CN112702994A - 治疗性纳米颗粒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于优化细胞内核酸特别是mRNA的递送的方法和组合物。除了mRNA，该组合物，特别是纳米颗粒，可以包括糖脂抗原。还提供了与检查点抑制剂的组合。本发明的方法和组合物靶向抗原呈递细胞，并且特别用于免疫治疗和疫苗接种目的。

Description

治疗性纳米颗粒及其使用方法
技术领域
本发明涉及优化细胞内核酸，特别是mRNA递送的方法和组合物。除了mRNA，该组合物，特别是纳米颗粒，可以包括糖脂抗原。还提供了与检查点抑制剂的组合。本发明的方法和组合物靶向抗原呈递细胞，并且特别用于免疫治疗和疫苗接种目的。
背景技术
在由于信使RNA的不稳定性而长期限制其使用的地方，如今有可能在体内成功递送mRNA[1]。这得到了该领域的两个最新突破的有力支持：(i)mRNA分子在纳米颗粒中的包装，旨在改善mRNA的选择性细胞靶向和胞质传递[2,3]和(ii)mRNA构建体的技术进步，包括掺入修饰的核苷酸，产生更稳定的mRNA，并具有改善的翻译能力[4-7]。特别是在疫苗接种领域，mRNA编码的抗原已成为一种用途广泛的有前途的平台[8]。
在癌症免疫治疗领域，Kranz等人提供了第一个人类证据，即通过将mRNA脂质纳米颗粒靶向树突状细胞(DC)，可诱导针对所编码的肿瘤抗原的细胞毒性T细胞(CTL)反应[2]。他们和其他人证明，除了树突状细胞成功表达mRNA外，mRNA疫苗的作用方式还取决于I型干扰素(IFN)的诱导作用[3,9,10]。更具体地，细胞进入后，mRNA分子会触发先天性免疫激活途径，包括内体Toll样受体(TLR)-7和胞质受体MDA-5和RIG-1，这会导致I型IFN信号传导和诱导抗病毒免疫。在现有技术中，mRNA疫苗依赖于mRNA的这种固有的自佐剂作用。但是，这些疫苗具有重要的局限性，因为已显示I型IFN信号传导就像一把双刃剑，因为诱发的免疫应答过早地停止了mRNA翻译，从而降低了抗原的生物利用度[11,12]。此外，有人提出，I型干扰素取决于与T细胞引发的相对时机，可以对T细胞反应产生正向或负面影响，而I型IFN的预暴露会导致T细胞衰竭和凋亡[13,14]。此外，高水平的IFNα可以引起从流感样症状到自身免疫性后遗症甚至危及生命的事件[15,16]的不良反应。
mRNA构建体的几种修饰或其他纯化步骤(包括通过HPLC去除双链RNA片段)可能会下调mRNA分子的免疫刺激特性，从而导致I型干扰素水平降低。例如，掺入修饰的核苷酸(例如假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和5-甲基胞苷(5meC))可改善mRNA的稳定性和翻译，从而使mRNA表达水平更高，更可持续。由于增加的抗原呈递被证明对诱导长寿抗体和辅助性T细胞应答(包括形成滤泡T细胞)有益，因此这种增强的mRNA表达在疫苗的开发中具有优势[17]。然而，核苷修饰的mRNA在很大程度上失去了其自佐剂性，导致I型干扰素水平降低，并且引起CTL免疫力的能力有限。
先前的研究表明，脂质纳米颗粒可以同时包裹核苷修饰的mRNA和单磷酰脂质A(MPLA)，在不强烈诱导I型IFN的情况下，恢复了获得T细胞数量的能力[18]。然而，核苷修饰的mRNA和MPLA的这种组合策略对肿瘤生长没有显著影响，强调了I型IFN参与多种抗肿瘤机制(例如NK细胞的活化，调节性T细胞的减少)。
在使用纳米颗粒的基于肽和蛋白的癌症疫苗中也已经显示了佐剂的使用(例如WO2012/088414，WO2016/154544，WO2014/128225，US2011229556)。蛋白或蛋白纳米颗粒疫苗的发现仅在一定程度上有用，因为抗原在细胞内的位置、抗原的处理和呈递与mRNA疫苗完全不同。先前将mRNA与其他佐剂(例如Poly(I:C)和脂多糖)结合的尝试提出了相容性问题，因为DC成熟会过早地消除细胞摄取机制(例如巨胞饮作用)，并为mRNA翻译创造不利的环境[2,19]。仍然需要确定可以与核苷修饰的mRNA疫苗结合使用的适当和安全的免疫刺激剂，以调节其免疫原性，实现强大而持久的CTL反应。
除了与疫苗诱导的I型IFN分泌有关的问题外，mRNA疫苗通常不足以引起持久的抗肿瘤免疫力。从本质上讲，肿瘤浸润CTL必须处理各种抑制性细胞(包括M2巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞)介导的免疫抵抗[20]。此外，在免疫攻击和干扰素产生过程中，免疫检查点途径被激活为抵抗适应性免疫的机制，例如肿瘤细胞、抗原呈递细胞(APC)及其效应细胞上的PD-1受体的程序性细胞死亡1(PD-1)配体的表达[21-23]。因此，理想情况下，mRNA疫苗不应仅着眼于CTL的激活，而应更广泛地利用宿主的免疫系统来应对这些不同的抑制机制。
发明内容
本发明涉及与被配置用于治疗、预防或改善各种类型的疾病的与核酸结合(例如复合、缀合、包裹、吸收、吸附、混合)的纳米颗粒，使用所述纳米颗粒的方法及其合成方法。另外，本发明还提供了用于优化核酸的胞质递送的方法、组合物、试剂盒、组合及其用途。该组合物、试剂盒或组合包含纳米颗粒、核酸(特别是mRNA)和至少一种佐剂(特别是iNKT激动剂)。该组合物任选地包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂。
在一个实施方案中，纳米颗粒是与核酸结合或包括核酸的基于脂质的纳米颗粒和/或阳离子纳米颗粒，特别是阳离子脂质体。在另一个实施方案中，纳米颗粒的脂质组分包括脂质，更具体地是阳离子脂质(例如DOTAP)或可电离的脂质，以及一种或多种辅助脂质，例如磷脂，胆固醇或其(功能性)衍生物或类似物和/或PEG。纳米颗粒还与佐剂，特别是刺激免疫的佐剂，更特别是iNKT激动剂结合。更具体地，本发明的纳米颗粒包括mRNA、脂质组分和α-GalCer或其类似物。mRNA包括将修饰的核苷(例如假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和/或5-甲基胞苷(5meC))部分或完全掺入到mRNA转录物中。
在一实施方案中，将α-GalCer化合物掺入到纳米颗粒的脂质组分中。纳米颗粒中α-GalCer化合物的浓度为总脂质量(＜1μg/kg体重)的约0.0015mol％至约1mol％。纳米颗粒中胆固醇的浓度为总脂质量的40mol％至80mol％。纳米颗粒中DOTAP的浓度为总脂质量的20mol％至60mol％。
本文提供的mRNA编码目的抗原或多肽，特别是肿瘤特异性抗原。任选地，所述mRNA包括链终止核苷、polyA序列、聚腺苷酸化信号和/或5'帽结构。
在一个实施方案中，纳米颗粒中脂质组分与mRNA的wt/wt比为约5:1至约50:1。
在另一个实施方案中，本发明的纳米颗粒、组合物、试剂盒或组合用作药物，特别是在通过体外、离体或体内应用将药剂递送到树突状细胞的细胞溶胶中的方法中，尤其是用于治疗癌症、传染性疾病或自身免疫性疾病。
更具体地，本发明提供了一种用于向抗原呈递细胞，优选脾和肺中的抗原呈递细胞递送和/或表达抗原的方法，所述方法包括施用本文提供的纳米颗粒或组合物。在一个特定的实施方案中，抗原呈递细胞是树突状细胞或巨噬细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者中诱导免疫应答(优选针对癌症的免疫应答)的方法中使用的纳米颗粒或组合物，包括向受试者施用如本文所述的纳米颗粒或组合物。所述纳米颗粒或组合物能够在受试者中刺激、引发和/或扩增细胞毒性T细胞和/或iNKT细胞。
本发明进一步提供了诱导抗原在细胞中表达并诱导抗原特异性T细胞免疫应答的方法，该方法包括施用包括以下的组合物：
(a)至少一种核苷修饰的mRNA，其至少一部分编码抗原；和
(b)呈递在CD1d分子中的糖脂抗原，其刺激iNKT细胞；和
(c)包括核苷修饰的mRNA的脂质纳米颗粒；和
(d)任选地本文提供的或技术人员已知的PD-1或PD-L1抑制剂或其他检查点抑制剂，
其中施用所述组合物后，由mRNA编码的抗原在靶细胞中表达，和/或从细胞分泌或排出，糖脂抗原由同一靶细胞呈递在CD1d途径中。
iNKT细胞对糖脂的识别引发了免疫级联反应，其特征是产生IFN-γ和IL-12p70，从而导致受试者的细胞毒性T细胞和/或iNKT细胞和/或NK细胞引发和/或扩增。
在一个实施方案中，本发明的纳米颗粒或组合物以两次、三次或更多次(后续)剂量施用于受试者，例如每周两次、每周至少一次或每两周一次。施用可以是静脉内、皮内、皮下、腹膜内、气管内、鼻内或通过吸入。
在一个特定方面，目的多肽在哺乳动物细胞中表达或产生。在另一方面，本发明提供了将mRNA递送至细胞(例如，哺乳动物细胞)的方法，该方法包括向受试者(例如，哺乳动物)施用纳米颗粒组合物，该纳米颗粒组合物包括(i)脂质组分、(ii)mRNA和(iii)iNKT细胞激动剂，其中给药包括使细胞与纳米颗粒组合物接触，从而将mRNA和糖脂抗原递送至细胞。
特别感兴趣的是本文提供的纳米颗粒或组合物与PD-1或PD-L1抑制剂或其他检查点抑制剂(例如抗CTLA4、抗PD-L2等)(例如抗体、小分子、多肽或核酸，尤其是抗PD-1或抗PD-L1抗体)的组合和联合使用(在本发明的方法中；在第一和进一步的医学用途中)。该组合在治疗癌症、传染性疾病或自身免疫性疾病中特别有用。
本发明进一步包括一种试剂盒，其包括第一容器，第二容器和包装插页，其中第一容器包括至少一个剂量的包括本文提供的纳米颗粒的药物组合物，第二容器包括至少一个剂量的包括本文所述的检查点抑制剂的药物组合物，并且包装插页包括使用所述药物组合物治疗患有例如癌症、传染性疾病或自身免疫性疾病的个体的说明。
附图说明
具体参考附图，应当注意，所示出的细节是作为示例并且出于对本发明的不同实施方案的说明性讨论的目的。附图说明使本领域技术人员清楚如何在实践中体现本发明的几种形式。
图1.全身施用(i)含有低剂量α-GalCer(每只小鼠约0.020μgα-GalCer)的OVA编码的核苷修饰的纳米颗粒后，相对于(ii)MPLA辅助的mRNA纳米颗粒(每只小鼠约2μg MPLA)，携带E.G7-OVA肿瘤的小鼠的治疗效果。用E.G7-OVA淋巴瘤细胞(3×105细胞)皮下接种小鼠。携带E.G7-OVA肿瘤的小鼠在第8天(当肿瘤清晰可见时)静脉内施用mRNA纳米颗粒，并在接种肿瘤后第12天进行第二次疫苗接种(n＝6)。
图2.DOTAP-胆固醇相对于用于mRNA递送的其他脂质制剂的转染效率。(A)在将细胞与包装在DOTAP-胆固醇-，DOTAP-DOPE，DC-胆固醇-DOPE或脂质体(lipofectamine)
Figure BDA0002976992610000051
RNAiMAX纳米颗粒(使用未经修饰的mRNA)中的mRNA孵育24小时后，增强绿色荧光蛋白(eGFP)转染的BM-DC的百分比。在无血清培养基
Figure BDA0002976992610000052
和含血清培养基(5％HycloneTMFetalClone ISerum)中进行转染。基于CD11c表面染色对DC进行选择(gated)。
图3.mRNA纳米颗粒的理化特性。(A)以增加的N/P比分散在HEPES缓冲液中的mRNA纳米颗粒(1μg mRNA的剂量)的大小(Z平均值)、多分散指数(PdI)和zeta电位。(B)分散在HEPES缓冲液中，或在人血清中于37℃孵育2h、6h和24h后，以2.5：1的N/P比对mRNA纳米颗粒(Cy5标记的mRNA)进行大小分析(通过fSPT)。
图4.mRNA Galsome促进α-GalCer向树突状细胞的递送。(A)与BM-DC孵育24小时后评估，与裸α-GalCer相比，在mRNA Galsome中配制的FITC标记的α-GalCer的细胞递送增强。(B)在mRNA Galsome中与α-GalCer孵育24小时后，BM-DC增强了CD1d复合物中α-GalCer的表面呈递(各图显示了三个独立实验的代表性数据(n＝3))。(C)相对于与裸α-GalCer或单独修饰的mRNA的共培养物相比，用包装有不同糖脂抗原的纳米颗粒转染的脾细胞和BM-DC的共培养物(24h)的上清液显示出更高的IFN-γ水平。(D)剂量反应实验：静脉内注射含有剂量逐渐降低的α-GalCer的mRNA Galsome 12小时后，C57Bl/6小鼠血清中的IFN-γ生产。
图5.mRNA Galsome的全身施用可在肺和脾中导致有效的mRNA转染。(A)静脉内注射纳米颗粒6小时后，C57Bl/6小鼠中fLuc mRNA的全身表达水平，所述纳米颗粒中含有不同货物(cargos)；未经修饰的、核苷修饰的或用α-GalCer配制的核苷修饰的mRNA纳米颗粒(n＝6-7，来自两个独立实验)(B)分离器官(肺、脾和肝)的代表性生物发光图像。
图6.通过不同的给药途径向C57Bl/6小鼠施用包括编码fLuc的mRNA的DOTAP-胆固醇纳米颗粒：静脉内、腹膜内、鼻内或气管内给药。如图所示，取决于给药途径，使用了不同的mRNA剂量和/或mRNA修饰。图显示了施用mRNA纳米颗粒6小时后小鼠的代表性生物发光图像。
图7.含有低剂量α-GalCer(20ng)的mRNA Galsome在体内诱导树突状细胞成熟。(A)施用mRNA Galsome 24小时后(n＝4)，脾DC(CD11c高群体)显示激活标志物CD40、CD86和CD80的表达增加(表示为MFI的倍数变化)。(B)CD40、CD86和CD80表达的代表性直方图。
图8.含有低剂量α-GalCer(20ng)的mRNA Galsome刺激免疫刺激性细胞因子的释放。注射后6h收集血清样品，并筛选炎性细胞因子的释放：未经修饰的mRNA纳米颗粒触发IFN-γ的产生，而mRNA Galsome诱导不同的细胞因子反应，包括IFN-γ、IL-4、IL-12p70、IL-27、IL-17a、IL-6和TNF-α。数据来自至少两个独立的实验。
