍의 mRNA 대 2㎍의 프로타민 대 20㎍의 지질의 비가 인간 투여 용 백신을 제형화하는데 특히 유리한 것으로 나타났다.
실험예 4-이중 면역 치료를 위해 2개의 mRNA가 하나의 쉘에 공동 패키징될 수 있다.
도 21에 도시된 연구에서, 500ng OVA mRNA가 IL12p70을 암호화하는 mRNA와 혼합하여 프로타민/mRNA 코어를 제조한 다음, 코어를 지질 쉘로 패키징하였다. 따라서, 생성된 mRNA 백신은 2개의 상이한 mRNA 분자, 즉 OVA 항원을 암호화하는 mRNA 및 수지상 세포 자극 사이토카인 IL12p70을 암호화하는 mRNA를 함유하였다. DC2.4 세포를 먼저 mRNA 백신으로 처리한 후, B3Z OVA-특이적 T 세포와 함께 배양 하였다. 세포 성장 배지에서의 IL-2 수준은 24시간 후에 측정되었다. 결과는 500ng의 IL12p70 mRNA의 공동-패키징이 백신 활성을 증가시켰음을 보여 주었다. 이는 1) 하나의 백신 입자에 2가지의 다른 유형의 mRNA 분자를 패키징할 수 있음을 보여 주었고; 2) 두 가지 유형의 mRNA 분자는 항원 생성과 수지상 세포 자극을 위한 다른 목적으로 사용될 수 있다.
상기 결과는 특히 특정 환자를 위해 생성된 "개인 맞춤화된" 암 면역 요법의 설계와 관련하여 본 발명의 중요한 측면을 입증하였다. 이러한 적용은 하기 실시예에 설명된 연구에서 더 확장되었다.
실험예 5-개인 맞춤화된 암 면역 요법을 위한 mRNA -기반 백신
암 게놈으로부터의 체세포 돌연변이의 확인 및 면역원성 종양 돌연변이의 예측에서의 진보는 개인 맞춤화된 암 면역 요법을 위한 치료 백신을 개발할 수 있는 전례없는 기회를 제공하였다. 그러나 종양에서 이종 돌연변이 스펙트럼을 갖는 암 세포를 표적으로 하기 위해 전통적인 단백질 또는 펩티드 기반 백신을 준비하는 것은 어려운 일이다. 개시된 mRNA 백신 플랫폼은 이러한 목적을 위해 특별히 고안되었다. 여기에서, 이 고효율 플랫폼은 환자의 고유한 암 게놈 특징에 기초한 맞춤형 백신 접종을 통해 개인 맞춤화된 유방암 치료가 달성될 수 있다는 가설을 테스트하는 데 사용되었다.
이 실시예는 유방암 연구에서 3가지 주요 과제를 해결한다:
a) 치료 요법을 보다 효과적이고 독성이 적으며 생존에 영향을 주는 요법으로 대체함으로써 혁명을 일으킨다.
b) 전이성 유방암과 관련된 사망률을 제거하고; 및
c) 유방암 세포가 수년 동안 발병하지 않다가 다시 재발하는 이유와 어떻게 재발하는지를 확인하고, 이 정보를 사용하여 그러한 재발을 방지한다.
암 면역 요법은 최근에 여러 유형의 암에서 전례 없는 임상 효능을 달성하였다. 그러나 소수의 암 환자만이 면역 요법의 혜택을 받고, 많은 환자가 효과적인 항종양 면역 반응에 반응하지 못한다. 여러 증거에 따르면 종양 침윤 림프구(TIL)의 존재가 예후 마커 역할을 하며 면역 요법 및 화학 요법을 포함한 다양한 요법에 대한 반응을 예측한. TIL이 결여된 종양은 "비염증성" 인 것으로 특성화되었으며, 일반적으로 치료 실패 및 불량한 예후와 상관관계가 있다. 예를 들어, TIL이 비교적 적은 유방암 환자에서 체크 포인트 차단 항체의 효능은 흑색종 또는 비소세포폐암종 환자에서와 비교하여 TIL이 풍부한 종양 유형에 비해 훨씬 덜 효과적이다. 따라서, 종양 미세 환경에서 T 세포 침윤을 촉진하고 T 세포의 기능을 유지하는 수단은 효과적인 면역 요법, 특히 유방암을 포함한 "비염증성" 종양 유형에 대한 개발에 중점을 둔다.
