CN112791192B - 炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112791192B
CN112791192B CN202011617773.6A CN202011617773A CN112791192B CN 112791192 B CN112791192 B CN 112791192B CN 202011617773 A CN202011617773 A CN 202011617773A CN 112791192 B CN112791192 B CN 112791192B
Authority
CN
China
Prior art keywords
melittin
lipid
preparation
liposome
anionic polymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011617773.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112791192A (zh
Inventor
彭金良
郑元
羊柳欣
王安琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN202011617773.6A priority Critical patent/CN112791192B/zh
Publication of CN112791192A publication Critical patent/CN112791192A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112791192B publication Critical patent/CN112791192B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供一种炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用。本发明制备包裹蜂毒素的脂质体纳米制剂并在表面修饰炎性细胞靶向功能分子，使得蜂毒素脂质体纳米制剂能够靶向结合炎性细胞并具有抑制细胞内炎性因子表达，降低细胞内一氧化氮和活性氧等水平的功能。

Description

炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及制药领域，特别是涉及炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和用途。
背景技术
蜂毒素是欧洲蜜蜂毒液中的主要毒性成分，是一种阳离子溶血肽。它占蜜蜂毒液干重的40～50％，是一个由26个氨基酸残基组成的小的线性多肽。据报道，蜂毒素在多种细胞类型中发挥着包括抗菌、抗病毒和抗炎在内的多种作用。高剂量时，蜂毒素可引起瘙痒、炎症和局部疼痛，而小剂量的蜂毒素则能够产生广泛的抗炎作用。作为一种具有良好抗炎效果的天然多肽，蜂毒素的体内外抗炎作用及相关机制已被广泛研究和报道。
蜂毒素特殊的二级结构对于生物膜具有很强的亲和力，极容易插入到脂质双分子膜中，并对其造成破坏，因此蜂毒素和其他抗菌肽类似，具有很强的溶血作用，在微量条件下就可与红细胞结合造成溶血。这也是蜂毒素作为炎症药物用于临床治疗的最大阻碍。同时，因为蜂毒素在生理条件下带有较多的净正电荷，极易与血液中的组分发生聚集而导致生物毒性增强和生物利用度降低。
蜂毒素具有两亲性，它分子中具有的2个α-螺旋结构使之易载入脂质膜中。目前，许多研究人员对蜂毒素脂质体制剂进行了研究，通过将蜂毒素载荷在脂质膜上在一定程度上提高了蜂毒素的稳定性并降低了溶血作用。但由于蜂毒素的两亲性导致的蜂毒素泄露或蜂毒素脂质体与体内生物膜接触引起的蜂毒素重分布，使其在体内实验中依然具有较强毒性作用，无法满足临床应用。采用阴离子聚合物或载体载荷蜂毒素，也同样面临着在生理溶液中不稳定，存在蜂毒素泄露等问题。
基于蜂毒素的抗炎应用和目前存在的上述问题，急需发展炎性细胞靶向的蜂毒素稳定载荷纳米制剂及相关的制备工艺。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和用途，用于解决现有技术中蜂毒素脂质体靶向治疗炎症的问题。
本发明的第一方面，提供一种炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂，含有蜂毒素脂质体，所述蜂毒素脂质体至少包括：蜂毒素、阴离子聚合物、阳离子脂质膜和脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子。
在一种实施方式中，脂质-聚乙二醇(PEG)-炎性细胞靶向功能分子中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，炎性细胞靶向功能分子可以为叶酸(Fa)、甘露糖(Mannose)中的一种或多种。其中叶酸修饰可用于靶向激活的炎性细胞，促进炎性细胞对纳米制剂的摄取和内吞；甘露糖修饰可增强巨噬细胞和树突状细胞等炎性细胞对制剂的摄取。
可选的，所述的炎性细胞靶向功能性修饰分子可以是脂质-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG3.4K-Fa)。
在一种实施方式中，所述蜂毒素和阴离子聚合物结合形成蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒，所述阳离子脂质可形成脂质双分子膜，所述蜂毒素脂质体包括外层结构和内核结构，所述外层结构包括脂质双分子膜及双分子膜上修饰的脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向功能分子，所述内核结构包括蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒中所述阴离子聚合物与所述蜂毒素的质量比为0.3:1～2:1。
在一种实施方式中，所述蜂毒素脂质体中，所述阳离子脂质膜与所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒的质量比为1:1～10:1。
在一种实施方式中，所述蜂毒素脂质体中，所述阳离子脂质膜与所述炎性细胞靶向功能性修饰分子的物质的量比为100:1～10:1。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物为含净电荷为负的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可为通过化学合成或生物分离方式获得的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可以是由相同单体或不同单体缩聚而成的，具有相同或不同聚合度的分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自生物可降解的阴离子聚合物。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自聚谷氨酸(γ-PGA)、聚天冬氨酸(PASP)、透明质酸(HA)、脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)中的一种或多种。
在一种实施方式，所述蜂毒素可选自生物提取纯化或合成的蜂毒素多肽。
在一种实施方式，所述蜂毒素可抑制炎性细胞内炎性细胞因子的表达，降低细胞一氧化氮和活性氧释放水平，进而实现抗炎作用。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质膜至少包含一种阳离子脂质。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质膜由至少一种阳离子脂质和辅助脂质制备而成。
可选的，所述阳离子脂质可以为：
DOTMA氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DOTAP溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DOSPA三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵；
DTAB溴化三甲基十二烷基铵；
TTAB溴化三甲基十四烷基铵；
CTAB溴化三甲基十六烷基铵；
DDAB溴化二甲基双十八烷基铵；
DORI溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DORIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HP溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HB溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HPc溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DPRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵；
DSRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵；
DMRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵；
DOGS N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺；
DOSC 1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯；
DC-Chol 3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇；
DLin-MC3-DMA 4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯
LPLL脂质多聚-L-赖氨酸；
SA硬脂胺。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、(3β-[N-N’，N’-二甲基胺乙基]胺基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)和溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)中的一种或多种。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)。
在一种实施方式中，所述的辅助脂质可以为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂(DPPC)、酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱胆固醇(Chol)中的一种或多种。
可选的，所述的辅助脂质可以是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一种实施方式中，脂质-聚乙二醇(PEG)-功能分子中，聚乙二醇可以为PEG2000、PEG3400、PEG5000。
在一种实施方式中，脂质-聚乙二醇(PEG)-功能分子中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，功能分子可以为叶酸(Fa)、甘露糖(Mannose)中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒粒径范围是60nm～150nm。
在一种实施方式中，所述蜂毒素与所述阴离子聚合物相结合，形成表面电位为负的蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
