CN109260157A - 一种正电荷多肽脂质体纳米制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种正电荷多肽脂质体纳米制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型纳米药物制剂技术领域，具体涉及一种正电荷多肽脂质体纳米制剂及其制备方法与应用。本发明所述正电荷多肽脂质体纳米制剂，含有正电荷多肽脂质体，所述正电荷多肽脂质体至少包括：正电荷多肽，阴离子聚合物和阳离子脂质载体。具有材料安全易得、制备操作简单、可重复性强的特点；脂质体制剂粒径大小和均一性理想、载药量大、制剂稳定、易于保存、正电荷多肽泄漏少、毒性低、具有生物可降解特性、可功能化修饰、具有在循环系统中的长循环和肿瘤的主被动靶向分布功能等特点，可进行规模化生产。

Description

一种正电荷多肽脂质体纳米制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于新型纳米药物制剂技术领域，具体涉及一种正电荷多肽脂质体纳米制剂及其制备方法与应用。
背景技术
目前，大量的多肽和蛋白用于抗菌、抗炎、抗肿瘤和免疫调节等方面的治疗；其中多肽药物由于其活性高、特异性强、免疫原性低等特性，受到了广泛的关注并获得很大的进展：如曲普瑞林(triptorelin)，亮丙瑞林(leuprorelin)等多种多肽类药物已在全球批准上市，还有很多药物已经进入临床试验阶段。然而，多肽药物在发展和用于临床疾病治疗的过程中还存在较多问题，如多肽药物在体内易被代谢降解，生物利用度低等。其中，有些多肽药物如蜂毒素等，由于其具有特殊的二级结构——ɑ-螺旋，导致其极易插入到磷脂双分子膜中而具有溶膜作用，从而导致严重的溶血和细胞毒性；有些多肽药物则由于在生理条件下带有较多的正电荷，极易与血液中的组分发生聚集而导致生物毒性增强和生物利用度降低。因此，这些多肽类药物在实际开发、研究和临床应用中面临巨大的挑战，如何设计一种载荷效率高、稳定性好、毒性低、循环时间长、生物利用度高的高效、特异、安全的多肽药物输送系统是这些多肽药物开发领域关注的重点。
基于上述问题，开发并利用具有功能活性的正电荷多肽用于临床疾病治疗急需开发出具有载荷效率高，稳定性好、毒性低、循环时间长、生物利用度高等特点的制剂。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种适用于正电荷多肽临床应用的脂质体纳米制剂及其制备方法与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种正电荷多肽脂质体纳米制剂，含有正电荷多肽脂质体，所述正电荷多肽脂质体至少包括：正电荷多肽，阴离子聚合物和阳离子脂质载体。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽和阴离子聚合物结合形成正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒，所述阳离子脂质载体可形成脂质双分子膜，所述正电荷多肽脂质体包括外层结构和内核结构，所述外层结构包括脂质双分子膜，所述内核结构包括正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒。
所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒表面电位为负。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒中，所述正电荷多肽和阴离子聚合物质量比为4:1～16:1。在该实施方式的进一步实施方式中，所述正电荷多肽和阴离子聚合物质量比为6:1～10:1。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽脂质体中，所述阳离子脂质载体与所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒的质量比为2:1～10:1。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽为多肽序列中所含净正电荷数大于等于1的多肽。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽为具有抗菌、抗炎症、抗肿瘤或免疫调节等作用的正电荷多肽序列。优选的，为抗肿瘤作用的正电荷多肽序列。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽可以为YAP样多肽及其改造和修饰产物。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物为所含净电荷为负的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可为通过化学合成或生物分离获得的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可以是由相同单体或不同单体缩聚而成的，具有相同或不同聚合度的分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自生物可降解的阴离子聚合物。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自聚谷氨酸(PGA)、聚天冬氨酸、透明质酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽可选自生物提取纯化或合成的正电荷多肽及其改造和修饰产物。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体至少包含一种阳离子脂质。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体由至少一种阳离子脂质，或阳离子脂质与辅助脂质制备而成。
可选的，所述阳离子脂质可以为：
