CN114288400A - 一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗、制备方法及其应用。该mRNA肿瘤疫苗是由负载α‑半乳糖神经酰胺(α‑Galcer)的阳离子复合物、鱼精蛋白和mRNA构建而成，其中α‑Galcer吸附于复合物磷脂层，鱼精蛋白‑HER2 mRNA缩合物包裹于复合物内核。本发明构建的mRNA肿瘤疫苗，可通过皮下注射或肌内注射或鼻粘膜途径进行免疫治疗，刺激DCs细胞成熟，分泌细胞因子。经小鼠免疫后，该新型mRNA肿瘤疫苗可有效促进T细胞增殖活化，发挥先天性和适应性免疫应答，并改善肿瘤免疫微环境的抑制作用，有效增强抗肿瘤免疫应答。

Description

一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗、制备方法 及其应用

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域及核酸疫苗领域，特别是涉及一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康，肿瘤免疫治疗通过激活机体自身免疫系统杀灭肿瘤细胞，对正常细胞危害较轻或无损害，在肿瘤治疗中有着巨大潜力。肿瘤疫苗作为肿瘤免疫治疗的一种重要策略，递送肿瘤相关抗原进入抗原提呈细胞 (APCs) ，进而激活细胞免疫反应，抑制肿瘤生长。mRNA疫苗是将编码目的蛋白基因的mRNA小基因片段传递至细胞，在胞质内翻译成蛋白质，随后激活APCs诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化和增殖，以清除或抑制癌细胞。相比多肽及DNA疫苗，mRNA疫苗在肿瘤治疗的有效性、安全性及生产成本上显示了其独特优势；mRNA进入细胞质开始翻译，不需进入细胞核发挥作用；mRNA治疗与质粒DNA和病毒载体不同，不会插入宿主细胞染色体中，无基因插入突变风险，安全性高；转染效率与靶细胞的细胞周期无关；mRNA 合成和纯化快速、成本低。然而mRNA疫苗策略也面临诸多挑战：编码抗原的mRNA容易被核酸酶降解，且负电性mRNA较难被APCs摄取；mRNA分子暴露于非APCs存在引发体内不良反应的风险。因此，需要寻求一种佐剂促使mRNA在APCs内翻译成抗原，诱导产生更强烈的Ｔ细胞反应。

脂质体具有生物相容性、生物可降解性和低/无毒性，在药物/疫苗的递送方面显示出良好的潜力，其能够结合亲水或疏水成分，并且可以进行双重抗原传递。其中阳离子脂质体与阴离子细胞膜具有良好的静电相互作用，阳离子脂质体被APCs更有效地吸收，能诱导更强的免疫应答，并且具有增强的储存效应，从而延长抗原释放到循环系统中的时间。

树突状细胞DC是专职的抗原提呈细胞，在协调免疫反应对抗病原体感染或肿瘤发展起着关键作用。在肿瘤免疫治疗中，mRNA疫苗递送系统被DC摄取后释放到胞质中翻译成蛋白质，进而被加工成抗原肽提呈到DC表面，启动MHCI类分子途径，激活CD8+T淋巴细胞分化为CTL杀伤肿瘤细胞，也通过MHCⅡ类分子途径，激活CD4+T淋巴细胞分化成Th1型淋巴细胞，分泌大量IL-12等细胞因子调控免疫应答。然而，肿瘤微环境（TME）中的各种免疫抑制因子通过抑制DC成熟和抗原呈递以及增强检查点蛋白表达来削弱DC的功能。免疫功能障碍的DC会导致肿瘤快速发展，这表明维持DC的免疫功能是成功抗肿瘤免疫的关键。

α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)是一种从海洋海绵体中提取的脂类抗原，DCs可通过表面的CD1d 分子提呈外源性α-Galcer供iNKT识别并使其活化，进而发挥iNKT调节作用诱导DC成熟，并调控DC免疫功能，两者通过相互协同，进而激活NK细胞、CD8⁺T细胞和 CD4⁺T细胞等，发挥先天性免疫和适应性免疫反应。除此之外，程序性死亡1(PD-1)是活化T细胞上PD-1受体与其配体PD-L1和肿瘤细胞结合诱导免疫抑制的主要共抑制检查点之一，可显著抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性。已有研究表明，PD-1抑制剂与癌症疫苗联合使用对黑色素瘤等免疫原性较低的肿瘤有治疗效果。