在一种实施方式中，阳离子脂质、辅助脂质和脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向功能分子溶解于有机溶剂并混合，置于圆底烧瓶内，旋转蒸发有机溶剂，吹氮气，得到脂质薄膜。
在一种实施方式中，脂质薄膜中的脂质分子在超声作用下，与蜂毒素-阴离子聚合物负电性纳米颗粒结合，并在静电驱动下均匀包裹在蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒表面，自组装形成脂质双分子层，从而得到所述炎性细胞靶向功能分子修饰的蜂毒素脂质体制剂。
蜂毒素与阴离子聚合物通过静电力作用结合。
本发明的第二方面，提供了一种炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂的制备方法，至少包括如下步骤：
(1)将蜂毒素和阴离子聚合物混合孵育，得到蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒；
(2)将阳离子脂质、辅助脂质和脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向功能分子混合溶解于有机溶剂，利用旋转蒸发制备脂质薄膜；
(3)将所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒直接水合脂质薄膜，密封超声，得到蜂毒素脂质体纳米制剂。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒中，所述阴离子聚合物与所述蜂毒素的质量比为0.3:1～2:1。
进一步的，所述炎性细胞靶向蜂毒素脂质体中，所述阳离子脂质膜脂质总量与所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒的质量比为1:1～10:1。
在一种实施方式中，所述蜂毒素脂质体中，所述阳离子脂质膜与所述炎性细胞靶向功能性修饰分子的物质的量比为100:1～10:1。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物为所含净电荷为负的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可为通过化学合成或生物分离方式获得的聚合物分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物可以是由相同单体或不同单体缩聚而成的，具有相同或不同聚合度的分子。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自生物可降解的阴离子聚合物。
在一种实施方式中，所述阴离子聚合物选自聚谷氨酸(γ-PGA)、聚天冬氨酸(PASP)、透明质酸(HA)、脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)中的一种或多种。
在一种实施方式，所述蜂毒素可选自生物提取纯化或合成的蜂毒素多肽。
在一种实施方式，所述蜂毒素可抑制炎性细胞的炎性细胞因子的表达，降低细胞一氧化氮和活性氧释放水平，实现抗炎作用。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质膜至少包含一种阳离子脂质。
在一种实施方式中，所述阳离子脂质膜由至少一种阳离子脂质和辅助脂质制备而成。
可选的，所述阳离子脂质可以为：
DOTMA氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DOTAP溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DOSPA三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵；
DTAB溴化三甲基十二烷基铵；
TTAB溴化三甲基十四烷基铵；
CTAB溴化三甲基十六烷基铵；
DDAB溴化二甲基双十八烷基铵；
DORI溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵；
DORIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HP溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HB溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DORIE-HPc溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵；
DPRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵；
DSRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵；
DMRIE溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵；
DOGS N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺；
DOSC 1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯；
DC-Chol 3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇；
DLin-MC3-DMA 4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯
LPLL脂质多聚-L-赖氨酸；
SA硬脂胺。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、(3β-[N-N’，N’-二甲基胺乙基]胺基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)和溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)中的一种或多种。
可选的，所述阳离子脂质可以为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)；
在一种实施方式中，所述的辅助脂质可以为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂(DPPC)、酰乙醇胺(DSPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱胆固醇(Chol)中的一种或多种。
可选的，所述的辅助脂质可以是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在一种实施方式中，脂质-聚乙二醇(PEG)-炎性细胞靶向功能分子中，聚乙二醇可以为PEG2000、PEG3400、PEG5000。
在一种实施方式中，脂质-聚乙二醇(PEG)-炎性细胞靶向功能分子中，脂质可以为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，功能分子可以为叶酸(Fa)、甘露糖(Mannose)中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒粒径范围是60nm～150nm。
在一种实施方式中，所述蜂毒素与所述阴离子聚合物相结合，形成表面电位为负的蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
在一种实施方式中，阳离子脂质、辅助脂质和巨噬细胞靶向功能性修饰分子溶解于有机溶剂并混合，置于圆底烧瓶内，旋转蒸发有机溶剂，吹氮气，得到脂质薄膜。
在一种实施方式中，在超声作用下，脂质薄膜中的阳离子脂质分子与蜂毒素-阴离子聚合物负电性纳米颗粒结合，并在静电和疏水作用驱动下均匀包裹在蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒表面，自组装形成脂质双分子层，从而得到所述炎性细胞靶向功能分子修饰的蜂毒素脂质体制剂。
优选地，所述超声功率范围为200～400W，超声时间为5～30min。
蜂毒素与阴离子聚合物通过静电力作用结合。
在一种实施方式中，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒由以下方法制备：
(1)分别将蜂毒素和阴离子聚合物溶于溶剂，配制成蜂毒素溶液和阴离子聚合物溶液；
(2)将步骤(1)得到蜂毒素溶液和阴离子聚合物溶液混匀孵育，获得蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
进一步的，所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒中，所述阴离子聚合物与所述蜂毒素的质量比为0.3:1～2:1。
进一步的，步骤(1)中，所述溶剂可以是去离子水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、生理盐水和葡萄糖注射液中的一种或多种。可选的，为去离子水。
在一种实施方式中，步骤(2)之后，还包括以下步骤：
(3)除去溶液中游离蜂毒素和阴离子聚合物；
进一步的，步骤(3)中，可通过超滤或透析的方法除去游离蜂毒素和阴离子聚合物；
进一步的，步骤(3)中，获得的蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒可以重新分散在溶剂中，所述溶剂可以为去离子水、生理盐水、葡萄糖注射液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述的炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂由以下方法制备：
(1)将蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒配制成溶液；
(2)阳离子脂质、辅助脂质和脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子混合溶解于有机溶剂，蒸发有机溶剂，制备脂质薄膜；
(3)将蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒溶液加入所述脂质薄膜中，密封超声，获得炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。
在一种实施方式中，所述的炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂由以下方法制备：
(1)将所述阳离子脂质、辅助脂质与脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子溶解于有机溶剂；
(2)将步骤(1)中的混合脂质溶液转移到容器中，利用旋转蒸发仪除去有机溶剂，吹氮气，制备脂质薄膜；
(3)将所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒加入上述覆盖脂质薄膜的容器中，密封，超声，得到脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子修饰的蜂毒素脂质体纳米制剂。
进一步的，所述炎性细胞靶向蜂毒素脂质体中，所述阳离子脂质载体脂质总量与所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒的质量比为1:1～10:1。
进一步的，所述巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体中，所述阳离子脂质载体与所述巨噬细胞靶向功能性修饰分子的物质的量比为100:1～10:1。
进一步的，步骤(1)中，所述有机溶剂可以是氯仿、甲醇、乙醇中的一种或多种。可选的，为氯仿。