DOTMA氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DOTAP溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DOSPA三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵；
DTAB溴化三甲基十二烷基铵；
TTAB溴化三甲基十四烷基铵；
CTAB溴化三甲基十六烷基铵；
DDAB溴化二甲基双十八烷基铵；
DORI溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DORIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HP溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HB溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HPc溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DPRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵；
DSRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵；
DMRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵；
DOGS N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺；
DOSC 1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯；
DC-Chol 3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇；
LPLL脂质多聚-L-赖氨酸；
SA硬脂胺。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、(3β-[N-N’，N’-二甲基胺乙基]胺基甲酰基)、胆固醇(DC-Chol)和溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)中的一种或多种。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)；
在一种实施方式中，所述的辅助脂质可以为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)胆固醇(Chol)中的一种或多种。
可选的，所述的辅助脂质可以是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒粒径范围是60nm～150nm。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽与所述阴离子聚合物相结合，形成表面电位为负的正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒，阳离子脂质载体中的阳离子脂质与该负电性纳米颗粒的结合并驱动阳离子脂质载体形成的脂质双分子膜在该负电性纳米颗粒表面的自组装，从而得到所述脂质体制剂。
正电荷多肽与阴离子聚合物通过静电力作用结合。
在一种实施方式中，所述外层结构修饰有脂质-聚乙二醇(PEG)或脂质-聚乙二醇-功能分子。
在一种实施方式中，所述脂质-PEG中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在一种实施方式中，脂质-PEG-功能分子中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，功能分子可以为精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(ARG-GLY-ASP,RGD肽)。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽脂质体中，脂质体总脂质与脂质-PEG的摩尔比为95：5。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽脂质体中，脂质体总脂质与脂质-PEG-功能分子的摩尔比为95：5。
本发明的第二方面，提供了一种正电荷多肽脂质体纳米制剂的制备方法，至少包括如下步骤：
将正电荷多肽和阴离子聚合物混合孵育，得到正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒；
将所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒与阳离子脂质载体混合孵育，得到正电荷多肽脂质体纳米制剂。
所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒表面电位为负。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒中，所述正电荷多肽和阴离子聚合物质量比为4:1～16:1。在该实施方式的进一步实施方式中，所述正电荷多肽和阴离子聚合物质量比为6:1～10:1。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽脂质体中，所述阳离子脂质载体与所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒的质量比为2:1～10:1。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽为多肽序列中所含净正电荷数大于等于1的多肽。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽可选自生物提取纯化或合成的正电荷多肽及其改造和修饰产物。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽为具有抗菌、抗炎症、抗肿瘤或免疫调节等作用的正电荷多肽序列。优选的，为抗肿瘤作用的正电荷多肽序列。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽可以为YAP样多肽及其改造和修饰产物。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物为所含净电荷为负的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可为通过化学合成或生物分离获得的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可以是由相同单体或不同单体缩聚而成的，具有相同或不同聚合度的分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自生物可降解的阴离子聚合物。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自聚谷氨酸(PGA)、聚天冬氨酸、透明质酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体至少包含一种阳离子脂质。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体由至少一种阳离子脂质，或阳离子脂质与辅助脂质制备而成。
可选的，所述阳离子脂质可以为：
DOTMA氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DOTAP溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DOSPA三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵；
DTAB溴化三甲基十二烷基铵；
TTAB溴化三甲基十四烷基铵；
CTAB溴化三甲基十六烷基铵；
DDAB溴化二甲基双十八烷基铵；
DORI溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DORIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
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DORIE-HPc溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DPRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵；
DSRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵；
DMRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵；
DOGS N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺；
DOSC 1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯；
DC-Chol 3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇；
LPLL脂质多聚-L-赖氨酸；
SA硬脂胺。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、(3β-[N-N’，N’-二甲基胺乙基]胺基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)和溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)中的一种或多种。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)；
在一种实施方式中，所述的辅助脂质可以为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)中的一种或多种。
可选的，所述的辅助脂质可以是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒粒径范围是60nm～150nm。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒由以下方法制备：
(1)分别将正电荷多肽和阴离子聚合物溶于溶剂，配制成正电荷多肽溶液和阴离子聚合物溶液；
(2)将步骤(1)得到正电荷多肽溶液和阴离子聚合物溶液混匀孵育，获得正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒；
在一种实施方式中，步骤(1)中，所述溶剂可以是去离子水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、生理盐水和葡萄糖注射液中的一种或多种。优选的，为去离子水。
在一种实施方式中，步骤(2)中，所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒中，所述正电荷多肽和阴离子聚合物质量比为4:1～16:1。在该实施方式的进一步实施方式中，所述正电荷多肽和阴离子聚合物质量比为6:1～10:1。
在一种实施方式中，步骤(2)之后，还包括以下步骤：
(3)除去溶液中游离正电荷多肽和阴离子聚合物。
进一步的，步骤(3)中，可通过超滤或透析的方法除去游离正电荷多肽和阴离子聚合物；
进一步的，步骤(3)中，获得的正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒可以重新分散在溶剂中，所述溶剂可以为去离子水、生理盐水、葡萄糖注射液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质载体可以为空白阳离子脂质体，空白阳离子脂质体可采用薄膜分散法、乙醇注入法或逆向蒸发法中的一种或多种制备。
在一种实施方式中，所述薄膜分散法，具体操作方法为，将阳离子脂质或阳离子脂质和辅助脂质按照一定比例溶解于氯仿或其他有机溶剂中，通过减压旋蒸使溶剂挥发，脂质在容器壁上形成薄膜；再加入相应的溶剂进行水合，获得空白阳离子脂质体。所述相应的溶剂是指溶解正电荷多肽和阴离子聚合物所用的溶剂。
