CN115920019A - 一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗及其制备方法与应用。属于纳米药物制剂及核酸疫苗技术领域。该疫苗可实现TLR4激动剂单磷酰脂质A(mPLA)与mRNA共包载。其粒径为60～600nm，Zeta电位为+8～+37mV，包封率为60～93％，mRNA载药量为7.5～20％。本发明构建的mRNA疫苗，可通过皮下/肌肉/鼻粘膜途径给药，刺激DCs细胞成熟，极化M2型巨噬细胞为M1型巨噬细胞，并激活NK细胞ADCC效应，多免疫通路协同发挥抗肿瘤治疗效果。尤其在肺癌骨转移发生后，该疫苗可有效抑制肿瘤生长，借助mPLA协同mRNA免疫疗法，激活机体固有免疫与适应性应答，协同抗肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物制剂及核酸疫苗技术领域，更具体的说是涉及一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤的发展及转移性肿瘤疾病严重威胁人类健康，随着医学水平快速发展，肿瘤免疫治疗已发展成为一种新的肿瘤治疗手段。与手术、化疗及放疗等治疗手段不同，肿瘤免疫治疗是通过激活机体自身免疫系统杀灭肿瘤细胞，对正常细胞危害较轻或无损害，在肿瘤治疗中有着巨大潜力。肿瘤疫苗是通过将肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原导入机体，刺激抗原提呈细胞(APCs)成熟活化，诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长。蛋白、肽类疫苗相对容易制备且可进行大规模生产，但免疫原性弱、引起免疫应答持续时间短、抗原肽选择具有局限性。DNA疫苗免疫效应低且存在不受控制的基因组突变和免疫耐受风险，存在潜在安全问题。相比多肽及DNA疫苗，信使RNA(mRNA)疫苗在肿瘤治疗的有效性、安全性及生产成本上更占优势，是一种极具潜力的肿瘤免疫治疗策略。mRNA疫苗是将编码目的蛋白基因的mRNA小基因片段传递至细胞，表达特定蛋白产生免疫应答的一种基因治疗手段，显示了其独特优势：mRNA进入细胞质开始翻译，不需进入细胞核发挥作用；mRNA治疗与质粒DNA和病毒载体不同，不会插入宿主细胞染色体中，无基因插入突变风险，安全性高；转染效率与靶细胞的细胞周期无关；mRNA合成和纯化快速、成本低。值得注意的是，mRNA疫苗策略也面临一些挑战，例如编码抗原的mRNA容易被核酸酶降解，且负电性mRNA较难被APCs摄取；mRNA分子暴露于非APCs存在引发体内不良反应的风险；需要寻求合适的递送载体促使mRNA在APCs内翻译成抗原，诱导产生更强烈的T细胞反应。利用纳米载体技术可以有效解决递送mRNA疫苗的难题。
肿瘤微环境中，巨噬细胞的极化与肿瘤存在较大相关性。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润在肿瘤组织周围的巨噬细胞，它们由外周单核细胞分化而来，在肿瘤微环境影响下，TAM分泌多种细胞因子，对肿瘤的发生和转移有重要作用。TAM分为M1和M2型巨噬细胞，其中M1型巨噬细胞发挥抗肿瘤作用，M2型巨噬细胞有促肿瘤生长作用。TAM中M1和M2型巨噬细胞的比例与肿瘤的预后之间存在相关性。因此，有效将M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，可作为肿瘤发生及转移性肿瘤治疗的靶点之一。
脂质体具有类生物膜结构，可包封水溶性和脂溶性药物。其选择性高、无毒性、无免疫原性、适于生物体内降解。阳离子脂质体能够诱导较强黏膜免疫、体液免疫及细胞免疫，具有良好的载体兼佐剂功能。单磷酰脂质A，脂多糖减毒衍生物，具有脂类结构特征，将其加入阳离子脂质体递送系统，可以发挥脂质载体和免疫调节剂的双重作用。mPLA可激活TLR4受体，刺激树突细胞成熟，进而激活CD8+T细胞；并将肿瘤相关巨噬细胞由促肿瘤的M2型巨噬细胞极化为杀伤肿瘤的M1型巨噬细胞，同时激活机体固有免疫与适应性免疫应答。
骨为肺癌转移的好发组织，肺癌骨转移表示肺癌已进入到晚期阶段，癌细胞通过血液系统和淋巴系统向全身进行多器官扩散，在扩散到骨头后引起局部肿胀感和疼痛感，甚至影响到局部的活动。骨转移的免疫治疗重点在于全身免疫系统的激活及肿瘤特异性免疫调控。mRNA疫苗的免疫疗法联合mPLA针对性极化巨噬细胞的功能，足以激活系统固有免疫与适应性免疫，起到交叉激活的作用。机体多种淋巴免疫细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞协同杀伤肿瘤细胞，以抑制肿瘤生长，起到延缓肿瘤扩增作用。
综上所述，如何构建一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗及其制备方法与应用。该疫苗可利用脂质体复合物共包载抗原特异性mRNA及单磷酰脂质A(mPLA)，mRNA翻译为蛋白增强树突状细胞(DCs)MHC分子表达，活化T细胞免疫效应；mPLA极化巨噬细胞为M1状态，协同增强机体免疫能力，用于肺癌的免疫治疗。骨为肺癌转移的好发部位，该疫苗可利用NKp46和FcRIII介导的细胞毒性、TLR4激活等多种免疫途径交叉激活固有免疫及适应性免疫应答，抑制肿瘤发展。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的为构建一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗。
一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，由负载单磷酰脂质A的脂质体复合物、鱼精蛋白和mRNA组成；
所述负载单磷酰脂质A的脂质体复合物为单磷酰脂质A吸附在阳离子脂质体上；
所述单磷酰脂质A和mRNA分别占总质量的0.5～1.5％和10～30％。
所取得的有益效果：该疫苗可实现mPLA与mRNA的共包载，协同发挥抗肿瘤作用，其中mPLA可激动TLR4受体，极化巨噬细胞为M1状态；mRNA可翻译为蛋白增强树突状细胞(DCs)MHC分子表达，活化T细胞免疫效应，协同增强机体免疫能力，用于肺癌及其后期肿瘤骨转移的治疗。
该疫苗可通过Toll样受体信号通路、T细胞信号通路、趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等通路发挥作用，在肺癌及其骨转移过程中直接杀伤肿瘤细胞。进一步的，其通过TLR4受体激活、CD8+T、CCR7趋化因子、NKp46和FcRIII介导的细胞毒性增强等免疫途径协同联动杀伤肿瘤。
进一步的，粒径为60～600nm，Zeta电位为+8～+37mV，包封率为60～93％，mRNA的载药量为7.5～20％。
进一步的，可实现单磷酰脂质A与mRNA的共包载，协同发挥抗肿瘤作用，其中单磷酰脂质A可激动TLR4受体，极化巨噬细胞为M1状态；mRNA可翻译为蛋白增强树突状细胞MHC分子表达，活化T细胞免疫效应，协同增强机体免疫能力，用于肺癌及其后期肿瘤骨转移的治疗。
进一步的，可通过Toll样受体信号通路、T细胞信号通路、趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等通路发挥作用，在肺癌及其骨转移过程中直接杀伤肿瘤细胞；
进一步的，通过TLR4受体激活、CD8+T、CCR7趋化因子、NKp46和FcRIII介导的细胞毒性增强等免疫途径协同联动杀伤肿瘤。
进一步的，单磷酰脂质A借助自组装吸附于阳离子脂质体的磷脂层后，形成负载单磷酰脂质A的脂质体复合物，之后依靠静电吸附力包裹鱼精蛋白缩合的mRNA。
进一步的，所述mRNA为肿瘤抗原相关mRNA，包括肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。
进一步的，所述mRNA为癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原153(CA153)或黑色素瘤抗原A1(MAGE-A1)；
所述mRNA优选黑色素瘤抗原A1，其理论长度为1970nt，在肺癌组织中高表达。
进一步的，所述单磷酰脂质A为靶向TLR4的脂多糖低毒衍生物，分子量为1763.47，可稳定吸附于阳离子脂质体中发挥作用；
所述阳离子脂质体由磷脂、胆固醇(Chol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)组成；
所述阳离子脂质体与单磷酰脂质A的质量比为30:1～70:1。
进一步的，所述磷脂为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷氯盐(DOTMA)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂(DLin-MC3-DMA)中的一种或几种。
本发明的第二个目的是提供上述治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的制备方法。
上述治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的制备方法，采用逆相蒸发法、薄膜分散法、冻融法、乙醇/乙醚注入法中的一种或几种。
进一步的，所述薄膜分散法包括如下步骤：
1)将单磷酰脂质A和阳离子脂质体溶于有机溶剂，旋转蒸发形成脂质薄膜，使用氮气除去有机溶剂(5～10min)，之后加入水化介质，在48～65℃水浴环境下水化孵育5～30min，得到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物；
所述有机溶剂为氯仿-甲醇(体积比9:1～5:1)、二氯甲烷、乙醚、石油醚中的一种或几种；
所述水化介质为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或生理盐水，浓度为10～45mmol/L，pH为3～7.5；
2)鱼精蛋白与mRNA混匀缩合，得到鱼精蛋白-mRNA缩合物；
3)将鱼精蛋白-mRNA缩合物加入到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物中，室温孵育10～30min，即得成品。
制备过程中，以粒径、包封率、载药量、Zeta电位等脂质体特性为考察指标，对主要影响因素，包括旋蒸温度、转速、水化介质的种类及pH、水化温度、水化方式、等多个条件逐一进行筛选，并对其进行优化，以获得性能最优的mRNA疫苗。
本发明的第三个目的是提供上述治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的应用。
上述治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的应用，所述疫苗通过皮下注射、肌肉注射或鼻粘膜途径进行免疫治疗3次，每次免疫治疗间隔5～7天；
优选鼻粘膜途径。
所述mRNA疫苗可有效刺激脾细胞增殖，增强脾脏免疫功能，充分发挥其免疫监视能力，尽早针对肿瘤细胞做出反应。
所述mRNA疫苗能够诱导较强黏膜免疫、体液免疫及细胞免疫，在肺癌及其骨转移的治疗过程中，借助树突状细胞、CD8+T、巨噬细胞、NK细胞的协同作用，交叉激活固有免疫与适应性免疫应答，用于杀伤肿瘤。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
1)肺癌作为一种起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，发病率和死亡率增长极快，是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。传统的治疗方法，包括手术切除、化疗、放疗等已被证明具有较大的局限性。mRNA疫苗作为一种新型免疫治疗方法，已被应用于多种疾病。在有效性、安全性及生产成本上显示了其独特优势。随之而来的mRNA易被核酸酶降解、负电性mRNA较难被APCs摄取、mRNA分子暴露于非APCs存在引发体内不良反应的风险等问题亟待解决。本发明利用阳离子脂质体生物相容性高、生物可降解和低毒性的优势，及其在药物/疫苗的递送方面的良好潜力，构建阳离子脂质体复合物，用于共载mRNA和mPLA，用于肺癌及其骨转移的免疫治疗。
2)树突状细胞(DCs)是专职的抗原提呈细胞，在协调免疫反应对抗病原体感染或肿瘤发展中起着关键作用。在肿瘤免疫治疗中，mRNA疫苗递送系统被DC摄取后释放到胞质中翻译成蛋白质，进而被加工成抗原肽提呈到DC表面，启动MHC分子途径，激活CD8+T淋巴细胞分化为CTL杀伤肿瘤细胞。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润在肿瘤组织周围的巨噬细胞，在肿瘤微环境影响下，TAM分泌多种细胞因子，对肿瘤的发生和转移有重要作用。TAM分为M1和M2型巨噬细胞，其中M1型巨噬细胞发挥抗肿瘤作用，M2型巨噬细胞有促肿瘤生长作用。TAM中M1和M2型巨噬细胞的比例与肿瘤的预后之间存在相关性。因此，有效将M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，可作为肿瘤发生及转移性肿瘤治疗的靶点之一。如何同时发挥DCs和TAM的免疫效应，用于激活固有免疫与适应性免疫应答，是杀伤肿瘤细胞成功抗肿瘤免疫的关键。
3)本发明将TLR4受体激动剂mPLA插入阳离子脂质体的磷脂层，使其具有载体兼佐剂功能，并以此包裹鱼精蛋白-mRNA缩合物，制得一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗(结构示意图见图1A)。通过琼脂糖凝胶电泳筛选出负载单磷酰脂质A的脂质体复合物、鱼精蛋白与mRNA的最佳比例为5:1:1(见图1C)，其包封率为88.9％，载药量为9.3％。此外，使用绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因，利用激光共聚焦显微镜成像、流式细胞术结合蛋白质免疫印迹实验验证细胞摄取mRNA疫苗能力、荧光蛋白翻译水平及蛋白表达(见图2)。
4)本发明制得的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗体外树突状细胞刺激成熟实验结果显示：疫苗能显著上调树突状细胞表面共刺激分子CD86、MHC-II、CCR7的表达水平，表明其能够有效促进小鼠骨髓未成熟树突状细胞的分化成熟；mRNA疫苗体外巨噬细胞诱导分化实验结果显示：疫苗能诱导骨髓来源巨噬细胞和腹腔来源巨噬细胞中M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，进而发挥杀伤肿瘤细胞的作用，进而表明本发明中治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗是一种良好的肿瘤治疗药物(见图3)。
5)通过鼻粘膜给药的方式对肺癌小鼠进行治疗，监测小鼠28天内肿瘤体积及体重变化，可明显发现mRNA疫苗具有显著的抑制肿瘤生长作用，且通过心肝脾肺肾组织HE染色可知mRNA疫苗生物安全性较高。与此同时，通过免疫荧光染色及流式分析，对脾脏与肿瘤中的CD8+T、NK以及巨噬细胞比例进行分析，结果表明，加入本发明mRNA疫苗明显增强了CD8+T、NK细胞和M1型巨噬细胞比例，激活了机体免疫应答。因此本发明所构建的肺癌及其骨转移的mRNA疫苗可激活适应性免疫应答与固有免疫，增强肿瘤免疫功能，克服肿瘤免疫逃逸，从而增强抗肿瘤效果(见图4)。
6)通过鼻粘膜给药的方式对肺癌骨转移小鼠进行治疗，可明显发现mRNA疫苗具有显著的抑制转移肿瘤生长作用。通过小动物活体成像和碱性磷酸酶(ALP)水平检测小鼠肿瘤发展情况，结果可知，mRNA疫苗组可显著抑制肿瘤发展，应用效果明显。与此同时，免疫荧光检测结果证实，经mRNA疫苗治疗的小鼠，NKp46和FcRIII介导的NK细胞细胞毒性显著增强，可直接杀伤肿瘤细胞(见图5)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的结构示意图和相关特性表征图。其中，A为mRNA疫苗结构示意图，B为实施例2制备的疫苗的粒径、电位、载药量、多分散指数、包封率结果示意图(Lip为空白阳离子脂质体，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mPLA-Lip为包载mPLA的脂质体复合物，mPLA-LPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，C为经过琼脂糖凝胶电泳实验优选不同比例负载单磷酰脂质A的脂质体复合物及鱼精蛋白包封mRNA结果示意图(从左至右分别为阳离子脂质体包封mRNA，鱼精蛋白包封mRNA，阳离子脂质体、鱼精蛋白联合包封mRNA)，D为实施例2制备的疫苗透射电镜形态。
图2为本发明的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的细胞摄取率(流式细胞术和激光共聚焦扫描显微镜)及WB表达翻译图。其中，A为细胞摄取的激光共聚焦图(LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，B为细胞摄取的流式表达图(LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，C为MAGE-A1mRNA在树突状细胞内的蛋白表达图(LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物，LLC为阳性对照)。
图3为本发明的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗对树突状细胞刺激成熟和极化巨噬细胞的流式细胞术测定结果图。其中，A、B、C为树突状细胞刺激成熟结果，A为MHCII分子(Lip为空白阳离子脂质体，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mPLA-Lip为包载mPLA的脂质体复合物，mPLA-LPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物，LPS为阳性对照脂多糖)，B为CD86分子(Lip为空白阳离子脂质体，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mPLA-Lip为包载mPLA的脂质体复合物，mPLA-LPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物，LPS为阳性对照脂多糖)，C为CCR7分子(与所制备的其他制剂组进行对比，Lip为空白阳离子脂质体，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mPLA-Lip为包载mPLA的脂质体复合物，mPLA-LPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物，LPS为阳性对照脂多糖)，D、E为巨噬细胞极化结果，D为骨髓来源巨噬细胞极化(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物，IFN-γ+LPS代表阳性对照)，E为腹腔来源巨噬细胞极化(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物，IFN-γ+LPS代表阳性对照)。
图4为本发明的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗在肺癌小鼠中的体内抗肿瘤效果评价图。其中，A为经治疗后小鼠肿瘤变化图(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，B为小鼠肿瘤体积在28天内连续测定图(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，C为小鼠体重变化(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，D为小鼠心肝脾肺肾HE染色图(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，E为小鼠肿瘤组织免疫荧光染色图(蓝色：细胞核/绿色：肿瘤细胞/红色：CD8+T/粉色：M1型巨噬细胞)，F为脾脏组织CD8+T细胞比例(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，G为脾脏组织NK细胞比例(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)，H为脾脏组织M2/M1巨噬细胞比值图(mLip为包载mPLA的脂质体复合物，LPR为包载mRNA的脂质体复合物，mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)；
图5为本发明的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗在肺癌骨转移小鼠中的体内抗肿瘤效果评价图(mLPR为共载mPLA与mRNA的脂质体复合物)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1通过薄膜分散法制备治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗
按DOTMA:胆固醇:DSPE-PEG2000:mPLA质量比5:1:0.5:0.1溶于氯仿-甲醇溶剂中，水浴50℃旋转蒸发形成脂质薄膜，随后使用氮气除去有机溶剂(10min)后再加入Tris-Hcl水化介质，在60℃水浴环境下水化孵育30min，得到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物。鱼精蛋白与mRNA以质量比1:1混匀缩合，得鱼精蛋白-mRNA缩合物。将所得鱼精蛋白-mRNA缩合物加入到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物中，室温孵育20min，即得可治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗。(负载单磷酰脂质A的脂质体复合物、鱼精蛋白与mRNA以质量比5:1:1)。
使用粒径、Zeta电位、包封率、载药量测定等方法对mRNA疫苗进行表征，并采用琼脂糖凝胶电泳实验考察mRNA与载体之间的包封情况。结果表明：可以成功构建脂质体mRNA疫苗，粒径为562.0±17.8nm，PDI0.482±0.132，zeta电位28.2±1.5mV，EE68.3±3.1％，LE7.1±0.4％。
实施例2通过薄膜分散法制备治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗
按DOTAP:胆固醇:DSPE-PEG2000:mPLA质量比3:1:1:0.1溶于氯仿-甲醇溶剂中，水浴38℃旋转蒸发形成脂质薄膜，随后使用氮气除去有机溶剂(10min)后再加入Tris-Hcl水化介质，在50℃水浴环境下水化孵育30min，得到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物。鱼精蛋白与mRNA以质量比1:1混匀缩合，得鱼精蛋白-mRNA缩合物。将所得鱼精蛋白-mRNA缩合物加入到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物中，室温孵育30min，即得可治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗。(负载单磷酰脂质A的脂质体复合物、鱼精蛋白与mRNA以质量比5:1:1)。
使用粒径、Zeta电位、包封率、载药量测定等方法对mRNA疫苗进行表征，并采用琼脂糖凝胶电泳实验考察mRNA与载体之间的包封情况。结果表明：可以成功构建脂质体mRNA疫苗，粒径为189.1±14.3nm，PDI0.288±0.096，zeta电位13.4±2.9mV，EE88.9±5.4％，LE9.3±0.7％(结果如图1所示)。
实施例3通过薄膜分散法制备治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗
按DLin-MC3-DMA:胆固醇:DSPE-PEG2000:mPLA质量比2:1:1:0.15溶于石油醚溶剂中，水浴40℃旋转蒸发形成脂质薄膜，随后使用氮气除去有机溶剂(10min)后再加入Tris-Hcl水化介质，在55℃水浴环境下水化孵育30min，得到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物。鱼精蛋白与mRNA以质量比1:1混匀缩合，得鱼精蛋白-mRNA缩合物。将所得鱼精蛋白-mRNA缩合物加入到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物中，室温孵育25min，即得可治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗。(负载单磷酰脂质A的脂质体复合物、鱼精蛋白与mRNA以质量比5:1:1)。
使用粒径、Zeta电位、包封率、载药量测定等方法对mRNA疫苗进行表征，并采用琼脂糖凝胶电泳实验考察mRNA与载体之间的包封情况。结果表明：可以成功构建脂质体mRNA疫苗，粒径为301.1±18.6nm，PDI0.381±0.134，zeta电位19.3±1.9mV，EE79.8±3.2％，LE8.4±0.2％。
实验1考察治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的细胞摄取效率
使用实施例2制备所得疫苗，采用编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)mRNA为报告基因，质量为3μg，考察DC2.4细胞对mRNA疫苗的摄取情况。分别采用激光共聚焦显微镜下观察EGFP在细胞中的瞬时表达，以及用流式细胞仪测定EGFP在细胞中的荧光强度。
结果如图2所示，通过流式细胞术结合激光共聚焦显微镜验证包载EGFP mRNA的LPR和mLPR能显著被APCs摄取并表达出绿色荧光蛋白，结果充分说明LPR与mLPR可有效被免疫细胞摄取，并在胞内翻译。
实验2考察治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的蛋白翻译能力
使用实施例2制备所得疫苗，并给药至DC2.4细胞，48h后提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法考察不同组别中MAGE-A1翻译为蛋白情况，借以判断mRNA疫苗递送核酸的能力及其有效翻译能力。
结果如图2所示，负载MAGE-A1mRNA的不同制剂组被DC2.4细胞摄取，并在胞质中翻译为蛋白质，这表明mRNA疫苗可以有效地将mRNA递送到抗原提呈细胞中，并在胞质中成功翻译为蛋白质，进而发挥抗原作用，为肿瘤疫苗发挥作用提供前提条件，验证其应用的前提。
实验3考察治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的刺激树突状细胞成熟和巨噬细胞极化能力
培养并获得骨髓原代树突细胞，给予细胞不同制剂刺激48h后，流式细胞术考察树突细胞成熟标志CD86、MHCII、CCR7表达情况。
不同制剂处理如下：
阴性对照组：PBS；
疫苗组：Lip、LPR、mLip、mLPR；
阳性对照组：IFN-γ+LPS。
培养获得骨髓原代巨噬细胞、腹腔原代巨噬细胞，给予细胞不同制剂刺激48h后，流式细胞术考察巨噬细胞细胞中M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞比例变化。
结果如图3所示，治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗能够显著促进细胞成熟分子CD86、MHCII、CCR7的表达，表明其具有刺激树突细胞成熟的能力，并极化M2型巨噬细胞为M1型巨噬细胞，增强其杀伤肿瘤细胞能力。
实验4考察治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗在荷瘤小鼠体内治疗效果
C57BL/6小鼠于接种肺癌细胞后第7天进行第一次给药，间隔一周再次给药，共给药3次。mRNA疫苗通过鼻粘膜途径进行免疫治疗，接种体积为100μl(MAGE-A1mRNA10μg/只)。每隔3天测量肿瘤体积、小鼠体重。末次给药一周后牺牲小鼠，取出肿瘤，称重。对小鼠心肝脾肺肾组织进行HE染色，考察不同mRNA疫苗组的生物安全性；对小鼠肿瘤组织进行免疫荧光染色，考察mRNA疫苗对肿瘤组织中肿瘤细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞的影响；对小鼠脾脏组织进行流式细胞术检测，考察脾脏中免疫细胞的变化。
结果如图4所示，肿瘤体积生长曲线表明所构建的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗可显著抑制肿瘤生长(图4A、图4B)，且通过小鼠体重变化检测及心肝脾肺肾HE染色(图4C和图4D)验证疫苗具有一定的生物安全性。图4E、图4F、图4G、图4H结果说明mRNA疫苗可显著提升脾脏及肿瘤组织中T淋巴细胞、NK细胞和M1型巨噬细胞比例，降低肿瘤细胞数量，激活免疫系统，抑制肺癌发展。
实验5考察治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗在肺癌骨转移小鼠体内治疗效果
C57BL/6小鼠于胫骨接种荧光肺癌细胞后第7天进行第一次给药，间隔一周再次给药，共给药3次。mRNA疫苗通过鼻粘膜途径进行免疫治疗，接种体积为100μl(MAGE-A1mRNA10μg/只)。末次给药一周后使用小动物活体成像检测小鼠体内荧光肿瘤细胞生存情况。
结果如图5所示，mLPR组显著抑制肿瘤生长，具有良好的抗肿瘤效果。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，其特征在于，由负载单磷酰脂质A的脂质体复合物、鱼精蛋白和mRNA组成；
所述负载单磷酰脂质A的脂质体复合物为单磷酰脂质A吸附于阳离子脂质体上；
所述单磷酰脂质A和mRNA分别占总质量的0.5～1.5％和10～30％。
2.如权利要求1所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，其特征在于，粒径为60～600nm，Zeta电位为+8～+37mV，包封率为60～93％，mRNA的载药量为7.5～20％。
3.如权利要求1所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，其特征在于，可实现单磷酰脂质A与mRNA的共包载，协同发挥抗肿瘤作用，其中单磷酰脂质A可激动TLR4受体，极化巨噬细胞为M1状态；mRNA可翻译为蛋白增强树突状细胞MHC分子表达，活化T细胞免疫效应，协同增强机体免疫能力，用于肺癌及其后期肿瘤骨转移的治疗。
4.如权利要求1所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，其特征在于，可通过Toll样受体信号通路、T细胞信号通路、趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等通路发挥作用，在肺癌及其骨转移过程中直接杀伤肿瘤细胞；
优选的，通过TLR4受体激活、CD8+T、CCR7趋化因子、NKp46和FcRIII介导的细胞毒性增强等免疫途径协同联动杀伤肿瘤。
5.如权利要求1所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，其特征在于，单磷酰脂质A借助自组装吸附于阳离子脂质体的磷脂层后，形成负载单磷酰脂质A的脂质体复合物，之后依靠静电吸附力包裹鱼精蛋白缩合的mRNA。
6.如权利要求1所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA为癌胚抗原、甲胎蛋白、糖类抗原153或黑色素瘤抗原A1；
所述mRNA优选黑色素瘤抗原A1，其理论长度为1970nt，在肺癌组织中高表达。
7.如权利要求1所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，其特征在于，所述单磷酰脂质A为靶向TLR4的脂多糖低毒衍生物，分子量为1763.47；
所述阳离子脂质体由磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000组成；
所述阳离子脂质体与单磷酰脂质A的质量比为30:1～70:1。
8.如权利要求7所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗，其特征在于，所述磷脂为溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷氯盐、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂中的一种或几种。
9.权利要求1～8任一所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法，包括如下步骤：
1)将单磷酰脂质A和阳离子脂质体溶于有机溶剂，旋转蒸发形成脂质薄膜，使用氮气除去有机溶剂，之后加入水化介质，在48～65℃水浴环境下水化孵育5～30min，得到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物；
所述有机溶剂为氯仿-甲醇、二氯甲烷、乙醚、石油醚中的一种或几种；
所述氯仿-甲醇的体积比为9:1～5:1；
所述水化介质为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或生理盐水，浓度为10～45mmol/L，pH为3～7.5；
2)鱼精蛋白与mRNA混匀缩合，得到鱼精蛋白-mRNA缩合物；
3)将鱼精蛋白-mRNA缩合物加入到负载单磷酰脂质A的脂质体复合物中，室温孵育10～30min，即得成品。
10.权利要求1～8任一所述的治疗肺癌及其骨转移的mRNA疫苗的应用，其特征在于，所述疫苗通过皮下注射、肌肉注射或鼻粘膜途径进行免疫治疗3次，每次免疫治疗间隔5～7天；
优选鼻粘膜途径。
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