在一种实施方式中，获得蜂毒素脂质体纳米制剂后，除去游离的蜂毒素和脂质组分，去除方法可以为超滤或透析。
在一种实施方式中，获得的炎性细胞靶向蜂毒素脂质体可以重新分散在溶剂中，所述溶剂可以为去离子水、生理盐水、葡萄糖注射液、PBS、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)中的一种或多种。
本发明的第三方面提供了上述方法制备炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。
本发明的第四方面提供了前述炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂制备在抗炎治疗药物中应用。
在一种实施方式中，炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂可抑制炎性细胞的炎性细胞因子如TNF-alpha、IL-6、IL-1beta、PGE2的表达，降低细胞一氧化氮和活性氧释放水平，实现抗炎作用。
如上所述，本发明的蜂毒素脂质体纳米制剂，具有以下有益效果：
本发明具有材料安全易得、制备操作简单、可重复性强的特点；脂质体制剂具有脂质双分子层包裹均匀、粒径大小和均一性理想、炎性靶向功能性分子修饰牢固效率高、载药量大、制剂稳定、易于保存、蜂毒素泄漏少、无溶血作用、毒性低、具有生物可降解特性、可靶向炎性细胞、具有在循环系统中的长循环和炎症部位的主动靶向分布功能等特点，可进行规模化生产。本材料具有抑制细胞炎性因子表达和一氧化氮水平、活性氧水平提高的功能，具备良好的抗炎效果。同时亦可对相似性质的多肽、蛋白类药物的制剂研究提供参考。
附图说明
图1A：实施例1所得蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的粒径分布图。
图1B：实施例1所得蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的电势分布图。
图2A：实施例1所得巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的粒径分布图。
图2B：实施例1所得巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的电势分布图。
图3：实施例1所得蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒和巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的冷冻透射电镜(Cryo-TEM)形貌观测图。
图4：实施例2中巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的稳定性情况考察结果。去离子水、HEPES、5％葡萄糖、生理盐水、1640培养基曲线分别表示巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂在去离子水、HEPES、5％葡萄糖注射液、生理盐水和RPMI1640培养基中的粒径随时间变化情况。
图5：实施例3中不同蜂毒素制剂的溶血性实验结果。其中，Mel代表游离蜂毒素药物；MpG@NP为蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；Fa-MpG@LNP为巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂。
图6：实施例4中巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对Raw264.7细胞的细胞毒性实验结果。其中，Mel代表游离蜂毒素药物；MpG@NP为蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；Fa-MpG@LNP为巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂。
图7：实施例5中FITC荧光标记巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的特异性结合情况的Confocal观测图。其中，Fa&FITC-MpG@LNP组为FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂组，直接加入Fa&FITC-MpG@LNP溶液孵育30min；Fa+Fa&FITC-MpG@LNP组为竞争抑制组，先加入DSPE-PEG3400-Fa溶液37℃孵育1h，用PBS清洗三次后再加入Fa&FITC-MpG@LNP溶液孵育30min；PEG&FITC-MpG@LNP为对照组，直接加入PEG修饰的FITC标记蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂溶液孵育30min。
图8：实施例5中FITC荧光标记叶酸修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的特异性结合情况的流式检测图。其中，Blank为LPS激活的未加入脂质体的Raw264.7细胞；Fa+Fa&FITC-MpG@LNP组为竞争抑制组，先加入DSPE-PEG3400-Fa溶液37℃孵育1h，用PBS清洗三次后再加入Fa&FITC-MpG@LNP溶液孵育30min；PEG&FITC-MpG@LNP为对照组，直接加入PEG修饰的FITC标记蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂溶液孵育30min；Fa&FITC-MpG@LNP组为FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂组，直接加入Fa&FITC-MpG@LNP溶液孵育30min。
图9：实施例6中FITC荧光标记甘露糖修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的特异性结合情况的Confocal观测图。其中，Man&FITC-MpG@LNP组为FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂组，直接加入Man&FITC-MpG@LNP溶液孵育30min；Man+Man&FITC-MpG@LNP组为竞争抑制组，先加入DSPE-PEG2000-Man溶液37℃孵育1h，用PBS清洗三次后再加入Man&FITC-MpG@LNP溶液孵育30min；PEG&FITC-MpG@LNP为对照组，直接加入PEG修饰的FITC标记蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂溶液孵育30min。
图10：实施例7中叶酸修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7细胞中促炎细胞因子释放的影响结果图。其中，LPS为500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 1μg/mL为预先加入1μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 2μg/mL为预先加入2μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 5μg/mL为预先加入5μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组。
图11：实施例8中叶酸修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7细胞中NO、PGE2释放的影响结果图。其中，LPS为500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 1μg/mL为预先加入1μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 2μg/mL为预先加入2μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 5μg/mL为预先加入5μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组。
图12：实施例9中叶酸修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7细胞内活性氧(ROS)含量的影响结果图。其中，LPS为500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 1μg/mL为预先加入1μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 2μg/mL为预先加入2μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Fa-MpG@LNP 5μg/mL为预先加入5μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组。
图13：实施例10中甘露糖修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7细胞中促炎细胞因子释放的影响结果图。其中，LPS为500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Man-MpG@LNP 1μg/mL为预先加入1μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Man-MpG@LNP 2μg/mL为预先加入2μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组；LPS+Man-MpG@LNP 5μg/mL为预先加入5μg/mL巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂后加入500ng/mL LPS激活Raw264.7组。
具体实施方式
虽然在炎症部位药物递送方面脂质体纳米制剂展示出优于传统药物的特性，但在被动靶向过程中，其在静脉或关节内给药后仍存在许多药代动力学和药效学方面的挑战，为了克服这些障碍，可利用主动靶向的方式将药物传递到炎症部位。炎症部位的可能靶点包括炎性细胞、蛋白酶和血管生成的特异性受体。可以在药物载体表面修饰肽或抗体等配体，使其与特异性表达或过度表达的炎性细胞表面受体结合。这种配体受体的相互作用也有助于通过受体介导的内吞作用将颗粒有效地吸收到病变细胞中。
甘露糖受体主要由包括肺泡巨噬细胞、腹膜巨噬细胞、单核细胞来源的树突状细胞和库普弗细胞在内的免疫细胞表达。这些受体在免疫功能中扮演多种角色，包括抗原识别、内吞作用和抗原呈递，并参与体内平衡维持、炎症和免疫反应等。甘露糖修饰脂质体已多次被证明优先以巨噬细胞和树突状细胞为靶点，在体内和体外均增强细胞对制剂的摄取。叶酸是所有分裂细胞存活和增殖的必要成分，细胞膜结合蛋白即叶酸受体可促进细胞对叶酸的吸收，而β亚型叶酸受体在炎症部位被激活的巨噬细胞中特异性表达。因此甘露糖受体，β亚型叶酸受体为以炎性细胞及激活炎性细胞为作用靶细胞的炎症治疗提供了强有力的靶点。
现有的脂质体制备方法中，采用将带负电的蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒与带正电的阳离子脂质体混合孵育的方法实现内外层结构的组装。但该方法完全依赖静电作用驱动阳离子脂质体包裹蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒，存在脂质膜包裹不均匀，制剂中阳离子脂质体过量等问题。本方法在超声条件下驱动脂质薄膜与蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒结合，使脂质包裹更均匀，能在阳离子脂质体用量更低的情况下实现稳定包载。