在一种实施方式中，所述乙醇注入法，具体操作方法为，阳离子脂质或阳离子脂质和辅助脂质按照一定比例溶解于无水乙醇中，65℃水浴加热混合溶解；之后将其缓慢滴加入相应溶剂中，水浴加热，获得脂质体制剂或空白脂质体。所述相应溶剂是指溶解正电荷多肽和阴离子聚合物所用的溶剂。
在一种实施方式中，所述逆向蒸发法，具体操作方法为，阳离子脂质或阳离子脂质和辅助脂质按照一定比例溶解于氯仿或其他有机溶剂中并混匀，再将其加入制备好的纳米颗粒溶液或相应溶剂中，形成乳剂；通过减压旋转蒸发挥干有机溶剂，得到脂质体制剂或空白脂质体。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质可以为含阳离子脂质的脂质胶束溶液中的阳离子脂质。
进一步的，所述脂质胶束溶液的溶剂选自去离子水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、生理盐水和葡萄糖注射液中的一种或多种。优选的，为去离子水。
在一种实施方式中，获得正电荷多肽脂质体纳米制剂后，除去游离的正电荷多肽和脂质组分，去除方法可以为超滤或透析。
按照前述制备方法获得的正电荷多肽脂质体纳米制剂，还可在制备过程中加入脂质-聚乙二醇(PEG)或脂质-聚乙二醇(PEG)-功能分子。
在一种实施方式中，可以采用后插法，具体包括以下步骤：将正电荷多肽和阴离子聚合物混合孵育，得到正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒；将所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒与阳离子脂质载体孵育，得到正电荷多肽脂质体纳米制剂；分别将脂质-PEG或脂质-PEG-功能分子加入到所述正电荷多肽脂质体纳米制剂中，孵育，得到PEG修饰的或功能分子修饰的正电荷多肽脂质体纳米制剂。
在一种实施方式中，所述脂质-PEG中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，PEG是指聚乙二醇。
在一种实施方式中，脂质-PEG-功能分子中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，PEG是指聚乙二醇，功能分子可以为精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(ARG-GLY-ASP,RGD肽)。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽脂质体中，脂质体总脂质与脂质-PEG的摩尔比为95：5。
在一种实施方式中，所述正电荷多肽脂质体中，脂质体总脂质与脂质-PEG-功能分子的摩尔比为95：5。
本发明的第三方面提供了一种由前述制备方法获得的正电荷多肽脂质体纳米制剂。
本发明的第四方面提供了前述正电荷多肽脂质体纳米制剂在制备抗肿瘤、抗菌和抗炎症药物中的用途。
本发明具有以下有益效果：
本发明具有材料安全易得、制备操作简单、可重复性强的特点；脂质体制剂粒径大小和均一性理想、载药量大、制剂稳定、易于保存、正电荷多肽泄漏少、细胞毒性、毒性低、具有生物可降解特性、可功能化修饰、具有在循环系统中的长循环和肿瘤的主被动靶向分布功能等特点，可进行规模化生产。同时亦可对相似性质的多肽、蛋白类药物的制剂研究提供参考。
附图说明
图1：实施例1所得YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒的粒径和电势分布图(A为粒径分布，B为zeta电势分布)。
图2：实施例1中YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒的原子力显微镜(AFM)的形貌观测图。
图3：为实施例1所得YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的粒径和电势分布图(A为粒径分布，B为zeta电势分布)。
图4：实施例2中YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的稳定性情况考察结果。
图5：实施例3所得YAP样多肽-DNA纳米颗粒的粒径和电势分布图(A为粒径分布，B为zeta电势分布)。
图6：实施例3所得YAP样多肽-DNA脂质体纳米制剂的粒径和电势分布图(A为粒径分布，B为zeta电势分布)。
图7：实施例4所得YAP样多肽-透明质酸纳米颗粒的粒径和电势分布图(A为粒径分布，B为zeta电势分布)。
图8：实施例4所得YAP样多肽-透明质酸脂质体纳米制剂的粒径和电势分布图(A为粒径分布，B为zeta电势分布)。
具体实施方式
目前，关于多肽药物的输送可以大致分为以下类型：(1)通过药物载体输送，如使用树枝状聚合物、脂质体或量子点等作为药物载体；(2)改造多肽，通过改变多肽氨基酸序列或连接其他分子或多肽，使其在体内更加稳定且或具有靶向性。其中，脂质体是一个非常高效的药物输送载体，其主要成分为磷脂，由磷脂疏水的尾部和亲水的头部通过疏水作用力自组装形成。脂质体可基于EPR效应聚集于肿瘤组织，起到被动靶向的作用；因其成分与细胞膜相似，能更好地作用并进入细胞。但脂质体在多肽药物等的输送方面仍存在一些缺点与阻碍，特别是对多肽药物的有效和稳定的载荷一直是个急需解决的问题。
本发明针对正电荷多肽药物，根据其序列带有净正电荷的特性，提出一种新型的脂质体纳米制剂及制备方法。该制剂通过将正电荷多肽药物先与一种阴离子聚合物材料相互作用形成表面电位为负的纳米颗粒，再将该纳米颗粒与含一种或一种以上阳离子脂质组分的空白脂质体或脂质胶束溶液混合孵育，阳离子脂质通过静电作用结合到带负电纳米颗粒的表面并驱动其它脂质自组装到纳米颗粒表面，获得外面包裹脂质双分子膜的正电荷多肽/阴离子聚合物纳米颗粒，即得正电荷多肽脂质体纳米制剂。该方法可以实现对正电荷多肽药物的有效载荷，保护多肽药物在循环系统不被降解并减少多肽药物与血液中其它分子的结合，消除多肽药物所带正电荷的潜在细胞和生理毒性，有效提高多肽药物在靶组织的分布。之后还可对脂质体进行功能性脂质如PEG脂质及功能分子脂质的修饰，提高脂质体的循环时间，减少网状内皮系统的清除，增加制剂的靶向性和进细胞能力等，从而增加药效。
为了更好的说明本发明，我们选择了一种在pH＝7的条件下带正电的体内天然YAP(Yes-associated protein)的类似物-YAP样多肽(Yap-like peptide)作为正电荷多肽药物模型，该多肽含有17个氨基酸，序列为V P Met Hcy L R K Nle P AS Phe Cys K P P E。天然YAP作为Hippo信号通路中的主要效应分子，通过在细胞核内与转录因子TEADs(Transcriptional enhancer associate domain transcription factors)结合，激活下游基因表达；当天然YAP活性异常时，YAP-TEADs会导致细胞非控制性增殖，凋亡被抑制，从而造成恶性肿瘤多种疾病。YAP样多肽具有与天然YAP类似的多肽序列，它可以占据与TEADs的结合位点，从而竞争性抑制YAP-TEADs复合物的形成，进而抑制细胞的恶性增殖与发展，在肿瘤的治疗中具有非常大的应用潜力。然而关于YAP样多肽的体内药物输送系统的研究还没有；同时，该药物具备多肽类药物的特点，同时在生理条件下呈正电性，游离状态下生物学毒性非常大。因此作为本发明的模型药物理由充分，具有说服力。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的制备和表征
制备方法：
(1)将YAP样多肽和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为0.5mg/mL；将YAP样多肽溶液加入聚谷氨酸溶液中，涡旋震荡10s后，在室温条件下孵育30min，得到YAP样多肽与聚谷氨酸质量比为8:1的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒；使用100KD超滤管，超滤除去游离YAP样多肽，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，使用薄膜分散法制备脂质体，经过去离子水水合后获得1mg/mL的空白阳离子脂质体。在涡旋状态下，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，涡旋震荡15s，室温孵育12h，获得空白脂质体与纳米颗粒的质量比为4：1的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂。
将步骤(1)中获得的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒和步骤(2)中获得的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌观测；制剂经100KD超滤管超滤，并使用10％Triton和1％NaOH溶液处理后，使用HPLC对包封率进行检测。
其中，如图1，步骤(1)获得的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒的水合粒径为73.41nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.062，zeta电位为-5.31mV；如图2，AFM中观测到的纳米颗粒粒径为70nm；。
其中，如图3，步骤(2)获得的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的水合粒径为124.6nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.259，zeta电位为9.96mV。制剂YAP样多肽的包封率为58.5％。
实施例2YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂稳定性研究
制备方法：
将实施例1中制备好的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂重新分别分散于去离子水，，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)，生理盐水或5％葡萄糖注射液中。在不同时间点使用动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位，考察其稳定性。
如图4，结果显示YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的粒径在去离子水、HEPES、生理盐水和5％葡萄糖注射液中均没有明显变化，且在5天内其粒径一直保持稳定。YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂没有明显的YAP样多肽泄漏。
实施例3YAP样多肽-质粒DNA脂质体纳米制剂的制备与表征
制备方法：
(1)将YAP样多肽和质粒DNA(pGL3质粒)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度为0.5mg/mL；将YAP样多肽溶液加入质粒DNA溶液中，涡旋震荡10s后，在室温条件下孵育30min，得到YAP样多肽与质粒DNA质量比为8:1的YAP样多肽-质粒DNA纳米颗粒溶液。使用100KD超滤管超滤除去游离YAP样多肽，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，使用薄膜分散法制备脂质体，去离子水水合后获得1mg/mL的空白阳离子脂质体。在涡旋状态下，将之前获得的YAP样多肽-质粒DNA纳米颗粒加入空白阳离子脂质体溶液中，涡旋震荡15s，室温孵育12h，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为2：1的YAP样多肽-质粒DNA脂质体纳米制剂。
将步骤(1)中获得的YAP样多肽-质粒DNA复合物纳米颗粒和步骤(2)中获得的YAP样多肽-质粒DNA脂质体纳米制剂经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌观测；YAP样多肽-质粒DNA脂质体纳米制剂经100KD超滤管超滤，并使用10％Triton和1％NaOH溶液处理后，使用HPLC对包封率进行检测。
