CN114502204A - 具有降低的免疫刺激性质的rna组合和组合物 - Google Patents

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J·卢兹
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Abstract

本发明涉及组合等，该组合包括(i)包含至少一种治疗性RNA的第一组分和(ii)包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的第二组分。进一步提供了包括至少一种治疗性RNA和至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的组合物。两种组分的组合能够减少第一组分的免疫刺激性质以及促进施用后的表达。另外，提供了第一和第二医疗用途以及治疗或预防疾病、紊乱或病症的方法。

Description

具有降低的免疫刺激性质的RNA组合和组合物
介绍
本发明涉及组合等等，该组合包含(i)包含至少一种治疗性RNA的第一组分和(ii)包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的第二组分。还提供了包含至少一种治疗性RNA和至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的组合物。此外，提供了第一和第二医学用途，以及治疗或预防疾病、紊乱或病症的方法。
基于RNA的治疗剂可用于如被动和主动免疫疗法、蛋白质替代疗法或基因工程。因此，治疗性RNA有潜力为多种疾病、紊乱或病症的疗法提供高度特异性和个体化的治疗选择。
除了用作疫苗外，RNA分子还可以用作替代疗法的治疗剂，诸如，如，蛋白质替代疗法，用于取代患者体内缺失或突变的蛋白质，诸如生长因子或酶。然而，与疫苗相比，安全且有效的基于RNA的替代疗法的成功开发基于不同的先决条件。在将编码RNA应用于蛋白质替代疗法时，治疗性编码RNA应在表达水平和持续时间方面赋予目标蛋白质足够的表达，并对先天免疫系统赋予最小刺激，以避免待治疗患者的炎症，以及避免针对施用的RNA分子和编码的蛋白质的特异性免疫应答。
尽管治疗性RNA的固有免疫刺激性质可能被认为是疫苗的理想特征，但这种作用可能会引起替代疗法中出现不期望的并发症。这对于需要在延长的时间段内重复施用RNA治疗剂的慢性疾病的治疗尤其如此。治疗性RNA引发先天免疫应答的潜在能力可能代表其在体内应用的局限性。
先天和/或适应性免疫系统的免疫应答的诱导和/或增强在许多疾病中起重要作用。已经鉴定出一些先天免疫受体，它们专门用于检测外来或与损伤相关的核酸。这些核酸感知免疫受体组之一是Toll样受体(TLR)，它们是模式识别受体(PRR)，优先位于不同免疫细胞亚群和某些体细胞的内溶酶体区室中。后一种受体用于识别病原体相关分子模式(PAMP)和危险相关分子模式(DAMP)。PPR作为对致病实体的主要防御，并通过激活促炎细胞因子、趋化因子和干扰素以及B细胞和T细胞的产生来控制适应性免疫的激活和进展。在PPR中，Toll样受体(TLR)受到特别关注。它们在30多年前的发现提高了在调节先天免疫、炎症和细胞因子诱导方面的知识，核酸感知受体的刺激通常导致细胞因子和趋化因子(I型干扰素)的诱导以警告相邻细胞，以及如招募免疫细胞。例如，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是细胞内TLR，它们识别通过内吞作用被细胞吸收并转移到内体的核酸(如，RNA)。其他核酸感知免疫受体包括解旋酶的RIG-I家族(如，RIG-I、MDA5、LGP2)、NOD样受体、PKR、OAS、SAMHD1、ADAR1、IFIT1和/或IFIT5。
因此，主要由RNA感知模式识别受体如Toll样受体7和8介导的先天免疫应答的诱导可能损害基于RNA的治疗剂的有效性，并因此可能导致治疗效果降低。即使某些细胞因子谱的诱导对于预防性疫苗可能是有利的，但必须避免特征在于发烧和生病的RNA疫苗的反应原性。因此，在诱导先天免疫应答以支持适应性免疫应答和避免发烧和生病之间找到平衡是该领域的挑战。
在本领域中，该问题已通过使用修饰的RNA核苷酸得到部分解决。通过引入修饰的核苷酸，治疗性RNA可以在体内显示出降低的先天免疫刺激。然而，包含修饰的核苷酸的治疗性RNA通常在体内显示出降低的表达或降低的活性，因为修饰还可以阻止有益RNA结合蛋白的招募，从而阻碍治疗性RNA的活性，如蛋白质翻译。
现有技术描述了使用具有修饰的CpG基序的免疫调节寡核苷酸(IRO)作为TLR的拮抗剂来抑制和/或压制基因疗法中使用的由内源性和/或外源性核酸如修饰的信使RNA(mmRNA)治疗剂或DNA诱导的TLR介导的免疫应答(WO2017136399)。含有未甲基化脱氧胞苷-脱氧鸟苷(CpG)二核苷酸的小型合成寡脱氧核苷酸(ODN)能够通过TLR9识别来模拟细菌DNA的免疫刺激活性(Pohar et al,Selectivity of Human TLR9 for Double CpG Motifsand Implications for the Recognition of Genomic DNA,J Immunol March 1,2017,198(5)2093-2104和El-Zayat et al Toll-like receptors activation,signaling,andtargeting:an overview,Bulletin of the National Research Centre(2019)43:187)。
综上所述，降低治疗性RNA的免疫刺激性质并同时保持功效(如这种RNA在细胞中的可翻译性和/或诱导适应性免疫应答)是有问题的。然而，在大多数治疗环境中，这两个特征(降低的或低的免疫刺激性质、体内高翻译率)对于RNA药物来说都是至关重要的。
上面概述的目的通过本发明的要求保护的主题来解决。
定义
为了清楚和可读性，提供以下定义。对于这些定义提及的任何技术特征都可以基于本发明的每个和每一个实施方式理解。
数字上下文中的百分比应理解为相对于相应项目的总数。在其他情况下，且根据上下文，百分比应理解为重量百分比(wt.-％)。
约：当参数或值不一定需要相等，即100％相同时，使用术语“约”。因此，“约”是指参数或值可以偏差0.1％至20％，优选地0.1％至10％；特别是0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。本领域技术人员将知道，例如根据如何确定参数的方法，某些参数或值可能略有改变。例如，如果某个参数或值在本文中被限定为具有例如“约1000个核苷酸”的长度，该长度可以偏差0.1％至20％，优选地0.1％至10％；特别是0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。因此，本领域技术人员将知道，在该具体实例中，该长度可以偏差1到200个核苷酸，优选地1到100个核苷酸；特别是5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个核苷酸。
适应性免疫应答：如本文所使用的术语“适应性免疫应答”将被本领域普通技术人员认识和理解，例如意指免疫系统(适应性免疫系统)的抗原特异性应答。抗原特异性允许产生针对特定病原体或病原体感染细胞的应答。产生这些针对应答的能力通常由“记忆细胞”(B细胞)在体内维持。在本发明的上下文中，抗原可以由本发明的组合/组合物的至少一种治疗性RNA提供。
抗体、抗体片段：如本文所使用，术语“抗体”包括完整抗体和抗体片段。通常，完整“抗体”是特异性结合特定抗原的免疫球蛋白。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别：IgG、IgM、IgE、IgA和IgD。通常，完整抗体是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有“轻”链和“重”链。“抗体片段”包括完整抗体的一部分，诸如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；族(tribe)；Tetra；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，抗体片段包含分离的片段、由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽接头(“ScFv蛋白”)连接在一起的重组单链多肽分子和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、片段Fd'、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)。可由本发明的治疗性RNA编码的合适抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体混合物或混杂物、人或人源化抗体、嵌合抗体、Fab片段或双特异性抗体。在本发明的上下文中，抗体可以由本发明的组合/组合物的至少一种治疗性RNA提供。
激动剂：术语“激动剂”用于与细胞受体结合并诱导应答的物质。激动剂通常模拟天然存在的物质诸如配体的作用。
拮抗剂：“术语拮抗剂”通常是指减弱激动剂作用的物质。
抗原：如本文所使用的术语“抗原”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指可以被免疫系统，优选被适应性免疫系统识别并能够例如通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分触发抗原特异性免疫应答的物质。通常，抗原可以是或可以包含可由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白质。还有衍生自如包含至少一个表位的癌抗原的肽或蛋白质的片段、变体和衍生物可以理解为抗原。在本发明的上下文中，抗原可以是所提供的治疗性RNA(如编码RNA、复制子RNA、mRNA)的翻译产物。术语“抗原性肽或蛋白质”将被本领域普通技术人员认识和理解，例如意指衍生自(抗原性)蛋白质的肽或蛋白质，其可刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。因此，“抗原性肽或蛋白质”包含其衍生的蛋白质的至少一个表位或抗原(如，肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原)。在本发明的上下文中，抗原可以由本发明的组合/组合物的至少一种治疗性RNA提供。
载体：术语“载体”包括任何赋形剂、稀释剂、填料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂质的囊泡、微球、脂质体包囊或本领域熟知的用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性将取决于特定应用的施用途径。如，在Remington'sPharmaceutical Sciences,18th Edition,ed.A.Gennaro,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990中描述了含有这些材料的药学上可接受的制剂的制备。
阳离子的、可阳离子化的：除非从特定上下文中明确不同的含义，否则术语“阳离子的”是指相应的结构带有正电荷，无论是永久的还是非永久的，但响应于某些条件，诸如，如，pH。因此，术语“阳离子的”涵盖“永久阳离子的”和“可阳离子化的”。如本文所使用，术语“可阳离子化的”是指化合物或基团或原子在其环境的较低pH下带正电荷而在其环境的较高pH下不带电荷。同样在无法确定pH值的非水性环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在氢离子浓度高时带正电荷，而在氢离子浓度或活性低时不带电荷。它取决于在其带电荷或不带电荷的pH或氢离子浓度下，可阳离子化或可聚阳离子化的化合物的个体性质，特别是各个可阳离子化的基团或原子的pKa。在稀释的水性环境中，可以使用本领域技术人员熟知的所谓的Henderson-Hasselbalch方程来估计带有正电荷的可阳离子化的化合物、基团或原子的分数。如，如果化合物或部分是可阳离子化的，则优选其在约1至9、优选4至9、5至8或甚至6至8的pH值下带正电荷，更优选pH值为或低于9、为或低于8、为或低于7，最优选在生理pH值下，例如约7.3至7.4，即在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下。在实施方式中，优选可阳离子化的化合物或部分在生理pH值下主要是中性的，如，约7.0-7.4，但在较低的pH值时带正电荷。在一些实施方式中，可阳离子化的化合物或部分的pKa的优选范围为约5至约7。
衍生自：在整个说明书中在核酸的上下文中使用的术语“衍生自”，即核酸“衍生自”(另一种)核酸，是指衍生自(另一种)核酸的核酸与其衍生自的核酸共享如至少约70％、80、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的序列同一性。本领域技术人员知道，序列同一性通常是针对相同类型的核酸计算的，即针对DNA序列或针对RNA序列。因此，可以理解，如果DNA“衍生自”RNA或如果RNA“衍生自”DNA，则在第一步中将RNA序列转化为相应的DNA序列(特别是通过在整个序列中将U替换为T)或反之亦然，将DNA序列转化为相应的RNA序列(特别是通过在整个序列中将T替换为U)。此后，确定DNA序列的序列同一性或RNA序列的序列同一性。优选地，“衍生自”核酸的核酸还指与其衍生的核酸相比被修饰的核酸，如为了进一步增加RNA稳定性和/或延长和/或增加蛋白质产量。在氨基酸序列的上下文中，术语“衍生自”是指衍生自(另一个)氨基酸序列的氨基酸序列与其衍生自的氨基酸序列共享如至少约70％、80、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的序列同一性。
CRISPR-相关蛋白：术语“CRISPR-相关蛋白”或“CRISPR-相关内切核酸酶”将被本领域普通技术人员认识和理解。术语“CRISPR-相关蛋白”是指RNA-引导的内切核酸酶，它们是CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)系统(及其同源物、变体、片段或衍生物)的一部分，其被原核生物用于赋予针对外来DNA元件的适应性免疫性。CRISPR-相关蛋白包括但不限于Cas9、Cpf1(Cas12)、C2c1、C2c3、C2c2、Cas13、CasX和CasY。如本文所使用，术语“CRISPR-相关蛋白”包括野生型蛋白及其同源物、变体、片段和衍生物。因此，当提及编码Cas9、Cpf1(Cas12)、C2c1、C2c3和C2c2、Cas13、CasX和CasY的人工核酸分子时，所述人工核酸分子可以编码各自的野生型蛋白，或其同源物、变体、片段及衍生物。除了Cas9和Cas12(Cpf1)，还有其他几种适用于本发明范围内的基因工程的CRISPR-相关蛋白，包括Cas13、CasX和CasY。在本发明的上下文中，CRISPR-相关蛋白可以由本发明的组合或组合物的至少一种治疗性RNA提供。
片段：在整个本说明书中在核酸序列或氨基酸(aa)序列的上下文中使用的术语“片段”通常可以是例如核酸序列或氨基酸序列的全长序列的较短部分。片段通常由与全长序列中的相应一段片段(stretch)相同的序列组成。在整个本说明书中在蛋白质或肽的上下文中使用的术语“片段”通常可以包含如本文所限定的蛋白质或肽的序列，关于其氨基酸序列(或其编码的核酸分子)，其是与原始(天然)蛋白质(或其编码的核酸分子)的氨基酸序列相比被N端和/或C端截短的。因此，这种截短可以在aa水平上或相应地在核酸水平上发生。因此，与本文限定的此类片段相关的序列同一性可优选指本文限定的完整蛋白质或肽或此类蛋白质或肽的完整(编码)核酸分子。抗原性蛋白质或肽的片段可以包含这些蛋白质或肽的至少一个表位。此外，蛋白质的结构域，如细胞外结构域、细胞内结构域或跨膜结构域以及蛋白质的缩短或截短形式也可以理解为包含蛋白质片段。
异源的：在整个本说明书中在核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“异源的”或“异源序列”是指本领域普通技术人员将识别和理解的序列(如DNA、RNA、氨基酸)，并且旨在指衍生自另一个基因、另一个等位基因、另一个物种的序列。如果两个序列不是衍生自相同基因或相同等位基因，则它们通常被理解为“异源的”。即，尽管异源序列可能衍生自相同的生物体，但它们自然地(在自然界中)不会出现在相同的核酸分子中，例如在相同的RNA或蛋白质中。
(序列的)同一性：在整个本说明书中在核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“同一性”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指两个序列同一的百分比。为了确定两个序列同一的百分比，如，本文限定的核酸序列或氨基酸(aa)序列，优选由本文限定的核酸序列编码的aa序列或自身aa序列，可以比对序列以便随后相互比较。因此，例如可以将第一序列的位置与第二序列的对应位置进行比较。如果第一个序列中的位置被与第二个序列中的位置的相同的残基占据，则两个序列在该位置上是同一的。如果不是这种情况，则该位置的序列不同。如果与第一个序列相比，在第二个序列中发生了插入，则可以在第一个序列中插入空位以允许进一步比对。如果与第一个序列相比，在第二个序列中出现缺失，则可以在第二个序列中插入空位以允许进一步比对。然后，两个序列同一的百分比是相同位置的数量除以包括在一个序列中仅被占据的那些位置在内的位置的总数的函数。可以使用算法确定两个序列同一的百分比，如集成在BLAST程序中的算法。
免疫应答：术语“免疫应答”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指适应性免疫系统对特定抗原的特异性应答(所谓的特异性或适应性免疫应答)或先天免疫系统的非特异性反应(所谓的非特异性或先天免疫应答)，或它们的组合。
免疫系统：术语“免疫系统”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指可以保护生物体免受感染的生物体系统。如果病原体成功通过生物体的物理屏障并进入该生物体，则先天免疫系统会提供即时但非特异性的应答。如果病原体逃避这种先天反应，脊椎动物就会拥有第二层保护，即适应性免疫系统。在这里，免疫系统在感染期间调整其应答以提高其对病原体的识别。这种提高的应答在病原体被消除后以免疫记忆的形式保留下来，并允许适应性免疫系统在每次遇到这种病原体时发起更快和更强的攻击。据此，免疫系统包括先天免疫系统和适应性免疫系统。这两个部分中的每一个通常都包含所谓的体液和细胞组分。
治疗：术语“治疗”通常是指旨在获得有益或预期结果的方法，其可能包括症状的缓解，或延迟或改善疾病进展。
信使RNA(mRNA)：术语“信使RNA”(mRNA)是指一种类型的RNA分子。在体内，DNA的转录通常会产生所谓的早熟RNA，它必须被加工成所谓的信使RNA，通常缩写为mRNA。通常，mRNA包含5'-帽、5'-UTR、开放阅读框/编码序列、3'-UTR和聚(A)。
核苷：术语“核苷”通常指由糖(通常为核糖或脱氧核糖)和嘌呤或嘧啶碱基组成的化合物。
核苷酸：术语“核苷酸”通常是指包含连接到糖上的磷酸基团的核苷。
核酸序列、RNA序列：术语“核酸序列”或“RNA序列”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指分别指其核苷酸或氨基酸的连续的特定和单独顺序。
(序列的)变体：在整个本说明书中在核酸序列的上下文中使用的术语“变体”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指衍生自另一核酸序列的核酸序列变体。如，与衍生变体的核酸序列相比，核酸序列的变体可以表现出一个或多个核苷酸缺失、插入、添加和/或取代。核酸序列的变体可以与衍生该变体的核酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的同一性。变体优选是功能变体，因为变体保留了其衍生序列的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多的功能。核酸序列的“变体”可以在该核酸序列的至少10、20、30、50、75或100个核苷酸的一段片段内具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的核苷酸同一性。
在整个本说明书中在蛋白质或肽的上下文中使用的术语“变体”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指蛋白质或肽变体，其氨基酸序列与原始序列的一个或多个突变不同，例如一个或多个取代、插入和/或缺失的氨基酸。优选地，这些片段和/或变体与全长天然蛋白质相比具有相同的生物学功能或特异性活性，如其特异性抗原性性质。如本文所限定的蛋白质或肽的“变体”可以包含与其天然(即未突变的生理学)序列相比的保守氨基酸取代。蛋白质或肽的“变体”可以在该蛋白质或肽的至少10、20、30、50、75或100个核苷酸的一段片段内具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性。优选地，蛋白质的变体包含蛋白质的功能变体，这意味着变体发挥与衍生其的蛋白质相同的作用或功能或作用或功能的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
发明内容
本发明基于以下发现：与单独施用相应的治疗性RNA相比，共同施用包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的组分导致例如由治疗性RNA诱导的(先天)免疫刺激减少。令人惊讶的是，包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的组分的共同施用优选增加和/或延长由治疗性RNA编码的肽或蛋白质的表达。
如实施例部分所述，发明人发现添加化学修饰的寡核苷酸对共同施用的免疫刺激性RNA序列(“RNAdjuvant”)具有免疫抑制作用(参见如图1A)。此外，发明人表明，化学修饰的寡核苷酸有效地拮抗RNA的免疫刺激(参见如实施例2(体外)或实施例3(体内))，这种免疫刺激是一种通常由RNA感知受体触发的不期望的副作用。本文使用的寡核苷酸已被描述为拮抗Toll样受体(TLR)7和8，它们是参与先天免疫反应的RNA感知模式识别受体(参见Schmitt et al.2017.RNA 23:1344-135)。本发明基于显示包含至少一种RNA感知受体的至少一种拮抗剂和至少一种治疗性RNA的组合或组合物可以降低所述至少一种治疗性RNA的免疫刺激性质的发现。出乎意料的是，拮抗性寡核苷酸的添加也增加和/或延长了共同施用的治疗性RNA的编码蛋白的表达，这表明包含至少一种RNA感知模式识别受体(如TLR7拮抗剂)和治疗性RNA(如mRNA)的组合或组合物导致免疫刺激减少和蛋白质表达增加和/或延长——这些特征对于大多数基于RNA的药物至关重要。
在第一方面，本发明涉及一种组合，其包括(i)包含至少一种治疗性RNA的至少一种第一组分和(ii)包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的至少一种第二组分。
在第二方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含一种组合和任选地至少一种药学上可接受的载体或由它们组成，所述组合包含(i)至少一种治疗性RNA，优选如第一方面所述；(ii)至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂，优选如第一方面所述。
在第三方面，本发明涉及试剂盒或部分的试剂盒(kit of parts)，其包含第一方面的组合的第一和第二组分，和/或包含第二方面的组合物。
在第四方面，本发明涉及用作药物的第一方面的组合、第二方面的组合物或第三方面的试剂盒或部分的试剂盒。
在进一步方面，本发明涉及在慢性医学治疗中用作药物或用作疫苗的第一方面的组合、第二方面的组合物或第三方面的试剂盒或部分的试剂盒。其他方面涉及治疗或预防疾病、紊乱或病症的方法、减少治疗性RNA的(先天)免疫刺激的方法、降低治疗性RNA组合物的反应原性的方法以及增加和/或延长由(编码)治疗性RNA编码的肽或蛋白质的表达的方法。
具体实施方式
本申请与电子格式的序列表一起提交，该序列表是本申请说明书的一部分(WIPO标准ST.25)。与本申请一起提交的序列表的电子格式中包含的信息通过引用整体并入本文。对于许多序列，序列表还提供了额外的详细信息，如关于某些结构特征、序列修饰、GenBank标识符或额外的详细信息。特别是，此类信息在WIPO标准ST.25序列表中的数字标识符<223>下提供。因此，在所述数字标识符<223>下提供的信息全部明确地包括在本文中，并且必须被理解为潜在发明的描述的组成部分。
组合
在第一方面，本发明涉及包括包含治疗性RNA的第一组分和包含RNA感知模式识别受体的拮抗剂的第二组分的组合，等等。
在本发明的上下文中，术语“组合”优选意指至少一种治疗性RNA(本文称为“第一组分”)和至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂(本文称为“第二组分”)的组合出现。因此，所述组合可以作为一种组合物出现，在一个和相同的组合物或混合物中包含所有这些组分(但作为单独的实体)，或者可以作为部分的试剂盒出现，在其中不同的组分形成这种部分的试剂盒的不同部分(如第三个方面所限定)。因此，组合的第一和第二组分的施用可以同时或时间上交错发生，或者在相同的施用部位或在不同的施用部位，如下文进一步概述。组分可以一起配制为共同制剂(如在第二方面的上下文中进一步描述的)，或可以配制为不同的单独制剂(并且任选地在配制后组合)，如下文所述。
在第一方面，组合包括：
(i)包含至少一种治疗性RNA的至少一种第一组分；
(ii)包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的至少一种第二组分。
在下文中，描述了第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的有利实施方式和特征。值得注意的是，在本发明的组合(第一方面)的上下文中描述的所述至少一种拮抗剂的所有描述的实施方式和特征同样适用于药物组合物(第二方面)、或者试剂盒或部分的试剂盒(第三方面)、或本文描述的任何其他方面(例如医疗用途、治疗方法)的至少一种拮抗剂。
本说明书通篇使用的术语“模式识别受体”(PRR)将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指为先天免疫系统的一部分的受体。种系编码的PRR负责通过识别称为病原体相关分子模式(PAMP)的保守结构来感知微生物特异性分子(如细菌或病毒DNA或RNA)的存在。最近的证据表明，PRR还负责识别从受损细胞释放的内源性分子，称为损伤相关分子模式(DAMP)。目前，已经确定了四种不同类别的PRR家族。这些家族包括跨膜蛋白，如Toll样受体(TLR)和C型凝集素受体(CLR)，以及细胞质蛋白，如维甲酸诱导基因(RIG)-I样受体(RLR)和NOD样受体(NLR)。根据它们的定位，PRR可分为膜结合型PRR和细胞质型PRR，它们不仅在巨噬细胞和DC中表达，而且在各种非专业免疫细胞中也有表达。(Takeuchi和Akira2010.Pattern Recognition Receptors and Inflammation,Cell,Volume 140,ISSUE 6,P805-820)。
本发明上下文中的典型“模式识别受体”(PRR)是Toll样受体、NOD样受体、RIG-I样受体、PKR、OAS1、IFIT1和IFIT5。
本说明书通篇使用的术语“先天免疫系统”，也称为非特异性(或无特异性)免疫系统，将被本领域普通技术人员认识和理解，例如，意指通常包含以非特异性方式保护宿主免受其他生物体感染的细胞和机制的系统。这意味着先天系统的细胞可能以一种通用的方式识别病原体并对其进行应答，但与适应性免疫系统不同的是，它不会赋予宿主持久的或保护性的免疫力。先天免疫系统可以例如由“模式识别受体”(PRR)的配体(例如PAMP)或其他辅助物质激活，诸如脂多糖、TNF-α、CD40配体、或细胞因子、单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β、TNF-α、生长因子、以及hGH、人Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的配体、鼠Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的配体、NOD样受体的配、RIG-I样受体的配体、免疫刺激核酸、免疫刺激RNA(isRNA)、CpG-DNA、抗细菌剂、抗病毒剂、PKR的配体和OAS1(如，长双链RNA)或IFIT1和IFIT5的配体(5'ppp RNA)。
通常，先天免疫系统的应答(例如在感知RNA之后)包括通过产生化学因子(包括称为细胞因子的特殊化学介质)将免疫细胞招募到感染部位；补体级联的激活；通过专门的白细胞识别和去除器官、组织、血液和淋巴液中存在的异物；激活适应性免疫系统；和/或作为传染原的物理和化学屏障。通常，在先天免疫应答期间蛋白质合成也会减少。炎症应答由促炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-1和IL-6协调。这些细胞因子是多效性蛋白质，可调节炎症组织的细胞死亡，改变血管内皮通透性，将血细胞招募到炎症组织，并诱导急性期蛋白质的产生。
PRR可以被多种病原体相关分子模式(PAMP)激活，例如源自病毒、细菌、真菌、原生动物、范围包括脂蛋白、碳水化合物、脂多糖和各种类型的核酸(DNA、RNA、dsRNA、未加帽的RNA或5'ppp RNA)的PAMP。PPR可能存在于细胞的不同区室中(如，位于内体的膜中或位于细胞质中)。在感知PAMP时，PRR触发信号传导级联，尤其是导致例如细胞因子、趋化因子的表达。例如，toll样受体3(TLR-3)通常检测长双链RNA(>40bp)，并且也在某些细胞类型的表面上表达。TLR7在人体免疫系统中的表达通常局限于B细胞和PDC，TLR8优先在髓系免疫细胞中表达。因此，TLR7配体驱动B细胞激活以及浆细胞样树突状细胞(PDC)中大量IFN-α的产生，而TLR8则诱导髓样免疫细胞中大量IL-12p70的分泌。本领域已经证明，TLR8选择性地检测ssRNA，而TLR7主要检测短链dsRNA，但也可以容纳某些ssRNA寡核苷酸。TLR9受体主要在人B细胞和浆细胞样树突状细胞中表达，并检测含有未甲基化CpG二核苷酸的单链DNA。除了诱导细胞因子外，先天免疫系统的一些RNA感知模式识别受体可以在与其激动剂(例如dsRNA、5'ppp RNA)结合后抑制蛋白质翻译，例如PKR和OAS1。例如，长双链RNA的结合被教导激活PKR以磷酸化eIF2a，从而抑制mRNA分子的翻译。IFIT1和IFIT5被教导与5'ppp RNA结合导致eIF2a的阻断，从而抑制mRNA分子的翻译(在Hartmann,G."Nucleic acid immunity."Advances in immunology.Vol.133.Academic Press,2017.121-169中进行综述)。
因此，在本发明的上下文中，如本文所使用的术语“RNA感知模式识别受体”是指能够感知RNA的一类PRR。在这种情况下，“感知”必须被理解为受体与RNA结合的能力，并因此触发下游信号传导级联(如细胞因子的诱导或如翻译的抑制)。
因此，术语“至少一种RNA感知模式识别受体的拮抗剂”涉及能够抑制和/或压制由本发明的治疗性RNA诱导的PRR介导的免疫应答的化合物。此外，这种拮抗剂可以减弱激动剂(如，免疫刺激性RNA种类)的作用(如，PRR介导的免疫应答)。
因此，至少一种RNA感知模式识别受体优选在与RNA激动剂结合时诱导细胞因子。这种RNA激动剂可以是单链RNA、双链RNA或5'三磷酸化RNA(5'ppp RNA)。
可选地或另外，至少一种RNA感知模式识别受体可在结合RNA激动剂时抑制翻译。这种RNA激动剂可以是单链、双链或5'三磷酸化RNA(5'ppp RNA)。
有利地，第二组分的至少一种拮抗剂在与RNA激动剂结合时减少至少一种RNA感知模式识别受体的细胞因子诱导和/或在结合RNA激动剂时减少至少一种RNA感知模式识别受体的翻译抑制。
因此，在优选的实施方式中，与施用第一组分的至少一种治疗性RNA而没有与第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的组合相比，施用第一组分的至少一种治疗性RNA与第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的组合导致先天免疫应答降低。
因此，与仅施用相应的第一组分相比，向细胞、组织或生物体施用该组合(即，施用第一组分和第二组分)导致(先天)免疫刺激降低。
在进一步的实施方式中，与施用包含修饰的核苷酸(如，本文所限定)并具有相同的RNA序列的对照RNA相比，向细胞、组织或生物体施用该组合(即，施用第一组分和第二组分)导致至少相当的(先天)免疫刺激。
如上所述的先天免疫应答的诱导或激活或刺激通常通过测量细胞因子的诱导来确定。
优选地，降低的先天免疫刺激特征在于优选地选自以下的至少一种细胞因子的降低的水平：Rantes、MIP-1α、MIP-1β、McP1、TNFα、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL-12、IL-6、或IL-8。
术语“至少一种细胞因子的降低的水平”必须理解为与对照(例如仅第一组分)相比，根据本发明的组合的施用将细胞因子的诱导降低到某一百分比。
因此，在本发明的上下文中降低的先天免疫刺激特征在于优选地选自以下的至少一种细胞因子的降低的水平：Rantes、MIP-1α、MIP-1β、McP1、TNFα、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL-12、IL-6、或IL-8，其中至少一种细胞因子的降低的水平是至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的降低。优选地，至少一种细胞因子的降低的水平是至少30％的降低。
评估特定细胞/器官/组织中通过治疗性RNA的(先天)免疫刺激(即，如Rantes、MIP-1α、MIP-1β、McP1、TNFα、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL-12、IL-6、或IL-8的诱导)的方法对于本领域技术人员是熟知的。通常，将与第二组分组合的治疗性RNA的(先天)免疫刺激与单独治疗性RNA(或与包含修饰的核苷酸的对照RNA)(即没有第二组分的(额外的)施用)的(先天)免疫刺激进行比较。必须使用相同的条件(如，相同的细胞系、相同的生物体、相同的施加途径、相同的检测方法、相同数量的治疗性RNA、相同的RNA序列等)(如果可行)以进行有效比较。本领域技术人员理解如何对本发明的组合和各自的对照RNA(单独的治疗性RNA或包含修饰的核苷酸并具有相同RNA序列的对照RNA)进行比较。
在本发明的上下文中，细胞因子的诱导通过将组合施用至细胞、组织或生物体，优选hPBMC、Hela细胞或HEK细胞中来测量。在该上下文中，优选的是hPBMC。在向hPBMC、Hela细胞或HEK细胞施用组合(或相应的对照)后，进行用于测量细胞因子水平的测定。分泌到培养基或上清液中的细胞因子可以通过诸如基于珠的细胞因子测定(例如细胞计数珠阵列(CBA))、ELISA和蛋白质印迹等技术进行量化。
优选地，进行基于珠的细胞因子测定，最优选细胞计数珠阵列(CBA)以测量在施用组合(及其相应的对照)后细胞中细胞因子的诱导。
CBA可以量化来自同一样本的多种细胞因子。CBA系统使用流式细胞仪和抗体包被的珠子提供的广泛荧光检测来捕获细胞因子。阵列中的每个珠子都具有独特的荧光强度，因此可以同时混合和采集珠子。在该上下文中，在来自Reynolds等人的2012的BDBioscience应用说明“Quantification of Cytokines Using BDTM Cytometric BeadArray on the BDTM FACSVerse System and Analysis in FCAP ArrayTM Software”中描述了适合的CBA测定。在本发明的实施例部分中描述了用于确定细胞因子水平的示例性CBA测定。
在各种实施方式中，至少一种RNA感知模式识别受体是内体受体或细胞质受体。在优选的实施方式中，至少一种RNA感知模式识别受体是内体受体。示例性内体RNA感知模式识别受体的非限制性列表包括TLR3、TLR7或TLR8。在这种情况下，“内体”必须被理解为定位于内体或定位于内体膜。示例性细胞质RNA感知模式识别受体的非限制性列表包括RIG1、MDA5、NLRP3或NOD2。
在各种实施方式中，至少一种RNA感知模式识别受体是单链RNA(ssRNA)的受体和/或双链RNA(dsRNA)的受体。dsRNA的示例性RNA感知模式识别受体的非限制性列表包括TLR3、RIG1、MDA5、NLRP3或NOD2。ssRNA的示例性RNA感知模式识别受体的非限制性列表包括TRL7、TLR8、RIG1、NLRP3或NOD2。
因此，在优选的实施方式中，至少一种第二组分包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂，其中至少一种RNA感知模式识别受体选自Toll样受体(TLR)，和/或维甲酸可诱导基因-I样受体(RLR)，和NOD样受体和/或PKR、OAS、ADAR1、IFIT1和/或IFIT5。
在优选的实施方式中，至少一种第二组分包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂，其中至少一种RNA感知模式识别受体选自PKR、OAS、SAMHD1、ADAR1、IFIT1和/或IFIT5。
在优选的实施方式中，至少一种Toll样受体选自TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9。在特别优选的实施方式中，Toll样受体选自TLR7和/或TLR8。因此，在本发明的上下文中，优选的是，“至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂”是选自TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9，优选地TLR7和/或TLR8的Toll样受体的拮抗剂。
在优选实施方式中，至少一种维甲酸可诱导基因-I样受体(RLR)选自RIG-1、MDA5、LGP2、cGAS、AIM2、NLRP3、和/或NOD2。在特别优选实施方式中，RLR是RIG-1和/或MDA5。因此，在本发明的上下文中，优选的是，“至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂”是选自RIG-1、MDA5、LGP2、cGAS、AIM2、NLRP3、和/或NOD2，优选地RIG-1、MDA5的维甲酸可诱导基因-I样受体的拮抗剂。
在本发明的上下文中，本文限定的第二组分的至少一种拮抗剂可以选自核苷酸、核苷酸类似物、核酸、肽、蛋白质、抗体、小分子、脂质或任何这些的片段、变体或衍生物。
在这些实施方式中，拮抗剂是TLR拮抗剂，其包括取代的喹啉化合物、取代的喹唑化合物、三环TLR抑制剂(如，米安色林、地昔帕明、环苯扎林、丙咪嗪、酮替芬和阿米替林)、牛痘病毒A52R蛋白质(US 20050244430)、多粘菌素-B(LPS-生物活性的特异性抑制剂)、BX795、氯喹、羟氯喹、CU-CPT8m、CU-CPT9a、CU-CPT9b、CU-CPT9c、CU-CPT9d、CU-CPT9e、CU-CPT9f、CLI-095、RDP58、ST2825、ML120B、PHA-408、胰岛素(临床试验NCT01 151605)、抑制CpG诱导的免疫反应的寡脱氧核苷酸(ODN)、G-富集ODN和具有TTAGGG基序的ODN。在一些实施方式中，TLR拮抗剂包括在专利或专利申请US20050119273、WO2014052931、WO2014108529、US20140094504、US20120083473、US8729088和US20090215908中描述的那些。在一些实施方式中，TLR抑制剂包括ST2抗体；sST2-Fc(功能性鼠可溶性ST2-人IgG1 Fc融合蛋白；参见Biochemical and Biophysical Research Communications,29December2006,vol.351,no.4,940-946)；CRX-526(Corixa)；脂质IVA；RSLA(球形红杆菌脂质A)；E5531((6-0-{2-脱氧-6-0-甲基-4-0-膦酰基-3-0-[(R)-3-Z-十二-5-内酰氧基]-2-[3-氧代-十四烷氨基]--0-膦酰基-a-D-吡喃葡萄糖四钠盐)；E5564(a-D-吡喃葡萄糖,3-0-癸基-2-脱氧-6-0-[2-脱氧-3-0-[(3R)-3-甲氧基癸基]-6-0-甲基-2-[[(11Z)-1-氧代-11-十八烯基]氨基]-4-0-膦酰基--D-吡喃葡萄糖基]-2-[(1,3-二氧十四烷基)氨基]-l-(磷酸二氢盐)，四钠盐)；化合物4a(氢化肉桂酰-L-缬氨酰吡咯烷；参见PNAS,June 24,2003,vol.100,no.13,7971-7976)；CPG 52364(Coley Pharmaceutical Group)；LY294002(2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-l-苯并吡喃-4-酮)；PD98059(2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4H-l-苯并吡喃-4-酮)；氯喹；(具有丙烯间隔基的C2二聚体，作为TLR7/8的拮抗剂(参见表A)和免疫调节寡核苷酸(参见，美国专利申请号2008/0089883)。Patinote等人描述了进一步稳定的TLR拮抗剂(Patinote et al,Agonist and antagonist ligands of toll-like receptors 7and 8:Ingenious tools for therapeutic purposes,Eur J Med Chem.2020May 1；193:112238.)
因此，可以用作本发明的上下文中的拮抗剂的合适的化学化合物，如小分子化合物可以选自氯喹、CU-CPT9a、羟氯喹、奎纳克林、莫能菌素、巴佛洛霉素Al、渥曼青霉素、β-马来酸蒿乙醚胺、(+)-吗啡喃类、9-氨基吖啶、4-氨基喹啉、4-氨基喹啉类、7,8,9,10-四氢-6H-环庚[b]喹啉-基1-胺；l-甲基-2,3-二氢lH-吡咯[2,3-b]喹啉-4-基胺；l,6-二甲基-2,3-二氢lH-吡咯[2,3-b]喹啉-4-基胺；6-溴-1-甲基-2,3-二氢1H-吡咯[2,3-b]喹啉-4-基胺；l-甲基-2,3,4,5-四氢-lH-氮
Figure BDA0003557920630000121
[2,3-b]喹啉-6-基胺；3,3-二甲基-3,4-二氢吖啶-9-基胺；l-苄基-2,3-二氢lH-吡咯[2,3-b]喹啉-4-基胺；6-甲基-1-苯基-2,3-二氢1H-吡咯[2,3-b]喹啉-4-基胺；N*2*,N*2*-二甲基-喹啉-2,4-二胺、2,7-二甲基-二苯并[b,g][1,8]萘啶-11-基胺；2,4-二甲基-苯并[b][l,8]萘啶-5-基胺；7-氟-2,4-二甲基-苯并[b][l,8]萘啶-5-基胺；1,2,3,4-四氢-吖啶-9-基胺盐酸他克林；2,3-二氢lH-环戊[b]喹啉-9-基胺；2,4,9-三甲基-苯并[b][l,8]萘啶-5-基胺；9-氨基-3,3-二甲基-l,2,3,4-四氢-吖啶-l-醇和7-乙氧基-N*3*-呋喃-2-基甲基-吖啶-3,9-二胺；喹唑啉、N,N-二甲基-N'-{2-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-3,4-二氢喹唑啉-4-基}-乙烷-1,2,-二胺；N'-[6,7-二甲氧基2-(4-苯基-哌嗪-1-基)-喹唑啉-4-基]-N,N-二甲基-乙烷-1,2-二胺；N'-[6,7-二甲氧基2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-喹唑啉-4-基]-N,N-二甲基-乙烷-1,2-二胺；N,N-二甲基-N'-(2-苯基-喹唑啉-4-基)-乙烷-1,2-二胺；二甲基-(2-{2-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基]-喹唑啉-4-基氧基}-乙基)-胺；N'-(2-联苯基-4-基-喹唑啉-4-基)-N,N-二甲基-乙烷-l,2-二胺和二甲基-[2-(2-苯基-喹唑啉-4-基氧基)-乙基]-胺、他汀类药物、阿托伐他汀类药物。
在一些实施方式中，合适的化学化合物，如小分子化合物可以选自氯喹(C18H26ClN3)，其是具有抗炎作用和潜在的化学增敏和放射增敏活性的抗疟药，或CU-CPT9a(C17H15NO2)，其是Toll样受体8的有效选择性抑制剂(参见，表A)，(Zhang,S.et al,2018.Small-molecule inhibition of TLR8 through stabilization of its restingstate.Nat Chem Biol,14(1):58-64和Mohamed et al,effect of toll-like receptor7and 9targeted therapy to prevent the development of hepatocellularcarcinoma,Liver International(2015)。
表A：本发明优选的小分子拮抗剂：
Figure BDA0003557920630000131
在优选实施方式中，组合的第二组分的“至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂”是核酸。
术语“核酸”或“核酸分子”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指包含核酸组分，优选由核酸组分组成的分子。术语核酸分子优选指DNA和RNA或其混合物。它优选与术语多核苷酸同义使用。优选地，核酸或核酸分子是包含核苷酸单体(天然和/或修饰的)或由其组成的聚合物，所述核苷酸单体通过糖/磷酸骨架的磷酸二酯键彼此共价连接。合适的修饰核苷酸的实例是LNA或PNA核苷酸。术语“核酸”还涵盖修饰的核酸分子，如本文限定的碱基修饰的、糖修饰的或骨架修饰的DNA或RNA分子。术语“核酸”还包括单链、双链和支链核酸分子。
在特别优选的实施方式中，组合的第二组分的“至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂”是单链核酸，例如单链RNA。
在可选实施方式中，组合的第二组分的“至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂”是双链核酸，例如双链RNA。
在优选的实施方式中，组合的第二组分的“至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂”是核酸，其包含或由选自以下的核苷酸组成：DNA核苷酸、RNA核苷酸、PNA核苷酸和或LNA核苷酸，或这些中任一种的类似物或衍生物。
在特别优选的实施方式中，组合的第二组分的“至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂”是单链核酸，其中所述核酸包含或由选自以下的核苷酸组成：DNA核苷酸、RNA核苷酸、PNA核苷酸和或LNA核苷酸，或这些中任一种的类似物或衍生物。
在其他实施方式中，组合的第二组分的“至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂”是双链核酸，其中所述核酸包含或由选自以下的核苷酸组成：DNA核苷酸、RNA核苷酸、PNA核苷酸和或LNA核苷酸，或这些中任一种的类似物或衍生物。
如本文所使用，术语“LNA核苷酸”是指修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸是锁定的核酸。LNA核苷酸的核糖部分可以用连接2'氧和4'碳的额外桥进行修饰。该桥将核糖锁定在3'内(北)构象中，这在A型双链体中很常见。LNA核苷酸可以与例如寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合。LNA核苷酸与DNA或RNA杂交。包含LNA核苷酸的寡聚物是化学合成的并且是可商购的。锁定的核糖构象增强了碱基堆积和骨架预组织。
如本文所使用，术语“PNA核苷酸”是指修饰的核酸。DNA和RNA具有脱氧核糖和核糖骨架。PNA的骨架由重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成，并且其通过肽键连接。因此，PNA像肽一样进行描述，即从N端到C端。PNA表现出更高的结合强度。PNA寡聚体在与互补DNA结合方面也表现出更高的特异性，其中PNA/DNA碱基错配比DNA/DNA双链体中的类似错配更不稳定。这种结合强度和特异性也适用于PNA/RNA双链体。PNA不容易被核酸酶或蛋白酶识别，而且PNA在很宽的pH范围内也是稳定的。
在具体实施方式中，第二组分的核酸是杂合RNA核酸，其中所述杂合RNA核酸包含RNA核苷酸以及另外至少一种DNA、LNA或PNA核苷酸。
在具体实施方式中，核酸包括至少一种修饰的核苷酸和/或至少一种核苷酸类似物或核苷酸衍生物。
术语“类似物”或“衍生物”可互换使用，一般指具有修饰碱基和/或糖的任何嘌呤和/或嘧啶核苷酸或核苷。修饰的碱基是不是鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的碱基。修饰的糖是不是核糖或2'脱氧核糖的任何糖，并且可以用在寡核苷酸的骨架中。
在实施方式中，第二组分的核酸包含至少一种修饰的核苷酸和/或至少一种核苷酸类似物，其中至少一种修饰的核苷酸和/或至少一种核苷酸类似物选自骨架修饰的核苷酸、糖修饰的核苷酸和/或碱基修饰的核苷酸或其任何组合。
本发明上下文中的骨架修饰是其中核苷酸骨架的磷酸盐被化学修饰的修饰。本发明上下文中的糖修饰是核苷酸的糖的化学修饰。本发明上下文中的碱基修饰是核苷酸的碱基部分的化学修饰。
在实施方式中，可并入如本文所述的第二组分的核酸中的核苷酸类似物/修饰优选地选自：2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、2-氨基嘌呤-核苷-5'-三磷酸；2-氨基腺苷-5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧胞苷-三磷酸、2-硫胞苷-5'-三磷酸、2-硫尿苷-5'-三磷酸、2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-O-甲基-肌苷-5'-三磷酸4-硫尿苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、6-氮杂胞苷-5'-三磷酸、6-氮杂尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、7-脱氮腺苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、8-氮杂腺苷-5'-三磷酸、8-叠氮腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸、或嘌呤霉素-5'-三磷酸、黄苷-5'-三磷酸。对于核苷酸特别优选选自由以下组成的碱基修饰的核苷酸的碱基修饰：5-甲基胞苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、和假尿苷-5'-三磷酸、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、和4-甲氧基-2-硫-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯-胞苷、吡咯-假异胞苷、2-硫-胞苷、2-硫-5-甲基-胞苷、4-硫-假异胞苷、4-硫-1-甲基-假异胞苷、4-硫-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫-泽布拉林、2-硫-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫-鸟苷、6-硫-7-脱氮-鸟苷、6-硫-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫-鸟苷、N2-甲基-6-硫-鸟苷、和N2,N2-二甲基-6-硫-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-尿苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷、6-氮杂-胞苷、2-硫-胞苷、α-硫-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫-尿苷、4-硫-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯-胞苷、肌苷、α-硫-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞嘧啶、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫-腺苷、8-叠氮-腺苷、7-脱氮-腺苷。
在优选实施方式中，至少一种修饰的核苷酸和/或至少一种核苷酸类似物选自细菌tRNA中发现的修饰的核苷酸。在特别优选的实施方式中，至少一种修饰的核苷酸和/或至少一种核苷酸类似物选自1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6-羟基正戊酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-羟基正戊酰基氨基甲酰基腺苷、肌苷、3-甲基胞苷、2'-O-甲基胞苷、2-硫胞苷、N4-乙酰基胞苷、赖氨酸、1-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2'-O-甲基鸟苷、辫苷(queuosine)、环氧辫苷、7-氰基-7-脱氮鸟苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、假尿苷、二氢尿苷、5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷′、5-羟基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷5-氧乙酸、尿苷5-氧乙酸甲基酯、5-氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硒基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷。
在优选的实施方式中，第二组分的核酸包含至少一种2'-取代的RNA核苷酸(核糖核苷)。
术语“2'-取代的核糖核苷”一般包括其中戊糖部分的2'-位置的羟基被取代以产生2'取代或2'-O-取代的核糖核苷的核糖核苷。在某些实施方式中，这种取代是用含有1-6个饱和或不饱和碳原子的低级烃基、用卤素原子或用具有6-10个碳原子的芳基进行的，其中这种烃基或芳基可以是未取代的或可以被例如卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基、或氨基基团取代。
在优选实施方式中，第二组分的核酸包括至少一种糖修饰的核苷酸。优选地，所述糖修饰的核苷酸是至少一种2'核糖修饰的(核糖核苷)RNA核苷酸。
2'-O-取代的核糖核苷的实例包括但不限于2'-氨基、2'-氟、2'-烯丙基、2'-O-烷基和2'-炔丙基核糖核苷、2'-O-甲基核糖核苷和2'-O-甲氧基乙氧基核糖核苷。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸的至少一种2'核糖修饰的RNA核苷酸是2'-O-甲基化RNA核苷酸(2'-O-甲基核糖核苷酸)。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸包括至少一种2'核糖修饰的RNA核苷酸，其中所述至少一种2'核糖修饰的RNA核苷酸是2'-O-甲基化RNA核苷酸。优选地，2'-O-甲基化RNA核苷酸可以选自2'-O-甲基化鸟苷(Gm)、2'-O-甲基化尿嘧啶(Um)、2'-O-甲基化腺苷(Am)、2'-O-甲基化胞嘧啶(Cm)、或这些核苷酸中任一种的2'-O-甲基化类似物。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸包括至少一种2'-O-甲基化RNA核苷酸，优选地至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种2'-O-甲基化RNA核苷酸，其中所述至少一种或所述至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种2'-O-甲基化RNA核苷酸可以选自2'-O-甲基化鸟苷(Gm)、2'-O-甲基化尿嘧啶(Um)、2'-O-甲基化腺苷(Am)、2'-O-甲基化胞嘧啶(Cm)、或这些核苷酸中任一种的2'-O-甲基化类似物。
在优选实施方式中，第二组分的核酸包括至少一种2'-O-甲基化RNA核苷酸，其中，优选地，至少一种2'-O-甲基化RNA核苷酸不位于核酸的5'末端和/或3'末端。
在优选实施方式中，第二组分的核酸包括三核苷酸M-X-Y基序中的至少一种或多种，
其中M选自Gm、Um或Am，优选地其中M是Gm；
其中X选自G、A或U，优选地其中X是G或A；和
其中Y选自G、A、U、C或二氢尿苷，优选地其中Y是C。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸包括三核苷酸M-X-Y基序中的至少一种或多种，
其中M是Gm；
其中X是G或A；和
其中Y是C。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸包括本文限定的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种三核苷酸M-X-Y基序，其中每个M-X-Y基序可以如本文所描述独立地限定。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸包括本文限定的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种三核苷酸M-X-Y基序，其中所述三核苷酸基序不位于3'末端和或5'末端。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸包括或由根据式I的至少一种核酸序列组成：
NW-M-X-Y-NZ (式I)
其中N独立地选自任意核苷酸或本文限定的核苷酸类似物，优选地G、A、U、C、Gm、Am、Um、Cm、或如本文所限定的修饰的核苷酸；
其中W是0或1至15的整数，优选地其中W是1至10的整数，最优选地1至5；
其中Z是0或1至15的整数，优选地其中Z是1至10的整数，最优选地1至5；
其中M、X和Y根据本文限定进行选择。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸包括或由根据式I的至少一种核酸序列组成，
其中N独立地选自G、A、U、C；
其中W是1至10的整数；
其中Z是1至10的整数；
其中M是Gm；
其中X是G；
和其中Y是C。
可以衍生自式I的示例性核酸分子序列是：
5'-MXYNNNNNNNN-3'
5'-NMXYNNNNNNN-3'
5'-NNMXYNNNNNN-3'
5'-NNNMXYNNNNN-3'
5'-NNNNMXYNNNN-3'
5'-NNNNNMXYNNN-3'
5'-NNNNNNMXYNN-3'
5'-NNNNNNNMXYN-3'
5'-NNNNNNNNMXY-3'
5'-MXYNNNNNNN-3'
5'-NMXYNNNNNN-3'
5'-NNMXYNNNNN-3'
5'-NNNMXYNNNN-3'
5'-NNNNMXYNNN-3'
5'-NNNNNMXYNN-3'
5'-NNNNNNMXYN-3'
5'-NNNNNNNMXY-3'
5'-MXYNNNNNN-3'
5'-NMXYNNNNN-3'
5'-NNMXYNNNN-3'
5'-NNNMXYNNN-3'
5'-NNNNMXYNN-3'
5'-NNNNNMXYN-3'
5'-NNNNNNMXY-3'
5'-MXYNNNNN-3'
5'-NMXYNNNN-3'
5'-NNMXYNNN-3'
5'-NNNMXYNN-3'
5'-NNNNMXYN-3'
5'-NNNNNMXY-3'
等。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸包括或由根据式I的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种核酸序列组成，其中根据式I的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种核酸序列的每一种可以是相同的或可以彼此独立地选择。
在该上下文中，可以衍生自式I的示例性核酸分子序列是：
5'-NNNNNMXYMXYNNNNNNNNNNNMXYN-3'
5'-NNNNNMXYMXYNNNNNNNNMXYN-3'
5'-NNMXYNNNNNMXYNNNMXYNNN-3'
5'-NNNMXYMXYNNNNNNNNNMXYN-3'
5'-NNMXYNNNMXYNNNMXYNNN-3'
5'-NNNMXYMXYNNNNNNMXYN-3'
5'-MXYNNNNNNNNNNNNNMXY-3'
5'-MXYNNNNNNNNNNNNNMXY-3'
5'-NNMXYNNNNNMXYNNNMN-3'
5'-MXYNNNNNNNNNNNMXY-3'
5'-NNMXYNNNMXYNNNNN-3'
5'-MXYNNNNNNNNNMXY-3'
等。
在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸含有不含三磷酸基团的5′端。换言之，第二组分的核酸的5'端可以包括单磷酸基团或二磷酸基团或羟基基团。在本发明的上下文中特别重要的是，第二组分的核酸缺少5'末端三磷酸基团，因为这样的5'ppp基团在施用时可能刺激先天免疫应答(通过RIG-1)。
因此，在实施方式中，使用合成方法(例如RNA合成)产生第二组分的核酸。在使用酶促法(如，RNA体外转录)产生第二组分的核酸的实施方式中，可能需要去除核酸的5'ppp基团以获得含有不含三磷酸基团的5'端的核酸(如，使用磷酸酶处理)。
在可选实施方式中，第二组分的核酸在5'端含有三磷酸基团，其中可以使用合成方法或酶促法产生这样的含有5'三磷酸基团的核酸。
第二组分的核酸的长度可以是1至约200个核苷酸、约3至约200个核苷酸、约3至约50个核苷酸、约3至约25个核苷酸、约5至约25个核苷酸、约5至约15个、或约5至约10个核苷酸。
在优选实施方式中，第二组分的核酸的长度可以是约3至约50个核苷酸、约5至约25个核苷酸、约5至约15个、或约5至约10个核苷酸。在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸的长度可以是约5至约15个核苷酸。
在各种具体实施方式中，第二组分的核酸的长度是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个核苷酸。
在优选的具体实施方式中，第二组分的核酸的长度可以是6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸或12个核苷酸。优选地，第二组分的核酸的长度为9个核苷酸。
在优选实施方式中，第二组分的核酸是单链寡核苷酸。在特别优选的实施方式中，第二组分的核酸是单链RNA寡核苷酸。
RNA寡核苷酸在本发明的上下文中包括RNA核苷酸，并且优选地包括至少一种化学修饰的RNA核苷酸。RNA寡核苷酸是短RNA分子，通常其长度不超过200个核苷酸。通常，RNA寡核苷酸使用结构单元、天然或化学修饰的核苷的保护的亚磷酰胺进行化学合成。
寡核苷酸的核苷残基可以通过许多已知的核苷间键中的任何一种相互偶联。这样的核苷间键包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、烷基硫代膦酸、磷酸三酯、磷酰胺、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、吗啉代、硼烷基(borano)、硫醚、桥连的磷酰胺、桥连的亚甲基膦酸、桥连的硫代磷酸、和砜核苷间键。术语“寡核苷酸”还涵盖具有一个或多个立体特异性核苷间键的多核苷(如，(Rp)-或(5)-硫代磷酸、烷基膦酸、或磷酸三酯键)。在本发明的上下文中优选的是磷酸二酯键。
通过遵循称为“合成循环”的常规程序，寡核苷酸链组装沿从3'-到5'-末端的方向进行。完成单个合成循环导致向生长链添加一个核苷酸残基。因此，在本发明的上下文中，第二组分的核酸是单链合成RNA寡核苷酸。
在一些实施方式中，第二组分的拮抗剂(优选地核酸)包含两种或更多种不同的核酸，例如本文所限定的寡核苷酸，其连接至核苷酸或非核苷酸接头，本文中被称为“分支的”。
在一些实施方式中，第二组分的拮抗剂(优选地核酸)包含两种或更多种不同的核酸，例如本文所限定的寡核苷酸，其中所述两个或更多个核酸，如寡核苷酸是非共价连接的，诸如通过静电相互作用、疏水相互作用、π-堆积相互作用、氢键及其组合。这种非共价键的非限制性实例包括Watson-Crick碱基配对、Hoogsteen碱基配对和碱基堆叠。
在一些实施方式中，第二组分的拮抗剂(优选地核酸)包括选自以下的基序：CpG、C*pG、C*pG*和CpG*，其中C是2'-脱氧胞苷，G是2'-脱氧鸟苷，C*是2'-脱氧胸苷、l-(2'-脱氧-B-D-核糖呋喃糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、5-Me-dC、2'-二脱氧-5-卤代胞嘧啶、2'-二脱氧-5-硝基胞嘧啶、阿糖胞苷、2'-脱氧-2'-取代的阿糖胞苷、2'-O-取代的阿糖胞苷、2'-脱氧-5-羟基胞苷、2'-脱氧-N4-烷基-胞苷、2'-脱氧-4-硫尿苷、2'-O-取代的核糖核苷酸(包括但不限于，2'-O-Me-5-Me-C、2'-O-(2-甲氧基乙基)-核糖核苷酸或2'-O-Me-核糖核苷酸)或其他胞嘧啶核苷酸衍生物，G*是2'-脱氧-7-脱氮鸟苷、2'-脱氧-6-硫鸟苷、阿糖鸟苷、2'-脱氧-2'取代的-阿糖鸟苷、2'-O-取代的-阿糖鸟苷、2'-脱氧肌苷、2'-O-取代的核糖核苷酸(包括但不限于，2'-O-(2-甲氧基乙基)-核糖核苷酸；或2'-O-Me-核糖核苷酸)或其他鸟嘌呤核苷酸衍生物，和p是核苷间键，其选自磷酸二酯、硫代磷酸、和二硫代磷酸。
在一些实施方式中，第二组分的拮抗剂(优选地核酸)包括7-脱氮鸟苷(c7G)和至少一个含UpG基序。
在本领域中，已经显示了，细菌tRNATyr序列片段可以起到TLR拮抗剂的功能(Schmitt et al 2017.RNA 23:1344-135)。因此，在实施方式中，第二组分的核酸包括衍生自细菌tRNA序列的核酸序列或由其组成。优选地，核酸序列是或衍生自细菌tRNATyr序列。
在实施方式中，第二组分的核酸包括衍生自细菌tRNATyr序列或由其组成，其中核酸序列是或衍生自tRNATyr的D-环。在优选实施方式中，核酸序列是或衍生自大肠杆菌的tRNATyr的D-环。
在优选实施方式中，第二组分的核酸是RNA寡核苷酸，即，大肠杆菌的tRNATyr的D-环，其中片段的长度为约5至约15个核苷酸，其中核酸序列包括至少一个2'-O-甲基化RNA核苷酸，优选地至少一个M-X-Y基序，任选地其中RNA寡核苷酸不含三磷酸5'末端，任选地其中M-X-Y基序不定位在RNA寡核苷酸的3'末端处。
在本发明的实施方式中，第二组分的核酸(优选地寡核苷酸)包括与选自SEQ IDNO:85-165的核酸序列或这些序列中任一个的片段同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或由其组成。关于这些合适的核酸序列中的每一个的附加信息也可以来自序列表，特别是来自其中在标识符<223>下提供的细节。
在本发明的优选实施方式中，第二组分的核酸(优选地寡核苷酸)包括与选自SEQID NO:85-100、149-165的核酸序列或这些序列中任一个的片段同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或由其组成。
在本发明的优选实施方式中，第二组分的核酸(优选地寡核苷酸)包括与选自SEQID NO:85-87、149-165的核酸序列或表B第1-20行中提供的核酸序列或这些序列中任一个的片段同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或由其组成。
在该上下文中特别优选的是与根据SEQ ID NO:85的核酸序列或表B第1行中提供的核酸序列或这些序列中任一个的片段同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或由其组成。
在下表(表B)中，提供了第二组分的合适核酸序列，其中指示了修饰的核苷酸(如，Gm)；优选地，表B中提供的序列是RNA寡核苷酸。特别优选的是RNA寡核苷酸5'-GAGCGmGCCA-3'(参见表B，第1行)，其中所述RNA寡核苷酸的第5位是2'-O-甲基化鸟苷(Gm)。关于这些合适的核酸序列中的每一个的附加信息也可以来自序列表，特别是来自其中在标识符<223>下提供的细节。
表B：本发明中优选的寡核苷酸拮抗剂：
Figure BDA0003557920630000211
Figure BDA0003557920630000221
Figure BDA0003557920630000231
*硫代磷酸(PTO)骨架，d＝脱氧，A6m＝N6-甲基腺苷，4Ac＝N4-乙酰基胞嘧啶，mE＝7-脱氮-2'-O-甲基-鸟嘌呤
在本发明的其他实施方式中，第二组分的核酸(优选地寡核苷酸)可以选自IRS-954(DV-1079)、IRO-5、IRS 2088、IRS 869、INH-ODN-2114、INH-ODN 4024、INH-ODN 4084-F、IRS-661、IRS-954、INH-ODN-24888、IHN-ODN 2088、ODN 20958、IHN-ODN-21595、IHN-ODN-20844、IHN-ODN-24991、IHN-ODN-105870、IHN-ODN-105871、ODN A151、G-ODN、ODN INH-1、ODN INH-18、ODN 4084-F、INH-4、INH-13、(pS-)ST-ODN、INH-ODN 21 14、CMZ 203-84、CMZ203-85、CMZ 203-88、CMZ 203-88-1、CMZ 203-91、ODN 4084、ODN INH-47、CpG-52364(来自Coley Pharmaceutical的喹唑啉衍生物)、IMO-3100、IMO-8400、IMO-8503(抑制性RNA/DNA杂交寡核苷酸)、ODN 2087、ODN 20959、SM934、IMO-4200、IMO-9200、DV-1179、VTX-763、TMX-302、TMX-306，以及在以下文献或专利或专利申请公开的进一步寡核苷酸：Schmitt et al.(Schmitt et al 2017.RNA 23:1344-135.)、Robbins et al.(Robbins et al2007.Molecular therapy Vol 15No 9,1663-1669.)、WO2008017473(尤其是表2和表6，SEQID NO:195-201)、WO2009141146(SEQ ID No:4-56)、WO2010105819、US2009087388(表4和表6)、WO2017136399(表4)和WO2008033432(表1-5和表8)。
在进一步具体实施方式中，第二组分的核酸(优选地寡核苷酸)是或源自公开的PCT申请WO2009055076，特别是源自WO2009055076的权利要求44至45。WO2009055076的公开内容，特别是涉及WO2009055076的权利要求44至45的公开内容通过引用并入本文。
第一组分：治疗性RNA
在下文中，描述了第一组分的至少一种治疗性RNA的有利实施方式和特征。值得注意的是，在本发明组合(第一方面)的上下文中描述的所述治疗性RNA的所有描述的实施方式和特征同样适用于药物组合物(第二方面)或试剂盒或部分的试剂盒(第三方面)的治疗性RNA方面，以及本发明的其他方面。
在各种实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA选自编码RNA、非编码RNA、环状RNA(circRNA)、RNA寡核苷酸(siRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义RNA(asRNA)、CRISPR/Cas9指导RNA、mRNA、核糖开关、免疫刺激RNA(isRNA)、核酶、RNA适配体、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、病毒RNA(vRNA)、逆转录病毒RNA、小核RNA(snRNA)、自我复制RNA、复制子RNA、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、和Piwi-相互作用RNA(piRNA)。
术语“RNA”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在是核糖核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是腺苷-一磷酸盐、尿苷-一磷酸盐、鸟苷-一磷酸盐和胞苷-一磷酸盐单体，它们沿着所谓的骨架相互连接。骨架通常由第一单体的糖(即核糖)和相邻的第二单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定连续性称为RNA序列。
术语“治疗性RNA”涉及任何RNA，特别是如上限定的任何RNA，其提供治疗方式。在该上下文中，术语“治疗性”必须理解为“提供治疗功能”或“适合治疗或施用”。然而，在这种情况下，“治疗性”根本不应被理解为仅限于某种治疗方式。治疗方式的实例可以是提供编码肽或蛋白质的编码序列(通过所述治疗性RNA)(其中所述肽或蛋白质具有某种治疗功能，例如用于疫苗的抗原，或用于蛋白质替代疗法的酶)。进一步的治疗方式可能是基因工程，其中RNA提供或协调因素，以例如操纵DNA和/或RNA。通常，术语“治疗性RNA”不包括不适合施用于受试者(例如动物、人)的天然RNA提取物或RNA制品(例如从细菌中获得，或从植物中获得)。为了适合治疗目的，本发明的RNA可以是人工的、非天然的RNA。
因此，在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA是人工RNA。
如本文所使用，术语“人工RNA”旨在指非天然存在的RNA。换言之，人工RNA可以理解为非天然RNA分子。由于它们的单独序列(例如G/C含量修饰的编码序列，UTR)和/或由于其他修饰，例如修饰的核苷酸的结构修饰，这类RNA分子可能是非天然的。人工RNA可以通过基因工程设计和/或产生以对应于所需的人工核苷酸序列。在这种情况下，人工RNA是可能非天然存在的序列，即它与野生型序列的不同之处在于至少一个核苷酸/修饰。
在实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA是非编码RNA，其优选地选自RNA寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义RNA(asRNA)、CRISPR/Cas9指导RNA、核糖开关、核酶、RNA适配体、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、和Piwi-相互作用RNA(piRNA)。
在优选实施方式中，第一组分的至少一个治疗性RNA是非编码RNA，优选地CRISPR/Cas9指导RNA或小干扰RNA(siRNA)。
如本文所使用，术语“指导RNA”(gRNA)涉及能够将CRISPR相关蛋白/CRISPR相关内切核酸酶靶向目标靶DNA序列的任何RNA分子。在本发明的上下文中，术语指导RNA必须以其最广义进行理解，并且可以包括双分子gRNA(“tracrRNA/crRNA”)，其包含crRNA(“CRISPRRNA”或“靶向子(targeter)-RNA”或“crRNA”或“crRNA重复”)以及对应的tracrRNA(“反式作用CRISPR RNA”或“活化子-RNA”或“tracrRNA”)分子，或单分子gRNA。“sgRNA”通常包括在其tracrRNA的3′端至5′端处通过“环装”序列连接的crRNA。在本发明的上下文中，指导RNA可以由本发明组合/组合物的至少一种治疗性RNA提供。
在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA是编码RNA。最优选地，所述编码RNA可以选自mRNA、(编码)自我复制RNA、(编码)环状RNA、(编码)病毒RNA或(编码)复制子RNA。
编码RNA可以是任何类型的RNA构建体(例如双链RNA、单链RNA、环状双链RNA或环状单链RNA)，其特征在于所述编码RNA包含至少一个序列(cds)，其被翻译成至少一个氨基酸序列(在施用于例如细胞时)。
如本文所使用的术语“编码序列”、“编码区”或“cds”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在指可以翻译成肽或蛋白质的几个核苷酸的序列。在本发明的上下文中，cds优选地是RNA序列，其由以起始密码子开始和优选地以一个终止密码子终止的多个核苷酸三联体组成。在实施方式中，RNA的cds可以以一个或两个或更多个终止密码子终止。两个或更多个终止密码子的第一个终止密码子可以是TGA或UGA，以及两个或更多个终止密码子的第二个终止密码子可以选自TAA、TGA、TAG、UAA、UGA或UAG。
在实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA是环状RNA。如本文所使用，“环状RNA”或“circRNA”必须理解为可编码至少一种肽或蛋白质的环状多核苷酸构建体。因此，在优选实施方式中，所述circRNA包含至少一个cds，该cds编码至少一种如本文所限定的肽或蛋白质。circRNA可以使用本领域提供的各种方法合成，包括例如在US6210931、US5773244、WO1992/001813、WO2015/034925和WO2016/011222中提供的方法，涉及circRNA合成的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA是复制子RNA。术语“复制子RNA”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在是优化的自我复制RNA。此类构建体可以包括衍生自例如α病毒(例如SFV、SIN、VEE或RRV)的复制酶元件，以及用目标核酸和编码序列对结构病毒蛋白进行的取代。可选地，可以在独立的RNA构建体上提供复制酶。复制酶的下游可以是控制复制子RNA复制的亚基因组启动子。
在特别优选的实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA是信使RNA(mRNA)。本发明上下文中通常的mRNA(信使RNA)提供在例如施用至细胞后被翻译为肽或蛋白质的氨基酸序列的编码序列。
在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，特别是编码RNA或mRNA，是体外转录的RNA。适当地在该上下文中，治疗性RNA是体外转录的编码RNA或体外转录的mRNA。
体外转录的RNA必须理解为通过RNA体外转录获得的RNA。
术语“RNA体外转录”或“体外转录”涉及其中RNA在无细胞系统(体外)中合成的过程。RNA可以通过DNA依赖性RNA体外转录合适的DNA模板获得，该模板是线性化的质粒DNA模板或PCR扩增的DNA模板。用于控制RNA体外转录的启动子可以是任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的具体实例是T7、T3、SP6或Syn5 RNA聚合酶。在一个优选的实施方式中，DNA模板在进行RNA体外转录之前用合适的限制酶线性化。
通常用于RNA体外转录的试剂包括：具有启动子序列的DNA模板(线性化质粒DNA或PCR产物)，该启动子序列对其各自的RNA聚合酶(如噬菌体编码的RNA聚合酶(T7、T3、SP6、或Syn5)具有高结合亲和性；用于四种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷酸三磷酸(NTP)；任选地，如所限定的帽类似物；任选地，如本文限定的进一步修饰的核苷酸；能够与DNA模板内的启动子序列结合的DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7、T3、SP6或Syn5 RNA聚合酶)；任选地，灭活任何可能污染RNA酶的核糖核酸酶(RNA酶)抑制剂；任选地，降解焦磷酸的焦磷酸酶；供应Mg2+离子作为聚合酶的辅助因子的MgCl2；维持合适pH值的缓冲液(TRIS或HEPES)，其还可以包含抗氧化剂(如DTT)，和/或最佳浓度的多胺，例如亚精胺，例如WO2017/109161中所公开的包含TRIS-柠檬酸盐的缓冲系统。
因此，在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，特别是编码RNA或mRNA，是体外转录的RNA，其中体外转录的RNA可通过使用序列优化的核苷酸混合物的RNA体外转录获得。
在该上下文中，用于RNA体外转录的核苷酸混合物可能另外包含如下限定的修饰的核苷酸。在优选实施方式中，用于RNA体外转录反应的核苷酸混合物(即，混合物中每个核苷酸的分数)基本上针对给定的RNA序列(优化的NTP混合物)进行了优化，优选地，如WO2015/188933中所描述。通过使用优化的NTP混合物的过程获得的RNA的特征在于降低的免疫刺激特性，这在本发明的上下文中是优选的。
在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，特别是编码RNA或mRNA，是纯化的RNA(如纯化的、体外转录的mRNA)。
如本文所使用，术语“纯化的RNA”必须理解为在某些纯化步骤(例如(RP)-HPLC、TFF、Oligo d(T)纯化、沉淀步骤)之后比起始材料具有更高纯度的治疗性RNA(例如体外转录的RNA或合成的RNA)。纯化RNA中基本不存在的典型杂质包括肽或蛋白质(例如源自RNA体外转录的酶，例如RNA聚合酶、RNA酶、焦磷酸酶、限制性内切核酸酶、DNA酶)、亚精胺、BSA、无效RNA序列、RNA片段(短双链RNA片段、无效序列等)、游离核苷酸(修饰的核苷酸、常规NTP、帽类似物)、模板DNA片段、缓冲组分(HEPES、TRIS、MgCl2)等。可能衍生自例如发酵程序的其他潜在杂质包括细菌杂质(生物负载、细菌DNA)或源自纯化程序的杂质(有机溶剂等)。因此，在这点上，希望“RNA纯度”尽可能接近100％。对于RNA纯度，还希望全长RNA转录物的量尽可能接近100％。因此，如本文所使用的“纯化的RNA”具有超过70％、80％、85％、非常特别地90％、95％和最有利地99％或更高的纯度。此外，如本文所使用的“纯化的RNA”可以另外或可选地具有超过70％、80％、85％、非常特别地90％、95％和最有利地99％或更多的量的全长RNA。本文限定的这种纯化的RNA的特征在于免疫刺激特性降低(与非纯化的RNA相比)，这在本发明的上下文中是特别优选的。
纯度或全长RNA的量可以例如通过分析型HPLC来确定，其中上面提供的百分比对应于色谱中所需RNA的峰面积与所有峰的总面积之间的比率。可选地，纯度可以通过其他方式确定，例如通过分析琼脂糖凝胶电泳或毛细管凝胶电泳。
在本发明的上下文中，特别是对于医学应用，可能需要提供药物级RNA。在特别优选的实施方式中，RNA制造是在当前良好生产规范(GMP)下进行的，在DNA和RNA水平上，优选地按照WO2016/180430中所述的程序进行各种质量控制步骤。使用RP-HPLC(如WO2008/077592中所述)和/或切向流过滤(如WO2016/193206中所述)对获得的RNA产物进行优选地纯化。因此，在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，特别是编码RNA或mRNA，为GMP级RNA或药物级RNA。
在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，特别是编码RNA或mRNA，是纯化的RNA(例如纯化的、体外转录的mRNA)，其中纯化的RNA通过RP-HPLC和/或TFF和/或Oligod(T)纯化进行纯化。优选地，纯化的RNA是(RP)-HPLC纯化的RNA。
必须强调的是，本文限定的“纯化的RNA”或本文限定的“药物级RNA”可能具有优异的稳定性特征(体外、体内)和改进的效率(例如，更好的RNA体内可翻译性)并且因此特别适用于任何医疗目的。此外，这种RNA的特征在于降低的免疫刺激特性(与未纯化的RNA相比)，这在本发明的上下文中是优选的。
在具体实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，特别是编码RNA或mRNA，是体外转录的RNA、纯化的RNA、药物级RNA。这种RNA的特征在于降低的免疫刺激特性(与例如非纯化的体外转录的RNA相比)，并且因此特别适用于本发明的上下文中。
在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，如编码RNA或mRNA，包含编码至少一种肽或蛋白质的至少一种编码序列(cds)。
有利地，与不与第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂组合的编码RNA或mRNA的编码的至少一种肽或蛋白质的表达相比，编码RNA或mRNA的编码的至少一种肽或蛋白质的表达通过在施用到细胞、组织或生物体中时与第二组分的至少一种RNA感知受体的至少一种拮抗剂的组合而增加或延长。
因此，与仅施用相应的第一组分/治疗性RNA相比，向细胞、组织或生物体施用组合(即，施用第一和第二组分)导致增加或延长的肽/蛋白质表达。
评估治疗性RNA在特定细胞/器官/组织中的表达(即，蛋白质表达)的方法，以及确定表达持续时间的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用基于抗体的检测方法(蛋白质印迹，FACS)或定量质谱法来确定蛋白质表达。实施例部分中提供了示例性方法。通常，将与第二组分组合的治疗性RNA的表达与单独治疗性RNA(或单独第一组分)(即，没有(额外)施用第二组分)的表达进行比较。必须使用相同的条件(如，相同的细胞系、相同的生物体、相同的应用途径、相同的检测方法、相同数量的治疗性RNA、相同的RNA序列)(如果可行)以进行有效比较。本领域技术人员理解如何进行本发明组合与相应对照RNA(如，仅治疗性RNA或仅第一组分)的比较。
本发明组合的“增加的蛋白质表达”必须理解为与相应对照(仅第一组分或仅治疗性RNA)相比表达的百分比增加，可以通过如上所述的各种完善确立的表达测定(如，基于抗体的检测方法)确定这种增加。
因此，与仅施用相应的第一组分/治疗性RNA相比，向细胞、组织或生物体施用组合(即，施用第一和第二组分)导致表达增加，其中所述细胞、组织或生物体中的表达的百分比增加为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或甚至更多。
本发明组合的“延长的蛋白质表达”必须理解为与相应对照(仅第一组分或仅治疗性RNA)相比蛋白质表达的额外持续时间，其中本发明组合的表达仍然是可检测的，可以通过如上所述的各种完善确立的表达测定(如，基于抗体的检测方法)确定这种蛋白质表达的额外持续时间。
因此，与仅施用相应的第一组分/治疗性RNA相比，向细胞、组织或生物体施用组合(即，施用第一和第二组分)导致延长的蛋白质表达，其中所述细胞、组织或生物体中蛋白质表达的额外持续时间为至少5h、10h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h、75h、80h、85h、90h、95h、或10h、或甚至更长。
在特别优选的实施方式中，和不与第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂组合的编码RNA或mRNA的编码的至少一种肽或蛋白质的表达相比，在施用到细胞、组织或生物体后，通过与第二组分的至少一种RNA感知受体的至少一种拮抗剂组合而增加或延长了编码RNA或mRNA的编码的至少一种肽或蛋白质的表达，而同时和施用不与第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂组合的第一组分的至少一种编码RNA或mRNA相比，施用至少一种编码RNA或mRNA与第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的组合导致先天免疫应答降低。
在优选实施方式中，编码RNA或mRNA的cds编码至少一种肽或蛋白质，其中所述至少一种肽或蛋白质是或衍生自治疗性肽或蛋白质。
在各种实施方式中，编码的肽或蛋白质(如，治疗性肽或蛋白质)的长度可以是至少或大于约20、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1500个氨基酸。
在实施方式中，至少一种治疗性肽或蛋白质是或衍生自抗体、胞内抗体、受体、受体激动剂、受体拮抗剂、结合蛋白、CRISPR相关内切核酸酶、蛋白伴侣、转运蛋白、离子通道、膜蛋白、分泌蛋白、转录因子、酶、肽或蛋白激素、生长因子、结构蛋白、细胞质蛋白、细胞骨架蛋白、病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、过敏原、肿瘤抗原或任何这些的片段、变体或组合。
在一些实施方式中，由根据本发明的RNA或mRNA编码的抗体可以选自所有抗体，例如来自通过重组方法产生的或天然存在的并且本领域技术人员从现有技术中已知的所有抗体，特别是(可以)用于治疗目的或诊断或研究目的或已发现针对特定疾病(如，癌症疾病、传染病等)的抗体，还如在WO2008083949中所描述，其通过引用包括在本文中。
在本发明的上下文中，由根据本发明的RNA或mRNA编码的抗体通常包括本领域技术人员已知的所有抗体，例如天然存在的抗体或通过免疫在宿主生物体中产生的抗体，通过重组方法制备的抗体(其已从天然存在的抗体或通过(常规)免疫在宿主生物体中产生的抗体或借助分子生物学方法产生的抗体分离和鉴定)，以及嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、胞内抗体(即在细胞中表达并可能定位于特定细胞区室中的抗体)，以及上述抗体的片段。就此而言，术语抗体应以其最广泛的含义来理解。在这种情况下，抗体通常包含轻链和重链，两者均具有可变结构域和恒定结构域。
根据实施方式，至少一种如本文限定的治疗性RNA的cds编码至少一种如上限定的(治疗性)肽或蛋白质，以及另外地至少一种其他异源肽或蛋白质元件。
合适地，至少一种另外的异源肽或蛋白质元件可以选自分泌信号肽、跨膜元件、多聚化结构域、VLP形成序列、核定位信号(NLS)、肽接头元件、自切割肽、免疫佐剂序列或树突状细胞靶向序列。
根据优选实施方式，第一组分的治疗性RNA包含至少一个cds，其中cds编码如本文所指定的至少一种肽或蛋白质。在那种情况下，编码至少一种肽或蛋白质的任何cds都可以理解为合适的cds，并因此可以包含在治疗性RNA中。
在实施方式中，cds的长度可以是至少或大于约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、3500、4000、5000、或6000个核苷酸。在实施方式中，cds的长度范围为约300至约2000个核苷酸。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA是修饰的和/或稳定的RNA，优选地，修饰的和/或稳定的编码RNA或修饰的和/或稳定的mRNA。
第一组分的治疗性RNA因此可以作为“稳定的人工RNA”提供，即显示对体内降解提高的抗性的RNA和/或显示提高的体内稳定性的RNA，和/或显示提高的体内可翻译性的RNA。
在下文中，描述了适合于“稳定”第一组分的治疗性RNA的修饰。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA的至少一个cds是密码子修饰的cds，其中与由对应野生型cds编码的氨基酸序列相比，由至少一个密码子修饰的cds编码的氨基酸序列优选地没有被修饰。
术语“密码子修饰的编码序列”涉及与对应的野生型cds相比在至少一个密码子(编码一个氨基酸的核苷酸的三联体)上不同的编码序列。本发明上下文中的密码子修饰的cds显示对体内降解提高的抗性和/或提高的体内稳定性，和/或提高的体内可翻译性。由于编码相同氨基酸的多个密码子可以互换地使用以优化/修饰编码序列，所以密码子修饰利用遗传密码的简并性(表1)。
在特别优选的实施方式中，第一组分的治疗性RNA的至少一个cds是密码子修饰的cds，其中密码子修饰的cds选自C最大化cds、CAI最大化cds、人密码子选择(codon usage)适应cds、G/C含量修饰的cds和G/C优化的cds，或它们的任何组合。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA可以被修饰，其中与对应野生型cds的C含量相比，至少一个cds的C含量可以被增加，优选地被最大化(本文称为“C最大化编码序列”)。与由各自野生型核酸cds编码的氨基酸序列相比，C最大化cds编码的氨基酸序列没有被修饰。C最大化核酸序列的产生可以使用根据WO2015/062738的方法进行，WO2015/062738的公开内容通过引用包括在本文中。
在实施方式中，第一组分的治疗性RNA可以被修饰，其中与对应野生型cds的G/C含量相比，至少一个cds的G/C含量可以被修饰(本文称为“G/C含量修饰的编码序列”)。在该上下文中，术语“G/C优化”或“G/C含量修饰”涉及与对应野生型RNA相比包括修饰的优选地增加数量的鸟苷和/或胞嘧啶核苷酸的RNA。这种增加的数量可以通过用含有G或C核苷酸的密码子取代含有A或T核苷酸的密码子来产生。有利地，具有增加的G/C含量的RNA序列比对应的野生型序列或具有增加的A/U含量的序列更稳定(这可能导致增加的体内翻译)。与由各自的野生型序列编码的氨基酸序列相比，由G/C含量修饰的cds编码的氨基酸序列优选地不被修饰。优选地，与对应的野生型序列的cds的G/C含量相比，至少一个cds的G/C含量增加至少10％、20％、30％，优选地至少40％。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA可以被修饰，其中与对应野生型cds的G/C含量相比，至少一个cds的G/C含量可以被优化(本文称为“G/C含量优化的编码序列”)。在该上下文中“优化的”是指，其中G/C含量被优选地增加至基本上最高可能的G/C含量的cds。与由各自的野生型cds编码的氨基酸序列相比，由G/C含量优化的cds编码的氨基酸序列优选地不被修饰。有利地，具有G/C含量优化的编码序列的RNA序列比对应的野生型序列更稳定(这可能导致增加的体内翻译)。G/C含量优化的核酸序列的产生可以根据WO2002/098443的方法进行，WO2002/098443的公开内容通过引用包括在本文中。
在实施方式中，第一组分的治疗性RNA可以被修饰，其中至少一个cds中的密码子可以适应人密码子选择(本文称为“人密码子选择适应编码序列”)。在受试者(如，人)中编码相同氨基酸的密码子以不同的频率出现。因此，根据人密码子选择，cds优选地被修饰，使得编码相同氨基酸的密码子频率对应该密码子的天然存在的频率。如，在氨基酸Ala的情况中，野生型cds优选地以如下方式进行适应：密码子“GCC”以0.40的频率使用，密码子“GCT”以0.28的频率使用，密码子“GCA”以0.22的频率使用和密码子“GCG”以0.10的频率使用等(参见表1)。因此，这样的程序(如针对Ala所举例说明)适用于由cds编码的每个氨基酸，以获得适合人密码子选择的序列。有利地，与相应的野生型序列相比，具有人密码子选择适应的编码序列的RNA序列在体内可能更稳定或显示更好的可翻译性。
表1:针对每个氨基酸指示的具有各自密码子频率的人密码子选择
Figure BDA0003557920630000301
Figure BDA0003557920630000311
*：针对某一氨基酸的最常见的人密码子
在实施方式中，第一组分的治疗性RNA可以被修饰，其中在至少一个cds中密码子适应指数(CAI)可以被增加或优选地被最大化(本文称为“CAI最大化编码序列”)。因此，优选的是，在例如人细胞中相对稀有的野生型核酸序列的所有密码子被交换为在例如人细胞中常见的各自的密码子，其中常见的密码子与相对稀有的密码子编码相同的氨基酸。合适地，最常见的密码子用于每个编码的氨基酸(参见表1，用星号标记最常见的人密码子)。合适地，RNA包括至少一个cds，其中至少一个cds的密码子适应指数(CAI)为至少0.5、至少0.8、至少0.9或至少0.95。最优选地，至少一个cds的密码子适应指数(CAI)为1。如，在氨基酸Ala的情况中，野生型cds以如下方式适应：最常见的人密码子“GCC”总是用于所述氨基酸。因此，这样的程序(如针对Ala所举例说明)适用于由cds编码的每个氨基酸，以获得CAI最大化cds。
在实施方式中，第一组分的治疗性RNA(编码RNA或mRNA)可以通过添加5'-帽结构进行修饰，其优选地稳定RNA和/或增强编码的肽或蛋白质的表达。在治疗性RNA是线性的(如，线性mRNA或线性复制子RNA)的实施方式中，5'-帽结构特别重要。因此，在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括5'-帽结构。
在优选实施方式中，5'-帽结构是m7G(m7G(5')ppp(5')G)、cap0、cap1、cap2、修饰的cap0或修饰的cap1结构。
本文所使用的的术语“5'-帽结构”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且例如旨在指5'修饰的核苷酸，特别地鸟嘌呤核苷酸，其定位在RNA(如mRNA)的5'-端。通常，5'-帽结构经由5'-5'-三磷酸键连接至RNA。
适合用于本发明的上下文中的5'-帽结构是cap0(第一核碱基的甲基化，如，m7GpppN)、cap1(m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的另外的甲基化)、cap2(m7GpppN下游的第二核苷酸的核糖的另外的甲基化)、cap3(m7GpppN下游的第三核苷酸的核糖的另外的甲基化)、cap4(m7GpppN下游的第四核苷酸的核糖的另外的甲基化)、ARCA(抗-反向帽类似物)、修饰的ARCA(如，硫代磷酸修饰的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、和2-叠氮-鸟苷。
5'-帽(cap0或cap1)结构可以在化学RNA合成或使用帽类似物的RNA体外转录(共转录加帽)中形成。
本文所使用的术语“帽类似物”将被本领域普通技术人员所认识和理解，并且旨在指具有帽功能的非可聚合二核苷酸或三核苷酸，因为当在核酸分子的5'-端处并入时，它促进翻译或定位，和/或防止核酸分子，特别是RNA分子的降解。非可聚合意思是帽类似物将仅在5'-末端被并入，因为其不具有5'三磷酸并因此不能通过模版依赖的RNA聚合酶在3'-方向上延伸。帽类似物的实例包括但不限于选自以下的任一种：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化帽类似物(如，GpppG)；二甲基化帽类似物(如m2,7GpppG)、三甲基化帽类似物(如m2,2,7GpppG)、二甲基化对称帽类似物(如m7Gpppm7G)、或抗反向帽类似物(如ARCA；m7,2'OmeGpppG、m7,2'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG和它们的四磷酸衍生物)。之前已经描述了另外的帽类似物(WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347、和WO2013/059475)。在该上下文中另外合适的帽类似物在WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/053297、WO2017/066782、WO2018/075827和WO2017/066797中进行了描述，设计帽类似物的公开内容通过引用并入本文。优选的帽-类似物是共转录产生cap0结构的二-核苷酸帽类似物m7G(5')ppp(5')G(m7G)或3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')G。
在实施方式中，修饰的cap1结构使用三核苷酸类似物产生，如在WO2017/053297、WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/066782、WO2018/075827和WO2017/066797中所公开。特别地，可以从WO2017/053297的权利要求1-5中公开的结构衍生的任何帽结构可以合适地用于共转录产生修饰的cap1结构。进一步，可以从WO2018075827的权利要求1或权利要求21中限定的结构衍生的任何帽结构可以合适地用于共转录产生修饰的cap1结构。
在特别优选的实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括cap1结构。cap1结构可以酶促地或共转录地形成(如，使用m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG，或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG类似物)。包括RNA(优选地mRNA)的cap1结构在本发明的上下文中具有若干有利特征，包括增加的翻译效率和先天免疫系统的减少的刺激。
在优选实施方式中，5'-帽结构可以合适地在如本文所限定的RNA体外转录反应中使用如本文所限定的三核苷酸帽类似物共转录地添加。有利的是，第一组分的RNA包括cap1结构，其中所述cap1结构是通过共转录加帽可获得的。
在优选实施方式中，至少一种治疗性RNA的cap1结构使用采用三核苷酸帽类似物m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG的共转录加帽形成。在该上下文中优选的cap1类似物是m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
不受理论束缚，使用共转录加帽产生cap1结构的有利效果可以通过与酶促加帽相比提高的加帽效率和/或酶促加帽也可以产生中间cap1结构(如，5'帽的部分甲基化和/或5'帽后的核糖的部分)来解释。
在其他实施方式中，5'-帽结构经由使用加帽酶(如，牛痘病毒加帽酶和/或帽依赖性2'-O-甲基转移酶)的酶促加帽形成，从而产生cap0或cap1或cap2结构。5'-帽结构(cap0或cap1)可以使用固定的加帽酶和/或帽依赖性2'-O-甲基转移酶，使用在WO2016/193226中公开的方法和方式进行添加。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA(种类)中约70％、75％、80％、85％、90％、95％包括cap1结构，如使用加帽测定进行确定。在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA(种类)中小于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％包括cap1结构，如使用加帽测定进行确定。在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA(种类)中小于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％包括cap0结构，如使用加帽测定进行确定。在优选实施方式中，第一组分的编码RNA(种类)中小于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％包括cap1中间体结构，如使用加帽测定进行确定。
术语“治疗性RNA种类”不限于表示“一个单分子”，而是理解为包括基本上同一的RNA治疗性分子的全体。术语可以优选地涉及编码相同氨基酸序列的多种基本上同一的编码RNA分子。
为了确定加帽程度或cap1中间体的存在，可以使用如公开的PCT申请WO2015101416中所述的加帽测定，特别是如公开的PCT申请WO2015101416的权利要求27至46中所述的加帽测定。可用于确定治疗性RNA的加帽程度的其他加帽测定描述于PCT/EP2018/08667或公开的PCT申请WO2014/152673和WO2014152659。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA(编码RNA或mRNA)包括5'末端m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)帽结构。在这样的实施方式中，RNA包括5'末端m7G帽，以及m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的另外的甲基化，在该情况中，2'O甲基化腺苷。
在其他优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA(编码RNA或mRNA)包括m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)帽结构。在这样的实施方式中，RNA包括5'末端m7G帽，以及相邻核苷酸的核糖的另外的甲基化，在该情况中，2'-O-甲基化鸟苷。
因此，在本发明的上下文中无论何时提及治疗性编码RNA，所述编码RNA或mRNA序列的第一个核苷酸，即m7G(5')ppp结构下游的核苷酸，可以是2'-O-甲基化鸟苷或2'-O-甲基化腺苷。
RNA的稳定性或效率也可以受例如第一组分的治疗性RNA的修饰的磷酸骨架的影响。骨架修饰可以是其中RNA的核苷酸骨架的磷酸被化学修饰的修饰。可以优选地使用的核苷酸包括例如硫代磷酸-修饰的磷酸骨架，优选地磷酸骨架中包含的磷酸氧中至少一个被硫原子取代。稳定的RNA可以进一步包括例如：非离子磷酸酯类似物，诸如，如烷基和芳基膦酸酯，其中带电荷的膦酸酯氧被烷基或芳基取代，或磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧残基以烷基化形式存在。此类骨架修饰通常包括来自甲基膦酸酯、磷酰胺和硫代磷酸酯(如，胞苷-5′-O-(1-硫代磷酸))的修饰。
因此，在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA包括至少一个修饰的核苷酸和/或至少一个核苷酸类似物。
在实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA包括至少一个修饰的核苷酸，其中至少一个修饰的核苷酸选自骨架修饰的核苷酸、糖修饰的核苷酸和/或碱基修饰的核苷酸，或其任何组合。
在本发明的上下文中的骨架修饰是其中核苷酸的骨架的磷酸酯被化学修饰的修饰。在本发明的上下文中的糖修饰是RNA的核苷酸的糖的化学修饰。在本发明的上下文中的碱基修饰是RNA的核苷酸的碱基部分的化学修饰。在该上下文中，核苷酸类似物或修饰优选地选自核苷酸类似物/修饰的核苷酸，其可适用于转录和/或翻译。优选地，选择这样的核苷酸类似物/修饰的核苷酸，其显示先天免疫系统的减少的刺激(在体内施用包括这类修饰的核苷酸的RNA后)。
在实施方式中，本文所描述的可以并入RNA的核苷酸类似物/修饰优选地选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、2-氨基嘌呤-核苷-5'-三磷酸；2-氨基腺苷-5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧胞苷-三磷酸、2-硫胞苷-5'-三磷酸、2-硫尿苷-5'-三磷酸、2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-O-甲基-肌苷-5'-三磷酸4-硫尿苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞苷-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸、6-氮杂胞苷-5'-三磷酸、6-氮杂尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、7-脱氮腺苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、8-氮杂腺苷-5'-三磷酸、8-叠氮腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸、N1-甲基腺苷-5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸、或嘌呤霉素-5'-三磷酸、黄苷-5'-三磷酸。对于碱基修饰，特别优选的核苷酸选自由以下组成的碱基修饰的核苷酸的组：5-甲基胞苷-5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、和假尿苷-5'-三磷酸、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、和4-甲氧基-2-硫-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯-胞苷、吡咯-假异胞苷、2-硫-胞苷、2-硫-5-甲基-胞苷、4-硫-假异胞苷、4-硫-1-甲基-假异胞苷、4-硫-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫-泽布拉林、2-硫-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2、6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫-鸟苷、6-硫-7-脱氮-鸟苷、6-硫-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫-鸟苷、N2-甲基-6-硫-鸟苷、和N2,N2-二甲基-6-硫-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-尿苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷、6-氮杂-胞苷、2-硫-胞苷、α-硫-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫-尿苷、4-硫-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯-胞苷、肌苷、α-硫-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞嘧啶、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫-腺苷、8-叠氮-腺苷、7-脱氮-腺苷。
在实施方式中，至少一个化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮杂-尿苷、2-硫-二氢假尿苷、2-硫-二氢尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-0-甲基尿苷。
在实施方式中，第一组分的治疗性RNA的cds中100％的尿嘧啶具有化学修饰，优选地在尿嘧啶的第5位中的化学修饰。在其他实施方式中，在cds中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的尿嘧啶核苷酸具有化学修饰，优选地在所述尿嘧啶核苷酸的第5位中的化学修饰。此类修饰在本发明的上下文中是合适的，因为自然尿嘧啶的减少可以减少在施用至细胞后由第一组分潜在引起的先天免疫系统的刺激(在体内施用包括此类修饰的核苷酸的RNA后)。
合适地，第一组分的治疗性RNA，特别是所述治疗性RNA的cds，可以包括至少一个修饰的核苷酸，其中所述至少一个修饰的核苷酸可以选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶、和5-甲氧基尿苷，其中假尿苷(ψ)是优选的。
在本发明的上下文中，优选的是，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括本文所限定的5'-帽结构，优选地Cap1结构，并且不含本文限定的任何修饰的核苷酸。因此，第一组分的治疗性RNA可以包括5'-帽结构，以及包括A、U、G、C核苷酸的RNA序列，其中RNA序列不含任何修饰的核苷酸。
在可选实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括本文所限定的5'-帽结构，优选地Cap1结构，并且另外地包括本文限定的修饰的核苷酸，优选地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶和5-甲氧基尿苷。
在实施方式中，与其各自野生型核酸的核糖体结合位点的环境中A/U含量相比，治疗性(编码)RNA的核糖体结合位点的序列环境中A/U含量可以被增加。该修饰(核糖体结合位点周围的增加的A/U含量)增加了核糖体与RNA结合的效率。核糖体与核糖体结合位点的有效结合继而对RNA的有效翻译产生影响。
因此，在特别优选的实施方式中，第一组分的治疗性(编码)RNA包括核糖体结合位点，也称为“Kozak序列”，其与序列SEQ ID NO:3或4中任一个或其片段或变体同一或具有至少80％、85％、90％、95％的同一性。
在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，优选地mRNA，包括至少一个聚(A)序列，和/或至少一个聚(C)序列，和/或至少一个组蛋白茎环序列/结构。
因此，第一组分的治疗性(编码)RNA可以包括至少一个聚(N)序列，如，至少一个聚(A)序列，至少一个聚(U)序列，至少一个聚(C)序列，或其组合。
在优选实施方式中，治疗性(编码)RNA包括至少一个聚(A)序列。
如本文所使用，术语“聚(A)序列”、“聚(A)尾”或“3'-聚(A)尾”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在是腺苷核苷酸的序列，通常位于编码RNA的3'-端处，具有至多约1000个腺苷核苷酸。所述聚(A)序列基本上是均聚的，例如，如100个腺苷核苷酸的聚(A)序列具有基本上100个核苷酸的长度。在其他实施方式中，聚(A)序列可以被不同于腺苷核苷酸的至少一个核苷酸打断。
合适位于本文所限定的3'UTR下游的聚(A)序列可以包括约10至约500个腺苷核苷酸、约30至约500个腺苷核苷酸、约30至约200个腺苷核苷酸或约50至约150个腺苷核苷酸。合适地，聚(A)序列的长度可以为至少约或甚至大于约30、50、64、75、100、200、300、400或500个腺苷核苷酸。在优选实施方式中，聚(A)序列包括约50至约250个腺苷。在特别优选的实施方式中，聚(A)序列包括约64个腺苷核苷酸。在特别优选的实施方式中，聚(A)序列包括约100个腺苷核苷酸。
本文限定的聚(A)序列合适地位于治疗性RNA(如，mRNA)的3'末端。因此，优选的是，RNA的3'末端核苷酸(即，在多核苷酸链中最后的3'末端核苷酸)是至少一个聚(A)序列中的3'末端A核苷酸。术语“位于末端处”必须理解为确切位于3'末端–换句话说，RNA的3'末端由以A核苷酸终止的聚(A)序列构成。
优选地，第一组分的治疗性RNA的聚(A)序列在RNA体外转录期间从DNA模板获得。在其他实施方式中，聚(A)序列是通过化学合成的常用方法在体外获得的，而不必从DNA模板转录。在其他实施方式中，使用市售的聚腺苷酸化试剂盒和本领域已知的相应方案，或可选地通过使用固定的聚(A)聚合酶，如使用WO2016/174271中描述的方法和手段，通过RNA的酶促聚腺苷酸化(在RNA体外转录后)产生聚(A)序列。
因此，治疗性RNA可以包括通过酶促聚腺苷酸化获得的聚(A)序列，其中RNA分子的大部分包括约100(+/-10)至约500(+/-50)，优选地约250(+/-25)个腺苷核苷酸。
在实施方式中，治疗性RNA可以包括衍生自模板DNA的聚(A)序列，并且可以包括通过酶促聚腺苷酸化产生的至少一种另外的聚(A)序列，如在WO2016/091391中所描述。
在实施方式中，第一组分的治疗性RNA可以包括至少一个聚(C)序列。
在实施方式中，合适地位于3'末端或3'末端附近的聚(C)序列包括10至200个胞嘧啶核苷酸，约10至100个胞嘧啶核苷酸，或约10至50个胞嘧啶核苷酸。在优选实施方式中，聚(C)序列包括约30个胞嘧啶核苷酸。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA包括至少一个组蛋白茎环。
本文所使用的术语“组蛋白茎环”(缩写为“hsl”)被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如意指主要存在于组蛋白mRNA中的核酸序列。
组蛋白茎环结构/序列可以合适地选自WO2012/019780中公开的组蛋白茎环序列，涉及组蛋白茎环序列/组蛋白茎环结构的公开内容通过引用并入本文。在本发明内可以使用的组蛋白茎环序列可以优选地衍生自WO2012/019780的式(I)或(II)。根据进一步优选的实施方式，编码RNA可以包括至少一个组蛋白茎环序列，其衍生自专利申请WO2012/019780的具体式(Ia)或(IIa)的至少一个。
在特别优选的实施方式中，第一组分的治疗性RNA包括至少一个组蛋白茎环序列，其中所述组蛋白茎环序列包括与SEQ ID NOs:1或2或其片段或变体同一或具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸序列。
在实施方式中，第一组分的治疗性RNA包括3′-末端序列元件。所述3′-末端序列元件包括聚(A)序列和组蛋白茎环序列，和任选地聚(C)序列，其中所述序列元件位于本发明的RNA的3'末端。
因此，第一组分的治疗性RNA包括3′-末端元件，其包括与SEQ ID NO:7至38或其片段或变体同一或具有至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核酸序列或由其组成。
在各种实施方式中，第一组分的治疗性RNA可以包括根据SEQ ID NO:5或6或其片段或变体的5′-末端序列元件。这类5′-末端序列元件包括，如，用于T7 RNA聚合酶的结合位点。进一步，所述5′-末端起始序列的第一个核苷酸可以优选地包括2'-O-甲基化，如，2'-O-甲基化鸟苷或2'-O-甲基化腺苷。
第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，可以包括cds、5'-UTR和/或3'-UTR。UTR(非翻译区)可能含有决定RNA转换、稳定性和/或定位的调节序列元件或基序。UTR也可能含有增强翻译的序列元件或基序。在RNA的医学应用中，将cds翻译成至少一种肽或蛋白质对于治疗效果至关重要。3'-UTR和/或5'-UTR的某些组合可以增强可操作连接的编码序列的表达，这些编码序列编码如上限定的肽或蛋白质。含有所述UTR组合的RNA有利地使编码的肽或蛋白质在施用于受试者后能够快速和瞬时表达。
因此，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，可以包含3'-UTR和/或5'-UTR的某些组合，导致治疗性蛋白质(如，CRISPR相关的内切核酸酶，或抗原)的(提高的)翻译，并因此，在治疗上相关的细胞或组织中表达蛋白质。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包含至少一个异源5'-UTR和/或至少一个异源3'-UTR。所述5'-UTR或3'-UTR可源自天然存在的基因或可合成工程化。在优选实施方式中，RNA包括至少一个与至少一个(异源)3'-UTR和/或至少一个(异源)5'-UTR可操作连接的cds。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA包括至少一个异源3'-UTR。
术语“3'-非翻译区”或“3'-UTR”或“3'-UTR元件”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在指位于cds的3'(即下游)的RNA的一部分，其不翻译成蛋白质。3'-UTR可能是RNA的一部分，例如mRNA，位于cds和末端聚(A)序列之间。3'-UTR可能包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。这样的调节元件可以是例如核糖体结合位点、miRNA结合位点等。
优选地，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包含3'-UTR，其可衍生自与具有增强的半衰期的RNA相关的基因(即，提供稳定的RNA)。
在一些实施方式中，3'-UTR包括聚腺苷酸化信号、影响细胞内RNA定位稳定性的蛋白质结合位点，或一种或多种miRNA或miRNA结合位点中的一个或多个。
微小RNA(或miRNA)是19-25个核苷酸长的非编码RNA，其与核酸分子的3′-UTR结合并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。如，已知微小RNA调节RNA，并由此调节蛋白质表达，如，在肝脏(miR-122)、心脏(miR-ld、miR-149)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)中。第一组分的治疗性RNA可以包括一种或多种微小RNA靶序列、微小RNA序列、或微小RNA种子。这样的序列可以例如对应于任何已知的微小RNA，例如US2005/0261218和US2005/0059005中教导的那些。
因此，miRNA或上述限定的miRNA的结合位点可以从3'-UTR中去除或引入到3'-UTR，从而使治疗性RNA的表达或活性适应期望的细胞类型或组织。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括至少一个异源3'-UTR，其中至少一个异源3'-UTR包含衍生自选自PSMB3、ALB7、α-球蛋白(称为“muag”)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因或来自这些基因中任何一个的同源物、片段或变体的3'-UTR的核酸序列。
在这种上下文中，特别优选的核酸序列可以衍生自公开的PCT申请WO2019/077001A1，特别是WO2019/077001A1的权利要求9。WO2019/077001A1的权利要求9的相应3'-UTR序列通过引用并入本文(如，WO2019/077001A1的SEQ ID NO:23至34，或其片段或变体)。
在其他实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括在WO2016/1777中描述的3'-UTR，WO2016/107877中关于3'-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。合适的3'-UTR是WO2016/107877的SEQ ID NO:1至24和SEQ ID NO:49至318，或这些序列的片段或变体。在其他实施方式中，治疗性RNA包含WO2017/036580中描述的3'-UTR，WO2017/036580中涉及3'-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。合适的3'-UTR是WO2017/036580的SEQ IDNO:152至204，或这些序列的片段或变体。在其他实施方式中，治疗性RNA包含WO2016/022914中描述的3'-UTR，WO2016022914中关于3'-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的3'-UTR是根据WO2016/022914的SEQ ID NO:20至36的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在优选实施方式中，使用的组合物的编码RNA包含至少一个异源5'-UTR。
术语“5'-非翻译区”或“5'-UTR”或“5'-UTR元件”将被本领域普通技术人员认识和理解，并且旨在指位于cds的5'(即“上游”)的RNA的一部分，其不翻译成蛋白质。5'-UTR可以是位于cds的5'的RNA的部分。通常，5'-UTR从转录起始位点开始，在cds的起始密码子之前结束。5'-UTR可包含用于控制基因表达的元件，称为调节元件。这样的调节元件可以是例如核糖体结合位点、miRNA结合位点等。5'-UTR可以是转录后修饰的，例如通过酶促或转录后添加5'-帽结构(见上文)。
优选地，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包含5'-UTR，其可衍生自与具有增强的半衰期的RNA相关的基因(即，提供稳定的RNA)。
在一些实施方式中，5'-UTR包括影响细胞内RNA定位稳定性的蛋白质结合位点或一种或多种miRNA或miRNA结合位点中的一个或多个(如上所限定)。
因此，miRNA或上述限定的miRNA的结合位点可以从5'-UTR中去除或引入到5'-UTR，从而使治疗性RNA的表达或活性适应期望的细胞类型或组织。
在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括至少一个异源5'-UTR，其中至少一个异源5'-UTR包含衍生自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因或来自这些基因中任何一个的同源物、片段或变体的人和/或鼠5'-UTR的核酸序列。在这种上下文中，特别优选的核酸序列可以来源于公开的PCT申请WO2019/077001A1，特别是WO2019/077001A1的权利要求9。WO2019/077001A1的权利要求9的相应5'-UTR序列通过引用并入本文(如，WO2019/077001A1的SEQID NO:1-20，或其片段或变体)。
合适地，在优选实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括编码本文指定的至少一种肽或蛋白质的至少一个cds，其可操作地连接至选自以下的5'-UTR/3'-UTR组合的3'-UTR和/或5'-UTR：a-1(HSD17B4/PSMB3)、a-2(NDUFA4/PSMB3)、a-3(SLC7A3/PSMB3)、a-4(NOSIP/PSMB3)、a-5(MP68/PSMB3)、b-1(UBQLN2/RPS9)、b-2(ASAH1/RPS9)、b-3(HSD17B4/RPS9)、b-4(HSD17B4/CASP1)、b-5(NOSIP/COX6B1)、c-1(NDUFA4/RPS9)、c-2(NOSIP/NDUFA1)、c-3(NDUFA4/COX6B1)、c-4(NDUFA4/NDUFA1)、c-5(ATP5A1/PSMB3)、d-1(Rpl31/PSMB3)、d-2(ATP5A1/CASP1)、d-3(SLC7A3/GNAS)、d-4(HSD17B4/NDUFA1)、d-5(Slc7a3/Ndufa1)、e-1(TUBB4B/RPS9)、e-2(RPL31/RPS9)、e-3(MP68/RPS9)、e-4(NOSIP/RPS9)、e-5(ATP5A1/RPS9)、e-6(ATP5A1/COX6B1)、f-1(ATP5A1/GNAS)、f-2(ATP5A1/NDUFA1)、f-3(HSD17B4/COX6B1)、f-4(HSD17B4/GNAS)、f-5(MP68/COX6B1)、g-1(MP68/NDUFA1)、g-2(NDUFA4/CASP1)、g-3(NDUFA4/GNAS)、g-4(NOSIP/CASP1)、g-5(RPL31/CASP1)、h-1(RPL31/COX6B1)、h-2(RPL31/GNAS)、h-3(RPL31/NDUFA1)、h-4(Slc7a3/CASP1)、h-5(SLC7A3/COX6B1)、i-1(SLC7A3/RPS9)、i-2(RPL32/ALB7)、i-2(RPL32/ALB7)、或i-3(α-球蛋白基因/-)。
在该上下文中，如上所限定的合适的5'-UTR序列可以是或可以衍生自SEQ ID NO:44-65，或其片段或变体，并且如上所限定的合适的3'-UTR序列可以是或可以衍生自SEQ IDNOs:66-81、185、186。
在其他实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括WO2013/143700中描述的5'-UTR，WO2013/143700中涉及5'-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5'-UTR是衍生自WO2013/143700的SEQ ID NO:1-1363、SEQ ID NO:1395、SEQ ID NO:1421和SEQ ID NO:1422的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其他实施方式中，治疗性RNA包括WO2016/107877中描述的5'-UTR，WO2016/107877中涉及5'-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5'-UTR是根据WO2016/107877的SEQ ID NO:25至30和SEQ ID NO:319至382的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其他实施方式中，治疗性RNA包括WO2017/036580中描述的5'-UTR，WO2017/036580中涉及5'-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5'-UTR是根据WO2017/036580的SEQ ID NO:1至151的核酸序列，或这些序列的片段或变体。在其他实施方式中，治疗性RNA包括WO2016/022914中描述的5'-UTR，WO2016/022914中涉及5'-UTR序列的公开内容通过引用并入本文。特别优选的5'-UTR是根据WO2016/022914的SEQ ID NO:3至19的核酸序列，或这些序列的片段或变体。
在实施方式中，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，优选地在5'-至3'-方向上包括以下元件：
A)5'-帽结构，优选地m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)；
B)5'-末端起始元件，优选地选自SEQ ID NO:5或6，或其片段或变体；
C)任选地，5'-UTR，优选地如本文所指定，例如选自SEQ ID NO:44至65；
D)核糖体结合位点，优选地选自SEQ ID NO:3或4，或其片段或变体；
E)编码本文所指定的至少一种治疗性肽或蛋白的至少一种编码序列；
F)3'-UTR，优选地如本文所指定，例如选自SEQ ID NO:66至81；
G)任选地，包括约50至约500个腺苷的聚(A)序列；
H)任选地，包括约10至约100个胞嘧啶的聚(C)序列；
I)任选地，组蛋白茎环(序列)，优选地选自SEQ ID NO:1或2；
J)任选地，3'-末端序列元件SEQ ID NO:7至38。
优选地，第一组分的治疗性RNA，优选地mRNA，包括约50至约20000个核苷酸，或约500至约10000个核苷酸，或约1000至约10000个核苷酸，或优选地约1000至约5000个核苷酸。
在一个实施方式，第一组分(如，治疗性RNA)和第二组分(如，核酸拮抗剂)附接至彼此。
有利地，这种附接可以简化载体中的共同配制(见下文所述)。理想地，第一和第二组分通过非共价结合彼此附接以允许在体内施用后分离。因此，本发明还涉及包含本文限定的第一组分和本文限定的第二组分的化合物。
第一和/或第二组分的配制：
在下文中，描述了关于第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的配制/络合的有利实施方式和特征。此外，描述了关于第一组分的至少一种治疗性RNA的配制/络合的有利实施方式和特征。在“组合”(第一方面)的上下文中，所有描述的关于配制的实施方式和特征同样适用于“组合物”(第二方面)或“试剂盒或部分的试剂盒”(第三方面)。
在优选的实施方案中，本文限定的第二组分的核酸和/或本文限定的第一组分的至少一种治疗性RNA与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物，优选地阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白质、或阳离子或聚阳离子肽、或其任意组合络合或缔合或至少部分络合或部分缔合。
在实施方式中，本文限定的第二组分的核酸附接至一种或多种阳离子或聚阳离子化合物，优选地阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白质、或阳离子或聚阳离子肽、或其任意组合。合适地，第二组分的治疗性RNA与这样的阳离子或聚阳离子化合物络合或缔合。
本文所使用的“阳离子或聚阳离子化合物”将被本领域技术人员认识或理解，并且例如旨在指带电荷的分子，其在范围为约1至9的pH值下、在范围为约3至8的pH值下、在范围为约4至8的pH值下、在范围为约5至8的pH值下、更优选地在范围为约6至8的pH值下、甚至更优选地在范围为约7至8的pH值下、最优选地在生理pH(如范围为约7.2至7.5)下带正电荷。因此，阳离子组分，如阳离子肽、阳离子蛋白质、阳离子聚合物、阳离子多糖、阳离子脂质可以是在生理条件下带正电荷的任何带正电荷的化合物或聚合物。“阳离子或聚阳离子肽或蛋白质”可以包含至少一种带正电的氨基酸，或多于一种带正电的氨基酸，如选自Arg、His、Lys或Orn。因此，“聚阳离子”组分也在给定条件下表现出多于一个正电荷的范围内。
阳离子或聚阳离子化合物，特别优选的可以选自阳离子或聚阳离子肽或蛋白质或其片段的以下列表：鱼精蛋白、核仁蛋白(nucleoline)、精胺或亚精胺、或其他阳离子肽或蛋白质，诸如聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-精氨酸、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)，包括HIV-结合肽、HIV-1Tat(HIV)、Tat-衍生的肽、穿透素(Penetratin)、VP22衍生的或类似物肽、HSVVP22(Herpes simplex)、MAP、KALA或蛋白质转导结构域(PTD)、PpT620、富含脯氨酸的肽、富含精氨酸的肽、富含赖氨酸的肽、MPG-肽(一种或多种)、Pep-1、L-低聚物、降钙素肽(一种或多种)、触角足-衍生的肽、pAntp、pIsl、FGF、乳铁蛋白、转运素(Transportan)、Buforin-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT-衍生的肽、SAP、或组蛋白。更优选地，编码RNA与一种或多种聚阳离子，优选地与鱼精蛋白或低聚转染胺，最优选地鱼精蛋白络合。
可以用作第一和/或第二组分的络合剂的进一步优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，如壳聚糖,聚凝胺等；阳离子脂质，如DOTMA、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油基磷脂酰乙醇-胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS、DIMRI、DOTAP、DC-6-14、CLIP1、CLIP6、CLIP9、低聚转染胺；或阳离子或聚阳离子聚合物，如修饰的聚氨基酸，诸如β-氨基酸聚合物或反向聚酰胺等、修饰的聚乙烯，诸如PVP等、修饰的丙烯酸酯，诸如pDMAEMA等、修饰的氨基胺，诸如pAMAM等、修饰的聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺端修饰的1,4丁二醇二丙烯酸酯-co-5-氨基-1-戊醇聚合物等、树枝状大分子，诸如聚丙胺树枝状大分子或基于pAMAM的树枝状大分子等，聚亚胺(一种或多种)，诸如PEI、聚(丙烯亚胺)等、聚烯丙基胺、基于糖骨架的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物、基于葡聚糖的聚合物等，基于硅烷骨架的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物等、由一种或多种阳离子嵌段(如选自上述提到的阳离子聚合物)的组合和一种或多种亲水性或疏水性嵌段(如聚乙二醇)构成的嵌段聚合物；等。
可以用于第一和/或第二组分的络合的优选的阳离子或聚阳离子蛋白质或肽可以衍生自专利申请WO2009/030481或WO2011/02664的式(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x，WO2009/030481或WO2011/026641中涉及上述的公开内容通过引用并入本文。
在各种实施方式中，第一和/或第二组分的一种或多种阳离子或聚阳离子肽选自SEQ ID NO:39至43，或其任意组合。
因此，在优选实施方式中，第二组分的至少一种拮抗剂，优选地核酸，与选自SEQID NO:39至43，或其任意组合的一种或多种阳离子或聚阳离子肽络合或缔合或至少部分络合或部分缔合。
因此，在优选实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，优选地mRNA，与选自选自SEQ ID NO:39至43，或其任意组合的一种或多种阳离子或聚阳离子肽络合或缔合或至少部分络合或部分缔合。
在实施方式中，本文限定的第二组分的核酸与一种或多种阳离子或聚阳离子聚合物络合或缔合或至少部分络合或部分缔合。
在实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA，优选地mRNA，与一种或多种阳离子或聚阳离子聚合物络合或缔合或至少部分络合或部分缔合。
因此，在实施方式中，第一和/或第二组分包括至少一种聚合物载体。
如本文所使用的术语“聚合物载体”将为本领域普通技术人员认识和理解，并且例如旨在指促进另一种化合物(如第一、第二组分)的转运和/或络合的化合物。聚合物载体通常是由聚合物形成的载体。聚合载体可以通过共价或非共价相互作用与其货物(如RNA)结合。聚合物可以基于不同的亚单元，例如共聚物。
该上下文中合适的聚合物载体可以包括，例如，聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸酯、胶原、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、PEG化鱼精蛋白、PEG化PLL和聚乙烯亚胺(PEI)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二甲基-3,3'-二硫代双丙酰亚胺(DTBP)、聚(乙烯亚胺)双氨基甲酸酯(PEIC)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、组氨酸修饰的PLL、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯亚胺(PPI)、聚(氨基胺)(PAMAM)、聚(氨基乙烯亚胺)(SS-PAEI)、三乙烯四胺(TETA)、聚(β-氨基酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)(PHP)、聚(烯丙基胺)、聚(α-[4-氨基丁基]-L-乙醇酸(PAGA)、聚(D,L-乳酸-co-乙醇酸(PLGA)、聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶)、聚(磷腈)(PPZ)、聚(磷酸酯)(PPE)、聚(磷酰胺)(PPA)、聚(N-2-羟基丙基甲基丙烯酰胺)(pHPMA)、聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(pDMAEMA)、聚(2-氨基乙基磷酸丙烯酯)PPE_EA)、半乳糖基化壳聚糖、N-十二烷基化壳聚糖、组蛋白、胶原和葡聚糖-精胺。在一个实施方式中，聚合物可以是惰性聚合物，诸如但不限于PEG。在一个实施方式中，聚合物可以是阳离子聚合物，诸如但不限于PEI、PLL、TETA、聚(烯丙基胺)、聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶)、pHPMA和pDMAEMA。在一个实施方式中，聚合物可以是生物可降解PEI，诸如但不限于DSP、DTBP和PEIC。在一个实施方式中，聚合物可以是生物可降解的，诸如但不限于组氨酸修饰的PLL、SS-PAEI、聚(β-氨基酯)、PHP、PAGA、PLGA、PPZ、PPE、PPA和PPE-EA。
合适的聚合物载体可以是由二硫化物交联的阳离子化合物形成的聚合物载体。二硫化物交联的阳离子化合物可以彼此相同或不同。聚合物载体也可以包含其他组分(如类脂质化合物)。根据本发明使用的聚合物载体可以包括如本文限定的阳离子肽、蛋白质或聚合物和任选地本文限定的其他组分的混合物，其通过二硫键交联(经由-SH基团)。
在该上下文中，根据公开的PCT申请WO2012/013326的式(Ia){(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa')x(Cys)y}和式(lb)Cys{(Arg)l；(Lys)m；(His)n；(Orn)o；(Xaa)x}Cys的聚合物载体是优选的，WO2012/013326中涉及其的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，用于络合至少一种编码RNA的聚合物载体可以衍生自根据公开的PCT申请WO2011/026641的式(L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)的聚合物载体分子，WO2011/026641中涉及其的公开内容通过引用并入本文。
在实施方式中，聚合物载体化合物由肽元件CysArg12Cys(SEQ ID NO:39)或CysArg12(SEQ ID NO:40)或TrpArg12Cys(SEQ ID NO:41)形成，或包括其，或由其组成。在其他实施方式中，聚合物载体化合物由SEQ ID NO:42或43形成，或包括其，或由其组成。
在特别优选的实施方式中，聚合物载体化合物由(R12C)-(R12C)二聚体、(WR12C)-(WR12C)二聚体、或(CR12)-(CR12C)-(CR12)三聚体形成，其中在二聚体(如(WR12C))或三聚体(如(CR12))中的个体肽元件通过-SH基团连接。
在优选实施方式中，第一和/或第二组分的阳离子或聚阳离子聚合物是包括HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH(肽单体的SEQ ID NO:42)的聚乙二醇/肽聚合物和/或包括HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH(肽单体的SEQ ID NO:43)的聚乙二醇/肽聚合物。
在实施方式中，第一和/或第二组分与聚合物载体络合或缔合，并且任选地与公开的PCT申请WO2017/212008A1、WO2017/212006A1、WO2017/212007A1和WO2017/212009A1中描述的至少一种脂质或类脂质络合或缔合，WO2017/212008A1、WO2017/212006A1、WO2017/212007A1和WO2017/212009A1的公开内容通过引用并入本文。
在特别优选的实施方式中，(第一和/或第二组分的)聚合物载体是肽聚合物，优选地以上限定的聚乙二醇/肽聚合物，和脂质，优选地类脂质。
类脂质(或lipidoit)是脂质样化合物，即，具有脂质样物理特性的双亲性化合物。类脂质优选地包括两个或更多个阳离子氮原子和至少两个亲脂性尾。与许多常规阳离子脂质相反，类脂质可以不含可水解连接基团，特别是包括可水解酯、酰胺或氨基甲酸酯基团的连接基团。类脂质的阳离子氮原子可以是可阳离子化或永久阳离子的，阳离子氮的两种类型可以存在于化合物中。在本发明的上下文中，术语脂质被认为也涵盖类脂质。
在本发明的一些实施方式中，类脂质可以包括PEG部分。
合适地，类脂质是阳离子的，其意思是类脂质是可阳离子化或永久阳离子的。在一个实施方式中，类脂质是可阳离子化的，即，其包括一个或多个可阳离子化氮原子，而没有永久阳离子氮原子。在另一实施方式中，类脂质的阳离子氮原子中至少一个是永久阳离子的。任选地，类脂质包括两个永久阳离子氮原子，三个永久阳离子氮原子，或甚至四个或更多个永久阳离子氮原子。
在实施方式中，类脂质可以是选自公开的PCT专利申请WO2017/212009A1的第50-54页的表中提供的类脂质的类脂质的任一种，所述表中提供的特定类脂质以及与其相关的具体公开内容通过引用并入本文。
在优选实施方式中，类脂质可以是选自3-C12-OH、3-C12-OH-cat、3-C12-酰胺、3-C12-酰胺一甲基、3-C12-酰胺二甲基、RevPEG(10)-3-C12-OH、RevPEG(10)-DLin-pAbenozic、3C12酰胺-TMA cat.、3C12酰胺-DMA、3C12酰胺-NH2、3C12酰胺-OH、3C12酯-OH、3C12酯-amin、3C12酯-DMA、2C12Amid-DMA、3C12-lin-amid-DMA、2C12-sperm-amid-DMA、或3C12-sperm-amid-DMA(参见，公开的PCT专利申请WO2017/212009A1的表(表50–54))中任一种。在本发明的上下文中特别优选的类脂质是3-C12-OH或3-C12-OH-cat。
在优选实施方式中，包含如上所指定的类脂质的肽聚合物被用于络合第一组分的至少一种治疗性RNA和/或第二组分的至少一种拮抗剂(如核酸)以形成具有如下N/P比率的络合物：约0.1至约20、或约0.2至约15、或约2至约15、或约2至约12，其中N/P比率定义为阳离子肽或聚合物的碱基基团的氮原子与核酸的磷酸基团的摩尔比。在该上下文中，公开的PCT专利申请WO2017/212009A1的公开内容，特别是WO2017/212009A1的权利要求1至10，以及涉及其的具体公开内容通过引用并入本文。
在具体实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA(优选地mRNA)与聚合物载体络合或缔合(优选地与如上限定的聚乙二醇/肽聚合物)和脂质(优选地3-C12-OH和/或3-C12-OH-cat)络合或缔合。
在具体实施方式中，第二组分的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与聚合物载体络合或缔合(优选地与如上限定的聚乙二醇/肽聚合物)和脂质(优选地3-C12-OH和/或3-C12-OH-cat)络合或缔合。
其他合适的类脂质可源自公开的PCT专利申请WO2010/053572。特别地，可在本发明的上下文中使用源自已公布的PCT专利申请WO2010/053572的权利要求1至297的类脂质，如并入到本文所述的肽聚合物中，或并入到脂质纳米颗粒中(如下所述)。因此，已公布的PCT专利申请WO2010/053572的权利要求1至297以及与之相关的具体公开内容通过引用并入本文。
在优选实施方式中，第一化合物的至少一种治疗性RNA(优选地mRNA)与一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)络合、部分络合，被一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)包封或部分包封，与一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)缔合，由此形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物(lipoplexes)、和/或纳米脂质体。
在优选实施方式中，第二化合物的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)络合、部分络合，被一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)包封或部分包封，与一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)缔合，由此形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物、和/或纳米脂质体。
脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体——掺入的第一化合物的治疗性RNA或第二化合物的拮抗剂(如核酸)——可完全或部分位于脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的内部空间，在膜内，或与膜的外表面缔合。第一化合物的所述RNA或第二化合物的所述拮抗剂的掺入在本文中也称为“包封”，其中限定的治疗性RNA/限定的拮抗剂(如核酸)完全包含在脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体内部空间内。将第一和/或第二组分掺入脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体的目的是保护组分免受可能含有降解如治疗性RNA的酶或化学物质的环境和/或导致治疗性RNA快速排泄的系统或受体影响。此外，将第一和/或第二组分掺入脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物和/或纳米脂质体可促进RNA的摄取，并因此可增强其治疗效果。
在该上下文中，术语“络合”或“缔合”是指本文所限定的第一组分的治疗性RNA，或本文所限定的第二组分的拮抗剂(如核酸)与一种或多种脂质基本上稳定组合为更大的络合物或组装体，而不需要共价结合。
术语“脂质纳米颗粒”，也称为“LNP”，不限于任何特定的形态，并且包括当阳离子脂质和任选地一种或多种其他脂质在如水性环境中和/或存在RNA的情况下组合时产生的任何形态。例如，脂质体、脂质复合物、脂质体复合物等都在LNP的范围内。
脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物、和/或纳米脂质体可以具有不同的尺寸，诸如但不限于多层囊泡(MLV)，其直径可以是数百纳米并且可以包含由窄水性隔室分开的一系列同心双层，小单细胞囊泡(SUV)，其直径可以小于50nm，以及大单细胞囊泡(LUV)，其直径可以在50nm和500nm之间。
本发明的LNP合适地表征为具有通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离的内部水空间的微观囊泡。LNP的双层膜通常由两亲性分子形成，诸如合成或天然来源的脂质，这些脂质可以包括空间分离的亲水性和疏水性结构域。脂质体的双层膜还可以由两亲性聚合物和表面活性剂形成(如，聚合物囊泡(polymerosomes)、非离子表面活性剂囊泡(niosomes)等)。
因此，在优选实施方式中，第一组份的至少一种治疗性RNA和/或第二组分的至少一种拮抗剂(如核酸)与一种或多种脂质络合，由此形成脂质纳米颗粒(LNP)。
LNP通常包括至少一种阳离子脂质和一种或多种赋形剂，其选自中性脂质、带电脂质、类固醇和或聚合物缀合脂质(如PEG化脂质)。本文所限定的至少一种治疗性RNA/本文所限定的至少一种拮抗剂(如核酸)可以包封在LNP的脂质部分中或由LNP的一些或整个脂质部分包围的水性空间中。至少一种治疗性RNA/至少一种拮抗剂(如核酸)或其部分还可以与LNP缔合以及络合。LNP可以包括能够形成核酸附接的颗粒的任何脂质，或其中包封一种或多种核酸的任何脂质。优选地，LNP包括一种或多种阳离子脂质，以及一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和PEG化脂质。
LNP的阳离子脂质可以是可阳离子化的，即，其在pH低于脂质的可离子化基团的pK时被质子化，但是在较高的pH值下逐渐变得中性。在低于pK的pH值下，脂质然后能够与带负电荷的核酸缔合。在某些实施方式中，阳离子脂质包括两性离子脂质，其假设pH值降低时带正电荷。
这样的脂质包括但不限于DSDMA、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰基三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)(也称为N-(2,3-二油酰基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵和1,2-二油基氧-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐)、N-(1-(2,3-二油基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧)丙基胺(DODMA)、ckk-E12、ckk、1,2-二亚油基氧-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-y-亚麻基氧-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、98N12-5、1,2-二亚油基氨基甲酰基氧-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、ICE(咪唑类)、HGT5000、HGT5001、DMDMA、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环)HGT4003、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙烷二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DM A)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸(MC3)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺))、1,1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)十二烷-2-醇(C12-200)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-Nl,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-l,16-二酰胺)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧)-N,N-二甲基丙烷-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)、
Figure BDA0003557920630000471
(市售的包括DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3磷酸乙醇胺(DOPE)的阳离子脂质体，来自GIBCO/BRL,Grand Island,N.Y.)；
Figure BDA0003557920630000472
(市售的包括N-(1-(2,3二油基氧)丙基)-N-(2-(精胺羧氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)的阳离子脂质体，来自GIBCO/BRL)；以及
Figure BDA0003557920630000473
(市售的阳离子脂质，其包括乙醇中的双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)或前述中任一种的任意组合。在本发明的组合物和方法中使用的另外合适的阳离子脂质包括在国际专利申请公开WO2010/053572(并且特别地在第[00225]段处描述的CI 2-200)和WO2012/170930中描述的那些(其两篇通过引用并入本文)、HGT4003、HGT5000、HGTS001、HGT5001、HGT5002(参见US20150140070A1)。
在实施方式中，阳离子脂质可以是氨基脂质。
代表性氨基脂质包括但不限于1,2-二亚油基氧-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧-3吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧-3二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N二亚油基氨基)-1,2-丙烷二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[l,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；二亚油基-甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)；MC3(US20100324120)。
在一个实施方式中，本文限定的至少一种治疗性RNA/本文限定的至少一种拮抗剂(如核酸)可以在氨基醇类脂质中进行配制。可以在本发明中使用的氨基醇类脂质可以通过在美国专利号8,450,298中描述的方法进行制备，其通过引用以其整体并入本文。合适的(离子化)脂质还可以是在公开的PCT专利申请WO2017/075531A1中的表1、2和3所公开以及权利要求1-24中所限定的化合物，具体公开内容通过引用并入本文。
在其他实施方式中，合适的脂质可以选自公开的PCT专利申请WO2015/074085A1(即，ATX-001至ATX-032或权利要求1-26中指定的化合物)、美国申请号61/905,724以及15/614,499或美国专利号9,593,077和9,567,296，其通过引用并入本文。
在其他实施方式中，合适的阳离子脂质可以选自公开的PCT专利申请WO2017/117530A1(即，脂质13、14、15、16、17、18、19、20，或权利要求中指定的化合物)，其具体公开内容通过引用并入本文。
在优选实施方式中，可离子化脂质/阳离子脂质还可以选自公开的PCT专利申请WO2018/078053A1中公开的脂质(即，衍生自WO2018/078053A1的式I、II和III的脂质，或WO2018/078053A1的权利要求1至12中所指定的脂质)，WO2018/078053A1中涉及其的具体公开内容通过引用并入本文。在该上下文中，在WO2018/078053A1的表7中公开的脂质(如，衍生自式I-1至I-41的脂质)和在WO2018/078053A1的表8中公开的脂质(如，衍生自式II-1至II-36的脂质)可以合适地用于本发明的上下文中。因此，WO2018/078053A1的式I-1至式I-41以及式II-1至式II-36，以及涉及其的具体公开内容通过引用并入本文。
在优选实施方式中，阳离子脂质可以衍生自公开的PCT专利申请WO2018/078053A1的式III。因此，WO2018/078053A1的式III，以及涉及其的具体公开内容通过引用并入本文。
在特别优选的实施方式中，本文限定的至少一种治疗性RNA/本文限定的拮抗剂(如核酸)与一种或多种脂质络合，由此形成LNP，其中LNP的阳离子脂质选自公开的PCT专利申请WO2018/078053A1的表9的结构III-1至III-36。因此，WO2018/078053A1的式III-1至III-36，以及涉及其的具体公开内容通过引用并入本文。
在特别优选的实施方式中，本文限定的至少一种治疗性RNA/本文限定的拮抗剂(如核酸)与一种或多种脂质络合，由此形成LNP，其中LNP包括以下阳离子脂质：
Figure BDA0003557920630000481
在某些实施方式中，阳离子脂质(如III-3)相对于LNP的总脂质含量以约30至约95mol％的量存在于LNP中。如果在LNP内掺入多于一种阳离子脂质，那么这样的百分比适用于组合的阳离子脂质。
其他合适的(阳离子或可离子化)脂质被公开在公开的专利申请WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、WO 2013/063468、US2011/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2017/070613、WO2017/070620、WO2017/099823、WO2012/040184、WO2011/153120、WO2011/149733、WO2011/090965、WO2011/043913、WO2011/022460、WO2012/061259、WO2012/054365、WO2012/044638、WO2010/080724、WO2010/21865、WO2008/103276、WO2013/086373、WO2013/086354、和美国专利号7,893,302、7,404,969、8,283,333、8,466,122和8,569,256以及美国专利公开号US2010/0036115、US2012/0202871、US2013/0064894、US2013/0129785、US2013/0150625、US20130178541、US2013/0225836、US2014/0039032和WO2017/112865中。在该上下文中，WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、WO2013/063468、US2011/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2017/070613、WO2017/070620、WO2017/099823、WO2012/040184、WO2011/153120、WO2011/149733、WO2011/090965、WO2011/043913、WO2011/022460、WO2012/061259、WO2012/054365、WO2012/044638、WO2010/080724、WO2010/21865、WO2008/103276、WO2013/086373、WO2013/086354、美国专利号7,893,302、7,404,969、8,283,333、8,466,122和8,569,256和美国专利公开号US2010/0036115、US2012/0202871、US2013/0064894、US2013/0129785、US2013/0150625、US20130178541、US2013/0225836和US2014/0039032和WO2017/112865中具体地涉及适合用于LNP的(阳离子)脂质的的公开内容通过引用并入本文。
LNP可以包括两种或更多种(不同的)阳离子脂质。阳离子脂质可以被选择以贡献不同的有利性质。如，可以在LNP中使用性质不同的阳离子脂质，所述性质诸如胺pKa、化学稳定性、循环中的半衰期、组织中的半衰期、组织中的净积累、毒性或免疫刺激。
LNP在体内的特性和行为可以通过向LNP表面添加亲水性聚合物涂层(如如聚乙二醇(PEG))来修饰，以赋予其空间稳定。此外，LNP可用于通过附接配体(如，抗体、肽和碳水化合物)而特异性靶向其表面或附接的PEG链的末端(如经由PEG化脂质或PEG化胆固醇)。
在一些实施方式中，这类PEG链可以用于附接本发明的拮抗剂。
在一些实施方式中，LNP包括聚合物缀合的脂质。术语“聚合物缀合的脂质”是指包括脂质部分和聚合物部分两者的分子。聚合物缀合的脂质的例子是PEG化脂质。术语“PEG化脂质”是指包括脂质部分和聚乙二醇部分两者的分子。PEG化脂质在本领域是已知的并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)等。
在各种实施方式中，LNP包括稳定脂质，其是聚乙二醇-脂质(PEG化脂质)。合适的聚乙二醇-脂质包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG-修饰的修饰的磷脂酸、PEG-修饰的神经酰胺(如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油、PEG-修饰的二烷基甘油。代表性聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA、PEG-s-DMG、PEG-DMG、PEG-DSG、PEG-DSPE、PEG-DOMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在优选的实施方式中，聚乙二醇-脂质是PEG-2000-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG)。在其他实施方式中，LNP包括PEG化二酰基甘油(PEG-DAG)，诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)，诸如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、PEG化神经酰胺(PEG-cer)、或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，诸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在优选实施方式中，PEG化脂质优选地衍生自公开的PCT专利申请WO2018/078053A1的式(IV)。因此，衍生自公开的PCT专利申请WO2018/078053A1的式(IV)的PEG化脂质，以及涉及其的各自的公开内容通过引用并入本文。
在特别优选的实施方式中，第一组分的治疗性RNA和/或第二组分的至少一种拮抗剂与一种或多种脂质络合，由此形成LNP，其中LNP包括PEG化脂质，其中PEG脂质优选地衍生自公开的PCT专利申请WO2018/078053A1的式(IVa)。因此，衍生自公开的PCT专利申请WO2018/078053A1的式(IVa)的PEG化脂质，以及涉及其的各自的公开内容通过引用并入本文。
在特别优选地实施方式中，PEG脂质具有式(IVa)：
Figure BDA0003557920630000501
其中n的平均值范围为30至60，诸如约30±2、32±2、34±2、36±2、38±2、40±2、42±2、44±2、46±2、48±2、50±2、52±2、54±2、56±2、58±2或60±2。在最优选的实施方式中，n是约49。
在该上下文中合适的PEG脂质的另外实例提供在US2015/0376115A1和WO2015/199952中，其中每篇通过引用以其全部并入本文。
在一些实施方式中，基于LNP中脂质的总摩尔，LNP包括小于约3、2或1mol％的PEG或PEG-修饰的脂质。在另外的实施方式中，以摩尔为基础，LNP包括约0.1％至约20％的PEG-修饰的脂质。在优选实施方式中，以摩尔为基础，LNP包括约1.0％至约2.0％的PEG-修饰的脂质。在各种实施方式中，阳离子脂质与PEG化脂质的摩尔比的范围为约100:1至约25:1。
在优选实施方式中，LNP包括在颗粒形成期间或制造过程期间稳定颗粒的形成的一种或多种另外的脂质(如，中性脂质和/或一种或多种类固醇或类固醇类似物)。
在优选实施方式中，LNP包括一种或多种中性脂质和/或一种或多种类固醇或类固醇类似物。
合适的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。术语“中性脂质”是指在生理pH下以未带电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质种类中的任一种。代表性中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂、和脑苷脂。
在实施方式中，LNP包括一种或多种中性脂质，其中中性脂质选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)、或其组合。
在一些实施方式中，LNP包括选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在各种实施方式中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比的范围为约2:1至约8:1。在优选实施方式中，中性脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。阳离子脂质与DSPC的摩尔比范围可以在约2:1至8:1的范围。在优选实施方式中，类固醇是胆固醇。阳离子脂质与胆固醇的摩尔比可以在约2:1至1:1的范围。在一些实施方式中，胆固醇可以被PEG化。
在特别优选的实施方式中，脂质是为或衍生自式III，优选地III-3的脂质化合物，中性脂质是DSPC，类固醇是胆固醇，以及PEG化脂质是式(IVa)的化合物。
在优选的实施方式中，脂质体、脂质纳米颗粒、脂质体复合物和/或纳米脂质体优选地包括或由以下构成：(i)至少一种阳离子脂质；(ii)至少一种中性脂质；(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物；和(iv)至少一种聚集减少脂质，其中优选地，(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇、和0.5-15％PEG-脂质。
在具体实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA和/或第二组分的至少一种拮抗剂(如核酸)与一种或多种脂质络合，由此形成LNP，其中LNP包括：
(i)本文所限定的至少一种阳离子脂质，优选地脂质III-3；
(ii)本文所限定的至少一种中性脂质，优选地1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)本文所限定的至少一种类固醇或类固醇类似物，优选地胆固醇；和
(iv)本文所限定的至少一种PEG-脂质，如PEG-DMG或PEG-cDMA，优选地式(IVa)的PEG化脂质，其中优选地(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质、5-25％中性脂质、25-55％固醇；0.5-15％PEG-脂质。
在特别优选的实施方式中，第一组分的至少一种治疗性RNA和/或第二组分的至少一种拮抗剂(如核酸)与一种或多种脂质络合，由此形成LNP，其中LNP的摩尔比为大约50:10:38.5:1.5，优选地47.5:10:40.8:1.7，或更优选地47.4:10:40.9:1.7(即，阳离子脂质(优选地脂质III-3)、DSPC、胆固醇和PEG-脂质((优选地式(IVa)的PEG-脂质，n＝49)的比例(mol％)；溶解在乙醇中)。
在各种实施方式中，本文所限定的LNP的平均直径为约50nm至约200nm、约50nm至约150nm、或约50nm至约100nm。如本文所使用，平均直径可由本领域公知的动态光散射确定的z-平均值表示。LNP的多分散性指数(PDI)合适地在0.1至0.5的范围中。在特定实施方式中，PDI在0.2以下。通常，PDI通过本领域公知的动态光散射确定。
在优选实施方式中，组合的施用(优选地第一组分和第二组分的施用)基本上是同时的。
在该上下文中，“同时”必须被理解为组合的第一和第二组分的施用可以同时发生，而不是以时间交错的方式发生。所述同时施用可以是相同的施用部位/施用途径或不同的施用部位/施用途径，如下文进一步概述。
在其他优选实施方式中，组合的施用(优选地第一组分和第二组分的施用)是顺序的。
在上下文中，“顺序”必须理解为组合的第一和第二组分的施用可以时间交错的方式发生而不是同时发生。所述“顺序”施用可以是相同的施用部位或不同的施用部位，如下文进一步概述。
在优选实施方式中，组合的施用(即第一组分和/或第二组分的施用)(顺序或同时)进行多于一次，例如每天一次或多于一次，每周一次或多于一次，每月一次或多于一次。有利地，本发明的组合适用于重复施用，例如长期施用。
组合可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、向颊地、阴道或通过植入的储库施用。如本文所使用，术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内、眼内、玻璃体内、视网膜下、瘤内。
在特别优选的实施方式中，组合的施用(特别是第一组分和/或第二组分的施用)(顺序或同时)静脉内进行。在特别优选的实施方式中，组合作为长期治疗静脉内施用(如，多于一次，例如每天一次或多于一次，每周一次或多于一次，每月一次或多于一次)。
在特别优选的实施方式中，组合的特征在于以下特征：
(I)本文限定的至少一种第一组分，优选地编码治疗性肽或蛋白质(如抗体、酶、抗原)的mRNA，其中任选地，所述mRNA不包括修饰的核苷酸，其中所述mRNA包括Cap1结构(优选地，通过共转录加帽可获得的)，其中所述第一组分在脂质纳米颗粒中或在聚乙二醇/肽聚合物中进行配制。
(II)本文限定的至少一种第二组分，优选地单链RNA寡核苷酸，其包括至少一个2'-O-甲基化RNA核苷酸，优选地包括根据式I的核酸序列，其中所述第二组分在脂质纳米颗粒中或在聚乙二醇/肽聚合物中进行配制。
在一些实施方式中，例如，与单独施用相应的第一组分相比，将所述组合施用至细胞、组织或生物体导致表达增加。
特别地，(先天)免疫刺激的减少促进了第一组分的翻译。
组合物
在第二方面，本发明提供了组合物，其包含本文限定的的第一组分和本文限定的第二组分。
在优选实施方式中，药物组合物包括或由以下组成：
(i)至少一种治疗性RNA；
(ii)至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂，和
任选地，至少一种药学上可接受的载体。
优选地，至少一种性RNA如在组合的上下文中作为“第一组分”所描述，和至少一种拮抗剂如在组合的上下文中作为“第二组分”所描述。因此，上述与组合的第一组分有关的实施方式(在第一方面的上下文中)也适用于组合物的至少一种治疗性RNA。此外，与上述组合的第二组分有关的实施方式(在第一方面的上下文中)也适用于组合物的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂。
在优选实施方式中，第二方面的药物组合物由在第一方面的上下文中限定的组合，以及任选地至少一种药学上可接受的载体组成，或包括在第一方面的上下文中限定的组合，以及任选地至少一种药学上可接受的载体。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”优选地包括第一和/或第二组分的液体或非液体基础。如果第一和/或第二组分以液体形式提供，则载体可以是水，如无热原水；等渗盐水或缓冲(水性)溶液，如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。可以使用水或优选地缓冲液，更优选地水性缓冲液，其含有钠盐(优选地至少50mM的钠盐)、钙盐(优选地至少0.01mM的钙盐)、和任选地钾盐(优选地至少3mM的钾盐)。根据优选的实施方式，钠盐、钙盐和任选地钾盐可以其卤化物的形式(如氯化物、碘化物、或溴化物)，以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、或硫酸盐等的形式出现。钠盐的实例包括NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，任选的钾盐的实例包括KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，和钙盐的实例包括CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。值得注意的是，合适的药学上可接受的载体是指不干扰本文限定的第一和/或第二组分、组合或组合物的有效性并且与诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体等的生物系统相容的物质。
本发明的药物组合物的进一步有利的实施方式和特征描述如下。值得注意的是，在药物组合物的上下文中描述的实施方式和特征同样可以适用于第一方面的组合和/或第三方面的试剂盒或部分的试剂盒。
因此，药物组合物包括或由以下组成：
(i)至少一种治疗性RNA，其中至少一种治疗性RNA是第一方面的上下文中所限定的“第一组分”；
(ii)至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂，其中至少一种拮抗剂第一方面的上下文中所限定的“第二组分”和
任选地，至少一种药学上可接受的载体，优选地如上所限定的药学上可接受的载体。
在优选实施方式中，药物组合物包括或由以下组成：
(i)至少一种治疗性RNA，其中至少一种治疗性RNA是“第一组分”；
(ii)至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂，其中至少一种拮抗剂是“第二组分”，优选地核酸；
所述组合物合适地包含安全且有效量的本文所指定的治疗性RNA。如本文所使用，“安全且有效量”是指足以导致施用后编码的蛋白质的表达和/或活性的治疗性RNA(优选地mRNA)的量。同时，“安全且有效量”小到足以避免施用所述治疗性RNA引起的严重副作用。
另外，组合物合适地包含安全且有效量的本文所指定的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂(优选地核酸)。如本文所使用，“安全且有效量”是指足以导致施用后拮抗至少一种RNA感知模式识别受体的拮抗剂(优选地核酸)的量。同时，“安全且有效量”小到足以避免施用所述拮抗剂引起的严重副作用。
此外，组合物的第一和第二组分的“安全且有效量”将随着待治疗的具体病症以及待治疗的患者的年龄和身体状况、病症的严重程度、治疗的持续时间、伴随疗法的性质、使用的特定药学上可接受的载体的性质等而改变。此外，本文所述的第一和第二组分的“安全且有效量”可能取决于施加途径(如静脉内、肌肉内)、施加装置(针注射、注射装置)和/或络合/制剂(如，与聚合物载体或LNP缔合的RNA)。此外，组合物的“安全且有效量”可能取决于治疗对象(婴儿、免疫功能低下的人类对象等)的状况。
在本发明的上下文中，“组合物”是指任何类型的组合物，其中可以掺入指定成分(如本文限定的第一组分，如本文限定的mRNA和/如本文限定的第二组分，如核酸)，任选地连同任何其他成分，通常与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。组合物可以是干燥组合物(诸如粉末或颗粒)或固体单元(诸如冻干形式)。组合物可以是液体形式，并且每种成分可以独立地以溶解或分散(如悬浮或乳化)形式掺入。
如本文所使用，术语“受试者”、“患者”或“个体”通常包括人类和非人类动物和优选地哺乳动物，包括嵌合体和转基因动物模型和疾病模型。预期施用组合物(优选地药物组合物)的对象包括但不限于人类和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、羊、猫、狗；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，诸如鸟类、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。优选地，术语“受试者”是指非人类灵长动物或人类，最优选地人类。
在优选实施方式中，“需要治疗的受试者”或“有需要的受试者”在本发明的上下文中是人类受试者。
在实施方式中，组合物可以包括多种或至少多于一种的如上限定的治疗性RNA种类，其中每种治疗性RNA种类(如每种mRNA种类)可以编码限定的不同的治疗性肽或蛋白质。
在实施方式中，组合物包括多于一种或多种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种)不同的如上限定的第一组分的治疗性RNA种类。
如本文所使用，术语“RNA种类”并非旨在仅指一种单一分子。术语“RNA种类”必须被理解为基本上相同的RNA分子的集合，其中RNA集合的每个RNA分子(换言之RNA种类的每个分子)编码具有基本相同的核酸序列的相同的治疗性蛋白质(在治疗性RNA是编码RNA的实施方式中)。然而，RNA集合的RNA分子的长度或质量可能不同，这可能是由酶促或化学制造过程引起的。
在实施方式中，组合物包含多于一种或多种不同的第一组分的治疗性RNA种类，其中多于一种或多种不同的治疗性RNA种类选自各自编码不同蛋白质的编码RNA种类。
在实施方式中，组合物包含多于一种或多种不同的第一组分的治疗性RNA种类，其中多于一种或多种不同的治疗性RNA种类中至少一种选自编码RNA种类(如，编码CRISPR相关的内切核酸酶的mRNA)，和至少一种选自非编码RNA种类(如，指导RNA)。
在实施方式中，组合物包含多于一种或多种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种)不同的如上所限定的第二组分的拮抗剂(优选地核酸种类)。
如本文所使用，术语“核酸种类”并非旨在仅指一种单一核酸分子。在第二组分的上下文中术语“核酸种类”必须被理解为基本上相同的核酸分子的集合，其中这类集合的每个核酸分子具有基本相同的核酸序列。
在优选实施方式中，组合物包括第一组分的治疗性RNA(优选地mRNA)和第二组分的拮抗剂(优选地核酸)，其中所述第一组分和/或所述第二组分与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物(优选地阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白质、或阳离子或聚阳离子肽，或其任意组合)络合或缔合，或至少部分络合或部分缔合。如本文所限定的与载体的络合/缔合(“配制”)促进治疗性RNA和/或拮抗剂被细胞摄取。
本文所使用的术语“阳离子或聚阳离子化合物”将被本领域技术人员认识和理解，并且例如旨在指带电荷的分子，其在范围约1至9的pH值下、在范围约3至8的pH值下、在范围约4至8的pH值下、在范围约5至8的pH值下、更优选地在范围约6至8的pH值下、甚至更优选地在范围约7至8的pH值下、最优选地在生理pH(如范围约7.2至7.5)下带正电荷。因此，阳离子组分(如阳离子肽、阳离子蛋白质、阳离子聚合物、阳离子多糖、阳离子脂质(包括类脂质))可以是在生理条件下带正电荷的任何带正电荷的化合物或聚合物。“阳离子或聚阳离子肽或蛋白质”可以含有至少一种带正电荷的氨基酸或多于一种带正电荷的氨基酸，如选自Arg、His、Lys或Orn。因此，“聚阳离子”组分也在给定条件下表现出多于一个正电荷的范围内。
在该上下文中特别优选的阳离子或聚阳离子化合物可以选自阳离子或聚阳离子肽或蛋白质或其片段的以下的列表：鱼精蛋白、核仁蛋白、精胺或亚精胺、或其他阳离子肽或蛋白质，诸如聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-精氨酸、碱性多肽、细胞穿透肽(CPP)，包括HIV-结合肽、HIV-1Tat(HIV)、Tat-衍生的肽、穿透素、VP22衍生的或类似物肽、HSV VP22(Herpessimplex)、MAP、KALA或蛋白质转导结构域(PTD)、PpT620、富含脯氨酸的肽、富含精氨酸的肽、富含赖氨酸的肽、MPG-肽(一种或多种)、Pep-1、L-低聚物、降钙素肽(一种或多种)、触角足-衍生的肽、pAntp、pIsl、FGF、乳铁蛋白、转运素、Buforin-2、Bac715-24、SynB、SynB(1)、pVEC、hCT-衍生的肽、SAP、或组蛋白。
可以用作转染剂或络合剂的进一步优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，例如壳聚糖、聚凝胺等；阳离子脂质，如DOTMA、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPC、DODAP、DOPE：二油基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC、DOGS、DIMRI、DOTAP、DC-6-14、CLIP1、CLIP6、CLIP9、低聚转染胺；或阳离子或聚阳离子聚合物，如修饰的聚氨基酸，诸如β-氨基酸-聚合物或反向聚酰胺等，修饰的聚乙烯，诸如PVP等，修饰的丙烯酸酯，诸如pDMAEMA等，修饰的氨基胺，诸如pAMAM等，修饰的聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺端修饰的1,4丁二醇二丙烯酸酯-co-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状大分子，诸如聚丙胺树枝状大分子或基于pAMAM的树枝状大分子等，聚亚胺(一种或多种)，诸如PEI、聚(丙烯亚胺)等、聚烯丙基胺、基于糖骨架的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物、基于葡聚糖的聚合物等，基于硅烷骨架的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物等、由一种或多种阳离子嵌段(如选自上述提到的阳离子聚合物)的组合和一种或多种亲水性或疏水性嵌段(如聚乙二醇)构成的嵌段聚合物；等。
在实施方式中，包括至少一种治疗性RNA和至少一种拮抗剂的组合物单独地进行配制。因此，第一组分(如在第一方面中限定的)和第二组分(如在第一方面中限定的)可以作为单独的实体进行配制(络合/缔合)。组分的配制/络合可以相同(如两种组分络合在聚合物载体中)或可以不同(如一种组分包封在LNP中，另一种组分络合在聚合物颗粒中)。
在实施方式中，包括至少一种治疗性RNA和至少一种拮抗剂的组合物共配制。因此，第一组分(如在第一方面中限定的)和第二组分(如在第一方面中限定的)可以作为一个实体进行配制(络合/缔合)。在这些实施方式中，组分的配制/络合可以相同(如两种组分在LNP中)。
在优选实施方式中，至少一种治疗性RNA和至少一种拮抗剂共配制以增加在一个颗粒中存在两者的可能性，以确保至少一种治疗性RNA和至少一种拮抗剂被同一细胞摄取。
在该上下文中，用于配制的合适的阳离子或聚阳离子化合物可以选自在第一方面的上下文中限定的任何一种。组合物的第一和第二组分可以与相同的阳离子或聚阳离子化合物络合或缔合，或与不同的阳离子或聚阳离子化合物络合或缔合。在优选实施方式中，组合物的第一和第二组分可以在相同的阳离子或聚阳离子化合物内络合或缔合(即，“共配制”)。在其他实施方式中，组合物的第一和第二组分可以在不同的阳离子或聚阳离子化合物内络合或缔合。
在组合物的优选实施方式中，(第一和/或第二组分的)聚合物载体是肽聚合物(优选地如上限定的聚乙二醇/肽聚合物)，和脂质(优选地类脂质)。在优选实施方式中，组合物的第一和第二组分可以在相同的聚合物化合物内络合或缔合(即，“共配制”)。在其他实施方式中，组合物的第一和第二组分可以在不同的聚合物化合物内络合或缔合(即，“单独地配制”)。
在组合物的优选实施方式中，第一化合物的至少一种治疗性RNA(优选地mRNA)与一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)络合、部分络合，被一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)包封或部分包封，或与一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)缔合，由此形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物(lipoplexes)、和/或纳米脂质体，和/或第二化合物的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)络合、部分络合，被一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)包封或部分包封，或与一种或多种脂质(如阳离子脂质和/或中性脂质)缔合，由此形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物、和/或纳米脂质体。
合适的脂质体/脂质纳米颗粒可以源自第一方面的上下文中提供的公开内容。
组合物的第一和第二组合物可以在相同脂质纳米颗粒内络合或缔合，或与不同的脂质纳米颗粒络合或缔合。在优选实施方式中，组合物的第一和第二组分可以在相同脂质纳米颗粒内络合或络合(即，“共配制”)。如上所述，共配制增加在一个颗粒中存在两者的可能性，以确保至少一种治疗性RNA和至少一种拮抗剂被同一细胞摄取。
在组合物的优选实施方式中，第一化合物的至少一种治疗性RNA是mRNA，和第二化合物的至少一种拮抗剂是RNA寡核苷酸，其在本文限定的脂质体/脂质纳米颗粒中共配制。
在组合物(或组合)的实施方式中，本文限定的第二组分的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与第一组分的至少一种治疗性RNA的摩尔比范围为约1:1至约100:1，或范围为约20:1至约80:1。
在组合物(或组合)的优选实施方式中，本文限定的第二组分的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与第一组分的至少一种治疗性RNA的摩尔比范围为约200:1至约1:1、或约100:1至约1:1、或约90:1至约1:1、或约80:1至约1:1、或约70:1至约1:1、或约60:1至约1:1、或约50:1至约1:1、或约40:1至约1:1、或约30:1至约1:1、或约20:1至约1:1、或约10:1至约1:1、或约5:1至约1:1、或约4:1至约1:1、或约3:1至约1:1、或约2:1至约1:1，或范围为约1:1至约1:200、或约1:1至约1:100、或约1:1至约1:90、或约1:1至约1:80、或约1:1至约1:70、或约1:1至约1:60、或约1:1至约1:50、或约1:1至约1:40、或约1:1至约1:30，或范围为约1:1至约1:20，或范围为约1:1至约1:10，或范围为约1:1至约1:5，或范围为约1:1至约1:4，或范围为约1:1至约1:3，或范围为约1:1至约1:2。
在组合物的具体实施方式中，本文限定的第二组分的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与第一组分的至少一种治疗性RNA的摩尔比为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1，或1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50；1:59、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100。
在组合物(或组合)的实施方式中，本文限定的第二组分的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与第一组分的至少一种治疗性RNA的重量-重量比范围为约1:1至约1:30，或范围为约1:2至约1:20。
在组合物(或组合)的优选实施方式中，本文限定的第二组分的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与第一组分的至少一种治疗性RNA的重量-重量比范围为约1:1至约1:20、或约1:1至约1:15、或约1:1至约1:10、或约1:1至约1:9、或约1:1至约1:8、或约1:1至约1:7、或约1:1至约1:6、或约1:1至约1:5、或约1:1至约1:4、或约1:1至约1:3、或约1:1至约1:2，或范围为约10:1至约1:1、或约9:1至约1:1、或约8:1至约1:1、或约7:1至约1:1、或约6:1至约1:1、或约5:1至约1:1、或约4:1至约1:1、或约3:1至约1:1、或约2:1至约1:1。
在组合物的具体实施方式中，本文限定的第二组分的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与第一组分的至少一种治疗性RNA的重量-重量比为约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50，或2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1。
特别优选的是，本文限定的第二组分的至少一种拮抗剂(优选地核酸)与第一组分的至少一种治疗性RNA的重量-重量比范围为约1:2至约1:20，具体地约1:5、1:10、或1:15。
因此，组合物或组合中的第二组分的至少一种拮抗剂(具体地核酸)的质量的百分比(总核酸的质量％)占40％、35％、30％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％。
在组合物(或组合)的实施方式中，第一化合物的治疗性RNA以如下量提供：约20ng至约1000μg、约0.2μg至约1000μg、约0.2μg至约900μg、约0.2μg至约800μg、约0.2μg至约700μg、约0.2μg至约600μg、约0.2μg至约500μg、约0.2μg至约400μg、约0.2μg至约300μg、约0.2μg至约100μg、约0.2μg至约100μg、约0.2μg至约80μg、约0.2μg至约60μg、约0.2μg至约40μg、约0.2μg至约20μg、约0.2μg至约10μg、约0.2μg至约5μg、约0.2μg至约2μg，具体地以如下的量提供：约0.2μg、约0.4μg、约0.6μg、约0.8μg、约1μg、约1.2μg、约1.4μg、约1.6μg、约1.8μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg、约12μg、约14μg、约16μg、约18μg、约20μg、约40μg、约60μg、约80μg、约100μg。
在组合物(或组合)的实施方式中，第一化合物的治疗性RNA以如下量提供：约20μg至约200mg、约0.2mg至约200mg、约0.2mg至约180mg、约0.2mg至约160mg、约0.2mg至约140mg、约0.2mg至约120mg、约0.2mg至约100mg,0.2mg至约80mg、约0.2mg至约60mg、约0.2mg至约50mg、约0.2mg至约40mg、约0.2mg至约30mg、约0.2mg至约20mg、约0.2mg至约10mg、约1mg至约10mg，具体地以如下的量提供：约0.2mg、约0.4mg、约0.6mg、约0.8mg、约1mg、约1.2mg、约1.4mg、约1.6mg、约1.8mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约11mg、约12mg、约14mg、约16mg、约18mg、约20mg、约40mg、约60mg、约80mg、约100mg。
在组合物(或组合)的实施方式中，第二化合物的拮抗剂(优选地核酸)以如下量提供：约1ng至约50μg、2ng至约100μg、约2ng至约80μg,2ng至约60μg、约2ng至约40μg、约2ng至约20μg、约2ng至约10μg、约2ng至约5μg、约2ng至约2μg，具体地以如下的量提供：约2ng、约4ng、约6ng、约8ng、约10ng、约12ng、约14ng、约16ng、约18ng、约20ng、约30ng、约40ng、约50ng、约60ng、约70ng、约80ng、约90ng、约100ng、约110ng、约140ng、约160ng、约180ng、约200ng、约400ng、约600ng、约800ng、约1000ng。
在组合物(或组合)的实施方式中，第二化合物的拮抗剂(优选地核酸)以如下量提供：约2μg至约20mg、约20μg至约20mg、约20μg至约18mg、约20μg至约16mg、约20μg至约14mg、约20μg至约12mg、约20μg至约10mg、约20μg至约8mg、约20μg至约6mg、约20μg至约4mg、约20μg至约2mg、约20μg至约1mg，具体地以如下的量提供：约2μg、约4μg、约6μg、约8μg、约10μg、约12μg、约14μg、约16μg、约18μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约110μg、约140μg、约160μg、约180μg、约200μg、约400μg、约600μg、约800μg、约1000μg。
在优选实施方式中，组合物包括约20ng至约100μg第一化合物的治疗性RNA，优选地如本文限定的mRNA，和约0.2ng至约10μg第二化合物的拮抗剂，优选地如本文限定的核酸拮抗剂。
在其他优选的实施方式中，组合物包括约200μg至约200mg第一化合物的治疗性RNA，优选地如本文限定的mRNA，和约20μg至约20mg第二化合物的拮抗剂，优选地如本文限定的核酸拮抗剂。
在优选的实施方式中，包含第一和第二组分的组合物在林格或林格-乳酸溶液中施用。
在优选实施方式中，与仅施用相应的第一组分相比，向细胞、组织或生物体施用组合物导致(包含在所述组合物中的)第一组分的治疗性RNA的活性增加或延长或至少相当。
在该上下文中，术语“活性”的含义取决于第一组分的治疗性RNA的治疗方式。因此，“活性”与第一成分的治疗性RNA的治疗效果密切相关。在治疗性RNA是编码RNA的实施方式中，“活性”必须被理解为表达，如在施用至细胞、组织或生物体之后发生的蛋白质表达，其中蛋白质由施用的编码RNA(如，mRNA)的cds提供。在治疗性RNA是编码抗原的编码RNA的实施方式中，“活性”必须理解为表达，如在施用至细胞、组织或生物体后发生的蛋白质表达，其中蛋白质由施用的编码RNA(如，mRNA)提供和/或提供至诱导抗原特异性免疫应答(如B细胞应答和/或T细胞应答)。
在特别优选的实施方式中，与施用相应的第一组分作为对照相比，将组合物施用至细胞、组织或生物体导致(包含在组合物中的)第一组分的治疗性RNA的活性增加或延长。
在其他特别优选的实施方式中，与施用相应的第一组分作为对照(其中RNA包含修饰的核苷酸并具有相同的RNA序列)相比，将组合物施用至细胞、组织或生物体导致所述组合物中包含的第一组分的治疗性RNA(包含非修饰的的核苷酸)的活性增加或延长。
因此，在组合物的优选实施方式中，治疗性RNA(或相应的对照)的活性是表达，优选地蛋白质表达，优选地编码治疗性RNA(如治疗性mRNA)的蛋白质表达。表达可以如第一方面的上下文中所限定进行确定。
在优选实施方式中，与施用治疗性RNA或第一组分作为对照相比，将组合物施用至细胞、组织或生物体导致(先天)免疫刺激减少。
在进一步优选的实施方式中，与施用包括修饰的核苷酸(如本文所限定)并具有相同的RNA序列的对照RNA相比，施用组合物至细胞、组织或生物体导致基本上相同或至少相当的(先天)免疫刺激。
优选地，组合物的减少的免疫刺激是选自以下的至少一种细胞因子的水平降低：Rantes、MIP-1α、MIP-1β、McP1、TNFα、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL-12、IL-6、或IL-8。细胞因子水平可以如第一方面的上下文中所限定进行确定。
在优选实施方式中，组合物的施用进行多于一次，例如每天一次或多于一次、每周一次或多于一次、每月一次或多于一次。有利地，本发明的组合物适用于重复施用，例如长期施用。
组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、向颊地、阴道或通过植入的储库施用。如本文所使用，术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内、眼内、玻璃体内、视网膜下、瘤内。
在特别优选的实施方式中，组合物的施用静脉内进行。在特别优选的实施方式中，组合物作为长期治疗静脉内施用(如，多于一次，例如每天一次或多于一次，每周一次或多于一次，每月一次或多于一次)。
在特别优选的实施方式中，药物组合物包括：
(I)至少一种第一组分，优选地编码治疗性肽或蛋白质(如抗体、酶、抗原)的至少一种mRNA，其中优选地所述mRNA任选地不包括修饰的核苷酸，其中所述mRNA包括Cap1结构(优选地通过共转录加帽可获得的；和
(II)至少一种第二组分，优选地包括至少一个2'-O-甲基化RNA核苷酸(优选地包括根据式I的核酸序列)的至少一种单链RNA寡核苷酸；和
其中，优选地，组合物的所述第一组分和所述第二组分在本文限定的脂质纳米颗粒中共配制，或在本文限定的聚乙二醇/肽聚合物中共配制。
试剂盒或部分的试剂盒
在第三方面，本发明提供了一种试剂盒或部分的试剂盒，其优选地保护组合的各个组分(如在第一方面的上下文中所限定)和/或包括(如在第二个方面的上下文所限定的)药物组合物。
值得注意的是，涉及本发明的第一和第二方面的实施方式同样适用于本发明的第三方面的实施方式，并且涉及本发明的第三方面的实施方式同样适用于本发明的第一和第二方面的实施方式。
在第三方面的优选实施方式中，试剂盒或部分的试剂盒包括在第一方面的上下文中所限定的至少一种第一组分和至少一种第二组分，和/或在第二方面的上下文中限定的至少一种组合物，任选地包含用于溶解的液体载体，和任选地，提供关于组分的施用和/或剂量的信息的技术说明。
在优选实施方式中，试剂盒或部分的试剂盒包括：
(a)本文限定的至少一种第一组分，优选地编码治疗性肽或蛋白质(如抗体、酶、抗原)的mRNA，优选地其中所述mRNA不包括修饰的核苷酸，优选地其中所述mRNA包括Cap1结构，优选地其中所述第一组分在脂质纳米颗粒中或在聚乙二醇/肽聚合物中进行配制。
(b)本文限定的至少一种第二组分，优选地单链RNA寡核苷酸，其包括至少一种2'-O-甲基化RNA核苷酸，优选地包括根据式I的核酸序列，优选地其中所述第二组分在脂质纳米颗粒中或在聚乙二醇/肽聚合物中进行配制。
(c)任选地，用于溶解(a)和/或(b)的液体载体，和任选地提供关于组分的施用和/或剂量的信息的技术说明。
在优选实施方式中，试剂盒或部分的试剂盒包括：
(a)在第二方面的上下文中限定的至少一种组合物；
(b)任选地，用于溶解的液体载体，和任选地提供关于组分的施用和/或剂量的信息的技术说明。
在第一和第二组分或第二方面的组合物的上下文中公开的实施方式和特征同样适用于试剂盒或部分的试剂盒的RNA和/或组合物。
试剂盒或部分的试剂盒可进一步包含在第一或第二组分或组合物的上下文中描述的附加组分，特别是药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂等。
所述试剂盒或部分的试剂盒的技术说明可以包括关于施用和剂量以及患者组的信息。这样的试剂盒，优选地部分的试剂盒，可应用于如本文提及的任何应用或医疗用途。
优选地，可以以冻干形式提供试剂盒或部分的试剂盒的各个组分。试剂盒可进一步包含作为部分的用于溶解第一组分的治疗性RNA和/或第二组分的拮抗剂(优选地核酸)和/或第二方面的组合物的载体(如药学上可接受的缓冲液)。
在优选实施方式中，试剂盒或部分的试剂盒包含林格-或林格乳酸溶液。
在优选实施方式中，试剂盒或部分的试剂盒包括注射针、微针、注射装置、导管、植入物递送装置或微插管。
任何上述试剂盒可用于本发明上下文中限定的应用或医疗用途。
医疗用途：
另一个方面涉及所提供的组合、组合物或试剂盒的第一医疗用途。
以下描述的实施方式(在“治疗方法”的上下文中)也适用于本文所述的第一医疗用途和进一步的医疗用途。
因此，本发明提供了在第一方面的上下文中限定的组合作为药物使用、在第二方面中限定的组合物作为药物使用，以及在第三方面中限定的试剂盒或部分的试剂盒作为药物使用。
特别地，所述组合、组合物或试剂盒或部分的试剂盒可用于人类医学目的，也可用于兽医医学目的，优选地用于人类医学目的。
特别地，所述组合、组合物或试剂盒或部分的试剂盒用作用于人类医疗目的的药物，其中所述组合、组合物或试剂盒或部分的试剂盒可特别适用于幼儿、新生儿、免疫受损受者，以及孕妇和哺乳期妇女和老年人。
另一方面涉及所提供的组合、组合物或试剂盒的进一步医学用途。
因此，本发明提供了在第一方面中限定的组合作为药物使用、在第二方面中限定的组合物作为药物使用，以及在第三方面中限定的试剂盒或部分的试剂盒作为长期医学治疗使用。
术语“长期医学治疗”涉及需要多于一次施用组合、组合物或试剂盒或部分的试剂盒的治疗，例如每天一次或多于一次，每周一次或多于一次，每月一次或多于一次。
本发明进一步提供第一方面所限定的组合、第二方面所限定的组合物、以及第三方面所限定的试剂盒或部分的试剂盒用于治疗或预防感染或与这种感染有关的紊乱。优选地，感染选自病毒感染、细菌感染、原生动物感染。因此，在所述实施方式中，治疗性RNA编码至少一种抗原。
本发明进一步提供第一方面所限定的组合、第二方面所限定的组合物、以及第三方面所限定的试剂盒或部分的试剂盒用于治疗或预防肿瘤疾病或与这种肿瘤疾病有关的紊乱。因此，在所述实施方式中，治疗性RNA可以编码至少一种肿瘤或癌症抗原和/或至少一种治疗性抗体(如检查点抑制剂)。
本发明进一步提供第一方面所限定的组合、第二方面所限定的组合物、以及第三方面所限定的试剂盒或部分的试剂盒用于治疗或预防遗传紊乱或症状。
本发明进一步提供第一方面所限定的组合、第二方面所限定的组合物、以及第三方面所限定的试剂盒或部分的试剂盒用于治疗或预防蛋白质或酶缺乏症或蛋白质替代。因此，在所述实施方式中，治疗性RNA编码至少一种蛋白质或酶。在该上下文中，“蛋白质或酶缺乏症”必须被理解为疾病或缺乏症，其中至少一种蛋白质缺乏，如A1AT缺乏症。
治疗和递送的方法：
本发明的另一方面涉及治疗或预防疾病、紊乱或病症的方法。
(在第一医疗用途和进一步医疗用途的上下文中的)上述实施方式也适用于此处所述的治疗方法。
在第三方面的优选实施方式中，治疗或预防紊乱、疾病或病症的方法包括向受试者施加或施用第一方面的组合、第二方面的组合物、或第三方面的试剂盒或部分的试剂盒的步骤。
组合优选地被作为“共施用”施用。术语“共施用”通常是指时间上足够接近的至少两种不同物质的施用。共施用是指同时施用，以及时间间隔顺序最多相隔数天，以任何顺序，以单一剂量或单独的剂量施用至少两种不同的物质。
在优选实施方式中，第一组分和第二组分的施加或施用基本上同时进行(如本文所限定)。
在一些实施方式中，本文限定的拮抗剂和治疗性RNA作为同一组合物的一部分同时施用。在一些实施方式中，本文限定的拮抗剂和治疗性RNA作为不同组合物的一部分同时施用。在一些实施方式中，拮抗剂和治疗性RNA通过相同的施用途径进行施用。在一些实施方式中，拮抗剂和治疗性RNA通过不同的施用途径进行施用。
在优选实施方式中，施加或施用第一组分和第二组分顺序进行(如本文所限定)。在一些实施方式中，在治疗性RNA之前施用拮抗剂。在一些实施方式中，在拮抗剂之前施用治疗性RNA。在一些实施方式中，拮抗剂和治疗性RNA通过相同的施用途径进行施用。在一些实施方式中，拮抗剂和治疗性RNA通过不同的施用途径进行施用。
在优选实施方式中，施加或施用第一方面的组合、第二方面的组合物、或第三方面的试剂盒或部分的试剂盒进行多于一次，例如，每天一次或多于一次，每周一次或多于一次，每月一次或多于一次(本文所限定)。
施用可以口服地、肠胃外的、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、鼻腔地、向颊地、阴道地或通过植入的储库。如本文所用，术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、透皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内、眼内、玻璃体内、视网膜下、瘤内。
在优选实施方式中，施加或施用的步骤是皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、透皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内、眼内、玻璃体内、视网膜下、或瘤内。
在优选实施方式中，有需要的受试者是哺乳动物受试者，如牛、猪、马、羊、猫、狗；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，诸如鸟类、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。在特别优选的实施方式中，有需要的受试者是人类受试者。
减少或抑制治疗性RNA的(先天)免疫刺激的方法：
本发明的另一方面涉及减少或抑制由治疗性RNA诱导的(先天)免疫刺激的方法。通过减少或抑制由治疗性RNA诱导的免疫刺激，可以增加施用后的效率(如，治疗性RNA的翻译、治疗性RNA的活性)。因此，本文所述的“减少或抑制治疗性RNA的(先天)免疫刺激的方法”也应理解为“增加治疗性RNA效率的方法”。
在优选实施方式中，方法包括向受试者施用至少一种治疗性RNA(如本文所限定)以及另外地至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的步骤。
至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂可以作为单独实体提供(如，在第一方面的组合的上下文中所描述)或作为包括至少一种治疗性RNA以及另外地至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的单一组合物提供。
有利地，所述拮抗剂的施用降低了可能由治疗性RNA诱导的先天免疫应答(如，不影响如治疗性编码RNA的翻译)。适当地，减少先天免疫应答的刺激可能有利于治疗性RNA的各种医学应用。特别地，方法可以例如使治疗性RNA的长期施用成为可能，或者可以如增强或提高编码抗原(如病毒抗原、肿瘤抗原)的治疗性RNA的治疗效果。因此，减少本发明的治疗性RNA的先天免疫应答导致治疗性RNA的效率增加(如在施用于细胞或受试者后)。
此外，在该上下文中，方法允许降低编码治疗性RNA(包括编码如抗原的cds)的反应原性。术语反应原性是指如疫苗能够产生不良反应的特性，尤其是过度的免疫应答和相关的体征和症状——发烧、注射部位的手臂酸痛等。反应原性的其他表现通常包括瘀伤、发红、硬结、和肿胀。
因此，减少或抑制治疗性RNA的(先天)免疫刺激的方法也被理解为减少或抑制编码治疗性RNA的反应原性的方法，其中所述编码RNA包括编码抗原的cds。
增加和/或延长(编码)治疗性RNA的表达的方法：
本发明的另一方面涉及增加和/或延长编码治疗性RNA的表达的方法。通过增加和/或延长编码治疗性RNA的表达，施用后的效率(如治疗性RNA的翻译、治疗性RNA的活性)可以显著增加。因此，本文所述的“增加和/或延长(编码)治疗性RNA表达的方法”也应理解为“增加(编码)治疗性RNA的效率的方法”。
在优选实施方式中，方法包括向受试者施用至少一种编码治疗性RNA(如本文所限定)以及另外地至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的步骤。
至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂可以作为单独实体提供(如，在第一方面的组合的上下文中所描述)或作为包括至少一种治疗性RNA以及另外地至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的单一组合物提供。
有利地，所述拮抗剂的施用减少了可能由治疗性RNA诱导的蛋白质翻译的抑制。适当地，增加和/或延长对于治疗性RNA的各种医学应用可能是有利的。特别地，方法可以例如使治疗性RNA的长期施用成为可能，或者可以例如增强或提高编码抗原(如病毒抗原、肿瘤抗原)的治疗性RNA的治疗效果。因此，本发明的治疗性RNA的增加和/或延长导致治疗性RNA的效率增加(例如在施用于细胞或受试者后)。
列举和表格的简述
表A:本发明的优选的小分子拮抗剂
表B:本发明的优选的寡核苷酸拮抗剂
表1:针对每个氨基酸指示的具有各自密码子频率的人密码子选择
表2:DOTAP制剂的RNA构建体与2'-O-甲基化寡核苷酸的组合
表3:用于体内表达和免疫刺激的分析的PpLuc mRNA和2'-O-甲基化寡核苷酸的构建体和剂量
表4:用于体内表达和免疫刺激的分析的注射安排
表5:体内免疫刺激的分析的时间点和实验装置
附图说明
图1A显示了体外在PBMC中向免疫刺激性非编码RNA(“RNAdjuvant”)添加2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18”)的免疫抑制作用。与通过CBA阵列在PBMC上清液中测量的仅免疫刺激性非编码RNA的转染相比，未加帽的免疫刺激性非编码RNA和2'-O-甲基化寡核苷酸的DOTAP共转染显示了细胞因子应答的降低。载体＝仅DOTAP；在实施例2中提供了进一步的细节。
图1B显示了体外在PBMC中向PpLuc mRNA添加2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18”)的免疫抑制作用。与通过CBA阵列在PBMC上清液中测量的仅PpLuc mRNA转染相比，加帽的编码PpLuc mRNA和寡核苷酸的DOTAP共转染显示了细胞因子应答的降低。载体＝仅DOTAP；在实施例2中提供了进一步的细节。
图2显示了在129Sv小鼠中静脉内注射LNP后6小时和24小时来自具有和不具有2'-O-甲基化RNA(“Gm18”)寡核苷酸混合物的mRNA的PpLuc表达。为了定量PpLuc表达，静脉注射3mg的萤光素后5分钟开始记录生物发光持续3分钟。与任一剂量(10μg或30μg的mRNA)下不具有2'-O-甲基化RNA寡核苷酸的PpLuc mRNA相比，添加2'-O-甲基化RNA寡核苷酸增加注射后24小时的PpLuc表达。在实施例2中提供了进一步的细节。
图3显示了在小鼠中单次静脉注射在LNP中配制的具有和不具有2'-O-甲基化RNA寡核苷酸(“Gm18”)混合物的PpLuc mRNA后PpLuc在肝脏裂解物中的表达。在注射10μg或30μg的mRNA后24小时收集肝脏。与任一剂量下不具有2'-O-甲基化RNA寡核苷酸的PpLuc mRNA相比，添加2'-O-甲基化RNA寡核苷酸增加了注射后24小时的PpLuc表达。在实施例3中提供了进一步的细节。
图4A显示了在小鼠中注射后6小时向在LNP中配制的PpLuc mRNA添加2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18“)的免疫抑制作用。用静脉注射后6小时获得的血清进行CBA阵列，以比较由共配制的mRNA+2'-O-甲基化寡核苷酸或通过仅配制的mRNA诱导的细胞因子水平(RANTES、IL6、MCP1、MCP-1β、TNFα和IFNγ)。2'-O-甲基化寡核苷酸的混合物以剂量依赖性方式强烈降低所有细胞因子水平。在实施例3中提供了进一步的细节。
图4B显示了在小鼠中注射后24小时向在LNP中配制的PpLuc mRNA添加2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18“)的免疫抑制作用。用静脉注射后24小时获得的血清进行ELISA，以比较由共配制的mRNA+2'-O-甲基化寡核苷酸或通过仅配制的mRNA诱导的INFα水平。2'-O-甲基化寡核苷酸的混合物以剂量依赖性方式强烈降低INFα水平。在实施例3中提供了进一步的细节。
图5A显示了体外在PBMC中向PpLuc mRNA添加2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸和小分子的免疫抑制作用。与通过CBA阵列在PBMC上清液中测量的仅PpLuc mRNA转染相比，加帽的编码PpLuc mRNA和寡核苷酸和小分子的DOTAP共转染显示了细胞因子应答的降低(IFN-α)。载体＝仅DOTAP；在实施例4中提供了进一步的细节。
图5B显示了体外在PBMC中PpLuc从具有和不具有2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18“)、2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸和小分子的混合物的mRNA到PpLucmRNA的表达。为了定量PpLuc表达，静脉注射3mg的萤光素后5分钟开始记录生物发光持续3分钟。与不具有混合物的PpLuc mRNA相比，添加2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18“)、2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸和小分子增加转染后24小时的PpLuc表达
实施例
为了使本领域技术人员更清楚地理解和实践本发明，给出以下实施例。本发明的范围不受示例性实施方式的限制，这些示例性实施方式仅旨在说明本发明的单个方面，并且功能等效的方法也在本发明的范围内。实际上，根据前面的描述、附图和下面的实施例，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例1：产生RNA构建体
1.1.DNA模板的制备
制备编码荧光素酶的DNA序列并用于随后的RNA体外转录。所述DNA序列是通过引入GC优化的cds来修饰野生型cds序列而制备的。将序列引入到包含UTR序列、腺苷的一段片段、组蛋白茎-环结构和任选的30个胞嘧啶的一段片段的质粒载体。使用常用方案将获得的质粒DNA在细菌中转化并增殖，提取质粒DNA，纯化和用于随后的RNA体外转录，如下面所概括。
制备了编码免疫刺激非编码RNA的DNA序列，并用于随后的RNA体外转录。使用常规方案将获得的质粒DNA在细菌中转化并增殖，提取质粒DNA，纯化和用于随后的RNA体外转录。
1.2.来自质粒DNA模板的RNA体外转录：
1.2.1.编码PPluc的mRNA的制备：
使用限制酶对根据小节1.1制备的DNA质粒进行酶促线性化，并用于在合适的缓冲液条件下在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)和帽类似物(如，m7GpppG或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG))存在的情况下使用T7 RNA聚合酶的DNA依赖性RNA体外转录。使用RP-HPLC(
Figure BDA0003557920630000661
WO2008/077592)纯化获得的RNA并用于体外和体内实验。
1.2.2.免疫性非编码RNA的制备：
使用限制酶对根据小节1.1制备的DNA质粒进行酶促线性化，并用于在合适的缓冲液条件下在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)存在的情况下使用T7 RNA聚合酶的DNA依赖性RNA体外转录。使用RP-HPLC(
Figure BDA0003557920630000662
WO2008/077592)纯化获得的非编码RNA并用于体外和体内实验。
实施例2：通过2'-O-甲基化寡核苷酸和RNA的共转染免疫刺激人外周血单核细胞 (PBMC)
对于以下描述的实施例，通过Biomers(biomers.net GmbH,Germany)：5'-GAGCGmG CCA-3'(SEQ ID NO 85)(本文也称为“Gm18”)合成2'-O-甲基化寡核苷酸(9-mer)。
2.1人PBMC的制备
通过标准Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(Ficoll 1.078g/ml)从健康志愿者的肝素化血液中分离人外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC重新悬浮在补充有10％热灭活的FCS的RPMI 1640中。计数后，将细胞以每毫升5000万个细胞重新悬浮在胎牛血清、10％DMSO中并冷冻。使用前，将细胞解冻。
2.2PBMC刺激
对于转染实验，将每孔2x 105个人PBMC接种到X-Vivo 15培养基(Lonza)中的96-孔板的每个孔中。对于含有免疫刺激性非编码RNA和2'-O-甲基化寡核苷酸(SEQ ID NO:85)两者的DOTAP络合物的制备，首先将寡核苷酸以25％的重量百分比添加到免疫刺激性非编码RNA。对于含有PpLuc mRNA和2'-O-甲基化寡核苷酸两者的DOTAP络合物的制备，首先将寡核苷酸以25％的重量百分比添加至PpLuc mRNA。PpLuc mRNA与寡核苷酸的摩尔比因此为1:45(MW(寡核苷酸)＝2907g/mol，MW(PpLuc mRNA)＝652377g/mol)。以3μl的DOTAP/1μg的RNAdjuvant或1μg的mRNA的比率，形成含有免疫刺激性非编码RNA或不具有或具有寡核苷酸的PpLuc mRNA的DOTAP络合物。在37℃下，在加湿的5％CO2气氛中，以200μl的总体积，利用1μg/ml的免疫刺激性非编码RNA或不具有或具有0.25μg/ml的寡核苷酸的mRNA培育PBMC过夜。为了定量背景刺激，用单独DOTAP(“媒介(vehicle)”)或仅培养基培育PBMC。转染后24小时，收集上清液。
表2:DOTAP制剂的RNA构建体与2'-O-甲基化寡核苷酸的组合
Figure BDA0003557920630000671
2.3细胞计数珠阵列(CBA)
在从不用或用2'-O-甲基化寡核苷酸刺激的PBMC收集的上清液中，使用以下试剂盒，根据制造商说明(BD Biosciences)通过细胞计数珠阵列(CBA)测量IFN-α、IFN-γ、TNF的浓度：Human Soluble Protein Master Buffer Kit(目录号558264)、Assay Diluent(目录号560104)、Human IFN-αFlex Set(目录号560379)、Human IFN-γFlex Set(目录号558269)、Human TNF Flex Set(目录号560112)；所有试剂盒来自BD Biosciences。使用FCAP Array v3.0软件(BD Biosciences)分析数据
2.4结果：添加2'-O-甲基化寡核苷酸的免疫抑制作用
在人PBMC中2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18”)连同免疫刺激性非编码RNA(“RNAdjuvant”)的DOTAP共转染说明与仅免疫刺激性非编码RNA的转染相比，细胞因子INF-α、INF-γ、和TNF的分泌减少证明了2'-O-甲基化寡核苷酸的免疫抑制作用(图1A)。
在人PBMC中2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18”)连同加帽的编码PpLuc mRNA的DOTAP共转染说明与仅PpLuc mRNA的转染相比，2'-O-甲基化寡核苷酸的免疫抑制作用由细胞因子INF-α、INF-γ、和TNF的分泌减少证明(图1B)。
结果显示了本文中测试的2'-O-甲基化寡核苷酸能够减少RNA的免疫刺激，表明包括寡核苷酸和治疗性RNA的组合或组合物可以显示降低的免疫刺激性质。
实施例3：体内利用LNP的PpLuc mRNA联合2'O-甲基化寡核苷酸的免疫刺激
对于以下描述的实施例，通过Biomers(biomers.net GmbH,Germany)：5'-GAGCGmG CCA-3'(SEQ ID NO 85)合成9-mer 2'-O-甲基化寡核苷酸(9-mer)
3.1产生PpLuc mRNA构建体
根据实施例1产生编码PpLuc的mRNA构建体。
3.2LNP制剂
对于含有PpLuc mRNA和2'-O-甲基化寡核苷酸两者的脂质纳米颗粒(LNP)的制备，首先以20％或6.7％的重量百分比将2'-O-甲基化寡核苷酸添加到PpLuc mRNA(参见表3)。使用阳离子脂质、胆固醇、PEG-脂质和中性脂质制备含有具有或不具有2'-O-甲基化寡核苷酸混合物的PpLuc mRNA的LNP。在pH 4的柠檬酸盐缓冲液中将mRNA稀释至1g/L。使用Nanoassemblr(PrecisionNanoSystems)以1:3的比率(vol/vol)将乙醇脂质溶液与水性RNA溶液混合。然后去除乙醇并通过透析以包括9％蔗糖的10mM HEPES,pH 7.4替换缓冲液。最后，将LNP-配制的RNA调节至0.2g/L。
表3：用于体内表达和免疫刺激的分析的PpLuc mRNA和2'-O-甲基化寡核苷酸的构 建体和剂量
组 帽结构 5'UTR 3'UTR mRNA剂量 寡核苷酸的质量％ LNP制剂@0.2g/L
1 Cap1 HSD17B4 PSMB3 30μg 0 A
2 Cap1 HSD17B4 PSMB3 10μg 0 A
3 Cap1 HSD17B4 PSMB3 30μg 20％ B
4 Cap1 HSD17B4 PSMB3 10μg 20％ B
5 Cap1 HSD17B4 PSMB3 30μg 6.7％ C
6 Cap1 HSD17B4 PSMB3 10μg 6.7％ C
表4：体内表达和免疫刺激的分析的注射安排
Figure BDA0003557920630000681
Figure BDA0003557920630000691
3.3在小鼠中静脉注射PpLuc mRNA、2'-O-甲基化寡核苷酸和LNP
对于体内实验，用各种LNP制剂注射8周龄雌性小鼠(约25g，种系129SV)(参见表4和5)，每组使用4只动物。以0.2g/l的浓度静脉注射10μg或30μg配制具有或不具有2'-O-甲基化寡核苷酸的mRNA。在LNP注射后6小时和24小时进行生物发光成像。在LNP注射后6小时和最后在LNP注射后24小时对血液进行取样。此后立即处死小鼠，收集肝脏并置于1.5ml PP管中，冷冻并储存直至分析(<-70℃)。
3.4体内成像的表达分析
单次静脉注射不具有或具有2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18”)的混合物的LNP-配制的PpLuc mRNA后6小时和24小时，可视化PpLuc的表达。在静脉注射3mg的荧光素后5分钟开始记录生物发光图像，持续3分钟以量化PpLuc表达(参见表5)。与任一剂量(10μg或30μg的mRNA)下不具有Gm18的PpLuc mRNA相比，添加2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18”)增加注射后24小时的PpLuc表达(参见图2)。
表5:体内免疫刺激的分析的时间点和实验装置
Figure BDA0003557920630000692
Figure BDA0003557920630000701
3.5由细胞裂解物的表达分析
为了制备组织裂解物，首先在每个肝脏中添加一个钢珠(steal bead)。将冷冻的肝脏固定在组织裂解器中并摇动三分钟。然后，添加800μl的裂解缓冲液(25mM Tris-HClpH 7.5、2mM EDTA、10％(w/v)甘油、1％(w/v)Triton X-100、2mM DTT和1mM PMSF)。组织裂解持续6分钟以上。将样品在4℃下以13500rpm离心10分钟。将20μl每份上清液添加到白色LIA测定板中。将板引入读板器(Berthold Technologies TriStar2 LB 942)中，每孔注射50μl含有萤光素作为萤火虫萤光素酶底物的Beetle-Juice(PJK GmbH)。萤光素酶活性量化为相对光单位(RLU)。与任一剂量(10μg或30μg)下不具有寡核苷酸的PpLuc mRNA相比，添加2'-O-甲基化寡核苷酸增加注射后24小时的PpLuc表达(参见图3)。
3.6对免疫刺激的影响-CBA测定和ELISA
为了分析2'-O-甲基化寡核苷酸对免疫刺激的影响，如2.3节中所描述的执行通过细胞计数珠阵列(CBA)在来自LNP注射后6小时收集的血液的血清中测量IFNγ、TNFα、IL-6、MIP-1β、RANTES和MCP1的浓度。向PpLuc mRNA添加2'-O-甲基化RNA寡核苷酸以剂量依赖的方式强烈地降低所有炎性细胞因子的释放(参见图4A)。为了进一步评估2'-O-甲基化寡核苷酸对免疫刺激的影响，通过ELISA在来自LNP注射后24小时收集的血液的血清中测量IFNα的浓度。向PpLuc mRNA添加2'-O-甲基化RNA寡核苷酸以剂量依赖的方式强烈地降低IFNα的释放(参见图4B)。
发现的总结(实施例1至3):
实施例2、图1中描述的体外实验的结果显示了本文使用的2'-O-甲基化寡核苷酸(“Gm18”)拮抗共施用的RNA的免疫刺激，该免疫刺激通常由RNA感知模式识别受体触发。因此，寡核苷酸作为RNA感知模式识别受体的拮抗剂。结果显示了包括寡核苷酸拮抗剂和治疗性RNA的组合或组合物有利地降低治疗性RNA的免疫刺激性质。实施例3、图2至3中描述的体内实验的结果显示了本文使用的2'-O-甲基化寡核苷酸还拮抗体内RNA的免疫刺激。出乎预料地，添加2'-O-甲基化寡核苷酸还增加/延长RNA编码的蛋白质的表达，表明除了降低的免疫刺激外，包括寡核苷酸拮抗剂和治疗性RNA的组合或组合物还增加体内表达和/或活性——对大多数基于RNA的药物来说至关重要的特征。
4.RNA与2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸和小分子的共转 染对人外周血单核细胞(PBMC)的刺激以及表达效率
对于以下描述的实施例，通过Biomers(biomers.net GmbH,Germany),Invivogen(https://www.invivogen.com/,United States)或Miltenyi Biotec(miltenyibiotec.com/DE-en/,Germany)合成了不同的寡核苷酸和小分子(表6)。
4.1产生PpLuc mRNA构建体
根据实施例1产生编码PpLuc的mRNA构建体。
表6：合成的2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸和小分子
Figure BDA0003557920630000711
*＝硫代磷酸骨架，Nm＝甲基化核苷酸(G、U、C或A)
4.2与2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA和DNA寡核苷酸以及小分子共转染的PMBC的 表达和免疫刺激的分析
根据实施例2.1进行人PBMC的制备。对于转染实验，将每孔2x105个人PBMC在X-Vivo 15培养基(Lonza)中接种到96-孔板的每个孔中。对于包括拮抗剂(2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或小分子)以及PpLuc mRNA(SEQ ID NO:82，与表2中所示相同的RNA设计)两者的DOTAP(载体)的制备，首先以20％的重量百分比将拮抗剂添加至PpLuc mRNA(1:5mRNA：寡核苷酸/小分子)。PpLuc mRNA与拮抗剂的摩尔比因此为1:45(MW(寡核苷酸)＝2907g/mol，MW(PpLuc mRNA)＝652377g/mol)。以5μl的DOTAP/1μg的mRNA的比率，形成含有PpLuc mRNA和拮抗剂的DOTAP络合物，并转染100ng。在37℃下，在加湿的5％CO2气氛中，以200μl的总体积，利用不具有或具有0.25μg/ml的拮抗剂的mRNA培育PBMC过夜。为了定量背景刺激，用单独DOTAP(“媒介”)或仅RPMI(“培养基”)培育PBMC。转染后24小时，收集上清液，并裂解细胞，在-80℃下储存。根据2.3进行细胞计数珠测定(CBA)。通过测量荧光素酶活性进行表达分析，其在BioTek SynergyHT读板器中测量为相对光单位(RLU)。使用50μΙ的裂解物和200μΙ的荧光素缓冲液(75μΜ荧光素、25mM甘氨酰甘氨酸、pH 7.8(NaOH)、15mM MgSO4、2mM ATP)以5秒测量时间测量PpLuc活性。
4.3与2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA和DNA寡核苷酸以及小分子共转染的PMBC的 免疫抑制作用和表达效率的分析
在人PBMC中的2'-O-甲基化寡核苷酸的变体、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸以及小分子连同加帽的编码PpLuc mRNA的DOTAP共转染说明了通过PBMC上清液中的CBA阵列测量，与仅PpLuc mRNA的转染相比，细胞因子IFN-α的分泌减少证明了免疫抑制作用(图4A)。
与PpLuc mRNA自身相比，添加2'-O-甲基化寡核苷酸变体、RNA和DNA寡核苷酸以及小分子增加了转染后24小时的PBMC中的PpLuc表达(图4B)。
序列表
<110> 库尔维科公司
<120> 具有降低的免疫刺激性质的RNA组合和组合物
<130> CU01P300WO1
<160> 212
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 组蛋白茎环序列
<400> 1
caaaggctct tttcagagcc acca 24
<210> 2
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 组蛋白茎环序列mRNA
<400> 2
caaaggcucu uuucagagcc acca 24
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak
<400> 3
gccgccacca tgg 13
<210> 4
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak mRNA
<400> 4
gccgccacca ugg 13
<210> 5
<211> 6
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 5'-端
<400> 5
gggaga 6
<210> 6
<211> 6
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 5'-端
<400> 6
aggaga 6
<210> 7
<211> 128
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64-N5-C30-组蛋白SL-N5
<400> 7
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaugcauc cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca 120
ccagaauu 128
<210> 8
<211> 124
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 组蛋白SL-A100
<400> 8
caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaa 124
<210> 9
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A100
<400> 9
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100
<210> 10
<211> 134
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5-C30-组蛋白SL-N5
<400> 10
auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120
gagccaccag aauu 134
<210> 11
<211> 134
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5-C30-组蛋白SL-N5
<400> 11
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120
gagccaccag aauu 134
<210> 12
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A64-N5
<400> 12
auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaauu 99
<210> 13
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A64-N5
<400> 13
agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaauu 99
<210> 14
<211> 110
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N12-A64-N5-组蛋白SL-N5
<400> 14
auuaauagau cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaugca ucaaaggcuc uuuucagagc caccagaauu 110
<210> 15
<211> 110
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N12-A64-N5-组蛋白SL-N5
<400> 15
auuaauagau cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaugca ucaaaggcuc uuuucagagc caccagaauu 110
<210> 16
<211> 130
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A100
<400> 16
auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa 130
<210> 17
<211> 130
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A100
<400> 17
agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa 130
<210> 18
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A100
<400> 18
auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 106
<210> 19
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A100
<400> 19
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 106
<210> 20
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A75-组蛋白SL
<400> 20
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaacaaag gcucuuuuca gagccacca 99
<210> 21
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 U3-A75-组蛋白SL
<400> 21
uuuaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaca aaggcucuuu ucagagccac ca 102
<210> 22
<211> 178
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A154-组蛋白SL
<400> 22
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaagg cucuuuucag agccacca 178
<210> 23
<211> 181
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 U3-A154-组蛋白SL
<400> 23
uuuaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacaa aggcucuuuu cagagccacc 180
a 181
<210> 24
<211> 101
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N2-A75-组蛋白SL
<400> 24
agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaacaa aggcucuuuu cagagccacc a 101
<210> 25
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 组蛋白SL-A75
<400> 25
caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 99
<210> 26
<211> 170
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 组蛋白SL-A146
<400> 26
caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 170
<210> 27
<211> 136
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N8-A64-N5-C30-组蛋白SL-N5
<400> 27
agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc cccccccccc ccccccccaa aggcucuuuu 120
cagagccacc agaauu 136
<210> 28
<211> 131
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N8-A64-N5-C30-组蛋白SL
<400> 28
agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc cccccccccc ccccccccaa aggcucuuuu 120
cagagccacc a 131
<210> 29
<211> 105
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N8-A64-N5-C4-组蛋白SL
<400> 29
agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaugcauccc ccaaaggcuc uuuucagagc cacca 105
<210> 30
<211> 115
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N8-A64-N5-C14-组蛋白SL
<400> 30
agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc cacca 115
<210> 31
<211> 129
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5-C30-组蛋白SL
<400> 31
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120
gagccacca 129
<210> 32
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5-C4-组蛋白SL
<400> 32
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa ugcauccccc aaaggcucuu uucagagcca cca 103
<210> 33
<211> 113
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5-C14-组蛋白SL
<400> 33
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca cca 113
<210> 34
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-组蛋白SL-N5
<400> 34
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa caaaggcucu uuucagagcc accagaauu 99
<210> 35
<211> 123
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64-N5-C30-组蛋白SL
<400> 35
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaugcauc cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca 120
cca 123
<210> 36
<211> 97
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64-N5-C4-组蛋白SL
<400> 36
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaugcauc ccccaaaggc ucuuuucaga gccacca 97
<210> 37
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64-N5-C14-组蛋白SL
<400> 37
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaugcauc cccccccccc ccccaaaggc ucuuuucaga gccacca 107
<210> 38
<211> 93
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64-组蛋白SL-N5
<400> 38
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaacaaagg cucuuuucag agccaccaga auu 93
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体肽1
<400> 39
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys
1 5 10
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体肽2
<400> 40
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体肽3
<400> 41
Trp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys
1 5 10
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体肽4
<400> 42
Cys His His His His His His Arg Arg Arg Arg His His His His His
1 5 10 15
His Cys
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体肽5
<400> 43
Cys Gly His His His His His Arg Arg Arg Arg His His His His His
1 5 10 15
Gly Cys
<210> 44
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSD17B4 5'-UTR
<400> 44
gtcccgcagt cggcgtccag cggctctgct tgttcgtgtg tgtgtcgttg caggccttat 60
tc 62
<210> 45
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSD17B4 5'-UTR
<400> 45
gucccgcagu cggcguccag cggcucugcu uguucgugug ugugucguug caggccuuau 60
uc 62
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASAH1 5'-UTR
<400> 46
gcctctgctg gagtccgggg agtggcgttg gctgctagag cg 42
<210> 47
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ASAH1 5'-UTR
<400> 47
gccucugcug gaguccgggg aguggcguug gcugcuagag cg 42
<210> 48
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP5A1 5'-UTR
<400> 48
gcggctcggc cattttgtcc cagtcagtcc ggaggctgcg gctgcagaag taccgcctgc 60
ggagtaactg caaag 75
<210> 49
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP5A1 5'-UTR
<400> 49
gcggcucggc cauuuugucc cagucagucc ggaggcugcg gcugcagaag uaccgccugc 60
ggaguaacug caaag 75
<210> 50
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mp68_(2010107E04Rik) 5'-UTR
<400> 50
ctttcccatt ctgtagcaga atttggtgtt gcctgtggtc ttggtcccgc ggag 54
<210> 51
<211> 54
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mp68_(2010107E04Rik) 5'-UTR
<400> 51
cuuucccauu cuguagcaga auuugguguu gccugugguc uuggucccgc ggag 54
<210> 52
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ndufa4 5'-UTR
<400> 52
gtccgctcag ccaggttgca gaagcggctt agcgtgtgtc ctaatcttct ctctgcgtgt 60
aggtaggcct gtgccgcaaa c 81
<210> 53
<211> 81
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ndufa4 5'-UTR
<400> 53
guccgcucag ccagguugca gaagcggcuu agcguguguc cuaaucuucu cucugcgugu 60
agguaggccu gugccgcaaa c 81
<210> 54
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nosip 5'-UTR
<400> 54
ctcctgtcgg gcggaagtag gaggagtaga gtttaaaaac agtactcttt ttccggttcg 60
ggacgtagtt gaagcaacga caagccggat aaccgctctt gagacagg 108
<210> 55
<211> 108
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nosip 5'-UTR
<400> 55
cuccugucgg gcggaaguag gaggaguaga guuuaaaaac aguacucuuu uuccgguucg 60
ggacguaguu gaagcaacga caagccggau aaccgcucuu gagacagg 108
<210> 56
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rpl31 5'-UTR
<400> 56
cccgtgaccc ggaagttgta cggctacgcg actttccctc ccacaaaccc tcgcgccctt 60
cctttcctac ttgggcccgg caga 84
<210> 57
<211> 84
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rpl31 5'-UTR
<400> 57
cccgugaccc ggaaguugua cggcuacgcg acuuucccuc ccacaaaccc ucgcgcccuu 60
ccuuuccuac uugggcccgg caga 84
<210> 58
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Slc7a3 5'-UTR
<400> 58
gggcgcttgg cttgcaagga ccctgagctg cggcattgaa gcacacccaa cccaactcga 60
ctgaagtcag cctcactgaa ccggatctga gaatcttctc tctctgggct tgccagggct 120
ctccgaacct agctagcatc ctcttcaatt ccaactaga 159
<210> 59
<211> 159
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Slc7a3 5'-UTR
<400> 59
gggcgcuugg cuugcaagga cccugagcug cggcauugaa gcacacccaa cccaacucga 60
cugaagucag ccucacugaa ccggaucuga gaaucuucuc ucucugggcu ugccagggcu 120
cuccgaaccu agcuagcauc cucuucaauu ccaacuaga 159
<210> 60
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TUBB4B 5'-UTR
<400> 60
atataagcgt tggcggagcg tcggttgtag cactctgcgc gcccgctctt ctgctgctgt 60
ttgtctactt cctcctgctt ccccgccgcc gccgccgcca tc 102
<210> 61
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TUBB4B 5'-UTR
<400> 61
auauaagcgu uggcggagcg ucgguuguag cacucugcgc gcccgcucuu cugcugcugu 60
uugucuacuu ccuccugcuu ccccgccgcc gccgccgcca uc 102
<210> 62
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ubqln2 5'-UTR
<400> 62
cggagacggc ctgcaggacc tgctctctca gccctcagcc gaggcctacg ccgagccgag 60
tgcgcagccg acgaccggga ggagccgcag ccttcaactc tgaggtactg tgatccgcgc 120
tgcccgccgg gccgccccag tccgctgctg cggcacctcc ttccctcgcg ccctcttcgc 180
tcgccagcgc cttccctgtg agcctgcgtc accgcggccg cc 222
<210> 63
<211> 222
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ubqln2 5'-UTR
<400> 63
cggagacggc cugcaggacc ugcucucuca gcccucagcc gaggccuacg ccgagccgag 60
ugcgcagccg acgaccggga ggagccgcag ccuucaacuc ugagguacug ugauccgcgc 120
ugcccgccgg gccgccccag uccgcugcug cggcaccucc uucccucgcg cccucuucgc 180
ucgccagcgc cuucccugug agccugcguc accgcggccg cc 222
<210> 64
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL32 (32L4, 32L3) 5'-UTR
<400> 64
ggcgctgcct acggaggtgg cagccatctc cttctcggca tc 42
<210> 65
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL32 (32L4, 32L3) 5'-UTR
<400> 65
ggcgcugccu acggaggugg cagccaucuc cuucucggca uc 42
<210> 66
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PSMB3 3'-UTR
<400> 66
ccctgttccc agagcccact tttttttctt tttttgaaat aaaatagcct gtctttc 57
<210> 67
<211> 57
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PSMB3 3'-UTR
<400> 67
cccuguuccc agagcccacu uuuuuuucuu uuuuugaaau aaaauagccu gucuuuc 57
<210> 68
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CASP1 3'-UTR
<400> 68
aataaggaaa ctgtatgaat gtctgtgggc aggaagtgaa gagatccttc tgtaaaggtt 60
tttggaatta tgtctgctga ataataaact tttttgaaat aataaatctg gtagaaaaat 120
g 121
<210> 69
<211> 121
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CASP1 3'-UTR
<400> 69
aauaaggaaa cuguaugaau gucugugggc aggaagugaa gagauccuuc uguaaagguu 60
uuuggaauua ugucugcuga auaauaaacu uuuuugaaau aauaaaucug guagaaaaau 120
g 121
<210> 70
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX6B1 3'-UTR
<400> 70
actggctgca tctccctttc ctctgtcctc catccttctc ccaggatggt gaagggggac 60
ctggtaccca gtgatcccca ccccaggatc ctaaatcatg acttacctgc taataaaaac 120
tcattggaaa agtgaga 137
<210> 71
<211> 137
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX6B1 3'-UTR
<400> 71
acuggcugca ucucccuuuc cucuguccuc cauccuucuc ccaggauggu gaagggggac 60
cugguaccca gugaucccca ccccaggauc cuaaaucaug acuuaccugc uaauaaaaac 120
ucauuggaaa agugaga 137
<210> 72
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gnas 3'-UTR
<400> 72
gaagggaaca cccaaattta attcagcctt aagcacaatt aattaagagt gaaacgtaat 60
tgtacaagca gttggtcacc caccataggg catgatcaac accgcaacct ttcctttttc 120
ccccagtgat tctgaaaaac ccctcttccc ttcagcttgc ttagatgttc caaatttagt 180
aagcttaagg cggcctacag aagaaaaaga aaaaaaaggc cacaaaagtt ccctctcact 240
ttcagtaaat aaaataaaag cagcaacaga aataaagaaa taaatgaaat tcaaaatgaa 300
ataaatattg tgttgtgcag cattaaaaaa tcaataaaaa ttaaaaatga gca 353
<210> 73
<211> 353
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gnas 3'-UTR
<400> 73
gaagggaaca cccaaauuua auucagccuu aagcacaauu aauuaagagu gaaacguaau 60
uguacaagca guuggucacc caccauaggg caugaucaac accgcaaccu uuccuuuuuc 120
ccccagugau ucugaaaaac cccucuuccc uucagcuugc uuagauguuc caaauuuagu 180
aagcuuaagg cggccuacag aagaaaaaga aaaaaaaggc cacaaaaguu cccucucacu 240
uucaguaaau aaaauaaaag cagcaacaga aauaaagaaa uaaaugaaau ucaaaaugaa 300
auaaauauug uguugugcag cauuaaaaaa ucaauaaaaa uuaaaaauga gca 353
<210> 74
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ndufa1 3'-UTR
<400> 74
ggaagcattt tcctggctga ttaaaagaaa ttactcagct atggtcatct gttcctgtta 60
gaaggctatg cagcatatta tatactatgc gcatgttatg aaatgcataa taaaaaattt 120
taaaaaatct aaa 133
<210> 75
<211> 133
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ndufa1 3'-UTR
<400> 75
ggaagcauuu uccuggcuga uuaaaagaaa uuacucagcu auggucaucu guuccuguua 60
gaaggcuaug cagcauauua uauacuaugc gcauguuaug aaaugcauaa uaaaaaauuu 120
uaaaaaaucu aaa 133
<210> 76
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPS9 3'-UTR
<400> 76
gtccacctgt ccctcctggg ctgctggatt gtctcgtttt cctgccaaat aaacaggatc 60
agcgctttac 70
<210> 77
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPS9 3'-UTR
<400> 77
guccaccugu cccuccuggg cugcuggauu gucucguuuu ccugccaaau aaacaggauc 60
agcgcuuuac 70
<210> 78
<211> 187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALB7 3'-UTR
<400> 78
gcatcacatt taaaagcatc tcagcctacc atgagaataa gagaaagaaa atgaagatca 60
atagcttatt catctctttt tctttttcgt tggtgtaaag ccaacaccct gtctaaaaaa 120
cataaatttc tttaatcatt ttgcctcttt tctctgtgct tcaattaata aaaaatggaa 180
agaacct 187
<210> 79
<211> 187
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALB7 3'-UTR
<400> 79
gcaucacauu uaaaagcauc ucagccuacc augagaauaa gagaaagaaa augaagauca 60
auagcuuauu caucucuuuu ucuuuuucgu ugguguaaag ccaacacccu gucuaaaaaa 120
cauaaauuuc uuuaaucauu uugccucuuu ucucugugcu ucaauuaaua aaaaauggaa 180
agaaccu 187
<210> 80
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muag 3'-UTR
<400> 80
gcccgatggg cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accg 44
<210> 81
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muag 3'-UTR
<400> 81
gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accg 44
<210> 82
<211> 2035
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PpLuc
<400> 82
ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu gaggauggag 60
gacgccaaga acaucaagaa gggcccggcg cccuucuacc cgcuggagga cgggaccgcc 120
ggcgagcagc uccacaaggc caugaagcgg uacgcccugg ugccgggcac gaucgccuuc 180
accgacgccc acaucgaggu cgacaucacc uacgcggagu acuucgagau gagcgugcgc 240
cuggccgagg ccaugaagcg guacggccug aacaccaacc accggaucgu ggugugcucg 300
gagaacagcc ugcaguucuu caugccggug cugggcgccc ucuucaucgg cguggccguc 360
gccccggcga acgacaucua caacgagcgg gagcugcuga acagcauggg gaucagccag 420
ccgaccgugg uguucgugag caagaagggc cugcagaaga uccugaacgu gcagaagaag 480
cugcccauca uccagaagau caucaucaug gacagcaaga ccgacuacca gggcuuccag 540
ucgauguaca cguucgugac cagccaccuc ccgccgggcu ucaacgagua cgacuucguc 600
ccggagagcu ucgaccggga caagaccauc gcccugauca ugaacagcag cggcagcacc 660
ggccugccga aggggguggc ccugccgcac cggaccgccu gcgugcgcuu cucgcacgcc 720
cgggacccca ucuucggcaa ccagaucauc ccggacaccg ccauccugag cguggugccg 780
uuccaccacg gcuucggcau guucacgacc cugggcuacc ucaucugcgg cuuccgggug 840
guccugaugu accgguucga ggaggagcug uuccugcgga gccugcagga cuacaagauc 900
cagagcgcgc ugcucgugcc gacccuguuc agcuucuucg ccaagagcac ccugaucgac 960
aaguacgacc ugucgaaccu gcacgagauc gccagcgggg gcgccccgcu gagcaaggag 1020
gugggcgagg ccguggccaa gcgguuccac cucccgggca uccgccaggg cuacggccug 1080
accgagacca cgagcgcgau ccugaucacc cccgaggggg acgacaagcc gggcgccgug 1140
ggcaaggugg ucccguucuu cgaggccaag gugguggacc uggacaccgg caagacccug 1200
ggcgugaacc agcggggcga gcugugcgug cgggggccga ugaucaugag cggcuacgug 1260
aacaacccgg aggccaccaa cgcccucauc gacaaggacg gcuggcugca cagcggcgac 1320
aucgccuacu gggacgagga cgagcacuuc uucaucgucg accggcugaa gucgcugauc 1380
aaguacaagg gcuaccaggu ggcgccggcc gagcuggaga gcauccugcu ccagcacccc 1440
aacaucuucg acgccggcgu ggccgggcug ccggacgacg acgccggcga gcugccggcc 1500
gcgguggugg ugcuggagca cggcaagacc augacggaga aggagaucgu cgacuacgug 1560
gccagccagg ugaccaccgc caagaagcug cggggcggcg ugguguucgu ggacgagguc 1620
ccgaagggcc ugaccgggaa gcucgacgcc cggaagaucc gcgagauccu gaucaaggcc 1680
aagaagggcg gcaagaucgc cguguaagac uagugcauca cauuuaaaag caucucagcc 1740
uaccaugaga auaagagaaa gaaaaugaag aucaauagcu uauucaucuc uuuuucuuuu 1800
ucguuggugu aaagccaaca cccugucuaa aaaacauaaa uuucuuuaau cauuuugccu 1860
cuuuucucug ugcuucaauu aauaaaaaau ggaaagaacc uagaucuaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa augcaucccc 1980
cccccccccc cccccccccc cccccccaaa ggcucuuuuc agagccacca gaauu 2035
<210> 83
<211> 1929
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PpLuc
<400> 83
aggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60
ccuuauucaa gcuuaccaug gaggacgcca agaacaucaa gaagggcccg gcgcccuucu 120
acccgcugga ggacgggacc gccggcgagc agcuccacaa ggccaugaag cgguacgccc 180
uggugccggg cacgaucgcc uucaccgacg cccacaucga ggucgacauc accuacgcgg 240
aguacuucga gaugagcgug cgccuggccg aggccaugaa gcgguacggc cugaacacca 300
accaccggau cguggugugc ucggagaaca gccugcaguu cuucaugccg gugcugggcg 360
cccucuucau cggcguggcc gucgccccgg cgaacgacau cuacaacgag cgggagcugc 420
ugaacagcau ggggaucagc cagccgaccg ugguguucgu gagcaagaag ggccugcaga 480
agauccugaa cgugcagaag aagcugccca ucauccagaa gaucaucauc auggacagca 540
agaccgacua ccagggcuuc cagucgaugu acacguucgu gaccagccac cucccgccgg 600
gcuucaacga guacgacuuc gucccggaga gcuucgaccg ggacaagacc aucgcccuga 660
ucaugaacag cagcggcagc accggccugc cgaagggggu ggcccugccg caccggaccg 720
ccugcgugcg cuucucgcac gcccgggacc ccaucuucgg caaccagauc aucccggaca 780
ccgccauccu gagcguggug ccguuccacc acggcuucgg cauguucacg acccugggcu 840
accucaucug cggcuuccgg gugguccuga uguaccgguu cgaggaggag cuguuccugc 900
ggagccugca ggacuacaag auccagagcg cgcugcucgu gccgacccug uucagcuucu 960
ucgccaagag cacccugauc gacaaguacg accugucgaa ccugcacgag aucgccagcg 1020
ggggcgcccc gcugagcaag gaggugggcg aggccguggc caagcgguuc caccucccgg 1080
gcauccgcca gggcuacggc cugaccgaga ccacgagcgc gauccugauc acccccgagg 1140
gggacgacaa gccgggcgcc gugggcaagg uggucccguu cuucgaggcc aagguggugg 1200
accuggacac cggcaagacc cugggcguga accagcgggg cgagcugugc gugcgggggc 1260
cgaugaucau gagcggcuac gugaacaacc cggaggccac caacgcccuc aucgacaagg 1320
acggcuggcu gcacagcggc gacaucgccu acugggacga ggacgagcac uucuucaucg 1380
ucgaccggcu gaagucgcug aucaaguaca agggcuacca gguggcgccg gccgagcugg 1440
agagcauccu gcuccagcac cccaacaucu ucgacgccgg cguggccggg cugccggacg 1500
acgacgccgg cgagcugccg gccgcggugg uggugcugga gcacggcaag accaugacgg 1560
agaaggagau cgucgacuac guggccagcc aggugaccac cgccaagaag cugcggggcg 1620
gcgugguguu cguggacgag gucccgaagg gccugaccgg gaagcucgac gcccggaaga 1680
uccgcgagau ccugaucaag gccaagaagg gcggcaagau cgccguguga ggacuagucc 1740
cuguucccag agcccacuuu uuuuucuuuu uuugaaauaa aauagccugu cuuucagauc 1800
uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaugcau cccccccccc cccccccccc cccccccccc caaaggcucu uuucagagcc 1920
accagaauu 1929
<210> 84
<211> 547
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 免疫刺激性RNA
<400> 84
gggagaaagc ucaagcuuau ccaaguaggc uggucaccug uacaacguag ccgguauuuu 60
uuuuuuuuuu uuuuuuuuga ccgucucaag guccaaguua gucugccuau aaaggugcgg 120
auccacagcu gaugaaagac uugugcggua cgguuaaucu ccccuuuuuu uuuuuuuuuu 180
uuuuuaguaa augcgucuac ugaauccagc gaugaugcug gcccagaucu ucgaccacaa 240
gugcauauag uagucaucga gggucgccuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uggcccaguu 300
cugagacuuc gcuagagacu acaguuacag cugcaguagu aaccacugcg gcuauugcag 360
gaaaucccgu ucagguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuccgc ucacuaugau uaagaaccag 420
guggaguguc acugcucucg aggucucacg agagcgcucg auacaguccu uggaagaauc 480
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugugcgacg aucacagaga acuucuauuc augcaggucu 540
gcucuag 547
<210> 85
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 85
gagcngcca 9
<210> 86
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 7mer寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 86
agcngcc 7
<210> 87
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5mer寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 87
gcngc 5
<210> 88
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 88
gugggguucc cgagcngcca aaggga 26
<210> 89
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 17 A
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 89
gugggguucc cgagangcca aaggga 26
<210> 90
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 17 G
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 90
gugggguucc cgaggngcca aaggga 26
<210> 91
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 17 U
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 91
gugggguucc cgagungcca aaggga 26
<210> 92
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 17 A
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 92
gugggguucc cgagcngcca aaggga 26
<210> 93
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 17 C
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<400> 93
gugggguucc cgagcngcca aaggga 26
<210> 94
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 17 U
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 94
gugggguucc cgagcngcca aaggga 26
<210> 95
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 19 A
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 95
gugggguucc cgagcnacca aaggga 26
<210> 96
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 19 C
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 96
gugggguucc cgagcnccca aaggga 26
<210> 97
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 19 U
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 97
gugggguucc cgagcnucca aaggga 26
<210> 98
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 20 A
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 98
gugggguucc cgagcngaca aaggga 26
<210> 99
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 20 G
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 99
gugggguucc cgagcnggca aaggga 26
<210> 100
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 26mer寡核苷酸 20 U
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 100
gugggguucc cgagcnguca aaggga 26
<210> 101
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gal-mU
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(19)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 101
cnacacaaan cagcgannnu u 21
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gal-mC
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(11)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<400> 102
nuananaaau nagngauuuu u 21
<210> 103
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gal-mG
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 103
cuacacaaau cancnauuuu u 21
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gal-mA
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(9)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 104
cuncncnnnu cngcgnuuuu u 21
<210> 105
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NP-mU
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(7)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(11)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(14)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 105
ggancnnann ncnncggagu u 21
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NP-mC
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<400> 106
ggaunuuauu unuunggagu u 21
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Luc-mU
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(14)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 107
gannangncc ggnnangnau u 21
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN 2216 (PO)
<400> 108
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 109
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN M362 (PO)
<400> 109
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 110
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN 6295 (PO)
<400> 110
taacgttgag gggcat 16
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN 1826 (PO)
<400> 111
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 112
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS-954 (DV-1079)
<400> 112
ugcuccugga gggguugu 18
<210> 113
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRO-5
<400> 113
cuaucugacg uucucugu 18
<210> 114
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS 2088
<400> 114
uccuggcggg gaagu 15
<210> 115
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS 869
<400> 115
uccuggaggg guugu 15
<210> 116
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN-2114
<400> 116
uccuggaggg gaagu 15
<210> 117
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN 4024
<400> 117
uccuggaugg gaagu 15
<210> 118
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN 4084-F
<400> 118
ccuggauggg aa 12
<210> 119
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS-661
<400> 119
ugcuugcaag cuugcaagca 20
<210> 120
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS-954
<400> 120
ugcuccugga gggguugu 18
<210> 121
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN-24888
<400> 121
uccuggcggg gaagu 15
<210> 122
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IHN-ODN 2088
<400> 122
uccuggcggg gaagu 15
<210> 123
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN A151
<400> 123
uuaggguuag gguuaggguu aggg 24
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-ODN
<400> 124
cuccuauugg ggguuuccua u 21
<210> 125
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN INH-1
<400> 125
ccuggauggg aauucccauc cagg 24
<210> 126
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN INH-18
<400> 126
ccuggauggg aacuuaccgc ugca 24
<210> 127
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-4
<400> 127
uucccaucca ggccuggaug ggaa 24
<210> 128
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-13
<400> 128
cuuaccgcug caccuggaug ggaa 24
<210> 129
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (pS-) ST-ODN
<400> 129
ucgucguuuu gucguuuugu cguu 24
<210> 130
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN 21 14
<400> 130
uccuggaggg gaagu 15
<210> 131
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内体TLR靶向TLR7
<400> 131
uccuggaggg guugu 15
<210> 132
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内体TLR靶向TLR9
<400> 132
ugcuugcaag cuugcaagca 20
<210> 133
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内体TLR靶向TLR7和9
<400> 133
ugcuccugga gggguugu 18
<210> 134
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 1
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 134
gnuacuuacc ug 12
<210> 135
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 2
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 135
ccgagccnaa ggcacc 16
<210> 136
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 3
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 136
nnuacuuacc ug 12
<210> 137
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 4
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 137
nauacuuacc ug 12
<210> 138
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 5
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 138
ccgngccgau uguacc 16
<210> 139
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 6
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 139
ccgagccgnu uguacc 16
<210> 140
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 7
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 140
ccgagccgan uguacc 16
<210> 141
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 8
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(11)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 141
ccgagccgau nguacc 16
<210> 142
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 9
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 142
ccgagccgau unuacc 16
<210> 143
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 10
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 143
ccgagccnau uguacc 16
<210> 144
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 11
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<400> 144
ccgagccgau uguanc 16
<210> 145
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 12
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<400> 145
ccgagccgau uguanc 16
<210> 146
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 13
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<400> 146
ccgagcngau uguacc 16
<210> 147
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 14
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 147
ccgagccncu uguccc 16
<210> 148
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的ORN 15
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 148
ccgagccgcu ugnccc 16
<210> 149
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 149
gagangcca 9
<210> 150
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 150
gaggngcca 9
<210> 151
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Am
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 151
gagungcca 9
<210> 152
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Cm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<400> 152
gagcngcca 9
<210> 153
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Um
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 153
gagcngcca 9
<210> 154
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 154
gagcnacca 9
<210> 155
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 155
gagcnccca 9
<210> 156
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 156
gagcnucca 9
<210> 157
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 157
gagcngaca 9
<210> 158
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 158
gagcnggca 9
<210> 159
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 159
gagcnguca 9
<210> 160
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 160
gagcgncca 9
<210> 161
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 161
gagcggnca 9
<210> 162
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 162
gagcggcna 9
<210> 163
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 163
gagnggcca 9
<210> 164
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 164
gancggcca 9
<210> 165
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 165
gngcggcca 9
<210> 166
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS-954 (DV-1079)
<400> 166
tgctcctgga ggggttgt 18
<210> 167
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRO-5
<400> 167
ctatctgacg ttctctgt 18
<210> 168
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS 2088
<400> 168
tcctggcggg gaagt 15
<210> 169
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS 869
<400> 169
tcctggaggg gttgt 15
<210> 170
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN-2114
<400> 170
tcctggaggg gaagt 15
<210> 171
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN 4024
<400> 171
tcctggatgg gaagt 15
<210> 172
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN 4084-F
<400> 172
cctggatggg aa 12
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS-661
<400> 173
tgcttgcaag cttgcaagca 20
<210> 174
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS-954
<400> 174
tgctcctgga ggggttgt 18
<210> 175
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN-24888
<400> 175
tcctggcggg gaagt 15
<210> 176
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IHN-ODN 2088
<400> 176
tcctggcggg gaagt 15
<210> 177
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN A151
<400> 177
ttagggttag ggttagggtt aggg 24
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-ODN
<400> 178
ctcctattgg gggtttccta t 21
<210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN INH-1
<400> 179
cctggatggg aattcccatc cagg 24
<210> 180
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN INH-18
<400> 180
cctggatggg aacttaccgc tgca 24
<210> 181
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-4
<400> 181
ttcccatcca ggcctggatg ggaa 24
<210> 182
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-13
<400> 182
cttaccgctg cacctggatg ggaa 24
<210> 183
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (pS-) ST-ODN
<400> 183
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 184
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN 21 14
<400> 184
tcctggaggg gaagt 15
<210> 185
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ndufa1(G51C) 3'-UTR
<400> 185
ggaagcattt tcctggctga ttaaaagaaa ttactcagct atggtcatct cttcctgtta 60
gaaggctatg cagcatatta tatactatgc gcatgttatg aaatgcataa taaaaaattt 120
taaaaaatct aaa 133
<210> 186
<211> 133
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ndufa1(G51C) 3'-UTR
<400> 186
ggaagcauuu uccuggcuga uuaaaagaaa uuacucagcu auggucaucu cuuccuguua 60
gaaggcuaug cagcauauua uauacuaugc gcauguuaug aaaugcauaa uaaaaaauuu 120
uaaaaaaucu aaa 133
<210> 187
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm PTO (Gm18变体1)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(9)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 187
gagcngcca 9
<210> 188
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm (Gm18变体3)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 188
gcngccaaa 9
<210> 189
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm PTO (Gm18变体4)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(9)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 189
gcngccaaa 9
<210> 190
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 190
ccgagcngc 9
<210> 191
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 9mer寡核苷酸 Gm, m6a
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 其中n是N6-甲基腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 其中n是N6-甲基腺苷
<400> 191
gngcngccn 9
<210> 192
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 12mer寡核苷酸 Gm, ac4c
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 其中n是4-乙酰胞苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(9)
<223> 其中n是4-乙酰胞苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(11)
<223> 其中n是4-乙酰胞苷
<400> 192
gagcnngcnc na 12
<210> 193
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN 2088 PTO (DNA寡核苷酸1)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(15)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<400> 193
tcctggcggg gaagt 15
<210> 194
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN 2088对照 (ODN 20959) PTO (DNA寡核苷酸2)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(15)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<400> 194
taatggcggg gaagt 15
<210> 195
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN 2088对照 (ODN 2087) PTO
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(15)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<400> 195
tcctgagctt gaagt 15
<210> 196
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ODN 2088对照 (ODN 20958) PTO
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(15)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<400> 196
tcctaacaaa aaaat 15
<210> 197
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS-954 (DV-1079) PTO
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(18)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<400> 197
tgctcctgga ggggttgt 18
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRS-661 PTO
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(20)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<400> 198
tgcttgcaag cttgcaagca 20
<210> 199
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INH-ODN-24888 PTO Em PTO
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(15)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> 其中n是7-脱氮-2'-O-甲基-鸟嘌呤
<400> 199
tcctggcngg gaagt 15
<210> 200
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRO-5
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 200
ctatctnncg ttctctgt 18
<210> 201
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SM-MePS PTO (RNA寡核苷酸1)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(17)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (9)..(10)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 201
nnannuuunn ggunnuu 17
<210> 202
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 12mer寡核苷酸 Um PTO
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(12)
<223> 其中所有核苷酸间键是硫代磷酸键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 202
ganacuuacc ug 12
<210> 203
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18mer寡核苷酸 Um, Gm, Cm, Am (RNA寡核苷酸5)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(6)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(7)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(9)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(14)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 203
nnnnnnnnnn nnnnnnnu 18
<210> 204
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2OMe 2 xG(S) (RNA寡核苷酸3)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(8)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 204
uugaununuu uagucgcuau u 21
<210> 205
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 27mer寡核苷酸 Gm (RNA寡核苷酸4)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
<400> 205
ggugggguuc ccgagcngcc aaaggga 27
<210> 206
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10-mer (Um)
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (8)..(10)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 206
ggncnacnnn 10
<210> 207
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (mU)21
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(21)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 207
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 208
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (mU)15
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(15)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 208
nnnnnnnnnn nnnnn 15
<210> 209
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> (mU)10
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(10)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 209
nnnnnnnnnn 10
<210> 210
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gal-mU
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(10)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(19)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的尿嘧啶
<400> 210
cnacacaaan cagcgannnu u 21
<210> 211
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gal-mC
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (11)..(11)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的胞嘧啶
<400> 211
nuananaaau nagngauuuu u 21
<210> 212
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gal-mA
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(9)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的鸟苷
2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated 腺苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> n可以是任何核苷酸，其中核苷酸是2-O-甲基化的，优选地2-O-甲基化的腺苷
<400> 212
cuncncnnnu cngcgnuuuu u 21

Claims (94)

1.一种组合，其包括或由以下组成：
(i)包含至少一种治疗性RNA的至少一种第一组分；和
(ii)包含至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的至少一种第二组分。
2.根据权利要求1所述的组合，其中所述至少一种RNA感知模式识别受体在结合RNA激动剂后诱导细胞因子。
3.根据权利要求1或2所述的组合，其中所述至少一种RNA感知模式识别受体在结合RNA激动剂后抑制翻译。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第二组分的至少一种拮抗剂减少在结合RNA激动剂后所述至少一种RNA感知模式识别受体的细胞因子诱导和/或减少在结合RNA激动剂后所述至少一种RNA感知模式识别受体的翻译抑制。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中与施用所述第一组分的至少一种治疗性RNA而不与所述第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂组合相比，施用所述第一组分的至少一种治疗性RNA和所述第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂的组合导致降低的先天免疫应答。
6.根据权利要求5所述的组合，其中通过测量细胞因子的所述诱导确定先天免疫应答的诱导。
7.根据权利要求6所述的组合，其中所述细胞因子选自IFN-α、TNF-α、IP-10、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-8、Rantes、MIP-1α、MIP-1β、McP1或IFNβ。
8.根据权利要求6或7所述的组合，其中细胞因子的所述诱导是通过将所述组合施用至细胞、组织或生物体中，优选地hPBMC、Hela细胞或HEK细胞中测量的。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述至少一种RNA感知模式识别受体是内体受体或细胞质受体，优选地内体受体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述至少一种RNA感知模式识别受体是用于单链RNA(ssRNA)的受体和/或用于双链RNA(dsRNA)的受体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述至少一种RNA感知模式识别受体选自Toll样受体(TLR)、维甲酸可诱导基因-I-样受体(RLR)、NOD-样受体、PKR、OAS、SAMHD1、ADAR1、IFIT1和/或IFIT5。
12.根据权利要求11所述的组合，其中所述至少一种Toll样受体选自TLR3、TLR7、TLR8和/或TLR9。
13.根据权利要求11或12所述的组合，其中所述至少一种Toll样受体选自TLR8和/或TLR9，最优选选自TLR7和/或TLR8。
14.根据权利要求11所述的组合，其中所述维甲酸可诱导基因-I-样受体(RLR)选自RIG-1、MDA5、LGP2、cGAS、AIM2、NLRP3、NOD2，优选地RIG1和/或MDA5。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第二组分的至少一种拮抗剂选自核苷酸、核苷酸类似物、核酸、肽、蛋白质、小分子、脂质、或这些中任一种的片段、变体或衍生物。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第二组分的至少一种拮抗剂是核酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第二组分的至少一种拮抗剂是单链核酸。
18.根据权利要求16或17所述的组合，其中所述第二组分的核酸包括或由选自以下的核苷酸组成：DNA核苷酸、RNA核苷酸、PNA核苷酸、和/或LNA核苷酸、或这些中任一种的类似物或衍生物。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸包括至少一种修饰的核苷酸和/或至少一种核苷酸类似物或核苷酸衍生物。
20.根据权利要求19所述的组合，其中所述至少一种修饰的核苷酸和/或至少一种核苷酸类似物选自骨架修饰的核苷酸、糖修饰的核苷酸和/或碱基修饰的核苷酸、或其任意组合。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的组合，其中所述至少一种修饰的核苷酸和/或所述至少一种核苷酸类似物选自1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、2-甲硫基-N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6-羟基正戊酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-羟基正戊酰基氨基甲酰基腺苷、肌苷、3-甲基胞苷、2'-O-甲基胞苷、2-硫胞苷、N4-乙酰基胞苷、赖氨酸、1-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2'-O-甲基鸟苷、辫苷、环氧辫苷、7-氰基-7-脱氮鸟苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、假尿苷、二氢尿苷、5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷′、5-羟基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷5-氧乙酸、尿苷5-氧乙酸甲基酯、5-氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硒基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫尿苷、或5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的组合，其中所述至少一种修饰的核苷酸是糖修饰的核苷酸，优选地2'核糖修饰的RNA核苷酸。
23.根据权利要求22所述的组合，其中所述2'核糖修饰的RNA核苷酸是2'-O-甲基化RNA核苷酸。
24.根据权利要求23所述的组合，其中所述2'-O-甲基化RNA核苷酸选自：2'-O-甲基化鸟苷(Gm)、2'-O-甲基化尿嘧啶(Um)、2'-O-甲基化腺苷(Am)、2'-O-甲基化胞嘧啶(Cm)、或这些核苷酸中任一种的2'-O-甲基化类似物。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸包括至少一个或多个三核苷酸M-X-Y基序，
其中M选自Gm、Um或Am，优选地其中M是Gm；
其中X选自G、A或U，优选地其中X是G；和
其中Y选自G、A、U、C、或二氢尿苷，优选地其中Y是C。
26.根据权利要求16至25中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸包括根据式I的核酸序列或由其组成：
NW-M-X-Y-NZ(式I)
其中N独立地选自G、A、U、C、Gm、Am、Um、Cm或修饰的核苷酸；
其中W是0或1至15的整数；
其中Z是0或1至15的整数；
其中M、X和Y根据权利要去25中限定进行选择。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸包括根据式I的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸序列或由其组成，其中根据式I的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸序列中每个是同一的或彼此独立地选择。
28.根据权利要求16至27中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸包含不含三磷酸基团的5'端。
29.根据权利要求16至27中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸包含在5'端的三磷酸基团。
30.根据权利要求16至29中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸的长度为约3至约50个核苷酸、约5至约25个核苷酸、约5至约15个、或约5至约10个核苷酸，优选地约5至约15个核苷酸。
31.根据权利要求16至30中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸的长度为5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、或13个核苷酸，优选地9个核苷酸。
32.根据权利要求16至31中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸是单链寡核苷酸。
33.根据权利要求32所述的组合，其中所述单链寡核苷酸是单链RNA寡核苷酸。
34.根据权利要求16至33中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸包括衍生自细菌tRNA，优选地细菌tRNATyr的核酸序列，或由其组成。
35.根据权利要求34所述的组合，其中所述核酸序列是细菌tRNATyr或衍生自细菌tRNATyr，优选地衍生自细菌tRNATyr的D-环，最优选地大肠杆菌tRNATyr的D-环。
36.根据权利要求16至35中任一项所述的组合，其中所述第二组分的核酸包括与选自SEQ ID NO:85-212的核酸序列或这些序列中任一个的片段同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或由其组成。
37.根据权利要求36所述的组合，其中所述第二组分的核酸包括与选自SEQ ID NO:85-87、149-212的核酸序列或这些序列中任一个的片段同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或由其组成，优选地其中所述第二组分的核酸包括与根据5'-GAG CGmG CCA-3'(SEQ ID NO:85)的核酸序列或其片段同一或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或由其组成。
38.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA选自编码RNA、非编码RNA、环状RNA(circRNA)、RNA寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、反义RNA(asRNA)、CRISPR/Cas9指导RNA、mRNA、核糖开关、核酶、RNA适配体、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、病毒RNA(vRNA)、逆转录病毒RNA、小核RNA(snRNA)、自我复制RNA、复制子RNA、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、和Piwi-相互作用RNA(piRNA)。
39.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA是体外转录的RNA。
40.根据权利要求39所述的组合，其中所述体外转录的RNA是使用序列优化的核苷酸混合物通过RNA体外转录可获得的。
41.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA是纯化的RNA。
42.根据权利要求41所述的组合，其中所述纯化的RNA通过RP-HPLC和/或TFF和/或Oligo d(T)纯化进行纯化。
43.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA是编码RNA。
44.根据权利要求43所述的组合，其中所述编码RNA选自mRNA、自我复制RNA、环状RNA、病毒RNA或复制子RNA。
45.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA是mRNA。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的组合，其中所述编码RNA或所述mRNA包括编码至少一种肽或蛋白质的至少一个编码序列。
47.根据权利要求46所述的组合，其中与不与所述第二组分的至少一种RNA感知模式识别受体的至少一种拮抗剂组合的所述编码RNA或所述mRNA的所编码的至少一种肽或蛋白质的表达相比，所述编码RNA或mRNA的所编码的至少一种肽或蛋白质的表达在施用至细胞、组织或生物体后通过与所述第二组分的至少一种RNA感知受体的至少一种拮抗剂组合而增加或延长。
48.根据权利要求46至47所述的组合，其中所述至少一种肽或蛋白质是或衍生自治疗性肽或蛋白质。
49.根据权利要求48所述的组合，其中所述治疗性肽或蛋白质是或衍生自抗体、胞内抗体、受体、受体激动剂、受体拮抗剂、结合蛋白、CRISPR相关内切核酸酶、蛋白伴侣、转运蛋白、离子通道、膜蛋白、分泌蛋白、转录因子、酶、肽或蛋白激素、生长因子、结构蛋白、细胞质蛋白、细胞骨架蛋白、病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、过敏原、肿瘤抗原或这些中任一种的片段、变体或组合。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的组合，其中所述至少一种编码序列是密码子修饰的编码序列，其中与由对应的野生型编码序列编码的氨基酸序列相比，由所述至少一种密码子修饰的编码序列编码的氨基酸序列优选地未被修饰。
51.根据权利要求50所述的组合，其中所述至少一种密码子修饰的编码序列选自C最大化编码序列、CAI最大化编码序列、人密码子选择适应编码序列、G/C含量修饰的编码序列和G/C优化的编码序列，或它们的任何组合。
52.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA，优选地mRNA，包括5'-帽结构。
53.根据权利要求52所述的组合，其中所述5'-帽结构是cap0、cap1、cap2、修饰的cap0或修饰的cap1结构。
54.根据权利要求53所述的组合，其中所述5'-帽结构是cap1结构。
55.根据权利要求54所述的组合，其中所述cap1结构是通过使用三核苷酸cap1类似物的共转录加帽可获得的。
56.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的治疗性RNA(种类)中约70％、75％、80％、85％、90％、95％包括使用加帽检测测定确定的cap1结构。
57.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA包括至少一种修饰的核苷酸或修饰的核苷酸类似物。
58.根据权利要求57所述的组合，其中所述至少一种修饰的核苷酸选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲基胞嘧啶、和/或5-甲氧基尿苷。
59.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA，优选地mRNA，包括至少一个聚(A)序列和/或至少一个聚(C)序列，和/或至少一个组蛋白茎环序列/结构。
60.根据权利要求59所述的组合，其中所述聚(A)序列位于所述治疗性RNA的3'末端，和/或其中所述RNA的3'末端由以A核苷酸终止的聚(A)序列组成。
61.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第一组分的至少一种治疗性RNA，优选地mRNA，包括至少一个异源5'-UTR和/或至少一个异源3'-UTR。
62.根据权利要求61所述的组合，其中所述至少一种异源3'-UTR包括衍生自基因的3'-UTR的核酸序列，所述基因选自PSMB3、ALB7、α-球蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9，或选自这些基因中任一种的同系物、片段或变体。
63.根据权利要求61所述的组合，其中所述至少一种异源5'-UTR包括衍生自基因的5'-UTR的核酸序列，所述基因选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2，或选自这些基因中任一种的同系物、片段或变体。
64.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第二组分的至少一种拮抗剂，优选地核酸，和/或所述第一组分的至少一种治疗性RNA与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物络合或缔合，或与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物至少部分络合或部分缔合，所述一种或多种阳离子或聚阳离子化合物优选地为阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子多糖、阳离子或聚阳离子脂质、阳离子或聚阳离子蛋白质或阳离子或聚阳离子肽、或其任意组合。
65.根据权利要求64所述的组合，其中所述一种或多种阳离子或聚阳离子肽选自SEQID NO:39至43，或其任意组合。
66.根据权利要求64所述的组合，其中所述阳离子或聚阳离子聚合物是包括HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH(肽单体的SEQ ID NO:42)的聚乙二醇/肽聚合物和/或包括HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH(肽单体的SEQ ID NO:43)的聚乙二醇/肽聚合物。
67.根据权利要求65或66所述的组合，其另外地包括脂质和/或类脂质。
68.根据前述权利要求中任一项所述的组合，其中所述第二组分的至少一种拮抗剂，优选地核酸，和/或所述第一组分的至少一种治疗性RNA与一种或多种脂质络合、与一种或多种脂质部分络合、被一种或多种脂质包封、被一种或多种脂质部分包封、或与一种或多种脂质缔合，由此形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体复合物、和/或纳米脂质体，优选地脂质纳米颗粒(LNP)。
69.根据权利要求68所述的组合，其中所述LNP包括：
(i)至少一种阳离子脂质，优选地脂质III-3；
(ii)至少一种中性脂质，优选地1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；
(iii)至少一种类固醇或类固醇类似物，优选地胆固醇；和
(iv)至少一种PEG-脂质，优选地式(IVa)的PEG化脂质，
优选地其中(i)至(iv)的摩尔比为约20-60％阳离子脂质；5-25％中性脂质；25-55％固醇；0.5-15％PEG-脂质。
70.药物组合物，其包括根据权利要求1至69中任一项所述限定的组合以及任选地至少一种药学上可接受的载体，或由其组成。
71.根据权利要求70所述的药物组合物，其中所述至少一种治疗性RNA和所述至少一种拮抗剂单独地配制。
72.根据权利要求71所述的药物组合物，其中所述至少一种治疗性RNA和所述至少一种拮抗剂共配制以增加在一个颗粒中存在两者的可能性，以确保所述至少一种治疗性RNA和所述至少一种拮抗剂被同一细胞摄取。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种拮抗剂，优选地核酸，与所述至少一种治疗性RNA的摩尔比范围为约1:1至约100:1，或范围为约20:1至约80:1。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种拮抗剂，优选地核酸，与所述至少一种治疗性RNA的重量-重量比范围为约1:1至约1:30，或范围为约1:2至约1:10。
75.根据权利要求70至74中任一项所述的药物组合物，其中与仅施用相应的治疗性RNA相比，向细胞、组织或生物体施用所述组合物导致所述治疗性RNA的基本相同或至少相当的活性。
76.根据权利要求70至74中任一项所述的药物组合物，其中例如与仅施用相应的治疗性RNA相比，向细胞、组织或生物体施用所述组合物导致所述治疗性RNA的增加的活性。
77.根据权利要求75或76所述的药物组合物，其中所述治疗性RNA的活性是编码的肽或蛋白质的表达，优选地蛋白质表达。
78.根据权利要求70至77中任一项所述的药物组合物，其中与仅施用相应的治疗性RNA相比，向细胞、组织或生物体施用所述组合物导致降低的(先天)免疫刺激。
79.试剂盒或部分的试剂盒，其包括权利要求1至69中任一项限定的至少一种第一组分和至少一种第二组分，和/或权利要求70-78中任一项限定的至少一种药物组合物，任选地包括用于溶解的液体载体，和任选地提供关于所述组分的施用和/或剂量的信息的技术说明。
80.根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒，其用作药物。
81.根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒，其用于长期医学治疗中。
82.根据权利要求81所述的医疗用途，其中在所述长期医学治疗中，施用所述组合、所述组合物、所述试剂盒或部分的试剂盒进行多于一次，例如每天一次或多于一次，每周一次或多于一次，每月一次或多于一次。
83.根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒，其用于治疗或预防感染，优选地病毒感染、细菌感染、或原生动物感染。
84.根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒，其用于治疗或预防肿瘤疾病，或与这类肿瘤疾病有关的紊乱。
85.根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒，其用于治疗或预防遗传紊乱或病症。
86.根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒，其用于治疗或预防蛋白质或酶缺乏。
87.一种治疗或预防紊乱、疾病或病症的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施加或施用根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒。
88.根据权利要求87所述的方法，其中施用所述第一组分和所述第二组分是基本上同时的。
89.根据权利要求87所述的方法，其中施用所述第一组分和所述第二组分是顺序的。
90.根据权利要求86至89中任一项所述的方法，其中施用所述组合、所述药物组合物、所述试剂盒或部分的试剂盒进行多于一次，例如每天一次或多于一次，每周一次或多于一次，每月一次或多于一次。
91.根据权利要求86至90中任一项所述的方法，其中所述施加或施用是皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、鼻内、口服、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、透皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内、眼内、玻璃体内、视网膜下、或瘤内。
92.根据权利要求86至91中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者是哺乳动物受试者，优选地人类受试者。
93.减少治疗性RNA的(先天)免疫刺激的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施加或施用根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒。
94.增加和/或延长(编码)治疗性RNA编码的肽或蛋白质的表达的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施加或施用根据权利要求1至69中任一项所述的组合，根据权利要求70至78中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求79所述的试剂盒或部分的试剂盒。
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