本制剂需要依靠表面修饰的DSPE-PEG3.4K-Fa实现巨噬细胞靶向作用，但DSPE-PEG3.4K-Fa水溶性较差，首尾两端疏水难以制成胶束，不宜采用脂质插入法进行靶向修饰。若作为脂质组分制备空白脂质体再进行载药，则引入的聚乙二醇水化层严重影响药物进入脂质体内腔。传统的薄膜分散法、乙醇注入和逆向蒸发法，同样不适用于大分子量蜂毒素阴离子聚合物的包载。而本制备方法能有效克服DSPE-PEG3.4K-Fa的脂质体修饰难题，提高其后插效率。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的制备和表征
(1)将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA，700KD)分别溶解于去离子水中，配制0.5mg/mL水溶液；按蜂毒素与聚谷氨酸质量比2:1的比例将聚谷氨酸溶液一次性快速加入蜂毒素溶液中，用移液枪吹打混匀，涡旋震荡10s，在室温条件下使用恒温摇床350rpm震荡孵育30min，得到蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒；使用100KD超滤管，超滤除去游离蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将摩尔比为47.5:47.5:5的DOTAP、DOPE脂质和DSPE-PEG3400-Fa溶解于氯仿，转移到圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪除去氯仿，吹氮气，制备覆盖圆底烧瓶底部的均匀脂质薄膜。
(3)按总脂质体组分与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒质量比2:1的比例将之前获得的纳米颗粒加入覆盖均匀脂质薄膜的圆底烧瓶中，室温下超声水合15min，超声功率400W，获得巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂。
(4)使用10KD透析袋，将制备得到的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂置于4℃去离子水中透析24h，除去游离的脂质组分。
将步骤(1)中获得的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒和步骤(4)中获得的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂经过动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位；利用冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)进行形貌观测；蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂使用10％Triton和1％NaOH溶液进行处理后，使用HPLC对包封率进行检测(蜂毒素的特征吸收波长为280nm)。
其中，如图1A、图1B，步骤(1)获得的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的水合粒径为78.86nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.145，zeta电位为-43.2mV。
其中，如图2A、图2B，步骤(2)获得的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的水合粒径为106.4nm(DLS检测)，多分散系数(PDI)为0.122，zeta电位为3.80mV，制剂的蜂毒素包封率为73.72％。
如图3，为冷冻透射电镜中观测到的纳米颗粒和巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，它们的粒径在40～80nm范围内。
实施例2巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂稳定性研究
将实施例1中制备好的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂重新分别分散于去离子水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)，5％葡萄糖注射液、生理盐水和RPMI1640培养基中。在不同时间点使用动态光散射纳米粒度分析仪(DLS)测定粒径、粒径多分散系数(PDI)以及zeta电位，考察其稳定性。通过透析后用HPLC检测透析液中的蜂毒素，分析蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的蜂毒素泄漏情况。
如图4，蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的粒径在去离子水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、5％葡萄糖注射液、生理盐水和RPMI1640培养基中均没有明显变化，且在5天内其形貌、PDI和zeta电位一直保持稳定。蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂没有明显的蜂毒素泄漏。
实施例3巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的溶血性检测
小鼠进行眼眶取血并用肝素钠抗凝，使用血细胞计数器计数后，分装到EP管中，使每管含有5×10^6个血细胞；2000rpm，离心5min去上清，加入等体积生理盐水。将实施例1中获得的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(MpG@NP)和巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa-MpG@LNP)及游离蜂毒素(Mel)药物分散于HEPES中，设置浓度梯度为0.5μg/mL，1μg/mL，3μg/mL，6μg/mL，12μg/mL，18μg/mL，24μg/mL(蜂毒素含量)，加入EP管中，37℃孵育6h。之后重新进行离心，收集上清加入96孔板中，设置三组平行样本；使用酶标仪进行检测，检测波长525nm。
溶血率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x 100％，其中As:实验组；Ac:Triton；Ab:PBS。
如图5，实验结果显示游离蜂毒素在较低浓度即引起明显的溶血效应，在浓度为1μg/mL时达到70％的溶血，在浓度为6μg/mL时溶血达到100％。相比游离蜂毒素，蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(MpG@NP)、巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa-MpG@LNP)都明显地降低了对红细胞的溶血性。游离蜂毒素在6μg/mL时，就达到了100％的溶血率；而MpG@NP仅为14.6％，Fa-MpG@LNP更低，仅为3.17％。在蜂毒素含量高达24μg/mL时，巨噬靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa-MpG@LNP)也仅造成10.34％的溶血。MpG@NP的溶血性相对于Fa-MpG@LNP较高，可能是MpG@NP在培养液中不够稳定，有蜂毒素释放出来导致溶血有关；而DSPE-PEG3400-Fa的修饰掩蔽了脂质体表面的正电荷，更有效地减少了溶血作用。
实施例4巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对Raw264.7细胞的细胞毒性实验
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，消化后计数；调整细胞浓度，接种于96孔板中；每孔10^4个细胞，100μL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)设置实验组别如下：巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂(Fa-MpG@LNP)；蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(MpG@NP)；游离蜂毒素(Mel)。样品用不含胎牛血清(FBS)的1640培养基稀释到蜂毒素浓度为0.1μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，加入至每孔细胞中；同时设置阳性对照组(每孔细胞中只加入等体积培养基)和空白对照组(每孔不接种细胞，只加入等体积培养基)。
(3)将加药完毕后的细胞在37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育4h，取出培养板，弃去培养基，每孔重新加入100μL含10％FBS的1640培养基，继续培养24h。之后，每孔加入10μLCCK8检测液，37℃避光孵育4h，使用酶标仪在450nm处检测吸光值，并代入公式计算细胞的存活率：
溶血率＝(A-An)/(Ap-An)×100％
其中A：实验组；Ab：空白对照组；Ap：阳性对照组
根据图6可以看出，5μg/mL以上浓度游离蜂毒素对于细胞具有显著毒性，10μg/mL以上蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒对于细胞具有显著毒性，而所有浓度巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的细胞存活率均在80％以上。可见通过合成蜂毒素纳米颗粒及蜂毒素-脂质体纳米制剂，可以极大地减少蜂毒素对于细胞的毒性。
实施例5巨噬细胞靶向叶酸修饰蜂毒素脂质体纳米制剂对小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的特异性结合
FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的制备：
(1)将合成的FITC荧光标记蜂毒素(FITC-Mel)和聚谷氨酸分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度为0.5mg/mL；按FITC荧光标记蜂毒素与聚谷氨酸质量比2:1的比例将聚谷氨酸溶液一次性快速加入FITC荧光标记蜂毒素溶液中，用移液枪吹打混匀，涡旋震荡10s，在室温条件下使用恒温摇床350rpm震荡孵育30min，得到FITC荧光标记的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；使用100KD超滤管，超滤除去游离FITC荧光标记蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将摩尔比为19:19:1的DOTAP、DOPE脂质和DSPE-PEG3400-Fa溶解于氯仿，转移到圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪旋干氯仿，吹氮气，制备覆盖圆底烧瓶底部的均匀脂质薄膜。
(3)按空白脂质体与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的质量比2:1的比例将之前获得的纳米颗粒加入覆盖均匀脂质薄膜的圆底烧瓶中，室温下超声水合15min，功率400W，获得FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa&FITC-MpG@LNP)。
(4)使用10KD透析袋，将制备得到FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂置于4℃去离子水中透析24h，除去游离的脂质组分。
采用实施例4(1)～(4)所述方法制备FITC标记的PEG修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(PEG&FITC-MpG@LNP)，制作方法与上述区别在于，步骤(2)中，将DSPE-PEG3400-Fa替换为DSPE-PEG2000，其余皆相同。
Confocal验证小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的特异性结合作用实验：
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，消化后计数；调整细胞浓度，接种于铺有盖玻片的24孔板中；每孔5×10^4个细胞，500μL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)加入适量LPS溶液，使细胞培养液中LPS的浓度为500ng/ml；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h。
(3)弃去细胞培养液，使用PBS冲洗细胞后，加入FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa&FITC-MpG@LNP)溶液或PEG修饰的FITC标记蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(PEG&FITC-MpG@LNP)溶液，37℃培养30min；竞争抑制组则是先加入DSPE-PEG3400-Fa溶液37℃孵育1h，用PBS清洗三次后再加入Fa&FITC-MpG@LNP溶液，37℃培养30min。细胞培养液中蜂毒素的浓度为10μg/ml。
(4)弃去细胞培养液，用PBS冲洗细胞三次后，使用多聚甲醛对细胞进行固定，使用DAPI溶液染色；制片后使用激光共聚焦显微镜，在激发波长/发射波长为495/519和358/461条件下观测蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂对细胞的结合情况。
图7显示巨噬细胞被LPS激活，生理状态正常，PEG&FITC-MpG@LNP组细胞上绿色荧光信号较弱，而Fa&FITC-MpG@LNP组细胞上有明显的绿色荧光信号,说明该制剂可以有效的通过Fa与叶酸受体β的作用结合到被激活的巨噬细胞上，促进制剂与细胞膜的结合和内吞；当使用DSPE-PEG3400-Fa作为竞争抑制剂，占据细胞表面Fa的结合位点后，再次加入Fa修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，Raw264.7细胞上绿色荧光信号较弱，进一步说明该制剂可通过Fa与细胞膜上的叶酸受体β特异性识别，促进制剂与细胞膜的结合和内吞。
流式验证小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的特异性结合作用实验：
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，消化后计数；调整细胞浓度，接种于12孔板中；每孔1×10^5个细胞，1mL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)加入适量LPS溶液，使细胞培养液中LPS的浓度为500ng/ml；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h。
(3)弃去细胞培养液，使用PBS冲洗细胞后，加入FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa&FITC-MpG@LNP)溶液或PEG修饰的FITC标记蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(PEG&FITC-MpG@LNP)溶液，37℃培养30min；竞争抑制组则是先加入DSPE-PEG3400-Fa溶液37℃孵育1h，用PBS清洗三次后再加入Fa&FITC-MpG@LNP溶液，37℃培养30min。细胞培养液中蜂毒素的浓度为10μg/ml。
(4)弃去细胞培养液，用PBS冲洗细胞三次后，重悬于1mL PBS中，使用流式细胞仪，在激发波长/发射波长为495/519的条件下检测各组细胞的荧光强度。
图8显示巨噬细胞被LPS激活，生理状态正常，PEG&FITC-MpG@LNP组细胞的细胞绿色荧光信号较弱，而Fa&FITC-MpG@LNP组细胞有明显的绿色荧光信号,说明该制剂可以有效的通过Fa与叶酸受体β的作用结合到被激活的巨噬细胞上，促进制剂与细胞膜的结合和内吞；当使用DSPE-PEG3400-Fa作为竞争抑制剂，占据细胞表面Fa结合的靶点后，再次加入Fa修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，Raw264.7细胞绿色荧光信号较弱，进一步说明该制剂可通过Fa与细胞膜上的叶酸受体β特异性识别，促进制剂与细胞膜的结合和内吞。
实施例6甘露糖修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的特异性结合
FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的制备：
(1)将合成的FITC荧光标记蜂毒素(FITC-Mel)和聚谷氨酸分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度为0.5mg/mL；按FITC荧光标记蜂毒素与聚谷氨酸质量比2:1的比例将聚谷氨酸溶液一次性快速加入FITC荧光标记蜂毒素溶液中，用移液枪吹打混匀，涡旋震荡10s，在室温条件下使用恒温摇床350rpm震荡孵育30min，得到FITC荧光标记的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒；使用100KD超滤管，超滤除去游离FITC荧光标记蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将摩尔比为19:19:1的DOTAP、DOPE脂质和DSPE-PEG2000-甘露糖(Mannose)溶解于氯仿，转移到圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪旋干氯仿，吹氮气，制备覆盖圆底烧瓶底部的均匀脂质薄膜。
(3)按空白脂质体与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的质量比2:1的比例将之前获得的纳米颗粒加入覆盖均匀脂质薄膜的圆底烧瓶中，室温下超声水合15min，功率400W，获得FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Man&FITC-MpG@LNP)。
(4)使用10KD透析袋，将制备得到FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂置于4℃去离子水中透析24h，除去游离的脂质组分。
采用实施例4(1)～(4)所述方法制备FITC标记的PEG修饰蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(PEG&FITC-MpG@LNP)，制作方法与上述区别在于，步骤(2)中，将DSPE-PEG3400-Fa替换为DSPE-PEG2000，其余皆相同。
Confocal验证小鼠单核巨噬细胞Raw264.7的特异性结合作用实验：
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，消化后计数；调整细胞浓度，接种于铺有盖玻片的24孔板中；每孔5×10^4个细胞，500μL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)弃去细胞培养液，使用PBS冲洗细胞后，加入FITC标记的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Man&FITC-MpG@LNP)溶液或PEG修饰的FITC标记蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(PEG&FITC-MpG@LNP)溶液，37℃培养30min；竞争抑制组则是先加入DSPE-PEG2000-Man溶液37℃孵育1h，用PBS清洗三次后再加入Man&FITC-MpG@LNP溶液，37℃培养30min。细胞培养液中蜂毒素的浓度为10μg/ml。
(3)弃去细胞培养液，用PBS冲洗细胞三次后，使用多聚甲醛对细胞进行固定，使用DAPI溶液染色；制片后使用激光共聚焦显微镜，在激发波长/发射波长为495/519和358/461条件下观测蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂对细胞的结合情况。
图9显示巨噬细胞生理状态正常，PEG&FITC-MpG@LNP组细胞上绿色荧光信号较弱，而Man&FITC-MpG@LNP组细胞上有明显的绿色荧光信号,说明该制剂可以有效的通过Man与巨噬细胞上甘露糖受体的作用结合到巨噬细胞上，促进制剂与细胞膜的结合和内吞；当使用DSPE-PEG2000-Man作为竞争抑制剂，占据细胞表面Man的结合位点后，再次加入Man修饰的蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，Raw264.7细胞上绿色荧光信号较弱，进一步说明该制剂可通过Man与细胞膜上的甘露糖受体特异性识别，促进制剂与细胞膜的结合和内吞。
实施例7巨噬细胞靶向叶酸修饰蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7炎性细胞中促炎细胞因子释放的影响
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，消化后计数；调整细胞浓度，接种于12孔板中；每孔2.5×10^5个细胞，1mL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)弃去细胞培养液，换无血清1640培养基，在实验组中加入实施例1中巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa-MpG@LNP)溶液，蜂毒素浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育4h。
(3)弃去细胞培养液，每孔加入1mL含10％FBS的1640细胞培养液，加入适量LPS溶液，使细胞培养液中LPS浓度为500ng/ml；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h。
(4)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法，测定细胞培养上清液中细胞因子IL-1beta、IL-6、TNF-alpha的含量。
IL-1beta、IL-6、TNF-alpha是巨噬细胞在炎症反应进程中分泌的典型炎症因子，能促进炎症的发生与发展。由图10可知，与对照组相比，LPS显著增加巨噬细胞IL-1beta、IL-6、TNF-alpha的分泌水平；而Fa-MpG@LNP处理组显著抑制IL-1beta、IL-6、TNF-alpha的分泌水平，并且随浓度的升高，抑制作用逐渐增强，呈现量效关系。结果表明，巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂可以显著抑制炎性细胞炎性细胞因子的合成，从而抑制炎症反应。
实施例8巨噬细胞靶向叶酸修饰蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7炎性细胞中NO、PGE2释放的影响
