CN116212011A - 一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116212011A
CN116212011A CN202310293533.2A CN202310293533A CN116212011A CN 116212011 A CN116212011 A CN 116212011A CN 202310293533 A CN202310293533 A CN 202310293533A CN 116212011 A CN116212011 A CN 116212011A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
bacteria
antigen
vaccine
personalized
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310293533.2A
Other languages
English (en)
Inventor
甘璐
雍土莹
陈朝霞
杨祥良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong University of Science and Technology
Original Assignee
Huazhong University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong University of Science and Technology filed Critical Huazhong University of Science and Technology
Priority to CN202310293533.2A priority Critical patent/CN116212011A/zh
Publication of CN116212011A publication Critical patent/CN116212011A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/001181—Alpha-feto protein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/5555—Muramyl dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6006—Cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明属于肿瘤疫苗技术领域，更具体地，涉及一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法。包括工程化改造的正电荷细菌及其负载的训练免疫激活剂，以及通过静电吸附粘附在所述工程化改造的正电荷细菌表面的肿瘤抗原。通过工程化改造的正电荷细菌负载训练免疫激活剂以及静电吸附肿瘤个性化抗原，实验证明该肿瘤个性化疫苗可以避免免疫耐受，提高抗原在注射部位的滞留时间，增强接种部位DCs、单核/巨噬细胞的招募，增强免疫细胞对抗原的摄取及抗原递呈，显著增强肿瘤特异性T细胞激活反应，削弱肿瘤免疫抑制微环境，具有明显抑瘤效果，实现针对不同肿瘤患者的术后精准治疗。

Description

一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于肿瘤疫苗技术领域，更具体地，涉及一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法。
背景技术
近年来肿瘤免疫疗法为抗肿瘤治疗带来了巨大的希望。不同类型的肿瘤免疫治疗策略，已被广泛研究或单独或与其他常规方法联合用于肿瘤治疗中，例如手术治疗、化学疗法或放射疗法等。此外，据报道，术后免疫治疗，例如免疫检查点阻断(ICB)疗法，或许能够降低癌症复发和转移的风险。然而，其治疗效果仍有待提高。
肿瘤疫苗接种具有特殊的优势并且在未来癌症治疗中将发挥巨大的潜力。其主要包含有全细胞肿瘤疫苗，DC细胞疫苗，DNA疫苗，病毒载体疫苗，mRNA疫苗，经典的多肽疫苗等多种形式，然而，由于肿瘤抗原的免疫原性较差、难以较长时间持续的诱导免疫反应及安全性差等缺点，阻碍了肿瘤疫苗的发展。目前不同来源的肿瘤疫苗的一些不利因素限制了其进一步发展，比如，单纯的肿瘤全细胞疫苗免疫原性较低，仅能刺激机体产生较低水平的免疫应答，需要与其他合适的佐剂联合使用来增强疫苗的免疫原性；DC细胞疫苗是需要在体外经肿瘤抗原及细胞因子的刺激后，使其成为成熟的DC，再回输到体内，其制备工艺较为复杂，需要激活大量的DC细胞，费时费力；DNA肿瘤疫苗是将编码肿瘤特异性抗原的片段结合在质粒DNA载体上，使其表达出所需抗原，进而诱导机体产生特异性免疫应答，但是由于质粒DNA进入细胞核内并表达肿瘤抗原的较少，并且组织注射点不能很好地诱导APC细胞成熟并刺激激活T细胞，所以DNA肿瘤疫苗也有待进一步优化。肿瘤疫苗的活性成分包括肿瘤抗原、制剂、免疫佐剂和递送载体，目前已经研究检测的抗原、佐剂、递送策略和制剂数量众多，但是在临床上有效响应率还比较低。因此，寻找最有效的抗原佐剂类型、递送方法等问题仍是目前前进的方向。
关于肿瘤疫苗的研发史目前已延续120余年。1893年，癌症免疫治疗之父WilliamB.Coley发现了化脓性链球菌所分泌的毒素可引起患者肿瘤的消退，从此奠定了肿瘤疫苗的研究开端。2006年世界上第一个HPV疫苗由默克公司研制并得到美国FDA批准。2010年治疗前列腺癌的DC细胞疫苗Provenge成为首个被美国FDA批准上市的新型治疗性肿瘤疫苗。近些年有很多的研究致力于各种策略制备肿瘤疫苗，提高肿瘤疫苗的体内外免疫反应水平。David Mooney及其同事开发了一种介孔二氧化硅微棒(MSR)，通过静电相互作用依次吸附了聚乙烯内亚胺(PEI)和新抗原。吸附的PEI与MSR协同作用，可以激活APCs并诱导炎性细胞因子的分泌。在体内抑瘤实验中，疫苗平台在负载肿瘤相关特异性抗原时显示出较强的抗肿瘤能力。马光辉教授报告了一种包裹肿瘤抗原后具有特殊的自愈合功能得新型微球肿瘤疫苗制剂。接种疫苗后，注射点微球中的抗原能得到有效释放，并且募集更多抗原递呈细胞，有效地提高抗原利用率，促进抗原递呈细胞成熟，改善抗原呈递水平，实现了有效的T细胞免疫激活、有效的肿瘤抑制、抗肿瘤转移和预防术后复发等效果。