图9.与包装有未经修饰的mRNA的纳米颗粒相比，mRNA Galsome介导优异的抗原特异性CD8+T细胞应答。(A)α-GalCer强烈介导抗原特异性CD8+T细胞反应的诱导。用OVA mRNA纳米颗粒免疫小鼠。6天后，使用H-2kb OVA四聚体染色测量脾中OVA特异性CD8+T细胞的百分比。(B)OVA特异性CD8+T细胞的代表性流式细胞术散点图。
图10.mRNA Galsome的全身给药导致iNKT和NK细胞的扩增。(A)注射mRNA Galsome三天后，与未治疗的小鼠相比，脾和肝显示出增大的iNKT细胞数量。(B)脾和肝中iNKT细胞的代表性流式图(flow plot)(TCRβ+、mCD1d PBS-57+细胞)。(C)NK细胞(CD3-、NK1.1+细胞)的下游激活。该图中的数据(n＝6)来自两个独立的实验。
图11.E.G7-OVA淋巴瘤中OVA mRNA Galsome或未经修饰的mRNA纳米颗粒的治疗性疫苗接种。用E.G7-OVA淋巴瘤细胞(3×105细胞)皮下接种小鼠。当肿瘤清晰可见时，在第8天给携带E.G7-OVA肿瘤的小鼠接种疫苗。图显示了未经治疗的对照组以及用OVA mRNAGalsome或未经修饰的OVA mRNA纳米颗粒治疗的小鼠(n＝7-8)随时间变化的Kaplan–Meier存活曲线和相应的肿瘤生长曲线(A和B)。
图12.B16-OVA黑色素瘤模型中OVA mRNA Galsome或未经修饰的mRNA纳米颗粒的治疗性疫苗接种。用B16-OVA淋巴瘤细胞(3×105细胞)皮下接种小鼠。携带B16-OVA的小鼠在第8天、第12天和第16天接受了3次疫苗接种。图表显示了未经治疗的对照组以及用OVAmRNA Galsome或未经修饰的OVA mRNA纳米颗粒治疗的小鼠(n＝7-8)随时间的变化的Kaplan-Meier存活曲线以及相应的肿瘤生长曲线(A和B)。
图13.mRNA Galsome的治疗性疫苗接种导致效应细胞的肿瘤浸润。在第14天处死接受了两次疫苗接种的携带B16-OVA的小鼠，并评估CD8+T细胞(A)和OVA特异性CD8+T细胞(B)，iNKT细胞(C)和NK细胞(D)的浸润。
图14.mRNA Galsome的治疗性疫苗接种可积极影响B16 OVA黑色素瘤中的抑制性髓样细胞，但激活PD-1/PD-L1途径。(A)在肿瘤部位存在MDSC(CD11b+、GR1+、MHC-II-)和(B)M1极化TAM(CD11b+、F4/80+、MHC-II+)(n＝8，来自两个独立实验)。(C)mRNA Galsome在肿瘤细胞(CD45-)和APC(CD45+、CD11c+)(n＝5)上诱导PD-L1表达。(D)在第14天(加强免疫后两天)(n＝6-8，来自两个实验)或在第21-33天之间的较晚时间当肿瘤体积达到1000mm3(n＝5)时评估肿瘤浸润的CD8+T细胞的PD-1表达。CD8+T细胞在肿瘤部位显示更高的PD-1表面表达水平。在最初用mRNA Galsome攻击3天后测量(n＝8，来自两个实验)，脾中活化的iNKT细胞表现出增加的PD-1表达。
图15.在用mRNA Galsome刺激后，利用抗PD-L1抗体的检查点抑制作用防止诱导iNKT无反应性。为了评估iNKT无反应性，初次接种的小鼠(naive mice)接受了两次后续的mRNA Galsome暴露，第一次和第二次给药间隔5天。(A)图表显示在第一次和第二次施用mRNA Galsome以及同种型或抗PD-L1抗体后6小时收集的血清中IFN-γ的产生。条显示平均值±SD(n＝4)。(B)每次接种3天后测量的脾细胞中iNKT细胞(TCRβ+，mCD1d PBS-57+细胞)的百分比。(C)分别在第一次治疗6小时后和第二次治疗3天后测量的脾DC(CD11c+细胞)上的PD-L1表达和iNKT细胞上的PD-1表达(n＝4)。
图16.mRNA Galsome结合抗PD-L1抗体改善了携带B16-OVA黑素瘤的小鼠的治疗效果。小鼠皮下接种B16-OVA黑色素瘤细胞(5×105细胞)，并在第8天当肿瘤清晰可见时接种疫苗。为此，在单一疗法中携带B16-OVA的小鼠为腹膜内施用100μg大鼠IgG2b抗体(同种型对照)或抗PD-L1抗体，或在联合疗法中与mRNA Galsome一起施用。图(A)显示了每种治疗的平均肿瘤生长曲线和(B)Kaplan–Meier存活曲线，表明抗PD-L1抗体与mRNA Galsome(n＝6-8)之间具有协同作用。箭头指示治疗日期。
图17.抗PD-L1抗体与mRNA Galsome或编码相关肿瘤抗原TRP-2的未经修饰的mRNA纳米颗粒的联合疗法。小鼠皮下接种B16F0黑色素瘤细胞(5×105细胞)，并在第8天当肿瘤清晰可见时接种疫苗。在单一疗法中携带B16F0的小鼠腹膜内施用100μg大鼠IgG2b抗体(同种型对照)或抗PD-L1抗体，或在联合疗法中与Galsome或未经修饰的含有编码TRP-2的mRNA纳米颗粒一起施用。图显示了每种治疗的平均肿瘤生长曲线(n＝6)。箭头指示治疗日期。
图18.接种mRNA Galsome和αGC类似物后，iNKT细胞和抗原特异性CTL的增殖。(A)在接种含有αGC或不同αGC类似物(即NU-αGC、PyrC-αGC或OCH)的mRNA Galsome 3天后，分析C57BL/6小鼠的脾中iNKT细胞的存在。(B)使用SIINFEKL-H2Kb四聚体染色，在接种小鼠的脾中鉴定了OVA特异性CD8+T细胞(第7天)。(C)PD-1在iNKT细胞上的表达。通过单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey事后检验(Tukey’s post hoc test.)，进行了与αGC相比的统计分析。(**，p＜0.01，***，p＜0.001；****，p＜0.0001，n＝3)。
图19.用含有经典αGC或αGC类似物的mRNA Galsome在B16-OVA黑色素瘤模型中进行的治疗性疫苗接种。小鼠皮下接种B16-OVA细胞(3×105细胞)。携带B16-OVA的小鼠在第8天进行了疫苗接种，并在第15天接受了加强免疫接种。(A)图显示了未经治疗的对照组(阴性对照)和用含αGC或αGC类似物(即NU-α-GC、PyrC-α-GC或OCH)(n＝5-6)的OVA mRNAGalsome治疗的小鼠的肿瘤生长曲线(直到中位生存时间点)，(B)显示了各自的中位生存天数。
图20.由“可离子化”脂质制剂(即Dlin-MC3-DMA/DSPC/胆固醇/PEG-DMG)组成的mRNA Galsome的表达和免疫原性。向C57BL/6小鼠施用与fLuc mRNA和tOVAI80 mRNA共配制的MC3 mRNA Galsome，并将翻译活性和免疫效果与先前描述的DOTAP/胆固醇mRNA Galsome进行比较。(A)施用MC3 mRNA Galsome 6h后，小鼠中fLuc mRNA表达的代表性生物发光图像。(B)用DOTAP-与MC3 mRNA Galsome免疫接种6天后测得的iNKT细胞和OVA特异性CTL的脾百分比。(C)在注射后6小时收集血清样品，并筛选炎性细胞因子的释放。
发明详述
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，将更详细地定义本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合，除非清楚地相反地指出。如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。举例来说，“化合物”是指一种化合物或多于一种的化合物。在本说明书的整个说明书和权利要求书中，单词“包括(comprise)”和该单词的其他形式，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，是指包括但不限于，并且不打算排除例如其他添加剂、组件、整数或步骤。如本文所使用的，“约”，“大约”，“基本上”和“显著”将被本领域普通技术人员理解，并且在使用它们的上下文中将在某种程度上变化。如果在给定使用上下文的情况下存在对本领域普通技术人员而言不清楚的术语的使用，则“约”和“大约”将表示特定值或术语的正负10％。上面描述的术语以及说明书中使用的其他术语对于本领域技术人员来说是众所周知的。本说明书中引用的所有参考文献和具体参考的教导均通过引用整体并入本文。
本发明涉及靶向抗原呈递细胞，诱导mRNA表达并引起适当的免疫应答的mRNA递送系统。令人惊讶地发现，通过仅将少量的iNKT细胞激动剂掺入递送系统的脂质组合物中，就产生了有效的抗原特异性T细胞免疫应答以及平衡的细胞因子应答和iNKT/NK细胞活化。与现有技术相反，该平台允许mRNA构建体可以被最佳地设计以获得用于抗原识别的改进的表达水平。
我们在本文中证明了将核苷修饰的mRNA与糖脂α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)或其功能类似物结合使用，可为(癌症)免疫疗法提供独特的特性。更具体地说，α-GalCer是一种众所周知的糖脂抗原，当由MHC-1样分子CD1d中的抗原呈递细胞呈递时，会导致恒定自然杀伤T细胞(iNKT)的有效活化。非常规T细胞的这一子集有助于先天和适应性免疫，但也可以发挥直接和间接的抗肿瘤作用。与直接触发危险途径的经典免疫佐剂不同，α-GalCer通过呈递α-GalCer的DC与iNKT细胞之间的双向相互作用发挥间接佐剂作用。这样，iNKT细胞可以通过CD40与CD40配体之间的相互作用激活被mRNA转染的APC，从而引起细胞因子(例如IL-12p70，IFN-γ)的产生和共刺激受体(例如CD80、CD86和CD70)的表达。
在本发明中，显示了核苷修饰的mRNA与iNKT配体的组合，例如α-GalCer化合物(以非常低的浓度掺入)不仅可以促进T细胞免疫，而且还具有激活NKT和NK细胞从而形成更广泛且协同的抗肿瘤免疫的优势。
在本发明中，核苷修饰的mRNA与iNKT配体的组合极大地改变了疾病介导的免疫抑制机制。本质上，本发明减少了具有免疫抑制表型的MDSC和巨噬细胞的数量和功能。
本发明可以诱导保护性免疫应答，通过将疫苗平台与最新的免疫疗法(例如检查点抑制剂)组合可以进一步增强所述保护性免疫应答。
在一个实施方案中，本发明涉及一种纳米颗粒，其包括核苷修饰的mRNA、脂质组合物和iNKT细胞激动剂，特别是糖脂抗原，例如α-GalCer或其功能类似物或衍生物。
在一个实施方案中，mRNA被掺入到纳米颗粒中，特别是阳离子纳米颗粒中。如本文所用，术语“纳米颗粒”可以被广义地解释，并且是指用作另一种物质例如药物，特别是核酸，更特别是mRNA的运输模块的载体。目前正在研究纳米颗粒在例如药物递送中的用途，其直径大小的范围为5-1000nm，特别是约5-约500nm，更特别是约50-约400nm。特别地，纳米颗粒的大小使得它能够被哺乳动物细胞，特别是抗原呈递细胞，例如树突状细胞吸收。术语“阳离子纳米颗粒”是指包括嵌入芯部或表面的阳离子剂的纳米颗粒。当纳米颗粒被用于络合作为治疗剂的核酸时，带正电荷的纳米颗粒被认为与带负电荷的DNA/RNA分子发生静电相互作用，这不仅有利于治疗剂的络合，而且可以保护后者免于酶促降解。
在一个实施方案中，阳离子剂可以是聚阳离子剂，例如但不限于壳聚糖，肽(例如聚(L-赖氨酸))，肽衍生物(例如聚(L-赖氨酸)-棕榈酸)，聚乙烯亚胺，聚(酰胺基乙烯亚胺)和聚(酰胺基胺)。特定的聚阳离子试剂是聚合物，优选为多糖，更优选为葡聚糖，其被反应性(甲基)丙烯酸酯部分官能化，随后与阳离子(甲基)丙烯酸酯单体共聚合，所述阳离子(甲基)丙烯酸酯单体为例如2-氨基乙基甲基丙烯酸酯、2-(二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、2-N-吗啉基乙基甲基丙烯酸酯、2-(叔丁基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯或[2-(甲基丙烯酰氧基)-乙基]三甲基氯化铵。
在另一个实施方案中，本发明的纳米颗粒是包括脂质组分的载体，也称为脂质复合物(lipoplex)制剂或基于脂质的纳米颗粒，并且包括固体脂质纳米颗粒、脂质体和胶束。本发明特别考虑使用基于脂质的纳米颗粒以促进核酸，尤其是mRNA向靶细胞的递送。所述纳米颗粒的双层膜通常由两亲性分子形成，例如包括空间上分离的亲水和疏水结构域的合成或天然来源的脂质。基于(脂质)的纳米颗粒的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合物体(polymerosome)、囊泡(niosome)等)形成。合适的脂质的实例包括例如磷脂酰化合物(例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂类和神经节苷脂类)。
在本发明的上下文中，基于脂质的纳米颗粒通常用于将核酸，例如mRNA，运输至靶细胞。并入的核酸可以完全或部分位于颗粒的内部空间中，在颗粒的双层膜内或与颗粒膜的外表面结合。核酸与纳米颗粒的结合在本文中也称为“包裹”，其中核酸完全掺入到颗粒中。该颗粒保护核酸免受可能包括酶或化学物质的环境的影响，并允许包裹的核酸到达靶细胞。
尽管纳米颗粒可以促进将核酸引入靶细胞，但是如本文所提供的作为共聚物的聚阳离子的添加可以促进并且在某些情况下显著提高转染效率。
在另一个实施方案中，脂质组分是或包括阳离子脂质，即基于脂质的纳米颗粒可通过包括使用一种或多种阳离子脂质(任选地与非阳离子脂质和PEG修饰的脂质)的不同比例的多组分脂质混合物来制备。通常包括阳离子脂质以允许带负电荷的DNA/RNA分子的静电络合，并且可以根据氨基的pKa粗略地细分为(i)“永久带电荷的脂质”，例如DOTMA，DOTAP和DC-胆固醇，或(ii)“pH依赖性可电离脂质”，例如D-Lin-MC3-DMA和类脂质分子C12-200。术语“阳离子脂质”和“氨基脂质”在本文可互换使用，以包括具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和pH可滴定的氨基头基(例如烷基氨基或二烷基氨基头基)的那些脂质及其盐。文献中已经描述了几种阳离子脂质，其中许多是可商购的。用于本发明的组合物和方法的特别合适的阳离子脂质包括1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”，N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]–N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”，5-羧基精氨酰基甘氨酸双十八烷基酰胺或“DOGS”，2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-羰酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵或“DOSPA”，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”。可电离的脂质的pKa<7，在生理pH条件下具有中性至轻度阳离子电荷。当脂质在低于所述pKa的pH值(例如pH 4)下带正电荷时，在头基(headgroup)中具有伯、仲或叔胺的所述可电离的阳离子脂质已经开发用于包封核酸以及在生理pH值下接近中性的LNP。相对于永久带电荷的脂质，这提供了某些好处，其中最重要的是，可电离的脂质与降低的毒性和延长的血液循环寿命有关。预期的阳离子或“可电离的”阳离子脂质还包括1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”，1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”，1,2-二亚油基氧基(linoleyloxy)-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”，三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯或“DLin-MC3-DMA”或“MC3”，2,2-二亚油基(dilinoleyl)-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环或“DLin-KC2-DMA”或“KC2”，1,2-二亚麻基氧基(linolenyloxy)-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”，N-二油基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”，N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”，N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”，3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式，顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”，2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式，顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”，N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺或“DMOBA”，1,2-N,N'-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”，2,3-二亚油酰氧基(dilinoleoyloxy)-N,N-二甲基丙胺或“DLinDAP”，1,2-N,N′-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”，1,2-二亚油酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-XTC2-DMA”。
纳米颗粒中阳离子脂质的浓度为总脂质量的15mol％至65mol％，特别是20mol％至60mol％，并且更特别是35mol％至45mol％。
在本发明的特定实施方案中，在载体中使用阳离子脂质1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷或“DOTAP”。DOTAP可以单独配制，也可以与中性脂质或其他阳离子或非阳离子脂质组合制成脂质体转移载体或脂质纳米颗粒，此类基于脂质的纳米颗粒可用于增强核酸向靶细胞的递送。在一个特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒的脂质组分不包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
在另一个实施方案中，本文提供的纳米颗粒包括胆固醇。更特别地，纳米颗粒的脂质组分包括脂质，特别是阳离子脂质，更特别是DOTAP，与胆固醇的组合。在当前实施例中已经显示所述颗粒在血清中特别稳定。纳米颗粒的脂质组分包括40mol％至80mol％的胆固醇。特别地，纳米颗粒中胆固醇的浓度为总脂质量的55mol％至65mol％。
本发明还考虑使用基于胆固醇的阳离子脂质。此类基于胆固醇的阳离子脂质可以单独或与其他阳离子或非阳离子脂质组合作为纳米颗粒脂质组分的一部分。合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括，例如，DC-胆固醇3β-[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇，1,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪或ICE。作为胆固醇的替代物，可以使用其他结构的脂质或类似物，例如选自由以下各项组成的组的的脂质：粪甾醇(fecosterol)、谷甾醇(sitosterol)、麦角甾醇、菜油甾醇(campersterol)、豆甾醇、菜子甾醇、番茄碱、熊果酸和α-生育酚。
本发明的纳米颗粒可以在尺寸，表面电荷和任何靶向部分(例如，抗体、肽、叶酸、碳水化合物(例如甘露糖、半乳糖或GalNAc)、氟哌啶醇、茴香酰胺和强心苷类等)的附着方面进行定制。此外，可以用能够维持纳米颗粒胶体稳定性，减少非特异性相互作用和被免疫系统识别的聚(乙二醇)(PEG)或相关聚合物或部分修饰纳米颗粒表面。
通常，本发明的纳米颗粒适合与遗传物质一起用作(治疗)药剂。该药剂可以被纳米颗粒包裹，或者可以附着至纳米颗粒的一个或多个表面以形成缀合物。用于将药剂包裹在纳米颗粒内部的合适方法是技术人员已知的，并且包括静电络合、共价偶联、疏水相互作用、被动加载、远程加载、盐析、纳米沉淀、乳液扩散、溶剂蒸发、喷雾干燥和乳液聚合。通常，可以根据用于制造纳米颗粒的材料和所选择的药剂来调整此类方法，该调整将在技术人员的能力范围内。
在一个特定的实施方案中，遗传物质是核酸，包括(质粒)DNA，RNA，信使RNA(mRNA)，DNA反义寡核苷酸，RNA反义寡核苷酸，形成三链体的寡核苷酸，转录因子诱骗寡核苷酸，小的非编码RNA(例如siRNA，dsiRNA或miRNA)和长的非编码RNA。
特别优选的是纳米颗粒和mRNA的复合物，以及更特异性的mRNA纳米颗粒。mRNA可以是天然或非天然存在的mRNA。mRNA可以包括一个或多个修饰的核碱基、核苷或核苷酸。mRNA的核碱基是有机碱基，例如嘌呤或嘧啶或其衍生物。核碱基可以是规范碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶)或包括一个或多个取代或修饰的非规范或经修饰的碱基，所述取代或修饰包括但不限于烷基、芳基、卤素、氧代、羟基、烷氧基和/或硫代取代；一个或多个稠环或开环；氧化和/或还原。
mRNA可以包括5'非翻译区、3'非翻译区和/或编码或翻译序列。任选地，mRNA包括茎环、链终止核苷、polyA序列、聚腺苷酸化信号和/或5'帽结构中的一个或多个。
mRNA可以包括任何数量的碱基对，包括数十、数百或数千个碱基对。任意数量(例如，全部、部分或没有)的核碱基、核苷或核苷酸可以是规范种类的类似物，可以被取代、修饰或以其他方式非天然存在。在一个特定的实施方案中，mRNA被修饰。本发明的mRNA的取代和修饰可以通过众所周知的或本领域技术人员熟知的方法进行。
如本文所用，“修饰的”是指非天然的。即，mRNA可以包括一个或多个非天然存在的核碱基、核苷、核苷酸或接头。在所述实施方案中，mRNA可包括至少一种修饰，其赋予核酸增加的或增强的稳定性，包括例如改善的对体内核酸酶消化的抗性。如本文所用，术语“修饰”和“修饰的”这样的术语与本文所提供的核酸有关，包括至少一种改变，这种改变优选地增强稳定性并使得mRNA比mRNA的野生型或天然存在的形式更稳定(例如，对核酸酶消化有抗性)。如本文所用，术语“稳定的”和“稳定性”这样的术语与本发明的核酸有关，尤其是与mRNA有关，是指对例如通常能够降解此类mRNA的核酸酶(即，核酸内切酶或核酸外切酶)引起的降解具有增加的或增强的抗性。增加的稳定性可以包括，例如，对靶细胞或组织内的内源酶(例如，核酸内切酶或核酸外切酶)或条件引起的水解或其他破坏的敏感性降低，从而增加或增强此类mRNA在靶细胞、组织、受试者和/或细胞质中的停留(residence)。与本发明的mRNA相关的术语“修饰”和“修饰的”这样的术语也涵盖改善或增强mRNA核酸翻译的改变，包括例如包括在蛋白质翻译的启动中起作用的序列(例如，Kozac共有序列)。
在另一个实施方案中，本发明的mRNA已进行化学或生物学修饰以使其更稳定。对mRNA的示例性修饰包括碱基的缺失(例如，通过缺失或通过一个核苷酸被另一核苷酸取代)或碱基的修饰，例如碱基的化学修饰。如本文所用，短语“化学修饰”包括引入不同于天然存在的mRNA中所见化学的修饰，例如共价修饰，例如引入修饰的核苷酸(例如核苷酸类似物，或包括在此类mRNA分子中无法自然发现的侧基(pendant group))。
另外，合适的修饰包括密码子的一个或多个核苷酸的改变，使得该密码子编码相同的氨基酸，但是比在mRNA的野生型形式中发现的密码子更稳定。例如，已证明RNA的稳定性与较高数量的胞苷(C's)和/或尿苷(U's)残基之间存在反比关系，并且发现缺乏C和U残基的RNA对大多数核糖核酸酶(RNase)稳定[30]。在一些实施方案中，mRNA序列中C和/或U残基的数量被降低。在另一个实施方案中，通过将编码特定氨基酸的一个密码子替换为编码相同或相关氨基酸的另一个密码子来降低C和/或U残基的数量。术语修饰还包括，例如，将非核苷酸键或修饰的核苷酸掺入到本发明的mRNA序列中(例如，对编码功能性分泌的蛋白质或酶的mRNA分子的3'和5'端之一或二者的修饰)。此类修饰包括向mRNA序列添加碱基(例如，包括聚A尾巴或更长的聚A尾巴)，改变3'UTR或5'UTR，使mRNA与试剂复合(例如，蛋白质或互补核酸分子)，以及包括改变mRNA分子结构(例如，形成二级结构)的元素。
在一个特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒包括修饰的mRNA，更具体而言是核苷修饰的mRNA，其中将天然存在的修饰核苷酸以部分(至少10％)并直至完全取代(例如10-100％，20-100％，30-100％，40-100％，50-100％等)的方式掺入到mRNA转录物中。优选的核苷酸是假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和/或5-甲基胞苷(5meC)。通过使用核苷修饰的mRNA，可以减少TLR3、TLR7和TLR8对细胞内mRNA的识别，从而使mRNA变得“免疫沉默”并避免I型干扰素的释放。此外，核苷酸修饰可以使RNA对酶促降解更具抗性。但是，这会伴随RNA的自我佐剂作用的丧失，从而影响DC激活和T细胞引发。在本发明中，我们证明了掺入少量的iNKT激动剂，更特别是α-GalCer或类似物，既确保了高抗原表达又确保了强大的免疫激活作用，但没有强烈诱导I型IFN。
在一个实施方案中，本发明涉及一种基于阳离子和/或脂质的纳米颗粒，其中可以使本文提供的核苷修饰的mRNA和佐剂例如iNKT激动剂都可被复合。如本文所用，术语“复合的”包括佐剂与纳米颗粒或在纳米颗粒中的缀合、包裹、附着或偶联。术语“混合”是指溶解、分散或悬浮在纳米颗粒中的佐剂。通过本领域技术人员熟知的方法或本文提供的方法，将iNKT激动剂与纳米颗粒缔合、共价偶联或掺入/包裹在纳米颗粒中。例如，可以将iNKT激动剂掺入到本文提供的基于脂质的纳米颗粒的水性核(aqueous core)和/或脂质膜中，iNKT激动剂可以是脂质或聚合物胶束制剂的一部分，或者iNKT激动剂可以施加到聚合物纳米颗粒(如聚合物缀合物，聚合物基质纳米颗粒和固体聚合物纳米颗粒)中。
纳米颗粒组合物中mRNA的量可以取决于mRNA的大小、序列和其他特征。纳米颗粒组合物中mRNA的量还可取决于纳米颗粒组合物的大小、组成、所需靶标和其他特征。mRNA和其他元素(例如脂质)的相对量也可以变化。在一个实施方案中，纳米颗粒组合物中脂质组分与mRNA的wt/wt比可以为约1：1至约100：1。例如，脂质组分与mRNA的wt/wt比可以为约5:1至约50:1。纳米颗粒组合物中mRNA的量可以例如使用荧光光谱法(例如，荧光相关光谱法)来测量。在一些实施方案中，可以选择一种或多种mRNA、脂质及其量以提供特定的N：P比。组合物的N：P比是指一种或多种脂质中的氮原子与mRNA中磷酸基团数目的摩尔比。可选择一种或多种mRNA、脂质及其量以提供约1：2至约6：1的N：P比，例如1：2、1：1、2：1、3：1，4：1、5：1和6：1，特别是大约1：1至3：1。
在另一个实施方案中，mRNA编码任何目的多肽或抗原，包括任何天然或非天然存在的或以其他方式修饰的多肽或肽表位。由mRNA编码的多肽可以具有任何大小，并且可以具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，当在细胞中表达时，由mRNA编码的多肽可以具有(间接)治疗作用。在另一个实施方案中，本发明的方法包括用编码抗原的核酸，特别是RNA，更特别是mRNA装载或转染纳米颗粒。如本文所用，“抗原”不限于本发明。在一个实施方案中，抗原选自由以下各项组成的组：肿瘤抗原、肿瘤相关抗原、癌-睾丸抗原、突变组(mutantome)衍生抗原，(致癌的)病毒抗原、细菌抗原、酵母抗原、寄生抗原和真菌抗原。本发明的纳米颗粒制剂证明高转染效率提高了适当剂量的mRNA将被递送至靶细胞的可能性，同时使潜在的(全身性)不利影响最小化。
可以通过技术人员已知的任何方法来制备包括mRNA的纳米颗粒，例如通过乙醇稀释，脂质膜水合或通过使用微流体装置。制备本发明的负载mRNA的基于脂质的纳米颗粒的示例性方法包括以下步骤：(1)将适量的脂质溶解在氯仿中，(2)添加适量的iNKT激动剂，(3)蒸发氯仿并在缓冲液中再水化所得脂质，(4)通过超声处理或挤压减小所得脂质颗粒的大小，(5)与mRNA混合。
如本文所用，“iNKT细胞激动剂”具有本领域的一般含义，是指源自脂质的任何衍生物或类似物，其通常在CD1d环境中由抗原呈递细胞(APC)呈递并且可以激活iNKT细胞，即以特定方式促进iNKT细胞产生细胞因子。在一个具体的实施方案中，根据本发明的iNKT细胞激动剂是糖脂抗原，例如α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer；(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-N-己糖酰基-2-氨基-1,3,4-十八碳三醇)，通用名称KRN7000，是一种agelasphin衍生物。如本文所用，术语“α-半乳糖基神经酰胺化合物”或“α-GalCer化合物”具有本领域的一般含义，包括衍生自糖鞘脂的功能性衍生物或类似物，所述糖鞘脂包括通过α-键连接至神经酰胺脂质的半乳糖碳水化合物，所述神经酰胺脂质具有酰基和可变长度的鞘氨醇链。功能性类似物或衍生物保留了激活iNKT细胞的能力。各种出版物已经描述了α-GalCer化合物及其合成。α-半乳糖基神经酰胺的功能性衍生物或类似物提供于例如WO2014001204(通过引用并入并且具体参考公开的化合物NU-αGC、PyrC-αGC和OCH)、WO201379687和WO2013162016。iNKT细胞激动剂的示例包括：HS44，BbGL-II，苏糖醇神经酰胺，ABX196，PBS-25，PBS-57，α-C-GalCer，OCH，Naphtylureum-α-GalCer或NU-α-GalCer，α-GalCer-6”-(4-吡啶基)氨基甲酸酯或PyrC-α-GalCer，(3S，4S，5R)-1-(6”-O-(4-吡啶基氨基甲酰基)-α-C-D-半乳糖基-吡喃糖基)-3-二十六烷基氨基-十九烯-4,5-二醇，(3S，4S，5R)-1-(6”-O-(4-吡啶基氨基甲酰基)-α-C-D-半乳糖基-吡喃糖基)-3-二十六烷基氨基-1-十九烯-4,5-二醇，(3S，4S，5R)-1-(6”-naphtureido-6”-脱氧-α-C-D-半乳糖基-吡喃糖基)-3-二十六烷基氨基-十九烯-4,5-二醇，(3S，4S，5R)-1((6”-naphtureido-6”-脱氧-α-C-D-半乳糖-吡喃糖基)-3-二十六烷基氨基-1-十九烯-4,5-二醇，α-1C-GalCer或7DW8-5。α-GalCer化合物可以通过技术人员已知的方法化学合成。在本发明的特定实施方案中，将α-GalCer化合物掺入到本文提供的纳米颗粒的脂质组分中。
引人注目的是，在本发明的用途和方法中，iNKT细胞激动剂，特别是纳米颗粒，比溶液中相同的激动剂的效力高约3-5倍。与现有技术的mRNA疫苗相比，特别是由未经修饰的mRNA组成的脂质纳米颗粒，在本发明中可获得4-5倍数量的抗原特异性T细胞。iNKT细胞激动剂，特别是α-GalCer化合物，更特别是α-GalCer在纳米颗粒中的浓度为总脂质量的0.0015mol％至1mol％，特别是0.0015mol％至0.5mol％，更特别是0.0015mol％至0.25mol％，甚至更特别是0.0015mol％至0.15mol％。
短语“激活iNKT细胞”或“诱导iNKT免疫应答”具有相似的含义，例如是指观察到的细胞因子产生的诱导，例如α-GalCer化合物在iNKT细胞中诱导的IFN-γ。iNKT细胞产生的细胞因子(例如IFN-γ)的分析可以通过本文提供的方法进行，也可以使用载有αGalCer或衍生物(例如PBS-57)的CD1d四聚体通过流式细胞术进行。
组合物/制剂
本发明进一步提供了一种药物组合物、制剂或递送系统，其包括本文提供的纳米颗粒，即，包括遗传物质，例如mRNA和iNKT细胞激动剂，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。
例如，(药物)组合物可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，例如但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、制粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体载体、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油和防腐剂。还可以包括赋形剂，例如蜡、黄油、着色剂、涂布剂、调味剂和芳香剂。药学上可接受的赋形剂是本领域众所周知的(参见例如Remington的The Science and Practice ofPharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)。
药学上可接受的赋形剂可以是固体(例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂)、凝胶或液体。用于口服和肠胃外给药的液体赋形剂的合适实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物、以及油(例如分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外给药，赋形剂也可以是油酸酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体赋形剂可用于肠胃外给药的无菌液体形式组合物中。液体药物组合物是无菌溶液或悬浮液，可通过例如皮下、结节内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和肌肉内注射来使用。在一个实施方案中，将组合物冻干。
为了支持医学作用，即特别是免疫应答，在本发明的实施方案中，药物组合物还可以包括其他活性化合物，其中可以同时或连续施用。例如，通过通过激活补体系统作为期望的副作用而具有更好作用的某些抗肿瘤药物，或者通过减少剂量而降低这些药物的副作用数量，可以产生根据本发明的药物组合物的治疗作用。这样，本文公开的用途和方法还可包括本文所述的纳米颗粒或组合物与一种或多种其他(治疗)药剂一起用于治疗疾病的用途。在一个实施例中，所述治疗药剂选自化学治疗剂、生物治疗剂、免疫原性剂、免疫刺激性细胞因子和用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞。活性成分的组合可以是：(1)在本发明的纳米颗粒中，例如，掺入另外的mRNA；(2)以联合制剂共同配制和同时施用或递送；(3)以单独的制剂(例如通过交替、后续或并行)递送；或(3)通过本领域已知的任何其他组合治疗方案。当在交替疗法中递送时，本文所述的方法可以包括依次例如在分开的溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂或胶囊中，或通过在分开的注射器中的不同注射剂顺序地施用或递送活性成分。通常，在交替疗法期间，将有效剂量的每种活性成分依次地，即连续地施用，而在同时疗法中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。也可以使用各种顺序的间歇性联合疗法。在某些情况下，本文公开的化合物与第二治疗剂一起施用和/或配制。
在一个具体的实施方案中，第二治疗剂或药剂可以是化学治疗剂或免疫治疗剂中的一种或多种。用于本文公开的联合疗法中的特异性免疫治疗剂包括所谓的“检查点抑制剂”。在过去的几年中，除了基于溶瘤病毒的治疗概念外，免疫肿瘤学领域已成为抗击癌症的一种有价值的方法。最新的激活治疗性抗肿瘤免疫力的有效方法之一是对免疫检查点的封锁。免疫检查点是指硬连接到免疫系统的多种抑制途径，这些途径对于维持自我耐受以及调节外周组织中生理免疫反应的持续时间和幅度以最大程度地减少附带组织的损害来说至关重要。现在很明显，肿瘤选择某些免疫检查点途径作为免疫抵抗(特别是针对对肿瘤抗原具有特异性的T细胞)的主要机制。因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，所以它们很容易被抗体阻断或被重组形式的配体或受体调节。一个重要的免疫检查点受体是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4；也称为CD152)，它可以下调T细胞活化的幅度。已批准的抗CTLA4抗体的名称是“伊匹单抗(ipilimumab)”，并由Bristol Myers Squibb(BMS)以商标名称
Figure BDA0002976992610000211
出售。另一个重要的免疫检查点受体是程序性细胞死亡蛋白1(PD1)，可限制组织内的T细胞效应子功能。人源化单克隆抗体派姆单抗(Pembrolizumab)(也称为MK-3575或Merck Sharp Dohme销售的
Figure BDA0002976992610000212
MSD)针对靶标PD-1。另一种抗PD1抗体是纳武单抗(nivolumab)(Bristol Myers Squibb销售的
Figure BDA0002976992610000213
BMS)。因此，在特定的实施方案中，检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂或拮抗剂，其特异性结合CTLA-4。在另一个实施方案中，检查点抑制剂是PD-1和CTLA-4双特异性分子。这样的双特异性分子能够特异性结合存在于衰竭和耐受的肿瘤浸润淋巴细胞和其他细胞类型的表面上的PD-1和CTLA-4分子。
在一个特定的实施方案中，检查点抑制剂是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抑制剂或程序性死亡配体(PD-L1)或(PD-L2)抑制剂。术语“抑制剂”或“拮抗剂”是指任何削弱此类细胞表面分子响应其各自配体的能力的化学化合物或生物分子，即阻断癌细胞上表达的PD-L1与免疫细胞(T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1结合和/或阻断癌细胞上表达的PD-L2与免疫细胞表达的PD-1结合的化合物或分子。PD-1及其配体的替代名称或同义词包括：针对PD-1的PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；针对PD-L1的PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；针对PD-L2的PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在一个实施方案中，PD-1抑制剂阻断人PD-L1与人PD-1的结合，并且优选阻断人PD-L1和PD-L2两者与人PD-1的结合。人PD-1氨基酸序列可在NCBI位置编号:NP005009中找到。人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可分别在NCBI位置编号：NP054862和NP079515中找到。
在一个实施方案中，所述抑制剂包括抗体及其抗原结合片段。或者，可以使用PD-1或PD-L1(2)结合部分或拮抗剂，其包括多种不同类型的分子，包括分别特异性结合PD-1或PD-L1(2)的分子。此类配体包括小分子、多肽(例如融合蛋白)或核酸(适体、siRNA、shRNA等)等。
术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、人抗体、以及抗原结合抗体片段和具有抗原结合功能的分子。更特别地，术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白，其具有通过二硫键连接的四个多肽链(两个重(H)链和两个轻(L)链)。术语“抗体”还包括PD-1或PD-L1(2)结合抗体片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段、结构域抗体(dAb)、重链抗体(hcAb)、小抗体、骆驼科动物重链抗体的可变结构域(VHH或
Figure BDA0002976992610000221
)、新抗原受体的可变结构域(VNAR)和工程化CH2结构域(纳米抗体)。也可以使用具有抗体样特征的肽和支架，例如单链反平行卷曲蛋白(α体(alphabodies))。活性片段可以通过多种本领域已知技术从抗体衍生。例如，纯化的单克隆抗体可以用诸如胃蛋白酶的酶裂解，并进行HPLC凝胶过滤。然后可以收集合适的含有Fab片段的级分，并通过膜过滤浓缩。抗PD-L1和抗PD-1抗体及其制备方法是本领域已知的。
抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体能够特异性结合PD-1或PD-L1(2)。这样的抗体是可商购的或可以通过技术人员通常已知的方法来产生。示例性的抗PD-L1抗体是阿特珠单抗(Atezolizumab)(Roche出售的
Figure BDA0002976992610000222
)或阿维单抗(Avelumab)(默克出售的
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)。抗PD-L1抗体阻断了其与受体PD-L1的结合以及PD-L1的激活，这可以增强T细胞介导的对肿瘤的免疫应答，并逆转慢性感染疾病中的T细胞失活。PD-L1在造血组织和薄壁组织中广泛表达。
至关重要的是，药物组合物包括作为活性化合物的有效量的纳米颗粒和/或其分散体以及药学上可耐受的助剂。术语“有效量”或“有效剂量”在本文可互换使用，表示对疾病或病理变化具有预防或治疗相关作用的药物活性化合物的量。“预防作用”可以防止疾病的发作，甚至可以防止病原体进入个体代表后的感染，从而大大减少其后续传播甚至完全灭活。“治疗相关作用”摆脱一种或多种疾病症状或导致与疾病或病理变化相关或因果相关的一种或多种生理或生化参数部分或完全逆转至正常状态。用于施用根据本发明的纳米颗粒的相应剂量或剂量范围足够大，以实现诱导免疫应答的所需预防或治疗效果。另外，该组合物可用作主要治疗或初始治疗之外的“辅助治疗”，以使其在治疗环境中的效果最大化，或用作初始治疗后的“维持”或“巩固”治疗，以最大化疾病控制并延迟疾病的复发。
通常，剂量将随着患者的年龄、体质和性别而变化，并且将考虑疾病的严重程度。另外，给药的具体剂量、频率和持续时间还取决于多种因素，例如纳米颗粒的靶向和结合能力、待治疗个体的营养习惯、给药类型、排泄率以及与其他药物的组合。既可以针对原发疾病也可以针对任何并发症的发生调整个体剂量。精确剂量可以由本领域技术人员使用已知的手段和方法来确定。本发明的该教导对于包括纳米颗粒和/或其分散体的药物组合物是有效的并且可以不受限制地应用，只要看起来合适即可。
应用
本发明提供本文提供的纳米颗粒、组合物或组合的第一医学用途和进一步的医学用途。
本发明的纳米颗粒、组合物和方法提供了核酸，特别是mRNA的递送，以治疗多种疾病。特别地，本发明的纳米颗粒和/或纳米颗粒分散体适用于疾病的预防或治疗，所述疾病选自癌症、传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏以及慢性或急性炎症过程的组。
如本文所使用的，术语“传染性疾病”是指由病原微生物剂(包括病原病毒、病原细菌、真菌、原生动物或多细胞寄生虫)的存在引起的任何类型的临床上明显的疾病。
本发明还涉及用于免疫预防或免疫疗法的根据本发明的纳米颗粒和组合物。本发明还涉及有效量的根据本发明的纳米颗粒在制备用于免疫预防或免疫疗法的疫苗中的用途。
一方面，本发明涉及开发(治疗性)疫苗，该疫苗通过递送如本文提供的编码肿瘤抗原的mRNA并使用如本文所述的纳米颗粒引起针对癌症的适应性免疫应答。
所公开的组合物和方法对于治疗癌症特别有用，例如，抑制癌症的生长，包括完全的癌症缓解，抑制癌症的转移，以及促进抗癌性。在本发明的上下文中，术语“癌症”是指由恶性肿瘤引起的任何类型的疾病。术语“癌症生长”通常是指暗示癌症改变为更严重形式的多种指数中的任何一种。因此，用于测量对癌症生长的抑制的指标包括但不限于癌细胞存活率的降低，肿瘤体积或形态的降低(例如，如使用计算机断层扫描(CT)，超声检查或其他成像方法所确定的)，延迟的肿瘤生长，肿瘤血管的破坏，改善的迟发性超敏反应皮肤试验的性能，溶细胞性T淋巴细胞活性的增加以及肿瘤特异性抗原水平的降低。术语“抗癌性”是指受试者抵抗癌症生长，特别是已经具有的癌症生长的能力提高。换句话说，术语“抗癌性”是指受试者中癌症生长的倾向降低。
一方面，癌症包括实体瘤，例如癌和肉瘤。癌包括源自上皮细胞的恶性肿瘤，其浸润例如侵袭周围组织并引起转移。腺癌是源自腺组织或形成可识别的腺结构的组织的癌。另一类广泛的癌症包括肉瘤和纤维肉瘤，它们是其细胞包埋在诸如胚胎结缔组织的纤维状或均质物质中的肿瘤。
本发明进一步提供了通过向患有癌症的受试者施用本发明的纳米颗粒或组合物来降低或抑制患有癌症的受试者的肿瘤生长、癌细胞侵袭或转移的方法，其中以足以降低受试者的肿瘤生长、癌细胞侵袭或转移的量施用所述纳米颗粒。在一个特定的实施方案中，癌细胞选自由以下组成的组：乳腺癌细胞、结肠癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、皮肤癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、直肠癌细胞、胃癌细胞、甲状腺癌细胞和子宫癌细胞。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括治疗受试者的淋巴结中的转移性癌症，其中将纳米颗粒或组合物施用于患有转移性癌的受试者的淋巴结中。
在另一方面，纳米颗粒或组合物可用于将抗原递送和/或表达至抗原呈递细胞(优选脾和肺中的抗原呈递细胞)的方法，和/或用于在受试者中诱导免疫应答(优选针对癌症的免疫应答)的方法，所述方法包括向受试者施用根据本发明的纳米颗粒或组合物。
如本文所用，“抗原呈递细胞”是指可被诱导向T细胞呈递抗原的任何细胞，其还包括可分化并活化为抗原呈递细胞的前体细胞。抗原呈递细胞包括树突状细胞、朗格汉斯细胞、PBMC、巨噬细胞、B淋巴细胞或其他活化或修饰的细胞类型，例如上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞，其在细胞表面表达MHC分子，但优选包括树突状细胞，特别是淋巴结的树突状细胞。抗原呈递细胞的前体包括CD34+细胞、单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞。
如本文所用，术语“受试者”是指施用了本发明的组合物和方法的任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、啮齿类动物等。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中针对人类受试者可互换使用。
施用
一种施用途径是静脉内施用。另外，可以使用任何标准施用途径(包括口、直肠、阴道、透粘膜、肺部(包括气管内或吸入)或肠内施用)；肠胃外递送(包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射)将纳米颗粒或包括纳米颗粒的组合物递送给患者。
在一个特定的实施方案中，施用是通过静脉内(推注(bolus)或输注)或腹膜内注射，或通过吸入或气管内或鼻内施用。
或者，本发明的组合物可以以局部而不是全身的方式给药，例如，通过将药物组合物直接注射到靶组织或肿瘤中，例如以缓释制剂的形式。取决于要靶向的组织，可以用各种方式影响局部递送。例如，可以吸入含有本发明组合物的气雾剂(用于鼻，气管或支气管递送)；例如，可以将本发明的组合物注射到损伤、疾病表现或疼痛的部位；可以以锭剂形式提供组合物，用于口服、气管或食道施加；可以以液体、片剂或胶囊剂形式提供，用于施用于胃或肠，也可以以栓剂形式提供，用于直肠或阴道施加；甚至可以通过使用乳霜、滴剂甚至注射剂将其输送到眼睛。甚至可以通过外科手术方式施用含有与治疗性分子或配体复合的本发明组合物的制剂，例如与可以使组合物从植入部位扩散到周围细胞的聚合物或其他结构或物质结合。或者，它们可以在不使用聚合物或支撑物的情况下通过外科手术来施加。
施用可以采取单剂量施用的形式，或者本文公开的组合物可以在一段时间内以分次剂量或以连续释放制剂或施用方法(例如泵)施用。应该选择所施用的组合物的量和所选择的施用途径以允许有效治疗疾病状况。在一个实施方案中，将本发明的纳米颗粒或组合物每天一次，每天两次，每天或每隔一天施用给受试者。在一个优选的实施方案中，将本发明的组合物每周两次，每周、每十天、每两周、每三周、或更特别地每四周一次，每月、每六周、每八周、每隔一个月、每三个月、每四个月、每六个月、每八个月、每九个月或每年一次施用给受试者。
本发明的组合或组合物可以用于治疗、改善、降低疾病风险或预防疾病的单一疗法中。或者，所述组合物或组合物可以用作已知疗法的辅助或与已知疗法组合，所述已知疗法可用于治疗、改善、降低疾病风险或预防疾病。
本文描述的所有特征(包括任何所附权利要求，摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任意组合(除了这些特征和/或步骤中的至少一些是互斥的那些组合)与上述方面中的任一方面组合。通过以下附图、表格和实施例将进一步描述本发明，这些附图，表格和实施例无意于限制权利要求中限定的保护范围。
具体实施方式
材料和方法
细胞培养和小鼠
从Envigo(Gannat,法国)购买雌性C57BL/6小鼠(6周龄)，并安置在SPF设施中。所有动物实验均根据比利时法律规定进行，并得到当地伦理委员会的批准。如Verbeke等人(2017)所述，产生了原代鼠骨髓来源的DC(BM-DC)培养物。
在补充了10％FBS，100U ml-1青霉素，100μg ml-1链霉素，2mm l-谷氨酰胺和0.4mg/ml选择剂G418(赛默科技，阿尔斯特，比利时)的RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich,Diegem,比利时)中，在5％CO2湿润气氛中在37℃培养小鼠黑色素瘤细胞系B16-OVA(由麻省大学医学院的K.Rock提供)和T细胞淋巴瘤E.G7-OVA(获自美国菌种保藏中心,Rockville,MD,USA)。
mRNA构建体
编码萤火虫荧光素酶(fLuc)的未修饰的和核苷修饰的(5meC，Ψ)mRNA以及编码eGFP的mRNA购自TriLink(San Diego,CA)。为了进行免疫研究，通过从pGEM-Ii80tOVA质粒中进行体外mRNA转录，生产出与恒定链(Ii80)的前80个氨基酸融合的截短形式的卵清蛋白(tOVA)[24]。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，芬洛(Venlo)，荷兰)纯化质粒，并使用Spe I限制性酶(Promega，Leiden，荷兰)线性化。线性化的质粒用作使用T7 MegaScript试剂盒进行体外转录反应的模板，该试剂盒包括抗反向帽类似物(ARCA)和聚(A)加尾试剂(Ambion,Life Technologies,根特，比利时)。为了经修饰mRNA的转录，将胞苷和尿苷核苷酸100％替换为5-甲基胞苷和假尿苷(TriLink)。通过DNase I消化来纯化得到的mRNA，用LiCl沉淀并用70％乙醇洗涤。通过测量260nm处的吸光度确定mRNA浓度。将mRNA以1μgμl-1的浓度保存在-80℃下的小等分试样中。Karine Breckpot教授和Kris Thielemans教授友情提供了编码鼠酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)的mRNA。TRP-2被称为B16黑色素瘤细胞表达的肿瘤相关抗原[34]。
mRNA脂质纳米颗粒制备
DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)和胆固醇购自Avanti Polar Lipids(Alabaster,USA)。α-半乳糖基神经酰胺(ɑ-GalCer)，奈基尿(Naphtylureum)-α-GalCer(NU-α-GalCer)，α-GalCer-6”-(4-吡啶基)氨基甲酸酯(Pyr-α-GalCer)，(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-半乳糖吡喃糖基)-N-二十四烷酰基-2-氨基-1,3,4-壬烷三醇(OCH)和FITC标记的ɑ-GalCer由S.Van Calenbergh(根特大学，根特，比利时)提供。通过将溶解于氯仿中的适量脂质转移至圆底烧瓶中，制备DOTAP-胆固醇(摩尔比为2：3)的阳离子脂质体。对于使用α-GalCer配制的脂质体，用α-GalCer或提供的类似物代替总脂质量的0.5mol％、0.15mol％、0.015mol％或0.0015mol％。在氮气下蒸发氯仿，然后在HEPES缓冲液(20mM，pH 7.4，Sigma-Aldrich)中将脂质膜重新水化，最终脂质浓度为12.5μmol ml-1。将所得阳离子脂质体在浴超声仪(Branson Ultrasonics，Dansbury，USA)中超声处理直至分散液变澄清。然后将其与mRNA混合获得mRNA纳米颗粒，阳离子脂质与mRNA(N/P)的比例为3。在含有5％葡萄糖的等渗HEPES缓冲液(Sigma-Aldrich)中制备用于体内使用的mRNA纳米颗粒。
如前所述[31]，在R.van der Meel的实验室中制备了由“可电离的”氨基脂质DLin-MC3-DMA组成的mRNA脂质纳米颗粒。简而言之，将适当的脂质(Dlin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇，PEG-DMG和α-GalCer)溶解在乙醇中，使最终脂质的总浓度为10mM。将mRNA货物溶解在25mM乙酸钠pH 4缓冲液中。接下来，使用T型结混合器[32]将两种溶液在阳离子(氨基)脂质与mRNA(N/P)的比为3的情况下混合(水溶液(mRNA)和有机溶液(脂质)的流速比为3：1)。将所得混合物用PBS(pH7.4)透析过夜，最后通过0.22μm的过滤器。使用Quant-iTTMRiboGreenTMRNA分析试剂盒(Thermo-Scientific)测量mRNA LNP中的总mRNA量，以计算用于小鼠研究的mRNA LNP剂量。在一种LNP制剂中，将fLuc mRNA和tOVAI80 mRNA(50:50)结合在一起。
mRNA脂质复合物的理化特性
使用Malvern Zetasizer nano-ZS(Malvern Instruments Ltd,Worcestershire,UK)，对在HEPES缓冲液中以不同N/P比制备的mRNA纳米颗粒进行大小和Zeta电位质量控制。为了检查mRNA与脂质体的络合以及在含血清的培养基中这种相互作用的稳定性，将mRNA纳米颗粒稀释并在50％FCI血清或50％人血清中孵育。在37℃下孵育2h后，添加Ambion上样缓冲液(Ambion)，并将混合物上样至TBE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶中，并向其中添加GelRed(Biotium，Hayward，CA)以显示mRNA。该凝胶在100V下运行30分钟，并在UV光下成像。将仅包括(未包装，即所谓“裸露”的)mRNA，仅包括血清或包括血清以及裸露的mRNA的样品作为对照。包括具有在0.25kb至10kb范围内的条带的分子量标记，以测定RNA的大小(Promega，Leiden，荷兰)。
为了预测血清中mRNA纳米颗粒的胶体稳定性，将含有Cy5标记的mRNA的纳米颗粒在90％的人血清中于37℃孵育24小时。随后，通过荧光单粒子追踪(fSPT)显微镜对它们的尺寸分布进行评估。fSPT可以监测荧光标记的纳米颗粒在生物流体中的扩散[25]。通过记录单个运动粒子的高速共聚焦电影，可以可视化单个粒子的运动轨迹，并可以计算它们的尺寸分布。对mRNA纳米颗粒的fSPT测量如下进行：首先，将20μl Cy5标记的mRNA纳米颗粒在人血清中稀释(1:25)，并在37℃下孵育2小时、6小时或24小时，然后将5μl加入到45μl人血清中。然后将样品转移到涂有黑色涂层的96孔板上，并置于配备了Plan Apo 60x 1.0NA油浸物镜(Nikon)以及快速灵敏的EMCCD相机(Ixon Ultra 897；Andor Technology,CT，USA)的扫场(swept-field)共聚焦显微镜(LiveScan扫场共聚焦显微镜系统；Nikon,Brussels，比利时)上。将显微镜聚焦在孔板底部上方20μm处，并用固态125mW 640nm(AgilentTechnologies，CA，USA)的激光器激发Cy5标记的mRNA纳米颗粒。对于每个样本，在样本内的不同随机位置记录了20个大约100帧的电影。
利用BM-DC对mRNA转染、α-GalCer递送和α-GalCer呈递的体外评估
在细胞培养的第6天，在BM-DC上进行体外实验。转染前一天，将细胞以每孔5x105个细胞接种到24孔板中，并在含5％FCI血清的细胞培养基中生长。通过使用eGFP报告mRNA评估mRNA脂质复合物的转染效率。为了在
Figure BDA0002976992610000291
中进行转染，去除细胞培养基，将分散在
Figure BDA0002976992610000292
中的eGFP mRNA脂质复合物添加到细胞中(每5x105个细胞1μg mRNA)，孵育2小时后，将细胞在含5％FCI血清的培养基中重新培养。为了递送α-GalCer，将含有0.5mol％α-GalCer的mRNA纳米颗粒直接添加到完整细胞培养基中的细胞中(每5x105个细胞1μg mRNA)。使用标记有共价偶联的FITC染料(由S.Van Calenbergh提供)的α-GalCer评估α-GalCer的细胞摄取。为了评估α-GalCer在细胞表面CD1d复合物中的呈递，用对α-GalCer-CD1d复合物具有特异性的单克隆抗体(克隆L363，eBioscience)对BM-DC细胞进行了表面染色。加入mRNA纳米颗粒(fLuc mRNA)24小时后进行流式分析。收集细胞并用PBS洗涤，根据制造商的说明用可固定的活力染料
Figure BDA0002976992610000301
(eBioscience)染色，与Fc阻断剂(CD16/32)孵育以阻断非特异性FcR结合(BD Biosciences，Erembodegem，比利时)，并在4℃下对CD11c-APC(克隆N418)和α-GalCer：CD1d复合物-PE进行30分钟的表面染色。小鼠IgG2akappa PE抗体用作α-GalCer：CD1d呈递的同种型对照。在额外的洗涤步骤之后，使用CytoFLEX(Beckman Coulter,Krefeld,德国)，通过流式细胞术分析细胞，并使用FlowJo软件(FlowJo,OR,USA)进行分析。使用Nikon C1si共聚焦激光扫描模块记录细胞的共聚焦显微镜图像，该模块安装在配备有Plan Apo 60x 1.0 NA油浸物镜(Nikon)的机械化NikonTE2000-E倒置显微镜(Nikon Benelux,Brussels,比利时)上。
mRNA纳米颗粒和抗PD-L1抗体的施用
在通风的麻醉室中用含3％异氟烷的氧气对小鼠进行麻醉。注射前，将含有无菌0.9％NaCl溶液的聚乙烯管导管(Intramedic PE10，BD)插入尾静脉。正确放置后，缓慢注入稀释在无菌5％葡萄糖HEPES缓冲液中的带有指示货物的纳米颗粒(每只小鼠200μl，含10μgmRNA)。基于细胞因子的产生和iNKT激活确定的纳米颗粒包裹的α-GalCer的最佳剂量为每只小鼠20ng(0.015mol％)。以100μg的剂量，腹膜内施用抗PD-L1抗体(10F.9G2，Bio X细胞，West Lebanon,USA)或大鼠IgG2b同种型对照抗体(LTF-2，Bio X细胞)，这些抗体在施用mRNA纳米颗粒后立即注射。
生物发光成像
施用(静脉注射(i.v.)，腹腔注射(i.p.)，i.n.或鞘内注射(i.t.))含有fLuc mRNA的纳米颗粒六小时后，麻醉小鼠，并用脱毛膏使腹部和胸部脱毛。随后，以每只小鼠100μl(33mg ml-1)的体积腹膜内施用VivoGloTM萤光素(Promega)。5-10分钟后，通过IVIS luminaII系统(PerkinElmer,Waltham,MA)获取生物发光图像。
治疗性疫苗接种实验
通过在荷瘤小鼠中进行治疗性疫苗接种，评估了mRNA纳米颗粒(包括不同的货物，或与抗PD-L1抗体组合)的治疗潜力。为此，C57BL/6在腹侧接受皮下(s.c)注射x105 E.G7-OVA，B16-OVA或B16F0肿瘤细胞(悬浮在PBS中)。肿瘤接种8天后，当病变可触及时，根据肿瘤体积将小鼠随机分为不同的治疗组，并通过静脉内途径接种mRNA纳米颗粒。在一些实验中，动物接受了第二次和第三次治疗性疫苗接种。每隔一天或两天使用数字卡尺测量肿瘤的生长。当肿瘤体积超过1000mm3(B16-OVA，B16F0)或1500mm3(E.G7-OVA)时，通过颈脱位法将小鼠安乐死。
单细胞悬液的流式细胞仪分析
在免疫后的不同时间点处死小鼠，收集脾、肺脏、肝脏或肿瘤，然后按照[18]中的描述处理成单细胞悬液。根据生产商的说明，将单细胞悬液用可固定的活力染料
Figure BDA0002976992610000311
(Thermo Scientific)或Zombie YellowTM(Biolegend，San Diego，CA)染色，并与Fc阻断剂(CD16/32)孵育来阻断非特异性FcR结合(BD Biosciences，Erembodegem，比利时)，并在4℃下30分钟内用指示抗体进行表面染色(全部为Thermo-Scientific)以从分析中排除死细胞。在另外的洗涤步骤之后，通过流式细胞术分析细胞。使用由单独的荧光染料偶联的抗体染色的UltraComp eBeadsTM补偿珠(Thermo-Scientific)计算光谱重叠的补偿。
通过测量共刺激分子CD40-FITC(HM40-3)，CD86-FITC(CL1)，CD80-PE/Cy7(16-10A1)和抑制分子PD-L1-Super Bright 436(MIH5)的上调来分析脾中对CD11c-(APC或FITC)阳性的DC的激活状态。T细胞用单克隆抗体染色，单克隆抗体包括CD3e-PE(145-2C11)，CD4-FITC(GK1.5)，CD8a-(APC或AF488)(53-6.7)和PD-1-(efl450或FITC)(RMP1-30)。为了对OVA选择性T细胞进行染色，使用了BV450缀合的H-2Kb/SIINFEKL四聚体(OVA-四聚体)，该四聚体获自国立卫生研究院(NIH)四聚体核心实验室(National Institutes ofHealth(NIH)Tetramer Core Facility)。iNKT细胞用从NIH四聚体核心实验室获得的TCRβ-APC(H57-597)，PD1-efl450和mCD1d PBS-57PE四聚体染色。使用CD3e-PE(阴性门控)和NK1.1-APC(PK136)染色检测NK细胞。此外，用包括CD11b-PE/DazzleTM 594(Biolegend)，MHC-II-efl450(M5/114.15.2)，F4/80-(FITC或AF700)(6F12)，Ly-6G/Ly-6C-FITC(RB6-8C5)和CD206-APC(C068C2)的抗体染色骨髓来源的抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。评估DC(CD11c+)和肿瘤细胞(CD45-PerCP-Cy5.5阴性细胞)的PD-L1表达。
细胞因子测量和丙氨酸转氨酶(ALT)活性
静脉注射mRNA纳米颗粒6小时后收集血清，并将样品在-80℃下保存。MousePlatinum IFNαELISA试剂盒，IFN-γ和IL-4ELISA试剂盒
Figure BDA0002976992610000321
购自赛默科技(Thermo-Scientific)。使用多重测定法(LEGENDplexTMMouse Inflammation Panel，Biolegend)定量一组其他13种细胞因子，包括IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-23、IL-27、MCP-1、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF。使用比色法测定试剂盒(MaxDiscoveryTM,Bioo Scientific Corporation,Austin,USA)测量ALT酶活性。所有测定均按照制造商的说明进行。
统计分析
所有数据均以平均值±标准差表示。呈现的体外实验数据代表了在3个不同日期进行的至少3个独立实验。体内实验包括合并成一张图的至少两个实验的数据，这在图的标题中已明确提及。使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计分析，然后进行Tukey事后检验(GraphPad Prism6,La Jolla,CA,USA)。星号表示统计显著性(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。在Kaplan-Meier图中可以看到存活情况。存活差异通过时序(Mantel–Cox)检验进行了分析。
结果
1.mRNA Galsome与结合经典佐剂的mRNA纳米颗粒相比具有更好的治疗效果。
在先前的研究中[18]，我们表明与核苷修饰的mRNA脂质复合物共同递送TLR激动剂(MPLA)是可行的，并可用于促进先天性免疫激活。但是，对于例如癌症的治疗性应用，图1显示，使用具有相对较高剂量的MPLA(每只小鼠2μg)的mRNA纳米颗粒获得的免疫反应不会破坏免疫耐受并抑制已建立的E.G7-OVA肿瘤中的肿瘤生长。与之形成鲜明对比的是，我们发现，施用包含iNKT激动剂α-GalCer的mRNA纳米颗粒(在本文中称为“mRNA Galsome”)可有效实现肿瘤消退。有趣的是，与使用具有MPLA的mRNA纳米颗粒(每只小鼠2μg MPLA)相比，使用α-GalCer获得的这些结果所用的佐剂剂量(每只小鼠0.020μgα-GalCer)低100倍。
2.血清中mRNA纳米颗粒的理化特性和稳定性
我们最初评估了具有不同脂质组成的mRNA纳米颗粒。mRNA纳米颗粒由阳离子脂质DOTAP(1,2-二油酰基氧基-3-三甲基铵丙烷氯化物)或DC-胆固醇(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇)和辅助脂质，DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)或胆固醇组成。脂质体(Lipofectamine)RNAiMAX mRNA纳米颗粒如(Broos等人2016)中所述制备。
有趣的是，我们发现DOTAP-胆固醇mRNA纳米粒在转染鼠骨髓来源的(BM)-DC方面优于广泛报道的DOTAP-DOPE mRNA纳米粒或商品化转染脂质体(Lipofectamine)RNAiMAX。图2显示，暴露于血清后，DOTAP-DOPE mRNA纳米颗粒(几乎)未能转染(BM)-DC，而DOTAP-胆固醇mRNA纳米颗粒则成功了，使其更适合于体内使用。
我们专注于血清中(体外)DOTAP-胆固醇mRNA纳米颗粒的行为。为了确保完整的mRNA络合并因此保护mRNA免受酶促降解，我们研究了不同N/P比(即“电荷比”)的mRNA纳米颗粒。从DOTAP-胆固醇/mRNA纳米颗粒的凝胶电泳实验(结果未显示)可以得出结论，mRNA的完全复合是从N/P比为2.5：1开始的。因此，选择N/P 2.5：1的mRNA纳米颗粒用于进一步的实验。在该电荷比下，纳米颗粒的平均大小为160nm，ζ电位为+50mV(图3A)。
为了预测mRNA纳米颗粒在体内的稳定性，并避免在肠胃外注射复合物后过早释放mRNA，我们将mRNA纳米颗粒在人血清中于37℃孵育了2小时。我们进行了荧光波动光谱法(FFS)，以获得关于血清中mRNA与DOTAP-胆固醇制剂的络合情况的定量信息。简而言之，该技术监视小体积中荧光分子的荧光强度波动。这些荧光波动是由于荧光分子在激发体积内外的扩散所致。在我们这种情况下，该技术允许根据荧光强度从与脂质体结合的荧光mRNA区分游离荧光mRNA(用Cy5标记)。该实验显示在血清中孵育2h后，Cy5修饰的mRNA对DOTAP-胆固醇脂质复合物的络合效率为86±9％。
随后，我们利用荧光单粒子跟踪(fSPT)测量了血清中mRNA脂质复合物聚集的程度。图3B清楚地表明，mRNA纳米颗粒保持其初始大小，并且在含血清的培养基中不聚集。有趣的是，这表明在这种脂质体制剂中多余地包括了通常用于防止纳米颗粒聚集的聚乙二醇化脂质。
3.mRNA Galsome：DOTAP-胆固醇脂质体作为核苷修饰的mRNA和α-GalCer的递送剂
重要的是要注意，两种纳米颗粒货物(mRNA和α-GalCer)对它们的细胞内递送有不同的要求。mRNA应迅速从核内体逃逸，以产生足够的抗原。相比之下，α-GalCer必须在晚期的核内体和DC的溶酶体中积累，然后将其装载到CD1d分子中并呈递给iNKT细胞。因此，我们首先使用DOTAP-胆固醇脂质体作为载体系统评估了mRNA和α-GalCer的递送效率，并评估了mRNA翻译与α-GalCer呈递过程之间的相容性。
为了评估α-GalCer的递送，将骨髓来源的DC(BM-DC)与游离的α-GalCer或mRNAGalsome(包括等剂量的α-GalCer)一起孵育。当使用FITC标记的α-GalCer时，很明显，α-GalCer的细胞内递送被通过mRNA Galsome的递送增加了一倍(图4A)。这也转化为α-GalCer在CD1d中增强的呈递：与可溶性α-GalCer形式相比，我们观察到通过CD1d复合物呈递的α-GalCer增加了约3倍(图4B)。当我们与脾细胞一起培养BM-DC时，我们可以证明与用mRNAGalsome处理的细胞共培养时，IFN-γ的产量高4至5倍。有趣的是，当将不同的α-GalCer类似物包装在纳米颗粒内部时，观察到了相似的效果(图4C)。
为了确定mRNA Galsome在体内引发免疫应答的效力，我们通过向小鼠静脉内注射含有固定剂量的10μg mRNA和递减剂量的α-GalCer的mRNA Galsome进行了剂量反应研究(图4D)。注射后12小时，通过血清中IFN-γ的产生间接测量iNKT细胞的激活。当注射含有1.4μgα-GalCer的mRNA Galsome时，该剂量对应于在小鼠体内常规全身施用的α-GalCer的量，在血清中可以检测到高达25.000pg ml-1的IFN-γ水平[26]。尽管这表明mRNA Galsome非常有效地诱导免疫，但这与所有动物的脾肿大相吻合。但是，可以通过调整α-GalCer的剂量容易地改善IFN-γ的水平。重要的是，当使用低得多的剂量时，每只小鼠低至20ngα-GalCer(或纳米颗粒中脂质总量的0.015mol％)，仍产生高水平的IFN-γ(～4000pg ml-1)，而没有任何急性毒性迹象。因此，我们使用包装了20ngα-GalCer的mRNA Galsome进行进一步的实验。
先前将mRNA与其他佐剂结合使用的尝试提出了相容性问题，因为DC成熟可以过早消除细胞摄取机制(例如巨胞饮作用)或潜在地诱导抗RNA防御机制(例如I型IFN信号传导)，从而导致mRNA快速降解[19，27]。由于这些原因，我们研究了包含α-GalCer对mRNA翻译的影响。给小鼠静脉内注射包裹不同货物的纳米颗粒：单独的核苷修饰的mRNA，与α-GalCer组合的核苷修饰的mRNA或编码萤火虫荧光素酶(fLuc)的未经修饰的mRNA(免疫原性)。6h后评估生物发光。图5A-5B证明α-GalCer的掺入不干扰肺和脾中mRNA的翻译。如所预期的，未经修饰的fLuc mRNA纳米颗粒显示出显著较低的表达水平，这是由于其较低的细胞内稳定性以及I型IFN介导的可降解并避免mRNA翻译的抗病毒途径所致[27]。注意，本发明的纳米颗粒还可以用于通过其他施用途径例如腹膜内、鼻内或气管内施用来递送mRNA(图6)。总之，这些结果表明，核苷修饰的mRNA和α-GalCer的共同包装改善α-GalCer的递送和呈递，而不影响mRNA的表达水平。
4.mRNA Galsome在体内介导强大的佐剂作用并激活树突状细胞
α-GalCer的免疫激活是一种间接现象：在CD1d中呈递α-GalCer的DC会刺激iNKT细胞，进而通过CD40-CD40-配体相互作用引起DC的表型成熟。为了评估mRNA Galsome是否也是这种情况，尤其是在使用低剂量(20ng)α-GalCer的情况下，我们研究了粒子注射后24h脾DC的成熟状态(图7A-B)。相对于未经治疗的小鼠，我们可以观察到脾DC上激活标志物CD40、CD80和CD86的强烈显著上调。重要的是，在不存在iNKT细胞的情况下将mRNA Galsome添加到BM-DC培养物中时，未观察到DC成熟，这表明该成熟作用是通过与iNKT细胞的连接介导的。
为了研究免疫应答的宽度，在接种疫苗后6h对动物血液进行了广泛的炎性细胞因子筛选(图8)。如所预期的，在未经修饰的mRNA纳米颗粒诱导IFN-α的强烈释放的情况下，对于核苷修饰的mRNA纳米颗粒(具有或不具有α-GalCer)则不是这种情况。相反，mRNAGalsome诱导IFN-γ和IL-4的明显生产。此外，在接受mRNA Galsome的人群中，我们还可以检测到刺激T细胞的细胞因子(例如IL-12p70和IL-27)的存在以及IL-6、TNFα和IL-17a的水平升高。重要的是，这种广谱的细胞因子不会引起明显的毒性症状，在H&E染色的肺、脾和肝脏的器官切片中未发现病理变化，并且ALT活性水平正常。
5.mRNA Galsome作为免疫多能性诱导剂
可以预期，增加的mRNA表达水平与强力的DC成熟结合以及诱导CTL的细胞因子(如IL-12p70)的产生，具有使mRNA Galsome与I型IFN依赖性mRNA疫苗竞争的潜力。除T细胞介导的免疫力外，与α-GalCer的组合还可提供激活iNKT和NK细胞的优势，从而形成更广泛的潜在协同抗肿瘤免疫力。
为了评估这些多重效应反应，用编码作为模型抗原的鸡卵清蛋白(OVA)的mRNA免疫动物。免疫六天后，在分离的脾中测量了OVA特异性CTL的细胞数(图9)。有趣的是，我们观察到与用“金标准”未经修饰的OVA mRNA纳米颗粒治疗的小鼠相比，mRNA Galsome产生的OVA特异性CTL水平高4至5倍。
为了评估iNKT和下游NK细胞反应的增殖，在接种疫苗3天后分离了脾和肝脏。与细胞因子反应相对应(图8)，我们观察到iNKT细胞的增殖增加，在脾中从0.8％增加到2.3％，在肝脏中从4.4％增加到14％(图10A-10B)。相应地，mRNA Galsome也介导了NK细胞的增殖，它们在脾和肝脏中的水平分别从2.2％增加到3.8％，从4.7％增加到12％(图10C)。
6.mRNA Galsome在E.G7-OVA淋巴瘤和B16-OVA黑色素瘤模型中的治疗功效
为了评估mRNA Galsome在治疗性疫苗接种研究中的潜力，将小鼠皮下接种表达OVA的E.G7淋巴瘤细胞或B16-OVA黑色素瘤细胞，并在第8天能够触及肿瘤时接种编码OVA的mRNA。
为了区分分别基于iNKT细胞激活或I型IFN应答而激发免疫力的纳米颗粒的治疗潜力，通过单次施用mRNA Galsome或含有未经修饰mRNA的纳米颗粒治疗携带E.G7-OVA的小鼠。首先，相对于未治疗的小鼠，两种疗法均导致肿瘤进展显著减慢(图11A-11B)。总体而言，用未经修饰的mRNA纳米颗粒治疗的小鼠在4/6只动物中显示出完全的肿瘤消退，而用mRNA Galsome治疗的小鼠在3/7只动物中显示出了完全的肿瘤消退。
在更具攻击性的B16-OVA黑色素瘤模型中，在接种肿瘤后第8天、12天和16天，向动物施用了3次mRNA Galsome或未经修饰的mRNA纳米颗粒。尽管我们观察到了肿瘤过度生长的延迟，但是使用mRNA Galsome或未经修饰的mRNA纳米颗粒治疗的小鼠仅适度延长了生存期，中位生存期为28天和29天，而未治疗的动物为22.5天(图12A-12B)。另外，我们注意到多次施用不能有效地增强或延长抗肿瘤反应。这也发生在E.G7-OVA模型中，在该模型中，第二次(加强)疫苗接种并未导致更好地控制肿瘤的过度生长。
7.mRNA Galsome促进CTL、iNKT细胞和NK细胞的肿瘤浸润，但PD-L1的表达阻碍了免疫监视
由于无法完全控制肿瘤的过度生长，我们旨在研究哪种免疫抑制机制可以发挥作用，以抵消由mRNA Galsome或未经修饰的mRNA纳米颗粒引起的抗肿瘤免疫力。因此，进行了实验，其中在第二次纳米颗粒施用(第14天)2天后处死了携带B16-OVA的小鼠，并进行了肿瘤免疫微环境的详细分析。筛选肿瘤和脾中可能影响治疗结果的效应子反应和/或抑制机制。最重要的发现如图13-14所示。
首先，与未经治疗的组相比，用mRNA Galsome治疗的动物显示出高达5倍的肿瘤浸润CTL水平，而接种未经修饰的mRNA纳米颗粒后，肿瘤部位CTL的存在仅增加了一倍(图13A)。同样，与未经修饰的mRNA治疗的动物相比，接种mRNA Galsome导致对OVA特异性的CTL数量高6至7倍(根据SIINFEKL-H2Kb四聚体染色确定，肿瘤中活细胞为10％)，而在未经治疗的动物的肿瘤中几乎没有(<0.04％)检测到OVA特异性CTL(图13B)。此外，与其他组相比，我们在用mRNA Galsome治疗的小鼠的肿瘤中检测到iNKT细胞数量增加了4倍(图13C)。与仅具有±5％NK细胞的未治疗小鼠相比，对于两种治疗，均观察到增加的肿瘤浸润性NK细胞水平，其中mRNA Galsome为±13％NK细胞，未经修饰的mRNA纳米颗粒为±11％NK细胞(图13D)。
通过分析肿瘤部位的抑制性免疫细胞，我们发现与未治疗的对照相比，未经修饰的mRNA的递送导致MDSC(CD11b+，GR1+，MHC-II-细胞)增加了2倍。有趣的是，在用mRNAGalsome治疗的动物中未观察到MDSC水平的这种升高(图14A)。此外，我们注意到，mRNAGalsome组中的几乎所有TAM(CD11b+，F4/80+细胞)均表现出促炎性的M1样表型，其标志为MHC-II水平升高(图14B)。
尽管接种mRNA Galsome会导致“热”T细胞浸润的肿瘤，但我们研究了通过PD-1/PD-L1轴进行的免疫抑制是否可以参与抵抗疫苗诱导的免疫应答[23]。实际上，与未治疗的动物的肿瘤相比，用mRNA Galsome治疗的小鼠的肿瘤PD-L1表达增加了约4倍。对于肿瘤内的APC，观察到了相似的作用，与对照组相比，PD-L1表达受到约2倍的上调(图14C)。此外，各种肿瘤浸润性T细胞亚群，包括CD8+T细胞，OVA特异性CTL和CD4+T细胞，均表现出PD-1表达上调，并随时间增加(图14D)。应该注意的是，无论mRNA纳米颗粒的类型如何，都会产生这些影响：对于mRNA Galsome和未经修饰的mRNA纳米颗粒，PD-1的上调量相似。重要的是，我们还观察到了最初用mRNA Galsome攻击后激活的iNKT细胞中PD-1表达显著升高(图14D)。这与我们多次注射mRNA Galsome时观察到的有限的增强作用相吻合(图11-12)，并且与以前的报道(表明通过PD-1/PDL-1途径的抑制信号在(过度)刺激后对后续α-GalCer刺激的反应性丧失中起作用)相符。
综上所述，这些发现表明，抑制性PD-1/PD-1L免疫检查点轴参与了CTL的抑制，它可能潜在地解释了iNKT细胞对第二次(加强)疫苗接种的有限反应性，从而限制了抗肿瘤免疫力。
8.抗PD-L1检查点阻断抗体与mRNA Galsome的抗肿瘤作用协同作用
先前的数据表明，增加的PD-1/PD-L1信号传导可通过麻痹T细胞反应并诱导iNKT细胞无反应性来限制抗肿瘤免疫力。这为研究mRNA Galsome接种与抗PD-L1免疫检查点抑制的治疗性组合提供了理论依据。
为了首先更详细地研究iNKT的无反应性问题，以5天为间隔，对初次接种的小鼠接种mRNA Galsome两次。每次施用后分别在6h和3天，我们评估了细胞因子的释放和iNKT的激活。如图15A所示，第二次暴露后测得的IFN-γ水平仅为第一次施用后测得的一半。另外，由于可以测量到较高水平的IL-4和IL-10，我们可以观察到连续施用后向Th2极化细胞因子产生的转变。最后，我们注意到用mRNA Galsome加强免疫接种不会进一步增加iNKT细胞数量，从而证实诱导了iNKT细胞低反应状态。与之相反，当小鼠同时接种并注射抗PD-L1抗体时，与最初的攻击相比，第二次接种后IFN-γ的产量增加了4倍。同样，与抗PD-L1抗体的组合进一步促进了iNKT细胞的扩增，因为第二次施用使脾iNKT细胞的数量增加了一倍(2.25±0.7对4.73±1.2％，图15B)。为了进一步研究PD-1/PD-L1信号传导的作用，我们测量了脾DC的PD-L1表达和活化的iNKT细胞的PD-1表达。与其他报道相似，我们观察到大部分DCs快速上调了用同种型对照治疗的动物中PD-L1的表达，而伴随递送的抗PD-L1抗体可以完全消除它(图15C)[28，29]。另外，通过mRNA Galsome/检查点联合策略重复激活iNKT细胞是可行的，因为与仅接受单次接种单一mRNA Galsome的小鼠的iNKT细胞相比，PD-1水平降低了一半(图15C)。
为了评估联合治疗的上述效果是否也可以转化为改善的治疗结果，对携带B16-OVA的小鼠接种了mRNA Galsome，并腹膜内施用抗PD-L1抗体或同种型对照抗体。抗PD-L1-或同种型抗体的单一疗法用作额外的对照。图16中的结果表明，到最后一次接种时(第22天)，用mRNA Galsome和检查点阻断抗体联合治疗的小鼠的平均肿瘤体积仍限制在59±46mm3。相比之下，在所有其他组中，肿瘤已经长大了10倍。这也转化为中位生存期的显著增加。接受抗PD-L1抗体或mRNA Galsome单一治疗的小鼠分别在第21天和第22.5天达到了中位生存期，这并不显著晚于仅注射同种型对照抗体的对照组的动物(中位生存期为19天)。联合治疗将中位生存期显著延长至30天，表明两种治疗策略之间均具有协同作用。
接下来，我们研究了在B16F0黑色素瘤模型中是否可以针对天然表达的酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)肿瘤抗原获得相似的抗肿瘤反应。更具体地，携带B16F0的小鼠接种了现在包括编码TRP-2的mRNA的mRNA Galsome或未经修饰的mRNA纳米颗粒，并结合了抗PD-L1检查点疗法(图17)。当在头对头比较(head-to-head comparison)中评估与检查点疗法结合的两种mRNA平台时，我们现在可以观察到与未经修饰的mRNA纳米颗粒相比，mRNA Galsome制剂具有更好的抗肿瘤作用，这被分别为24天和18天的中位生存期表明。同样，携带B16F0的小鼠对PD-L1检查点抑制的单一治疗无反应，接受同种型对照抗体或抗PD-L1抗体的动物均在第15天达到中位生存期。
总体上，清楚地表明，通过合理地结合PD-L1检查点抑制，可以增强mRNA Galsome的治疗潜力。该检查点阻断(1)防止诱导iNKT无反应性，允许进行多次接种，并且(2)避免肿瘤部位的适应性耐药机制，延长B16-OVA-或B16F0黑色素瘤模型中的抗肿瘤作用。此外，mRNA Galsome可以获得比最先进的未经修饰的mRNA纳米颗粒更好的抗肿瘤反应，因为它们可以使肿瘤微环境向更促炎性的表型转变，并且与PD-L1检查点抑制相结合，它们可以显示更长的生存期，这在例如针对TRP-2的B16F0黑色素瘤模型中得到证实。
9.用α-GalCer的功能衍生物配制的mRNA Galsome
此外，我们测试了用α-GalCer类似物配制的mRNA Galsome的治疗潜力，这些类似物经过专门合成以增加或降低CD1d复合物中糖脂类的稳定性。选择了三种功能衍生物：(1)NU-α-GalCer(α-GalCer-6”-(1-萘基)脲，(2)PyrC-α-GalCer(a-GalCer-6”-(吡啶-4-基)氨基甲酸酯)和(3)(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-半乳糖吡喃糖基)-N-二十四烷酰基-2-氨基-1,3,4-壬三醇)(OCH)。NU-和PyrC-类似物分别用萘基脲和吡啶氨基甲酸酯基团修饰半乳糖部分，分别导致与CD1d(树突状细胞)或TCR受体(iNKT细胞)的相互作用增加。相反，OCH是具有较短酰基链的神经酰胺修饰类似物，因此已知对CD1d受体的亲和力较弱。
通过包括α-GalCer或一种结构类似物(占总脂质量的0.015mol％)来制备mRNAGalsome。首先，我们比较了这些mRNA Galsome在无肿瘤小鼠中引起iNKT和抗原特异性CTL反应的活性。接种3天后，与含αGC(～3％)的mRNA Galsome相比，我们能够检测到接种PyrC-αGC(～12％)和NU-αGC(～6％)的C57BL/6小鼠脾中iNKT细胞的百分比增加，而发现OCH的增殖较低(～1.8％)(图18A)。尽管iNKT细胞具有独特的活性，但所有mRNA Galsome都能诱导OVA特异性CD8+T细胞强烈增殖(>3％；7天后测量)(图18B)。应该注意的是，没有任何糖脂佐剂的相同颗粒几乎不会产生OVA特异性CD8+T细胞。随后，我们评估了不同α-GalCer类似物的掺入将在多大程度上影响iNKT细胞上PD-1的表达。先前的研究表明，iNKT无反应性有一个“激活阈值”[28,30]。如图18C所示，在用OCH mRNA Galsome处理后，我们观察到iNKT细胞PD-1的表达显著降低。
接下来，在本文所述的B16-OVA黑色素瘤模型中比较了包装有α-GalCer或这些类似物的mRNA Galsome的治疗潜力。携带B16-OVA的小鼠在第8天接受了第一次接种，在第15天接受了加强接种。图19显示，用含有α-GalCer类似物的mRNA Galsome接种的小鼠比经典α-GalCer配制的颗粒具有更好的抗肿瘤作用。PyrC-和OCH类似物均对肿瘤生长有最显著的影响，这由以下证实：改善的中位生存期分别为32天和28天，而NU-α-GalCer为26天，α-GalCer为25天，并且未经治疗的动物为21天。在PyrC类似物的情况下，这可能通过由于该类似物刺激iNKT细胞的能力增强所致来解释(图18)。相比之下，OCH的优异抗肿瘤作用可以通过iNKT细胞刺激降低，因此在单次接种后iNKT细胞上的PD-1表达水平较低来解释(图18C)。通过限制初始iNKT细胞无反应性，与其他α-GalCer变体相比，第二次接种对OCH类似物可能具有更好的效果，尤其是对于建立连续的CTL反应。基于这些结果，发现使用这些α-GC类似物是一个额外的吸引人的参数，其可以调节mRNA Galsome制剂的功效和(潜在的安全性)。
10.使用由可电离脂质MC3组成的替代脂质纳米颗粒系统共递送核苷修饰的mRNA和α-GalCer。
由可电离的阳离子脂质和其他“辅助”脂质(例如磷脂、胆固醇和聚乙二醇(PEG)脂质)组成的脂质纳米颗粒被认为是RNA治疗技术中在临床上最先进的技术。作为杰出的示例，利用这种可电离的LNP技术治疗遗传性转甲状腺素蛋白(transthyretin)介导的淀粉样变性的短干扰(si)RNA治疗药Onpattro(patisiran)最近获得了FDA和EMA的首批批准。此外，这些由可电离的阳离子脂质组成的LNP也已成为递送mRNA疫苗的“金标准”脂质制剂。我们评估了这种脂质制剂，特别是与可离子化脂质MC3一起，是否也可以用于mRNA和作为iNKT激动剂的α-GalCer的共同递送。
为了评估在同一动物中佐以α-GalCer的MC3 LNP的转染效率和免疫原性，将fLucmRNA和tOVAI80 mRNA共同配制在单个纳米颗粒中。首先，与由DOTAP和胆固醇组成的mRNAGalsome相比，MC3 LNP的全身递送可达到更高的全身荧光素酶表达水平(图20A)。与以前的报道相似，在肝脏中检测到了显著的高选择性mRNA表达[33]。
重要的是，观察到脾中iNKT细胞百分比的增加，其细胞数量与用DOTAP mRNAGalsome的免疫相似(图20B)。此外，MC3 mRNA Galsome还能够诱导在脾中测得的OVA特异性CTL(1.65±0.62％)，尽管程度要比DOTAP mRNA Galsome(4.42±0.85％)低。另外，在免疫后早期，可以在用MC3 mRNA Galsome治疗的动物中检测到与iNKT细胞刺激相关的Th1和Th2细胞因子反应。仅观察到了细胞因子极化的轻微模式变化，IFN-γ、TNF-α和IL-6的细胞因子水平相似或更高，但IL-4和IL-2的水平较低(图20C)。这些差异可能与全身性施用后两种颗粒的其他器官分布特征有关，从而刺激了这些纳米颗粒靶向的器官中存在的其他NKT细胞亚群。
总之，这些结果表明，使用替代阳离子脂质的LNP可以用作载体，用于共同递送核苷修饰的mRNA和α-GalCer，从而刺激iNKT细胞并诱导增强的抗原特异性T细胞反应。
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Claims (15)

1.一种纳米颗粒，其包含核苷修饰的mRNA，包含阳离子脂质和胆固醇的脂质组分，以及α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)化合物。
2.根据权利要求1的纳米颗粒，其中所述阳离子脂质是可电离的阳离子脂质。
3.根据权利要求1或2的纳米颗粒，其中所述阳离子脂质选自由以下组成的组：1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”，N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]–N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”，5-羧基精氨酰基甘氨酸双十八烷基酰胺或“DOGS”，2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵或“DOSPA”，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”，1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”，1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”，1,2-二亚油基氧基(dilinoleyloxy)-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”，三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯或“DLin-MC3-DMA”或“MC3”，2,2-二亚油基(dilinoleyl)-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环或“DLin-KC2-DMA”或“KC2”，1,2-二亚麻基氧基(dilinolenyloxy)-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”，N-二油基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”，N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”，N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”，3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式，顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”，2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式，顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”，N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺或“DMOBA”，1,2-N,N'-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”，2,3-二亚油酰氧基(dilinoleoyloxy)-N,N-二甲基丙胺或“DLinDAP”，1,2-N,N′-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”，1,2-二亚油酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-XTC2-DMA”。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米颗粒，其中所述mRNA编码目的抗原或多肽，特别是肿瘤特异性抗原。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核苷修饰的mRNA包括将天然存在的修饰核苷酸，例如假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(m1Ψ)和/或5-甲基胞苷(5meC)掺入到mRNA转录物中。
6.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的纳米颗粒，以及药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
7.根据权利要求1至6中任一项的纳米颗粒或组合物与检查点抑制剂的组合，所述检查点抑制剂特别是分别特异性结合PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA-4的PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA-4抑制剂，并选自抗体、小分子、多肽或核酸。
8.根据权利要求1至7中任一项的纳米颗粒、组合物或组合，其用作药物。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的纳米颗粒、组合物或组合，其用于在受试者内引发和/或扩增针对癌细胞或肿瘤细胞或针对传染原的细胞毒性T细胞和iNKT细胞或NK细胞的方法。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的纳米颗粒、组合物或组合，其用于治疗性癌症疫苗接种，或用作感染性疾病或自身免疫性相关疾病的预防性或治疗性疫苗。
11.根据权利要求8至10中任一项的用途的纳米颗粒、组合物或组合，其中所述纳米颗粒、组合物或组合通过静脉内、皮下、皮内、肌内、腹膜内、鼻内施用或通过吸入施用。
12.一种试剂盒，其包括第一容器、第二容器和包装插页，其中所述第一容器包括至少一个剂量的包含根据权利要求1至5中任一项的纳米颗粒的药物组合物，所述第二容器包括至少一个剂量的包括检查点抑制剂的药物组合物，所述包装插页包括使用所述药物组合物治疗患有癌症的个体的说明。
13.一种用于与抗原特异性T细胞免疫应答一起诱导抗原在细胞中表达的组合物，包括施用包含以下内容的组合物：
(a)至少一种核苷修饰的mRNA，其至少一部分编码所述抗原；
(b)呈递在CD1d分子中的糖脂抗原，其刺激iNKT细胞；
(c)包括所述核苷修饰的mRNA和所述糖脂抗原的脂质纳米颗粒；和
(d)任选地PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA-4抑制剂，特别是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体或抗-CTLA-4抗体，
其中在施用所述组合物之后，由mRNA编码的抗原在靶细胞中表达，和/或从所述细胞分泌或排出，其中糖脂抗原由靶细胞呈递在CD1d途径中，通过iNKT细胞连接引发免疫级联反应。
14.根据权利要求13使用的组合物，其特征在于IFN-γ和IL-12p70的产生，以及细胞毒性T细胞和/或iNKT细胞和/或NK细胞的引发和/或扩增。
15.根据权利要求13使用的组合物，其中所述靶细胞是抗原呈递细胞，优选脾和肺中的抗原呈递细胞。
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