Griess Reagent法检测巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7 细胞NO释放的影响：
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，消化后计数；调整细胞浓度，接种于48孔板中；每孔5×10^4个细胞，200μL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)弃去细胞培养液，换无血清1640培养基，在实验组中加入实施例1中的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa-MpG@LNP)溶液，使蜂毒素浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育4h。
(3)弃去细胞培养液，每孔加入200μL含10％FBS的1640细胞培养液，加入适量LPS溶液，使细胞培养液中LPS浓度为500ng/ml；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h。
(4)采用Griess Reagent法，取50μL细胞培养上清液于96孔板中，依次加入GriessReagent I和Griess Reagent II，于540nm处检测吸光度，测定细胞培养上清液中NO的含量。
Elisa法检测巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7细胞PGE2 释放的影响：
利用酶联免疫吸附试验(ELISA)法，采用实例6(1)～(4)方法得到细胞培养上清液，检测细胞培养上清液中细胞因子PGE2的含量。
在活化的巨噬细胞中，大量的NO由诱导型NO合酶(iNOS)产生，NO效应因子诱导其他炎症介质如前列腺素E2(PGE2)和前列腺素I2((PGI2)从COX途径释放，而iNOS途径可以被cPLA2调整，通过这种机制，炎症反应中生理或病理反应可以被放大。
由图11可知，与对照组相比，LPS显著增加巨噬细胞NO和PGE2的分泌水平，巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂能够抑制LPS激活RAW 264.7细胞中NO和PGE2的产生；并且随浓度的升高，抑制作用逐渐增强，呈现量效关系。结果表明，炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂的可以显著抑制LPS诱导的炎性细胞的NO和PGE2水平，从而抑制炎症反应。
实施例9巨噬细胞靶向叶酸修饰蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7细胞内活性氧(ROS)含量的影响
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，消化后计数；调整细胞浓度，接种于12孔板中；每孔2x10^5个细胞，1mL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)弃去细胞培养液，换无血清1640培养基，在实验组中加入炎性细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa-MpG@LNP)溶液，浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育4h。
(3)弃去细胞培养液，每孔加入1mL含10％FBS的1640细胞培养液，加入适量LPS溶液，使细胞培养液中LPS浓度为500ng/ml；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h。
(4)弃去细胞培养液，使用PBS冲洗细胞后，每孔加入500μL 100μM DCFH-DA工作液。37℃细胞培养箱内避光孵育30min。
(5)弃去工作液，用PBS冲洗细胞三次后，重悬于1mL PBS中，使用流式细胞仪，在激发波长/发射波长为495/519的条件下检测各组细胞的荧光强度。
由于炎症作用造成的细胞损伤导致巨噬细胞内自由基和活性氧(ROS)的释放。根据图12可以看到，巨噬细胞被LPS激活，细胞内ROS含量升高，荧光强度增加；空白对照组细胞内ROS含量低，荧光强度较低。Fa-MpG@LNP组细胞绿色荧光信号随药物浓度的升高明显减弱。结果表明，随药物浓度的升高，细胞内ROS浓度逐渐降低。巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂可以显著抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。
实施例10甘露糖修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7炎性细胞中促炎细胞因子释放的影响
甘露糖修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂的制备
(1)将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA，700KD)分别溶解于去离子水中，配制0.5mg/mL水溶液；按蜂毒素与聚谷氨酸质量比2:1的比例将聚谷氨酸溶液一次性快速加入蜂毒素溶液中，用移液枪吹打混匀，涡旋震荡10s，在室温条件下使用恒温摇床350rpm震荡孵育30min，得到蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒；使用100KD超滤管，超滤除去游离蜂毒素，并将纳米颗粒重新分散于去离子水中。
(2)将摩尔比为47.5:47.5:5的DOTAP、DOPE脂质和DSPE-PEG2000-甘露糖溶解于氯仿，转移到圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪除去氯仿，吹氮气，制备覆盖圆底烧瓶底部的均匀脂质薄膜。
(3)按总脂质体组分与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒质量比2:1的比例将之前获得的纳米颗粒加入覆盖均匀脂质薄膜的圆底烧瓶中，室温下超声水合15min，超声功率400W，获得巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂。
(4)使用10KD透析袋，将制备得到的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂置于4℃去离子水中透析24h，除去游离的脂质组分。
甘露糖修饰巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂对LPS激活Raw264.7炎性细胞中 促炎细胞因子释放的影响
(1)取对数生长期的小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，消化后计数；调整细胞浓度，接种于12孔板中；每孔2.5×10^5个细胞，1mL含10％FBS的1640细胞培养液；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)弃去细胞培养液，换无血清1640培养基，在实验组中加入实施例11中甘露糖修饰巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Man-MpG@LNP)溶液，蜂毒素浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育4h。
(3)弃去细胞培养液，每孔加入1mL含10％FBS的1640细胞培养液，加入适量LPS溶液，使细胞培养液中LPS浓度为500ng/ml；在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h。
(4)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法，测定细胞培养上清液中细胞因子IL-1beta、IL-6、TNF-alpha的含量。
IL-1beta、IL-6、TNF-alpha是巨噬细胞在炎症反应进程中分泌的典型炎症因子，能促进炎症的发生与发展。由图13可知，与对照组相比，LPS显著增加巨噬细胞IL-1beta、IL-6、TNF-alpha的分泌水平；而Man-MpG@LNP处理组显著抑制IL-1beta、IL-6、TNF-alpha的分泌水平，并且随浓度的升高，抑制作用逐渐增强，呈现量效关系。结果表明，巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂可以显著抑制炎性细胞炎性细胞因子的合成，从而抑制炎症反应。
实施例11其他脂质体制剂及其表征研究
本发明还参照实施例1，调整各成分的比例，制备了不同组分比例的巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂，并进行表征。
类型1与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(1)中，将蜂毒素和聚谷氨酸(PGA)分别溶解于去离子水中，使得其水溶液的最终浓度均为0.05mg/mL，将蜂毒素溶液加入聚谷氨酸溶液中，得到聚谷氨酸与蜂毒素质量比分别为0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、3:1的蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒，其余皆相同。不同摩尔比聚谷氨酸(PGA)与蜂毒素(Mel)形成蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒的水合粒径和电位如下表1:
表1
PGA:Mel 0.2:1 0.3:1 0.4:1 0.5:1 1:1 1.5:1 2:1 3:1
Size(nm) 189.9 145.3 132.5 78.86 88.57 85 101.8 197.6
PDI 0.371 0.211 0.196 0.145 0.189 0.176 0.231 0.276
Zeta(mV) -21.3 -30.8 -36.8 -43.2 -52.6 -60 -67.8 -72.1
如上表所示，在聚谷氨酸与蜂毒素质量比为0.3:1～2:1的区间范围内，都能够形成粒径在150nm以内，电位在-30mV～-60mV之间的蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒。在后续实验中也能与脂质薄膜超声水合，得到粒径均一，在100～200nm之间，且电位适中、稳定性高的巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。并且在细胞实验中均有如实施例5所示的良好靶向作用和如实施例6～8所示的有效抗炎作用。
当聚谷氨酸与蜂毒素质量比小于0.3:1时，以上表中0.2:1为例，所形成的纳米颗粒粒径偏大，且所带负电较低，难以与阳离子脂质膜超声水合，通过静电驱动得到粒径合适、稳定性高的巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。当聚谷氨酸与蜂毒素质量比大于2:1时，所形成的纳米颗粒粒径偏大且负电性较强，在与阳离子脂质膜超声水合的过程中，由于带电过强，会发生沉淀现象，不能形成稳定的巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。证明聚谷氨酸与蜂毒素质量比为0.3:1～2:1的区间范围的设置合理性。
类型2与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(3)中，分别按总脂质体组分与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒质量比为0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、8:1、10:1、12:1的比例将之前获得的纳米颗粒加入覆盖均匀脂质薄膜的圆底烧瓶中，室温下超声水合15min，功率400W，获得巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂。其余步骤均相同。