细菌及其衍生物质可以通过先天免疫反应调动免疫系统对外源“危险信号”作出应答。细菌具有丰富的病原体相关分子模式，即使在肿瘤免疫抑制微环境中也能够有效激活免疫细胞、增强特异性免疫反应识别、消除肿瘤细胞。细菌具有独特的缺氧部位靶向能力，能在肿瘤部位特异性定植，实现较强的免疫激活。例如，细菌的肽聚糖、脂多糖、DNA、鞭毛、RNA等，可以通过抗原递呈细胞上的模式识别受体结合，进而引发相应的免疫反应。有研究报道来自大肠杆菌细胞质膜及自体肿瘤组织切除的肿瘤细胞膜为佐剂和抗原的纳米肿瘤疫苗。此疫苗可诱导树突细胞成熟，从而激活T细胞。在CT26结肠癌模型和4T1乳腺肿瘤小鼠模型中显示出抗肿瘤功效。但是疫苗需要经过复杂的提取细菌细胞膜的程序以及需要通过超声或挤压等方式使细菌细胞膜及肿瘤抗原融合，融合效率以及稳定性有待进一步提高。细菌外膜囊泡(OMV)由于其较丰富的免疫刺激抗原，没有感染性，使其也成为有吸引力的免疫刺激佐剂，目前认为OMV是肿瘤疫苗的理想组分。但是OMV的一些不利的因素也限制其发展，比如：OMV稳定产量的控制难度较大；需要通过基因工程的方式诱导表达肿瘤抗原，步骤较为繁琐；OMV来源为细菌天然分泌，其质量控制难度较大；其制备的工艺在大规模放大制备时难度较大；综合以上肿瘤疫苗的优点及缺点，若能进一步突破肿瘤疫苗的限制，将进一步推动肿瘤疫苗的发展。
如何提高疫苗安全性，选择合适佐剂更加高效率的增强体内免疫应答，改善肿瘤免疫抑制性微环境，是目前改善肿瘤疫苗设计的关键问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法，解决了现有技术肿瘤疫苗免疫原性较低、机体免疫应答反应水平低、诱导免疫耐受、放大制备工艺难度大等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗，包括工程化改造的正电荷细菌及其负载的训练免疫激活剂，还包括通过静电吸附粘附在所述工程化改造的正电荷细菌表面的肿瘤抗原；所述训练免疫激活剂为能够激活训练免疫的物质。
优选地，所述工程化改造的正电荷细菌为对细菌进行灭活及电荷翻转得到的正电荷细菌。
优选地，所述肿瘤抗原为肿瘤模式化抗原或肿瘤个性化抗原；其中：所述肿瘤模式化抗原为鸡卵白蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原或鳞状上皮细胞癌抗原；所述肿瘤个性化抗原为源自于结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌或皮肤癌的肿瘤组织的肿瘤抗原。
优选地，所述训练免疫激活剂为能够激活训练免疫的多糖或多肽，进一步优选为β-葡聚糖、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽中的一种或多种。
优选地，所述工程化改造的正电荷细菌在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为(1.5*108～2*109)CFU/mL，所述肿瘤抗原在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为100～500μg/mL，所述训练免疫激活剂在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为100～500μg/mL。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的肿瘤个性化疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1：对细菌进行电荷翻转，得到所述工程化改造的正电荷细菌；
S2：将肿瘤组织进行消化处理和裂解，收集细胞裂解物，得到所述肿瘤抗原；
S3：将训练免疫激活剂与所述工程化改造的正电荷细菌和所述肿瘤抗原混合孵育，使工程化改造的正电荷细菌负载训练免疫激活剂，且使所述工程化改造的正电荷细菌表面通过静电吸附所述肿瘤抗原，即得到肿瘤个性化疫苗。
优选地，步骤S1将细菌与氨基化合物、羧基活化剂和氨基酸保护剂混合后震荡孵育，实现所述细菌的电荷翻转；其中所述氨基化合物为PEI、壳聚糖或聚赖氨酸，所述羧基活化剂为EDC，所述氨基酸保护剂为NHS。
优选地，步骤S2中，所述消化处理为：向肿瘤组织加入含I型胶原酶的RPMI 1640培养基并孵育。
优选地，步骤S2所述孵育的温度为25～37℃，孵育时间为10～120min；步骤S3所述孵育的温度为25～37℃，孵育时间为10～120min。
按照本发明的另一个方面，提供了一种治疗肿瘤的药物，其包括所述的以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗，其包括工程化改造的正电荷细菌和负载在所述细菌表面的训练免疫激活剂，以及通过静电吸附包裹在所述细菌表面的肿瘤抗原。通过将细菌电荷翻转得到工程化改造的正电荷细菌，与肿瘤抗原和训练免疫激活剂混合孵育，得到肿瘤个性化疫苗。实验表明，肿瘤个性化疫苗，可以避免免疫耐受，提高抗原在注射部位的滞留，促进接种部位DCs招募、抗原摄取与递呈，显著增强肿瘤特异性T细胞激活反应，削弱肿瘤免疫抑制微环境。
(2)本发明将细菌作为疫苗的载体，形成抗原库，提高抗原在注射部位的滞留；并且细菌可作为佐剂为肿瘤抗原提供PAMPs信号，增强免疫细胞对抗原的摄取及抗原递呈。
(3)细菌疫苗主要是利用细菌可以作为佐剂的角度出发，但是细菌疫苗存在一个很大的问题就是细菌疫苗使用过程中会诱导免疫耐受，就是多次疫苗皮下注射给药后，巨噬细胞会不再响应或者响应很低，导致巨噬细胞产生的炎性细胞因子降低，从而引起注射部位招募的DCs量降低，削弱免疫激活效果。另一方面，以葡聚糖为代表的训练免疫激活剂能够促进T细胞增殖，激活免疫吞噬反应的作用，但仅单一的训练免疫激活剂作为肿瘤疫苗佐剂时，容易代谢及降解，仍无法改善肿瘤的免疫抑制微环境，导致诱导抑制性免疫细胞的浸润，使DC变成功能失常的DC，并不断增强肿瘤的免疫抑制微环境。然而，本发明将以葡聚糖为代表的训练免疫激活剂负载在细菌表面后，进一步地通过静电吸附肿瘤抗原，实验发现训练免疫激活剂葡聚糖等可能由于能够促进更多的炎性因子释放而更多的在注射部分驻留，显著增强接种部位DCs、单核/巨噬细胞的招募，增加与巨噬细胞的相互作用，治疗效果显著提升。