치료용 암 백신은 강력한 항종양 면역을 자극할 가능성이 있다. 최근의 연구에서, p66 HER2 항원 펩티드를 함유하는 나노 기술 기반 수지상 세포 백신(nano-DC 백신)을 사용하여 HER2-양성 유방암을 표적화 하고, 항원-특이적 CD8+ T 세포의 대규모 종양 침윤 및 Th1-치우친(biased) 사이토카인의 자극을 검출하였다. 이는 유방암의 쥐 모델에서 HER2-양성 종양 성장의 강력한 억제를 초래하였다.
후속 연구는 또한 종양 관련 CD45+ 세포 집단 내에서 증가된 CD3+ T 세포에 의해 입증되는 바와 같이, T 세포의 종양 침윤을 추가로 촉진시키는데 있어서 암 백신으로의 치료와 항-PD-1 항체로의 치료 사이의 상승 작용을 입증하였다.
개인 맞춤화된 면역요법의 새로운 시대에서 치료용 mRNA 백신. 유방암의 전체 돌연변이 정도는 흑색종 또는 비소세포폐암만큼 많지는 않지만, 최근 560개의 유방암 전체 게놈 서열에 대한 연구는 93개의 암 유전자에서 1,628개의 암 유발 돌연 변이(driver mutation)를 확인했으며 에스트로겐 수용체 (ER)-음성 유방암에서 TP53이 가장 일반적으로 돌연변이가 나타났다. 이 결과는 TP53 돌연변이가 HER2- 양성(72%) 및 기저형(80%) 유방암에서 더 빈번하게 발생하는 반면 PIK3CA 돌연변이는 다른 아형(29-45 %)과 비교하여 기저형 유방암(9%)에서 드물게 발생한다는 이전의 보고서와 잘 일치한다. 프로테아좀 절단 모티프에 기초한 온라인 도구를 사용하여, TP53, PIK3CA 및 PTEN의 단백질을 포함하여 인간 및 쥐 단백질 사이에 100% 보존된 다수의 세포 독성 T 세포 에피토프가 확인되었다(표 2). 이들 에피토프는 "차세대" 면역 치료제의 개발을 위한 최고의 제제로서 역할을 하며, 쥐 종양 모델을 사용한 효능 연구로부터 얻은 결과는 환자 반응을 예측하기 위해 직접 적용될 수 있다.
BC에서 세포독성 T 세포 에피토프 ( epitope )
펩티드 이름 펩티드 서열* 서열번호 : X
TP53-170 TEVVRRCPH 서열번호 :1
TP53-170* TEVV H RCPH 서열번호 :2
TP53-258 TLEDSSGN 서열번호 :3
TP53-258* T D EDSSGN 서열번호 :4
PIK3CA-106 GNREEKNRE 서열번호 :5
PIK3CA-106* GNRE N KNRE 서열번호 :6
PIK3CA-721 QEKLKDETQK 서열번호 :7
PIK3CA-721* QEKLKD K TQK 서열번호 :8
PTEN-63 NHYKIYNLC 서열번호 :9
PTEN-63* NHY N IYNLC 서열번호 :10
* 야생형 단백질에서의 아미노산 서열은 참조로 제공되었고, 돌연변이 아미노산은 밑줄로 기재되었다.