不同质量比脂质总量(T-Lipo)与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(MpG@LNP)水合得到的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂(Fa-MpG@LNP)的水合粒径和电位如下表2：
表2
T-Lipo:LNP 0.5:1 1:1 2:1 3:1 4:1 8:1 10:1 12:1
Size(nm) 201.3 148.2 106.4 87.3 83.5 74.8 75.2 73.9
PDI 0.653 0.321 0.122 0.132 0.121 0.265 0.176 0.189
Zeta(mV) -31.2 -18.7 3.80 8.5 14.6 23.2 29.4 37.6
如上表所示，在脂质总量(T-Lipo)与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(MpG@LNP)质量比为1:1～10:1的区间范围内，都能够形成粒径在150nm以内，电位在-20mV～+30mV之间的巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。该粒径和电位范围处于细胞实验以及体内实验的合适区间，在细胞实验中均有如实施例5所示的良好靶向作用和如实施例6～8所示的有效抗炎作用。
当脂质总量(T-Lipo)与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(MpG@LNP)质量比小于1:1时，以上表中0.5:1为例，所形成的制剂粒径偏大，且所带负电较高，蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒不能完全被包裹在脂质双分子层中，在完全培养基中的稳定性差，且实施例3溶血实验中溶血现象严重。当脂质总量(T-Lipo)与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(MpG@LNP)质量比大于10:1时，所形成的制剂正电性过强，空白脂质体数量大幅增加，且在完全培养基中与其中的带负电蛋白通过静电作用结合沉淀，稳定性差。证明脂质总量(T-Lipo)与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒(MpG@LNP)质量比为1:1～10:1的区间范围的设置合理性。
类型3与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(2)中将摩尔比为49.75:49.75:0.5(DSPE-PEG3.4K-Fa占总脂质0.5％)、49.5:49.5:1(DSPE-PEG3.4K-Fa占总脂质1％)、49:49:2(DSPE-PEG3.4K-Fa占总脂质2％)、47.5:47.5:5(DSPE-PEG3.4K-Fa占总脂质5％)、45:45:10(DSPE-PEG3.4K-Fa占总脂质10％)、40:40:20(DSPE-PEG3.4K-Fa占总脂质20％)的DOTAP、DOPE脂质和DSPE-PEG3400-Fa溶解于氯仿，转移到圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪旋干氯仿，吹氮气，制备覆盖圆底烧瓶底部的均匀脂质薄膜。其余步骤均相同。
不同物质的量百分比DSPE-PEG3400-Fa修饰量(占总脂质量的比例)蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的水合粒径和电位如下表3：
表3
Figure BDA0002875325360000221
如上表所示，当DSPE-PEG3400-Fa修饰量(占总脂质量的比例)为1％～10％范围内，都能够形成粒径在150nm以内，电位在-10mV～+20mV之间的巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。这些制剂粒径均一，稳定性好，均在如实施例5所示的靶向实验中显示出良好的靶向作用，且与巨噬细胞的结合强度随DSPE-PEG3400-Fa修饰量的增加而逐渐增强。这些制剂也有如实施例6～8所示的有效抗炎作用。
当DSPE-PEG3400-Fa修饰量(占总脂质量的比例)小于1％时，所形成的制剂电位偏高，且在如实施例5所示的靶向实验中不能显示出良好的靶向作用，与对照组DSPE-PEG2K修饰制剂的靶向结合能力并无明显差距。当DSPE-PEG3400-Fa修饰量(占总脂质量的比例)大于10％时，脂质可修饰位点已饱和，插入量并没有明显提高，且在如实施例5所示的靶向实验中的靶向性相较于10％修饰量制剂无明显提高。证明DSPE-PEG3400-Fa修饰量(占总脂质量的比例)为1％～10％区间范围的设置合理性。
实施例12超声方式对脂质体制剂制备效果的作用研究
本发明还参照实施例1，调整超声功率及时间，与非超声方式做对比，探究了超声制备方式对脂质体制剂制备效果的作用。
类型1与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(3)中，按总脂质体组分与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒质量比2:1的比例将之前获得的纳米颗粒加入覆盖均匀脂质薄膜的圆底烧瓶中，超声功率400W，设置不同的超声水合时间0min、5min、10min、15min、30min、40min、60min，获得巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。不同超声时间下得到的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的水合粒径和电位如下表4：
表4
超声时间(min) 0 5 10 15 30 40 60
Size(nm) 416.8 119.2 112.6 106.4 102.1 84.6 63.6
PDI 0.579 0.251 0.168 0.122 0.163 0.321 0.298
Zeta(mV) -12.3 4.89 5.80 3.80 5.90 12.76 13.87
如上表所示，当超声时间在5～30min的范围内时，可以得到粒径均一、包裹均匀，粒径在100～120nm范围内，电位在0mV～+10mV之间的巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。该粒径和电位范围处于细胞实验以及体内实验的合适区间，在细胞实验中均有如实施例5所示的良好靶向作用和如实施例6～8所示的有效抗炎作用。
当超声时间小于5min，则无法有效通过超声作用驱动阳离子脂质膜包裹在蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒表面，所形成的制剂粒径偏大，且所带负电较高，蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒不能完全被包裹在脂质双分子层中，在完全培养基中的稳定性差，且实施例3溶血实验中溶血现象严重。当超声时间大于30min，蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒则在长时间的超声作用下被破坏，所形成的制剂粒径过小，正电性过强，粒径小于50nm的空白脂质体数量大幅增加，稳定性差。本组数据证明，超声时间5～30min的区间范围的设置合理性。
类型2与实施例1中的蜂毒素脂质体纳米制剂制备方法的不同之处在于，步骤(3)中，按总脂质体组分与蜂毒素-聚谷氨酸纳米颗粒质量比2:1的比例将之前获得的纳米颗粒加入覆盖均匀脂质薄膜的圆底烧瓶中，超声时间为30min，设置不同的超声功率100W、200W、400W、800W，获得巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂，其余皆相同。不同超声功率下得到的巨噬细胞靶向蜂毒素-聚谷氨酸脂质体纳米制剂的水合粒径和电位如下表5：
表5
超声功率(W) 100 200 400 800
Size(nm) 376.2 113.7 106.4 73.9
PDI 0.428 0.176 0.122 0.214
Zeta(mV) -15.78 5.24 3.80 3.98
如上表所示，当超声功率在200～400W的范围内时，可以得到粒径均一、包裹均匀，粒径在100～120nm范围内，电位在0mV～+10mV之间的巨噬细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。该粒径和电位范围处于细胞实验以及体内实验的合适区间，在细胞实验中均有如实施例5所示的良好靶向作用和如实施例6～8所示的有效抗炎作用。
当超声功率小于200W，则无法有效通过超声作用驱动阳离子脂质膜包裹在蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒表面，所形成的制剂粒径偏大，且所带负电较高，蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒不能完全被包裹在脂质双分子层中，在完全培养基中的稳定性差，且实施例3溶血实验中溶血现象严重。当超声功率大于400W，蜂毒素聚谷氨酸纳米颗粒则在大功率的超声作用下被破坏，所形成的制剂粒径过小，粒径小于50nm的空白脂质体数量大幅增加，稳定性差。本组数据证明，超声功率200～400W的区间范围的设置合理性。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂，其特征在于，所述纳米制剂含有蜂毒素脂质体，所述蜂毒素脂质体至少包括：蜂毒素、阴离子聚合物、阳离子脂质膜和脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子；
所述蜂毒素和阴离子聚合物结合形成蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒，所述阳离子脂质膜可形成脂质双分子膜，所述蜂毒素脂质体包括外层结构和内核结构，所述外层结构包括脂质双分子膜及双分子膜上修饰的脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子，所述内核结构包括蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒；
所述的炎性细胞靶向分子选自叶酸和甘露糖中的一种或多种；
所述纳米制剂包括以下特征：所述阴离子聚合物为聚谷氨酸；
所述炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将蜂毒素和阴离子聚合物混合孵育，得到蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒；
(2)将阳离子脂质、辅助脂质和脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子混合溶解于有机溶剂，利用旋转蒸发法制备脂质薄膜；
(3)将所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒直接水合脂质薄膜，得到蜂毒素脂质体纳米制剂；
所述制备方法中阴离子聚合物与蜂毒素的质量比为0.3:1～2:1；
所述制备方法中蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒与阳离子脂质膜的质量比为1:1～10:1；
所述制备方法中阳离子脂质膜与脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子的物质的量比为100:1～10:1；
所述制备方法步骤(3)中直接水合为将蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒溶液加入所述脂质薄膜中，密封超声；
所述超声的功率范围为200～400W，时间为5～30min。
2.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：
所述蜂毒素为蜂毒中提取或化学合成的蜂毒素。
3.根据权利要求1所述的纳米制剂，其特征在于：所述阳离子脂质膜至少包含一种阳离子脂质。
4.根据权利要求3所述的纳米制剂，其特征在于：所述阳离子脂质选自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、脂质多聚-L-赖氨酸、或硬脂胺中的任一种或几种。
5.一种如权利要求1所述的炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将蜂毒素和阴离子聚合物混合孵育，得到蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒；
(2)将阳离子脂质、辅助脂质和脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子混合溶解于有机溶剂，利用旋转蒸发法制备脂质薄膜；
(3)将所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒直接水合脂质薄膜，得到蜂毒素脂质体纳米制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒由以下方法制备：
(1)分别将蜂毒素和阴离子聚合物溶于溶剂，配制成蜂毒素溶液和阴离子聚合物溶液；
(2)将步骤(1)得到蜂毒素溶液和阴离子聚合物溶液混匀孵育，获得蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂由以下方法制备：
(1)将蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒配制成溶液；
(2)阳离子脂质、辅助脂质和脂质-聚乙二醇-炎性细胞靶向分子混合溶解于有机溶剂，蒸发有机溶剂，制备脂质薄膜；
(3)将蜂毒素-阴离子聚合物纳米颗粒溶液加入所述脂质薄膜中，密封超声，获得炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：超声的功率范围为200～400W，超声的时间为5～30min。
9.如权利要求5-8任一项所述的方法制备的炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂。
10.如权利要求1或权利要求9所述的炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂在制备抗炎药物中的应用。
CN202011617773.6A 2020-12-31 2020-12-31 炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用 Active CN112791192B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011617773.6A CN112791192B (zh) 2020-12-31 2020-12-31 炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011617773.6A CN112791192B (zh) 2020-12-31 2020-12-31 炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112791192A CN112791192A (zh) 2021-05-14
CN112791192B true CN112791192B (zh) 2023-04-07

Family

ID=75805950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011617773.6A Active CN112791192B (zh) 2020-12-31 2020-12-31 炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112791192B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114288400A (zh) * 2022-01-26 2022-04-08 宁夏医科大学 一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗、制备方法及其应用
CN117045619B (zh) * 2023-07-14 2024-03-29 上海中医药大学 一种共载蜂毒溶瘤肽和腺苷a2ar受体抑制剂的脂质体-聚合物纳米粒及制备和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597338A (zh) * 2009-06-23 2009-12-09 山东大学 一种含有甘露聚糖的配体及其制备方法和应用
CN102670484A (zh) * 2012-05-30 2012-09-19 浙江大学 甘露糖修饰的固体脂质纳米粒复合凝胶及其制备方法
CN109260157A (zh) * 2018-11-19 2019-01-25 上海交通大学 一种正电荷多肽脂质体纳米制剂及其制备方法与应用
CN109288794A (zh) * 2018-11-19 2019-02-01 上海交通大学 一种蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法与应用
CN110678204A (zh) * 2016-03-29 2020-01-10 恩多塞特公司 用于靶向肿瘤相关巨噬细胞的叶酸缀合物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597338A (zh) * 2009-06-23 2009-12-09 山东大学 一种含有甘露聚糖的配体及其制备方法和应用
CN102670484A (zh) * 2012-05-30 2012-09-19 浙江大学 甘露糖修饰的固体脂质纳米粒复合凝胶及其制备方法
CN110678204A (zh) * 2016-03-29 2020-01-10 恩多塞特公司 用于靶向肿瘤相关巨噬细胞的叶酸缀合物
CN109260157A (zh) * 2018-11-19 2019-01-25 上海交通大学 一种正电荷多肽脂质体纳米制剂及其制备方法与应用
CN109288794A (zh) * 2018-11-19 2019-02-01 上海交通大学 一种蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112791192A (zh) 2021-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110522918B (zh) 靶向元件及其制备方法和运用
Xiang et al. Synthesis and evaluation of a novel ligand for folate-mediated targeting liposomes
Moghassemi et al. Nano-niosomes as nanoscale drug delivery systems: an illustrated review
US8277847B2 (en) Lipidated glycosaminoglycan particles and their use in drug and gene delivery for diagnosis and therapy
CN109288794B (zh) 一种蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法与应用
US20120039983A1 (en) Amphiphilic macromolecule-lipid complexes
CN112791192B (zh) 炎性细胞靶向蜂毒素脂质体纳米制剂及其制备方法和应用
Sheoran et al. Recent patents, formulation techniques, classification and characterization of liposomes
Purohit et al. Interaction of cationic partial dendrimers with charged and neutral liposomes
Jiang et al. Anti-cancer efficacy of paclitaxel loaded in pH triggered liposomes
CN108635593B (zh) 一种e-选择素肽配体修饰的靶向热敏脂质体的制备和应用
Kapare et al. Micellar drug delivery system: a review
R Naik et al. Liposomes as potential carrier system for targeted delivery of polyene antibiotics
AU2015206628A1 (en) Liposome compositions encapsulating modified cyclodextrin complexes and uses thereof
Wang et al. Construction of a novel cationic polymeric liposomes formed from PEGylated octadecyl‐quaternized lysine modified chitosan/cholesterol for enhancing storage stability and cellular uptake efficiency
US11260031B2 (en) Protein particle with a poorly water-soluble drug encapsulated therein and preparation method thereof
Fu et al. Liposomal formulation: Opportunities, challenges, and industrial applicability
US20110027347A1 (en) Polymersomes and methods of making and using thereof
Sirisha et al. Liposomes-the potential drug carriers
Patel et al. Cubosomes: novel nanocarriers for drug delivery
CN114712520B (zh) 纳晶药物稳定系统、制备方法、药物组合物和应用
CN114848831A (zh) 包裹型纳米制剂及其载体的制备方法和应用
Liu et al. Micelle morphology phase diagram in a phospholipid, PEGylated lipid, and peptide amphiphiles ternary system
Charumathy et al. Recent update on liposome-based drug delivery system
Asai Nucleic acid delivery system with DOP-DEDA, a charge-reversible lipid derivative

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant