CN103933558A - 一种新型、广谱的治疗性肿瘤疫苗的制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型、广谱的治疗性肿瘤疫苗的制备和使用方法，本发明所述治疗性肿瘤疫苗，由一种转基因肿瘤细胞系和DC细胞共同培养后制备得到；或者脱离DC细胞，单独的经过照射灭活的转基因肿瘤细胞系疫苗；其中，所述转基因肿瘤细胞系是用逆转录病毒对肿瘤细胞进行转染得到的，具有在细胞内表达GM-CSF分子和/或在细胞表面表达NY-ESO-1分子的能力；所述在细胞内表达GM-CSF分子的能力通过病毒或者DNA质粒介导获得；所述在细胞表面表达NY-ESO-1分子的能力通过病毒或者DNA质粒介导获得。

Description

一种新型、广谱的治疗性肿瘤疫苗的制备和使用方法

技术领域：

本发明涉及一种生物疫苗及其制备方法，特别是涉及一种治疗性肿瘤疫苗及其制备方法。

背景技术：

肿瘤疫苗一直是近些年研究的热点之一，其原理是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，激活患者自身免疫系统，增强机体的抗肿瘤能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。在抗肿瘤免疫反应中，最早接触肿瘤抗原的是抗原递呈细胞(Antigenpresenting cells,APC)，再由APC将肿瘤抗原处理后递呈给T细胞、B细胞等效应细胞，

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。

人体内大部分DC处于非成熟状态，激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，但未成熟DC具有极强的抗原吞噬能力，在摄取抗原(包括体外加工)或受到某些因素刺激时即分化为成熟DC，而成熟的DC表达高水平的共刺激因子和粘附因子。DC在成熟的过程中，由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官，与T细胞接触并激发免疫应答。DC作为目前发现的功能最强的APC，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成。近年来研究表明，应用肿瘤相关抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，回输或免疫接种于载瘤宿主，可诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应。

DC抗肿瘤的机制如下：①DC可以高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC-I类限制性CTL反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4+Thl反应。同时，DC还通过其高表达的共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。②DC与T细胞结合可大量分泌IL-12、IL-18激活T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；③DC分泌趋化因子(Chemotactic Cytokines，CCK)专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集，增强了T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在，可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述CCK进一步以正反馈旁分泌的方式活化DC，上调IL-12及CD80、CD86的表达；同时DC也直接向CD8+T细胞呈递抗原肽，在活化的CD4+T细胞辅助下使CD8+T细胞活化，CD4+和CD8+T细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤，增强机体抗肿瘤免疫应答。

该发明基于以上前提，沿用以下思路而产生：

(1)研究以树突状DC细胞为靶向的治疗性癌症疫苗的必要性。DC细胞是最强有力的抗原呈递细胞，它们可以激活天然T细胞去识别内源性的肿瘤细胞。DC细胞在产生和调节抗肿瘤免疫反应的过程中起了十分重要的作用。因此，DC细胞被评价为肿瘤疫苗发展的基石。抗前列腺肿瘤疫苗Provenge,是第一例美国FDA通过的治疗性肿瘤疫苗，是最前沿的DC细胞疫苗之一。它是用自体DC细胞加人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)在体外培养而制成的。

然而，像Provenge一样，大多数DC细胞疫苗的制作过程需要首先对病人特有的粒细胞进行分离、然后用细胞因子刺激、同肿瘤相关抗原一起培育，最终在许多严格的质量控制措施下生长成熟。这些漫长的过程大大增加了DC细胞疫苗的造价。所以每个前列腺癌患者注射三次Provenge总共会花费九万四千美元。可以单独使用的针对DC细胞表面受体的治疗性疫苗，可以绕过体外培育DC细胞这个过程，而直接运用体内生长的DC细胞，那么这将大大减低治疗的费用而弥补目前DC细胞疫苗的不足。

(2)用重要的DC细胞表面受体使疫苗产生靶向作用。DC细胞表面受体对DC细胞产生固有免疫和获得性免疫起着重要作用。根据抗原的大小，未成熟DC细胞运用巨胞饮作用(macropinocytosis)、胞吞作用(endocytosis)、吞噬作用(phagocytosis)以及调理作用(opsonization)来摄吸外源性抗原。受体介导的吞噬作用比常规的巨胞饮作用更特异和有效。因此，运用DC细胞表面受体的靶向疫苗可以更有效的摄吸和处理抗原。重要的DC表面受体如下所述。

(3)通过配基与DC细胞表面受体的相互作用来诱导抗肿瘤免疫反应。包括细胞内受体和成熟受体在内的多种受体都常参与抗原靶向识别。参与DC细胞吞噬作用的主要受体是补体受体、Fc受体、凝集素和整合素家族受体；然而使DC细胞成熟的主要受体是在DC细胞、单核细胞、B细胞、吞噬细胞、嗜酸性细胞和上皮细胞上的toll样受体(TLR)。TLR是固有免疫系统的主要成份，因为它们可以检测细菌感染，还可以激活DC细胞成熟来诱导获得性免疫反应。目前在人和小鼠体内至少已经有11种TLR被发现，他们可以识别一组有限的但是高度保守的分子结构，因此叫做病原体相关的分子模式。例如TLR4可以识别革兰阴性菌上特有的脂多糖，TLR2可以识别革兰阳性菌上特有的肽聚糖，TLR3可以识别病毒感染时产生的双链RNA，TLR9可以识别原核细胞和病毒上非甲基化的CpGDNA序列。通过TLR激活DC细胞可以诱导DC细胞的成熟并向淋巴结迁移。通过这些参与刺激的受体，DC细胞产生极化并分泌细胞因子和趋化因子，例如促炎症反应的TNF-a、IL-1、IL-6、IL-12等等。

在多达15年研究睾丸癌抗原NY-ESO-1高免疫原性的基础上，我们发现NY-ESO-1与DC细胞表面的补体C1q受体和TLR4相连，并作为自己的佐剂，成为树突状细胞靶向定位的配基之一。肿瘤细胞被认为可以释放“危险信号”，例如热休克蛋白和尿酸。作为睾丸肿瘤抗原NY-ESO-1的发现者，我们团队一直在研究为什么NY-ESO-1可以在癌症病人中诱导毒性T细胞，辅助性T细胞，以及抗体反应。这种被来源于肿瘤的NY-ESO-1抗原所诱导的细胞免疫和体液免疫并不是由于NY-ESO-1的高水平表达。事实上，与其它肿瘤相关抗原相比，NY-ESO-1抗原在肿瘤组织中反而处于低水平的表达。

我们因此假设NY-ESO-1的内因子引起了它在体内超强的免疫原性。这种假设被我们现在的研究所支持，那就是NY-ESO-1通过DC细胞表面的C1q受体(与钙网织蛋白CRT作用相同)直接与人和小鼠的未成熟DC细胞相连。在肿瘤细胞，CRT暴露在表面的作用是发出“相连的信号”，把免疫原性传递给没有免疫原性的凋亡细胞。在我们的报告中，多聚物NY-ESO-1/CRT的相互作用与快速的吞噬作用联系在一起，并被人DC细胞交叉呈递。最新的资料显示TLR4和钙网织蛋白CRT一道作为NY-ESO-1在DC细胞表面的一个共受体。快速的吞噬作用与强有力的TLR信号大概可以解释为什么在免疫抑制性的肿瘤微环境中NY-ESO-1作为细胞内蛋白而具有强大的免疫原性。

我们在此基础上同时借鉴GVAX思路和其失败原因，本发明所使用的同时表达GM－CSF和表面NY－ESO－1分子的疫苗一方面可以通过GM－CSF来吸引和诱导骨髓系细胞比如单核细胞转化为未成熟DC；另一方面可以通过NY－ESO－1这一TLR4的自然受体直接作用于诱导DC细胞的成熟和进一步刺激T/B细胞，达到疫苗激活作用。

发明内容：

本发明所解决的技术问题系提供了一种新的转基因肿瘤细胞系,其细胞表达GM-CSF和/或细胞表面的NY-ESO-1分子。可以靶向激活未成熟DC细胞使其变为成熟DC细胞。

此外，还提供一种新型、广谱的治疗性肿瘤疫苗及其制备方法，该治疗性肿瘤疫苗能安全、有效的特异性治疗多种肿瘤。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

一种治疗性肿瘤疫苗，由一种转基因肿瘤细胞系和DC细胞共同培养后制备得到。或者脱离DC细胞，单独的经过照射灭活的转基因肿瘤细胞系疫苗。

其中，所述转基因肿瘤细胞系是用逆转录病毒对肿瘤细胞进行转染得到的，具有在细胞内表达GM-CSF分子和/或在细胞表面表达NY-ESO-1分子的能力。

本发明所述在细胞内表达GM-CSF分子的能力通过病毒(慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，AV)，或者DNA质粒介导获得。

本发明所述在细胞表面表达NY-ESO-1分子的能力通过病毒(慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，AV)，或者DNA质粒介导获得。

所述逆转录病毒来源于本实验室构建质粒，结构如图1A，构建方法可参照文献：L.Xu,J.Zheng,D.H.Nguyen,Q.T.Luong,Z.Lin,G.Zeng“Enhancingwhole tumor-cell vaccination by engaging innate immune system throughNY-ESO-1/dendritic cell interactions.”J.Immunother.(2013)in press。如以下方法：通过Bgl I和Sal I两种限制性内切酶的作用，将完整的NY-ESO-1cDNA克隆到pDisplay载体中。以pDisplay-NY-ESO-1质粒作为基因克隆模板，上游引物(5’ACACTCGAGCAATTGATGGAGACAGACACACTCCTGCT-3’)，下游引物(5’-ACGCGGCCGCGGATCCAGCGGCCGCCTAACGTGGCT-3’)。PCR原料包含T7,CMV,signal peptide,HA tag,NY-ESO-1,myc tag以及经过Xho I和Bam I限定将血小板衍生生长因子跨膜区亚克隆逆转录病毒载体。将这个重组质粒命名为pRV-Display-NY-ESO-1。

所述肿瘤细胞是从患者身上获得的活的肿瘤细胞，根据本发明，包括任何一种经过培养可以生长繁殖并被可以被逆转录病毒所转染的肿瘤细胞或者多种同类异源肿瘤细胞系的混合，如：肺癌，胃癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，结肠癌，鼻咽癌，头颈癌的细胞；

所述转染是将含有逆转录病毒的质粒和Phoenix细胞混合，其中加入DNA转染试剂得到含有逆转录病毒的Phoenix细胞上清液；然后再用该细胞上清液和肿瘤细胞混合培养得到转染逆转录病毒的肿瘤细胞；

转染逆转录病毒的肿瘤细胞经过培养扩增，然后利用表面表达的NY－ESO－1分子进行流式细胞仪介导的肿瘤细胞纯化，对纯化后的细胞进行GM－CSF转染，得到可表达GM－CSF的纯化的转染逆转录病毒的肿瘤细胞系，即本发明所述具有在细胞内表达GM-CSF分子和/或在细胞表面表达NY-ESO-1分子的能力的转基因肿瘤细胞系；

所述制备是将所得可表达GM－CSF的纯化的转染逆转录病毒的肿瘤细胞进行灭活，得到灭活的可表达GM－CSF的纯化的转染逆转录病毒的肿瘤细胞，这一细胞系或者多株灭活的混合细胞系可以单独作为肿瘤疫苗使用；将该灭活的可表达GM－CSF的纯化的转染逆转录病毒的肿瘤细胞和DC细胞共同培养，得到细胞混合物，再经提取分离即得本发明所述的疫苗。

本发明所述的疫苗，具体可以通过以下方法制备：

1)使用Phoenix细胞系统产生逆转录病毒:首先，在六孔板中进行转染，将2ug编码人类GM-CSF或表面NY-ESO-1分子的逆转录病毒DNA质粒加入1-2x10⁶Phoenix细胞系统，同时加入DNA转染试剂LipofectamineLTXand PLUSReagents。转染48小时以后，收集悬浮细胞进行下一步操作。

2)使用逆转录病毒转染肿瘤细胞：肿瘤细胞可以是来源于病人自身的体外培养的肿瘤细胞系或者是2－3株异体但是同类的肿瘤细胞系，比如小细胞肺癌，透明细胞肾癌等等。使用逆转录病毒转染肿瘤细胞，肿瘤细胞在转染过程中会经历一个快速增长的过程。具体方法如下：在一个六孔板中，1x10⁶肿瘤细胞将被放在0.5mL逆转录病毒悬液和0.5mL浓度为4ug/mL的聚凝胺中悬浮培养。最后，通过流式细胞仪检测抗癌基因抗体来证实转染是否成功。

3)纯化扩增转染的肿瘤细胞：经过以上基因工程转染的细胞能够通过流式细胞仪对抗癌基因抗体荧光染色的活细胞进一步分选，达到大于90％的纯度。之后，对分选出的细胞进行进一步扩增，整个培养过程将严格操作，以保证表达表面NY-ESO-1分子的肿瘤细胞纯度大于90％。

4)多次GM－CSF转染：在以上初步纯化的肿瘤细胞到达5x10⁶以后，需要进行多次GM－CSF病毒转染，同时检测细胞上清液，保证二十四小时内每百万个肿瘤细胞分泌GM－CSF到达500pg/ml。

5)灭活制备肿瘤疫苗：经过支原体，细菌等等阴性检测后的细胞系需要做成单细胞悬液并经过300Gy的辐照仪照射，得到灭活细胞。

6)上述灭活细胞和DC细胞用培养液共同培养，得到混合细胞悬液。

7)对混合细胞悬液进行纯化，分离，配制，制备成疫苗制剂。

本发明的疫苗经过以下实验证明具有优良的技术效果：

在肾癌动物模型上的效果实验：

材料和方法

实验小鼠

所有老鼠依照动物加利福尼亚大学洛杉矶分校研究委员会批准的指导原则办理手续。6-8周雌性BALB/c小鼠购买于Charles River Laboratories(SanDiego,CA).TLR4缺陷小鼠(BALB/c小鼠,年龄在6-8周)来自于JacksonLaboratory(Sacramento,CA).为便于皮下注射，用异氟醚对小鼠进行短时间麻醉。将1×10⁶肿瘤细胞和基质胶(BD Biosciences，San Diego，CA)按照2:1的比例注入小鼠。每隔一天计算小鼠肿瘤体积，计算公式如下：体积＝(L×W²)/2,L是最大长度；W是最大宽度。

质粒结构

通过Bgl I和Sal I两种限制性内切酶的作用，将完整的NY-ESO-1cDNA克隆到pDisplay载体中。以pDisplay-NY-ESO-1质粒作为基因克隆模板，上游引物(5’ACACTCGAGCAATTGATGGAGACAGACACACTCCTGCT-3’)，下游引物(5’-ACGCGGCCGCGGATCCAGCGGCCGCCTAACGTGGCT-3’)。PCR原料包含T7,CMV,signal peptide,HA tag,NY-ESO-1,myc tag以及经过Xho I和Bam I限定将血小板衍生生长因子跨膜区亚克隆逆转录病毒载体。将这个重组质粒命名为pRV-Display-NY-ESO-1。作为对照，我们用同样的方法构建一出pRV-Display-GFP。质粒结构通过DNA测序的方法验证。

细胞系和逆转录病毒的转导

小鼠肾癌细胞系，Renca(BALB/c同源)，细胞系购买于美国模式培养物集存库(Manassas,VA)，细胞系经含10％FBS以及青霉素和链霉素的RPMI1640培养。如之前所述，通过逆转录病毒的基因转导，Renca细胞系能够在细胞膜上表达与膜相连接的NY-ESO-1或GFP，这两种细胞系分别命名为Renca-ESO和Renca-GFP。Renca-ESO和Renca-GFP细胞系通过流式细胞分选仪富集，获得的细胞系纯度大于90％。在一些实验中可能会用到Renca-CA9细胞系，这是一种能够表达carbonicanhydrase9(CA9)抗原的Renca细胞系。所有细胞系将通过支原体检测试剂盒(Mycoplasma Detection Kit,Molecular Probes,Eugene,OR)检测，检测结果为无支原体污染。

试剂和抗体

结合有H-2Dd的多肽CA9172-180(AFCPALRPL),CA9258-266(AFARVDEAL)和CA9323-331(RYFQYEGSL)通过GenScript(Piscataway,NJ)公司人工合成。LPS和CpG(分别为TLR4和TLR9的激动剂)购买于InvivoGen(San Diego,CA)。鼠单克隆抗体,CD4,CD11b,CD11c,CD80,CD86,and I-A/I-E购买于BioLegend(San Diego,CA)。鼠单克隆抗体CD8和FoxP3购买于BD Pharmingen(San Diego,CA)。

在机体内和机体外的DC活化试验

肿瘤细胞(1×10⁶重悬于50μL PBS)注射到小鼠的后脚底板。在注入肿瘤细胞后三天，取出小鼠引流淋巴结和对侧淋巴结。用注射器对淋巴结进行机械解离后，将细胞通过70μm细胞筛网过滤。将细胞悬液离心后，对其进行流式抗体染色，进行流式分析。对于机体外的分析，我们先通过冲洗小鼠股骨和胫骨获得小鼠骨髓细胞，经过红细胞裂解后，将细胞培养于含有10％FBS,20ng/mL重组鼠GM-CSF(R&D systems,Minneapolis,MN),50μM2-巯基乙醇(Invitrogen,Carlsbad,CA)的RPMI1640中，培养六天。细胞每隔一天进行一次换液。第六天，收集髓系DC细胞，将其放入6孔板中与肿瘤细胞(每孔放入5×10⁵DC细胞和5×10⁵肿瘤细胞)共培养24小时。之后，收集共培养细胞，将细胞悬液离心后，对其进行流式抗体染色，进行流式分析。

T cell功能试验

对于体外细胞毒性T细胞(CTL)，我们用CytoTox96Non-radioactiveCytotoxicity assay(Promega,Madison,WI)进行检测，这种方法是基于乳酸脱氢酶(LDH)的色度比色检测。Renca细胞或同源NIH3T3细胞系(靶细胞)接种于96孔板，每孔1×10⁴个细胞。脾细胞来自已获得免疫的小鼠(效应细胞)，通过计数后按照不同的效靶比加入靶细胞中，所有试验进行三次。经过37℃培养4小时后，吸取50μL上清分析LDH活性，并按照试剂盒推荐方法换算细胞毒性百分比。抗原特异性CTL细胞应答在体内的检测，是通过CFSE对捐献脾细胞的小鼠进行活体细胞染色检测。未成熟的同源脾细胞系悬液作为靶细胞，向其中加入10μg/mL多肽在37℃培养一小时，之后用5μM CFSE(CFSEhigh cells)对细胞进行染色标记。未加多肽刺激的脾细胞作为阴性对照，同样用5μM CFSE(CFSElowcells)对其进行染色标记。取相同数量的两种细胞混匀，取5×10⁶的细胞静脉注射给免疫小鼠(immunized mice)。第二天，杀死小鼠用流式方法对小鼠脾细胞进行CFSE强度的分析。The peptide-specific lysis通过以下公式计算:lysis％＝[1–(Rnaive/Rimmunized)]×100,R代表CFSElow/CFSEhigh比例。为检测IFN的分泌，从免疫小鼠脾脏分离出脾细胞(2×10⁶)，与经35gray强度照射的Renca细胞或NIH3T3细胞共培养48小时。然后按照试剂盒使用说明用ELISA kit(BioLegend,San Diego,CA)检测细胞培养液上清。

增加肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)

通过用注射器对肿瘤进行机械剪碎后，将肿瘤放入含有1mg/mL胶原酶D(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)和200U/mL DNase I(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的PBS中，37℃培养30分钟，之后通过多次吹打和70μm细胞筛网过滤，使肿瘤成为单细胞悬液。通过Ficoll分离液分离，收集中间层细胞进行下一步分析。

肿瘤肺转移治疗实验

通过尾静脉将100μL PBS(约2×10⁵个肿瘤细胞)注入小鼠体内建立小鼠肺转移模型。小鼠在接种肿瘤25-28天后被杀死。为区分正常组织和肿瘤组织，通过气管向小鼠肺部加入墨汁(15％墨汁,85％水，3滴NH4OH/100mL)。摘取小鼠的肺，在Fekete’s溶液(100mL70％乙醇,10mL37％福尔马林,and5mL冰醋酸)中保存。数出白色肿瘤小组织个数。

统计分析

数据以均值±SD形式呈现，通过独立样本t检验法或单因素方差分析法分析，并且遵从邦博朗尼事后多重校正法(Bonferroni posttest multiplecomparisons)。P<0.05表示在统计学上显著的。

结果

细胞表面表达NY-ESO-1能够降低小鼠机体内肾癌细胞生长

在人工培养的细胞系和临床肿瘤样本中，NY-ESO-1被证实是一种细胞质蛋白，在细胞死亡以后，能够通过结合细胞表面CRT和TLR4启动固有免疫系统。为了研究NY-ESO-1在细胞外对固有免疫和适应性免疫的影响，我们让NY-ESO-1表达于Renca细胞(鼠科肾癌细胞系)表面。异常的超量表达NY-ESO-1也许能够增强细胞固有免疫和可测量的免疫学结果之间的相互关系。我们通过融合血小板源生生长因子受体跨膜区(Fig.1A)结构构建一个逆转录病毒载体，实现在肿瘤细胞细胞表面表达NY-ESO-1。经过这种逆转录病毒转导的Renca细胞被分选出来，并命名为Renca-ESO。最后，通过抗体对HA tag染色，用共聚焦显微镜(Fig.1B)和流式细胞仪(Fig.1C)对细胞表面表达NY-ESO-1进行确认。以上述相同方法，构建一株细胞表面表达GFP的Renca细胞系(Renca-GFP)作为对照。

为确定基因修饰是否对Renca细胞系生长产生影响，我们进行细胞体外增殖试验(Fig.1D)。通过观察原代Renca细胞和转染后Renca细胞生长情况，细胞增殖无明显差异。为评估直接接入NY-ESO-1对固有免疫的影响，5组WT BALB/c小鼠通过皮下接种1×10⁶Renca-ESO细胞，监视肿瘤生长情况(Fig.1D)。按相同方法，将Renca细胞和Renca-GFP细胞注入小鼠体内，作为对照。Renca-ESO肿瘤显示出的生长速度明显慢于其他对照组肿瘤生长速度。这个肿瘤模型的肿瘤生长动力学区别可以认为是肿瘤细胞表面表达的NY-ESO-1与固有免疫相互作用的结果。

细胞表面表达NY-ESO-1能够使机体内和离体培养的DC细胞活性增强

DC细胞在肿瘤免疫应答开始、进行，以及调控起着关键性作用。但同时，DC细胞的角色并不单一，当成熟的/激活的DC细胞开始进行免疫反应时，未成熟的DC细胞是趋向于免疫耐受的。在机体内，成熟的DC细胞会迅速的从外周组织迁移到引流淋巴结。同时，它还参与一些其他的免疫协调工作，包括抗原递呈过程中的一些复杂的分子表达上调和T细胞共刺激。因此，我们需要知道细胞表面表达NY-ESO-1是否有助于肿瘤细胞激活DC细胞。分别将大约1×106Renca细胞、Renca-GFP细胞和Renca-ESO细胞通过后脚底板注射到不同WT BALB/c小鼠体内。三天后，切下小鼠引流淋巴结并对小鼠DC细胞表型进行流式分析。我们的结果显示注入Renca-ESO肿瘤细胞的小鼠引流淋巴结(the draining lymph node)内激活的DC细胞比例高于另外两组(Fig.2A)。我们之前的数据表明NY-ESO-1能够结合DC细胞表面的TLR4，我们试图确认上面的观点，因此我们建立了一个肿瘤细胞与WT或TLR4缺陷的(TLR4–/–)BALB/c小鼠的髓系DC细胞(BMDC)离体共培养体系。将未成熟的BMDC与细胞表面不表达NY-ESO-1的Renca细胞共培养24小时。Renca-ESO细胞，能够向阳性对照LPS和CpG一样，通过刺激上调DC细胞表面CD80、CD86、MHC II有效的证明DC细胞被活化(Fig.2B)，而对照组并没有显示出相应的结果。与此同时，在TLR4–/–小鼠组，Renca-ESO细胞没有激活DC细胞，这正好符合我们上述观点：在NY-ESO-1激活DC细胞过程中，TLR4起到关键性的作用(Fig.2B)。

细胞表面表达NY-ESO-1能够增强肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫应答

为了确定被活化的DC细胞是否有助于增强肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫应答，我们进行INF-分泌量和CTL活性试验。为进行上述试验，我们从免疫幼鼠身上获得脾细胞，将其与Renca细胞或同源的NIH3T3细胞(阴性对照)作为靶细胞共培养。来自幼鼠或免疫小鼠的脾细胞与辐射后的Renca细胞或Renca-GFP细胞产生少量或低水平的IFN-。相比之下，脾细胞与辐射后的Renca-ESO细胞释放了更高水平的IFN-(Fig.3B)。CD8+T细胞活性检测，通过LDH释放试验进行评估，与对照组进行比较，相对Renca细胞，Renca-ESO细胞显示了非常高的细胞毒性(Fig.3C)。

接下来，我们进行体内CTL试验检测抗原特异性CD8+T细胞的细胞毒性。Renca-CA9细胞系，能够表达CA9抗体的Renca细胞系，曾被用作细胞疫苗。与对照组相比，Renca-CA9-ESO免疫小鼠显示出更强的靶细胞杀伤毒性(Fig3)，如数据中显示，通过CA9多肽得冲击，CFSEhigh脾细胞死亡率升高。这个结果与之前体外实验结果相吻合，它们共同表明，对于辐射后的肿瘤细胞，表面表达NY-ESO-1能够增强肿瘤细胞与T细胞之间的免疫应答作用。

细胞表面表达NY-ESO-1能够增强肿瘤疫苗效果并且增加TIL

为评价细胞表面表达NY-ESO-1细胞疫苗的潜在效果，我们对WT BALB/c小鼠每隔两天注射一次肿瘤疫苗，共注射三次(Fig.4A)，第一次注射疫苗在小鼠接种肿瘤细胞6天后进行。与为注射肿瘤疫苗组相比，接受肿瘤疫苗的所以实验组肿瘤生长速度都得到了明显的减缓(Fig.4B)。在接受肿瘤疫苗的实验组中，Renca-ESO实验组相对于Renca实验组和Renca-GFP实验组，肿瘤生长速度也明显的慢于后两者(Fig.4B)。

为确定在免疫小鼠体内使肿瘤生长减慢的T细胞亚型，在小鼠生长到30天时，分离小鼠肿瘤，进行机械剪碎，并对小鼠肿瘤进行侵润T细胞流式分析。相对于未处理小鼠，所有接受疫苗的小鼠显示出高比例的侵润CD4+和CD8+T细胞(Fig.4C)。在接受肿瘤疫苗的小鼠中，它们的CD4+T细胞比例无明显区别，CD8+T细胞有较大差别。Renca-ESO疫苗中CD8+T细胞比例明显高于其他疫苗(Fig.4C)。在分析相同大小肿瘤中的T细胞绝对数量时，我们发现，在这些实验组中，每毫克肿瘤含CD4+T细胞数量为600个。相比之下，每毫克肿瘤含CD8+T细胞数量，Renca-ESO组数量分别是Renca组和Renca-GFP组的2倍和1.5倍。因此，Renca-ESO疫苗抗肿瘤效果与侵润CD8+T细胞数量升高相关。

Renca-ESO疫苗能够通过减少MDSC和Treg增强抗肿瘤效果

癌症疫苗治疗的最佳效果，需要将抗肿瘤免疫应答的产生、肿瘤发展过程中的免疫逃逸和免疫耐受机制相互联系。在遭受肿瘤的动物或者癌症患者体内，大量的髓系抑制细胞(MDSC)和抑制性T细胞(Treg)堆积在骨髓、血液、脾脏和肿瘤位置。另外，CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)在肿瘤发生部位也能够产生免疫抑制的效果。因此，评估细胞表面表达NY-ESO-1是否对免疫抑制的发生有一定缓解作用。在经过之前的治疗方法治疗30天后，收集鼠源的脾细胞，用CD11b和Gr1染色MDSC(Fig.5A and5B)，CD4和FoxP3染色Treg(Fig.5C and5D)。没有肿瘤的小鼠CD11b+Gr1+MDSC百分比很低(1.8％)，接种肿瘤细胞但未接受疫苗的小鼠MDSC百分比明显升高(9.2％)。接受Renca疫苗(5.5％)和Renca-GFP(5.1％)肿瘤疫苗治疗的小鼠MDSC细胞百分比低于未接受肿瘤疫苗治疗的小鼠，接受Renca-ESO肿瘤疫苗治疗的小鼠显示出更低的MDSC百分比(3.6％)。类似的，Treg在没有肿瘤的小鼠体内百分比很低(1.8％)，但是在接种肿瘤但为接受肿瘤疫苗治疗的小鼠体内该百分比明显升高(9.6％)。不管怎样，接受Renca-ESO疫苗的小鼠体内Treg细胞百分比低于接受Renca疫苗和Renca-GFP疫苗的小鼠(分别为4.1％vs.5.8％and5.4％)。

经辐射的Renca-EOS疫苗疗法能够降低肺部肿瘤的转移

为评估这种改进的肿瘤细胞疫苗在抗肿瘤转移的效果，我们首先建立一个被大家公认的实验性肺转移模型。Renca细胞(2×10⁵)经过静脉输入BALB/c小鼠(Fig.6A)。六天后，这些小鼠开始接受经过辐射的肿瘤细胞疫苗的治疗，间隔2天进行下一次治疗，共进行3次治疗。在25-28天，摘取小鼠的肺，用墨汁(Fig.6B)和H&E(Fig.6C)染色；数出肺部白色小瘤数量(Fig.6D)。未接受肿瘤细胞疫苗治疗的小鼠肺部有大量的白色小瘤，接受Renca疫苗和Renca-GFP疫苗治疗的小鼠肺部白色小瘤数量明显减少，接受Renca-ESO疫苗治疗的小鼠肺部仅有少数白色小瘤。组织病理学分析确认，Renca-ESO疫苗降低肺部肿瘤转移的效果明显高于Renca疫苗和Renca-GFP疫苗。以上结果表明，肿瘤细胞表面表达NY-ESO-1能够增强肿瘤细胞疫苗降低肿瘤肺转移的效果。

本发明的技术特点为：

1)靶向性：“树突状细胞靶向的癌症免疫治疗技术“是一种针对树突状细胞的靶向型的肿瘤疫苗治疗新方法，体外体内针对性强，因此减少了细胞毒性。

2)平台性：虽然现阶段主要定向于肺癌和胃癌的术后治疗，但作为一个技术平台,它可以衍生出多种产品，也可用于乳腺癌，肝癌，结肠癌，鼻咽癌，头颈癌等的术后治疗。靶向肿瘤疫苗既可以提高恶性肿瘤病人的治愈率，减少转移和复发,也可以大幅度减轻因化疗、放疗而给病人带来的副作用。

3)价格在非靶向性癌症疫苗的1％以下：相比美国药监局刚刚通过的Provenge癌症疫苗(一个疗程9万4千美元)，我们的产品将更加针对中国人群，价格在其1％以下。

本发明的肿瘤疫苗以表达GM-CSF和在细胞表面表达NY-ESO-1的灭活肿瘤细胞为基础，将其与未成熟的树突状细胞共培养，达到激活树突状细胞的目的，使其成为成熟的细胞。在培养过程中，成熟的树突状细胞通过与灭活肿瘤细胞共培养，产生了特异性，回输到患者体内后，肿瘤疫苗能够激活患者体内B细胞与T细胞，使其攻击体内肿瘤细胞，从而达到杀死肿瘤细胞的效果。该项肿瘤疫苗还可以单独使用，或者与化疗药物搭配使用，在治疗多种肿瘤治疗甚至在预防肿瘤及其复发方面起到重要作用。

附图说明：

图1.Renca细胞表面表达NY-ESO-1分子降低了其致肿瘤性。

A,编译细胞表面分子NY-ESO-1的逆转录病毒载体图示。B,共聚焦显微镜观察免疫荧光染色图。抗HA抗体和Cy3二抗染色表达NY-ESO-1的Renca细胞(Renca-ESO)。DAPI对细胞核进行染色。C,对细胞表面表达NY-ESO-1(Renca-ESO，红色)和GFP(Renca-GFP,绿色)的Renca细胞进行流式分析，原代Renca细胞(黑色)作为阴性对照。D,用体外的细胞增殖实验评价Renca，Renca-GFP和Renca-ESO在指定时间点的生长率。数据为三次独立实验的平均值±标准方差。E,BALB/c小鼠(n＝5)，侧腹部进行皮下注射1×10⁶的Renca,Renca-GFP或Renca-ESO细胞，观察肿瘤的发展。三次独立实验得到了相似的结果。*P<0.05。

图2.细胞表面表达NY-ESO-1能够使机体内和离体培养的DC细胞活性增强。

A,在机体内，肿瘤细胞表面表达NY-ESO-1能够增强DCs的活性。对BALB/c小鼠(n＝3)进行后脚垫皮下注射1×10⁶的Renca,Renca-GFP或Renca-ESO细胞，3天后，腿弯部的淋巴结细胞被收集，与相应的抗体孵育染色后，进行流式细胞分析。非引流的对侧淋巴结细胞作为阴性对照。图示为CD11c阳性，同时CD86、CD80或MHC II阳性细胞的百分比。B,表面表达NY-ESO-1的肿瘤细胞能够诱导BMDCs成熟。将WT和TLR4-/-的BALB/c小鼠的未成熟BMDCs与Renca,RencaGFP或Renca-ESO共培养24小时。作为对照，其中两组BMDC分别加入10ng/mL LPS和5μg/mL CpG刺激培养24小时。用流式细胞术检测这些BMDC细胞CD86、CD80和MHCII的表达量来评价。平均荧光强度(MFI)作为指标(CD11c⁺门内细胞)。数据来自三次独立实验。*P<0.05。

图3.细胞表面表达NY-ESO-1能够增强肿瘤特异性CD8⁺T细胞免疫。

A,肿瘤细胞疫苗诱导的抗肿瘤CD8⁺T细胞免疫应答的研究计划。给正常BALB/c小鼠(n＝4)侧腹部内皮下注射两次1×10⁶被辐射(Ir.,35gray)过的Renca,Renca-GFP或Renca-ESO细胞，两次注射时间间隔为两周。第二次注射七天后，处死小鼠，分析小鼠体内抗肿瘤免疫应答。B,体外CTL实验。将未成熟的免疫小鼠脾细胞，以不同比率与作为靶细胞的活Renca细胞或NIH3T3细胞共培养，进行LDH释放实验，其中NIH3T3细胞为阴性对照。C,IFN-γ分泌实验。将辐射过的Renca或NIH3T3细胞与未成熟的免疫小鼠脾细胞刺激培养48小时，取细胞培养液上清，用ELISA方法检测IFN-γ分泌量。D和E,体内的CTL实验。对未成熟免疫小鼠进行静脉注射CA9多肽刺激，CFSE^high脾细胞(阳性)和未刺激的，CFSE^low脾细胞(阴性对照)以1:1的比率混合。收获脾细胞并进行流式细胞分析(D)。抗原特异性杀伤的百分比(E)。数据来自两个独立实验。*P<0.05。图4.细胞表面表达NY-ESO-1增强了肿瘤细胞疫苗的疗效和TIL的富集。

A,皮下肿瘤模型的肿瘤细胞疫苗疗效研究计划。将BALB/c小鼠(n＝5)右侧腹部皮下注射1×10⁶Renca细胞，肿瘤细胞接种六天后，小鼠(n＝5)不经过处理或从左侧腹部皮下注射2×10⁶经辐射的(ir,35gray)Renca,Renca-GFP或Renca-ESO细胞3次，每次注射间隔两天。第30天处死小鼠并分析TIL。B,接种疫苗小鼠体内肿瘤的生长曲线。C,未经处理的和接种疫苗的小鼠肿瘤内CD4⁺和CD8⁺T细胞的流式等高线图。D,未经处理的和接种疫苗的小鼠每毫克肿瘤内CD4⁺和CD8⁺T细胞的数量。两次独立实验得到相似结果。*P<0.05。

图5.Renca-ESO疫苗抗肿瘤疗效的增强与其能减少MDSC和Treg有关。

A和C，与图4相同，未经处理的和接种疫苗的小鼠的脾脏内MDSC和Treg的流式等高线图。B和D，未经处理的和接种疫苗的小鼠的脾脏内MDSC和Treg的细胞数量。数据来自两个独立实验。*P<0.05。

图6.基于肺转移模型的肿瘤治疗实验评价不同肿瘤细胞疫苗治疗肿瘤的抗肿瘤效果。

A,肺转移模型中肿瘤细胞疫苗疗效的研究计划。BALB/c小鼠通过尾静脉注射1×10⁵Renca细胞。肿瘤接种六天后，小鼠(n＝4)不被处理或使用2×10⁶辐射过的(ir,35gray)Renca,Renca-GFP或Renca-ESO细胞皮下注射3次，每次注射间隔两天。第25-28天处死小鼠并数出白色小瘤。B和C,各组肺转移的典型图片汇总(B)和H&E染色切片(C)。D,墨水染色肺部后肺部白色小瘤数量。两次独立实验得到了相似的实验结果。*P<0.05。

具体实施方式：

实施例1肾癌肿瘤疫苗的制备方法

1、首先，将1mL编码人类表面NY-ESO-1分子的逆转录病毒DNA质粒加入1-2x10⁶Phoenix细胞系统，同时加入DNA转染试剂LipofectamineLTX andPLUSReagents。转染24小时，收集悬浮细胞进行下一步操作。

2、复苏一支肾癌肿瘤细胞系，将其放入6孔板中，仅使用一孔，接种肿瘤细胞数量为1－1.5×10⁶cells。放入培养箱中培养(温度：37℃，CO₂浓度：5％)。

3、等肿瘤细胞饱和度(贴壁)为50％-70％时，将0.5mL逆转录病毒悬液和0.5mL新鲜培养液(混有浓度为8微克/mL的聚凝胺)加入肿瘤细胞中进行培养，培养16小时以后，换新鲜培养液，并保持细胞快速生成，不要满壁。

4、等将近90％满壁时，将转染NY-ESO-1的肿瘤细胞移入培养瓶中进行扩增培养，细胞转瓶过程中使用EDTA对贴壁肿瘤细胞进行消化，肿瘤细胞培养约5－10天，细胞数量生长到5×10⁷-1×10⁸。

5、用c-Myc对表面表达NY-ESO-1的活肿瘤细胞进行特异性标记，进行流式分选，使表达NY-ESO-1的肿瘤细胞纯度大于90％，细胞收集率为5％-15％。

6、对分选出的细胞进行进一步扩增，培养5－10天，细胞数量达到1×10⁸cells。

7、在六孔板中接种1－1.5×10⁶cells纯化扩增后的NY-ESO-1肿瘤细胞，其余细胞进行液氮保存。

8、将1mL编码人类表面GM-CSF分子的逆转录病毒DNA质粒加入1-2x10⁶Phoenix细胞系统，同时加入DNA转染试剂LipofectamineLTX and PLUSReagents。转染24小时，收集悬浮细胞进行下一步操作(同第一步一样，该步骤还需仔细修改，不过这次retrovirus已经做好)。

9、将0.5mL逆转录病毒悬液和0.5mL浓度为4微克/mL的聚凝胺加入肿瘤细胞中进行培养，添加前细胞一定处于快速生长期，且只有50％左右confluency，培养12小时。

10、用GM-CSF的ELISA试剂盒检测细胞上清液，最终保证二十四小时内每百万个肿瘤细胞分泌GM－CSF到达1ng/ml以上。如果不行，重复以上9－10步骤2-3次。

11、将上述细胞制成单细胞悬液，对其进行300Gy的辐照仪处理，得到灭活细胞。该灭活细胞可以单独使用，视肿瘤种类做皮下，静脉，或者淋巴节注射。也可做如下处理。

12、采集患者外周血，对外周血进行分离，得到外周血单个核细胞(PBMC)，并制成DC。

13、将灭活肿瘤细胞与DC进行共同培养，培养1天。

14、第2天，DC细胞经具体途径视肿瘤种类而定，回输给患者。

实施例2肝癌肿瘤疫苗的制备方法

1、首先，将1mL编码人类表面NY-ESO-1分子的逆转录病毒DNA质粒加入1-2x10⁶Phoenix细胞系统，同时加入DNA转染试剂LipofectamineLTX andPLUSReagents。转染24小时，收集悬浮细胞进行下一步操作。

2、复苏一支肝癌肿瘤细胞系，将其放入6孔板中，仅使用一孔，接种肿瘤细胞数量为1－1.5×10⁶cells。放入培养箱中培养(温度：37℃，CO₂浓度：5％)。

3、等肿瘤细胞饱和度(贴壁)为50％-70％时，将0.5mL逆转录病毒悬液和0.5mL新鲜培养液(混有浓度为8微克/mL的聚凝胺)加入肿瘤细胞中进行培养，培养16小时以后，换新鲜培养液，并保持细胞快速生成，不要满壁。

4、等将近90％满壁时，将转染NY-ESO-1的肿瘤细胞移入培养瓶中进行扩增培养，细胞转瓶过程中使用EDTA对贴壁肿瘤细胞进行消化，肿瘤细胞培养约5－10天，细胞数量生长到5×10⁷-1×10⁸。

5、用c-Myc对表面表达NY-ESO-1的活肿瘤细胞进行特异性标记，进行流式分选，使表达NY-ESO-1的肿瘤细胞纯度大于90％，细胞收集率为5％-15％。

6、对分选出的细胞进行进一步扩增，培养5－10天，细胞数量达到1×10⁸cells。

7、在六孔板中接种1－1.5×10⁶cells纯化扩增后的NY-ESO-1肿瘤细胞，其余细胞进行液氮保存。

8、将1mL编码人类表面GM-CSF分子的逆转录病毒DNA质粒加入1-2x10⁶Phoenix细胞系统，同时加入DNA转染试剂LipofectamineLTX and PLUSReagents。转染24小时，收集悬浮细胞进行下一步操作(同第一步一样，该步骤还需仔细修改，不过这次retrovirus已经做好)。

9、将0.5mL逆转录病毒悬液和0.5mL浓度为4微克/mL的聚凝胺加入肿瘤细胞中进行培养，添加前细胞一定处于快速生长期，且只有50％左右confluency，培养12小时。

10、用GM-CSF的ELISA试剂盒检测细胞上清液，最终保证二十四小时内每百万个肿瘤细胞分泌GM－CSF到达1ng/ml以上。如果不行，重复以上9－10步骤2-3次。

11、将上述细胞制成单细胞悬液，对其进行300Gy的辐照仪处理，得到灭活细胞。该灭活细胞可以单独使用，视肿瘤种类做皮下，静脉，或者淋巴节注射。也可做如下处理。

12、采集患者外周血，对外周血进行分离，得到外周血单个核细胞(PBMC)，并制成DC。

13、将灭活肿瘤细胞与DC进行共同培养，培养1天。

14、第2天，DC细胞经具体途径视肿瘤种类而定，回输给患者。

Claims (10)

1.一种治疗性肿瘤疫苗，由一种转基因肿瘤细胞系和DC细胞共同培养后制备得到；其中，所述转基因肿瘤细胞系是用逆转录病毒对肿瘤细胞进行转染得到的，具有在细胞内表达GM-CSF分子和/或在细胞表面表达NY-ESO-1分子的能力；所述在细胞内表达GM-CSF分子的能力通过病毒或者DNA质粒介导获得；所述在细胞表面表达NY-ESO-1分子的能力通过病毒或者DNA质粒介导获得；所述肿瘤细胞是从患者身上获得的活的肿瘤细胞，所述转染是将含有逆转录病毒的质粒和Phoenix细胞混合，其中加入DNA转染试剂得到含有逆转录病毒的Phoenix细胞上清液；然后再用该细胞上清液和肿瘤细胞混合培养得到转染逆转录病毒的肿瘤细胞；转染逆转录病毒的肿瘤细胞经过培养扩增，然后利用表面表达的NY－ESO－1分子进行流式细胞仪介导的肿瘤细胞纯化，对纯化后的细胞进行GM－CSF转染，得到可表达GM－CSF的纯化的转染逆转录病毒的肿瘤细胞系；所述制备是将所得可表达GM－CSF的纯化的转染逆转录病毒的肿瘤细胞进行灭活，得到灭活的可表达GM－CSF的纯化的转染逆转录病毒的肿瘤细胞；将该灭活的肿瘤细胞和DC细胞共同培养，得到细胞混合物，再经提取分离即得。

2.如权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的肿瘤细胞表达GM-CSF分子。

3.如权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的肿瘤细胞表面表达NY-ESO-1分子。

4.如权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于：所述的肿瘤细胞同时表达GM-CSF分子和表面NY-ESO-1分子。

5.如权利要求1所述的肿瘤疫苗，在制备转基因肿瘤细胞过程中，其特征在于：肿瘤细胞来源于病人本身的肿瘤体外培养细胞，异体的肿瘤培养细胞系，或者多个异体肿瘤培养细胞系混合。

6.如权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于实体瘤或者液体肿瘤可以通过病毒，或者DNA质粒介导达到表达GM-CSF和表面NY－ESO－1的作用。

7.如权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于肿瘤细胞包括胰腺癌，肺癌，胃癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，结肠癌，鼻咽癌，头颈癌。

8.如权利要求1所述的肿瘤疫苗，其特征在于疫苗制备过程需要通过细胞分选以达到90％以上的细胞表面NY－ESO－1表达效率。

9.权利要求1所述的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)使用Phoenix细胞系统产生逆转录病毒:首先，在六孔板中进行转染，将2微克编码人类GM-CSF或表面NY-ESO-1分子的逆转录病毒DNA质粒加入1-2x10⁶Phoenix细胞系统，同时加入DNA转染试剂LipofectamineLTXand PLUSReagents，转染24小时以后，收集悬浮细胞进行下一步操作；

2)使用逆转录病毒转染肿瘤细胞：在一个六孔板中，1x10⁶肿瘤细胞将被放在0.5mL逆转录病毒悬液和0.5mL浓度为4微克/mL的聚凝胺中悬浮培养；

3)纯化扩增转染的肿瘤细胞：以上基因工程转染的细胞能够通过流式细胞仪对抗癌基因抗体荧光染色的活细胞进一步分选，达到大于90％的纯度，之后，对分选出的细胞进行进一步扩增；

4)多次GM－CSF转染：在以上纯化的肿瘤细胞到达5x10⁶以后，进行多次GM－CSF病毒转染，同时检测细胞上清液，保证二十四小时内每百万个肿瘤细胞分泌GM－CSF到达3ng/ml以上；

5)灭活制备肿瘤疫苗：细胞系做成单细胞悬液经过300Gy的辐照仪照射，得到灭活细胞；

6)上述灭活细胞和DC细胞用细胞培养液共同培养，得到混合细胞悬液。

7)对混合细胞悬液进行纯化，分离，配制，制备成疫苗制剂。

10.权利要求1所述的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)首先，将1mL编码人类表面NY-ESO-1分子的逆转录病毒DNA质粒加入1-2x10⁶Phoenix细胞系统，同时加入DNA转染试剂LipofectamineLTX andPLUSReagents。转染24小时，收集悬浮细胞进行下一步操作，

2)复苏一支肿瘤细胞系，将其放入6孔板中，仅使用一孔，接种肿瘤细胞数量为1－1.5×10⁶cells。放入培养箱中培养，

3)等肿瘤细胞饱和度为50％-70％时，将0.5mL逆转录病毒悬液和0.5mL新鲜培养液加入肿瘤细胞中进行培养，培养16小时以后，换新鲜培养液，并保持细胞快速生成，不要满壁，

4)等将近90％满壁时，将转染NY-ESO-1的肿瘤细胞移入培养瓶中进行扩增培养，细胞转瓶过程中使用EDTA对贴壁肿瘤细胞进行消化，肿瘤细胞培养约5－10天，细胞数量生长到5×10⁷-1×10⁸，

5)用c-Myc对表面表达NY-ESO-1的活肿瘤细胞进行特异性标记，进行流式分选，使表达NY-ESO-1的肿瘤细胞纯度大于90％，细胞收集率为5％-15％，

6)对分选出的细胞进行进一步扩增，培养5－10天，细胞数量达到1×10⁸cells，

7)在六孔板中接种1－1.5×10⁶cells纯化扩增后的NY-ESO-1肿瘤细胞，其余细胞进行液氮保存，

8)将1mL编码人类表面GM-CSF分子的逆转录病毒DNA质粒加入1-2x10⁶Phoenix细胞系统，同时加入DNA转染试剂LipofectamineLTX andPLUSReagents，转染24小时，收集悬浮细胞进行下一步操作，

9)将0.5mL逆转录病毒悬液和0.5mL浓度为4微克/mL的聚凝胺加入肿瘤细胞中进行培养，添加前细胞一定处于快速生长期，且只有50％左右confluency，培养12小时，

10)用GM-CSF的ELISA试剂盒检测细胞上清液，最终保证二十四小时内每百万个肿瘤细胞分泌GM－CSF到达10ng/ml以上，

11)将上述细胞制成单细胞悬液，对其进行300Gy的辐照仪处理，得到灭活细胞。该灭活细胞可以单独使用，视肿瘤种类做皮下，静脉，或者淋巴节注射，

12)采集患者外周血，对外周血进行分离，得到外周血单个核细胞，并制成DC，

13)将灭活肿瘤细胞与DC进行共同培养，培养1天，

14)第2天，DC细胞经具体途径视肿瘤种类而定，回输给患者。