본원에 개시된 mRNA-기반 백신 플랫폼은 이 목적을 위해 이상적으로 개발되었다. 폴리플렉스/mRNA 코어가 폴리-(β-아미노에스테르) 폴리머/mRNA(PβAE/mRNA) 또는 프로타민/mRNA로 구성되는 리포좀 쉘 구조에서 mRNA 코어로 구성된 LPP mRNA 백신을 사용하는 단계 및 리포좀 쉘은 중성 및 양으로 하전된 인지질의 혼합물로 제조되며, 플랫폼은 mRNA 분자로부터 강력한 단백질 발현을 허용한다. 종래의 펩티드 기반 백신과 달리, mRNA 기반 백신은 하나의 minigene 컨스트럭트에 다수의 항원 에피토프를 포함 시키는 이점을 가지므로, 개별 암 게놈에서의 돌연변이 스펙트럼에 기초하여 개별 환자의 필요에 맞게 신속하게 맞춤화될 수 있다. 그들은 또한 전통적인 플라스미드 유래 백신과는(다른 장점들 중에서도) 분열 세포와 비 분열 세포 둘 다에서 기능 하며 게놈 통합에 대한 위험도 없다는 점에서 다르다. 흥미롭게도, 프로타민-기반 mRNA 백신 제품은 수년 동안 시험되었지만, naked 프로타민/mRNA로부터의 단백질 항원 발현은 LPP/mRNA의 일부일 뿐이었다. naked 컨스트럭스 내의 mRNA 분자가 혈장 RNase에 의해 공격받기 쉽다는 것이 가능한 이유이다.
대안적으로, LPP/mRNA는 DC를 유발하여 항원-제시 세포의 최대 항원 처리 및 제시 활성에 필수적인 사이토카인인 훨씬 더 높은 수준의 IL-12를 발현시킨다. mRNA 코어는 또한 TLR7/8 억제제 ODN2095에 의한 사이토카인 발현의 억제에 의해 입증된 바와 같이 TLR7 및 8(TLR7/8) 신호를 활성화시킴으로써 백신에 대한 강력한 보조제로서 작용한다. mRNA 백신의 활성을 시험하기 위해, 오브알부민(OVA)을 모델 항원으로서 적용하고, 골수-유래 수지상 세포(BMDC)를 LPP/OVA와 함께 배양하여 항원 제시 및 T 세포 활성화를 결정하였다. LPP/OVA와 함께 배양되었지만 프로타민/OVA와 함께 배양되지 않은 BMDC는 표면에 높은 수준의 주조직 적합성 복합체 I (MHCI)-OVA 에피토프를 나타냈다. LPP/OVA mRNA 백신으로의 처리는 비장 및 림프절에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 자극을 유발하였다. 이 백신은 또한 OVA-발현 종양의 성장을 억제하는데 효과적이었다. 별도의 연구에서, 공개된 LPP/mRNA 백신은 암 및 감염성 질환에 대한 구조 및 구성이 유사한 리포좀 mRNA 백신에 대한 최근의 저명한 간행물에도 불구하고, 간단한 리포좀 mRNA 백신(즉, mRNA-보호 코어 구조체가 없는 백신)보다 항원 발현을 촉진하고 DC 활성화를 자극하는 데 훨씬 더 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 종합하면, 이들 데이터는 LPP/mRNA 백신 플랫폼이 강력한 항원 처리 및 제시를 통해 강력한 항종양 면역성을 제공한다는 것을 보여 주었다. 폴리플렉스/mRNA 코어-리포좀 쉘 구조는 항-종양 면역을 자극하는데 있어서 다른 mRNA-기반 플랫폼(naked 프로타민/mRNA 및 리포좀 캡슐화된 mRNA)보다 훨씬 우수하다.
인간 암은 분자 및 구조적 특징 모두에서 이종이며, 유전자 돌연변이/증폭/ 삭제는 종양 성장, 클론 확장 및 약물치료 동안 빈번하게 발생하는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 복잡성을 가중시키는 것은 각 암 유형마다 고유한 특징이 있다는 것입니다. 예를 들어, 삼중 음성 유방암(TNBC, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 또는 HER2/neu의 발현이 없음)은 광범위한 유전자에서 저주파 돌연변이와 결합된 높은 속도의 TP53 돌연변이를 갖는다. 이들 돌연변이 사건은 단일 종양에서 특정 유전자 증폭/돌연변이 특징을 갖는 상이한 클론(일부 우성 및 일부는 잘 표현되지 않음)의 형성을 유발할 가능성이 높다. 결과적으로, 동일한 환자로부터 또는 1차 및 전이성 종양 사이의 상이한 종양 결절에서 상이한 돌연변이 스펙트럼을 확인하는 것은 드문 일이 아니다. 암 면역 요법의 목표는 고효율로 종양의 모든 클론을 제거하는 것이며, mRNA 암 백신은 이 목적에 매우 적합하다. 하나의 단일 백신 구조는 각 환자에서 암 게놈의 복잡성과 일치하도록 여러 항원을 표적화하도록 조작될 수 있기 때문이다.
면역 능력이 있는 쥐에서 원발성 및 전이성 종양의 발생: 4T1 쥐 유선 종양 세포(p53 null)는 실험실에서 일상적으로 수행되는 관행인 CRISPR/Cas9 기술로 PIK3CA 또는 PTEN 유전자에서 점 돌연변이를 생성하도록 조작될 것이다. 야생형 또는 PIK3CA 및 PTEN 돌연변이를 갖는 4T1 세포는 돌연변이 TP53 유전자 및 루시퍼 라제 유전자를 보유하는 레트로 바이러스로 감염될 것이다. 생성된 동종 이형 4T1 세포는 TP53 유전자(4T1/TP53*)에서의 단일 돌연변이, PIK3CA 또는 PTEN (4T1/TP53*PIK3CA* 또는 4T1/TP53*PTEN*)에서 이중 돌연변이, 또는 세 유전자 모두에서 돌연변이(4T1/TP53*PIK3CA*PTEN*)중 하나를 나타낼 것이다. 4개의 이소성 세포주를 모두 1:1:1:1 비로 모으고, 6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스의 유선 지방 패드에 접종하여 원발성 종양을 생성한다. 이전예에서 입증된 바와 같이, 4T1 원발성 종양은 간 및 폐로의 전이를 고효율로 발생시킨다. 조직학적 분석은 원발성 종양 및 전이성 종양 결절을 특성화하고 모 4T1 종양과 비교하기 위해 수행된다. 종양으로부터의 단일 세포는 주어진 종양에서 단일 TP53* 돌연변이 또는 이중 또는 삼중 돌연변이를 갖는 종양 세포의 백분율을 측정하기 위해 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 단리 및 정량될 수있다.
시험관 내의 면역 반응의 시험: mRNA-백신이 종양-보유 쥐 모델을 치료하기 위해 적용되기 전에 mRNA 백신이 의도된 기능을 발휘할 수 있도록 세포-기반 연구를 수행할 수있다. 개별 mRNA 백신을 6시간 동안 골수 유래 수지상 세포(BMDC)와 함께 배양한 다음, BMDC를 쥐 T 세포와 함께 배양할 수 있다. DC 성숙은 CD40 및 CD86 발현에 대한 유세포 분석법 및 인터루킨-12(IL-12) 발현에 대한 ELISA에 의해 결정될 수 있다. T 세포 활성화는 인터페론(IFN-1) 및 인터루킨 -2(IL-2) 발현에 의해 측정된다.
생체 내 mRNA 백신으로부터의 면역 반응의 검사 : BALB/c 마우스는 유선 지방 패드에서 4개의 동종 클론의 혼합물을 포함하는 4T1 세포로 접종될 것이다. 원발성 종양이 200-300 mm3에 도달하면, 마우스를 4개의 그룹(n=10 마우스/그룹)으로 나누고 4개의 mRNA 백신으로 피하 내로 투여하고, 백신 접종은 일주일에 한 번 더 부스팅될 것이다. 혈액 샘플은 두 번째 백신 접종 전에 한 번, 실험 완료시 다른 시간에 수집된다. 제2 백신 접종 3일 후에 마우스를 안락사시키고, 비장, 림프절 및 종양 샘플을 수집한다. 설명한 것과 같은 프로토콜을 따라 EasySepTM 마우스 T 세포 분리 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 CD3+ T 세포를 분리하기 위해 모든 샘플을 적용하고 IL-2 및 IFN-I 발현 수준 또는 표면 성숙 마커 또는 ELISPOT 분석을 사용하여 활성화된 세포를 탐지한다. 또한, 체크 포인트 억제제 단백질의 발현 수준을 검사한다.
mRNA 백신의 항-종양 활성의 평가: BALB/c 마우스에 모 4T1 종양을 접종하거나 4개의 동종 클론(n = 10 마우스/그룹)의 혼합물로부터 유래된 종양을 4개의 그룹으로 나누고 4주 동안 4개의 mRNA 백신으로 피하 내로(i.d.) 투여한다. 마우스는 종양 성장(종양 크기에 기초) 및 원발성 기관으로의 종양 전이(Xenogen IVIS-200 이미징 시스템을 사용)를 모니터링 하기 위해 유지될 것이다. 원발성 종양의 중량 (1g/cm3으로 가정하는 종양 부피를 기준으로 계산됨)이 체중의 10%를 초과할 때, 종양 궤양 또는 무기력, 꼽추 및 뻗은 모피를 포함하는 질병의 징후가 나타날 때 마우스를 안락사시킬 것이다.
HLA -A2 형질전환 마우스에서의 mRNA 백신에 대한 면역반응 : Jackson Laboratories (C57BL /6-Tg[HAL-A2.1]1Enge/J)로부터의 HLA-A2 형질전환 마우스는 비장, 골수 및 흉선 세포에서 인간 HLA-A2.1 MHC I 백혈구 항원을 발현한다. mRNA 백신에 대한 환자 면역 반응을 예측하기 위해, HLA-A2 마우스(n = 10 마우스/그룹)를 4개의 나열된 mRNA 백신으로 처리하고, 혈액 및 조직 샘플을 수집하여 항원-특이적 T 세포 활성에 대해 검사한다.
쥐 종양 모델: 혼합 동종 클론이 접종된 마우스는 혼합 분자 특징을 갖는 종양을 발생시킬 것이다. 하나의 동종 클론의 종양 세포가 나머지 클론보다 훨씬 빠르게 성장하는 경우, 이는 종양 샘플의 PCR 분석에 기초하여 검출될 것이며, 이들 클론의 비율은 종양 세포 접종 전에 조정될 수 있다. 원발성 종양으로부터의 신호가 전이성 결절의 검출을 방해하는 경우, 원발성 종양은 500cm3에 도달할 때 외과 적으로 제거될 수 있고, 종양 전이는 발광 분석에 의해 모니터링 될 수 있다.
항-종양 면역: 면역 반응의 분석은 mRNA 백신이 강력한 항종양 면역력을 발휘할 수 있음을 보여준다. 다수의 신생 항원 에피토프(예를 들어, LPP/p53-PI3K-PTEN)를 코딩하는 백신은 단일 에피토프(즉, LPP/p53)를 갖는 백신과 비교하여 더 강한 항종양 면역을 증진시키는 이점을 가질 것으로 예상되며, 그 효과는 T 세포 활성 측정 및 종양 성장 및 전이의 억제에 의해 반영될 것이다. LPP/p53 또는 LPP/p53-PI3K와 같은 특정 백신으로 치료하는 경우 종양 성장의 부분 억제만 유발하는 경우, 종양 조직은 백신 접종 후 마우스에서 수집할 수 있으며 종양 세포의 백분율에 초점을 둔 종양 구성을 4개의 개별 동종 클론으로부터 분석할 수 있다. 종양 조성의 변화는 특정 백신의 효능(또는 효능 부족)을 나타낸다. mRNA 백신의 하나의 잠재적 위험은 MHC I 신생 항원 에피토프가 일련의 알고리즘에 기초하여 선택되었지만 생물학적 연구로는 확인되지 않았다는 것이다. 특정 시험관 내 연구의 결과에 기초하여 선택된 에피토프로부터 매우 약한 반응이 관찰되지 않거나 매우 약한 반응이 관찰되는 경우, 대안적인 에피토프는 다수의 성공적인 후보자가 수득 될 때까지 연구의 반복에서 이용될 수 있다. 대안적으로, 항원 에피토프는 WT1 MHCI 항원을 개발하기 위해 성공적으로 적용된 전략인 MHC 결합을 향상시키기 위해 단일 아미노산 치환으로 변형될 수 있다.
HLA -A2 마우스에 대한 연구 : MHC I 신생 항원 에피토프 영역을 포함하는 펩티드 서열이 인간 단백질과 마우스 상동체 사이에 보존되므로, BALB/c 마우스 및 HLA-A2 형질전환 마우스로부터 유사한 면역 반응이 관찰될 것으로 예상된다.
치료용 암백신은 항-종양 활성을 발휘하기 위해 항원-제시 세포, 주로 DC를 활성화시켜야한다. mRNA-기반 치료용 암 백신의 작용 기전을 완전히 이해하고 이 신규 치료제의 활성을 추가로 개선하기 위한 접근법을 확인하기 위해서는, 항종양 면역을 유도하는 데 필수적인 DC의 하위 집단을 먼저 식별할 필요가 있다. 이 연구에서는 mRNA 백신 활성에서 DC의 3가지 주요 부분 집합(기존의 CD8+ 및 CD8 DC (cDC)) 및 형질세포 성 DC(pDC)의 역할을 결정하기 위한 실험이 선택되었다. 이 연구를 위해 잭슨 연구소(Jackson Laboratories)에서 3개의 유전자 조작된 마우스 라인을 얻었다: Batf3/녹아웃, zDC-DTR(Zbt646 유전자의 3 '비번역 영역의 디프테리아 독소 수용체 [DTR]) 및 Cd11c-DTR(DTR CD11c 프로모터의 제어). Batf3-/-녹아웃 마우스는 CD8+ DC를 생성하지 않는다. 디프테리아 독소(DT)로 zDC-DTR 마우스를 치료하면 골수에서 두 종류의 cDC가 모두 고갈되지만 pDC에는 영향을 미치지 않는 반면, Cd11c-DTR 마우스의 DT 치료는 신체에서 모든 DC를 고갈시킨다.
야생형 및 유전자 조작된 마우스에서의 항종양 면역 : 항종양 면역에서 CD8+ DC의 역할을 평가하기 위해, BAT/c 배경에서 Batf3-/-녹아웃 마우스 또는 야생형 마우스(n = 10 마우스/그룹)에 4T1 종양 세포를 접종하고, 동물에 4주 동안 매주 LPP/p53-PI3K-PTEN mRNA 백신을 투여하였다. mRNA 백신 활성에 대한 cDC 및 pDC의 영향을 평가하기 위해, 종양 보유 zDC-DTR 및 Cd11c-DTR 마우스를 라인당 2개의 처리 그룹(n = 10 마우스 / 그룹)으로 나누었다. 대조 그룹의 마우스는 DT로 치료를받지 않는 반면, 처리 그룹의 마우스는 백신 접종 24시간 전에 DT(20㎍/kg, i.p.)를 투여받았다. DC 서브 세트의 고갈은 본격적인 효능 연구 전에 유세포 분석에 의해 확인된다. 종양 성장 및 전이가 모니터링되고, 마우스가 질병의 징후를 나타낼 때 안락사된다.
mRNA 백신의 작용 메커니즘에 기초하여, Cd11c-DTR 마우스에서 모든 DC의 고갈은 mRNA 백신으로부터 항종양 면역을 완전히 제거해야 한다. Batf3/녹아웃 및 zDC-DTR 마우스의 결과는 어느 DC 서브세트가 mRNA 백신 활성을 촉진시키는 데 필수적인 역할을 하는지를 설명해야 한다. 이전예에서, mRNA 백신 처리에 대한 강한 반응이 BMDC로부터 관찰되었으며, 이는 CD8+ DC의 관여를 나타낸다. DT 처리(여러 실험실에서 사용하는 프로토콜) 20㎍/kg DT 처리 후 zDC-DTR 또는 Cd11c-DTR 마우스에서 DC의 대상 하위 집합이 완전히 제거되지 않으면 필요에 따라 DT 용량 및/ 또는 투여 일정을 조정할 수 있다.
참고문헌
이하의 참조는 이들이 본 명세서에 제시된 것들에 보충적인 예시적인 절차 적 또는 다른 세부 사항을 제공하는 한, 본 명세서에 명시적으로 참조함으로써 그 전체가 본 명세서에 구체적으로 포함된다 :
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Claims (40)

  1. 항원을 코딩하는 mRNA 분자 집단을 포함하는 조성물로서,
    상기 mRNA 분자 집단은 적어도 폴리머 또는 단백질을 포함하는 복수의 폴리플렉스 또는 단백질 코어 입자 내에 포함되고,
    상기 복수의 폴리플렉스 또는 단백질 코어 입자는 생체 적합성 지질 이중층 쉘에 캡술화된 것이고,
    상기 생체 적합성 지질 이중층은,
    (a) 45% 내지 49%의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (EDOPC);
    (b) 49% 내지 45%의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜-에탄올 아민(DOPE); 및
    (c) 1% 내지 2%의 1,2- 디스테아르오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올 아민­N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-PEG)을 포함하는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생체 적합성 지질 이중층 쉘은 하나 이상의 포유 동물 항원-제시 세포에 의해 복수의 폴리플렉스 또는 단백질 코어 입자의 대음세포작용(macropinocytosis)를 촉진하는 것인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 CpG, 폴리(I:C), 명반 및 이들의 전부 또는 일부의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아쥬반트(adjuvant)를 더 포함하고,
    여기서 상기 아쥬반트는 상기 생체 적합성 지질 이중층 쉘 내에 캡슐화되어 있는, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 IL-12p70 단백질, FLT3 리간드, [[또는]] 인돌아민 2,3-디옥시제나아제(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO-1) 억제제, 및 이들의 전부 또는 일부의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 조절 화합물을 더 포함하고,
    여기서 상기 면역 조절 화합물은 상기 생체 적합성 지질 이중층 쉘 내에 캡슐화되어 있는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 인돌아민 2,3-디옥시제나아제 억제제는 GDC-0919, INCB24360 또는 이들의 조합인 것인, 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리머 또는 단백질은 프로타민, 폴리에틸렌이민, 폴리-(B-아미노에스테르), 또는 이들의 전부 또는 일부의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항원은 포유동물 세포에 특이적인 것인, 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 mRNA 분자 집단이 하나 이상의 암- 또는 종양- 특이적인 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 이의 항원성 단편을 코딩하는 것인, 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 mRNA 분자 집단이 HER2p66, HER2E75, HER2YVMA, TRP2, p66, 및 이들의 전부 또는 일부의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 종양-특이적인 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 것인, 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 적합한 포유동물 세포 내로 도입될 때, I형 인터페론(IFN-I)의 발현을 증가시키도록 조정되고 구성된 것인, 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 적합한 포유동물 세포 내로 도입될 때, IFN-α4, IFN-β, 또는 이들의 일부 또는 전부의 조합의 발현을 증가시키도록 조정되고 구성된 것인, 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 인간 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 암세포, 또는 이들의 전부 또는 일부의 조합 중 하나 이상을 포함하는 포유동물 항원-제시 세포 집단에 도입될 때, IFN-1 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 면역 조절제, 항 종양제, 세포 독성제, 세포 증식 억제제, 신경 활성제, 항염증제, 항 지질 작용제, 호르몬, 수용체 작용제, 수용체 길항제, 항 감염제, 단백질, 펩타이드, 항체, 항원 결합 단편, 효소, RNA, DNA, siRNA, mRNA, 리보자임, 보조 인자, 스테로이드, 안티센스 분자, 및 이들의 전부 또는 일부의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 치료용 제제를 더 포함하는 것인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 치료용 제제는 사이클로 포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 트라스투주맙(trastuzumab), 메토트렉세이트(methotrexate), 에피루비신(epirubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 비노렐빈(vinorelbine), 카페시타빈(capecitabine), 젬시타빈(gemcitabine), 미톡산트론(mitoxantrone), 이사베필론(isabepilone), 에리불린(eribulin), 라파티닙(lapatinib), 카르무스틴(carmustine), 질소 머스타드(nitrogen mustard), 황 머스타드(sulfur mustard), 백금 사질산염(platin tetranitrate), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide), 캄프토테신(camptothecin), 및 이들의 전부 또는 일부의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 항원 폴리펩티드, 항원 융합 폴리펩티드, 항원 펩티드, 또는 이의 단편을 더 포함하는 것인, 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 다공성 실리콘 입자, 나노 입자, 미세 입자, 또는 이들의 전부 또는 일부의 조합의 집단 내에 포함되는 것인, 조성물.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 계면 활성제, 리포좀, 니오좀, 에토좀, 트랜스퍼좀, 인지질, 스핑고좀, 또는 이들의 전부 또는 일부의 조합 중 하나 이상을 더 포함하는 것인, 조성물.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 완충제, 희석제, 운반체(vehicle), 또는 부형제 중 하나 이상을 더 포함하는 것인, 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 포유동물에게 전신 투여하기 위해 제형화(formulation)된 것인, 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 인간에게 피내 또는 정맥 내 투여하기 위해 제형화된 것인, 조성물.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 암세포, 종양 세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 전부 또는 일부의 조합 중 하나 이상을 포함하는 포유동물 항원 제시 세포의 단리된 집단 내에 포함되는 것인, 조성물.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물 및 이를 필요로 하는 인간에게 상기 조성물을 투여하기 위한 적어도 일 세트의 설명서를 구비하는 치료용 키트의 일부로서 조정되고 구성되는 것인, 조성물.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 포유동물 암의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 것인, 조성물.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 인간 암의 치료 또는 개선에 사용하기 위한 것인, 조성물.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 인간 전이성 암의 치료 또는 개선에 사용하기 위한 것인, 조성물.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리머 또는 단백질은 양으로 하전된 것인, 조성물.
  27. 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 포함하는 포유동물 세포의 단리된 집단.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 포유동물 세포는 항원-제시 세포, 인간 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 및 이들의 전부 또는 일부의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 포유동물 세포의 단리된 집단.
  29. 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 포함하는, 포유동물 대상체에서 암 또는 과증식성 장애를 예방, 치료 또는 개선하기 위한 약학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 포유동물 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 반려동물, 외래종, 가축 또는 사료용 동물인 것인, 약학적 조성물.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 암은 내화성(refractory), 전이성, 재발 또는 치료 저항성 암으로 진단되거나 또는 식별되는 것인, 약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 암은 전이성 유방암, 전이성 폐암 또는 전이성 흑색종인 것인, 약학적 조성물.
  33. 제29항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간인 것인, 약학적 조성물.
  34. 제29항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 치료 유효량의 방사선 또는 추가 화학 요법제를 조합하여 포유동물에게 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  35. 제29항에 있어서,
    상기 조성물은 포유동물에게 단일 투여로, 또는 1일 이상의 기간 동안, 1주 이상의 기간 동안 또는 1개월 이상의 기간 동안 또는 더 길게 일련의 다중 투여로 전신으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  36. 제29항에 있어서,
    상기 조성물은 화학 요법제 또는 치료용 암 백신을 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  37. 1) 제1항 또는 제2항에 따른 조성물; 및 2) 포유동물 대상체에서 암 또는 과증식성 장애의 예방, 치료 또는 개선을 위한 요법의 일부로서, 이를 필요로 하는 포유동물 대상체에게 상기 조성물을 투여하기 위한 설명서;를 포함하는 키트.
  38. 포유동물 대상체에서 암 또는 과증식성 장애의 예방, 치료 또는 개선을 위한, 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 약학적 조성물로서, 항원을 코딩하는 mRNA를, 이를 필요로 하는 포유동물 대상체의 체내 세포 집단에 투여하기 위한, 약학적 조성물.
  39. 삭제
  40. 삭제
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