综上所述，构建一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的就在于构建一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，该疫苗可改善乃至扭转肿瘤免疫微环境中DCs免疫抑制状态，增强肿瘤免疫治疗效果，克服传统疫苗存在的免疫原性弱、生产工艺复杂等缺陷，使其通过免疫后能有效诱免疫应答反应。该疫苗利用肿瘤抗原物质联合α-Galcer诱导机体特异性免疫反应，杀伤肿瘤细胞，改善肿瘤免疫微环境，达到治疗肿瘤的目的。

本发明的另一目的是提供上述mRNA肿瘤疫苗的制备方法。

本发明的另一目的是提供上述mRNA肿瘤疫苗的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案为：

一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，其特征在于该mRNA肿瘤疫苗是由负载α-Galcer的阳离子复合物、鱼精蛋白和mRNA构建而成，各物质用量按照质量比5:1:1～15:1:1配置。

所述mRNA肿瘤疫苗粒径为80～600nm，Zeta电位为10～35mV，包封率为50～90%，mRNA载药量为5～15%。

所述鱼精蛋白将mRNA缩合成纳米大小复合物后包裹于阳离子复合物中，α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)吸附在阳离子复合物外层。

所述阳离子复合物是由阳离子磷脂、胆固醇（Chol）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-甘露糖（DSPE-PEG2000-mannose）组成，其同α-半乳糖神经酰胺按照摩尔比为2:2:0.1:0.05:0.3～2:3:0.5:0.2:0.8配置。

所述阳离子磷脂为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP）、溴化二甲基双十八烷基铵（DDAB）、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇（DC-Chol）中的一种或几种，优选溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP）。

所述mRNA为体外转录mRNA编码肿瘤抗原，该肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，具体为糖类抗原242（CA242）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）、人类表皮生长因子受体2（HER2）或黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)；优选人类表皮生长因子受体2（HER2），其理论长度为3768nt，在乳腺癌组织中高表达。

所述α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)为分子量858.32的糖脂，能被iNKT 细胞特异性识别使之激活，介导DCs与iNKT细胞相互作用，诱导DCs成熟，且能调控DCs的免疫功能。

上述改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗的制备方法，主要是采用注入法、高压均质法、薄膜分散法、冷冻干燥法中的一种或几种，优选薄膜分散法。

本发明以粒径、Zeta电位、包封率、载药量、形态等特性为考察指标，对薄膜分散法制备脂质体的主要影响因素：旋蒸温度、转速、时间、水化介质的种类及pH、mRNA与脂质体复合物的比例、水化温度、水化方式、超声破碎时间等进行筛选，并对其进行优化，最终得到改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗，其具体步骤包括：

1）将α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)和阳离子脂质体溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发，使用氮气除去有机溶剂后再加入水化介质，在48～65℃水浴环境下水化孵育15min～45min，得到空白脂质体；

2）使用鱼精蛋白对mRNA进行缩合；

3）将上述过程2）所得鱼精蛋白- mRNA缩合物加入到空白脂质体中，孵育静置15～45min，即得可改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗。

所述有机溶剂为四氢呋喃、氯仿、丙酮、甲醇、二氯甲烷中的一种或几种。

所述水化介质为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或磷酸缓冲盐溶液，其浓度为10～35mmol/L，pH为6～8。

上述改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗的应用，具体是将所述mRNA肿瘤疫苗通过皮下注射或肌内注射或鼻粘膜途径进行免疫治疗，并同时腹腔注射anti-PD-1抗体；间隔一周再次给药，共给药4次。

本发明使用鱼精蛋白将mRNA缩合成纳米大小复合物，目的是防止核酸酶对mRNA的降解作用，而后通过静电吸附作用，将鱼精蛋白-mRNA缩合物包裹于阳离子复合物内核；糖脂α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)吸附于所构建的阳离子复合物磷脂层，同时发挥载体及iNKT激动剂的作用。其中，负载α-Galcer的阳离子复合物、鱼精蛋白、mRNA最佳质量比优选为10:1:1。

所述mRNA肿瘤疫苗递送的mRNA在抗原提呈细胞胞质中翻译为蛋白质，进而被加工成抗原肽提呈到DCs表面，可上调DCs表面CD86、MHC-II等分子表达，激活DCs成熟并促进IL-12与TNF-α分泌，诱导CTL活化增殖，抑制肿瘤生长。