其中，如图5，步骤(1)获得的YAP样多肽-质粒DNA纳米颗粒的水合粒径为98.78nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.152，zeta电位为-2.82mV。
其中，如图6，步骤(2)获得的YAP样多肽-质粒DNA脂质体纳米制剂的水合粒径为102.2nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.224，zeta电位为8.86mV。制剂YAP样多肽的包封率为56.5％。
实施例4YAP样多肽-透明质酸脂质体纳米制剂的制备与表征
制备方法：
(1)将YAP样多肽和透明质酸分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度为0.5mg/mL；将YAP样多肽溶液加入透明质酸溶液中，涡旋震荡10s在室温条件下孵育30min，获得YAP样多肽与透明质酸质量比为8:1的YAP样多肽-透明质酸纳米颗粒。使用100KD超滤管超滤除去游离YAP样多肽，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将DOTAP、DOPE脂质溶解于氯仿，使用薄膜分散法制备脂质体，去离子水水合后获得1mg/mL的空白阳离子脂质体。在涡旋状态下，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，涡旋震荡15s，室温孵育12h，得到空白脂质体与纳米颗粒质量比为2：1的YAP样多肽-透明质酸脂质体纳米制剂。
步骤(1)中获得的YAP样多肽-透明质酸纳米颗粒和步骤(2)中获得的YAP样多肽-透明质酸脂质体纳米制剂经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌观测；YAP样多肽-透明质酸脂质体纳米制剂经100KD超滤管超滤，并使用10％Triton和1％NaOH溶液处理后，使用HPLC对包封率进行检测。
其中，如图7，步骤(1)获得的YAP样多肽-透明质酸纳米颗粒的水合粒径为105.3nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.045，zeta电位为-9.23mV。
其中，如图8，步骤(2)获得的YAP样多肽-透明质酸脂质体纳米制剂的水合粒径为117.7m(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.191，zeta电位为6.96mV。制剂YAP样多肽的包封率为59.6％。
实施例5
本发明还参照实施例1制备了其他类型的YAP样多肽脂质体纳米制剂，并进行表征。
类型1、与实施例1中的YAP样多肽脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将YAP样多肽和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为0.05mg/mL，将YAP样多肽溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到YAP样多肽与聚谷氨酸质量比为4:1的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为2：1的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型2、与实施例1中的YAP样多肽脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将YAP样多肽和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为1mg/mL，将YAP样多肽溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到YAP样多肽与聚谷氨酸质量比为6：1的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为5：1的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型3、与实施例1中的YAP样多肽脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将YAP样多肽和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为5mg/mL，将YAP样多肽溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到YAP样多肽与聚谷氨酸质量比为8：1的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，空白脂质体和纳米颗粒的质量比为4：1的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型4、与实施例1中的YAP样多肽脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将YAP样多肽和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为5mg/mL，将YAP样多肽溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到YAP样多肽与聚谷氨酸质量比为10：1的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为5：1的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型5、与实施例1中的YAP样多肽脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将YAP样多肽和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为8mg/mL，将YAP样多肽溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到YAP样多肽与聚谷氨酸质量比为12：1的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为2：1的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型6、与实施例1中的YAP样多肽脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将YAP样多肽和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为3mg/mL，将YAP样多肽溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到YAP样多肽与聚谷氨酸质量比为14:1的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为8：1的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
类型7、与实施例1中的YAP样多肽脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将YAP样多肽和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为3mg/mL，将YAP样多肽溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到YAP样多肽与聚谷氨酸质量比为16：1的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒；步骤(2)中，将之前获得的纳米颗粒加入空白脂质体溶液中，得到空白脂质体和纳米颗粒的质量比为10：1的YAP样多肽-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。
将各类型的脂质体纳米制剂和相应的YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌观测；YAP样多肽-透明质酸脂质体纳米制剂经100KD超滤管超滤，并使用10％Triton和1％NaOH溶液处理，使用HPLC对包封率进行检测。
不同比例YAP样多肽-聚谷氨酸纳米颗粒的包封率如下表：
经验证，类型1-7的脂质体制剂均具有稳定结构，没有明显YAP样多肽泄漏。
经验证，PEG修饰的类型1-7的YAP样多肽脂质体纳米制剂具有近中性表面电位，稳定结构，低细胞毒性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种正电荷多肽脂质体纳米制剂，含有正电荷多肽脂质体，所述正电荷多肽脂质体至少包括：正电荷多肽，阴离子聚合物和阳离子脂质载体。
2.根据权利要求1所述的正电荷多肽脂质体纳米制剂，其特征在于，所述正电荷多肽和阴离子聚合物结合形成正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒，所述阳离子脂质载体可形成脂质双分子膜，所述正电荷多肽脂质体包括外层结构和内核结构，所述外层结构包括脂质双分子膜，所述内核结构包括正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的正电荷多肽脂质体纳米制剂，其特征在于，所述制剂还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述正电荷多肽为多肽序列中所含净正电荷数大于等于1的多肽；
b.所述正电荷多肽为具有抗菌、抗炎症、抗肿瘤或免疫调节作用的正电荷多肽序列；
c.所述正电荷多肽为YAP样多肽及其改造和修饰产物。
4.根据权利要求1所述的正电荷多肽脂质体纳米制剂，其特征在于，所述制剂还包括以下特征中的一项或多项：
a.阴离子聚合物为所含净电荷为负的聚合物分子；
b.所述阴离子聚合物为通过化学合成或生物分离获得的聚合物分子；
c.所述阴离子聚合物为聚谷氨酸、聚天冬氨酸、透明质酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸中的一种或多种；
d.所述阳离子脂质载体至少包含一种阳离子脂质。
5.根据权利要求2所述的正电荷多肽脂质体纳米制剂，其特征在于，所述外层结构修饰有脂质-聚乙二醇或脂质-聚乙二醇-功能分子。
6.一种正电荷多肽脂质体纳米制剂的制备方法，至少包括以下步骤：
将正电荷多肽和阴离子聚合物混合孵育，得到正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒；将所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒与阳离子脂质载体混合孵育，得到正电荷多肽脂质体纳米制剂。
7.如权利要求6所述的正电荷多肽脂质体纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒由以下方法制备：
(1)分别将正电荷多肽和阴离子聚合物溶于溶剂，配制成正电荷多肽溶液和阴离子聚合物溶液；
(2)将步骤(1)得到正电荷多肽溶液和阴离子聚合物溶液混匀孵育，获得正电荷多肽-阴离子聚合物纳米颗粒。
8.如权利要求6所述的正电荷多肽脂质体纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下特征中的一项或多项：
a.所述阳离子脂质载体由阳离子脂质或阳离子脂质与辅助脂质制备而成；
b.所述阳离子脂质载体溶液由薄膜分散法、乙醇注入法和逆向蒸发法中的一种或多种方法进行制备；
c.在制备过程中加入脂质-聚乙二醇或脂质-聚乙二醇-功能分子，得到聚乙二醇修饰的或功能分子修饰的正电荷多肽脂质体纳米制剂。
9.一种正电荷多肽脂质体纳米制剂，由权利要求6-8任一所述方法获得。
10.一种如权利要求1-5任一所述或权利要求9所述的脂质体纳米制剂在制备抗肿瘤、抗菌、抗炎症或免疫调节药物中的用途。
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