JP7181880B2 - 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム - Google Patents

免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム Download PDF

Info

Publication number
JP7181880B2
JP7181880B2 JP2019540384A JP2019540384A JP7181880B2 JP 7181880 B2 JP7181880 B2 JP 7181880B2 JP 2019540384 A JP2019540384 A JP 2019540384A JP 2019540384 A JP2019540384 A JP 2019540384A JP 7181880 B2 JP7181880 B2 JP 7181880B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
mrna
composition
cancer
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019540384A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020505403A (ja
JP2020505403A5 (ja
Inventor
ハイファ シェン，
Original Assignee
ザ・メソジスト・ホスピタル
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ・メソジスト・ホスピタル filed Critical ザ・メソジスト・ホスピタル
Publication of JP2020505403A publication Critical patent/JP2020505403A/ja
Publication of JP2020505403A5 publication Critical patent/JP2020505403A5/ja
Priority to JP2022184788A priority Critical patent/JP2023015346A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7181880B2 publication Critical patent/JP7181880B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001104—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001156—Tyrosinase and tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4612—B-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5015—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

関連出願への相互参照
本出願は、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５６０１（係属中；同時に出願；Ａｔｔｙ．Ｄｋｔ ３７１８２．２１５ＷＯ０１）および、２０１７年１月２７に出願された米国仮特許出願６２／４５１，５７５（係属中；Ａｔｔｙ．Ｄｋｔ ３７１８２．２１５ＰＶ０１）に対する優先権を主張し、その内容は、その全体が本明細書に、明白な参照により具体的に援用される。
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、アメリカ国防総省により与えられたＷ８１ＸＷＨ－１２－１－０４１４の助成金ならびに、アメリカ国立衛生研究所により与えられた１Ｒ０１－ＣＡ１９３８８０－０１Ａ１およびＵ４３－ＣＡ２１０１８１の助成金の下、政府支援によりなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
本開示は、分子生物学、腫瘍学、および特にｍＲＮＡワクチンのために最適化された多成分組成物に関する。これらの組成物を含む製剤および医薬、ならびにｍＲＮＡに基づくワクチンの哺乳動物細胞への効率的な送達のための方法、および罹患した哺乳動物における１または複数のがんまたは腫瘍の症状を処置し、および／または改善するための方法も開示される。
治療用ワクチン
ワクチンは通常、身体の免疫系によって認識され得る抗原および身体の免疫反応を増強し得る１または複数のアジュバントから構成されている。しかし治療用がんワクチンは感染性疾患を防止するために使用される予防用ワクチンとは全く異なっている。それは、ワクチンは病原体と戦う抗体を産生する代わりに、がん細胞を殺滅する免疫細胞を生成するのに十分に強力でなければならないからである。治療用ワクチンは、がんおよび感染性疾患を含む複数の種類の生命を脅かす疾患の処置において大きな潜在性を有している。がんワクチン接種の成功を決定する重要な課題は、選択した抗原に対する抗腫瘍応答の強力な誘導である。タンパク質ペプチドおよびＤＮＡプラスミドの両方は、従来よりワクチン開発のための抗原として役立ってきた（Ｍｅｌｅｒｏら、２０１４年；Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｔｒｕｂｅｒら、２０１１年；Ｋａｎｔｏｆｆら、２０１０年）。タンパク質およびペプチドは調製が比較的容易で、大スケールで産生することができるが、抗原ペプチドの選択は患者の独特の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質の型に依存し、したがって個別の患者に適合するようにカスタム化する必要がある。一方、ＤＮＡワクチンは効力が低いという欠点があり、制御できないゲノム組込みのリスクがある（ＭｃＮａｍａｒａら、２０１５年）。
ｍＲＮＡに基づくがんワクチン
ｍＲＮＡは最近、治療用がんワクチンの理想的な抗原源として現れた（ＳｕｌｌｅｎｇｅｒおよびＮａｉｒ、２０１６年）。ｍＲＮＡ分子は複数の抗原をコードするように調整でき、抗原提示細胞におけるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達をトリガーすることによってアジュバントとして作用する（Ｈｅｉｌら、２００４年；Ｄｉｅｂｏｌｄら、２００４年）。さらに、ｍＲＮＡ媒介遺伝子移入は、核移行および転写が要求されないので非分裂細胞において起こり得る一方、プラスミドＤＮＡ媒介遺伝子移入は、分裂細胞において最も効果的である（ＭｃＮａｍａｒａら、２０１５年；ＫａｌｌｅｎおよびＴｈｅｓｓ、２０１４年）。
負電荷のｍＲＮＡ分子は抗原提示細胞に直接進入できないので、ｍＲＮＡに基づくワクチンは通常、ｍＲＮＡ分子をエレクトロポレーションによって患者由来の樹状細胞（ＤＣ）にトランスフェクトすることによって調製される（Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏら、２００１年）。次いでＤＣワクチンは腫瘍抗原の合成、プロセシングおよび提示のために患者に再導入して戻される。いくつかのＤＣワクチンが臨床試験の異なった段階に達している（Ｗｉｌｇｅｎｈｏｆら、２０１３年）。しかし、この手順では既製の治療用ワクチンの大量生産は可能でない。
ｍＲＮＡワクチンを調製する代替の手法は、ｍＲＮＡ分子をナノ粒子内にパッケージ化し、これを体内に直接接種して、そこでワクチンを抗原提示細胞に取り込ませることである。この手法は、抗原提示細胞の高いファゴサイトーシス能力を利用している。プロタミン濃縮ｍＲＮＡワクチンはこのグループにおける重要な部分を占め、そのいくつかは前臨床研究および臨床試験の異なった段階にある（Ｗｅｉｄｅら、２００９年）。ｍＲＮＡを、プロタミンを用いてパッケージ化することは、細胞によるワクチン粒子の取り込みを可能にするだけでなく、宿主細胞におけるＭｙＤ８８依存性ＴＬＲ－７／８シグナル伝達の刺激を促進する（Ｓｃｈｅｅｌら、２００５年）。しかし、裸のｍＲＮＡの一部が体液に曝され、血漿および組織のＲＮａｓｅによる攻撃を受けやすいので、ｍＲＮＡの分解は潜在的な懸念である。さらに、ｍＲＮＡ分子の非抗原提示細胞への曝露は、体内における有害反応のトリガーとなる恐れがある。
従来技術の欠点
産業界および学界では長期にわたって効果的な治療用がんワクチンの開発に注力してきたが、今のところ成功にはほとんど至っていない。前臨床および臨床研究で試験されている治療用がんワクチンの１つの型がｍＲＮＡワクチンであり、これはコア構造（約２０ナノメートル～数百ナノメートルの範囲）に濃縮されたｍＲＮＡ分子で構成されている。ｍＲＮＡワクチンがいったん抗原提示細胞に取り込まれると、これらの細胞の中でｍＲＮＡが放出され、次いでコードされた抗原（複数可）を産生するための鋳型として使用される。そのようなワクチンの例が、ＣｕｒａＶａｃ ｍＲＮＡワクチンである。
そのようなワクチンにおける主な問題は、１）ｍＲＮＡ分子が体液に曝され、したがって組織、細胞、および／または血漿の酵素によって分解されやすいこと、２）「裸の」ｍＲＮＡ分子が全ての種類の免疫細胞と相互作用し、これが望ましくない副作用（例えば、高レベルのサイトカインの分泌）に繋がる可能性があること、および３）そのようなｍＲＮＡは抗原提示細胞によってあまり効果的には内在化されないことである。
大規模のがんゲノムシーケンシングの努力および免疫原性腫瘍変異の予測における技術の進歩の結果として、腫瘍関連ネオ抗原が常に同定されている（例えば、ＳｃｈｕｍａｃｈｅｒおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、２０１５年；Ｓｈｕｋｌａら、２０１５年；Ｙａｄａｖら、２０１４年を参照）。このリソースは新規で改善されたがんワクチンの開発のために前例のない機会を提供してきた。残念ながら、がんワクチンを可能にする技術の開発は遅れている。
しかし、本明細書に開示したような免疫療法は、がん治療法の新たな手段となる。これらの治療法は特定のがん細胞の独特の遺伝的特徴に基づいており、したがって従来の標準的治療の化学療法薬による不必要な攻撃から身体を救うことができる。本明細書に開示したｍＲＮＡに基づくワクチンは、同じ構築物の中に複数のネオ抗原を含む柔軟性を有しており、抗原ペプチド（複数可）の選択（複数可）は個別の患者の独特の変異スペクトルに基づいて調整でき、精密なまたは「個別化された」医療を可能にする。
本明細書に記載した生体適合性のシェル／コア多成分ワクチン送達プラットフォームは、一般的な意味で、抗がん免疫を刺激するための方法において抗原提示細胞（例えば樹状細胞）へのｍＲＮＡの効果的な送達およびそれによる効率的な取り込みのための組成物を提供することによって、当技術分野におけるこれらのおよびその他の固有の限界を克服することにおいて重要な進歩となる。
全体的かつ一般的な意味で、開示したコア／シェル組成物は、「コア」構造内にパッケージされ、外側の親水性脂質二重層を含む「シェル」とともにカプセル化された（例えば、１または複数のがんまたは腫瘍特異性抗原をコードするｍＲＮＡを含む）核酸分子を、（例えば、限定するものではないが樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞等の１または複数の抗原提示細胞を含む）１または複数の選択された哺乳動物細胞に効率的に送達することができる。内側の疎水性コアをカプセル化する親油性シェルの存在により、核酸は組織酵素による分解または他の免疫細胞との相互作用から保護される。さらに、親油性シェルによって抗原提示細胞による組成物の内在化も増大し、従来のｍＲＮＡに基づく治療用ワクチンと比べて、より強力な抗腫瘍免疫が刺激される。
既存の技術に対する重要な進歩として、開示したコア／シェル多成分ワクチン送達システムは、既存のｍＲＮＡに基づくワクチンを構成する従来の単一成分の「コア＋核酸のみ」の構造より優れた、強固な抗腫瘍免疫を刺激することによるｍＲＮＡに基づくがんワクチン開発における現在の「ボトルネック」に対する代替選択肢をもつことを可能にする。これらの多成分の親水性／疎水性シェル／コアにより、樹状細胞の成熟の刺激において、したがって抗原プロセシングおよび提示において、従来のｍＲＮＡワクチンよりも有意に強力なｍＲＮＡワクチンの調製が促進される。
特定の実施形態では、本開示は、インターフェロン－β、インターフェロン－α、およびインターロイキン－１２の刺激において従来のｍＲＮＡコアワクチンよりも有意に強力なコア－シェル構造化ｍＲＮＡワクチンを提供する。そのような多成分の、ｍＲＮＡに基づく、腫瘍抗原をコードする治療用ワクチンは、哺乳動物における１または複数の疾患の処置のため、ならびに特に哺乳動物のがんの１または複数の症状の処置および／または改善のための医薬の調製において特定の用途を見出す。
少なくとも第１の腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡ分子の集団を含む治療用がんワクチンを含む組成物であって、集団が少なくとも第１の正電荷ポリマーを含む複数のポリプレックスコア粒子内に含まれ、さらに複数のポリプレックスコア粒子がそれ自体、第１の生体適合性脂質二重層シェルにカプセル化されている、組成物。
好ましくは、第１の生体適合性脂質二重層シェルは、限定するものではないがヒト樹状細胞、ヒトマクロファージ、およびヒトＢ細胞を含む１または複数の哺乳動物の抗原提示細胞による複数のポリプレックスコア粒子のマクロピノサイトーシスを促進する。
そのような組成物は、生体適合性脂質二重層の中にカプセル化された、ｍＲＮＡコアの中に含まれた、またはコア粒子とそれらを取り囲む／包含するエンベロープ親水性リン脂質二重層との間の空間の中に含まれた、ＣｐＧ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、アラム（ａｌｕｍ）、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、またはそれらの任意の組合せ等の１または複数のアジュバントを必要に応じてさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態では、コア粒子を調製するために使用される正電荷作用物質（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ－ｃｈａｒｇｅｄ ａｇｅｎｔ）は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－（Ｂ－アミノエステル）、ポリ－アルギニン、ポリ－リシン、およびそれらの組合せの１または複数を含む。
同様に、親水性シェル成分を調製するために使用される生体適合性リン脂質は、好ましくは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、Ｏ－エチルホスファチジルコリン（ＥＤＰＰＣ）、コレステロール、およびそれらの組合せの１または複数を含む。
ある特定の実施形態では、生体適合性リン脂質二重層は、好ましくは、
（ａ）約３０％～約７０％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（「ＥＤＯＰＣ」）、
（ｂ）約７０％～約３０％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－エタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、または
（ｃ）約０．５～約５％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（「ＤＳＰＥ－ＰＥＧ」）
を含む。
あるいは、生体適合性脂質二重層は、好ましくは、
（ａ）約４５％～約５５％のＥＤＯＰＣ、
（ｂ）約５５％～約４５％のＤＯＰＥ、および
（ｃ）約１％～約２％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ
を、含んでよい。
本発明の実施において、本明細書に開示した組成物は、好ましくは、１または複数の哺乳動物のがんまたは腫瘍細胞に特異的な少なくとも１つの抗原をコードする、ｍＲＮＡ等の核酸分子の集団を含む。例示的ながん細胞特異的抗原には、これらに限定されないが、乳がん特異的ＨＥＲ２抗原Ｅ７５およびｐ６６、黒色腫特異的抗原ＴＲＰ２、ならびに乳がんおよび肺がんにおけるエクソン２０にＹＶＭＡ挿入を有するＨＥＲ２［ＨＥＲ２ＹＶＭＡ］等の腫瘍変異抗原［ネオ抗原］、ならびにがんゲノムにおける変異の結果として発生したもの等の腫瘍関連抗原が含まれる。例示的ながんおよび腫瘍特異的抗原には、これらに限定されないが、ＨＥＲ２Ｅ７５、ＨＥＲ２ｐ６６、ＨＥＲ２ＹＶＭＡ、およびＴＲＰ２が含まれる。
本明細書に開示した組成物は、好ましくは、好適な哺乳動物細胞に導入された場合に、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）の発現のレベルを増加させるのに適しており、好ましくは、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－β、およびそれらの下流サイトカイン、例えばＣＣＬ－５等の１または複数の発現を増加させるのに適している。
ある特定の実施形態では、開示した組成物は１または複数の種類の哺乳動物細胞の集団への導入に適している。そのような細胞には、これらに限定されないが、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、がん細胞、またはそれらの組合せが含まれる。
本明細書に開示した組成物は、例えば、限定するものではないが、免疫調節剤、抗新生物剤、神経活性薬剤、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、抗炎症剤、抗脂血症剤、ホルモン、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、抗感染症剤（ａｎｔｉ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合性断片、酵素、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、ホルモン、コファクター、ステロイド、アンチセンス分子、またはそれらの任意の組合せ等の薬剤を含む、１または複数の追加の治療剤を必要に応じてさらに含んでよい。好ましい実施形態では、免疫調節剤はＩＬ－１２ｐ７０、タンパク質、ＦＬＴ３リガンド［ＦＬＴ３Ｌ］、およびＧＤＣ－０９１９またはＩＮＣＢ２４３６０等のインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ［ＩＤＯ－１］の小分子阻害剤からなる群から選択される化合物である。
ある特定の実施形態では、治療剤は（これらに限定されないが）、シクロホスファミド、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキセート、エピルビシン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イサベピロン、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、窒素マスタード、硫黄マスタード、四硝酸プラチン（ｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）（例えばシスプラチン）、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシン、またはそれらの任意の組合せ等の１または複数の化合物を含んでよい。
他の実施形態では、組成物は、例えば、細胞によって別々に（即ち、異なるｍＲＮＡ分子から）、またはともに（即ち、１つのｍＲＮＡ分子から）産生される複数抗原ペプチドを含む、１または複数の抗原、抗原性ポリペプチド、またはその抗原性ペプチド断片を必要に応じてさらに含んでよい。そのような抗原は可溶性であってよく、ここで、抗原はコアの外部および外部脂質二重層の内側表面で画定される内腔もしくは容積の中に組み込まれ得るか、または、不溶性抗原の場合には、抗原はコア構造の中におよび／もしくは脂質二重層それ自体の中に組み込まれ得る。
可溶性抗原の例には、これらに限定されないが、ｐ６６ ＨＥＲ２抗原ペプチド（ＨＥＲ２ｐ６６）、およびそのホモログまたは抗原性断片が含まれる。
わずかに可溶性の抗原の例には、これらに限定されないが、Ｅ７５ ＨＥＲ２抗原ペプチド（ＨＥＲ２Ｅ７５）、およびそのホモログまたは抗原性断片が含まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示したがんワクチン送達組成物は、１もしくは複数の薬学的に許容される担体、緩衝剤、希釈剤、ビヒクル、もしくは賦形剤と混合してよく、または１もしくは複数の界面活性剤、リポソーム、ニオソーム、エトソーム、トランスフェロソーム、リン脂質、スフィンゴソーム、エキソソーム、もしくは細胞それ自体によって産生される他の種類のベシクルと混合してもよい。
そのような組成物は、好ましくは哺乳動物への全身投与のため、好ましくは皮内もしくは静脈内投与、筋肉内、腹腔内、結節内、もしくは眼内投与のため、または、あるいはヒトへの皮膚パッチの形態で、製剤化され、限定するものではないがヒト樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞を含む１または複数の抗原提示細胞との接触およびこれらによる取り込みのために特に製剤化される。
ある特定の実施形態では、開示したｍＲＮＡに基づくワクチン組成物は、組成物および組成物の投与を必要とするヒトがん患者等の哺乳動物への組成物の投与のための指示の少なくとも第１のセットを含む治療用キットの一部として適合され構成されてよい。そのようなキットは、限定するものではないが、感染性疾患［例えば、ウエストナイルウイルスおよびシャーガスのためのワクチン］、心血管疾患［例えば、心不全を防止するためのＨＳＰ６０ワクチン］等を含む、哺乳動物におけるがん、過剰増殖性障害、もしくは他の疾患、機能不全、外傷、または異常な状態の１または複数の症状の防止、診断、処置または改善のためのレジメンの一部として利用することができる。
本開示のさらなる態様は、がんの１または複数の症状の処置または改善を必要とする動物におけるがんの１または複数の症状を処置しまたは改善するための方法である。全体的かつ一般的な意味で、そのような方法は一般に、動物におけるがんの１または複数の症状を処置しまたは改善するのに十分な時間、有効量の本明細書に開示したｍＲＮＡに基づく治療用がんワクチン組成物の１または複数を動物に投与するステップを少なくとも含む。一部の実施形態では、がんは難治性、転移、再発、または治療抵抗性がんとして診断されまたは同定され得る。
そのようながんの例には、これらに限定されないが、乳がん、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、膵がん、膠芽細胞腫、頭頚部がん、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肝がん、腎がん、膀胱がん、黒色腫、および罹患した哺乳動物における関連状態が含まれる。
ある特定の実施形態では、がんは転移がん、例えば、転移乳がん、転移肺がん、転移黒色腫、または転移結腸直腸がん、胃がん、膵がん、膠芽細胞腫、頭頚部がん、肝がん、腎がん、膀胱がん、または罹患した哺乳動物における１もしくは複数の関連状態であり得る。
そのような方法は、治療有効量の放射線または追加の化学療法剤を、単回投与で、あるいは１日もしくはそれより長い日数からの期間にわたる、１週もしくはそれより長い週数の期間にわたる、または１か月もしくはそれより長い月数の期間にわたる、またはそれより長い期間にわたる一連の複数回投与で、動物に投与するステップを必要に応じてさらに含んでよい。
そのような方法は、第２の異なる化学療法剤または第２の異なる治療用がんワクチンを、処置中の罹患した哺乳動物に投与するステップを必要に応じてさらに含んでもよい。
別の実施形態では、本開示は、活性剤、および特に１もしくは複数の抗がん抗原、またはそのような抗がん抗原をコードする１もしくは複数のｍＲＮＡを、それを必要とする哺乳動物対象の１または複数の細胞、組織、器官、または系に投与するための方法も提供する。本方法は一般に、対象の体内または体に関する１または複数の選択された組織、器官、系、または細胞に存在する細胞（例えば、樹状細胞等の抗原提示細胞）の集団にｍＲＮＡワクチンを投与するのに有効な量および時間で、本明細書に開示した組成物の１または複数を、それを必要とする哺乳動物対象に提供するステップを含む。特に好ましい実施形態では、対象はヒトであり、組成物は、それ自体、外側の脂質二重層の中に含まれるポリプレックスコア粒子の集団の中に含まれた、ｍＲＮＡ抗原をコードする成分を含む。
開示した組成物は、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏ処置レジメンにおいて特定の有用性を見出し、これらは、限定するものではないが、１または複数のヒトのがん、過剰増殖性障害、感染性疾患、心疾患等の症状の処置または改善のためを含む種々の治療適応における使用のために、単独で、または代わりに、限定するものではないが、１もしくは複数の抗がん抗原、１もしくは複数の抗原ペプチド、１もしくは複数の診断試薬、１もしくは複数の治療試薬、１もしくは複数の細胞傷害性試薬、１もしくは複数の化学療法剤、１もしくは複数のアジュバント、１もしくは複数の免疫刺激剤、１もしくは複数の免疫調節剤、またはそれらの任意の組合せを含む１または複数の追加の薬剤と組み合わせて、製剤化することができる。
本明細書に記載したように、開示したワクチンシステムは、１または複数の活性剤、例えば、例えば、１もしくは複数の予防剤、１もしくは複数の治療剤、１もしくは複数の診断剤、１もしくは複数のワクチン、１もしくは複数のイメージング剤、１もしくは複数の放射標識、１もしくは複数のアジュバント剤、１もしくは複数の化学療法剤、１もしくは複数の細胞傷害性薬剤、１もしくは複数のチェックポイント阻害薬［例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体等］、またはそれらの任意の組合せを、必要に応じてさらに含んでよい。
関連する実施形態では、本発明は、典型的には１または複数の薬学的に許容される担体、目的の対象への組成物の投与のための１または複数のデバイス、ならびに、がん等の哺乳動物の疾患の診断または処置において組成物を使用するための１または複数の指示のセットと組み合わせて、本明細書に開示したコア／シェルに基づくｍＲＮＡワクチン送達システムの１または複数を含む治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）および／または治療用キットも提供する。
本発明は、全体的かつ一般的な意味で、ｍＲＮＡ分子の集団を、哺乳動物の体内の（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、または腫瘍細胞を含む）哺乳動物細胞の集団に効果的に送達するための組成物および方法も提供する。そのような組成物は、好ましくは、対象における１または複数の疾患または異常な状態を処置しまたは改善するのに有効な量および時間で、哺乳動物対象に投与される。ある特定の実施形態では、対象は、例えば、１または複数のがんまたは他の過剰増殖性障害を含む１または複数の異常な細胞増殖状態を有するリスクがあり、そのように診断され、またはその疑いがある。
本明細書で注目するように、本開示の組成物は、限定するものではないが、静脈内、皮膚に（ｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、皮下、あるいは対象の体内もしくは体に関する１もしくは複数の細胞または１もしくは複数の組織、器官、もしくは腫瘍への直接注射を含む、投与のための任意の１または複数の従来の方法によって、対象に投与してもよい。
本明細書においてさらに述べるように、ある特定の応用では、対象からｅｘ ｖｉｖｏで得られた細胞の集団を、本明細書に開示したワクチン組成物と接触させ、その後、続いて得られた接触させた細胞を対象の体内に再導入することが望ましいことがある。そのようなｅｘ ｖｉｖｏ治療は、開示したｍＲＮＡワクチンをヒト樹状細胞の集団に導入し、活性成分を細胞と接触させ、次いで得られた形質転換細胞を動物の体内に再導入して戻すことにおいて有用であると特に考えられる。好ましくは、そのようなｅｘ ｖｉｖｏ操作における使用のために抽出される樹状細胞は、処置を受けている実際の患者の樹状細胞である。
特定の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチン組成物は、薬学的投与のため、好ましくはヒトへの投与のために製剤化されてよい。そのような組成物は、１または複数の追加の治療剤、化学療法剤、アジュバント、または第２の異なるｍＲＮＡワクチンをさらに含んでよい。
本明細書に開示したｍＲＮＡワクチンをｉｎ ｖｉｔｒｏで使用して、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団を拡大することもできる。この応用の例は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団を患者に注入して戻す前に拡大するために、ヒト患者由来Ｔ細胞と共培養することである。
さらに、開示したｍＲＮＡワクチンを使用して、Ｔ細胞操作のために腫瘍抗原特異的Ｔ細胞受容体を単離することもできる。例は、ｍＲＮＡワクチンを含む樹状細胞をヒトＴ細胞と共培養し、それから高い結合能力を有するＴ細胞を単離することである。いったんＴ細胞が単離されれば、そのＴ細胞受容体をシーケンシングによって決定し、ＴＣＲ－Ｔ細胞（がん免疫療法の別のブランチ）を生成するために使用することができる。
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を示すために含まれる。本発明の原理の理解を促すために、図面に示された実施形態または実施例を参照し、特定の言語を使用してそれを説明する。それにもかかわらず、それによって本発明の範囲の限定が意図されないことが理解される。記載される実施形態における任意の変更およびさらなる修正、ならびに本発明の原理の任意のさらなる応用は、本発明が関係する当業者に通常想到するはずである。本発明は、同様の参照番号が同様の要素を識別する添付の図面と併せて以下の説明を参照することにより、よりよく理解され得る。
図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｋ、および図１Ｌは、リポポリプレックスｍＲＮＡワクチンの構造および特徴付けを示す。図１Ａは、本開示の一態様に従って調製されたリポポリプレックス－ｍＲＮＡに基づくワクチンの概略図である。例示的なワクチンは、正電荷ＰｂＡＥポリマーと負電荷ｍＲＮＡ分子との間の静電的相互作用によって組み立てられたポリプレックス疎油性（ｌｉｐｏｐｈｏｂｉｃ）「コア」から構成される。得られたポリプレックス－ｍＲＮＡコアは、次いで、親水性の脂質二重層「シェル」にカプセル化される。図１Ｂは、例示的なポリプレックス－ｍＲＮＡ結合に関するゲル遅延アッセイを示す。試料は、遊離ｍＲＮＡ、１０、２０、３０、および４０（ｗｔ．／ｗｔ．）のポリプレックス／ｍＲＮＡ、の順にロードされた。図１Ｃ、図１Ｄ、および図１Ｅは、空のリポソームシェル（図１Ｃ）、ポリプレックス／ｍＲＮＡコア（ｗｔ．／ｗｔ．＝２０）（図１Ｄ）、およびリポポリプレックス／ｍＲＮＡコア－シェル構造（図１Ｅ）の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像を示す。図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｋは、ｍＲＮＡパッケージ化粒子で処置したＤＣ２．４細胞でのｅＧＦＰ発現を示す。ＤＣ２．４細胞をＰＢＳ対照（図１Ｆ）、ＰｂＡＥ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡコア（図１Ｇ）、ＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥパッケージ化ＰｂＡＥ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ（図１Ｈ）、ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌパッケージ化ＰｂＡＥ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ（図１Ｉ）、ＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥ／Ｒ８パッケージ化ＰｂＡＥ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ（図１Ｊ）、またはプロタミン／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡコア（図１Ｋ）で処置し、２４時間後に蛍光顕微鏡法でｅＧＦＰ発現を検出した。図１Ｌは、様々な粒子タイプで処置した場合のＤＣ２．４の生存率を示す。
図２は、哺乳動物樹状細胞の集団による例示的なリポポリプレックス／ｍＲＮＡコアシェルワクチンの優先的な取り込みを示す。細胞選別の前に２４時間、リポポリプレックス／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡとともにインキュベートされた後のＤＣ２．４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびｍＤＭＥＣ細胞のＧＦＰ陽性細胞について、フローサイトメトリー分析が実施され；生物発光画像を使用して、ＬＰＰ／Ｌｕｃのｓ．ｃ．注射４８時間後の、マウスにおいてルシフェラーゼ発現を検出した。左側には対照マウスがあり；右側にはＬＰＰ／Ｌｕｃ処置マウスがある。
図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、および図３Ｈ は細胞進入のメカニズムを示す。図３Ａ～図３Ｆは、モック対照（図３Ａ）、アミロリド（図３Ｂ）、クロルプロマジン（図３Ｃ）、クロロキン（図３Ｄ）、ゲニステイン（図３Ｅ）、およびピモジド（図３Ｆ）の存在下でＬＰＰ／０．５μｇＦＡＭ標識ｅＧＦＰ ｍＲＮＡで処置したＤＣ２．４細胞の画像を表す。図３Ｇは、ＦＡＭ陽性細胞のＩｍａｇｅ Ｊ分析を示し、一方で図３Ｈは、ＤＣ２．４細胞によるＬＰＰ／ＦＡＭ標識ｅＧＦＰ ｍＲＮＡの時間依存的な取り込みを示す。エラーバーは、三重の実験の平均±標準偏差を表す。
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃは、ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンによるＤＣ刺激を示す。図４Ａは、ＬＰＰ／ＯＶＡ（ＯＶＡ ｍＲＮＡを用いてパッケージ化されたＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）および対照で処置したＢＭＤＣにおけるサイトカイン分泌を示し；図４Ｂは、ＴＬＲ７／８阻害剤ＯＤＮ２０８７によるＩＬ－１２およびＩＦＮ－β発現の阻害を示し；図４ＣはＤＣ刺激でのＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡとＬＰＰ／ＯＶＡタンパク質との間の比較であり；示されるものはＤＣ成熟マーカーのフローサイトメトリー分析である。エラーバーは、三重の実験の平均±標準偏差を表す。
図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃは、ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンによるＤＣ抗原交差提示の刺激を示す。図５Ａは、Ｈ－２ｋｂ－ＯＶＡ２５７－２６４提示のフローサイトメトリー分析である。図５Ｂは、処置後のＢＭＤＣとの共インキュベーション後のＯＶＡ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞による時間依存的なＩＬ－２分泌を示す。Ｂ３Ｚ：ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞；ＤＯＢＷ：ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞。図５Ｃは、処置後のＤＣ２．４細胞との共インキュベーション後のＯＶＡ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞による時間依存的なＩＬ－２分泌を示し；示されるものは、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡまたはＬＰＰ／ＯＶＡタンパク質で前処置したＤＣ２．４細胞との共インキュベーション後のＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌の比較である。
図６Ａおよび図６Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＰ／ＯＶＡからの抗腫瘍活性を示す。図６Ａは、ｓ．ｃ．によるＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡワクチン接種の３、６、および２４時間後の血清ＩＦＮ－βレベルを示し；図６Ｂは、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡによるＢ１６－ＯＶＡ黒色腫肺転移の阻害を示す。処置スケジュール（上のパネル）と処置後のマウスの肺の代表的な画像（中央のパネル）が示され、肺の腫瘍結節の平均数がまとめられている（下のパネル）。データは平均±ＳＥＭで表される。各群に５匹のマウスがいる。
図７は、ｍＲＮＡ分子が増加する量のポリマー（ＰｂＡＥ）と混合され、試料がアガロースゲルでの電気泳動により分離されたことを示す。非結合のｍＲＮＡ分子は底部に移動し、結合したｍＲＮＡ分子はポリマーとともに上部に残った。レーン＃１：遊離ｍＲＮＡ、レーン２～５：増加する量のポリマーを含むｍＲＮＡ分子。
図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ、非標的化および標的化のｍＲＮＡワクチンナノ粒子のサイズ分析を示す。
図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃは、それぞれ、本開示の一態様による、例示的な空の脂質シェル（左）、ｍＲＮＡコア（中央）、およびｍＲＮＡワクチンナノ粒子全体の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、および図１０Ｆは、ＤＣ２．４樹状細胞を、ｍＲＮＡコア形態（ＰｂＡＥ／ｍＲＮＡコアまたはプロタミン／ｍＲＮＡコア）の、または脂質シェル中にパッケージ化した（本発明者らのｍＲＮＡワクチン、ＤＯＴＡＰ／コレステロールカプセル化ｍＲＮＡ、またはＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥ／Ｒ８カプセル化ｍＲＮＡ）、同量のＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）ｍＲＮＡと共インキュベートした。ＥＧＦＰ発現は２４時間後に蛍光顕微鏡でモニターされた。
図１１は、ＤＣ２．４細胞を裸のｍＲＮＡコアまたはパッケージ化ｍＲＮＡとインキュベートし、細胞生存率を２４時間後に決定したことを示す。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、Ｃｙ５標識ｍＲＮＡが非標的化ワクチンまたは標的化ワクチン中にパッケージ化されたことを示す。次いで、蛍光ワクチン粒子をＤＣ２．４細胞とともに４時間インキュベートした。蛍光ｍＲＮＡワクチン粒子を内在化した細胞のパーセンテージ（図１２Ａ）および全蛍光を有する細胞（図１２Ｂ）を測定した。
図１３は、ｍＲＮＡワクチンによる樹状細胞成熟の刺激を示す。骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）をｍＲＮＡワクチンまたはワクチンの個々の成分で処置し、Ｉ型インターフェロンサイトカインインターフェロン－β（ＩＦＮ－β）および樹状細胞成熟マーカーＩＬ－１２ｐ７０の分泌を酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。
図１４は、ＴＬＲ７／８阻害剤ＯＤＮ２０９５によるｍＲＮＡワクチン媒介樹状細胞刺激の阻害を示す。ＢＭＤＣは、オボアルブミンタンパク質（ＯＶＡ）、ＴＬＲ７／８阻害剤ＯＤＮ２０９５、ＯＶＡを発現するｍＲＮＡワクチン、またはｍＲＮＡワクチンとＯＤＮ２０９５の組合せで処置し、Ｉ型インターフェロンサイトカインインターフェロン－β（ＩＦＮ－β）および樹状細胞成熟マーカーＩＬ－１２ｐ７０の分泌がＥＬＩＳＡによって測定された。
図１５は、ＰＢＳ陰性対照、プロタミン／ｍＲＮＡコア、またはＯＶＡ特異的ｍＲＮＡワクチン（ＯＶＡタンパク質を発現するｍＲＮＡワクチン）で処置したＢＭＤＣを示し；次いで、フローサイトメトリーを適用して、ＭＨＣＩ－ＯＶＡエピトープも提示したＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を検出した。
図１６Ａは、ＯＶＡ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞（ＤＯＢＷ）およびＣＤ８ Ｔ細胞（Ｂ３Ｚ）とともに２４時間または４８時間共インキュベートしたＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンで処置したＢＭＤＣ細胞を示し、図１６Ｂは、それで処置したＤＣ２．４細胞を示す。次いで、Ｔ細胞によるＩＬ－２発現を、ＥＬＩＳＡで検出および定量した。
図１７は、ＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンがＩＤＯ１阻害剤ＩＮＣＢ０２４３６０とともに共パッケージ化され、ＢＭＤＣの処置に適用されたことを示す。次いで、ＢＭＤＣをＯＶＡ特異的Ｔ細胞と共インキュベートし、ＩＬ－２分泌をＥＬＩＳＡで測定した。
図１８Ａおよび図１８Ｂは、Ｃ５７ＢＬ６マウスをＰＢＳ、ＯＶＡタンパク質、またはＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンで３回処置し、脾臓およびリンパ節からの細胞（活性化Ｔ細胞を含む）を単離し、Ｔ細胞刺激状態および腫瘍細胞殺滅活性の試験に適用したことを示す。図１８Ａでは、単離された細胞がＯＴＩおよびＯＴＩＩのＯＶＡ特異的抗原ペプチドでチャレンジされた（即ち、共インキュベートされた）後のインターフェロン－γ分泌。図１８Ｂでは、単離されたＴ細胞とＢ１６－ＯＶＡ腫瘍細胞の共インキュベーション、および細胞生存率を測定した。
図１９は、Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍肺転移を有するＣ５７ＢＬ６マウスをＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンで３回処置した（３、７、および１０日目）ことを示す。１８日目にマウスを安楽死させ、肺の腫瘍結節を数えた。上のタイムラインは処置スケジュールを示す。ＰＢＳ対照群とＯＶＡ ｍＲＮＡワクチン処置群の代表的な肺が画像の中央に示され；比較のために、肺の腫瘍結節の数に基づく定量が示されている。
本開示の特定の一態様によるワクチン構造の例示的な概略図を示す。その中で、（１）中央のｍＲＮＡコア、（２）外側の脂質シェル（標的化部分を含むかまたは含まない）、ならびに（３）間にある小分子および／またはタンパク質で構成されるｍＲＮＡワクチンナノ粒子の概要が視覚化され得る。
図２１は、ＩＬ１２ｐ７０をコードするｍＲＮＡの共パッケージ化が、単一抗原ワクチン単独と比較してｍＲＮＡワクチン活性をさらに促進することを示す。
配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型ＴＰ５３ペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号２は、変異したＴＰ５３ペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号３は、野生型ＴＰ５３ペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号４は、変異したＴＰ５３ペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号５は、野生型ＰＩＫ３ＣＡペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号６は、変異したＰＩＫ３ＣＡペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号７は、野生型ＰＩＫ３ＣＡペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号８は、変異したＰＩＫ３ＣＡペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号９は、野生型ＰＴＥＮペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
配列番号１０は、変異したＰＴＥＮペプチド由来の例示的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであり、本開示の１または複数の態様に従って有用である。
説明的実施形態の記述
本発明の説明的実施形態を以下に記述する。明瞭にするため、本明細書には実際の実施の全ての特徴を記載しているわけではない。もちろん、任意のそのような実際の実施形態の開発において、実施ごとに様々であるシステム関連および事業関連の制約の準拠等の開発者の固有の目的を達成するために、実施に固有な多くの決定を下さなければならないということが理解されよう。さらに、そのような開発努力は複雑で時間がかかるものであるが、本開示の恩恵を受ける当業者には日常の業務であることが理解されよう。
がん
がんは、間違いなく公衆の健康に対する最大の世界的脅威の１つである。がんの転移は悪性疾患の重要な特徴であり、固形腫瘍に関連する死亡の９０％超の原因となっている。がんの転移の機構についてよく分かっていないので、腫瘍の転移を効率的に制御するために利用可能な診断／予後の徴候および特定の処置は存在しない。実際、転移は、いくつかの腫瘍細胞が原発病巣を離れて遠い部位に定着する、良好に調整された一連の事象を含む複雑なプロセスである。原発腫瘍の中の全ての細胞が転移する能力を有しているわけではないので、転移がん細胞が特別の特徴を有し、これが価値ある治療目標を提供できるということが推論される。
ｍＲＮＡに基づく治療用がんワクチン
ｍＲＮＡに基づく治療用がんワクチンは、ＤＮＡワクチンからのゲノム組込みの潜在的危険もペプチドワクチンからの抗原選択の制限もなしに、強固な抗がん免疫をトリガーするという利点を有している。しかし、正電荷タンパク質コア構造の中の凝縮したｍＲＮＡ分子で構成された従来のｍＲＮＡワクチンは、抗原提示細胞によって効果的には内在化されず、したがって、血漿および組織の酵素による分解からｍＲＮＡ分子を十分に保護することができない。
ｍＲＮＡをパッケージするためのリポポリプレックス組成物
一態様では、本開示は、核酸分子（例えばｍＲＮＡを含む）をポリマー性ポリプレックス「コア」の中にパッケージし、このコアが次にリン脂質二重層で構成された「シェル」構造中にロードされるように設計されている、リポポリプレックス（ＬＰＰ）およびタンパク質に基づくシェル／コア送達システムを提供する。説明的なシステムを図１Ａに示し、そのようなワクチン送達システムの一般化された概略図を図２０に示す。これらの組成物は疎水性のポリプレックスコア構造の内部のｍＲＮＡ分子をＲＮＡｓｅによる攻撃および引き続く分解から保護することができるだけでなく、コアを取り囲むエンベロープリン脂質二重層シェル構造の存在が（限定するものではないがマクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞等を含む）抗原提示細胞によってベクターをより効率的に内在化するように作用し、小胞システムによる粒子の輸送およびｍＲＮＡ分子のコア構造からサイトゾルへの最終的な放出を促進し、コードされた抗原の産生を促進する。
実施例１において、特定のＬＰＰの組成および形態を系統的に特徴付け、ＤＣによるＬＰＰ／ｍＲＮＡの細胞取込みおよびコードされたペプチド抗原のＤＣ内での得られるタンパク質合成も研究した。抗原モデルとしてオボアルブミン（ＯＶＡ）を適用することによって、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンに対する免疫応答を細胞培養で調べ、抗腫瘍免疫も、ＯＶＡを発現するＢ１６黒色腫細胞で確立した黒色腫肺転移のマウスモデルで評価した。
医薬製剤
ある特定の実施形態では、本開示は、単独で、または１もしくは複数の他の診断、予防、および／もしくは治療の様式と組み合わせて、動物の１または複数の細胞または組織への投与のための薬学的に許容される製剤において調製されたワクチン送達組成物に関する。薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は当業者には周知であり、種々の診断およびがん予測レジメンにおいて本明細書に記載した特定のＬＰＰ－ｍＲＮＡに基づくワクチン組成物を使用するための好適な投薬および処置レジメンの開発も周知である。
ある特定の状況では、適切に製剤化した薬学的ビヒクル中の開示したポリマー性ポリプレックスコア／リン脂質二重層シェルに基づくワクチン送達システムを、限定するものではないが、皮下、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、腫瘍内、腹腔内、経皮、局所、経口もしくは経鼻吸入、または直接注射で、動物、好ましくはヒトの体内または体に関する１または複数の細胞、組織、または器官への１または複数の標準的な送達デバイスによって送達することが望ましい。
投与の方法は、そのそれぞれが明示的な参照により全体として本明細書に具体的に組み込まれる米国特許第５，５４３，１５８号、第５，６４１，５１５号、および第５，３９９，３６３号に記載された様式を含んでもよい。遊離の塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は無菌水中で調製してよく、ヒドロキシプロピルセルロース等の１または複数の界面活性剤と適切に混合してよい。分散液もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、油、またはそれらの混合物中で調製してよい。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
注射可能な水溶液の投与のため、限定するものではないが、溶液は必要な場合適切に緩衝され、液体希釈剤は最初に十分な食塩水またはグルコースで等張化され得る。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、および／または腹腔内投与に特に好適である。これに関し、本発明の組成物は、例えば、無菌の水性媒体、緩衝剤、希釈剤等を含む１または複数の薬学的に許容されるビヒクル中で製剤化してよい。例えば、所与の投与量の活性成分（複数可）を特定体積の等張溶液（例えば等張のＮａＣｌに基づく溶液）に溶解し、次いで提案した投与部位に注射するか、または静脈内注入に適したビヒクルでさらに希釈してよい（例えば「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」、１５版、１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照）。処置される対象の状態、処置の程度、および投与部位によって投与量のいくらかの変動が必然的に起こるが、それにも関わらず、投与に責任のある者は、医学および薬学の技術分野における通常の知識を使用して、個別の対象に適した正しい投与レジメンを決定することができる。
無菌の注射可能な組成物は、開示したワクチン組成物を必要な量で、必要に応じて上に列挙した他の成分のいくつかとともに適当な溶媒に組み込み、次いで濾過滅菌を行うことによって調製してよい。一般に、分散液は、選択され滅菌された活性成分（複数可）を、基礎分散媒および上に列挙した成分からの必要な他の成分を含む無菌のビヒクルに組み込むことによって調製できる。本明細書に開示したワクチン組成物は、中性または塩の形態で製剤化してもよい。
薬学的に許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）酸付加塩を含み、これは、限定するものではないが塩酸もしくはリン酸等の無機酸、または限定するものではないが酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸とともに形成される。遊離のカルボキシル基とともに形成される塩も、限定するものではないが水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄等の無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導することができる。製剤化されれば、液剤は投与製剤に適合した方法で、また意図した用途に効果的なかかる量で投与される。本発明の化合物の製剤は、持続放出カプセル、ヒドロゲル、コロイド、粘稠ゲル、経皮試薬、鼻内および吸入製剤等を含む注射可能な液剤、局所調製物、口腔製剤等の種々の剤形で容易に投与し得る。
本明細書に開示したワクチン組成物の量、投薬レジメン、製剤、および投与は、本教示の恩恵を有する当業者の技能範囲内にある。しかし、開示したｍＲＮＡに基づくワクチン組成物の１または複数の診断有効（即ち薬学的に有効な）量の投与は、限定するものではないが、それを必要とする患者に望ましい恩恵を提供するために十分な量の送達された薬剤の単回注射等の単回投与によって達成できる可能性がある。あるいは、一部の状況では、そのような手順（複数可）を受ける選択された個体へのそのような組成物の投与を監督する医師によって決定され得るように、比較的短い期間に、または比較的長い期間にわたってさえ、開示した組成物の複数回または継続的投与を提供することが望ましいことがある。
典型的には、本明細書に記載したポリマー性ポリプレックスコア／リン脂質二重層シェルに基づくワクチン送達システムの１または複数の製剤は、少なくとも有効量の第１の活性剤を含む。好ましくは、製剤は少なくとも約０．００１％のそれぞれの活性成分、好ましくは少なくとも約０．０１％の活性成分を含んでよいが、活性成分（複数可）の百分率はもちろん変動してよく、便利には全製剤に基づいて約０．０１～約９０重量％もしくは体積％、または約０．１～約８０重量％もしくは体積％、またはより好ましくは約０．２～約６０重量％もしくは体積％の量で存在してよい。当然ながら、それぞれの組成物中の活性化合物の量は、化合物の任意の所与の単位用量で好適な投与量が得られるように調製してよい。溶解性、生物利用性、生物学的ｔ１／２、投与経路、製品寿命、ならびに他の薬理学的考慮等の因子が、そのような医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、種々の投与量および処置レジメンが望ましいことがある。好ましい実施形態では、活性剤は内側のポリプレックスの中に含まれるｍＲＮＡワクチン成分である。
本発明の多くの実施形態において全身投与が効果的であると想定されるが、本明細書に開示した製剤が身体の１または複数の器官、組織、または細胞型への直接注射に適していることも想定される。例えば、開示した組成物の体内の特定の目立たない場所への直接投与、または腫瘍もしくはがんの組織への直接投与を、関連する医療腫瘍学技術分野における当業者に公知の好適な手段を使用して行ってもよい。
本発明の医薬製剤は１または複数の賦形剤、緩衝剤、または希釈剤をさらに含んでよく、哺乳動物細胞、特にヒト細胞との接触のため、および／または哺乳動物対象、例えばヒト患者への投与のために特に製剤化される。組成物は１もしくは複数の診断剤もしくは予後剤（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ）を必要に応じてさらに含んでよく、および／またはマイクロスフェア、ミクロ粒子、ナノスフェア、もしくはナノ粒子の集団の中に製剤化されてもよく、特にヒトの１または複数の細胞、組織、器官、または身体への投与のために製剤化されてよい。
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は当業者には周知であり、限定するものではないが、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻内、腫瘍内、および筋肉内投与経路を含む種々の様式で本明細書に記載した特定の組成物を使用するための好適な投薬、診断および／または処置レジメンの開発も周知である。
採用した組成物の特定の量、および投与の特定の時間、または開示したワクチン製剤を採用した組成物の投薬レジメンは、本教示の恩恵を有する当業者の技能範囲内にある。しかし、開示した製剤の投与は、そのような処置を受ける患者に所望の恩恵を提供するのに効果的な時間、製剤の１または複数の用量を投与することによって達成できる可能性がある。そのような投与レジメンは、特定の状態または患者、投与される治療の程度または期間等に応じて、化合物の投与を監督する医師によって決定されてよい。
本明細書に開示した１または複数の活性成分を含む医薬製剤は、決してヒトにおける使用のみに限定されるものでも、霊長類、または哺乳動物における使用に限定されるものでもない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示した方法および組成物は鳥類、両生類、爬虫類、または他の動物種を使用して用いることができる。しかし好ましい実施形態では、本発明の組成物は、がん細胞の転移潜在能を調節するための種々のレジメンにおいて、好ましくは哺乳動物、特にヒトへの投与のために製剤化される。上記のように、そのような組成物はヒトにおける使用にのみ限定されず、限定するものではないが選択された家畜、外来のまたは飼い慣らされた動物、（ペット等を含む）伴侶動物、非ヒト霊長類、ならびに動物学的標本、または他の種類の捕獲標本（ｃａｐｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎ）等への投与を含め、獣医学的投与のために製剤化されてもよい。
医薬の調製のための組成物
本発明の別の重要な態様は、例えば脊椎哺乳動物を含む動物における１または複数の疾患、機能不全、異常な状態、または障害の１または複数の症状を防止し、診断し、処置し、および／または改善するための医薬の調製において、開示した組成物（ならびにそれらを含む製剤）を使用するための方法に関する。開示した組成物の使用は、がんの診断および／もしくは予後において、がんの転移の検出もしくは予測において、またはその程度のモニタリングにおいて、および／または１もしくは複数のがん細胞型の転移潜在能の抑制のために、特に意図される。
そのような使用は一般に、罹患した哺乳動物におけるがんの１または複数の症状を診断し、処置し、軽減し、または改善するのに十分な量および時間で、開示したワクチン組成物の１または複数を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む。
開示したｍＲＮＡに基づくワクチン組成物の１または複数、ならびに特に罹患した哺乳動物におけるがんの１または複数の症状の治療および／または改善における使用のための少なくとも第１の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む組成物を含む医薬製剤も、本発明の一部を形成する。
例示的定義
本発明によれば、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列等は、これらに限定されないが、ＤＮＡ（これらに限定されないが、ゲノムＤＮＡまたはエクストラゲノムＤＮＡを含む）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ（これらに限定されないが、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含む）、ヌクレオシド、および天然源から得た、化学的に合成された、改質された、または他の方法により人の手で全体としてもしくは部分的に調製されもしくは合成された好適な核酸セグメントを含む。
他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における当業者によって共通に理解されているのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いる多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）、Ｊ． Ｓｔｅｎｅｓｈ（編）、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９年）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （第３版）、Ｐ． ＳｉｎｇｌｅｔｏｎおよびＤ． Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ（編）、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（２００７年）；Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（第２版）、Ｐ． Ｗａｌｋｅｒ（編）、Ｃｈａｍｂｅｒｓ（２００７年）；Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （第５版）、Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ（１９９１年）；ならびにＴｈｅ ＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｇ． ＨａｌｅおよびＪ．Ｐ． Ｍａｒｇｈａｍ（編）、ＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓ（１９９１年）。
本明細書に記載した方法および組成物と同様または等価の任意の方法および組成物が本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および組成物を本明細書に記載する。本発明の目的のため、明確にして参照を容易にするために、以下の用語を下に定義する。
長年にわたる特許法の慣例に従い、単語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、特許請求の範囲を含む本出願において用いる場合、「１または複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味する。
用語「約」および「ほぼ」は、本明細書で用いる場合、相互交換可能であり、所与の数の付近のある範囲の数、ならびに列挙した数の範囲内の全ての数を指すと一般に理解されるべきである（例えば、「約５～１５」は、他に述べない限り、「約５～約１５」を意味する）。さらに、本明細書中の全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数のそれぞれを含むと理解すべきである。
本明細書で用いる場合、「抗原性ポリペプチド」または「免疫原性ポリペプチド」は、脊椎動物に導入された場合に、脊椎動物の免疫系分子と反応し、即ち抗原性があり、および／または脊椎動物において免疫応答を誘導する、即ち免疫原性があるポリペプチドである。
「生体適合性」は、生きた細胞に曝された場合に、細胞において望ましくない効果、例えば、細胞の生活サイクルの変化、細胞の増殖速度の変化、または細胞傷害性効果を引き起こさずに細胞の適切な細胞活性を支持する材料を指す。
用語「生物学的機能等価」は当技術分野でよく理解されており、本明細書で詳細にさらに定義する。したがって、本明細書に提供したヌクレオチド配列の１または複数と同一または機能的に等価であるヌクレオチドの約８５％～約９０％、またはより好ましくは約９１％～約９５％、またはさらにより好ましくは約９６％～約９９％を有する配列は、本出願で説明した方法および組成物の実施において有用であると特に想定される。
本明細書で用いる場合、用語「緩衝剤」は、緩衝剤を含む溶液または組成物に酸またはアルカリを添加した場合にｐＨの変動に抵抗する１または複数の組成物、またはその水溶液を含む。ｐＨ変化へのこの抵抗はそのような溶液の緩衝特性によるものであり、組成物に含まれる１または複数の特定の化合物の機能であり得る。したがって、緩衝活性を示す溶液または他の組成物は、緩衝剤または緩衝溶液と称される。緩衝剤は一般に溶液または組成物のｐＨを維持する無制限の能力を有さず、むしろこれらは典型的にはｐＨをある特定の範囲内、例えば約５～７のｐＨに維持することができる。
本明細書で用いる場合、用語「担体」は、該当する場合には、関係する動物への投与に薬学的に許容される、または治療もしくは診断目的に許容される、任意の溶媒（複数可）、分散媒、コーティング（複数可）、希釈剤（複数可）、緩衝剤（複数可）、等張化剤（複数可）、溶剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コロイド（複数可）、不活性物（ｉｎｅｒｔ）（複数可）等、またはそれらの組合せを含むことが意図されている。
本明細書で用いる場合、用語「ＤＮＡセグメント」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まずに単離されたＤＮＡ分子を指す。したがって、本明細書に開示した組成物の１つを使用して生物学的試料から得られたＤＮＡセグメントは、そのＤＮＡセグメントが得られた特定の種の全ゲノムＤＮＡから単離された、またはそれを含まずに精製された、１または複数のＤＮＡセグメントを指す。用語「ＤＮＡセグメント」には、ＤＮＡセグメントおよびそのようなセグメントのより小さな断片、ならびに例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等を含む組み換えベクターが含まれる。
用語「有効量」は、本明細書で用いる場合、疾患もしくは状態を処置しもしくは改善することができる、または他の方法で意図した治療効果をもたらすことができる量を指す。
本明細書で用いる場合、用語「エピトープ」は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定される、所与の免疫原性物質に対する免疫応答を組み込んだ宿主免疫系の抗体または細胞表面受容体の標的であり、即ちこれに結合される、所与の免疫原性物質の部分を指す。さらに、エピトープは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって決定されるように、動物において抗体応答を誘起し、またはＴ細胞の応答を誘導する免疫原性物質の一部として定義され得る（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、１９８４年を参照）。エピトープは任意の免疫原性物質、例えば、タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖、有機もしくは無機の化学物質、またはそれらの任意の組合せの一部であってよい。用語「エピトープ」は、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と相互交換可能にも用いられ得る。
用語「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」または「例えば（ｅ．ｇ．）」は、本明細書で用いる場合、限定を意図せずに例としてのみ用いられ、本明細書中で明示的に列挙されたこれらの項目のみが言及されていると解釈すべきではない。
本明細書で用いる場合、「異種」は、所定の参照した核酸配列に関連して定義される。例えば、構造遺伝子配列に関して、異種プロモーターは、参照した構造遺伝子の近傍に天然には存在しないが、実験室での操作によって位置決めされたプロモーターとして定義される。同様に、異種遺伝子または核酸セグメントは、参照したプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの近傍に天然には存在しない遺伝子またはセグメントとして定義される。
本明細書で用いる場合、「相同」は、ポリヌクレオチドについて言及する場合には、異なった起源から発生したにも関わらず同じ本質的なヌクレオチド配列を有する配列を意味する。典型的には、相同の核酸配列は、１または複数の実質的に同様のゲノム配列を有する密接に関連した遺伝子または生物体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）に由来する。対照的に、「類似」ポリヌクレオチドは、異なった種または生物体からのポリヌクレオチドと同じ機能を共有しているが、同様の機能を遂行しまたは同様の生物学的活性を有する１または複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする顕著に異なった一次ヌクレオチド配列を有してもよいポリヌクレオチドである。類似ポリヌクレオチドは、（例えば、遺伝学的にまたは系統発生学的に）密接に関連していない２またはそれより多い生物体に由来し得ることが多い。
本明細書で用いる場合、用語「相同性」は、２またはそれより多いポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の相補性の程度を指す。第１の核酸またはアミノ酸配列が第２の核酸またはアミノ酸配列と正確に同じ一次配列を有する場合には、「同一性」という単語で「相同性」という単語を置き換えてもよい。配列相同性および配列同一性は、当技術分野で公知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを使用して２またはそれより多い配列を解析することによって決定することができる。そのような方法は、所与の配列が別の選択された配列と同一または相同であるかを評価するために使用され得る。
用語「同一」または「同一性」パーセントは、２またはそれより多い核酸またはポリペプチド配列の文脈では、以下に記載する配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して測定して、または目視によって、比較し最大の一致のために整列させたときに同じであるか、または同じである指定した百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２またはそれより多い配列または部分配列を指す。
本明細書で用いる場合、語句「処置を必要とする」は、患者が処置を必要とする（または１もしくは複数の点で恩恵を受ける）という、医師または獣医師等の医療従事者によってなされる判断を指す。そのような判断は、医療従事者の専門知識の領域内にある種々の要素に基づいてなされることがあり、本明細書で説明したもの等の１または複数の化合物または医薬組成物によって処置できる疾患状態の結果として、患者が病気であるという知識を含み得る。
語句「単離された」または「生物学的に純粋」は、自然の状態で見出されたときにその材料に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。したがって、本開示による単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、好ましくはそれらの天然のまたはｉｎ ｓｉｔｕの環境においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドに通常付随する材料を含まない。
本明細書で用いる場合、用語「キット」は、本発明の試薬、成分、または薬学的に製剤化された組成物の少なくとも１つのセットを含む多種の携行可能な自己充足型の封入物を記載するために用い得る。そのようなキットは、必要に応じて、例えば、実験室または臨床の用途における封入された組成物の使用のための指示の１または複数のセットを含んでよい。
「連結」または「接合」は、限定するものではないが組み換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、静電結合等を含む、１または複数のタンパク質、ペプチド、核酸、またはポリヌクレオチドを機能的に接続するための当技術分野で公知の任意の方法を指す。
用語「天然に存在する」は、本明細書で用いる場合、目的物に適用する際には、目的物が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、天然の源から単離できる（ウイルスを含む）生物体に存在し、人の手によって実験室内で意図的に改質されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に存在している。本明細書で用いる場合、古典的遺伝学に従って選択的に繁殖させることができたげっ歯類の実験室系統は、天然に存在する動物であると考えられる。
本明細書で用いる場合、用語「核酸」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含む）、およびプリンもしくはピリミジン塩基または改質されたプリンもしくはピリミジン塩基のＮ－グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチド（非塩基部位を含む）の１または複数の型を含む。用語「核酸」は、本明細書で用いる場合、典型的にはサブユニット間のホスホジエステル連結によって、いくつかの場合にはホスホロチオエート、メチルホスホネート等によって共有結合したリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのポリマーも含む。「核酸」は一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖ＲＮＡを含む。例示的な核酸は、限定するものではないがｇＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎＯＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、および一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）等、ならびにそれらの任意の組合せを含む。
用語「作動可能に連結された」は、本明細書で用いる場合、連結される核酸配列が典型的には連続的または実質的に連続的であり、２つのタンパク質コード領域を接合させることが必要な場合には、連続的で読み取りフレーム内にあることを指す。しかし、エンハンサーは一般にプロモーターから数キロ塩基離れた場合に機能し、イントロン配列の長さは変動し得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは作動可能に連結され得るが連続的でなくてよい。
本明細書で用いる場合、用語「患者」（「レシピエント」、「宿主」、または「対象」とも相互交換可能に称される）は、本明細書で論じるように血管アクセスデバイスの１または複数のためのレシピエントとして働くことができる任意の宿主を指す。ある特定の態様では、レシピエントは脊椎動物であり、これは任意の動物種（および好ましくは人類等の哺乳動物種）を意味することを意図している。ある特定の実施形態では、「患者」は、限定するものではないが飼い慣らされた家畜、群れをなすまたは移動性の動物または鳥類、外来のまたは動物学的標本を含む、これらに限定されないが、ヒトおよび非ヒト霊長類、鳥類、爬虫類、両生類、ウシ、イヌ、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）、ｃａｖｉｎｅ、カラス、ｅｐｉｎｅ、ウマ、ネコ、ヤギ（ｈｉｒｃｉｎｅ）、ウサギ（ｌａｐｉｎ）、ウサギ（ｌｅｐｏｒｉｎｅ）、オオカミ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、ｒａｃｉｎｅ、キツネ等、ならびに伴侶動物、ペット、および獣医師のケアを受ける任意の動物を含む任意の動物宿主を指す。
語句「薬学的に許容される」は、ヒトに投与した場合、特にヒトの眼に投与した場合に、アレルギー性または同様の有害な反応を生じない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当技術分野でよく理解されている。典型的には、そのような組成物は液体液剤としてまたは懸濁剤のいずれかとして、注射剤として調製される。あるいは、これらは注射に先立って液体中の液剤または懸濁剤とするのに適した固体形態で調製してよい。
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果を及ぼさない塩を指す。そのような塩の例は、これらに限定されないが、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等と形成された酸付加塩、および有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸（エンボン酸）、アルギン酸、ナフトエ酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸と形成された塩、例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等の多価金属カチオンとの塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成された有機カチオンと形成された塩、ならびにそれらの組合せを含む。
本明細書で用いる場合、用語「プラスミド」または「ベクター」は、遺伝子材料（即ち核酸）からなる遺伝子構築物を指す。典型的には、プラスミドまたはベクターは、細菌宿主細胞、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの中で機能的である複製起点、およびプラスミドを含む細菌宿主細胞を検出するための選択可能なマーカーを含む。本発明のプラスミドおよびベクターは、挿入されたコーディング配列が好適な発現細胞の中で転写され翻訳され得るように配置された、本明細書に記載した１または複数の遺伝子要素を含み得る。さらに、プラスミドまたはベクターは、１または複数の天然および／または人工の源から得られたまたはこれに由来するセグメントを含む、１もしくは複数の核酸セグメント、遺伝子、プロモーター、エンハンサー、アクチベーター、マルチプルクローニング領域、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド類」を包含することを意図しており、２またはそれより多いアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を含む。したがって、本明細書で用いる場合、これらに限定されないが、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」、「アミノ酸鎖」、および「連続したアミノ酸配列」を含む用語は、全て「ポリペプチド」の定義に包含され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれの代わりにも、またはそれらと交換可能に用いることができる。用語は、例えば、これらに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、誘導体化、タンパク分解的開裂、翻訳後プロセシング、または１もしくは複数の天然に存在しないアミノ酸の含有による改質を含む１または複数の翻訳後改質を受けたポリペプチドをさらに含む。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造については従来の命名法が当技術分野に存在する。
例えば、アミノ酸を記述するために１文字および３文字の略号が広く採用されている。アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ、ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、およびリシン（Ｋ、Ｌｙｓ）。本明細書に記載したアミノ酸残基は「ｌ」アイソマー形であることが好ましい。しかし、ポリペプチドの望ましい特性が保たれるならば、「ｄ」アイソマー形の残基でｌ－アミノ酸残基を置換してもよい。
本明細書で用いる場合、本明細書で用いる用語「防止する」、「防止すること」、「防止」、「抑制する」、「抑制すること」、および「抑制」は、疾患状態の任意の症状、態様または特徴を防止するために、疾患状態の臨床症状の発症に先立って、単独のまたは医薬組成物に含まれた化合物を投与することを指す。そのような防止および抑制は、医学的に有用であるとみなされるために絶対的である必要はない。
「タンパク質」は本明細書において「ペプチド」および「ポリペプチド」と相互交換可能に用いられ、合成により、組み換えにより、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたペプチドおよびポリペプチドと、核酸配列が宿主動物またはヒト対象に投与された後にｉｎ ｖｉｖｏで発現したペプチドおよびポリペプチドの両方を含む。用語「ポリペプチド」は、好ましくは、約２～約２０アミノ酸残基の長さの短いペプチド、約１０～約１００アミノ酸残基の長さのオリゴペプチド、および約１００アミノ酸残基またはそれを超える長さを含むより長いポリペプチドの鎖を含む任意のアミノ酸鎖長を指すことを意図している。さらに、用語は酵素、即ち少なくとも１つのアミノ酸ポリマーを含む機能的生体分子を含むことも意図している。本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、翻訳後に改質されるまたは改質されたポリペプチドおよびタンパク質も含み、骨格のアミノ酸鎖に付加された任意の糖または他の誘導体もしくはコンジュゲートを含む。
「精製された」は、本明細書で用いる場合、多くの他の化合物または実体から分離されたことを意味する。化合物または実体は、部分的に精製され、実質的に精製され、または純粋であってよい。化合物または実体は、実質的に全ての他の化合物または実体から除去され、即ち好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％より大きく純粋である場合に、純粋と考えられる。部分的にまたは実質的に精製された化合物または実体は、それとともに天然に見出される材料、例えば、細胞のタンパク質および／または核酸等の細胞材料の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％が除去されてよい。
用語「組み換え」は、材料（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）がヒトの介入によって人工的にまたは合成的に（非天然に）変化されたことを示す。変化は、その天然の環境または天然の状態の中の、またはそれから除去された材料について実施することができる。具体的には、例えば、プロモーター配列は、人の手によって操作された核酸セグメントの発現によって産生される場合には、「組み換え」である。例えば、「組み換え核酸」は、例えば、クローニング、ＤＮＡシャフリング、もしくは他の手順の間に核酸を組み換えることによって、または化学的もしくは他の変異誘発によって作られる核酸であり、「組み換えポリペプチド」または「組み換えタンパク質」は、組み換え核酸の発現によって産生されるポリペプチドまたはタンパク質であり、「組み換えウイルス」、例えば組み換えＡＡＶウイルスは、組み換え核酸の発現によって産生される。
用語「調節エレメント」は、本明細書で用いる場合、転写を調節する核酸配列の領域（単数または複数）を指す。例示的な調節エレメントには、これらに限定されないが、エンハンサー、転写後エレメント、転写制御配列等が含まれる。
用語「ＲＮＡセグメント」は、特定の種の全細胞ＲＮＡを含まずに単離されたＲＮＡ分子を指す。したがって、ＲＮＡセグメントは、他のＲＮＡから単離された、またはそれらを含まずに精製された、１または複数のＲＮＡセグメント（天然または合成の起源）を指し得る。ＲＮＡセグメントおよびそのようなセグメントのより小さな断片は、用語「ＲＮＡセグメント」の中に含まれる。
用語「配列」は、アミノ酸に言及する場合には、所与のアミノ酸鎖、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の中のアミノ酸のＮ末端からＣ末端への直線的な順序の全てまたは一部に関する。「部分配列」は、配列の中のアミノ酸の任意の連続した一続きの配列、例えば、所与のタンパク質またはポリペプチド配列の中の少なくとも３つの連続したアミノ酸を意味する。ヌクレオチド鎖に関しては、「配列」および「部分配列」は、ヌクレオチドの５’から３’への順序に関して同様の意味を有する。
用語「本質的に配列番号Ｘで示される配列」は、その配列が、配列番号Ｘの一部に実質的に対応し、配列番号Ｘのヌクレオチド（またはアミノ酸）と同一でないまたは生物学的に機能が等価でないヌクレオチド（または、ポリペプチド配列の場合にはアミノ酸）を比較的少なく有することを意味する。用語「生物学的に機能が等価」は当技術分野でよく理解されており、本明細書で詳細にさらに定義する。したがって、本明細書に提供されるヌクレオチド配列の１または複数と同一または機能的に等価なヌクレオチドの約８５％～約９０％、またはより好ましくは約９１％～約９５％、またはさらにより好ましくは約９６％～約９９％を有する配列は特に、本発明の実施において有用であることが意図される。
本発明における使用のための核酸についての好適な標準的ハイブリダイゼーション条件には、例えば、５０％のホルムアミド、５倍のデンハルト溶液、５倍のＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ中における４２℃、１６時間のハイブリダイゼーションおよびそれに続く所望の量のバックグラウンドシグナルを除去するための０．１倍のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ溶液による６０℃、１時間の逐次洗浄が含まれる。本発明のための低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件には、例えば、３５％のホルムアミド、５倍のデンハルト溶液、５倍のＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡまたはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ中における４２℃、１６時間のハイブリダイゼーションおよびそれに続く０．８倍のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳによる５５℃での逐次洗浄が含まれる。当業者は、そのようなハイブリダイゼーション条件は特定の用途のための所望のレベルのストリンジェンシーを得るために容易に調整できることを認識する。
本明細書で用いる場合、用語「構造遺伝子」は、コードされたペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リボザイム、触媒的ＲＮＡ分子、またはアンチセンス分子を産生するために発現される遺伝子等のポリヌクレオチドを一般に記述することを意図している。
用語「対象」は、本明細書で用いる場合、本発明による組成物を用いた処置を提供できる霊長類等の哺乳動物を含む生物体を記述している。開示した処置の方法から恩恵を受けることができる哺乳動物種には、これらに限定されないが、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル、イヌおよびネコ等の飼い慣らされた動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリ等の家畜、ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスター等の他の動物が含まれる。
用語「実質的に相補的」は、アミノ酸または核酸配列を定義するために用いる場合には、特定の対象配列、例えばオリゴヌクレオチド配列が、選択した配列の全てまたは一部に実質的に相補的であり、したがって選択した配列をコードするｍＲＮＡの一部に特異的に結合することを意味する。したがって、典型的には配列はｍＲＮＡ「標的」配列に高度に相補的であり、配列の相補部分を通して約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０程度以下の塩基のミスマッチを有する。多くの場合に、配列は正確にマッチすること、即ちオリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に完全に相補的であり、したがって相補的な一続きの配列に沿ってミスマッチはゼロであることが望ましいことがある。したがって、高度に相補的な配列は、典型的にはｍＲＮＡの標的配列領域に全く特異的に結合し、したがって標的ｍＲＮＡ配列のポリペプチド生成物への翻訳の低減および／または阻害においてさえも、高度に効率的である。
実質的に相補的な核酸配列は、その核酸が特異的に結合する対応する核酸標的配列に約８０パーセント（即ち「正確なマッチの％」）を超えて相補的であり、より好ましくは、その核酸が特異的に結合する対応する標的配列に約８５パーセントを超えて相補的である。ある特定の態様では、上記のように、本発明の実施における使用のために、さらにより実質的に相補的な核酸配列を有することが望ましく、そのような場合には、核酸配列は、その核酸が特異的に結合する対応する標的配列に約９０パーセントを超えて相補的であり、ある特定の実施形態では、その核酸が特異的に結合する対応する標的配列に約９５パーセントを超えて相補的であってよく、そしてさらには、設計した核酸が特異的に結合する標的配列の全てまたは一部に相補的な、最大約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、さらには約１００％のおよびそれらを含む正確な一致であり得る。
開示した核酸配列のいずれかの類似性パーセントまたは相補性パーセントは、例えば、ウィスコンシン大学のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から利用可能なＧＡＰコンピュータプログラムバージョン６．０を使用して配列情報を比較することによって決定することができる。ＧＡＰプログラムはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）の整列法を利用している。簡単には、ＧＡＰプログラムは、整列させた類似の記号（即ちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２つの配列のうち短い方の記号の総数で割った値として類似性を定義している。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメーターは、（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリックス（同一性について１、および非同一性について０の値を含む）ならびにＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（１９８６年）の重み付け比較マトリックス、（２）各ギャップについて３．０のペナルティおよび各ギャップ内の各記号について追加の０．１０のペナルティ、ならびに（３）末端ギャップについてペナルティなし、を含む。
当然ながら、本発明は、本明細書で具体的に示した特定のヌクレオチド配列の少なくとも１または複数に相補的な、本質的に相補的な、および／または実質的に相補的な核酸セグメントも包含する。「相補的な」核酸配列は、標準的なワトソン－クリック相補性規則に従って塩基対を形成できる核酸配列である。本明細書で用いる場合、用語「相補的配列」は、上で示した同じヌクレオチド比較によって評価し得る、またはすぐ上に記載したような比較的ストリンジェントな条件下で本明細書に開示した特定の核酸セグメントの１または複数にハイブリダイズすることができると定義され得る、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
本明細書で用いる場合、成分の量に関する用語「実質的に含まない」または「本質的に含まない」は、好ましくは、約１０重量パーセント未満、好ましくは約５重量パーセント未満、より好ましくは約１重量パーセント未満の化合物を含む組成物を指す。好ましい実施形態では、これらの用語は、約０．５重量パーセント未満、約０．１重量パーセント未満、または約０．０１重量パーセント未満を指す。
本発明における使用のためのプローブおよびプライマーは、任意の好適な長さであってよい。配列に数値を割り付けることによって、例えば、第１の残基を１、第２の残基を２などとして、所与の配列の中に含まれる全てのプローブまたはプライマーを定義する以下のアルゴリズムを提案することができる：
ｎからｎ＋ｙ（ここでｎは１から配列の最後の番号までの整数であり、ｙはプローブまたはプライマーの長さマイナス１であり、ｎ＋ｙは配列の最後の番号を超えない）。したがって、２５塩基対のプローブまたはプライマー（即ち「２５マー」）については、プローブまたはプライマーのコレクションは、配列の全長にわたって塩基１～２５、塩基２～２６、塩基３～２７、塩基４～２８などに対応する。同様に、３５塩基対のプローブまたはプライマー（即ち「３５マー」）については、例示的なプライマーまたはプローブ配列は、限定するものではないが、配列の全長にわたって塩基１～３５、塩基２～３６、塩基３～３７、塩基４～３８などに対応する配列を含む。同様に４０マーについては、そのようなプローブまたはプライマーは、第１の塩基対からｂｐ４０まで、配列の第２のｂｐからｂｐ４１まで、第３のｂｐからｂｐ４２までなどのヌクレオチドに対応し得、一方５０マーについては、そのようなプローブまたはプライマーは、ｂｐ１からｂｐ５０、ｂｐ２からｂｐ５１、ｂｐ３からｂｐ５２、ｂｐ４からｂｐ５３などに延びるヌクレオチド配列に対応し得る。
用語「実質的に対応する」、「実質的に相同」、または「実質的同一性」は、本明細書で用いる場合、選択した核酸またはアミノ酸配列が、選択した参照核酸またはアミノ酸配列と比較して少なくとも約７０または約７５パーセントの配列同一性を有している、核酸またはアミノ酸配列の特徴を意味する。より典型的には、選択した配列および参照配列は、少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、またはさらには８５パーセントの配列同一性を有し、より好ましくは、少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５パーセントの配列同一性を有する。さらにより好ましくは、高度に相同な配列は、選択した配列と、それと比較した参照配列との間で、少なくとも約９６、９７、９８、または９９パーセントより大きい配列同一性を共有することが多い。
本明細書で用いる場合、「合成の」は、材料がヒトおよび動物の起源でないことを意味する。
用語「治療上実際的な期間」は、１または複数の活性剤が治療上有効なために必要な期間を意味する。用語「治療上有効な」は、１または複数の症状の重症度および／または頻度の低減、１または複数の症状および／または根本原因の排除、症状および／またはその根本原因の発生の防止、ならびに損傷の改善または治療を指す。
「治療剤」は、対象における標的部位において所望の生物学的効果を生成し得る任意の生理学的または薬理学的に活性な物質であってよい。治療剤は、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、細胞傷害性薬剤、核酸分解性化合物、放射性同位元素、受容体、およびプロドラッグ活性化酵素であってよく、これらは天然に存在するものあっても、または合成もしくは組み換え法で産生されても、またはそれらの任意の組合せでもよい。古典的な多剤耐性によって影響される薬物、例えば、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）、アンスラサイクリン類（例えばドキソルビシンおよびダウノルビシン）、ＲＮＡ転写阻害剤（例えばアクチノマイシンＤ）、および微小管安定化薬（例えばパクリタクセル）は、治療剤として特定の有用性を有し得る。サイトカイン類も治療剤として使用し得る。そのようなサイトカイン類の例は、リンホカイン類、モノカイン類、および従来のポリペプチドホルモン類である。がん化学療法剤は好ましい治療剤であり得る。抗がん剤および他の治療剤のより詳細な記載については、当業者は、これらに限定されないがＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ ＲｅｆｅｒｅｎｃｅならびにＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、１０版、Ｈａｒｄｍａｎら（編）（２００１年）を含むいくつかの解説書を参照されたい。
本明細書で用いる場合、「転写因子認識部位」および「転写因子結合部位」は、直接のタンパク質－ＤＮＡ結合の形態を取ることが多い１または複数の転写因子の配列特異的相互作用のための部位として同定されるポリヌクレオチド配列または配列モチーフを指す。典型的には、転写因子結合部位は、ＤＮＡフットプリンティング、ゲル易動度シフトアッセイ等によって同定することができ、および／または既知のコンセンサス配列モチーフに基づいて、または当業者には公知の他の方法によって、予測することができる。
「転写調節エレメント」は、単独でまたは１もしくは複数の他の核酸配列と組み合わせて転写を活性化するポリヌクレオチド配列を指す。転写調節エレメントは、例えば、１もしくは複数のプロモーター、１もしくは複数の応答エレメント、１もしくは複数の負の調節エレメント、および／または１もしくは複数のエンハンサーを含んでよい。
「転写ユニット」は、少なくとも第１のシス作用性プロモーター配列に作動可能に連結され、必要に応じて構造遺伝子配列の効率的な転写のために必要な１もしくは複数の他のシス作用性核酸配列に作動可能に連結された少なくとも第１の構造遺伝子、ならびにプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの制御の下に作動可能に位置させた構造遺伝子配列の適切な組織特異的な、発生における転写に必要とされ得る少なくとも第１の末梢調節エレメント、ならびに効率的な転写および翻訳のために必要な任意の追加のシス配列（例えば、ポリアデニル化部位（複数可）、ｍＲＮＡ安定性制御配列（複数可）等）を含むポリヌクレオチド配列を指す。
本明細書で用いる場合、用語「形質転換」は、外来のポリヌクレオチド配列（例えば、ウイルスベクター、プラスミド、または組み換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子）を、外来のポリヌクレオチドが少なくとも第１の染色体に組み込まれ、または形質転換された宿主細胞の中で自律的に複製することができる宿主細胞またはプロトプラストの中に導入するプロセスを一般に記載することを意図している。トランスフェクション、エレクトロポレーション、および「裸の」核酸の取込みは全て、１または複数のポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するために使用する手法の例を表している。
本明細書で用いる場合、用語「形質転換された細胞」は、その核酸成分が１または複数の外来のポリヌクレオチドのその細胞への導入によって変化した宿主細胞を意味することを意図している。
「処置すること」または「～の処置」は、本明細書で用いる場合、任意の種類の医学的または外科的な管理を対象に提供することを指す。処置することは、これに限定されないが、治療剤を含む組成物を対象に投与することを含み得る。「処置すること」は、疾患、障害、もしくは状態、または疾患、障害、もしくは状態の１もしくは複数の症状もしくは徴候の治癒、回復、緩和、それの重症度の低減、それの進行の阻止、またはそれの可能性（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）の低減等を目的とする、対象への本発明の化合物または組成物の任意の投与または適用を含む。ある特定の態様では、本発明の組成物は、予防的に、即ちそのような予防が正当化される場合には、状態の任意の症状または徴候の発生の前に、投与してもよい。典型的には、そのような場合には、対象は、家族歴、診療記録、またはそのような疾患もしくは障害が後に発生する傾向を示す１もしくは複数の診断もしくは予後試験の完了の結果として、そのような疾患または障害が発生する「危険にある」と診断された対象である。
用語「ベクター」は、本明細書で用いる場合、核酸分子であって、宿主細胞内での複製が可能な、および／または別の核酸セグメントがそれに作動的に連結されて結合したセグメントの複製をもたらす、（典型的にはＤＮＡで構成された）核酸分子を指す。プラスミド、コスミド、またはウイルスは、例示的なベクターである。
「ゼロ次」または「ほぼゼロ次」という表現は、開示したワクチン送達組成物からの活性剤の放出動力学に適用する場合には、活性剤の治療効果のある血漿中濃度を達成するための、組成物の投与の後の治療として実際的な期間にわたって制御された様式での活性剤の放出の速度を含むことを意図している。
ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイにおける所与の標的配列の存在の決定において標識されたポリヌクレオチドプローブを採用する場合のように、本発明の１または複数の核酸セグメントを適切な検出可能なマーカー（即ち、「標識」）と組み合わせて採用することが有利である。限定するものではないが、蛍光、放射活性、酵素または他のリガンド、例えばアビジン／ビオチン等を含む、好適なアッセイで検出可能な、オリゴヌクレオチドプローブを標識するための多種多様な適切なインジケーター化合物および組成物が当技術分野で公知である。特定の実施形態では、放射活性または他の環境にとってあまり望ましくない試薬の代わりに、１もしくは複数の蛍光標識またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはペルオキシダーゼ等の酵素タグを採用してもよい。酵素タグの場合には、１または複数の相補的なまたは実質的に相補的な核酸配列を含む試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するために、ヒトの目に見える、または例えばシンチグラフィー、蛍光光度法、分光光度法等の分析法による、試料を検出するための方法を提供するために採用できる比色インジケーター基質、色素形成インジケーター基質、または蛍光原インジケーター基質が公知である。２またはそれより多い標識プローブが同時にまたは逐次に検出される、いわゆる「マルチプレキシング」アッセイの場合には、第１のオリゴヌクレオチドプローブを第１の検出特性またはパラメーター（例えば、発光および／または励起のスペクトル最大値）を有する第１の標識で標識し、第２のオリゴヌクレオチドプローブを第１の標識とは異なる（即ち目立たないまたは識別できる）第２の検出特性またはパラメーターを有する第２の標識で標識することが望ましい場合がある。特に遺伝子増幅／検出プロトコールに関してマルチプレキシングアッセイの使用は、分子遺伝学の技術分野における当業者には周知である。
生物学的機能等価
核酸の構造において、またはそれらを含むベクターに対して、ならびにそれらにコードされるｍＲＮＡ、ポリペプチド、または治療剤に対して改変および変更を行い、それでもなお所望の特徴を有する１または複数の治療剤を含む機能的ワクチン送達システムを得ることができる。上記のように、特定のポリヌクレオチド配列に１または複数の変異を導入することがしばしば望ましい。ある特定の状況では、得られるコードされたポリペプチド配列はこの変異によって変化し、他の場合には、ポリペプチドの配列はコードするポリヌクレオチドの１または複数の変異によって変化しない。
等価の、またはさらに改善された第２世代の分子を創製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることが望ましい場合には、アミノ酸の変化は、コードするＤＮＡ配列のコドンの１または複数を表１に従って変化させることによって達成できる。
例えば、ある特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子の結合部位等の構造と相互作用する結合能力の感知できるほどの損失なしに、タンパク質構造中の他のアミノ酸で置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性を定義するものはタンパク質の相互作用能力および性質であるので、タンパク質配列、およびもちろんその下にあるＤＮＡコード配列において、ある特定のアミノ酸配列置換を行い、それにも関わらず同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、生物学的な有用性または活性の感知できるほどの損失なしに、開示した組成物のペプチド配列または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に種々の変更を加えることができることが、本発明者らによって意図されている。
Figure 0007181880000001
そのような変更を行う場合、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮してよい。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する場合のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野で一般に理解されている（参照により本明細書に組み込まれるＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性が得られるタンパク質の二次構造に寄与し、それが次にタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を規定することが受け入れられている。それぞれのアミノ酸には、その疎水性および電荷の特徴に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（－０．４）、スレオニン（－０．７）、セリン（－０．８）、トリプトファン（－０．９）、チロシン（－１．３）、プロリン（－１．６）、ヒスチジン（－３．２）、グルタメート（－３．５）、グルタミン（－３．５）、アスパルテート（－３．５）、アスパラギン（－３．５）、リシン（－３．９）、およびアルギニン（－４．５）である。
ある特定のアミノ酸を同様のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換して、それでも同様の生物学的活性を有するタンパク質がもたらされ得る、即ちそれでも生物学的機能が等価なタンパク質が得られ得ることが、当技術分野で公知である。そのような変更を行う場合、ハイドロパシー指数が±２以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらにより特に好ましい。同様のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に行われ得ることも、当技術分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（それへの明示的な参照により全体として本明細書に特に組み込まれる）は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大の局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関していることを述べている。
米国特許第４，５５４，１０１号に詳細に述べられているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（－０．４）、プロリン（－０．５±１）、アラニン（－０．５）、ヒスチジン（－０．５）、システイン（－１．０）、メチオニン（－１．３）、バリン（－１．５）、ロイシン（－１．８）、イソロイシン（－１．８）、チロシン（－２．３）、フェニルアラニン（－２．５）、トリプトファン（－３．４）。アミノ酸を同様の親水性値を有する別のアミノ酸で置換し、それでも生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることが理解される。そのような変更において、その親水性値が±２以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらにより特に好ましい。
したがって、上に概要を示したように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸の側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づいている。上記の特徴の１または複数を考慮に入れた例示的な置換は当業者には周知であり、アルギニンとリシン、グルタメートとアスパルテート、セリンとスレオニン、グルタミンとアスパラギン、およびバリン、ロイシンとイソロイシンを含む。
全体で使用したセクションの見出しは構成上の目的のみのためのものであって、記述した主題を限定すると解釈すべきではない。本出願に引用した全ての文書、または文書の一部（これらに限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含む）は、それに対する明示的な参照により全体として本明細書に明示的に組み込まれる。組み込まれた文献および同様の資料の１または複数が本出願における用語の定義と矛盾する様式でその用語を定義した場合には、本出願が優先する。
以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を実証するために含まれる。これらの実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成するとみなすことができることを当業者は理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、それでも本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
（実施例１）
リポポリプレックスはｍＲＮＡに基づくワクチンの抗腫瘍免疫を増強する
この実施例では、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン／１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－エタノールアミン／１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）脂質シェルにカプセル化されたポリ－（β－アミノエステル）ポリマーｍＲＮＡコアからなるリポポリプレックスｍＲＮＡワクチンが記載されている。このコアシェル構造化ｍＲＮＡワクチンは、マクロピノサイトーシスにより樹状細胞に入る。それは、Ｔｏｌｌ様受容体７／８シグナル伝達を介して樹状細胞におけるインターフェロン－αおよびインターロイキン－１２の発現を強力に刺激することにより、固有のアジュバント活性を示した。ｍＲＮＡワクチンで処置した樹状細胞は、抗原提示能力の強化を示した。オボアルブミン抗原を発現する肺転移性Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍を担持するマウスをリポポリプレックスｍＲＮＡで処置し、腫瘍結節の９０％を超える減少が観察された。まとめると、このコアシェル構造は、ｍＲＮＡワクチンを哺乳動物細胞に送達するための優れたシステムを提供する。
図１Ａは、本発明の一態様による例示的なシェル／コア－ｍＲＮＡリポポリプレックスワクチン組成物の合成を概略的に示す。シェル／コア－ｍＲＮＡワクチンでは、負電荷ｍＲＮＡが正電荷ポリマーの内部に凝縮し、それらはともに直径数ナノメートルから数百ナノメートルのタイトなポリプレックス「コア」構造を形成した。次いで、このポリプレックスコアは、両方が樹状細胞による取り込みを強化し、細胞内ヌクレアーゼによる分解から内部コア内のｍＲＮＡ分子を保護する親水性のリン脂質二重層「シェル」によってカプセル化された。得られた３成分シェル／コア／ｍＲＮＡ組成物は、１または複数の可溶性アジュバントをポリプレックス－ｍＲＮＡ内部コアと外部脂質シェルの間の空間に入れることによりさらに修飾し、抗腫瘍免疫をさらに増強することができた。
本明細書に記載される結果は、従来の圧縮コア－ｍＲＮＡワクチンと比較して、開示されたシェル／コア－ｍＲＮＡ－ポリプレックス構造化ワクチンシステムの複数の利点を明らかにする。ポリプレックスコア－ｍＲＮＡ粒子をリン脂質外側シェルにカプセル化すると、コアｍＲＮＡ分子が分解から保護されるだけでなく、抗原提示樹状細胞によるワクチン粒子の取り込みが有意に改善された（図１Ａ）。さらに、コアをカプセル化する脂質シェル構造の存在により、コア－ｍＲＮＡ分子が非ＤＣ免疫細胞と相互作用することが妨げられ、潜在的な望ましくない副作用が制限された。さらに、本明細書に開示されるＬＰＰ－ｍＲＮＡワクチン組成物は、ＩＦＮ－αおよびＩＬ－１２（ＤＣ成熟の促進を通じて抗腫瘍免疫を媒介するのに重要な役割を果たすサイトカイン）の発現を刺激することにおいて、従来の「裸の」ｍＲＮＡコアワクチンよりも強力であった（図４Ａ）。さらに、ＬＰＰ－ｍＲＮＡワクチンは、腫瘍細胞の殺滅を媒介するのに非常に強力であった。最後に、本明細書に記載されるシェル／コア／ｍＲＮＡ多成分ワクチン組成物はまた、抗原提示細胞の活性をさらに増強する必要がある場合は常に、脂質シェルに可溶性アジュバントまたは他の刺激分子をカプセル化するための効果的な選択肢をも提供した。これらの特性は全て、急速に進化する精密医学の時代における新しい免疫療法薬の創出におけるこの治療ワクチンプラットフォームの有用性を強調している。
材料および方法
ポリ－（β－アミノエステル）ポリマー（ＰｂＡＥ）の合成。ＰｂＡＥ（ＭＷ約４ｋＤａ）は、これまでに記載された（Ｋａｍａｔら、２０１３年）ような、２段階の反応手順で合成された。第１のステップでは、１，４－ブタンジオールジアクリレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と５－アミノ－１－ペンタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１．２：１のモル比で混合することにより、ベースポリマーを合成した。この反応は、テフロン（登録商標）攪拌棒を備えたガラスシンチレーションバイアル内で、９０℃で２４時間維持した。ベースポリマーを乾燥させ、次いで、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１６７ｍｇ／ｍＬの最終濃度で溶解した。第２のステップでは、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブで４８０μＬのベースポリマー溶液を３２０μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌの（ＰＥＯ）４－ビス－アミン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ、ＵＳＡ）と混合し、室温で２４時間反応させた。ポリマー混合物を最初に透析チューブ（ＭＷＣＯ ３，５００Ｄａ）に入れミリＱ水に対して透析して、大量の遊離試薬を除去し、次いで４倍容量のエチルエーテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合し、激しくボルテックスした後、４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清中の未反応モノマーをさらに除去した。精製したポリマーを真空乾燥した後、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２に溶解した。
ＰｂＡＥ／ｍＲＮＡポリプレックスの調製。ＰｂＡＥ／ｍＲＮＡポリプレックスは、１容量のＰｂＡＥポリマーと２容量のｍＲＮＡ分子（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を混合することにより調製した。２０℃で２０分間インキュベートした後、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ動的光散乱装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＮＩＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ）を使用して、サイズ分布とゼータ電位についてポリプレックスを分析した。ＰｂＡＥ／ｍＲＮＡポリプレックスもまた、ゲル遅延アッセイで分析した。簡潔に述べると、２５０ｎｇのｍＲＮＡを含むポリプレックス試料を各ウェルにロードし、１×ＴＢＥ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む０．７％アガロースゲルでの電気泳動により分離した。ＲＮＡバンドをＧｅｌｒｅｄ核酸ゲル染色（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で染色し、ＧｅｌＤｏｃシステム（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で可視化した。
ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンの調製と特徴付け。脂質１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００）、コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）、および１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）から購入した。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手した。試薬を２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度でクロロホルムに溶解し、部分真空下でＢｕｃｈｉ Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（Ｏｌｄｈａｍ、ＵＮＩＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ）に適用して回転蒸発により薄い脂質フィルムを調製した。薄い脂質フィルムは、４９％ＥＤＯＰＣ、４９％ＤＯＰＥ、および２％ＤＳＰＥ－ＰＥＧで構成されていた。脂質フィルムをＰｂＡＥ／ｍＲＮＡポリプレックスを含む溶液で再水和して、リポポリプレックスｍＲＮＡワクチンを調製した。ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンのサイズ分布とゼータ電位を、ＤＬＳと透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）で測定した。同じ手順を適用して、ＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥ／オクタアルギニン（ＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥ／Ｒ８）およびＤＯＴＡＰ／コレステロール／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００（ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００）リポポリプレックスを調製した。プロタミン／ｍＲＮＡポリプレックスを調製するために、硫酸プロタミン（グレードＸ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をｍＲＮＡと２：１の重量比で１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液中で混合し、続いて室温で３０分間インキュベートした。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンの細胞取り込み。不死化ＤＣ２．４（マウス骨髄由来樹状細胞株）細胞を、ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンからのタンパク質発現の試験に適用した。簡潔に述べると、細胞を１．５×１０５細胞／ウェルの播種密度で２４ウェルプレートに播種し、１ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０完全培地（１０％ウシ胎仔血清［ＦＢＳ、Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ、ＵＳＡ］、１％ペニシリン／ストレプトマイシン［１０，０００単位のペニシリンと１０ｍｇのストレプトマイシン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］、および０．１％のβ－メルカプトエタノール［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］）中で維持した。細胞を０．５μｇのｅＧＦＰ ｍＲＮＡ（ＬＰＰ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ）をパッケージ化したＬＰＰとともに２４時間インキュベートし、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｓ蛍光顕微鏡（株式会社ニコン、東京、日本）を使用してｅＧＦＰ発現を視覚化した。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを測定するために、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用してフローサイトメトリーを実施した。同じ手順を適用して、ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）およびマウスｍＤＭＥＣ皮膚内皮細胞をそれぞれＬＰＰ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡとインキュベートした後に、それらの細胞においてｅＧＦＰ発現を決定した。
ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンの細胞内在化の経路を決定するため、ＤＣ２．４細胞を１．５×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、それらを、ＬＰＰ（ＬＰＰ／ＦＡＭ－ｍＲＮＡ）中にパッケージ化されたＦＡＭ標識ｍＲＮＡおよび次の小分子阻害剤：アミロリド（０．２ｍＭ）、クロロキン（１００ｍＭ）、ゲニステイン（５０μＭ）、クロルプロマジン（１５μＭ）、またはピモジド（１０μＭ）のうちの１つで処置した。細胞を４時間成長させた後、それらを氷冷ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡法によって粒子取り込みを決定するのに適用した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＬＰＰ／ｍＲＮＡからの細胞毒性。ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンの潜在的な細胞毒性を試験するために、ＤＣ２．４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、および内皮細胞を３×１０４細胞／ウェルの播種密度で９６ウェルプレートに播種し、ＬＰＰ／０．１μｇのｍＲＮＡで処置した。２４時間後、テトラゾリウムに基づくＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖（ＭＴＳ）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で、製造者の指示に従って細胞生存率を測定した。
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の調製。ＢＭＤＣは、これまでに記載された（Ｘｉａら、２０１５年）ようにＣ５７ＢＬ／６マウスから調製した。簡潔に述べると、大腿骨および脛骨からの骨髄細胞を、シリンジを使用して２％ＦＢＳ含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で流し出した。細胞を５００×ｇで４分間遠心分離し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．）で処置して赤血球を除去し、１０％ＦＢＳ、０．５％のβ－メルカプトエタノール、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－４（ＩＬ－４）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培養培地に再懸濁した。それらを、１×１０６細胞／ｍＬの播種密度で６ウェルプレートに播種し、１日おきに成長培地を交換した。非接着樹状細胞を５日目に採取した。
炎症促進性サイトカインの測定。ＢＭＤＣを３×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、ＬＰＰ／０．５μｇのＯＶＡ ｍＲＮＡで処置した。ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンの分解された成分（リポソームシェルとポリプレックスコア）は、陰性対照として機能した。２４時間のインキュベーション後、上清を収集し、サイトカイン測定用のＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、およびＩＬ－１２濃度を測定した。
ＴＬＲ７／８阻害。ＤＣ２．４細胞を１．５×１０５細胞／１ｍＬＲＰＭＩ－１６４０完全培地の密度で２４ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、３７℃で１時間、終濃度２．５μＭのＴＬＲ７／８阻害剤ＯＤＮ２０８７（Ｍｉｌｉｔｅｎｌｙ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処置した。その後、ＬＰＰ／０．５μｇＯＶＡ ｍＲＮＡを培養物に添加し、細胞成長をさらに２４時間維持した後、サイトカイン分析のために細胞培地を収集した。ＴＬＲ阻害剤処置のない樹状細胞は陽性対照として機能し、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡ処置のない細胞を陰性対照として使用した。
樹状細胞成熟の評価。ＤＣ２．４細胞を、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、１ｍＬのＲＰＭＩ完全培地を供給した。それらをＬＰＰ／０．５μｇｍＲＮＡで処置し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８６、およびＭＨＣ ＩＩに特異的な抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）によるフローサイトメトリー分析に適用した。
ＭＨＣ ＩおよびＩＩ拘束性抗原提示アッセイ。抗原提示を測定するために、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡで処置したＢＭＤＣをＯＶＡ２５７－２６４－Ｈ－２Ｋｂ複合体（Ｈ－２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を認識する五量体によって室温で１０分間染色した。次いで、細胞を抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３０分間染色し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターを使用して分析した。
Ｔ細胞の活性化を決定するために、ＢＭＤＣおよびＤＣ２．４細胞をＬＰＰ／０．５μｇ ＯＶＡ ｍＲＮＡで２４時間処置した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＣ／Ｔ細胞比１：１でＢ３Ｚ ＯＶＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞またはＤＯＢＷ ＯＶＡ特異的ＣＤ４Ｔ細胞のいずれかと共培養した。ＥＬＩＳＡを実施して、活性化Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌を測定した。全ての試料を三重で測定した。
細胞傷害性Ｔ細胞によるＢ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺滅。ＤＣ２．４を、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を３７℃で２４時間、ＬＰＰ／０．５μｇＯＶＡ ｍＲＮＡで処置した。続いて、これらのＤＣ２．４細胞をＤＣ２．４／Ｔ細胞比１：２でＢ３Ｚ Ｔ細胞と共培養した。２４時間のインキュベーション後、活性化されたＴ細胞を、３７℃で４、８、または２４時間、Ｔ細胞／腫瘍細胞比５：１でのＢ１６黒色腫細胞との共培養に適用した。次いで、上記のように、ＭＴＳホルマザン生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して、腫瘍細胞の生存率を決定した。非活性化Ｔ細胞またはＨＥＲ２乳がん抗原ペプチドで活性化されたＴ細胞で処置した腫瘍細胞は、陰性対照として機能した。全ての試料を三重で測定した。
肺転移黒色腫のマウスモデルにおける有効性試験。８週齢のオスおよびメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、尾静脈注射により２．５×１０５個のＢ１６－ＯＶＡ黒色腫腫瘍細胞を接種し、これまでに記載されたプロトコール（ＯｖｅｒｗｉｊｋおよびＲｅｓｔｉｆｏ、２００１年）に従って肺転移腫瘍を確立した。腫瘍接種の３日後に、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡ（１μｇ）をマウスの皮下にワクチン接種した。７日目と１０日目にさらに２回接種してワクチン接種をブーストした。マウスを１８日目に安楽死させ、肺を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。肺転移腫瘍結節の数を解剖顕微鏡下で数えた。
生きているマウスの生物発光イメージング。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＬＰＰへとロードした１０μｇのルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＬＰＰ／Ｌｕｃ ｍＲＮＡ）を皮下投与した。２４時間または４８時間後に、３０μｇのＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｕｌｔｒａ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）をマウスに腹腔内注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００イメージングシステムで生物発光を測定した。
肺転移黒色腫のマウスモデルにおける有効性試験。８週齢のオスおよびメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、尾静脈注射により２．５×１０５個のＢ１６－ＯＶＡ黒色腫腫瘍細胞を接種し、肺転移腫瘍を確立した。腫瘍接種の３日後に、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡ（１ｍｇ）をマウスの皮下にワクチン接種した。７日目と１０日目にさらに２回接種してワクチン接種をブーストした。マウスを１８日目に安楽死させ、肺を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。肺転移腫瘍結節の数を解剖顕微鏡下で数えた。
ｉｎ ｖｉｖｏのＴ細胞活性化分析。Ｔ細胞活性化状態を決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２．５ｍｇのＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡによりｓ．ｃ．で免疫した。表面マーカーによりＴ細胞活性化を決定するために、マウスを２４時間後に安楽死させ、脾臓およびリンパ節を収集し、処理し、抗マウスＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ６９抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により４℃で３０分間染色し、次いで、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用したフローサイトメトリーで分析した。ＩＦＮ－γ分泌によるＴ細胞の活性化を測定するために、１、４、７日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡまたはＬＰＰ／ＴＲＰ２ ｍＲＮＡによりｓ．ｃ．で免疫した。最後の免疫の１週間後、脾臓、リンパ節、およびＰＢＭＣを収集し、単一細胞分析のために処理した。３７℃で４８時間、ＯＴ－Ｉ（ＯＶＡ２５７－２６４）、ＯＴ－ＩＩ（ＯＶＡ３２３－３３９）、またはＰＭＡ－イオノマイシンで細胞を再刺激した。ＩＦＮ－γ分泌はＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析した。
統計解析。実験群間の比較には、両側スチューデントのｔ検定が適用された。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
結果
リポポリプレックスに基づくｍＲＮＡワクチンは、樹状細胞の取り込みとタンパク質の発現に最適である。脂質二重層エンベロープ中にパッケージ化されたＰｂＡＥ／ｍＲＮＡポリプレックスコア構造を含むｍＲＮＡに基づくワクチンのプラットフォームが記載されている（図１Ａ）。カチオン性ＰｂＡＥポリマーに対するｍＲＮＡの結合能を調べるためにアガロースゲル電気泳動を実施し、ＰｂＡＥ／ｍＲＮＡ比（ｗｔ．／ｗｔ．）が２０またはそれより大きいときにｍＲＮＡがＰｂＡＥに完全にカプセル化されていることが確認された（図１Ｂ）。その結果、研究の残りの部分でＬＰＰ ｍＲＮＡワクチンを調製するために、２０のＰｂＡＥ／ｍＲＮＡ比が選択された。ＴＥＭ分析は、ＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００脂質シェルに囲まれた５０ｎｍのＰｂＡＥ／ｍＲＮＡポリプレックスコア（図１Ｃ）を検出した（図１Ｄ、図１Ｅ、および図１Ｆ）。
ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンの脂質シェルは、ＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００、ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００、およびＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥ／Ｒ８の間で比較された。ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００はカチオン性脂質シェルを形成し、ＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥ／Ｒ８は活性な標的化部分を持つ脂質シェルであり；どちらもこれまでにＲＮＡ送達に適用されていた（Ｗａｎｇら、２０１３年；Ｈａｙａｓｈｉら、２０１５年）。ＤＣ２．４は抗原提示細胞として機能し、ｅＧＦＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子は、ポリプレックスコアを調製するために適用された。ＰｂＡＥ／ｍＲＮＡコアとともにインキュベートした細胞は、検出可能なレベルのｅＧＦＰを発現しなかった（図１Ｇ）。ＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００およびＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００でパッケージ化した粒子で処置した細胞は明るいｅＧＦＰタンパク質を発現したが、ＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥ／Ｒ８でパッケージ化したポリプレックスとインキュベートしたものは検出可能なレベルのｅＧＦＰを有さなかった（図１Ｈ、図１Ｉ、および図Ｊ）。興味深いことに、プロタミンに基づくｍＲＮＡワクチンは臨床試験の種々の段階にある（ＫａｌｌｅｎおよびＴｈｅｓｓ、２０１４年）が、プロタミン／ｅＧＦＰで処置した細胞はｅＧＦＰ発現レベルも高くなかった（図１Ｋ）。さらに、ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００製剤から高レベルの細胞毒性が検出された（図１Ｌ）。結果として、ＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００は、全ての追跡調査でＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンの調製に選択された。
ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンは、マクロピノサイトーシスにより樹状細胞に入る。種々の細胞型によるＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチン粒子の取り込みが調査された。ＰｂＡＥ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡでパッケージ化された等量のＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００粒子をＤＣ２．４細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳がん細胞、またはｍＤＭＥＣマウス内皮細胞の培養物に添加し、２４時間後に、ｅＧＦＰを発現する細胞を検出した。ＤＣは高い食作用の潜在能を有する最も効果的な抗原提示細胞であるという概念（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９８年）と合致して、全てのＤＣ２．４細胞はワクチン粒子を内在化し、緑色蛍光タンパク質を発現したが、比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の約半数がＧＦＰ陽性であり、内皮細胞のごく一部のみがＧＦＰを合成した（図２）。
細胞取り込みのメカニズムは、ＤＣ２．４細胞をエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、および食作用の阻害剤で処置することによって調べた。マクロピノサイトーシスの阻害剤であるアミロリド（Ｋｏｉｖｕｓａｌｏら、２０１０年）による処置は、ＥＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００でパッケージ化されたＦＡＭ蛍光色素標識ｍＲＮＡ（ＬＰＰ／ＦＡＭ－ｍＲＮＡ）の細胞取り込みを７０％減少させた。比較して、粒子の細胞取り込みは、カベオリン媒介性エンドサイトーシスの阻害剤であるゲニステイン；クラスリン媒介性エンドサイトーシスの阻害剤であるクロルプロマジン；または食作用の阻害剤であるピモジドによって有意には影響されなかった（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、および図３Ｇを参照されたい）。
これらの結果は、開示されたＬＰＰ ｍＲＮＡに基づくワクチンの細胞進入の主要経路がマクロピノサイトーシスであることを示唆した。重要なことに、エンドソームの酸性化と成熟を防止する試薬であるクロロキンは、ｍＲＮＡの蓄積に影響しなかった（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、および図３Ｇ）。クロロキン処置した細胞の時間依存的なモニタリングは、蛍光強度の遅延した増加を示し、ピーク強度はインキュベーション後１２０分に達した（図３Ｈ）。この結果は、ｍＲＮＡ分子が首尾よくエンドソームを出てサイトゾルに入ったことを示した。
ＬＰＰ ｍＲＮＡワクチンはＤＣ成熟を促進する。過剰発現したオボアルブミン（ＯＶＡ）を有するマウス腫瘍モデルは、がんワクチンの有効性を試験するために広く適用されている（Ｋｉｍら、２０１５年；Ａｖｃｉら、２０１１年；Ｕｈｌｉｇら、２０１５年）。ＯＶＡ ｍＲＮＡを、治療用ｍＲＮＡワクチン（ＬＰＰ／ＯＶＡ）を組み立てるのに適用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍免疫を調べた。ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境では、骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）をＬＰＰ／ＯＶＡまたは対照のいずれかとともに共インキュベートし、細胞成長培地中のサイトカインレベルを測定した。興味深いことに、ポリプレックス／ＯＶＡコアとＬＰＰ／ＯＶＡの両方が、プロタミン／ＯＶＡとともに、有意なＴＮＦ－α発現を誘発し得た（図４Ａ）。ＴＮＦ－α依存性ＤＣ成熟は、ウイルス感染に対する適応免疫応答の活性化（Ｔｒｅｖｅｊｏら、２００１年）および抗腫瘍免疫（Ｂｒｕｎｎｅｒら、２０００年）に重要であることがこれまでに報告されている。しかしながら、ポリプレックス／ＯＶＡとプロタミン／ＯＶＡのいずれも、ＩＦＮ－βおよびＩＬ－１２発現を刺激することについてＬＰＰ／ＯＶＡ程に強力ではなかった（図４Ａ）。Ｉ型インターフェロンＩＦＮ－βは、ＤＣの成熟、抗原プロセシングと提示、およびＴ細胞のクローン増殖の刺激を促進することがこれまでに示されている（Ｘｉａら、２０１５年）。同様に、ＩＬ－１２はＴｈ１サイトカインの１つであり（ＭｉｌｌｓおよびＬｅｙ、２０１４年）、ＩＬ－１２を産生するＤＣはＩ型ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫を促進する（Ｃａｒｒｅｎｏら、２０１３年；Ｃａｒｒｅｎｏら、２０１５年）。結果は、ワクチンからのアジュバント効果を最大化するために、ポリプレックス／ｍＲＮＡコアと脂質シェルの両方が必要であることを示す。ＬＰＰ／ｍＲＮＡを介したアジュバント効果は、プロタミン凝縮ｍＲＮＡ粒子（Ｓｃｈｅｅｌら、２００５年；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋら、１９９７年）と合致して、ＴＬＲ－７／８シグナル伝達の活性化により媒介された。なぜなら、短い一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＴＬＲ７／８阻害剤であるＯＤＮ２０８７による処置が、ＬＰＰ／ＯＶＡ刺激のＩＬ－１２およびＩＦＮ－βの発現を完全に抑制した（図４Ｂ）からである。
ＤＣ成熟マーカーもまた、ＬＰＰ／ＯＶＡ処置したＤＣ２．４細胞で調べられた。処置後の細胞は、劇的に増加したＭＨＣ ＩＩ発現のレベルを示した（図４Ｃ）。ＤＣは、活性化すると原形質膜の抗原に由来するペプチドをロードした高レベルのＭＨＣ ＩＩを発現することが報告されている（ＴｒｏｍｂｅｔｔａおよびＭｅｌｌｍａｎ、２００５年）。さらに、他のＤＣ成熟マーカーであるＣＤ４０およびＣＤ８６のレベルもまた、処置された細胞で高かった（図４Ｃ）。
ＬＰＰ ｍＲＮＡワクチンは抗原提示を刺激する。抗原プロセシングおよび提示は、ＬＰＰ／ＯＶＡで処置されたＢＭＤＣＳで分析された。フローサイトメトリーは、細胞表面にＭＨＣＩ－ＯＶＡエピトープをも提示するＣＤ１１ｃ＋ＤＣを検出した（図５Ａ）。処置後の細胞をＯＶＡ特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞と共インキュベートするとき、抗原特異的Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌の有意な増加が検出され（図５Ｂ）、ＤＣが、Ｔ細胞によって認識され得るＯＶＡエピトープを首尾よくプロセシングおよび提示したことが示された。これらの結果は、ＢＭＤＣがｍＲＮＡ抗原を適切に翻訳し、ならびに、抗原エピトープをプロセシングして提示することができることを実証した。別の研究では、同様の効果が処置後のＤＣ２．４細胞で観察された（図５Ｃ）。
ＬＰＰ ｍＲＮＡワクチンは強力な抗腫瘍活性を有する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞殺滅を試験するために、活性化ＯＶＡ特異的Ｔ細胞をエフェクターＴ細胞／腫瘍細胞比５：１でＢ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞と共培養し、時間依存的な腫瘍細胞殺滅を調べた。Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍細胞の生存率の有意な低下が、共インキュベーション後４時間で観察され、ほとんどの腫瘍細胞は２４時間の時点までに死滅した（図６Ａ）。
比較して、ナイーブＴ細胞で処置した腫瘍細胞は、有意な細胞死を示さなかった。抗原特異的な腫瘍細胞の殺滅を確認するために、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞をＨＥＲ２乳がん抗原に特異的であるがＯＶＡに特異的ではないＴ細胞と共インキュベートしたが、細胞死は観察されなかった。
抗腫瘍活性は、Ｂ１６－ＯＶＡ黒色腫肺転移モデルでさらに評価された。マウスをＬＰＰ／ＯＶＡの皮下注射で３回処置し、最後の処置の８日後に安楽死させて肺の腫瘍成長を調べた。ＰＢＳ対照群のマウスは、広範な肺転移を発症し；比較して、ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡで処置したマウスは、肺の腫瘍結節の数が９６％減少し（図６Ｂ）、転移性腫瘍の処置におけるＬＰＰ ｍＲＮＡワクチンの力を実証した。
別の研究では、Ｂ１６黒色腫を担持するＣ５７ＢＬ６マウスを、ＴＲＰ２を標的とする別のｍＲＮＡワクチン（ＬＰＰ／ＴＲＰ２ ｍＲＮＡ）で処置した。ＰＢＭＣによる有意なレベルのＩＦＮ－γ発現がワクチン接種されたマウスで検出された。全ＰＢＭＣの約４％がＴＲＰ２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞であった。これらの結果は、ＬＰＰ／ｍＲＮＡプラットフォームが１つの特定のｍＲＮＡだけに限定されないことを示しており、がんに対する戦いでの幅広い応用の潜在性を示している。
（実施例２）
リポポリプレックスはｍＲＮＡに基づくワクチンの抗腫瘍免疫を増強する
図８Ａおよび図８Ｂは、非標的化および標的化のｍＲＮＡワクチン粒子のサイズ分布を示す。標的化ｍＲＮＡワクチンは、脂質シェルの表面にマンノースを有する。樹状細胞はマンノース受容体を発現するため、表面にマンノース部分を有する粒子に高い結合親和性で結合する傾向がある。それは、非標的化ｍＲＮＡワクチンと同じ手順に従って調製された。シェルの脂質組成は、４９％ＥＤＯＰＣ、４９％ＤＯＰＥ、１％ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、および１％ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マンノースである。非標的化および標的化のｍＲＮＡワクチン粒子の両方は４０～２００ｎｍの範囲内にあり、標的化された粒子の中間のサイズは非標的化のものよりも大きい。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、樹状細胞が非標的化ｍＲＮＡワクチンよりも効果的に標的化ｍＲＮＡワクチンを取り込むことを示している。標的化ｍＲＮＡワクチンは、脂質シェルの表面にマンノースを有する。それは、非標的化ｍＲＮＡワクチンと同じ手順に従って調製された。シェルの脂質組成は、４９％ＥＤＯＰＣ、４９％ＤＯＰＥ、１％ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、および１％ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マンノースである。Ｃｙ５蛍光色素標識ｍＲＮＡ分子は、非標的化ワクチンまたは標的化ワクチン中にパッケージ化された。ワクチンをＤＣ２．４細胞（不死化樹状細胞株）とともに４時間インキュベートし、フローサイトメトリーを実施して、蛍光ワクチン粒子を取り込んだ細胞を検出した。蛍光ｍＲＮＡワクチンを内在化したＤＣ２．４細胞のパーセンテージを図１２Ａに示し、一方で、図１２Ｂは、ＤＣ２．４細胞の総蛍光強度を示している。これらの結果は、親和性部分（即ち、マンノース）の表面コンジュゲーションが、ワクチン粒子の樹状細胞の取り込みを増強する効果的なアプローチであることを示した。
図１７は、ＩＤＯ１阻害剤が、樹状細胞による抗原提示を増強したことを示す。ｍＲＮＡワクチンは、ＯＶＡ ｍＲＮＡコアとＩＤＯ１阻害剤ＩＮＣＢ０２４３６０の両方を脂質シェル内部にカプセル化することにより調製された。ＩＮＣＢ０２４３６０を含むまたは含まないｍＲＮＡワクチンを使用してＢＭＤＣを処置し、次に、ＢＭＤＣをＢ３Ｚ ＯＶＡ特異的Ｔ細胞との共インキュベートに適用した。刺激されたＴ細胞はＩＬ－２を成長培地に分泌し、ＥＬＩＳＡを、ＩＬ－２レベルの測定に適用した。結果に基づくと、ＩＤＯ１阻害剤を含めることで、Ｔ細胞の活性化をさらに刺激することができる。
図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンからの抗腫瘍免疫応答を示す。Ｃ５７ＢＬ６マウスは、１、４、および７日目にＯＶＡタンパク質またはＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンのいずれかで処置した。最後の処置の１週間後、マウスを安楽死させ、脾臓、リンパ節、および末梢血試料を収集した。（図１８Ａ）脾臓およびリンパ節から調製した単一細胞をＯＴＩ（ＯＶＡ２５７－２６４０）またはＯＴＩＩ（ＯＶＡ３２３－３３９）ペプチドで４８時間再刺激し、ＥＬＩＳＡを、培地中の分泌されたインターフェロン－γレベルを測定するのに適用した。（図１８Ｂ）末梢血からのＴ細胞をＢ１６－ＯＶＡ腫瘍細胞と共インキュベートし、２４時間後に細胞生存率を測定した。この結果は、ＯＶＡタンパク質ではなくＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンによる処置が、抗原を発現する腫瘍細胞の殺滅に有効なＯＶＡ抗原特異的Ｔ細胞の生成を促進することを示している。
（実施例３）
ｍＲＮＡワクチンプラットフォームの一般化した説明
図２０は、本明細書に開示されるｍＲＮＡワクチンプラットフォームの全体的な説明を示す。ワクチンは、好ましくは、親水性「シェル」構造（リポソーム二重層で構成され、その中にコア構造を効率的にカプセル化するよう組み立てる）内に含まれる複数の疎水性「コア」構造（各々が目的の抗原をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む）で構成される。疎水性「コア」は、好ましくは負電荷ｍＲＮＡ分子と正電荷ポリプレックス（例えば、ＰｂＡＥ）またはタンパク質（例えば、プロタミン）分子の集団を含み、親水性「シェル」は、好ましくは事前に選択され最適化された比の、脂質および／またはリン脂質の組合せで構成される。特定の実施形態では、１または複数の親和性部分（例えば、マンノースなどの糖部分、結合タンパク質、または１つもしくは複数のＤＣ発現エピトープに特異的な抗体）を脂質シェルの表面にコンジュゲートして、ワクチン粒子と、ワクチンのコア／シェル複合体が標的とする抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞など）との間の相互作用を強化する、および／またはその間の結合を増加させることによって、脂質シェルの表面を「機能化」することが望ましい場合がある。ｍＲＮＡを含む内部コアと外側のリポソーム二重層シェルとの間に形成される「サイトゾル」空間はまた、１または複数のサイトカイン（例えば、ＣｐＧ）、タンパク質（例えば、ＦＬＴ３Ｌ）、または小分子（例えば、ＩＤＯ－１阻害剤などの免疫調節剤）を含むように最適化し、それにより、選択された細胞および患者におけるワクチンの活性をさらに増強／拡張することができる。
好ましい実施形態では、本明細書に開示される治療組成物用のシェル／コア送達構築物を調製する際に最も望ましい結果を提供するために、≧２０：１のポリマー対ｍＲＮＡ分子（または、あるいは≧１：１のプロタミン対ｍＲＮＡ分子）の比が決定された。同様に、約１μｇのｍＲＮＡ対２μｇのプロタミン対２０μｇの脂質の比が、ヒト投与用のワクチンの製剤化に特に有利であることが示された。
（実施例４）
２つのｍＲＮＡを、デュアル免疫療法のために単一シェル中に共パッケージ化することができる
図２１に示す研究では、５００ｎｇのＯＶＡ ｍＲＮＡを、増加する量のＩＬ１２ｐ７０をコードするｍＲＮＡと混合して、プロタミン／ｍＲＮＡコアを調製し、その後、コアを脂質シェル中にパッケージ化した。そのため、得られたｍＲＮＡワクチンには、ＯＶＡ抗原をコードするｍＲＮＡと樹状細胞刺激サイトカインＩＬ１２ｐ７０をコードするｍＲＮＡの２つの異なるｍＲＮＡ分子が含まれていた。ＤＣ２．４細胞を最初にｍＲＮＡワクチンで処置し、次いでＢ３Ｚ ＯＶＡ特異的Ｔ細胞とともに共インキュベートした。細胞成長培地中のＩＬ－２レベルは２４時間後に測定された。結果は、５００ｎｇのＩＬ１２ｐ７０ ｍＲＮＡの共パッケージ化がワクチン活性をブーストすることを示した。これにより、１）１つのワクチン粒子に２つの異なる種類のｍＲＮＡ分子をパッケージ化できること；および２）２種類のｍＲＮＡ分子が異なる目的－一方が抗原産生、他方が樹状細胞刺激に役立ち得ること、が実証された。
この結果は、特に特定の患者向けに作成された「個別化」がん免疫療法の設計に関する、本発明の重要な態様を実証した。この用途は、次の実施例で説明する研究でさらに拡張される。
（実施例５）
個別化がん免疫療法のためのｍＲＮＡに基づくワクチン
がんゲノムからの体細胞変異の同定と免疫原性腫瘍変異の予測の進歩により、個別化がん免疫療法用の治療用ワクチンを開発する前例のない機会が提供された。しかしながら、所定の腫瘍で不均質な変異スペクトルを持つがん細胞を標的とするために、従来のタンパク質ベースまたはペプチドに基づくワクチンを準備することは困難な作業である。開示されるｍＲＮＡワクチンプラットフォームは、この目的のために特別に設計されている。ここでは、この非常に効果的なプラットフォームを使用して、患者固有のがんゲノムの特徴に基づいてカスタマイズされたワクチン接種により、個別化された乳がん処置を達成できるという仮説を検証した。
この実施例では、乳がんの研究における３つの主要な課題に対処している。
ａ）より効果的で毒性が低く、生存期間に影響を与える処置レジメンに置き換えることにより、処置レジメンに革命をもたらすこと；
ｂ）転移性乳がんに関連する死亡率を排除すること；および
ｃ）乳がん細胞が何年も休眠状態であり、その後再出現する理由と方法を解明し、この情報を使用してそのような再発を防止すること。
がん免疫療法は、近年、複数の種類のがんで前例のない臨床的有効性を達成している。しかし、免疫療法の恩恵を受けるのは少数のがん患者のみであり、多くの患者は効果的な抗腫瘍免疫応答に応答しないか、それを高めることができない。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在が予後マーカーとして機能し、免疫療法および化学療法を含む種々の治療法への応答を予測することを一連の複数の証拠が示している。ＴＩＬを欠く腫瘍は「非炎症性」と特徴付けられており、一般的に処置の失敗や予後不良と相関している。例えば、ＴＩＬが比較的少ない乳がん患者におけるチェックポイント遮断抗体の有効性は、「炎症性」として特徴付けられるＴＩＬが豊富な腫瘍タイプである、黒色腫または非小細胞肺癌の患者におけるそれと比較してはるかに効果的ではない。したがって、Ｔ細胞浸潤を促進し、腫瘍微小環境におけるＴ細胞の機能を維持する手段は、特に乳がんを含む「非炎症性」の腫瘍タイプに対する効果的な免疫療法の開発に焦点を当てている。
治療用がんワクチンは、強力な抗腫瘍免疫を刺激する潜在能を有する。最近の研究では、ｐ６６ ＨＥＲ２抗原ペプチドを含むナノテクノロジーに基づく樹状細胞ワクチン（ナノＤＣワクチン）を使用して、ＨＥＲ２陽性乳がんを標的とし、乳がんのマウスモデルでＨＥＲ２陽性腫瘍成長を強力に阻害する、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大量腫瘍浸潤とＴｈ１に偏ったサイトカインの刺激を検出した。
追跡研究では、腫瘍関連ＣＤ４５＋細胞集団内のＣＤ３＋Ｔ細胞の増加により示されるように、Ｔ細胞の腫瘍浸潤をさらに促進することにおける、がんワクチンによる処置と抗ＰＤ－１抗体による処置との相乗作用も実証された。
個別化された免疫療法の新時代における治療用ｍＲＮＡワクチン。乳がんの全体的な変異荷重は黒色腫または非小細胞肺がんほど重くはないが、５６０個の乳がんの全ゲノム配列の最近の研究では、９３個のがん遺伝子で１，６２８の可能性のあるドライバー変異が同定され、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性の乳がんにおいて、ＴＰ５３が最も一般的に変異しているドライバーがん遺伝子であった。この結果は、ＴＰ５３変異がＨＥＲ２陽性乳がん（７２％）および基底様乳がん（８０％）でより頻繁に発生するのに対し、ＰＩＫ３ＣＡ変異は、他のサブタイプ（２９～４５％）と比べて基底様乳がん（９％）でまれであるというこれまでの報告とよく一致する。プロテアソーム切断モチーフに基づいたオンラインツールを使用して、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＰＴＥＮ中のものを含むヒトとマウスのタンパク質間で１００％保存された複数の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが同定された（表２）。これらのエピトープは、「次世代」免疫療法の開発に最良の試薬として機能し、マウス腫瘍モデルを使用した有効性研究から得られた結果は、患者の応答を予測するために直接適用できる。
Figure 0007181880000002
本明細書に開示されるｍＲＮＡに基づくワクチンプラットフォームは、この目的のために理想的に開発された。ポリプレックス／ｍＲＮＡコアがポリ－（β－アミノエステル）ポリマー／ｍＲＮＡ（ＰβＡＥ／ｍＲＮＡ）またはプロタミン／ｍＲＮＡで構成されるリポソームシェル構造内のｍＲＮＡコアで構成され、リポソームシェルが中性リン脂質と正電荷リン脂質の混合物でできている、ＬＰＰ ｍＲＮＡワクチンを使用すると、このプラットフォームはｍＲＮＡ分子からのロバストなタンパク質発現を可能にする。従来のペプチドに基づくワクチンとは対照的に、ｍＲＮＡに基づくワクチンは、１つのミニ遺伝子構築物に複数の抗原エピトープを組み込むという利点があるため、個々のがんゲノムの変異スペクトルに基づいて個々の患者のニーズに合致するよう迅速にカスタマイズできる。また、それらは、従来のプラスミド由来のワクチンとは、（他の利点もある中でとりわけ）分裂細胞と非分裂細胞の両方で機能する一方でゲノム組み込みのリスクもないという点で異なっている。興味深いことに、プロタミンに基づくｍＲＮＡワクチン製品は長年にわたって試験されてきたが、裸のプロタミン／ｍＲＮＡからのタンパク質抗原発現はＬＰＰ／ｍＲＮＡに比べほんのわずかであった。考えられる理由は、裸の構築物のｍＲＮＡ分子が血漿ＲＮａｓｅによる攻撃を受けやすいということである。
代替的に、ＬＰＰ／ｍＲＮＡは、ＤＣが抗原提示細胞の最大の抗原プロセシングおよび提示活性に不可欠なサイトカインであるＩＬ－１２をはるかに高いレベルで発現するよう誘発する。ｍＲＮＡコアはまた、Ｔｏｌｌ様受容体７および８（ＴＬＲ７／８）阻害剤ＯＤＮ２０９５によるサイトカイン発現の阻害によって実証されるように、ＴＬＲ７／８シグナル伝達を活性化することにより、ワクチンの強力なアジュバントとしても機能する。ｍＲＮＡワクチンの活性を試験するために、オボアルブミン（ＯＶＡ）をモデル抗原として適用し、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）をＬＰＰ／ＯＶＡとインキュベートして抗原提示とＴ細胞活性化を決定した。プロタミン／ＯＶＡではなく、ＬＰＰ／ＯＶＡとインキュベートしたＢＭＤＣは、表面に高レベルの主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）－ＯＶＡエピトープを提示した。ＬＰＰ／ＯＶＡ ｍＲＮＡワクチンによる処置は、脾臓およびリンパ節のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激を引き起こした。このワクチンは、ＯＶＡ発現腫瘍の成長を阻害するのにも有効であった。別の研究では、開示されたＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンは、がんおよび感染症に対する類似した構造と組成を持つリポソームｍＲＮＡワクチンに関する最近の著名な刊行物にもかかわらず、抗原発現の促進およびＤＣ活性化の刺激において、単純なリポソームｍＲＮＡワクチン（即ち、ｍＲＮＡ保護コア構造を欠くワクチン）よりもはるかに効果的であることが示された。まとめると、これらのデータは、ＬＰＰ／ｍＲＮＡワクチンプラットフォームが強力な抗原プロセシングと提示を通じて強固な抗腫瘍免疫を提供することを示した。ポリプレックス／ｍＲＮＡコア－リポソームシェル構造は、抗腫瘍免疫の刺激において、他のｍＲＮＡに基づくプラットフォーム（裸のプロタミン／ｍＲＮＡおよびリポソームでカプセル化されたｍＲＮＡ）よりもはるかに優れている。
ヒトのがんは分子的特徴と構造的特徴の両方で不均質であり、腫瘍成長、クローンの増殖、および薬物処置中に遺伝子変異／増幅／欠失が頻繁に発生することは周知である。この複雑さの度合いを強めているのは、各がんのタイプにそれ自身の独自の特徴があることである。例えば、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体またはＨＥＲ２／ｎｅｕの発現を欠く）には、多種多様な遺伝子の低頻度変異と組み合わされた高率のＴＰ５３変異がある。これらの変異事象は、単一の腫瘍で特定の遺伝子増幅／変異の特徴を持つ異なるクローン（いくつかは優勢で、いくつかはよく表されていない）の形成を引き起こす可能性が最も高い。その結果、同じ患者からの異なる腫瘍結節で、または原発性腫瘍と転移性腫瘍の間で異なる変異スペクトルを同定することはまれなことではない。がん免疫療法の目標は、腫瘍内の全てのクローンを高効率で除去することであり、ｍＲＮＡがんワクチンは、ある単一のワクチン構築物が各々の患者のがんゲノムの複雑さに合わせて複数の抗原を標的とするように操作できるため、この目的に非常に適している。
免疫応答性のあるマウスにおける原発性および転移性腫瘍の生成：４Ｔ１マウス乳腺腫瘍細胞（ｐ５３ ヌル（ｎｕｌｌ））は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によってＰＩＫ３ＣＡまたはＰＴＥＮ遺伝子に点変異を生成するように操作され、これは、実験室で日常的に実施されている。次いで、野生型またはＰＩＫ３ＣＡおよびＰＴＥＮ変異を持つ４Ｔ１細胞に、変異ＴＰ５３遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を持つレトロウイルスを感染させる。得られた同系４Ｔ１細胞は、ＴＰ５３遺伝子に単一変異（４Ｔ１／ＴＰ５３＊）、ＴＰ５３遺伝子およびＰＩＫ３ＣＡもしくはＰＴＥＮの二重変異（４Ｔ１／ＴＰ５３＊ＰＩＫ３ＣＡ＊もしくは４Ｔ１／ＴＰ５３＊ＰＴＥＮ＊）、または３つの遺伝子全て（４Ｔ１／ＴＰ５３＊ＰＩＫ３ＣＡ＊ＰＴＥＮ＊）の変異のいずれかを持つ。４つの同質遺伝子系統全てを１：１：１：１の比で一緒にプールし、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪パッドに接種して、原発性腫瘍を生成する。前の実施例で示したように、４Ｔ１原発性腫瘍は肝臓と肺に高い効率で転移を起こす。原発性腫瘍と転移性腫瘍結節を特徴付けるために組織学的分析を実施し、親４Ｔ１腫瘍と比較する。腫瘍から単一細胞を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して定量して、所定の腫瘍で単一のＴＰ５３＊変異または二重もしくは三重変異を持つ腫瘍細胞の割合を測定することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫応答のテスト：細胞に基づく研究を実施して、ｍＲＮＡワクチンが腫瘍担持マウスモデルの処置に適用される前に意図した機能を発揮できることを確認することができる。個々のｍＲＮＡワクチンを骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）と６時間インキュベートし、次いでＢＭＤＣをマウスＴ細胞と共インキュベートする。ＤＣ成熟は、ＣＤ４０およびＣＤ８６の発現に関するフローサイトメトリー分析と、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）の発現に関するＥＬＩＳＡによって決定できる。Ｔ細胞の活性化は、インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）の発現によって測定される。
ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡワクチンからの免疫応答の調査：ＢＡＬＢ／ｃマウスに、乳腺脂肪パッドに４つの同質遺伝子クローンの混合物を含む４Ｔ１細胞を接種する。原発性腫瘍が２００～３００ｍｍ３に達するとき、マウスを４群に分け（ｎ＝１０マウス／群）、４つのｍＲＮＡワクチンで皮内処置し、１週間後にもう１回ワクチン接種をブーストする。血液試料は、２回目のワクチン接種の前に１回、実験の完了のときにもう１回収集する。２回目のワクチン接種の３日後にマウスを安楽死させ、脾臓、リンパ節、および腫瘍試料を収集する。ＥａｓｙＳｅｐＴＭマウスＴ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ての試料をＣＤ３＋Ｔ細胞の分離に適用し、本発明者らが記載したのと同一のプロトコールに従って、ＩＬ－２およびＩＦＮ－Ｉの発現レベルまたは表面成熟マーカーに基づいて、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、活性化細胞を検出する。チェックポイント阻害剤タンパク質の発現レベルも調べる。
ｍＲＮＡワクチンからの抗腫瘍活性の評価：ＢＡＬＢ／ｃマウスに親４Ｔ１腫瘍を接種するか、４つの同質遺伝子クローンの混合物に由来する腫瘍を４つの群に分けて（ｎ＝１０マウス／群）、４週間にわたって毎週、４つのｍＲＮＡワクチンで皮内（ｉ．ｄ．）処置する。マウスは、腫瘍成長（腫瘍サイズに基づく）および遠隔臓器への腫瘍転移のモニタリング（Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００イメージングシステムを使用）のために維持される。マウスは、原発性腫瘍の重量（密度を１ｇ／ｃｍ３と仮定して腫瘍体積に基づいて計算）が体重の１０％を超えるか、または腫瘍潰瘍形成、または不活発、猫背、立毛（ｒｕｆｆｅｄ ｆｕｒ）などの病気の徴候がある場合、安楽死させる。
ＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスにおけるｍＲＮＡワクチンに対する免疫応答：Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ［ＨＡＬ－Ａ２．１］１Ｅｎｇｅ／Ｊ）は、脾臓、骨髄、胸腺の細胞でヒトＨＬＡ－Ａ２．１ ＭＨＣＩ白血球抗原を発現する。ｍＲＮＡワクチンに対する患者の免疫応答を予測するために、ＨＬＡ－Ａ２マウス（ｎ＝１０マウス／群）を４つの列挙されたｍＲＮＡワクチンで処置し、血液および組織試料を収集して、抗原特異的Ｔ細胞活性を調べる。
マウス腫瘍モデル：混合同質遺伝子クローンを接種されたマウスは、混合分子の特徴（ｍｉｘｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｅａｔｕｒｅ）を持つ腫瘍を発症する。腫瘍試料のＰＣＲ分析に基づいて検出される、１つの同質遺伝子クローンからの腫瘍細胞が残りのクローンよりもはるかに速く成長する場合、これらのクローンの比は腫瘍細胞接種前に調整され得る。原発性腫瘍からのシグナルが転移性結節の検出に干渉する場合、原発性腫瘍は５００ｃｍ３に達したら外科的に切除し、発光アッセイで腫瘍の転移をモニターし得る。
抗腫瘍免疫：免疫応答の分析により、ｍＲＮＡワクチンが強力な抗腫瘍免疫を発揮できることを明らかにする。複数の新抗原エピトープ（例えば、ＬＰＰ／ｐ５３－ＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ）をコードするワクチンは、単一のエピトープ（即ち、ＬＰＰ／ｐ５３）を有するワクチンと比較して、より強力な抗腫瘍免疫を促進する利点があると予想され、その効果は、Ｔ細胞活性測定および腫瘍成長と転移の阻害によって反映される。ＬＰＰ／ｐ５３またはＬＰＰ／ｐ５３－ＰＩ３Ｋなどの特定のワクチンによる処置が腫瘍成長の部分的な阻害のみを引き起こす場合、４つの個々の同質遺伝子クローンからの腫瘍細胞の割合に焦点を合わせて、ワクチン接種後のマウスから腫瘍組織を収集して、腫瘍組成を分析できる。腫瘍組成の変化は、特定のワクチン（複数可）からの有効性（または有効性の欠如）を示す。ｍＲＮＡワクチンの潜在的なリスクの１つは、ＭＨＣＩ新抗原エピトープが一連のアルゴリズムに基づいて選択されたが、生物学的研究では確認されていないことである。特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究からの結果に基づいて選択されたエピトープから応答が観察されないか、非常に弱い場合、いくつかの成功した候補が得られるまで繰り返し研究において代替的なエピトープを利用できる。代替的に、抗原エピトープを単一アミノ酸置換で修飾して、ＭＨＣ結合を増強することができるが、この戦略は、ＷＴ１ ＭＨＣＩ抗原の開発に成功裏に適用されている。
ＨＬＡ－Ａ２マウスを用いる研究：ＭＨＣＩ新抗原エピトープ領域を包含するペプチド配列はヒトタンパク質とマウスホモログ間で保存されているため、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウスとＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスから同様の免疫応答が観察されると予想している。
治療用がんワクチンは、抗腫瘍活性を発揮するために、抗原提示細胞、主にＤＣを活性化する必要がある。ｍＲＮＡに基づく治療用がんワクチンの作用機序を完全に理解し、この新規治療薬の活性をさらに改善するアプローチを特定するために、まず抗腫瘍免疫を駆動するのに不可欠なＤＣの亜集団（複数可）を同定する必要がある。この研究では、ｍＲＮＡワクチン活性におけるＤＣの３つの主要なサブセット：従来のＣＤ８＋およびＣＤ８－ＤＣ（ｃＤＣ）および形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）の役割を解明するための、実験が選択された。この研究のために、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから３つの遺伝子組み換えマウス系統：Ｂａｔｆ３－／－ノックアウト、ｚＤＣ－ＤＴＲ（Ｚｂｔ６４６遺伝子の３’非翻訳領域のジフテリア毒素受容体［ＤＴＲ］）、およびＣｄ１１ｃ－ＤＴＲ（ＣＤ１１ｃプロモーターの制御下のＤＴＲ）が入手された。Ｂａｔｆ３－／－ノックアウトマウスは、ＣＤ８＋ＤＣを生成しない。ｚＤＣ－ＤＴＲマウスをジフテリア毒素（ＤＴ）で処置すると、両方のタイプのｃＤＣが骨髄から枯渇するが、ｐＤＣには影響せず、一方で、Ｃｄ１１ｃ－ＤＴＲマウスのＤＴ処置は、身体から全てのＤＣを枯渇させる。
野生型および遺伝子操作マウスの抗腫瘍免疫：抗腫瘍免疫におけるＣＤ８＋ＤＣの役割を評価するため、４Ｔ１腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのＢａｔｆ３－／－ノックアウトマウスまたは対照野生型マウス（ｎ＝１０マウス／群）に接種し、動物を４週間にわたって毎週、ＬＰＰ／ｐ５３－ＰＩ３Ｋ－ＰＴＥＮ ｍＲＮＡワクチンで処置する。ｍＲＮＡワクチン活性に対するｃＤＣおよびｐＤＣの影響を評価するために、腫瘍担持ｚＤＣ－ＤＴＲおよびＣｄ１１ｃ－ＤＴＲマウスを１系統あたり２つの処置群に分ける（ｎ＝１０マウス／群）。対照群のマウスはＤＴによる処置を受けないが、処置群のマウスにはワクチン接種の２４時間前にＤＴが投与される（２０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。ＤＣサブセットの枯渇は、本格的な有効性研究の前にフローサイトメトリー分析によって確認される。腫瘍成長と転移をモニターし、病気の徴候が現れた場合マウスを安楽死させる。
ｍＲＮＡワクチンの作用機序に基づいて、Ｃｄ１１ｃ－ＤＴＲマウスの全てのＤＣの枯渇は、ｍＲＮＡワクチンからの抗腫瘍免疫を完全に排除するはずである。Ｂａｔｆ３－／－ノックアウトおよびｚＤＣ－ＤＴＲマウスからの結果は、ｍＲＮＡワクチン活性を促進するためにどのＤＣサブセットが重要な役割を果たすかを示すはずである。以前の例では、ｍＲＮＡワクチン処置に対する強い応答がＢＭＤＣから観察され、ＣＤ８＋ＤＣの関与を示していた。ＤＣの標的のサブセットが２０μｇ／ｋｇＤＴ処置（複数の研究所で使用されるプロトコール）の後にｚＤＣ－ＤＴＲまたはＣｄ１１ｃ－ＤＴＲマウスで完全に除去されない場合、ＤＴの投与量および／または投与スケジュールは必要に応じて調整できる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されるものを補足する例示的な手順の詳細または他の詳細を提供する範囲で、明示的に参照することによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
ＡＬＴＳＣＨＵＬ， ＳＦ ｅｔ ａｌ．， “Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ，” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５（１７）：３３８９－３４０２ （１９９７）．
ＡＮＧＵＩＬＬＥ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， “Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．， １５（７）：ｅ２５７ｅ６７ （２０１４）．
ＡＶＣＩ， ＦＹ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ，” Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １７（１２）：１６０２－１６０９ （２０１１）．
ＢＡＮＣＨＥＲＥＡＵ， Ｊ ａｎｄ ＳＴＥＩＮＭＡＮ， ＲＭ， “Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，” Ｎａｔｕｒｅ， ３９２（６６７３）：２４５－２５２ （１９９８）．
ＢＥＮＴＥＹＮ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， “ｍＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ，” Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ， １４（２）：１６１ｅ１７６ （２０１５）．
ＢＲＯＯＳ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， “Ｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｍＲＮＡ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｆｉｃ ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒ－ ｆｅｒｏｎ，” Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ５：ｅ３２６ （２０１６）．
ＢＲＵＮＮＥＲ， Ｃ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ ｏｒ ｃｙｔｉｄｉｎｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ＤＮＡ ｄｒｉｖｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６５（１１）：６２７８－６２８６ （２０００）．
ＣＡＲＲＥＮＯ， ＢＭ ｅｔ ａｌ．， “ＩＬ－１２ｐ７０－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔ ＤＣ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｌｉｃｉｔｓ Ｔｃ１－ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，” Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １２３（８）：３３８３－３３９４ （２０１３）．
ＣＡＲＲＥＮＯ， ＢＭ， ｅｔ ａｌ．， “Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ａ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｂｒｅａｄｔｈ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３４８（６２３６）：８０３－８０８ （２０１５）．
ＤＥ ＢＥＵＣＫＥＬＡＥＲ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， “Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍＲＮＡ ｌｉｐｏｐｌｅｘ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｏ ｅｌｉｃｉｔ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，” Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ２４（１１）：２０１２ｅ２０２０． （２０１６）．
ＤＥＶＯＬＤＥＲＥ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， “Ｅｖａｄｉｎｇ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ｄｏｎ’ｔ ｓｈｏｏｔ ｔｈｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ，” Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． Ｔｏｄａｙ， ２１（１）：１１ｅ２５ （２０１６）．
ＤＩＥＢＯＬＤ， ＳＳ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｎａｔｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ＴＬＲ７－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０３（５６６３）：１５２９－１５３１ （２００４）．
ＦＯＴＩＮ－ＭＬＥＣＺＥＫ， Ｍ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｄｕａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅ ｂａｌａｎｃｅｄ ＴＬＲ－７ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． （Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ， ＭＤ）， ３４（１）：１－１５ （１９９７）．
ＧＲＩＢＳＫＯＶ， Ｍ， ａｎｄ ＢＵＲＧＥＳＳ， ＲＲ， “Ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｅ． ｃｏｌｉ， Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ， ｐｈａｇｅ ＳＰ０１， ａｎｄ ｐｈａｇｅ Ｔ４ ａｒｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４（１６）：６７４５－６７６３ （１９８６）．
ＨＡＬＥ， ＷＧ， ａｎｄ ＭＡＲＧＨＡＭ， ＪＰ， “ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，” ＨａｒｐｅｒＰｅｒｅｎｎｉａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）．
ＨＡＲＤＭＡＮ， ＪＧ， ａｎｄ ＬＩＭＢＩＲＤ， ＬＥ， （Ｅｄｓ．）， “ＧＯＯＤＭＡＮ ＡＮＤ ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ” １０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１）．
ＨＡＹＡＳＨＩ， Ｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ－ｔｙｐｅ ｎａｎｏ ｄｅｖｉｃｅ： ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｎｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ， Ｃｈｅｍ．， ２６（７）：１２６６－１２７６ （２０１５）．
ＨＥＩＬ， Ｆ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｖｉａ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７ ａｎｄ ８，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０３（５６６３）：１５２６－１５２９ （２００４）．
ＫＡＬＬＥＮ， ＫＪ ａｎｄ ＴＨＥＳＳ， Ａ， “Ａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｍａｙ ｅｖｏｌｖｅ ｉｎｔｏ ａ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ： ｍＲＮＡ ａｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ， ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｄｒｕｇｓ，” Ｔｈｅｒ． Ａｄｖ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ２（１）：１０－３１ （２０１４）．
ＫＡＭＡＴ， ＣＤ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ－ａｍｉｎｏ ｅｓｔｅｒ） ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＴＰ５３ ｈａｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ，” Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．， １２（４）：４０５－４１５ （２０１３）．
ＫＡＮＴＯＦＦ， ＰＷ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ，” Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３６３（５）：４１１－４２２ （２０１０）．
ＫＩＭ， Ｊ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ， ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ， ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ，” Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３３（１）：６４－７２ （２０１５）．
ＫＯＩＶＵＳＡＬＯ， Ｍ ｅｔ ａｌ．， “Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｙ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｓｕｂｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｐＨ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｒａｃ１ ａｎｄ Ｃｄｃ４２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，” Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １８８（４）：５４７－５６３ （２０１０）．
ＫＲＡＮＺ， ＬＭ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｌｏｉｔｓ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，” Ｎａｔｕｒｅ， ５３４（７６０７）：３９６ｅ４０１ （２０１６）．
ＫＲＥＩＴＥＲ， Ａ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎａｋｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ－ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏ－ ｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ７０（２２）：９０３１ｅ９０４０ （２０１０）．
ＫＹＴＥ， Ｊ， ａｎｄ ＤＯＯＬＩＴＴＬＥ， ＲＦ， “Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ，” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７（１）：１０５－１３２ （１９８２）．
ＭＣＮＡＭＡＲＡ， Ｍ ｅｔ ａｌ．， “ＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ．， ２０１５：７９４５２８ （２０１５）．
ＭＥＬＥＲＯ， Ｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ，” Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， １１（９）：５０９－５２４ （２０１４）．
ＭＩＬＬＳ， ＣＤ ａｎｄ ＬＥＹ， Ｋ， “Ｍ１ ａｎｄ Ｍ２ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ： ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｇｇ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，” Ｊ． Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ．， ６（６）：７１６－７２６ （２０１４）．
ＮＥＥＤＬＥＭＡＮ， ＳＢ ａｎｄ ＷＵＮＳＣＨ， ＣＤ， “Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８（３）：４４３－４５３ （１９７０）．
ＯＶＥＲＷＩＪＫ， ＷＷ ａｎｄ ＲＥＳＴＩＦＯ， ＮＰ， “Ｂ１６ ａｓ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ，” Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０（２０）：１ （２００１）．
ＰＲＯＢＳＴ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ，” Ｇｅｎｅｔ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｔｈｅｒ．， ４：１５２４７５３ （２００６）．
ＲＹＣＨＬＩＫ， Ｗ ａｎｄ ＲＨＯＡＤＳ， ＲＥ， “Ａ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｏｐｔｉｍａｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｆｉｌｔｅｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ，” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：８５４３－８５５１ （１９８９）．
ＳＣＨＥＥＬ， Ｂ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｂｙ ｐｒｏｔａｍｉｎｅ－ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｍＲＮＡ，” Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３５（５）：１５５７－１５６６ （２００５）．
ＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲ ２０１３． Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ， ＬＬＣ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （２０１３）．
ＳＣＨＵＭＡＣＨＥＲ， ＴＮ ａｎｄ ＳＣＨＲＥＩＢＥＲ， ＲＤ， “Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３４８（６２３０）：６９－７４ （２０１５）．
ＳＣＨＷＡＲＴＺＥＮＴＲＵＢＥＲ， ＤＪ ｅｔ ａｌ．， “ｇｐ１００ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ，” Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３６４（２２）：２１１９－２１２７ （２０１１）．
ＳＨＵＫＬＡ， ＳＡ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ＨＬＡ ｇｅｎｅｓ，” Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３３（１１）：１１５２－１１５８ （２０１５）．
ＳＩＮＧＬＥＴＯＮ， Ｐ ａｎｄ ＳＡＩＮＳＢＵＲＹ， Ｄ， “ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，” ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）．
ＳＵＬＬＥＮＧＥＲ， ＢＡ ａｎｄ ＮＡＩＲ， Ｓ “Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＲＮＡ ｗｏｒｌｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３５２（６２９２）：１４１７－１４２０ （２０１６）．
ＴＲＥＶＥＪＯ， ＪＭ ｅｔ ａｌ．， “ＴＮＦ－α－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９８（２１）：１２１６２－１２１６７ （２００１）．
ＴＲＯＭＢＥＴＴＡ， ＥＳ ａｎｄ ＭＥＬＬＭＡＮ， Ｉ， “Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ，” Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２３：９７５－１０２８ （２００５）．
ＵＨＬＩＧ， ＫＭ ｅｔ ａｌ．， “Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｒｅ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ａ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ８９（１７）：９０４４－９０６０ （２０１５）．
ＶＡＮ ＬＩＮＴ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， “Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＴｒｉＭｉｘ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｍＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ７２（７）：１６６１ｅ１６７１ （２０１２）．
ＶＡＮ ＴＥＮＤＥＬＯＯ， ＶＦ ｅｔ ａｌ．， “Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｍＲＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ： ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ ｔｏ ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｓｓｉｖｅ ｐｕｌｓｉｎｇ ｏｆ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，” Ｂｌｏｏｄ， ９８（１）：４９－５６ （２００１）．
ＷＡＮＧ， Ｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｍｏｌｅｃ． Ｔｈｅｒ．， ２１（２）：３５８－３６７ （２０１３）．
ＷＥＩＤＥ， Ｂ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔａｍｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｍＲＮＡ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｐｈａｓｅ １／２ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ３２（５）：４９８－５０７ （２００９）．
ＷＩＬＧＥＮＨＯＦ， Ｓ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｐｈａｓｅ ＩＢ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍＲＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，” Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ２４（１０）：２６８６－２６９３ （２０１３）．
ＸＩＡ， Ｘ ｅｔ ａｌ．， “ｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃｏｎ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｒｏｓｓ－ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，” Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， １１：９５７－９６６ （２０１５）．
ＹＡＤＡＶ， Ｍ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｕｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，” Ｎａｔｕｒｅ， ５１５（７５２８）：５７２－５７６ （２０１４）．
本明細書に記載される実施例および実施形態は例示のみを目的とするものであり、それを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、それらは本出願の趣旨および範囲内ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを理解されたい。
本明細書に引用される刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、それぞれの参考文献が個別にかつ具体的に参照により組み入れられることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書における値の範囲の言及は、本明細書中に別の指示がない限り、範囲に含まれるそれぞれの個別の値を個々に参照する簡略方法として機能することを意図しており、それぞれの個別の値は本明細書に個別に言及されているかのように、本明細書に組み入れられる。
１または複数の要素に関して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語を使用した本発明の任意の態様または実施形態の本明細書の説明は、特に明記しない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、特定の１または複数の要素「からなる」、「本質的に～からなる」、または「実質的に含む」本発明の同様の態様または実施形態のサポートを提供することを意図している（例えば、特定の要素を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として本明細書に記載される組成物はまた、特に明記しない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、その特定の要素を含む（ｃｏｎｔａｉｎ）および／または含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）組成物についても記載していると理解されるべきである）。
本明細書に開示され請求される全ての組成物および方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される、組成物および方法、ならびに方法のステップまたはステップの順序に変更を加えてもよいことが当業者には明らかである。より具体的には、化学的および／または生理学的に関連する特定の薬剤を本明細書に記載される薬剤の代わりに使用しても、同一または同様の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念内にあるとみなされる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
少なくとも第１の腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡ分子の集団を含む治療用がんワクチンを含む組成物であって、該集団が少なくとも第１の正電荷ポリマーまたはタンパク質を含む複数のポリプレックスまたはタンパク質コア粒子の中に含まれ、さらに該複数のポリプレックスまたはタンパク質コア粒子がそれ自体、第１の生体適合性脂質二重層シェルにカプセル化されている、組成物。
(項目２)
前記第１の生体適合性脂質二重層シェルが、１または複数の哺乳動物の抗原提示細胞による前記複数のポリプレックスまたはタンパク質コア粒子のマクロピノサイトーシスを促進する、項目１に記載の組成物。
(項目３)
前記生体適合性脂質二重層の中にカプセル化された、ＣｐＧ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、アラム、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアジュバントをさらに含む、項目１または項目２に記載の組成物。
(項目４)
前記生体適合性脂質二重層の間の空間の中にカプセル化された、ＩＬ－１２ｐ７０タンパク質、ＦＬＴ３リガンド、またはインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ－１）阻害剤等の免疫調節化合物をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目５)
前記インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ－１）阻害剤が、ＧＤＣ－０９１９、ＩＮＣＢ２４３６０、またはそれらの組合せである、項目４に記載の組成物。
(項目６)
前記正電荷ポリマーまたはタンパク質が、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－（Ｂ－アミノエステル）、またはそれらの任意の組合せを含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目７)
前記生体適合性脂質二重層が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、およびそれらの組合せの１または複数を含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目８)
前記生体適合性脂質二重層が、
（ａ）約３０％～約７０％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）、
（ｂ）約７０％～約３０％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、または
（ｃ）約０．５～約５％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）
を含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目９)
前記生体適合性脂質二重層が、
（ａ）約４５％～約５５％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）、
（ｂ）約５５％～約４５％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および（ｃ）約１～約２％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）
を含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１０)
ｍＲＮＡ分子の前記集団が、哺乳動物のがん細胞に特異的な少なくとも１つの抗原をコードする、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１１)
ｍＲＮＡ分子の前記集団が、少なくとも１つのがんもしくは腫瘍特異的タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド、またはその抗原性断片をコードする、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１２)
ｍＲＮＡ分子の前記集団が、ＨＥＲ２ｐ６６、ＨＥＲ２Ｅ７５、ＨＥＲ２ ＹＶＭＡ 、ＴＲＰ２、ｐ６６、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのヒト腫瘍特異的ポリペプチドまたはペプチドをコードする、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１３)
好適な哺乳動物の細胞に導入されたときにＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）の発現を増加させるように、好ましくはＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－β、またはそれらの組合せの発現を増加させるように、適合され構成された、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１４)
哺乳動物の抗原提示細胞、例えば、ヒト樹状細胞、マクロファージ細胞、Ｂ細胞、がん細胞、またはそれらの組合せの集団に導入されたときに、ＩＦＮ－Ｉの発現を増加させる、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１５)
治療剤、例えば、免疫調節剤、抗新生物剤、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、神経活性薬剤、抗炎症剤、抗脂血症剤、ホルモン、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、抗感染症剤、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合性断片、酵素、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、ホルモン、コファクター、ステロイド、アンチセンス分子、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される薬剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１６)
化学療法剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキセート、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イサベピロン、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、窒素マスタード、硫黄マスタード、四硝酸プラチン、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される化合物を含む、項目１３に記載の組成物。
(項目１７)
抗原ポリペプチド、抗原性融合ポリペプチド、抗原性ペプチド、またはその断片をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１８)
メソ多孔質ケイ素粒子、ナノ粒子、ミクロ粒子、またはそれらの任意の組合せの集団の中に含まれた、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目１９)
１または複数の界面活性剤、リポソーム、ニオソーム、エトソーム、トランスフェロソーム、リン脂質、スフィンゴソーム、またはそれらの任意の組合せと混合された、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目２０)
１または複数の薬学的に許容される担体、緩衝剤、希釈剤、ビヒクル、または賦形剤をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目２１)
哺乳動物への全身投与のため、好ましくはヒトへの皮内または静脈内投与のために製剤化された、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目２２)
哺乳動物の抗原提示細胞、例えば、がん細胞、腫瘍細胞、マクロファージ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せの単離された集団の中に含まれた、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目２３)
前記組成物および該組成物の投与を必要とするヒトへの該組成物の投与のための少なくとも第１のセットの指示を含む治療用キットの一部として適合され構成された、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目２４)
哺乳動物のがんの１または複数の症状の予防、治療、または改善における使用のための、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目２５)
ヒトのがんの１または複数の症状の治療または改善における使用のための、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目２６)
ヒトの転移がんの１または複数の症状の治療または改善における使用のための、先行する項目のいずれかに記載の組成物。
(項目２７)
先行する項目のいずれかに記載の組成物を含む、哺乳動物細胞の単離された集団。
(項目２８)
抗原提示細胞、好ましくは、ヒト樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、またはそれらの組合せとして特徴付けられる、項目２７に記載の哺乳動物細胞の単離された集団。
(項目２９)
哺乳動物対象における疾患、障害、または機能不全、例えばがんの少なくとも１つの症状を処置しまたは改善するための医薬の製造における、項目１から２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
(項目３０)
前記哺乳動物対象がヒト、非ヒト霊長類、伴侶動物、外来種、家畜、または原料動物である、項目２９に記載の使用。
(項目３１)
１）項目１から２６のいずれか一項に記載の組成物、および２）哺乳動物における疾患、障害、異常な状態、または機能不全、例えば、がんまたは過剰増殖性障害の１または複数の症状の防止、処置、または改善のためのレジメンの一部としての、該組成物の投与を必要とする該哺乳動物への該組成物の投与のための指示、を含むキット。
(項目３２)
がんの１または複数の症状の処置または改善を必要とする哺乳動物におけるがんの１または複数の症状を処置しまたは改善する方法であって、該哺乳動物における疾患、障害、異常な状態、または機能不全の１または複数の症状を処置しまたは改善するのに十分な時間、有効量の項目１から２６のいずれか一項に記載の組成物を該動物に投与するステップを含む、方法。
(項目３３)
前記疾患が、難治性、転移、再発、または治療抵抗性がんとして診断されまたは同定されている、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記がんが、転移乳がん、転移肺がん、または転移黒色腫である、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記哺乳動物がヒトである、項目３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
(項目３６)
前記哺乳動物に治療有効量の放射線または追加の化学療法剤を投与するステップをさらに含む、項目３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
(項目３７)
前記組成物が、単回投与で、あるいは１日もしくはそれより長い日数からの期間にわたる、１週もしくはそれより長い週数の期間にわたる、または１か月もしくはそれより長い月数の期間にわたる、またはそれより長い期間にわたる一連の複数回投与で、前記哺乳動物に全身投与される、項目３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
前記組成物が、化学療法剤、または第２の異なる治療用がんワクチンをさらに含む、項目３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
(項目３９)
治療用抗がん抗原をコードするｍＲＮＡの投与を必要とする哺乳動物対象の体内のがん細胞の集団に、治療用抗がん抗原をコードするｍＲＮＡを投与する方法であって、有効量の項目１から２６のいずれか一項に記載の組成物を該対象に投与するステップを含む、方法。

Claims (38)

  1. 抗原をコードするｍＲＮＡ分子の集団を含む組成物であって、ｍＲＮＡ分子の該集団が少なくともポリマーまたはタンパク質を含む複数のポリプレックスまたはタンパク質コア粒子の中に含まれ、該複数のポリプレックスまたはタンパク質コア粒子がそれ自体、生体適合性脂質二重層シェルにカプセル化されており、
    該生体適合性脂質二重層シェルが、
    （ａ）約４５％～約５５％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）、
    （ｂ）約５５％～約４５％の１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および
    （ｃ）約１％～約２％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）を含む、組成物。
  2. 前記生体適合性脂質二重層シェルが、１または複数の哺乳動物の抗原提示細胞による前記複数のポリプレックスまたはタンパク質コア粒子のマクロピノサイトーシスを促進する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記生体適合性脂質二重層シェルの中にカプセル化された、ＣｐＧ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、アラム、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアジュバントをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  4. ＩＬ－１２ｐ７０タンパク質、ＦＬＴ３リガンド、およびインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ－１）阻害剤からなる群より選択される免疫調節化合物をさらに含み、該免疫調節化合物は、前記生体適合性脂質二重層シェルの間の空間の中にカプセル化されており、該インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ－１）阻害剤が、ＧＤＣ－０９１９、ＩＮＣＢ２４３６０、またはそれらの組合せである、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
  5. 前記ポリマーまたはタンパク質が、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－（Ｂ－アミノエステル）、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 前記抗原が哺乳動物の細胞に特異的である、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
  7. ｍＲＮＡ分子の前記集団が、少なくとも１つのがんもしくは腫瘍特異的タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド、またはその抗原性断片をコードする、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
  8. ｍＲＮＡ分子の前記集団が、ＨＥＲ２ｐ６６、ＨＥＲ２Ｅ７５、ＨＥＲ２ＹＶＭＡ、ＴＲＰ２、ｐ６６、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのヒト腫瘍特異的ポリペプチドまたはペプチドをコードする、請求項１～７のいずれかに記載の組成物。
  9. 好適な哺乳動物の細胞に導入されたときにＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）の発現を増加させるように、好ましくはＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－β、またはそれらの組合せの発現を増加させるように、適合され構成された、請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
  10. ヒト樹状細胞、マクロファージ細胞、Ｂ細胞、がん細胞、またはそれらの組合せを含む哺乳動物の抗原提示細胞の集団に導入されたときに、ＩＦＮ－Ｉの発現を増加させる、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
  11. 免疫調節剤、抗新生物剤、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、神経活性薬剤、抗炎症剤、抗脂血症剤、ホルモン、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、抗感染症剤、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合性断片、酵素、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボザイム、ホルモン、コファクター、ステロイド、アンチセンス分子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される治療剤をさらに含む、請求項１～１０のいずれかに記載の組成物。
  12. 前記治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、ドセタキセル、パクリタキセル、トラスツズマブ、メトトレキセート、エピルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ビノレルビン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、イサベピロン、エリブリン、ラパチニブ、カルムスチン、窒素マスタード、硫黄マスタード、四硝酸プラチン、ビンブラスチン、エトポシド、カンプトテシン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
  13. 抗原ポリペプチド、抗原性融合ポリペプチド、抗原性ペプチド、またはその断片をさらに含む、請求項１～１２のいずれかに記載の組成物。
  14. メソ多孔質ケイ素粒子、ナノ粒子、ミクロ粒子、またはそれらの任意の組合せの集団の中に含まれた、請求項１～１３のいずれかに記載の組成物。
  15. １または複数の界面活性剤、リポソーム、ニオソーム、エトソーム、トランスフェロソーム、リン脂質、スフィンゴソーム、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項１～１４のいずれかに記載の組成物。
  16. １または複数の薬学的に許容される担体、緩衝剤、希釈剤、ビヒクル、または賦形剤をさらに含む、請求項１～１５のいずれかに記載の組成物。
  17. 哺乳動物への全身投与のため、好ましくはヒトへの皮内または静脈内投与のために製剤化された、請求項１～１６のいずれかに記載の組成物。
  18. がん細胞、腫瘍細胞、マクロファージ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せを含む哺乳動物の抗原提示細胞の単離された集団の中に含まれた、請求項１～１７のいずれかに記載の組成物。
  19. 前記組成物および該組成物の投与を必要とするヒトへの該組成物の投与のための少なくともセットの指示を含む治療用キットの一部として適合され構成された、請求項１～１８のいずれかに記載の組成物。
  20. 哺乳動物のがんの１または複数の症状の予防、治療、または改善における使用のための、請求項１～１９のいずれかに記載の組成物。
  21. ヒトのがんの１または複数の症状の治療または改善における使用のための、請求項１～２０のいずれかに記載の組成物。
  22. ヒトの転移がんの１または複数の症状の治療または改善における使用のための、請求項１～２１のいずれかに記載の組成物。
  23. 前記ポリマーまたはタンパク質は正に荷電している、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 請求項１～２３のいずれかに記載の組成物を含む、哺乳動物細胞の単離された集団。
  25. 前記哺乳動物細胞は、抗原提示細胞、好ましくは、ヒト樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の哺乳動物細胞の単離された集団。
  26. 哺乳動物対象における疾患、障害、または機能不全の少なくとも１つの症状を処置しまたは改善するための医薬の製造における、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  27. 前記哺乳動物対象がヒト、非ヒト霊長類、伴侶動物、外来種、家畜、または原料動物である、請求項２６に記載の使用。
  28. １）請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物、および２）哺乳動物における疾患、障害、異常な状態、または機能不全の１または複数の症状の防止、処置、または改善のためのレジメンの一部としての、該組成物の投与を必要とする該哺乳動物への該組成物の投与のための指示、を含むキット。
  29. 疾患、障害、異常な状態、または機能不全の１または複数の症状の処置または改善を必要とする哺乳動物における疾患、障害、異常な状態、または機能不全の１または複数の症状を処置しまたは改善するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物が、該哺乳動物における疾患、障害、異常な状態、または機能不全の１または複数の症状を処置しまたは改善するのに十分な時間投与されることを特徴とする、組成物。
  30. 前記疾患が、難治性、転移、再発、または治療抵抗性がんとして診断されまたは同定されている、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記がんが、転移乳がん、転移肺がん、または転移黒色腫である、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記組成物が、前記哺乳動物に放射線または追加の化学療法剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記組成物が、単回投与で、あるいは１日もしくはそれより長い日数からの期間にわたる、１週もしくはそれより長い週数の期間にわたる、または１か月もしくはそれより長い月数の期間にわたる、またはそれより長い期間にわたる一連の複数回投与で、前記哺乳動物に全身投与される、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記組成物が、化学療法剤、または治療用がんワクチンをさらに含む、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 抗原をコードするｍＲＮＡの投与を必要とする哺乳動物対象の体内の細胞の集団に、抗原をコードするｍＲＮＡを投与するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 哺乳動物対象における疾患、障害、または機能不全の少なくとも１つの症状を処置しまたは改善するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 前記哺乳動物対象がヒト、非ヒト霊長類、伴侶動物、外来種、家畜、または原料動物である、請求項３７に記載の組成物。
JP2019540384A 2017-01-27 2018-01-26 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム Active JP7181880B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022184788A JP2023015346A (ja) 2017-01-27 2022-11-18 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762451575P 2017-01-27 2017-01-27
US62/451,575 2017-01-27
PCT/US2018/015601 WO2018140826A1 (en) 2017-01-27 2018-01-26 Core/shell structure platform for immunotherapy

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022184788A Division JP2023015346A (ja) 2017-01-27 2022-11-18 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2020505403A JP2020505403A (ja) 2020-02-20
JP2020505403A5 JP2020505403A5 (ja) 2021-03-11
JP7181880B2 true JP7181880B2 (ja) 2022-12-01

Family

ID=61899339

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019540384A Active JP7181880B2 (ja) 2017-01-27 2018-01-26 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム
JP2022184788A Pending JP2023015346A (ja) 2017-01-27 2022-11-18 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022184788A Pending JP2023015346A (ja) 2017-01-27 2022-11-18 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11382964B2 (ja)
EP (3) EP4008344B1 (ja)
JP (2) JP7181880B2 (ja)
KR (2) KR20240014586A (ja)
CN (2) CN115845040A (ja)
AU (1) AU2018212887A1 (ja)
CA (1) CA3051136A1 (ja)
DK (2) DK3573656T3 (ja)
ES (1) ES2905591T3 (ja)
SG (1) SG11201906744VA (ja)
WO (1) WO2018140826A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11433143B2 (en) 2017-05-18 2022-09-06 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
WO2018213631A1 (en) * 2017-05-18 2018-11-22 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
JP2022506839A (ja) * 2018-11-07 2022-01-17 モデルナティエックス インコーポレイテッド Ｒｎａがんワクチン
CN109260157A (zh) * 2018-11-19 2019-01-25 上海交通大学 一种正电荷多肽脂质体纳米制剂及其制备方法与应用
CA3133175A1 (en) * 2019-03-14 2020-09-17 Engene, Inc. Reversible coating of chitosan-nucleic acid nanoparticles and methods of their use
CN114502204A (zh) * 2019-08-14 2022-05-13 库尔维科公司 具有降低的免疫刺激性质的rna组合和组合物
DE102019122014A1 (de) * 2019-08-15 2021-02-18 Technische Universität Darmstadt Reduktion der Knochenresorption, insbesondere bei chronischen Gelenkerkrankungen
WO2021081043A1 (en) * 2019-10-22 2021-04-29 The Johns Hopkins University Mucus penetrating particle compositions and methods of use thereof enhancing immune response
CN112245575A (zh) * 2020-10-26 2021-01-22 上海杏禾医疗科技有限公司 含支化聚合物和mRNA的核壳结构的抗肿瘤疫苗及其用途
WO2023034957A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-09 University Of Connecticut Stabilization of antigens for long term administration in transdermal microneedle patches
CN114699420A (zh) * 2022-03-08 2022-07-05 南方科技大学 一种用于治疗前列腺癌组合物及其制备方法与应用
CN114699538A (zh) * 2022-04-02 2022-07-05 中国药科大学 一种核-壳式高效基因药物递送系统及其制备方法
CN117442552B (zh) * 2023-11-20 2024-03-26 山东大学 一种淋巴结内t细胞区靶向纳米粒及其水凝胶

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
WO2010037408A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
MX2014004415A (es) * 2011-10-14 2015-06-05 Stc Unm Bicapas lipidicas soportadas por nanoparticulas porosas (protecelulas) para suministro dirigido, incluido el suministro transdermico de carga, y los metodos relacionados.
CN103181896B (zh) * 2011-12-30 2015-10-14 沈阳药科大学 一种含有小檗胺类药物的脂质体制剂及其制备方法
BR112015022868B1 (pt) * 2013-03-14 2023-05-16 Ethris Gmbh Composições de mrna de cftr e usos e métodos relacionados
CN103550783A (zh) * 2013-04-27 2014-02-05 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种核酸类药物靶向递送系统及其制备方法
US20160151284A1 (en) * 2013-07-23 2016-06-02 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
US20150110857A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
CN107683142A (zh) * 2015-04-02 2018-02-09 卫理公会医院 基于多孔硅微粒的癌症疫苗和增强抗肿瘤免疫性的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomaterials，2022年02月，Vol. 125，pp. 81-89

Also Published As

Publication number Publication date
CN109152830A (zh) 2019-01-04
EP3573656A1 (en) 2019-12-04
WO2018140826A9 (en) 2018-10-11
EP4008344B1 (en) 2023-12-06
EP3573656B1 (en) 2021-12-22
ES2905591T3 (es) 2022-04-11
EP4309739A3 (en) 2024-04-17
JP2020505403A (ja) 2020-02-20
CA3051136A1 (en) 2018-08-02
EP4309739A2 (en) 2024-01-24
JP2023015346A (ja) 2023-01-31
KR20190108150A (ko) 2019-09-23
WO2018140826A1 (en) 2018-08-02
EP4008344A1 (en) 2022-06-08
US11382964B2 (en) 2022-07-12
KR20240014586A (ko) 2024-02-01
CN115845040A (zh) 2023-03-28
US20220305103A1 (en) 2022-09-29
KR102627347B1 (ko) 2024-01-22
DK3573656T3 (da) 2022-03-14
DK4008344T3 (da) 2024-01-29
CN109152830B (zh) 2023-11-03
AU2018212887A1 (en) 2019-08-08
US20180360756A1 (en) 2018-12-20
SG11201906744VA (en) 2019-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7181880B2 (ja) 免疫療法のためのコア／シェル構造プラットホーム
Zhang et al. DP7-C-modified liposomes enhance immune responses and the antitumor effect of a neoantigen-based mRNA vaccine
JP6862369B2 (ja) 細胞透過性ペプチド、カーゴ、及びｔｌｒペプチドアゴニストを含む新規複合体
US9770467B2 (en) Compositions and methods for cancer immunotherapy
Nguyen et al. Enhanced cancer DNA vaccine via direct transfection to host dendritic cells recruited in injectable scaffolds
WO2019001339A1 (zh) 一种新型的肿瘤疫苗及其用途
Yang et al. Synthetic multiepitope neoantigen DNA vaccine for personalized cancer immunotherapy
US20200384104A1 (en) Structure-Function Relationships in the Development of Immunotherapeutic Agents
WO2020146906A2 (en) Self-assembled peptide nanoparticle and use thereof
CN117797250A (zh) 个体化mRNA组合物、载体、mRNA疫苗及其应用
US20240165263A1 (en) Targeting multiple t cell types using spherical nucleic acid vaccine architecture
US20180117176A1 (en) Porous silicon microparticle-based cancer vaccines and methods for potentiating anti-tumor immunity
Mohseninia et al. Harnessing self-assembling peptide nanofibers to prime robust tumor-specific CD8 T cell responses in mice
Cui et al. Uplifting Anti‐tumor Immunotherapy with Lymph Node‐targeted and Ratio‐controlled Co‐delivery of Tumor Cell Lysate and Adjuvant

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191001

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210126

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210126

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220309

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220607

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20221021

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20221118

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7181880

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02