所述mRNA肿瘤疫苗可用于激活iNKT细胞，表现出NK样MHC非依赖性细胞毒活性，增强肿瘤治疗效果；所述mRNA肿瘤疫苗可促进CD4+T、NK细胞等免疫效应细胞增殖，抑制Treg、MDSC等免疫抑制性细胞增殖，具有调控肿瘤免疫微环境的作用。

所述肿瘤疫苗通过皮下注射或肌内或鼻粘膜途径进行免疫治疗，并同时腹腔注射anti-PD-1。间隔一周再次给药，共给药4次；其中皮下注射肿瘤疫苗联合腹腔注射anti-PD-1具有良好的肿瘤治疗效果，尤其是抑制SKBR3乳腺癌肿瘤生长。其中皮下注射肿瘤疫苗联合腹腔注射anti-PD-1具有良好的肿瘤治疗效果，尤其是抑制SKBR3乳腺癌肿瘤生长。

所述mRNA浓度范围为30ng/µl~1000ng/µl。

所述水化介质为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液或磷酸缓冲盐溶液，其浓度为10～35mmol/L，pH为6～8。

所述有机溶剂为四氢呋喃、氯仿、丙酮、甲醇、二氯甲烷中的一种或几种。

本发明mRNA肿瘤疫苗递送的mRNA在抗原提呈细胞胞质中翻译为蛋白质，进而被加工成抗原肽提呈到DCs表面，可上调DCs表面CD86、MHC-II等分子表达，激活DCs成熟并促进IL-12与TNF-α分泌，诱导CTL活化增殖，抑制肿瘤生长。

本发明mRNA肿瘤疫苗可用于激活iNKT细胞，表现出NK样MHC非依赖性细胞毒活性，增强肿瘤治疗效果；所述mRNA肿瘤疫苗可促进CD4+T、NK细胞等免疫效应细胞增殖，抑制Treg、MDSC等免疫抑制性细胞增殖，具有调控肿瘤免疫微环境的作用。

本发明具有以下技术优势：

1）本发明的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗相较于传统的弱毒疫苗、灭活疫苗、类毒素等，具有更广泛的应用前景。与此同时，相比于多肽及DNA疫苗等新型疫苗，mRNA 疫苗在肿瘤治疗的有效性、安全性及生产成本上显示了其独特优势。mRNA疫苗已经在肿瘤领域展现出了巨大潜力，但mRNA易被核酸酶降解、负电性mRNA较难被APCs摄取、mRNA分子暴露于非APCs存在引发体内不良反应的风险等问题，需要合适的递送系统及免疫佐剂辅助解决。乳腺癌发病率在女性恶性肿瘤当中居首位，且晚期可发生远处转移，出现多器官病变，威胁患者的生命。常用的临床治疗手段包括手术治疗、放射治疗、内分泌治疗等效果均不理想，尤其是化疗药物具有较高的耐受性，限制了治疗效果。因此，应用mRNA肿瘤疫苗治疗乳腺癌被认为是极具前景的治疗策略。

2）在肿瘤发展及治疗进程中，肿瘤细胞能够分泌各种免疫抑制因子，形成肿瘤免疫微环境，使得免疫细胞功能异常，尤其是最为重要的抗原提呈细胞——DCs数量减少，功能异常，即DCs失能。已有研究证实，DCs失能致使激活下游免疫应答能力减弱，严重削弱了mRNA疫苗抗肿瘤效果，导致肿瘤免疫逃逸，发生肿瘤的复发及转移。因此，本发明的疫苗可有效改善肿瘤免疫微环境 DCs 失能，进一步激活CTL活化与增殖，增强肿瘤免疫治疗效果，具有极强的应用价值。

3）本发明将iNKT细胞激动剂α-半乳糖神经酰胺插入阳离子复合物磷脂层中，使其具有载体兼佐剂功能，并以此包裹鱼精蛋白——mRNA缩合物，制得一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗。通过琼脂糖凝胶电泳筛选出阳离子复合物、鱼精蛋白与mRNA的最佳比例为10:1:1（见图1），其包封率为86.1%，载药量为7.2%。此外，使用绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因，利用激光共聚焦显微镜成像、流式细胞术结合蛋白质免疫印迹实验测定阳性细胞率、平均荧光强度及蛋白条带，考察小鼠骨髓来源树突状细胞对不同纳米疫苗体外的摄取情况，表明阳离子脂质体-鱼精蛋白复合物可以成功将mRNA递送到BMDCs中，翻译成具有功能性的蛋白质，进而被DCs加工提呈给Ｔ细胞，激活适应性免疫（见图2）。

4）本发明制得的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗体外树突状细胞刺激成熟实验结果显示：此疫苗能显著上调树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-II、CCR7的表达水平，表明能够有效促进小鼠骨髓未成熟树突状细胞的分化成熟，并且检测到体外细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌，从而表明本发明阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗是一种良好的肿瘤治疗药物（见图3、图4）。

5）通过皮下注射阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗及腹腔注射anti-PD-1对乳腺癌小鼠进行治疗，监测小鼠肿瘤体积及体重变化，可明显发现阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗具有显著的抑制肿瘤生长作用，且联合PD-1抑制剂组抑制肿瘤生长作用最强（见图5）。与此同时，通过对脾脏与肿瘤中的促进免疫效应细胞（CD4⁺T、CD8⁺T、NK）以及抑制性细胞（Treg、MDSC）比例的分析，结果表明，加入本发明阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗组明显增强了促进免疫效应细胞增殖，抑制了抑制性细胞增殖，且联合PD-1抑制剂组效果最优（见图6）。因此本发明所构建的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗可改善肿瘤免疫微环境中的T细胞失能，增强肿瘤免疫功能，克服肿瘤免疫逃逸，从而增强抗肿瘤效果。

综上所述，本发明制备的一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗，可作为肿瘤免疫治疗的新途径，能够刺激体外DCs细胞成熟，分泌细胞因子，经小鼠免疫后，该新型mRNA肿瘤疫苗可有效促进T细胞增殖活化，发挥先天性和适应性免疫应答，并改善肿瘤免疫微环境的抑制作用，有效增强抗肿瘤免疫应答。

附图说明

图1为本发明改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗的结构及特性图。其中，a为结构示意图，b、c为疫苗的粒径与电位图，d为疫苗的透射电镜形态图，e为琼脂糖凝胶电泳实验筛选不同比例复合物包封mRNA质量比图。

图2为本发明阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗的细胞摄取及表达翻译图。其中，a为的细胞摄取的激光共聚焦图，b为HER2 mRNA在树突状细胞中的流式表达图，c为HER2 mRNA在胞内的蛋白表达图。

图3为本发明阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗对树突状细胞刺激成熟的流式细胞仪测定结果图。其中，a为CD80分子，b为CD86分子，c为MHCII分子，d为CCR7分子（与其他制剂组进行了对比）。

图4为本发明阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗刺激树突细胞分泌细胞因子ELISA测定结果图。其中细胞因子分别为IFN-γ、TNF-α（与其他制剂组进行了对比）。

图5为本发明阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗在HER2阳性乳腺癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤效力。其中，a为阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗的治疗性免疫方案，b为小鼠体重变化，c为治疗期间HER2阳性乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤体积变化，d为阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗对小鼠肿癌生长体积变化图像（均与其他制剂组进行了对比）。

图6为本发明阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗对肿瘤免疫微环境中免疫效应细胞与免疫抑制细胞的调节。其中，a为疫苗对免疫效应细胞的影响，分别为CD4+T，CD8+T 以及NK细胞；b为疫苗对免疫抑制细胞的影响，分别为Treg、MDSC细胞（均与其他制剂组进行了对比）。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

实施例1：薄膜分散法制备一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗。

将DDAB、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG-mannose、α-Galcer按摩尔比2:2:0.1:0.05:0.3溶于3ml氯仿中，加入100ml的圆底烧瓶，置于涡旋混合器上涡旋混匀1min后，37℃水浴旋转蒸发15min，减压干燥得到阳离子脂质体薄膜。将氮气通入形成阳离子脂质体薄膜的圆底烧瓶，挥干有机溶剂。加入pH 7.4 Tris缓冲液，于50℃水浴锅中水化20min，得到80～600nm的空白阳离子脂质体溶液（Lip）。以鱼精蛋白：mRNA质量比1:1室温孵育10min，获得鱼精蛋白-HER2 mRNA缩合物。随后将其加入到将Lip中，孵育20min，即得可改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗。

通过粒径、Zeta电位、包封率、载药量、形态等特性对阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗进行表征筛选，并采用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验考察质粒mRNA与载体之间的复合情况。

实施例2：薄膜分散法制备一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗。

将DC-Chol、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG-mannose、α-Galcer按摩尔比2:3:0.3:0.1:0.5溶于3ml氯仿中，加入100ml的圆底烧瓶，置于涡旋混合器上涡旋混匀1min后，37℃水浴旋转蒸发15min，减压干燥得到阳离子脂质体薄膜。将氮气通入形成阳离子脂质体薄膜的圆底烧瓶，挥干有机溶剂。加入pH 7.4 HEPES缓冲液，于45℃水浴锅中水化20min，得到80～600nm的空白阳离子脂质体溶液（Lip）。以鱼精蛋白：mRNA质量比1:1室温孵育10min，获得鱼精蛋白-HER2 mRNA缩合物。随后将其加入到将Lip中，孵育15min，即得可改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗。

通过粒径、Zeta电位、包封率、载药量、形态等特性对阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗进行表征筛选，并采用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验考察质粒mRNA与载体之间的复合情况。

实施例3：薄膜分散法制备一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗。

将DOTAP、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG-mannose、α-Galcer按摩尔比2:2:0.3:0.05:0.5溶于3ml氯仿中，加入100ml的圆底烧瓶，置于涡旋混合器上涡旋混匀1min后，37℃水浴旋转蒸发20min，减压干燥得到阳离子脂质体薄膜。将氮气通入形成阳离子脂质体薄膜的圆底烧瓶，挥干有机溶剂。加入pH 7.4 Tris缓冲液，于50℃水浴锅中水化20min，得到80～600nm的空白阳离子脂质体溶液（Lip）。以鱼精蛋白：mRNA质量比1:1室温孵育10min，获得鱼精蛋白-HER2 mRNA缩合物。随后将其加入到将Lip中，孵育15min，即得可改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗。

通过粒径、Zeta电位、包封率、载药量、形态等特性对阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗进行表征筛选，并采用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验考察质粒mRNA与载体之间的复合情况。

结果如图1所示，结果表明：本发明成功构建一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗，粒径为121.8nm，电位为11.4mv，外观呈圆球形，阳离子复合物-鱼精蛋白-mRNA的最佳质量比为10:1:1。

阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗对原代骨髓树突细胞(BMDC)的刺激成熟能力检测：

从C57BL/6小鼠体内获取骨髓树突细胞，培养6天后轻轻吹打收集细胞，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，加入不同制剂组（空白组、PBS组、Lip组、α-GC-Lip组、LPR组、α-GC-LPR组、LPS组，其中mRNA的质量为5μg，LPS质量5μg），放置在37℃ 5%CO₂的培养箱中孵育48h后，加入PBS并转移至预冷的EP管中，分别加入APC-CD11c、PE-CD86/PE-CD80/PE-MHCII/PE-CCR7流式抗体，于4℃避光染色30min，加入PBS润洗重悬后，采用FCM检测不同制剂组刺激BMDCs表面因子CD11c、CD86双阳性的表达、CD11c、CD80双阳性表达、CD11c、MHCII双阳性表达、CD11c、CCR7双阳性表达。

结果如图3所示，结果表明：本发明改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗能够提高共刺激分子CD80、CD86表达，促进了抗原提呈分子 MHCII以及趋化因子CCR7 的表达，表明其可以有效促进BMDCs成熟。

阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗促进BMDCs细胞因子表达分泌检测：

调整BMDC细胞浓度至1×10⁶/ml，加入不同制剂组（空白组、PBS组、Lip组、α-GC-Lip组、LPR组、α-GC-LPR组、LPS组，其中mRNA的质量为`5μg，LPS质量5μg），放置在37℃ 5%CO₂的培养箱中孵育48h后，巴氏吸管轻吹收集各孔细胞，离心收集细胞上清液，通过ELISA试剂盒说明书操作方法检测细胞上清液中TNF-α、IFN-γ细胞因子的分泌情况。

结果如图4所示，结果表明：本发明改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗能促进DC成熟并促进了细胞因子TNF-α、IFN-γ分泌，促进T细胞的活化。

阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗在荷瘤小鼠体内接种方式及治疗效果检测：

C57BL/6小鼠于接种肿瘤细胞后第7天进行第一次给药，间隔一周再次给药，共给药4次。阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗通过皮下注射途径进行免疫治疗，并同时腹腔注射anti-PD-1。接种体积为100μl（HER2 mRNA 5-15μg/只，PD-1抑制剂 60-120μg/只）。每隔3天测量肿瘤尺寸、测量小鼠体重。末次给药一周后牺牲小鼠，取出肿瘤，称重。

结果如图5所示，结果表明：本发明改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗具有显著的抑制肿瘤生长作用，且联合PD-1抑制剂抑制肿瘤生长作用最强。

阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗诱导肿瘤内免疫效应细胞以及免疫抑制细胞的变化检测:

牺牲小鼠后，剥离肿瘤组织，加入含有胶原酶的培养基中，消化30min。使用无菌注射器活塞头研磨制备细胞悬液，将过滤后的细胞悬液冰浴裂解、洗涤、离心收集沉淀。将细胞浓度调整为1×10⁶cells/ml后分成4份，分别使用T细胞、NK细胞、Treg细胞、MDSC细胞流式抗体进行染色后，使用流式细胞仪检测肿瘤免疫微环境中免疫细胞变化。

结果如图6所示，结果表明：本发明改善肿瘤免疫微环境DCs失能的阳离子复合物mRNA肿瘤疫苗可增强促进免疫效应细胞（T细胞、NK细胞）增殖，抑制了抑制性细胞（Treg细胞、MDSC细胞）增殖。

Claims (12)

1.一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，其特征在于该mRNA肿瘤疫苗是由负载α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)的阳离子复合物、鱼精蛋白和mRNA构建而成，各物质用量按照质量比5:1:1～15:1:1配置；所述肿瘤疫苗可用于改善肿瘤免疫微环境DCs失能，克服肿瘤免疫逃逸，增强抗肿瘤效果。

2.按照权利要求1所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，其特征在于所述mRNA肿瘤疫苗粒径为80～600nm，Zeta电位为10～35mV，包封率为50～90%，mRNA载药量为5～15%。

3.按照权利要求1所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，其特征在于所述鱼精蛋白将mRNA缩合成纳米大小复合物后，通过静电吸附包裹于阳离子复合物内核，α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)吸附在阳离子复合物外层。

4.按照权利要求1所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，其特征在于所述阳离子复合物是由阳离子磷脂、胆固醇（Chol）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-甘露糖（DSPE-PEG2000-mannose）组成，其同α-半乳糖神经酰胺按照摩尔比为2:2:0.1:0.05:0.3～2:3:0.5:0.2:0.8配置。

5.按照权利要求4所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，其特征在于所述阳离子磷脂为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP）、溴化二甲基双十八烷基铵（DDAB）、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇（DC-Chol）中的一种或几种，优选溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵（DOTAP）。

6.按照权利要求1所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，其特征在于所述mRNA为体外转录mRNA编码肿瘤抗原，该肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，具体为糖类抗原242（CA242）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）、人类表皮生长因子受体2（HER2）或黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)；优选人类表皮生长因子受体2（HER2），其理论长度为3768nt，在乳腺癌组织中高表达。

7.按照权利要求1所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗，其特征在于所述α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)为分子量858.32的糖脂，能被iNKT 细胞特异性识别使之激活，介导DCs与iNKT细胞相互作用，诱导DCs成熟，且能调控DCs的免疫功能。

8.一种如权利要求1至7任意一项所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于采用注入法、高压均质法、薄膜分散法、冷冻干燥法中的一种或几种。

9.按照权利要求8所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于所述薄膜分散法包括如下步骤：

1）将α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)和阳离子脂质体溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发，使用氮气除去有机溶剂后再加入水化介质，在48～65℃水浴环境下水化孵育15min～45min，得到空白脂质体；

2）使用鱼精蛋白对mRNA进行缩合；

3）将上述过程2）所得鱼精蛋白- mRNA缩合物加入到空白脂质体中，孵育静置15～45min，即得可改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗。

10.按照权利要求9所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为四氢呋喃、氯仿、丙酮、甲醇、二氯甲烷中的一种或几种。

11.按照权利要求9所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于所述水化介质为三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（HEPES）或磷酸缓冲盐溶液（PBS），其浓度为10～35mmol/L，pH为6～8。

12.一种如权利要求1至7任意一项所述的改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗的应用，其特征在于所述mRNA肿瘤疫苗通过皮下注射或肌内注射或鼻粘膜途径进行免疫治疗，并同时腹腔注射anti-PD-1抗体；间隔一周再次给药，共给药4次。

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