(4)临床肿瘤患者肿瘤组织中存在大量基因突变形成的、正常组织缺乏的肿瘤新抗原，导致递送肿瘤相关抗原的传统肿瘤疫苗难以实现针对临床肿瘤患者的高效肿瘤特异性T细胞激活反应。本发明技术方案可以提前制备好工程化修饰的细菌和训练免疫激活剂。在应用时通过利用肿瘤患者手术切下来的肿瘤组织得到肿瘤个性化抗原，然后与事先预备好的工程化修饰细菌和训练免疫激活剂简单混合后即得到针对该肿瘤患者的个性化疫苗而直接给药患者，从而发挥非常好的抑制肿瘤复发转移的功能。既快速即用，又可以实现针对不同肿瘤患者的术后精准治疗，发挥非常好的抑制肿瘤复发转移的功能。
附图说明
图1为本发明以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗的制备方法流程图。
图2为实施例1制备的疫苗BG/OVA@EcN负载抗原附着情况。内容A为疫苗BG/OVA@EcN负载抗原的激光共聚焦，标尺为20μm；内容B为疫苗BG/OVA@EcN负载抗原的Zeta电位；内容C为疫苗BG/OVA@EcN负载抗原的TEM图，标尺为1μm。
图3为实施例1制备的疫苗BG/Ag@EcN负载抗原附着情况。内容(A)为疫苗BG/Ag@EcN负载抗原的激光共聚焦，标尺为20μm；内容(B)为疫苗BG/Ag@EcN负载抗原的Zeta电位。
图4为疫苗BG/OVA-Cy5.5@EcN在皮下注射点抗原驻留的效果。内容(A)为小动物成像观察到的皮下抗原驻留；内容(B)为驻留抗原荧光比值；内容(C)为皮下注射点巨噬细胞对抗原的摄取量比值；内容(D)为皮下注射点树突状细胞对抗原的摄取量比值。
图5为疫苗BG/OVA@EcN在体内皮下接种后，皮下注射点招募的单核/巨噬细胞，树突状细胞的数量变化。其中，图5内容(A)对应皮下注射点招募的单核细胞数量；图5内容(B)对应皮下注射点招募的巨噬细胞数量；图5内容(C)对应皮下注射点招募的树突状细胞数量。
图6为疫苗BG/OVA@EcN在体内接种后血液内单核巨噬细胞数量的增高以及训练型单核巨噬细胞比例的增高。内容(A)为血液中单核细胞数量的变化；内容(B)为血液中巨噬细胞数量的变化；内容(C)为血液中训练型单核细胞比例的变化；内容(D)为血液中训练型巨噬细胞比例的变化。
图7为疫苗BG/OVA@EcN在体内接种后淋巴结内激活的树突状细胞数量的变化以及淋巴结内激活的CD8+T细胞数量的变化。内容(A)为淋巴结内激活的树突状细胞数量的变化；内容(B)为淋巴结内激活的CD8+T细胞数量的变化。
图8为疫苗BG/OVA@EcN在预防皮下B16-OVA黑色素肿瘤模型中的预防肿瘤生长的效果以及延长小鼠生存期效果。内容(A)为肿瘤治疗效果；内容(B)为延长肿瘤小鼠生存期效果。
图9为疫苗BG/OVA@EcN在治疗皮下B16-OVA黑色素肿瘤模型中的治疗效果以及延长生存期效果。内容(A)为肿瘤治疗效果；内容(B)为延长肿瘤小鼠生存期效果。内容(C-F)分别为肿瘤组织中的CD3+T细胞数量、CD8+T细胞数量、活化的IFNγ+CD8+T细胞数量、活化的CD69+CD8+T细胞数量。
图10为疫苗BG/Ag-4T1@EcN在原位乳腺4T1肿瘤术后切除模型中的抑制复发的效果以及延长生存期的效果。内容(A)为抑制肿瘤术后复发的效果；内容(B)为延长肿瘤小鼠生存期效果。
图11内容(A)和内容(B)为实施例5存活的小鼠中血液中单核/巨噬细胞的数量、内容(C)和内容(D)为血液中训练型单核/巨噬细胞的比例。
图12内容(A)和内容(B)为实施例5存活的小鼠中血液中记忆T细胞的比例、内容(C)和内容(D)为血液中T细胞体外经抗原再刺激后活化比例。
图13为疫苗MDP/Ag-H22@MG1655在皮下肝癌H22肿瘤术后切除模型中的抑制复发的效果以及延长生存期的效果。内容(A)为抑制肿瘤术后复发的效果；内容(B)为延长肿瘤小鼠生存期效果。
图14内容(A)和内容(B)为实施例6存活的小鼠中血液中单核/巨噬细胞的数量、内容(C)和内容(D)为血液中训练型单核/巨噬细胞的比例。
图15内容(A)和内容(B)为实施例6存活的小鼠中血液中记忆T细胞的比例。
图16为疫苗MDP/Ag-MC38@MG1655在皮下结肠癌MC38肿瘤术后切除模型中的抑制复发的效果以及延长生存期的效果。内容(A)为抑制肿瘤术后复发的效果；内容(B)为延长肿瘤小鼠生存期效果。
图17内容(A)和内容(B)为实施例7存活的小鼠中血液中单核/巨噬细胞的数量、内容(C)和内容(D)为血液中训练型单核/巨噬细胞的比例。
图18内容(A)和内容(B)为实施例7存活的小鼠中血液中记忆T细胞的比例。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗，该肿瘤个性化疫苗以细菌为载体，包括工程化改造的正电荷细菌及其负载的训练免疫激活剂，还包括通过静电吸附粘附在所述工程化改造的正电荷细菌表面的肿瘤抗原；所述训练免疫激活剂为能够激活训练免疫的物质。
本发明所述工程化改造的正电荷细菌为对细菌进行灭活及电荷翻转得到的正电荷细菌，本发明以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗中采用的细菌理论上可以为任意的对宿主有益的细菌载体。一些实施例中，所述细菌为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌，其中革兰氏阴性菌包括但不限于为大肠杆菌菌株Nissle1917(ECN)、大肠杆菌菌株MG1655、减毒沙门氏菌VNP20009等中的至少一种；革兰氏阳性菌包括但不限于为乳酸杆菌、双歧杆菌、益生芽孢菌等中的至少一种。
本发明所述肿瘤抗原可以为任意的能够起到肿瘤预防或治疗作用的肿瘤模式化抗原或肿瘤组织中分离出的肿瘤个性化抗原，一些实施例中，所述肿瘤抗原为肿瘤模式化抗原或肿瘤个性化抗原，所述肿瘤模式化抗原为鸡卵白蛋白(OVA)或甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原、鳞状上皮细胞癌抗原等等；所述肿瘤个性化抗原为源自于结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌或皮肤癌中的肿瘤细胞组织的肿瘤抗原。
一些实施例中，所述训练免疫激活剂为能够激活训练免疫的多糖或多肽，较佳实施例中，其为β-葡聚糖、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽等中的一种或多种。
一些实施例中，所述工程化改造的正电荷细菌在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为(1.5*108～2*109)CFU/mL，所述肿瘤抗原在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为100～500μg/mL，所述训练免疫激活剂在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为100～500μg/mL。
本发明还提供了一种所述的以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
S1：培养细菌，对细菌进行电荷翻转，得到所述工程化改造的正电荷细菌；
S2：将肿瘤组织进行消化处理和裂解，收集细胞裂解物，得到所述肿瘤抗原；
S3：将训练免疫激活剂与所述工程化改造的正电荷细菌和所述肿瘤抗原混合孵育，使工程化改造的正电荷细菌负载训练免疫激活剂，且工程化改造的正电荷细菌表面通过静电吸附所述肿瘤抗原，即得到肿瘤个性化疫苗。
一些实施例中，步骤S1中对细菌进行电荷翻转具体为，将所述细菌与氨基化合物、羧基活化剂和氨基酸保护剂震荡孵育，离心重悬得所述工程化改造的正电荷细菌，其中氨基化合物为PEI、壳聚糖、聚赖氨酸等，所述羧基活化剂为EDC，所述氨基酸保护剂为NHS。EDC作为羧基活化剂，但是其形成的酯容易水解，加入NHS后，利用其羟基与活性酯形成相对更稳定的活性酯，这样与氨基就很容易发生取代反应形成酰胺键了，此外NHS还可以提高偶联效率。
一些实施例中，步骤S1中对细菌进行电荷翻转，其中氨基化合物较佳为PEI(聚乙烯亚胺)，其终浓度较佳为2～4mg/mL，羧基活化剂较佳为EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)，其中终浓度较佳为20～30mg/mL，氨基酸保护剂优选为NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，其终浓度较佳为15～25mg/mL。
一些实施例中，步骤S2将肿瘤个性化细胞原位接种在Balb/c小鼠乳房垫中，待肿瘤体积达到250～300mm3左右，手术切除肿瘤将其用于后续的个性化肿瘤抗原的制备。
一些实施例中，步骤S2中，所述消化处理是将肿瘤组织剪碎后加入含I型胶原酶的RPMI 1640培养基并孵育，其中RPMI 1640培养基体积为2～4mL，I型胶原酶的浓度为0.7～0.9mg/mL。
一些实施例中，步骤S2和步骤S3中孵育温度为25～37℃，孵育时间为10～120min。
一些具体实施例中，步骤S2将肿瘤组织在I型胶原酶消化下，经机械剪碎得到小颗粒肿瘤组织，37℃消化30min。经过物理研磨，纱网过滤，红细胞裂解液裂解得到单个细胞悬液。将上述细胞悬液在液氮及37℃水浴中反复冻融，再经超声波细胞破碎仪得到破碎的细胞裂解物，即为所述的肿瘤抗原。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，其包括本发明所述的以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗。所述疫苗的给药方式可以为皮下注射等，其剂型包括但不限于为混悬液。
细菌具有丰富的病原体相关分子模式，即使在肿瘤免疫抑制微环境中也能够有效的激活免疫细胞，能够增强特异性免疫反应识别和消除肿瘤细胞。并且细菌具有独特的缺氧部位靶向能力，其能在肿瘤部位的特异性定植，并且细菌具有较强的免疫激活能力，易于工程化改造等优势，是肿瘤免疫治疗的理想候选者。例如细菌的肽聚糖、脂多糖、DNA、鞭毛、RNA等，可以通过抗原递呈细胞上的模式识别受体结合，进而引发相应的免疫反应。但是细菌疫苗存在一个很大的问题就是细菌疫苗使用过程中会诱导免疫耐受，就是多次疫苗皮下注射给药后，巨噬细胞会不再响应或者响应很低，导致巨噬细胞产生的炎性细胞因子降低，从而引起注射部位招募的DCs量降低，削弱免疫激活效果。本发明通过将细菌进行电荷翻转，得到工程化改造的正电荷细菌，将所述工程化改造的正电荷细菌与肿瘤抗原和训练免疫激活剂混合孵育，得到由细菌载体、负载在所述细菌表面的训练免疫激活剂以及静电吸附包裹在所述细菌表面的肿瘤抗原组成的肿瘤个性化疫苗。本发明肿瘤个性化疫苗可以避免免疫耐受，提高抗原在注射部位的滞留，促进接种部位DCs招募、抗原摄取与递呈，显著增强肿瘤特异性T细胞激活反应，削弱肿瘤免疫抑制微环境。
本发明肿瘤个性化疫苗中还负载有β-葡聚糖为代表的训练免疫激活剂，可激活单核/巨噬细胞等先天免疫细胞训练免疫，促进接种部位DCs招募、抗原摄取与递呈，显著增强肿瘤特异性T细胞激活反应；同时β-葡聚糖可激活外周血单核细胞训练免疫，提高肿瘤组织M1型TAMs比例，削弱肿瘤免疫抑制微环境，最终显著抑制肿瘤生长。
下述实施例中使用的小鼠乳腺癌4T1细胞，小鼠黑色素瘤B16-OVA细胞，小鼠肝癌H22细胞，小鼠结肠癌MC38细胞均购自中国典型物保藏中心CCTCC；BALB/c小鼠及C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；β-葡聚糖购自Invivogen公司；酵母提取物、胰化蛋白胨购自英国Oxoid公司；RPMI1640培养基、胶原酶I和PEI购自美国Gibco公司。
以下为实施例：
实施例1
一种以益生菌(EcN)为载体的个性化肿瘤疫苗的构建
制备工程化改造的正电荷细菌：
将5g酵母提取物、10g胰化蛋白胨和10g氯化钠置于锥形瓶中，加超纯水900mL溶解后用1mol/L氢氧化钠(NaOH)调定pH值为7.2，然后用超纯水定容到1L，然后用YM75型全自动立式压力蒸汽灭菌器高压灭菌(121℃，20min)，制备LB培养基。冷却后4℃储存备用。
将-80℃超低温冰箱中冻存的EcN取出至超净工作台中，以1:100比例接种于LB培养基中，于37℃全温培养摇床180rpm过夜培养活化。活化后的菌液以1:100比例接种于LB培养基中，于37℃全温培养摇床180rpm震荡培养。当活化的EcN菌液OD600达到1.0时，吸取菌液500μL，于高速冷冻离心机中以8000rpm离心3min,弃去上清，沉淀用生理盐水重悬并离心清洗三次，加入1mL生理盐水重悬后得到细菌。
将PEI溶解于PBS缓冲液中，配制6.25mg/mL的PEI母液，使用时稀释溶液至终浓度3.125mg/mL。将上述细菌使用生理盐水重悬后，加入EDC及NHS，使其终浓度分别为25mg/mL，20mg/mL。将PEI加入菌液中混匀，于37℃全温培养摇床180rpm震荡孵育30min。孵育后经高速冷冻离心机8000rpm离心3min，弃去上清，沉淀用生理盐水重悬并离心清洗三次，得到工程化改造的正电荷细菌(PEI@EcN)。
制备肿瘤全细胞来源的抗原：
制备乳腺癌肿瘤组织来源抗原(缩写为Ag-4T1)：收集对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞，PBS清洗1次并重悬，用PBS稀释至5×106个mL-1的细胞密度。18-20g的雌性BALB/c小鼠，乳腺部位剃毛，用一次性无菌胰岛素注射器吸取细胞悬液，于小鼠乳腺部位下接种100μL肿瘤细胞悬液，建立4T1原位肿瘤模型。待肿瘤生长至300mm3时，即可进行肿瘤手术切除。
制备肝癌肿瘤组织来源抗原(缩写为Ag-H22)：收集对数生长期的小鼠肝癌H22细胞，PBS清洗1次并重悬，用PBS稀释至2×107个mL-1的细胞密度。18-20g的雄性BALB/c小鼠，用一次性无菌胰岛素注射器吸取细胞悬液，于小鼠右后侧大腿根部皮下部位接种100μL肿瘤细胞悬液，建立H22皮下肝癌肿瘤模型。待肿瘤生长至300mm3时，即可进行肿瘤手术切除。
制备结肠癌肿瘤组织来源抗原(缩写为Ag-MC38)：收集对数生长期的小鼠结肠癌MC38细胞，PBS清洗1次并重悬，用PBS稀释至5×106个mL-1的细胞密度。18-20g的雌性C57BL/6J小鼠，用一次性无菌胰岛素注射器吸取细胞悬液，于小鼠右后侧大腿根部皮下部位接种100μL肿瘤细胞悬液，建立MC38皮下结肠癌肿瘤模型。待肿瘤生长至300mm3时，即可进行肿瘤手术切除。
将新鲜剥离的肿瘤组织经生理盐水清洗后置于6孔板，经手术剪剪碎后，加入3mL含0.8mg/mL的I型胶原酶的RPMI 1640培养基，于37℃恒温培养箱中孵育30min。消化结束后，吸取组织块和消化液过200目细胞筛网，用注射器活塞按压，RPMI1640培养基冲洗收集细胞悬液。用200目尼龙筛网过滤2次后，于4℃以1500rpm离心5min，加入红细胞裂解液裂解细胞沉淀，离心后弃去上清，加入PBS洗涤3次得到细胞沉淀。按说明书配制蛋白酶抑制剂溶液(Roche,Cat.No.04693159001)，使用配制的无菌的蛋白酶抑制剂溶液重悬上述细胞沉淀。细胞悬液在液氮及37℃水浴中反复冻融4次后离心得到细胞裂解物，再经超声波细胞破碎仪破碎得到小颗粒状细胞裂解物，即为从新鲜肿瘤组织制备的肿瘤全细胞抗原。
制备细菌载体的肿瘤个性化疫苗：
将40μg上述肿瘤全细胞抗原(终浓度为200μg/mL)与40μgβ-葡聚糖(终浓度为200μg/mL)及工程化改造的正电荷细菌(细菌数量为3*108CFU)PEI@EcN共同孵育30min后使工程化改造的正电荷细菌负载β-葡聚糖，且工程化改造的正电荷细菌表面通过静电吸附肿瘤全细胞抗原，即得到肿瘤个性化疫苗。
同时，制备模式化疫苗，将40ug模式抗原(OVA)与40ugβ-葡聚糖及工程化改造的正电荷细菌PEI@EcN(细菌数量为3*108CFU)共同孵育30min后，使工程化改造的正电荷细菌负载β-葡聚糖，且工程化改造的正电荷细菌表面粘附通过静电吸附的模式抗原，即得到肿瘤模式疫苗(BG/OVA@EcN)。
实施例2
为了检测抗原是否成功附着在细菌上，本实施例采用荧光标记的模式抗原FITC-OVA，与PEI@EcN在37℃恒温摇床中共同孵育30min后，PBS清洗3遍离心得到沉淀。沉淀经PBS重悬后，在共聚焦显微镜下观察细菌上是否成功负载抗原。对照组1为EcN细菌，对照组2为BG@EcN(BG@EcN为由实施例1制备的工程化改造的正电荷细菌PEI@EcN负载β-葡聚糖制备得到)，对照组3为OVA@EcN(OVA@EcN为由实施例1制备的工程化改造的正电荷细菌PEI@EcN负载模式抗原OVA制备得到)。实验组为实施例1制备的肿瘤模式疫苗(BG/OVA@EcN)。如图2内容A，展示了荧光标记的细菌(Dil-EcN，即为荧光染料Dil标记的PEI@EcN)与荧光标记的OVA抗原(FITC-OVA)有成功的共定位，说明抗原成功附着在细菌上。图2内容B展示了附着了葡聚糖及抗原的疫苗的电位。对照组1为EcN，对照组2为BG@EcN，对照组3为OVA@EcN，实验组为BG/OVA@EcN。图2内容C电镜图例，可以看出，对照组1活EcN细菌形态为杆状结构，有明显菌毛，实验组表明经抗原包裹后的细菌表面更粗糙，细菌表面有一层深色物质包裹。
采用同样的方法验证乳腺癌肿瘤全细胞抗原(缩写为Ag-4T1)是否成功附着在细菌上。图3内容A表示荧光标记的细菌(DIO-EcN，即为荧光染料DIO标记的PEI@EcN)与荧光标记的Ag-4T1抗原(PKH-26-Ag)有成功的共定位，说明抗原成功附着在细菌上。内容B展示了附着了葡聚糖及抗原的疫苗的电位。对照组1为EcN，对照组2为BG@EcN，对照组3为Ag-4T1@EcN，实验组为BG/Ag-4T1@EcN。
实施例3
疫苗在体内免疫激活效果
本实施例以OVA为模式抗原，检测了BG/OVA-Cy5@EcN在注射部位的驻留时间。并且在注射24小时后，收集注射点及淋巴结的细胞进行流式分析。对照组1为OVA-Cy5，由OVA抗原及Cy5-NHS混合搅拌24h制备得到；对照组2为游离BG+OVA-Cy5混合液；对照组3为OVA-Cy5@EcN，由PEI@EcN与OVA-Cy5抗原附着制备得到，实验组为实施例1制备的肿瘤模式疫苗(BG/OVA@EcN)。
注射点及淋巴结的处理步骤：将剥离的皮下注射点经I型胶原酶消化孵育30min。消化结束后，过200目细胞筛网，用注射器活塞按压，RPMI1640培养基冲洗收集细胞悬液。用200目尼龙筛网过滤2次后，于4℃以1500rpm离心5min得到细胞悬液。将新鲜剥离的肿瘤LNs经生理盐水清洗后置于24孔板中，用注射器活塞按压，PBS冲洗收集细胞悬液，用200目尼龙筛网过滤两次后，于4℃以2000rpm离心5min，加入PBS洗涤一次并重悬。
实验结果表明细菌负载了抗原后，相比于游离的抗原，能明显延长抗原在注射部位的驻留时间(图4内容(A)和内容(B))。图4内容(C)和内容(D)表明注射部位的巨噬细胞及树突状细胞对抗原的摄取增加，并且淋巴结内抗原阳性的DC细胞数量也明显增加。综上所述，实验组BG/OVA@EcN能延长抗原在注射部位的驻留，并且被先天性免疫细胞高效摄取，免疫细胞摄取后将携带抗原进入淋巴结进行抗原递呈。
为了评价疫苗是否激活DC细胞并引起特异性细胞免疫反应，6-7周龄的C57BL/6J小鼠皮下接种疫苗后，在第三天，分别取出小鼠的注射部位、淋巴结及血液检测免疫细胞激活情况。收集经肝素钠抗凝的血液，2500rpm离心5min后得到细胞沉淀，加入红细胞裂解液裂解3次并分别使用PBS清洗3次后，得到所需的细胞。所得细胞经荧光抗体染色后上流式细胞仪分析。图5、图6、图7和图8中对照组1为PBS组，对照组2为游离β-葡聚糖组，对照组3为游离OVA抗原组，对照组4为游离β-葡聚糖与游离OVA抗原简单混合组，对照组5为EcN组；对照组6为BG@EcN组，其为PEI@EcN负载BG得到的；对照组7为OVA@EcN组，其为由PEI@EcN负载OVA得到；实验组为实施例1制备的BG/OVA@EcN组，为PEI@EcN负载BG和OVA得到的。
结果显示，BG/OVA@EcN显著增强接种部位DCs、单核/巨噬细胞的招募，(图5内容(A)、内容(B)和内容(C))并激活DC细胞及巨噬细胞成熟，成熟的DC细胞在淋巴结内完成抗原的递呈及激活CD8+T及CD4+T细胞，促进T细胞的增殖与活化(图7内容(A)、内容(B))。血液中的免疫细胞分析结果表明，疫苗给药后，血液内单核/巨噬细胞的数量相比于空白小鼠或游离抗原组有明显的升高(图6内容(C)、内容(D))，迁移性单核/巨噬细胞的数量也明显提高(图6内容(A)、内容(B))。淋巴结中的免疫细胞分析结果见图7内容(A)、内容(B)。以上结果说明BG/OVA@EcN疫苗比游离抗原而言，能诱导特异性T细胞反应。并且将血液细胞体外经LPS再刺激后，其表达TNFa炎性因子的细胞比例相比于空白组明显提高，说明疫苗具有训练单核/巨噬细胞的能力，在第二次抗原再刺激后有较高的炎性因子分泌。这对于机体内产生特异性的抗肿瘤免疫反应，改善肿瘤免疫微环境具有重要意义。
在预防性肿瘤模型中，经疫苗先免疫再接种肿瘤的小鼠，抑瘤效果表明疫苗能明显抑制肿瘤生长，并且延长小鼠生存期(图8内容(A)、内容(B))，说明疫苗接种产生的特异性免疫反应对于肿瘤细胞的接种具有保护作用。
实施例4
为了评价疫苗在肿瘤模型上的治疗性作用，先构建了高表达OVA抗原的皮下黑色素瘤模型，再分别在第6天、第9天、第12天，第17天进行疫苗接种，观察并检测瘤体积大小及生存期。
皮下黑色素瘤模型构建：收集对数生长期的乳腺癌B16-OVA细胞，PBS清洗1次并重悬，用PBS稀释至5×106个mL-1的细胞密度。18～20g的雌性C57BL/6J小鼠，背部部位剃毛，用一次性无菌胰岛素注射器吸取细胞悬液，于小鼠皮下接种100μL肿瘤细胞悬液(约接种5×105个肿瘤细胞每只小鼠)，建立B16-OVA皮下肿瘤模型。对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5、对照组6、对照组7和实验组同图5至图7。实验结果如图9内容(A)和内容(B)所示，在最后一次接种即接枝实验组疫苗后，小鼠的瘤体积得到明显的抑制，并且显著延长小鼠生存期。
在第20天，将小鼠的血液、肿瘤组织、淋巴结组织、脾脏组织收集，检测其中免疫细胞的组分，发现肿瘤组织中的CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞数量明显升高，并且其活化的IFNγ+T、CD69+T细胞的数量也有明显的提高，说明在接种实验组疫苗后，肿瘤组织中浸润的杀伤性T细胞对肿瘤的杀伤作用相比与空白组有明显的提升图9内容(C)、内容(D)、内容(E)和内容(F)。并且肿瘤组织中的M1型巨噬细胞的比例及MHCII+DC细胞的数量有明显的升高，这可能是由于外周血中循环的单核细胞的比例升高。
结果表明训练后的小鼠体内单核/巨噬细胞的数量增多，其浸润到肿瘤组织后会更多的转变为促炎性M1型巨噬细胞及具有抗原递呈能力的MoDCs，从而招募更多的杀伤性T细胞浸润到肿瘤中，发挥抑瘤的作用。
实施例5
在临床肿瘤患者肿瘤组织中存在大量基因突变形成的、正常组织缺乏的肿瘤新抗原，导致递送肿瘤相关抗原的肿瘤疫苗难以实现针对肿瘤患者的高效抗肿瘤免疫治疗效果，这就要求发展新型个性化肿瘤疫苗，以满足临床术后肿瘤治疗迫切需求。所以我们将PEI@EcN的载体经静电吸附作用吸附个性化乳腺癌肿瘤组织全细胞来源的抗原，验证此细菌为载体的疫苗是否具有个性化发展前景。
实验方法同实施例1，在建立原位4T1肿瘤模型后，待肿瘤组织生长到300mm3左右后，经手术切除肿瘤组织体积的95％，缝合手术部位后，将得到的新鲜肿瘤组织制备肿瘤全细胞抗原(缩写为Ag-4T1)。然后将40μg上述肿瘤全细胞抗原与40μgβ-葡聚糖及工程化改造的正电荷细菌(细菌数量为3*108CFU)PEI@EcN共同孵育30min后使工程化改造的正电荷细菌负载β-葡聚糖，且工程化改造的正电荷细菌表面通过静电吸附肿瘤抗原，即得到肿瘤个性化疫苗BG/Ag-4T1@EcN。在第3天、第6天、第9天、第14天分别接种各组分的疫苗后，检测小鼠的复发瘤体积大小。图10、图11和图12中对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5、对照组6、对照组7、实验组分别对应PBS，BG,Ag-4T1,BG+Ag-4T1,EcN,BG@EcN,Ag-4T1@EcN，BG/Ag-4T1@EcN。
结果表明，BG/Ag-4T1@EcN组具有明显的抑瘤效果，并明显延长小鼠生存期(图10内容(A)和内容(B))。在存活的3只小鼠血液中，其单核/巨噬细胞的数量有明显升高(图11内容(A)和内容(B))，并且在体外经LPS再刺激后，其分泌TNFa的细胞比例相比与空白小鼠也有明显升高(图11内容(C)和内容(D))。血液中记忆T细胞的比例有明显提高(图12内容(A)和内容(B))，在体外经抗原再刺激后的T细胞其分泌的IFNγ及其活化的特异性T细胞的比例也有明显升高(图12内容(C)和内容(D))。提示小鼠血液中的单核巨噬细胞在疫苗训练后，具有更强的分泌炎性因子的能力，并且疫苗使小鼠体内产生特异性免疫应答，在浸润到肿瘤组织后具有更多的杀伤性T细胞，发挥抑瘤作用。图11和图12中对照组为健康小鼠，实验组为上述实验组BG/Ag-4T1@EcN中存活下来的小鼠。
实施例6
同样的，我们利用了壳聚糖(Chitosan)工程化改造细菌，得到工程化改造的正电荷细菌Chitosan@MG1655。我们将Chitosan@MG1655的载体经静电吸附作用吸附个性化肝癌肿瘤组织全细胞来源的抗原，验证此细菌为载体的疫苗是否具有抑制肝癌复发的效果。
实验方法同实施例1，在建立皮下肝癌肿瘤模型后，待肿瘤组织生长到300mm3左右后，经手术切除肿瘤组织体积的95％，缝合手术部位后，将得到的新鲜肿瘤组织制备肿瘤全细胞抗原(缩写为Ag-H22)。然后将40μg上述肿瘤全细胞抗原(终浓度为200μg/mL)与40μg胞壁酰二肽(缩写为MDP，终浓度为200μg/mL)及工程化改造的正电荷细菌(细菌数量为3*108CFU)Chitosan@MG1655共同孵育30min后使工程化改造的正电荷细菌负载胞壁酰二肽，且工程化改造的正电荷细菌表面通过静电吸附肿瘤抗原，即得到肿瘤个性化疫苗MDP/Ag-H22@MG1655。在第3天、第6天、第9天、第14天分别接种各组分的疫苗后，检测小鼠的复发瘤体积大小。图13、图14和图15中对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5、对照组6、对照组7、实验组分别对应PBS，MDP，Ag-H22，MDP+Ag-H22，MG1655，MDP@MG1655，Ag-H22@MG1655，MDP/Ag-H22@MG1655。
结果表明，MDP/Ag-H22@MG1655组具有明显的抑瘤效果，并明显延长小鼠生存期(图13内容(A)和内容(B))。在存活的4只小鼠血液中，其单核/巨噬细胞的数量有明显升高(图14内容(A)和内容(B))，并且在体外经LPS再刺激后，其分泌TNFa的细胞比例相比与空白小鼠也有明显升高(图14内容(C)和内容(D))。血液中记忆T细胞的比例有明显提高(图15内容(A)和内容(B))。提示小鼠血液中的单核巨噬细胞在疫苗训练后，具有更强的分泌炎性因子的能力，并且疫苗使小鼠体内产生特异性免疫应答，在浸润到肿瘤组织后具有更多的杀伤性T细胞，发挥抑瘤作用。图14和图15中对照组为健康小鼠，实验组为上述实验组MDP/Ag-H22@MG1655中存活下来的小鼠。
实施例7
同样的我们将PEI@MG1655的载体经静电吸附作用吸附个性化结肠癌肿瘤组织全细胞来源的抗原，验证此细菌为载体的疫苗是否具有抑制结肠癌复发的效果。
实验方法同实施例1，在建立皮下结肠癌肿瘤模型后，待肿瘤组织生长到300mm3左右后，经手术切除肿瘤组织体积的95％，缝合手术部位后，将得到的新鲜肿瘤组织制备肿瘤全细胞抗原(缩写为Ag-MC38)。然后将40μg上述肿瘤全细胞抗原与40μg胞壁酰二肽(缩写为MDP)及工程化改造的正电荷细菌(细菌数量为3*108CFU)PEI@MG1655共同孵育30min后使工程化改造的正电荷细菌负载胞壁酰二肽，且工程化改造的正电荷细菌表面通过静电吸附肿瘤抗原，即得到肿瘤个性化疫苗MDP/Ag-MC38@MG1655。在第3天、第6天、第9天、第14天分别接种各组分的疫苗后，检测小鼠的复发瘤体积大小。图16、图17和图18中对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5、对照组6、对照组7、实验组分别对应PBS，MDP，Ag-MC38，MDP+Ag-MC38，MG1655，MDP@MG1655，Ag-MC38@MG1655，MDP/Ag-MC38@MG1655。
结果表明，MDP/Ag-MC38@MG1655组具有明显的抑瘤效果，并明显延长小鼠生存期(图16内容(A)和内容(B))。在存活的3只小鼠血液中，其单核/巨噬细胞的数量有明显升高(图17内容(A)和内容(B))，并且在体外经LPS再刺激后，其分泌TNFa的细胞比例相比与空白小鼠也有明显升高(图17内容(C)和内容(D))。血液中记忆T细胞的比例有明显提高(图18内容(A)和内容(B))。提示小鼠血液中的单核巨噬细胞在疫苗训练后，具有更强的分泌炎性因子的能力，并且疫苗使小鼠体内产生特异性免疫应答，在浸润到肿瘤组织后具有更多的杀伤性T细胞，发挥抑瘤作用。图17和图18中对照组为健康小鼠，实验组为上述实验组MDP/Ag-MC38@MG1655中存活下来的小鼠。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗，其特征在于，包括工程化改造的正电荷细菌及其负载的训练免疫激活剂，还包括通过静电吸附粘附在所述工程化改造的正电荷细菌表面的肿瘤抗原；所述训练免疫激活剂为能够激活训练免疫的物质。
2.如权利要求1所述的肿瘤个性化疫苗，其特征在于，所述工程化改造的正电荷细菌为对细菌进行灭活及电荷翻转得到的正电荷细菌。
3.权利要求1所述的肿瘤个性化疫苗，其特征在于，所述肿瘤抗原为肿瘤模式化抗原或肿瘤个性化抗原；其中：
所述肿瘤模式化抗原为鸡卵白蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原或鳞状上皮细胞癌抗原；
所述肿瘤个性化抗原为源自于结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌或皮肤癌的肿瘤组织的肿瘤抗原。
4.如权利要求1所述的肿瘤个性化疫苗，其特征在于，所述训练免疫激活剂为能够激活训练免疫的多糖或多肽，优选为β-葡聚糖、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的肿瘤个性化疫苗，其特征在于，所述工程化改造的正电荷细菌在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为(1.5*108～2*109)CFU/mL，所述肿瘤抗原在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为100～500μg/mL，所述训练免疫激活剂在该肿瘤个性化疫苗中的终浓度为100～500μg/mL。
6.一种如权利要求1至5任一项所述的肿瘤个性化疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：对细菌进行电荷翻转，得到所述工程化改造的正电荷细菌；
S2：将肿瘤组织进行消化处理和裂解，收集细胞裂解物，得到所述肿瘤抗原；
S3：将训练免疫激活剂与所述工程化改造的正电荷细菌和所述肿瘤抗原混合孵育，使工程化改造的正电荷细菌负载训练免疫激活剂，且使所述工程化改造的正电荷细菌表面通过静电吸附所述肿瘤抗原，即得到肿瘤个性化疫苗。
7.如权利要求6所述的肿瘤个性化疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1将细菌与氨基化合物、羧基活化剂和氨基酸保护剂混合后震荡孵育，实现所述细菌的电荷翻转；其中所述氨基化合物为PEI、壳聚糖或聚赖氨酸，所述羧基活化剂为EDC，所述氨基酸保护剂为NHS。
8.如权利要求6所述的肿瘤个性化疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述消化处理为：向肿瘤组织加入含I型胶原酶的RPMI 1640培养基并孵育。
9.如权利要求8所述的肿瘤个性化疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2所述孵育的温度为25～37℃，孵育时间为10～120min；
步骤S3所述孵育的温度为25～37℃，孵育时间为10～120min。
10.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，其包括如权利要求1至5任一项所述的以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗。
CN202310293533.2A 2023-03-23 2023-03-23 一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法 Pending CN116212011A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310293533.2A CN116212011A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310293533.2A CN116212011A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116212011A true CN116212011A (zh) 2023-06-06

Family

ID=86578757

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310293533.2A Pending CN116212011A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116212011A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shi et al. Enhanced antitumor immunity by targeting dendritic cells with tumor cell lysate-loaded chitosan nanoparticles vaccine
Singh et al. An injectable synthetic immune-priming center mediates efficient T-cell class switching and T-helper 1 response against B cell lymphoma
CN110124019B (zh) 细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法
CN109568570B (zh) 一种抗肿瘤疫苗复合物及制备方法、注射剂及应用
Lv et al. Redox-responsive hyperbranched poly (amido amine) and polymer dots as a vaccine delivery system for cancer immunotherapy
US7247310B1 (en) Tumor vaccines
CN111658767B (zh) 一种亲水性抗原和/或疏水性抗原疫苗递送系统及其制备方法
CN112516297B (zh) 一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗的制备方法及其应用
CN101954073A (zh) 一种新型的抗肿瘤细胞疫苗及其制备方法
CN111346236A (zh) 负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用
CN101072582B (zh) 作为癌症疫苗佐剂的α胸腺肽
KR20120114358A (ko) 종양 세포 증식 억제를 위해 개선된 조성물
Dong et al. Hybrid M13 bacteriophage-based vaccine platform for personalized cancer immunotherapy
Wang et al. Programmed polymersomes with spatio-temporal delivery of antigen and dual-adjuvants for efficient dendritic cells-based cancer immunotherapy
CN111358942A (zh) 一种疫苗及其制备方法
AU2012334095A1 (en) Vaccine for tumor immunotherapy
CN116212011A (zh) 一种以细菌为载体的肿瘤个性化疫苗及其制备方法
CN116763907A (zh) 一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗及其制备方法
WO2024000724A1 (zh) 负载癌细胞全细胞组分和混合膜组分的疫苗的制备方法及其应用
CN115737830A (zh) 一种时空差异化诱导肿瘤免疫原性死亡和增强抗原提呈的水凝胶疫苗及其制备方法和应用
Zhang et al. In Situ biomimetic Nanoformulation for metastatic cancer immunotherapy
CN115919798A (zh) 基于肿瘤细胞外颗粒的肿瘤疫苗及其制备方法和应用
CN114931632A (zh) 一种基于抗原提呈细胞膜组分的癌症疫苗及其制备方法和应用
CN103933558A (zh) 一种新型、广谱的治疗性肿瘤疫苗的制备和使用方法
CN114288400A (zh) 一种改善肿瘤免疫微环境DCs失能的mRNA肿瘤疫苗、制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination