JPH06500014A - 多数の核酸相補体を生成させる環状伸長法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の　させる　゛ １且旦宜１ 本発明は、核酸の相補的コピーを多数生成させる方法に関する。詳しくは、新規 な環状鋳型を用いる上記相補コピーを生成させる方法に関する。

組換えＤＮＡ法によって、特定のＤＮＡフラグメントの単離と特性決定が可能に なり、分子生物学と遺伝学に革命がもたらされた。大きな効果は、複製連鎖反応 （ＰＣＲ）として知られている方法による少量のＤＮＡの指数関数的増幅であっ た。ＰＣＨの感受性、速度および適合性によって、上記の方法は、次のような広 範囲の用途、例えば医療診断法、ヒト遺伝学、法科学および生物科学の他の分野 に利用できるようになっている。

ＰＧＩ２は、標的配列の向かいあっているストランドとハイブリダイズする２つ のオリゴヌクレオチドブライマーが隣接しているＤＮＡ配列の酵素による増幅反 応である。そのプライマーはその３°末端によっておたがいの方向に向かって配 向されている。鋳型の熱変性、プライマーのその相補配列とのアニーリング、お よびアニールされたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長のサイクルを繰 り返すことによって、ＰＣＲプライマーの５°末端で形成されているセグメント が増幅される。各プライマーの伸長生成物は他のプライマーの鋳型として働（こ とができるので、各サイクルによって、数時間のうちに数百万の方法は、ゲノム ＤＮＡのような複合鋳型とともに使用可能でゲノムＤＮＡに含有されている単一 コピー遺伝子を増幅することができる。またこの方法は、Ｉ？ＮＡまたはＤＮＡ の複合混合物中で標的ＤＮＡの単一分子を増幅することが可能で、ある条件下で は、１０ｋｂｐ長までのフラグメント生成することができる。ＰＣＲ法は、米国 特許第４．８８３．１９５号、第４．８００．１５９号、第４．７５４．０６５ 号および第４．６８３．２０２号の課題であり、これらの特許はすべて本願に参 考として援用されている。

ＰＣＢを使用できる用途は多数あるが、ＤＮＡ配列が、標的配列の同かいあった ストランドとハイブリダイズする２つのプライマーを設計するのに充分な特異性 が分かっている場合に制限されている。その上に、加熱と冷却、プライマーのハ イブリダイゼーションおよび重合の繰り返しサイクルは時間がかかるので、高価 な百動式熱サイクル装置で実施するのが最適である。

ＰＣＲが明らかになってから、標的配列の；ビー数を増幅するいくつかの追加の 方法が考案されている。これらの方法は、少雪の標的配列の増幅を行うために各 種の方法を採用しているが、すべて固有の欠点がある。

連結連鎖反応法（ＬＣＲ）はこのような方法の１つである。国際特許公開第ｆｏ ｇ９／１２５９６号を参照のこと。この特許は本願に参考として援用されている 。この方法は、「プローブ」と呼ばれる予め作ったＤＮＡのストレッチを連結す るのにリガーゼ酵素を使う。これらのプローブがその相補的標的配列を見つけて これとアニールすると、そのリガーゼがその標的配列を連結し、ＰＣＨに見られ るのと類似の状態を起こす。すなわち、２つの鋳型を作り、その両者は標的配列 のさらに多くのコピーを生成する次のサイクルで作動する。

ＱＢレプリカーゼは標的配列を指数関数的に増幅させる別の手段である。この方 法は、酵素ＱＢレプリカーゼが組換えＲＮＡ分子のコピーを生成する能力に基づ いている。ＱＢレプリカーゼはバタテリオファージＱＢのＲＮＡ特異的ｔＲＮＡ ポリメラーゼである。

増幅される配列は、ＭＤＶ（ＨＡのようなＱＢの天然鋳型をコードする遺伝子中 にクローン化され、組換えＲＮＡとして産生される。

標的を増幅するために、組換えＲＮＡが相補的ＤＮＡとハイブリダイズし、ＲＮ Ａ合成の鋳型として作動する。ＫｒａｓｅｒおよびＬａｚａｒｄｉ、　Ｎａｔｕ ｒｅ、　３３９巻、４０１〜４０２頁、１９８９年を参照のこと。この文献は本 願に参考として援用されている。

さらに、転写ベースの増幅法（ＴＡＳ）が標的配列のコピー数を増幅するのに開 発されている。国際特許公開第ＷＯ３８／１０３１５号に記載されている。その サイクルは、標的ＲＮＡ配列からｃＤＮＡを合成することから始まる。ＴＡＳは ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含有する特殊な５°プライマーを利用 する。これらのプライマーを用いるとプロモーターの配列が２本鎖の生成物に組 み込まれる。プロモーターからの転写によって多数の！ｌＮＡｌＮ−が産生され る。次にこれらのコピーは、ｅＤＮＡの合成および転写の次のラウンドを行うた めに再プライム化することができる。この方法の欠点は、少なくとも３つの酵素 による工程を正確に実施する必要があることである。したがって全長の生成物を 得ることは困難である。

最後に、プライム化、伸長、切断、および標的配列のコピーを多数含有する線状 フラグメントの再アニーリングにより標的配列の増大法が発表された。Ｂｅａｋ ｅｒら、ヨーロッパ特許出願１０３００？９６号を参照のこと。この出願は本願 に参考として援用されている。この方法は、各サイクルで、標的配列の追加のコ ピーを生成するが、標的配列の多数のコピーで構成されている鋳型が各サイクル が終わる時に破壊されているので再使用できない欠点がある。さらに、コピーを 増加させるには各鋳型中に多数のコピーが存在していなければならないし、かつ 生成物の転写体は長さが非常に多様な転写体である。

上記の方法のほとんどが、生成物と鋳型の変性と再アニーリングの熱サイクル法 によっている。ＱＢレプリカーゼ法のような方法は、さらに、特殊な組換えＲＮ Ａ鋳型を必要とする。その上、すべての方法が線状の鋳型を用いているが、この 線状鋳型のいくつかは、増幅すべき配列の反復コピーを含有するよう特別に構成 されている。

したがって、変質性もしくは特殊な線状鋳型を用いずに、および時間のかかる熱 サイクル反応なしで標的配列の多数のコピーを生成する方法が要望されている。

このような方法は、医療診断法の効率を増大させるのに決定的に重要である。本 発明は、新規な環状鋳型を使用して上記の要望を満たすものであり、さらに関連 する利点を提供するものである。

会ｌ目と【旨 本発明は、少な（とも１つの切断部位を含有する１本鎖で環状の核酸鋳型の多数 の線状相補体を生成させる方法を提供する。その方法は、上記の一本鎖環状の核 酸鋳型を、）・イブリダイズするのに充分な条件下、ポリヌクレオチドプライマ ーと結合させ；次いでそのポリヌクレオチドブライマーを上記環のまわりを１回 以上伸長させて一本鎖で環状の核酸鋳型の１つ以上の連続相補体の相補的置換生 成物を生成させる方法である。本発明はさらに、線状ポリヌクレオチドを合成し 、その線状ヌクレオチドを連結して、−重鎖で環状の核酸を合成することによる 、３０と２２００との間のヌクレオチドの新規な一本鎖環状の核酸の合成法を提 供する。

Ｍ旦里皇ユ且旦 図１は、１本鎖環の概略図である。Ａは標的配列を示し、１０〜１０００塩基の 長さを有し、ポリヌクレオチドブライマーに対して相補的である。ＢとＣは、Ｏ 〜４００塩基の長さを有する配列を示し、環状相補体に対する検出配列として用 いられる。ｄ〜ｆはＯ〜１００塩基の長さを有する連続配列を示している。Ａ＝ ｅの配列はいずれも１つ以上の制限部位をもっている。

図２は、多数の核酸相補体の生成を示す概略図である。Ｇは、伸長のため標的ポ リヌクレオチドによってプライムされた一本鎖環を示す。Ｈは余分の一本鎖環を 示す。Ｉは、置換後、重合酵素によって伸長され多数の線状フンカテマーを生成 するＧを示す。Ｊは小さなフラグメントに切断されたｆを示す。にはＪＥｔｌの フラグメントでプライムされたＨを示す。反応１は重合酵素によるプライマーの 伸長反応である。反応２は、■が切断してＪを生成する反応である。反応３は、 Ｊ由来のフラグメントの環Ｈとの再アニーリングである。

図３は、一本鎖環を調製する構成を示す概略図である。Ｌは、連結する前にリン カ−ｍによって環状化された１つの線状フラグメントを示す。Ｎは、２つ以上の フラグメントのＯとＰで構成された環の形成を示し、これらのフラグメントは各 々長さが１５〜１１００塩基で配列は同じでも異なっていてもよい。Ｑはループ ｒとＳを含有する２つのサブユニットの連結によって少な（とも１つのステム構 造を生成できる環の生成を示す。Ｔは、ループｒとＳとを含有する単一の線状フ ラグメントを連結することによって少なくとも１つのステム構造を生成できる環 の生成を示す。Ｕは連結できる末端を有する１つ以上のステム構造を生成できる 環の生成を示す。Ｖは、ステム構造を部位Ｗで切断し、生成物の環を生成し連結 させることによって環を作ることを示す。

良肚囚２皿屋説亙 本発明は、一本鎖の環状核酸から多くの線状の相補体を生成するための簡便で安 価でありそして迅速な方法、およびこのような新規な環状核酸の生成方法にむけ られている。一本鎖の環状核酸から線状の相補体を生成するための重要な利点は 、この方法における各工程の異なる温度条件の必要性の軽減である。全工程は等 温的に遂行されるので、高価な熱サイクル装置の必要性が軽減される。従って、 この方法は医療診断法および感染症の分野での核酸の検出のための使用に適応さ れる。

１つの実施態様において、一本鎖環状核酸鋳型から多くの線状相補体を生成する ための方法には、該鋳型を生物学的試料中の被分析体などのポリヌクレオチドプ ライマーに組み合わせる工程が包含される。この組み合わせる工程は、プライマ ーと環状鋳型中の相補領域との間でプライマー−鋳型が形成される、ポリメラー ゼ伸長に使用され得るのに充分なハイブリダイゼーション条件下で行われる。例 えば、被分析体は、ウィルスあるいは細菌起源のものであって、　ＤＮＡあるい はＲＮＡで有り得る。

クレノーフラグメントのようなポリメラーゼによるプライマー−鋳型の伸長法で 、ストランド置換合成を介しての環状鋳型に対する線状フンカテマーを生成する 。そのことによって、合成されたＤＮＡセグメントは、環状鋳型のまわりをポリ メラーゼが通過するごとに新しいストランドに置換される。

この環状鋳型は、制限エンドヌクレアーゼ切断部位のような切断部位を含有し得 る。この制限エンドヌクレアーゼ部位は、相補的置換生成物に組み込まれ、そし て、制限ポリヌクレオチドにハイブリダイズされ、この置換生成物を切断して単 位長の線状相補体にするのに使用され得る。制限ポリヌクレオチドは、好ましく は、一本鎖の環状核酸鋳型であり、この環状鋳型中の制限部位は、エンドヌクレ アーゼの切断に対して耐性であるように改変されている。改変は、例えばメチル 化にいよって達成される。

ストランド置換合成および切断によって生成された線状相補体は、さらに他の線 状相補体の生成のための環状鋳型をプライムするのに使用され得る。線状相補体 にするための置換生成物のポリメラーゼ伸長および切断のための全ての成分は、 他のサイクルで使用し得るために残存している。この方法において、多数の線状 相補体が、少数の最初のポリヌクレオチドプライマーから生成される。

例えば、ポリヌクレオチドプライマーが生物学的試料の被分析体である場合には 、線状相補体の生成は被分析体の存在を意味する。線状相補体あるいは置換生成 物の検出は、当業者に公知の方法によって実施され得る。従って、本発明は、感 染病および遺伝症の迅速で効率のよい検出に使用され得る。

他の実施態様では、線状相補体を生成するための方法での使用のための新規環状 核酸を作製するための方法には、線状相補体の化学合成およびそれらの結合オリ ゴヌクレオチドとの結合が含まれる。結合オリゴヌクレオチドは、線状ポリヌク レオチドの末端に相補的な配列を有し、この線状ポリヌクレオチドにハイブリダ イズし得る。この２つの型の分子のハイブリダイゼーシヨンにより１つ以上の線 状ポリヌクレオチドの５°および３°末端をともにもたらす。この線状ポリヌク レオチドの末端を連結して、一本鎖環状核酸を生成する。

本ＢＡＩＩＥ書に眉いられている用語「一本鎖の環状核酸鋳型」あるいは「環状 鋳型」とは、その５°と３°末端とを結合して環状分子を形成する一本鎖核酸ポ リマーのことである。これらの一本鎖の環状鋳型には、一本鎖にされた小さな環 （３Ｇと７５０との間のヌクレオチド）、およびバクテリオファージ複製メカニ ズムを介してのインビボあるいはインビトロで生成される分子を合成するための 、本明細書に開示の方法により生成される分子が含まれる。さらに、完全に化学 合成により生成された環状分子も含まれる。環状鋳型はデオキシリボ核酸あるい はリボ核酸で有り得る。

本明細書に用いられている用語「切断部位ｊとは、ホスホジエステル骨格が選択 的に切断されるヌクレオチド配列のことである。例えば、制限エンドヌクレアー ゼにより認識されるヌクレオチド配列は、その配列中の切断部位で酵素がホスホ ジエステル骨格を切断するので、切断部位となる。このような切断部位は、エン ドヌクレアーゼに依存性して一本鎖あるいは二本鎖で有り得る。Ｍａｘａｍ　ａ ｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ配列分析でなされるピリミジンおよびプリン切断反応のよ うな化学的切断、あるいは本明細書に参考として援用されている米国特許第４゜ ７９５．７００号に開示されている酸化のような化学的方法も含まれる。

本明細書に用いられている用語「ポリヌクレオチドプライマー」とは、一本鎖環 状核酸にハイブリダイズするために充分に相補的な配列を有し、ポリメラーゼ伸 長反応のための基質として使用される任意の核酸のことである。この用語には、 置換生成物からの核酸、合成オリゴヌクレオチドおよび線状相補体の混合物中の 被分析体が含まれる。ＲＮＡおよびＤＮＡプライマーが使用され得る。プライマ ーの長さは、３゛末端のヌクレオチド型が鋳型を効果的にプライムし得る充分な 塩基対である限り変え得る。従って、本明細書の用語「プライマー−鋳型」とは 、一本鎖環状鋳型にハイブリダイズし、ポリメラーゼ伸長反応に使用され得るプ ライマーのことである。

本明細書に用いられている用語「置換合成」とは、二本鎖領域の一本鎖が酵素の プロセッシング性によって置換されるポリメラーゼ伸長反応のことである。事実 上このストランドは、同時に新しいストランド合成をともなって、鋳型からはが される。従って、本明細書の用語「相補的置換合成」あるいは「置換生成物」と は、この環状鋳型のまわりをポリメラーゼが進行してこの鋳型からはがされる置 換相補鎖のことである。

本明細書に用いられている用語「制限ポリヌクレオチド」とは、制限エンドヌク レアーゼ部位をコードし、相補鎖にハイブリダイズしたときに機能性制限エンド ヌクアーゼ部位を形成する核酸、好ましくは一本鎖デオキシリボ核酸のことであ る。制限ポリヌクレオチドの長さは、二本鎖の形態であるときに適切な制限酵素 がその配列を認識してホスホジエステル結合を切断するかぎりは変え得る。制限 ポリヌクレオチドには、線状のポリヌクレチドおよびオリゴヌクレオチド、なら びに本明細書に開示の環状鋳型のような環状核酸がふくまれ得る。

本明細書に用いられている用語「線状の相補体」とは、一本鎖環状鋳型の相補配 列のことである。線状相補体は、プライマー−鋳型基質からの伸長生成物であり 、置換合成により生成されるコンカテマーおよび環状鋳型のそれぞれのコピーが 含まれる。

本明細書に用いられている用語「ブロックされた」とは、改変された基の機能を 制限する、オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドの改変のことである。

このような機能には、ヌクレオチド（あるいは複数のヌクレオチド）の重合がふ くまれ得る。ブロックする基には、例えばオリゴヌクレオチドあるいはポリヌク レオチドに対する化学部分、有機ポリマーおよびマクロ分子のアタッチメントが 含まれる。オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドへのヌクレオチドの逆 付加も含まれる。改変には、ヌクレオチド塩基、糖部分およびホスファート骨格 への付加も含まれる。

本発明は、少なくとも１つの切断部位を含有する一本鎖で環状の核酸鋳型の多数 の線状相補体を生成させる方法であって、上記の一本鎖で環状の核酸鋳型を、ハ イブリダイゼーシゴンを行うのに充分な条件下でポリヌクレオチドブライマーと 連結させ；そのポリヌクレオチドプライマーを上記環のまわりを１回以上伸長さ せて、上記の一本鎖で環状の核酸鋳型の１つ以上の連続相補体からなる相補的置 換生成物を生成させ；次いでその置換生成物を切断して環状鋳型の線状相補体を 生させることによる方法を提供するものである。

図２（Ｇ）に示すように、一本鎖で環状の鋳型は、最初にポリヌクレオチドとハ イブリダイズさせる。得られたプライマー−鋳型は、核酸のポリメラーゼ特異的 合成に用いる基質である。例えば、鋳型がＤＮＡの場合、下記のような公知の任 意のＤＮＡポリメラーゼが相補的なりＮＡ鎖を合成するのに使用できる。

すなわちＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ１１　フレノウフラグメント、Ｔ４ もしくはＴ７のＤＮＡポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ類、逆転写酵素、Ｔａｑ ポリメラーゼ、ＢｓｔポリメラーゼおよびＴ、ｆｌａｖｉｎ互ポリメラーゼであ る。あるいは、鋳型がＲＮＡの場合、逆転写酵素が、相補的ＤＮＡ鎖を合成する のに使用できる。本発明は、上記のポリメラーゼ類を用いて、一本鎖で環状の核 酸の鋳型の多数のコピーを生成させる方法を提供するものである。

本発明は、ストランド置換合成をポリメラーゼで行うために選択されるポリヌク レオチドプライマーを提供するものである。この置換反応は種々の方式で行うこ とができる。例えば、全配列にわたって環状鋳型に相補的であるプライマーを選 択してもよい。その鋳型のまわりをプライマーが伸長すると、ポリメラーゼによ るプライマーの５°末端の置換が起こる。

得られた置換生成物は、図２（Ｉ）に示す環状鋳型に相補的な線状コンカテマー である。完全に相補的なプライマーが用−１られる場合、選択されるポリメラー ゼは、フレノウフラグメントのように５°から３′のエキソヌクレアーゼ活性を もって℃１ないものが好ましい。このように選択すると、ニノクトランスレーシ ブン活性を阻害して置換合成が保証される。

あるいは、ポリヌクレオチドプライマーとして、５°末端は環状鋳型の中に含ま れている配列に対して非相補的だが、３゜末端は環状鋳型に含まれている配列に 相補的で環状鋳型とハイブリダイズするものを選択してもよい。このプライマー −鋳型が前記環のまわりに伸長すると、プライマーの／％イブリダイズ領域と非 ハイブリダイズ領域の連結部で置換合成が行われる。

ポリヌクレオチドプライマーはまた、その５°末端がブロックされたものを選択 し得る。上記のようにプライマーの５°末端をブロックすると、置換合成を行う ことができる。５゛末端が非相補性のプライマーの場合には、例えば化学的部分 でその５″末端が改変されたプライマーは、ポリメラーゼの移動を阻害せず、ま たほとんどのポリメラーゼに見られる固有の５゜から３゛のエキソヌクレアーゼ 活性によって認識されることもない。それ故に、本発明は、ヌクレオチドブライ マーの５′末端が環状鋳型に対して非相補的か、またはプロ・ツクされて、ポリ メラーゼによって置換合成を行わせる、環状鋳型の多数の相補体を生成させる方 法を提供するものである。

さらに、本発明は、線状ポリヌクレオチドを化学的に合成し：その線状ポリヌク レオチドを、／％イブリダイズするのに充分な条件下で、相補的連結オリゴヌク レオチドと結合させ；次いでその線状ポリヌクレオチドを連結して一本鎖の環状 核酸を作ることによって；３０と７５０との間のヌクレオチドを含有する一本鎖 で環状の核酸を合成する方法を提供するものである。上記の連結は、酵素的手段 もしくは化学的手段によって行うことができる。

上記の線状ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法によって、化学的に合成さ れる（例えば、米国特許第４．５００．７０７号の方法がある。この方法は本願 に参考として援用されている）。現在の化学的合成法は、約２００塩基の長さま での線状ポリヌクレオチドを合成するのに使用できる。

約２００ヌクレオチドからなる一本鎖環状核酸を生成させるために、約２００ヌ クレオチドからなる線状ポリヌクレオチドが最初に合成される。その線状分子の ５°末端と３°末端は、相補的連結オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこ とによって環状分子を形成するように連結される（図３（Ｌ））。その連結オリ ゴヌクレオチドは、その５°末端が合成された線状ポリヌクレオチドの３°末端 と相補的で、および他方の３゛末端が線状ポリヌクレオチドの５゛末端と相補的 であるように設計される。

このようにして連結された線状ポリヌクレオチドの両端は連結反応で共有結合し ている。あるいは、ＲＮＡリガーゼは、ＤＮＡの両端を連結できるので、連結オ リゴヌクレオチドを使用せずに、環を連結するのに使用できる。さらに、同じ配 列の多数の線状ポリヌクレオチドからなるより大きな一本鎖環状核酸は、連結時 の成分の濃度を変えることによって得ることができる。

さらに、本発明は、環状核酸が２つ以上の線状ポリヌクレオチドから合成される 、一本鎖環状核酸の合成法を提供するものである（図３（Ｎ））。より大きな一 本鎖環状核酸の鋳型の合成は、例えば環の１７２の２つを線状ポリヌクレオチド として合成することによって達成することができる。例えば、４００ヌクレオチ ドからなる環を作るために、合計４００ヌクレオチドの２つの短い線状分子を最 初に合成する。

その線状分子を先に記載したのと同じ方式で連結して環状分子を作る。相補的に 連結するオリゴヌクレオチドは、一方の線状分子の５゛末端と、第２の線状分子 の３′末端とを結合するように設計される。例えば、４つの各末端に異なる末端 配列を含有する２つの線状分子を結合させるためには、２つの連結オリゴヌクレ オチドが必要である。一方の連結オリゴヌクレオチドは第１の線状分子の５°末 端に第２の分子の３゛末端とに相補的でなければならない。それ故に、第２の連 結オリゴヌクレオチドは、第１の分子の３°末端と箪２の分子の５°末端とに相 補的でなければならない。第１の線状分子の５°と３゜の末端がそれぞれ、第２ の線状分子の５°と３゛の末端の配列と同一もしくは類似していれば、単一の相 補的オリゴヌクレオチドだけを使ってもよい。相補的オリゴヌクレオチドと線状 分子とのハイブリダイゼーシッン反応で、線状分子の４つの末端が結合して非共 有結合で閉じた環を形成する。そのホスホジエステル骨格は連結し共有結合で閉 じた一本鎖環を形成することができる。類似の方式で３つ以上の線状ポリヌクレ オチド前駆物質からなる環を生成させることができる。その上に、線状ポリヌク レオチドを連結して環を作る別の方法を利用することができ、図３に示す。した がって、本発明は、３０と７５０との間のヌクレオチドを含有し、化学的に合成 されたオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドから生成される新規な一本 鎖環状核酸の鋳型を提供するものである。

本発明の一本鎖環状核酸の鋳型は、当業者には公知の各種の他の方法で生成する こともできる。例えば、一本鎖環状鋳型は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９１１９）　ｓ 　Ａｕ５ｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄＳｏｎｓ、（１９ ｇ？）；および５ｈｏｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 。

１６：７５８３−７６００　（１９１１ｇ）に記載されているインビボノイクテ リオファージ複製法によって誘導することができる。なおこれらの文献はすべて 本願に参考として援用されている。あるいは、本願に参考として援用されている ５ｈａｖｉｔｔおよびＬｉｕｎｅｈ、　Ｊ、。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１７１：３５３０−３５３１１　（１９８９）に 記載されてｌ、Ｍるようなインビトロ複製法を利用することができる。増幅され る配列はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”″（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 　５ｙｓｔｅｔｔｒｓ、　Ｌａ　Ｊｏｌｔａ、　ＣＡ）のような各種の入手し得 るファージベクター中にクローン化することができるし、または関連する配列だ けが残るようなベクターを構築することができる。本発明は、一本鎖環状核酸鋳 型がファージ複製から誘導される、環状鋳型の多数の相補体を生成させる方法を 提供するものである。

あるいは、環状核酸鋳型は、インビボのポリメラーゼ伸長反応で生成させること ができる。例えば、環状鋳型に形質転換される好ましくは５０と２２００との間 のヌクレオチドからなる配列が、線状鋳型のプライミングとポリメラーゼによる 伸長によって二本鎖分子としてまず合成される。線状二本鎖分子の所定の末端は 、公知の制限エンドヌクレチアーゼで消化して予め選択された配列の位置で切断 するか、または予め選択されたプライマーを複製連鎖反応合成法で用いることに よって生成される。線状伸長生成物は、まず前記二本鎖分子を変性し、それを前 記線状鋳型の各末端に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること によって、−重鎖分子として環状化することができる。この構造物をリガーゼで 処理すると、一本鎖環状鋳型が得られる。どの線状分子もＤＮアーゼ（例えばＥ ｘａ■）で消化して、連結しない相補的ストランドを含む残りの線状フラグメン トを除（ことができる。それ故に、本発明は、５０と２２００との間のヌクレオ チドである環状鋳型の多数の相補体を生成させる方法を提供するものである。

また本発明は、５０と２２０との間のヌクレオチドである新規な一本鎖環状核酸 を提供するものである。

環状核酸の合成は、前記の方法を組み合わせた方法と、当該技術分野で公知の方 法とを併用して達成することができる。

例えば、Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ、１１１：２６６１−２６６９　（１９９Ｇ）に記載されている二官能性ホ スホリル化剤を用いる方法を環状鋳型の合成に利用できる。なおこの文献は本願 に参考として援用されている。この方法は、長さが４つの塩基より長いヌクレオ チドの合成と環状化を行うことができ、または通常のホスホルアミダイト法とと もに用いて、化学的に合成された線状ポリヌクレオチドとして長さが５０と７５ ０との間のヌクレオチドのような長い分子を環状化することができる。したがっ て、本発明は、さらに化学的に合成されて３０と７５０との間のヌクレオチドか らなる一本鎖環状鋳皇の多数のコピーを生成させる方法を提供するものである。

他の実施態様では、本発明は、上記方法のいずれかによって生成される、５０〜 ２２００塩基の長さを有する小さな一本鎖環の特性決定法を提供するものである 。線状フラグメントを環状化すると、その線状フラグメントより通常遅いシフト した電気泳動移動度を有するバンドとして泳動する核酸生成物を生成する。この ような環は、次のようにして、最初の線状フラグメントまたは他の線状副生成物 から区別することができる。すなわち、１）マーカーに対する移動度のシフトに よって；２）環はＥＸＯＶ　Ｉ　Ｉで処理した場合（遊離の３゛末端もしくは５ °末端を要する）酵素によって分化されないことによって；３）環はプライムさ せることができ、かつプライマーは連続部位を通過して伸長できることによって ；および４ン非反復制限ポリヌクレオチドと連結部位以外の部位でアニールされ 、次に適切なエンドヌクレアーゼで切断したとき、環は１つの全長線状フラグメ ントだけを生成することによって区別できる。環を生成させるのに用いるリンカ −を含む非環状フラグメントは、ＥｘｏＬＩＩで分解され、線状末端を通過して 伸長できず、切断されると少なくとも２つのフラグメントを生成する。

本発明は、少な（とも１つの切断部位を有する、一本鎖環状鋳型を提供するもの である。この切断部位は、例えば、コンカテマーの置換生成物を個々の線状相補 体にするのニ用いる。

これらの個々の相補体は、環状鋳型の全体もしくは一部分の単一のコピーに相当 する。制限ポリヌクレオチドもしくは一本鎖環を相補的置換生成物とハイブリダ イズさせると、制限プライマーの長さの局所二本鎖領域を生成する。その二本鎖 領域は、適切なエンドヌクレアーゼ（すなわち、コードされている制限部位を認 識するエンドヌクレアーゼ）で処理された場合、そのエンドヌクレアーゼで切断 される基質である。

その切断部位は、予め決められた位置にコードされているので、その部位を切断 すると、所定の長さと配列を有する線状相補体を生成する。

さらに、本発明は、二本鎖型にハイブリダイズされると、切断を阻害するように 改変することができる制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、一本鎖環状鋳型の 多数の相補体を生成する方法を提供するものである。例えば、制限エンドヌクレ アーゼ活性を、改変された塩基でブロックすることができれば、ストランドの一 方もしくは両方が改変されている場合、適切な制限エンドヌクレアーゼはそのＤ ＮＡ切断しない。例えば、Ｈｐａ　ＩＩ、ＨａｅｌＩ、Ｈａｅｍおよび［１ｓｔ Ｕ１のようなエンドヌクレアーゼは、メチル化された部位を切断しないことが知 られている。

この実施態様の特別の使用法を図２（Ｊ）に示す。上記のように、置換生成物を 個々の線状相補体にまで切断すると、鋳型の部位が消化に対して無反応性でない ならば、環状鋳型は切断されて線状になる。例えば、Ｎｅ１ｓｏｎおよびＭｃＣ ｌｅｌｌａｎｄ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｆｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８ ７ン、　１５：２１９−２３ｆ）に記載されているようにメチル化反応によって 、環状鋳型のＨｐａＩＩ部位を改変すると、ヘミメチル化での消化を阻害し、そ して環状鋳型の構造を保存する。なお上記文献は本願に参考として援用されてい る。

好ましくは、環状鋳型は、ポリヌクレオチドブライマーと最初にハイブリダイズ する前に、本願に参考として援用されているＯｎｏおよびＵｅｄａ、　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８７）　１５：２１９−２３２に記載さ れているように、化学合成中、線状ポリヌクレオチドに５−メチルシトシンまた はメチルアデノンンのような改変塩基を組込むことによってメチル化される。ま た環状鋳型は、当業者に知られている他の各種の方法でもメチル化することがで きる。このような方法には、例えば、ＨｐａｌＩメチラーゼのような特異的なメ チラーゼ酵素を使って、環中の部位をメチル化する方法がある。それ故に、本発 明はさらに、鋳型の制限酵素部位をメチル化することによって改変する、該鋳型 の多数の相補体を生成させる方法を提供するものである。制限酵素活性をブロッ クできるか否かが分かっていない場合、溶解しているオリゴヌクレオチド二本鎖 分子を用いる簡単な方法によってどれ位の酵素活性が部位改変によって低下した かを容易に確かめることができる。

置換生成物の切断は、プライマーの伸長と置換合成に続いて行ってもよく、また は好ましくは、同時に行ってもよい。

前者の場合、制限エンドヌクレアーゼは後の方の時間に添加してもよい。置換合 成は、例えばポリメラーゼの熱変性または反応生成物の有機溶媒抽出によって停 止させることができる。制限ポリヌクレオチドを置換生成物とハイブリダイズさ せ、続いて適切なエンドヌクレアーゼで消化させる。後者の場合、制限ポリヌク レオチドと制限エンドヌクレアーゼが伸長反応に含まれる。置換生成物が産生さ れるとき、制限ポリヌクレオチドが置換生成物とハイブリダイズし、同時にエン ドヌクレアーゼによって消化される（図２（Ｊ）に示す。）同時に合成と制限を 行う間に、ハイブリダイズした制限ポリヌクレオチドのプライマー伸長によって 生成する伸長生成物が望ましくないものであれば、ポリメラーゼが、基質として 利月できない制限ポリヌクレオチドを選択し得る。これらのポリヌクレオチドは 、重合を行う遊離の３°末端ヌクレオチドをもっていない本願記載の環状鋳型、 または重合を行う基質でない線状分子であってもよい。例えば、ポリメラーゼが プライマー−鋳型を認識するには、プライマーの約３つの末端ヌクレオチドが鋳 型と正しくハイブリダイズすることが必要である（にｏｒｎｂｅｒｇ、　Ａ、、 　ＤＮＡ　ＲＥＰＬＩＣＡ丁１ＯＮ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ ｍｐａｎｙ　（１９１１０）、この文献は本願に参考として援用されている）。

それ故に、非相補体的３゛末端ヌクレオチドを持っている線状制限ポリヌクレオ チドを用いると、ポリメラーゼの伸長反応を無駄に促進する。あるいは、制限ポ リヌクレオチドの３°末端は化学的にブロックしてポリメラーゼ伸長反応を阻止 できる。２°、３−ジデオキシヌクレオシドを用いる３゛末端の化学的改変のよ うな保護基の付加末端ヌクレオチドの配向の逆転、またはアルキルアミンのよう な非ヒドロキシ部分の共有結合的連結によって、伸長生成物が制限ポリヌクレオ チドを失うことなく、置換生成物を同時に合成および切断することができる。し たがって本発明は、制限ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸であり、かつその ３°末端がポリメラーゼによるプライマー伸長に対して阻害性である、環状鋳型 の多数の相補体を生成させる方法を提供する。

さらに、制限ポリヌクレオチドは、切断されると、そのフラグメントは置換生成 物の５゛末端と１１イブリダイズしたままで残るように選択することができる。

切断されたときに、ハイブリダイズを種々の条件と温度下で保持するのに必要な 、制限部位からポリヌクレオチドの末端までの長さは、当業者には知られている か、または不適切な実験を行うことなく決定することができる。これらの方法は 、Ａｕ５ｕｂｅｌらの前記文献に詳細に記載されている。このようにして選択さ れた制限ポリヌクレオチドは、消化によって生成した線状相補体が、その後の鎖 置換合成に用いるポリヌクレオチドプライマーとして、直接または間接に使用で きる。制限ポリヌクレオチドの、線状相補体の５°末端とハイブリダイズしてい る部分は、前記の非相補的なまたはブロックされたポリヌクレオチドプライマー と類似の方式で機能するので、さらに環状鋳型と／％イブリダイズして重合する ことができる。

さらに、制限ポリヌクレオチドは、切断されたときに、線状相補体の３゛末端と ハイブリダイズしたフラグメントが不安定になりハイブリダイズしたままで残る ことがないように選択することができる。この切断によって、環状鋳型とハイブ リダイズする場合に、ポリメラーゼの基買として認識されて利用できる、線状相 補体の一本鎖３′末端が生成する。種々の条件及び温度のもとて不安定なポリヌ クレオチドの長さは、やはり、当業者が知っているか、または決定するこ・とが できる。例えば、ポリメラーゼにとって最適温度である３７℃において、消化さ れたときに約４つのヌクレオチドとしかハイブリダイズしない制限プライマーは 不安定である。その上、改変された環状鋳型を制限プライマーとして用いる場合 、線状相補体の消化された３°末端は環状鋳型と容易にハイブリダイズし、環状 鋳型と再ハイブリダイズを行うことなしに伸長することができる。環状鋳型をこ のように使用することは、環の切断がブロックされたときに宵利である。したが って、本発明は、線状相補体と一本鎖環状鋳型の間に直接ハイブリダイズしてプ ライマー−鋳型を形成する方法を提供するものである。

本発明はまた、少なくとも１つの切断部位を含有する一本鎖環状核酸鋳型の多数 の線状相補体を生成させる方法であって、（ａ）ハイブリダイゼーションを行う のに充分な条件下で、前記一本鎖環状核酸鋳型をポリヌクレオチドプライマーと 結合させ；（ｂ）上記ポリヌクレオチドブライマーを、上記環のまわりを１回以 上伸長させて、前記一本鎖環状核酸鋳型の１つ以上の連続相補体からなる相補的 置換生成物を生成させ；（Ｃ）上記置換生成物を切断して、環状鋳型の線状相補 体を生成させ；（ｄ）工程（ａ）で得た一本鎖環状鋳型を、ハイブリダイゼーシ ョンを行うのに充分な条件下で、工程（ｃ）で生成した線状相補体と結合させ； （ｅ）工程（ｂ）から（ｄ）を少なくとも１回繰返して環状鋳型の線状相補体を 生成させる方法を提供するものであるａ最初に生成された線状相補体を、順次ハ イブリダイズさせるか、または好ましくは同時にハイブリダイズさせることによ って、線状相補体の１回以上のサイクル（図２の工程Ｇ−Ｊに対応する上記の工 程ａ＝Ｃ）の生成物を生成されることができる。図２（ｋ、パート３〜６）は、 線状相補体の生成を描いた概略図を示す。したがって、ブライミング、ストラン ド置換合成、線状相補体の切断、および線状相補体による再ブライミングの反復 サイクルによって、最初のポリヌクレオチドプライマーのコピー数が指数関数的 に増幅される。環状鋳型の多数の相補体が生成するのは、最初のポリヌクレオチ ドプライマーが存在していることを示している。

また本発明は、全工程が等屋条件下で行われる、一本鎖環状鋳型の多数の線状相 補体を生成させる方法を提供する。本発明の好ましい実施態様を用いれば、例え ば、ポリヌクレオチドプライマー、制限ポリヌクレオチドおよび線状相補体のハ イブリダイズ、ストランド置換合成、並びに置換生成物の制限エンドヌクレアー ゼによる消化を含む全反応が、同じ温度で実施することができる。この温度は、 約２５℃と７０”Ｃとの間が好ましく、約３７から５０℃が一層好ましい。等温 条件によれば、前記サイクル中の多数の重複した工程を迅速かつ同時に実施する ことができる。

あるいは、一本鎖環状鋳型は、線状相補体とハイブリダイズする前、またはハイ ブリダイズ中に熱で変性してもよい。

熱による変性によって、全ての鋳型が合成の次のラウンドで確実に利用できるよ うになる。また線状相補体は、切断されると、環状鋳型とハイブリダイズする前 、またはハイブリダイズ中に熱によって変性することができ、有効なプライマー −鋳型のハイブリダイゼーションを行うために、制限ポリヌクレオチドの完全な 除去を確実に行う。

本発明は、合成のポリヌクレオチドのプライマーと合成の制限プライマーを利用 する。ポリヌクレオチドプライマーの化学合成法は当業者にはよく知られている 。ホスホルアミダイトヌクレオチドの化学反応のような、線状ポリヌクレオチド を合成する本願に開示した方法は、メーカーが提示するプロトコルと試薬を用い て自動合成器で通常実施される。

さらに、本発明は、ポリヌクレオチドプライマーが二本鎖および／または一本鎖 の核酸の混合物からなる、環状鋳型の多数の線状相補体を生成させる方法を提供 するものである。

例えば、生物学的試料内に核酸の被分析体が存在することが本願に記載の方法で 決定することができる。被分析体は、ウィルスもしくは細菌の様な感染性生成物 由来の核酸でもよい。

また被分析体はヒトのような宿主生物由来の核酸でもよい。

はとんどすべての起源由来の核酸を検出するので、本発明は多種類の臨床上の設 定に利用できる。多（の感染病および遺伝障害は本発明を用いて容易に診断する ことができる。

上記のような疾患と障害について分析すべき核酸は、生物の適切な組織もしくは 体液から単離して、線状相補体を生成させる際のポリヌクレオチドブライマーと して使用できる。

被分析体がＲＮＡの場合、ポリメラーゼ伸長を行うのに適切なポリヌクレオチド ブライマーとその３°末端は、予め選択された第１または第２のストランドのプ ライマーを用いて第１と第２のストランドのｃＤＮＡを合成することによって生 成させることができる。被分析体がＤＮＡの場合、プライマー伸長を行うのに適 切な３°末端は、そのＤＮＡを予め選択された制限酵素でＤＮＡを消化させるこ とで生成させることができる。したがって、３°末端のヌクレオチドが、環状鋳 型に対し充分相補的でプライマー−鋳型を生成する限り、いずれの核酸被分析体 も使用できるか、当該技術分野の通常の技術を用いて生成させることができる。

本発明の方法において、一本鎖環状核酸に対して有意に相補的である核酸のいず れの３゛末端も、置換生成物および線状相補体の合成を開始することができる。

このような核酸が、被分析体の標的配列のような望ましいポリヌクレオチドブラ イマーでない場合、非特異的なバックグラウンド（偽陽性のシグナル）が発生す る。非特異的バックグランドを減らすために、標的配列を含有する核酸の混合物 を、標的のある部分に相補的な核酸で処理してもよい。このような相補的核酸も しくはキャッチャ−核酸は、ビーズまたは膜のような固体支持体に固定化しても よく、またはビオチンのようなリガンドを含有させてもよい。このリガンドは、 ハイブリダイズしたキャッチャ−と標的配列を溶液から除去するのに使用できる 、ハイブリダイズしていない核酸を除去した後、標的フラグメントは一本鎖環状 核酸をプライムするのに用いることができる。標的ポリヌクレオチドのプライマ ーはこのように親和性で選択すると非特異的なバックグラウンドが大きく減少す る。

１）ＮＡもしくはｃＤＮＡのような二本鎖核酸を用いるか、またはポリヌクレオ チドのプライマーとして使用するために生成させた場合、そのストランドは、環 状鋳型とハイブリダイズする前に変性によって分離される。熱もしくはアルカリ による変性は、核酸のストランドを分離する２つの普通の方法であるが、利用で きる他の各種の方法が当業者に知られている。中間置換生成物の形態または線状 相補体の形態の被検体の検出は、当業者に知られている標準の蛍光染色法もしく はハイブリダイゼーション法を用いて行うことができる。

（以下余白） 本発明はまた、少な（とも１つの切断部位を含有する一本鎖環状核酸鋳型の多数 の線状相補体を検出する方法であって、（ａ）ハイブリダイゼーシヨンを行うの に充分な条件下、上記の一本鎖環状核酸鋳型をポリヌクレオチドブライマーと結 合させ；（ｂ）ポリヌクレオチドブライマーを、該層のまわりを１回以上伸長さ せて、一本鎖環状核酸鋳型の１つ以上の連続相補体からなる相補的置換生成物を 生成させ；（Ｃ）その置換生成物を切断して環状鋳型の線状相補体を生成させ１ （ｄ）工程（ａ）の一本鎖環状鋳型をハイブリダイゼーシヨンを行うのに充分な 条件下で、工程（ｃ）で生成した線状相補体と結合させ；　（ｅ）（ｂ）から（ ｄ）の工程を少なくとも一回繰り返して環状鋳型の線状相補体を生成させ；次い で（ｇ）線状相補体を検出する工程からなる方法である。

さらに、本発明は、置換生成物、制限ポリヌクレオチドとハイブリダイズした置 換生成物、線状相補体、または制限ポリヌクレオチドとハイブリダイズした線状 相補体から産生されるＤＮＡ、　ＲＮＡ、ポリペプチドおよび抗体のような産生 物を提供するものである。これらの核酸産生物、またはこれらの産生物をコード する核酸は、真核もしくは原核の生物内で増殖させるために、当該技術分野の通 常の技術を用いてベクター中クローン化することができる。ベクターの選択は、 核酸が増殖される生物によって決まる。さらに、クローン化された生成物は、イ ンビボで発現されてポリペプチドを産生ずることができるか（発現ベクターを用 いて）、または転写されて（転写ベクターを用いて）、インビトロで翻訳されて 組換えポリヌクレオチドを産生ずることができる。インビボもしくはインビトロ の方法によって得られるこのような組換えポリヌクレオチドは、さらに、Ｈａｒ ｌｏｔおよびＬａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ二Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　１９８８に記載されているようにして、モノクローナル抗体もしくはポリ クローナル抗体を作るのに使用することができる。上記文献は本明細書に弁考と して援用されている。

下記の実施例によって本発明を説明するが本発明を限定するものではない。

Ｌ１五 環状Ｍ１３ｉｐＨ１ＤＮＡ　（−末鎖もしくは二本鎖）を■、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌ　（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　Ｏ■）から購入した。合成のオリゴヌ クレオチドはすべて、ａ！準のホスホルアミダイト化学法を用い、Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　３ｇ０Ａ　ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｉｓ、　Ｆａｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　ＣＡ）で製造した。ＤＭＴ−ｏｎオ リゴヌクレオチドの精製は、１００ｍＭ　トリエチルアンモニウムアセテート中 ５から３０％のアセトニトリルにて１．０ｍｌ／ｍｌの流量で溶離する０、　３ ｘ　１５ｃ＋ａのＣ−８（３μ）カラムを用いる°ＤＭ丁ｏｎ”逆相ＨＰＬＣで 行った。５−メチル−２°−デオキシシチジンのホスホルアミドイトと、５°− ホスホリル化剤をＧｌｅｎ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ、■ｅｒｄｏｎ、　ＶＡから購入し た。指摘されている場合には、オリゴヌクレオチドリンカーは、Ｂｒａｎｃｈｅ ｄ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　［ｃａａ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）上で の合成によって、ブロックされた３°−末端を有するものが合成され、その結果 、３゛−ヒドロキシルにアルキルアミンを有するオリゴマーが得られる。環状生 成物と伸長生成物の大きさの測定は、アガロース（０，５〜４％）ゲルまたはボ アクリルアミド（４〜２０％）ゲルの電気泳動法による移動度に基づいておこな った。大きさのマーカーは、■ａｅｌｌｌで切断された二本鎖Ｐｈ１ｘ１７４ま たはＨａｅ　Ｉ　［Ｉで切断された一本鎖Ｍ１３　ＤＮＡであった。全核酸の合 成は、勤ｂｌルｕ−リＪユ封」：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒヨ４ａｎｕａｌ、　 ３巻、１９８８．　Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集Ｐ、　Ｅ１８−Ｅ１９に記載されて いる方法を用い、３２Ｐ−ｄＡＴＰもしくは３２Ｐ−ｄＣＴＰを組込んだ後ＤＥ −８１ディスクに核酸をイオン吸着させることによって定量を行った。反応中に 伸長されるプライマーの数は、既知の比活性を有する３２ｐで末端に標識をつけ たプライマーを用いて定量した。

プライムされた一本鎖ＤＮＡ環から産生される相補体の平均数は次のようにして 測定した。環状一本鎖ＤＮＡを、１０倍モル過剰の相捕的プライマーを添加して プライムする。プライマー伸長反応を、既知の比活性を有するα−３２Ｐ−ｄＡ ＴＰの存在下；結合させたプライマーで実施した。環状相補体に組込まれた３２ ｐの全量は２〜５μＬの反応混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ　ＤＥ８１イオン交換紙 にスポットすることによって測定した。そのＤＥ８１紙を、０．３ＭＮａＰＯａ 　ｐＨ７，ｏを泪いて１回洗浄当り５分間ずつ５回洗浄して、組込まれていない ３２Ｐ−ｄＡＴＰを除いた。そのＤＥ８１紙をシンチレーシ１ンカウンター法で 計数した。環状相補体当りのアデノニシン残基の数と、環状相補体の濃度は既知 であったので、１環状相補体の当りの比活性と、１環状相補体当り産生された環 状相補体の数を計算できた。

実施例■ のコピーを　る　）３００　のＭ３−　のこの実施例は、伸長後産生された相補 体ストランドを置換するＤＮＡポリメラーゼの能力と、１分間当り数百の塩基を 組込むポリメラーゼの能力を示す。

１９μｌ容積の反応液は、２００μＭｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰおよび α−３２ｐ−ｄＡＴＰ（６μＣ１ｏμｍｏｌ）を含有する伸長緩衝液（Ｌｏｗ） リス、ｐＨ７，４，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ、　１ｍＭジチオトレオール（ＤＴＴ） 中に、５０ｎＭのＭ１３モデルのプライマー（配列：　５　’　−ｄＧＧＴｒＴ ＴｃｃｃＡＧＴｃＡｃＧＡｃＧ）および５ｎＭのＭ１３ｍｐ１８の一本鎖環状Ｄ ＮＡ　（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｅｉｃａ１、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ ）を含有させた。伸長反応は、２単位のＤＮＡポリメラーゼクＬ／／つ７５グメ ント（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

ＭＤ）を含有する１μｌを添加することによって開始させた。負の対照は、プラ イマーを添加しないかまたは酵素を添加しなかった。伸長反応液を３７℃または ５０℃で１時間インキュベートした。全ＤＮＡ含有量を、反応液の２μｍ部分を ＤＥ８１アニオン交換紙のディスク（ｌＦｈａｔｍａｎ、　Ｃ１１ｆｔｏｎ、　 ＮＪ）上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７，３中で３回洗浄した 。また反応液の２〜５μｍ部分を、アガロースゲル電気泳動法、続いてＸＡＲフ ィルム（Ｋｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｓｓｔａｒ、　ＮＹ）によるオートランジオグ ラフィーによって分析して、伸長によって産生されたの平均の大きさを測定した 。得られた結果は、産生された環状相補体の平均の大きさが２５．０００塩基よ り大きいかまたは４１７塩基／分より大きい伸長速度を示した。これはｉｌｌ、 　０００以上の塩基の置換を示す。

実施例！Ｉ Ｍ１３に　づいた６８２　−　の この実施例は、組換え酵素法を用いて行った中間の大きさの一本鎖環の構築を示 す。

１ｍｇの一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８　（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｃ１ ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を、３００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５，４を含有する 全容積１５００μｌの液からエタノールで沈澱させ、遠心分離してペレット化し た。

上澄み液を除き、ペレットを７０％のエタノールで洗い減圧乾燥した。得られた ＤＮＡを５００μｍ水に再溶解した。得られた溶液の一部（９０μｌ、１８０Ｉ １ｇのＤＮＡ・７６ｐｍｏｌ）を次の方法で処理した。

２つの制限部位のオリゴヌクレオチドの各々１．５μｌ（７５０ｐｍｏｌ）を添 加しく５００μＭのＢｇｌ　ＩＩ／ＭＵ制限部位のオリゴヌクレオチ　ド、　配 列：　５ｌ−ｄＴに入ＧＡＧＡＴＣＴ入Ｃ入入入ＧＧＣｒＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴ ’παゴおよび１０ｐＭのＢａｍＨ１／Ｍ１３制限オリゴヌクレオチド、配列： ５官−ｄＴにＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡにλにＧＡＴＣＣＣ ＣＧ　）；１５μｍのＩＯＸ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅｒａｓ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）および ２７μｌの水を添加した。得られた混合物を６５°Ｃで３分間加熱し次いで氷上 で５分間冷却した。７．５ｕｌのＢａＩＩＨ１制限エンドヌクレアーゼ（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＋１．　ｔｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ） と７．５μｌのＢｇｌ　Ｉ＋制限エンドヌクレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　 Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）とを添加し、得られた混 合物を３７℃で３時間インキュベートした。

インキユベートの後、消化したＤＮＡの約０．５μｇを用いて１．５％アガロー ス・ミニゲル上で、消化の完成度についてチェックした。分取用１．５％アガロ ース（ＦＭＣＳｅａＫａｍ　ＧＴＧ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）　／ＴＡＢ をマーカーレーンを付けて調製した。アガロースゲル−ｏ−ディング染料（ａｇ ａｒｏｓｅ　ｇｅｔ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｄｙｅ）（１５゜０μｌ）を消化物に添 加した。その調製液の１０μｌをマーカーレーンに負荷し、残りを分取用ウェル に負荷した。試料をＴＡＥ緩衝液中、１．５時間、２５ｍＡで電気泳動させた。

マーカーレーンをゲルから切取り、Ｏ１Ｓμｇ／諷ｌの濃度の臭化エチジウム水 溶液で染色した。６１１２ｂｐのフラグメントを紫外線下で位置を決定し、ゲル 上の対応する場所から切り取った。

そのゲルスライスを５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　Ｅｌｕｔｒａ ｐ　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）に 負荷し、ｌｘ　ＴＡＥ緩衝液中で、４時間、１３０’／にて電気溶離を行った。

溶出液を回収し、ブタノールで４回抽出し、フェノール／クロロホルム／イソア ミルアルコールで２回抽出し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコールで１ 回抽出した。１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，４と２．５倍容積の１ ００％エタノールを添加し、得られた液を、エタノール／ドライアイス洛中で２ ０分間インキュベートしたＯこの調製液をマイクロヒュージで３０分間、室温に て、１４．Ｇｏ。

×Ｇで遠心分離した。上澄み液を除去し、０．７５ｍ１の７０％エタノールを添 加してペレットを洗浄し、生成した液を同条件で５分間再び遠心分離した。エタ ノールを除き、生成したペレ、２トを３分間減圧乾燥した。

乾燥したベレットを１００μｌの水に再溶解し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１００　 （Ａｍｉｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＥ）に負荷した。２■ｌの５０ｍＭ　 ＮａＯＨ／１ｍＭＥ　ＤＴＡを添加し、得られた液を固定角ローター（Ｍｏｄｅ ｌ　５Ｓ３４；Ｄｕｐｏｎｔ−５ｏｒｖａｌｌ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ Ｅ）で回転させて、４５分間室温で２４０Ｏｒｐｍで遠心分離した。上記の工程 を、追加の２■ｌのＮａＯＨ／ＥＤＴＡを加えて繰返した。１■ｌのＴＥ　１０ ：１　ｐ■８．０（１０ｍＭトリスｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を添加し、 上記のようにして遠心分離した。

６ｇ２ｂｐのフラグメントの環状化は次のようにして行った。合計容積３８μｌ の濃縮液を、ＣｅｎｔｒｉｃｏｎｌＯＯフィルター装置から回収した。４０μｌ の５Ｘリガーゼ緩衝液（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を添加 した。線状の６ｇ２ｂｐのフラグメントの両端をつなぐリンカ−分子を上記のよ うにして合成した。合成したリンカ−分子（Ｍ１３／６１１２連結リンカ−と呼 ぶ）は次の配列：　５　’　ｄＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧ ＧＣＴλＴＣＡＧ品　を有していた。１０７μｌのＨ２Ｏを添加し、得られた液 を６５°Ｃで５分間インキコベートし、次いで氷上で５分間、フラッシュ冷却し た。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を １μｍ当りＩＵ金含有る液３μｌを添加し、生成した液を１６℃で１時間インキ ュベートした。インキユベーションを行ってから、追加の２μｌのリンカ−を添 加した。

生成した液を６５°Ｃで５分間インキコベートし、氷上で５分間冷却し、次ぎに ３μｍのリガーゼを添加し続いて１時間１６℃でインキュベートした。追加の２ μｌのリンカ−を添加し、さらに６５℃でインキユベートし、水上で５分間急速 冷却を行った。３μｌの追加のりガーゼを添加し、反応生成物を１６°Ｃで一部 インキュベートした。

実施例ＩＩ＋ れた　。　と　−コア　１を　る ム７２　−　の この実施例は、オリゴヌクレオチド合成とこれに続く酵素による連結で環を作る 方法を用いて行う小さな一本鎖環状の構築を示す。

５°−ホスファートを有する７２塩基のＤＮＡオリゴマー（配列：標準のホスホ ルアミダイト化学法を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ 　ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　ｃ ｔｔｙ、　ｃＡ）で合成した。上記の７２塩基のＤＮＡオリゴマー中に含有され ているＨｐａ　ＩＩ制限部位（ＣＣＧＧ）中の両方のデオキシシチジンを、Ｈｐ ａＩＩによってこのオリゴマーが切断されるのを阻止するために、５−メチルデ オキシシチジンで置換した。また上記の７２塩基オリゴマーの各末端に相補的な １５塩基を有する３３塩基のリンカ−配列を合成した。リンカ−の３°末端は、 ３つの非相補的塩基を有しブロックされているので、リンカ−はポリメラーゼ反 応で伸長するのを阻止される。このオリゴマーは、７２塩基のオリゴマーの５゛ 末端と３°末端とを酵素連結させるのに用いた。

１０℃Ｍの７２塩基オリゴマー、５μＭの３３塩基のリンカ−オリゴマー、４０ ｍＭ）リス−Ｃ１ｐ［１７，Ｓ、１０＋＊ＭのＭｇＣｌ２．１ｈＭのジチオトレ オールおよび１ｍＭのＡＴＰを含有する１ｍＬ容積の反応液中で、７２塩基のオ リゴマーを酵素によって連結した。得られた反応混合物を５０℃で５分間インキ ュベートし、次に室温まで冷却した。４０．０００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）を反応混合物に添加した。得られた反応混合物を室温 で２時間インキュベートした。リンカ−濃度を１０℃Ｍにし、反応混合物をさら に１６時間室温でインキユベートした。

リンカ−の濃度を１５℃Ｍに増大して、反応混合物をさらに２時間室温でインキ ュベートした。得られた反応混合物をＩＸＴＢＥによる１０％ポリアクリルアミ ド／８Ｍ尿素ゲルで、１０００　Ｖにて４時間電気泳動を行った。ゆっくり泳動 する環状？２＋＋ｅｒの生成物をＵＶシャドウィング法で同定し、電気溶離し、 エタノールで沈澱させ、２６０ｎｍにおける光学濃度で定量した。得られた環状 の７２塩基オリゴマーは、Ｅｘｏ■による分解に耐性であり、かつプライマーに よって連結部位を通過して伸長できた。

実施例■ ！された　。　と　−コア　Ｃ ム　Ｏ−の 合成の１０１ｍａｒのオリゴマー（配列：５ｆ−ｐｄω工臥υＸ匹＝工込ＧＧ　 ）を実施例■と同様にして合成 した。下線を付けた部分は、下記の３３塩基のリンカ−に対して相補的な配列を 示す。この１０１塩基のオリゴマーは、制限エンドヌクレアーゼ■ｐａＩＩ　（ ＣＣＧＧ）　、Ｂｓｔ　Ｂｌ　（ＴＴＣＧＡＡ）およびＢｓｔ　ＩＪＩ　（ＣＧ ＣＧ）に対してブロックされた制限部位をもっている。

これらの制限エンドヌクレアーゼの制限部位内のすべてのデオキシシトシンを５ −メチルデオキシシトシンで置換して、制限切断を阻止した。上記１０１塩基オ リゴマーの各末端に相補的な１５塩基を有する３３塩基のリンカ−（配列：５° −ｄＴＣＡＧＡＧλ實ＴｒＡＡＴＣＡＴＡＡＴＧＴＣＣ？’ＡＴＣＡＧＴＡＧ　 ）　ヲ合成Ｌ　タｏ　コ（７）　！Ｊ　７　カーの３°末端は３つの非相補的塩 基と３″アミンとを合成し、リンカ−はポリメラーゼ反応で伸長するのを阻止さ れている。

このリンカ−オリゴマーを、上記の１０１塩基のオリゴマーの５゛末端と３°末 端を酵素連結させるのに使用した。１０１塩基のオリゴマーを酵素で連結し、実 施例■と同様にして生成した。

得られた環状の１０１＋ａｅｒは、ＥＸＯ■による分解に対して耐性でありかつ 連結部位を通過してプライマーによって伸長できた。

実施例Ｖ ！された　°　コア　１　る Ａ２０２−の この実施例は、２つのコア配列で構成され、その非反復配列の末端が酵素で連結 されて環を形成している小さな一本鎖環の構築を示す。

合成１０１塩基オリゴマー（配列：　５−ｐｄ実施例■と同様にして合成した。

この１０１塩基オリゴマーは、同じフ１塩基のコア配列、および各末端に異なる １５塩基のリンカ−配列をもっている。異なるリンカ−配列は下線を付けである が、この配列によって、上記のＬｏｔ塩基のオリゴマーと実施例■由来の１０１ 塩基のオリゴマーと特異的に連結することができる。また、各１０１塩基のオリ ゴマーの一方の末端に対して相補的な１５塩基を有する２つの３４塩基のリンカ −（配列：（１ｃ’ｒｃｃｃｃ−鳩）を合成した。これらのリンカ−の３゛末端 は４つの非相補的塩基と３°アミンを有し、これらのリンカ−はポリメラーゼ反 応で伸長するのを阻止されている。各リンカ−は、一方の１０１塩基オリゴマー の５°末端と他方の１０１塩基オリゴマーの３°末端を酵素で連結するのに使用 した。

各１０１塩基オリゴマーの濃度を０．６ｕＭとし、第１リンカ−の濃度を０．１ ５ＰＭから出発して０．７５ＰＭまで上昇させることを除いて実施例■と同様に して、両方の１０１塩基オリゴマーを酵素で連結し、精製して２０２塩基のオリ ゴマーを得た。この両方の１０１塩基のオリゴマーは、連結後ではなく連結する 前にゲルで精製した。得られた２０２塩基オリゴマーは、その濃度を０．３μＭ とし、第２リンカ−の濃度を０．１５ＰＭから出発して１．２μＭまで上昇させ ることを除いて実施例■と同様にして連結して環を生成させた。

実施例■ ６８−の この実施例は、ＤＮＡポリメラーゼが、伸長後に生成した相補体のストランドを 置換する能力、およびポリメラーゼが中間の大きさの一本鎖環に、１分間当り数 百の塩基を組み込む能力を示す。プライマー伸長反応を実施し、伸長生成物を実 施例■に記載したのと同様にして測定した。環状１ｉ８２ｂｐ−末鎖核酸を得る 伸長反応は、遊離のヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）　、合成３２ｐ標識プライマーフラグメント（５００ ０ｃｐｍ／　ｆｍｏｌｅ）　、およびＴ４　Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋ ｉｎａｓｅ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、 　ＭＡ）を用いて実施した。プライマー配列は、５　”　ＴＧＡＡＣＧＧＴＡＡ ＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴＡＣＣＣＣＧＧＴ ＴＧ入’！’３１であった。反応は、１０：１のモル比のプライマーと環、最終 濃度が５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）　、最終濃［カ２００μＭ（７） 遊離ｄＮＴＰ　（Ｐｈａｒ＋ｅａｃｉａ、　Ｐｌｅａｓａｎｔ旧１１．　ＣＡ） 　、フレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｅｏｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）、およびｔＯＸ伸長緩衝液からなる２０ μ！容積で実施した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。３．５ μｌの６Ｘアルカリ性ゲルローデイング緩衝液を反応液に添加し、次に０．７％ アルカリ性アガロースにて１６時間、ＩＳＯｍＡで電気泳動を行った。

得られたゲルを中和し、前記のようにして染色し、次ににｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡ Ｔ　ＡＲフィルム（にｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）にスクリーン をつけて室温で、２時間暴露し伸長生成物を分析した。６８２塩基の一本鎖環を 用いて作った環状相補体の平均の大きさは、２０．０００塩基より大きかった。

実施例■ …査基里旦亜長 異なるプライマー（配列：　５雷−ｄＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣ’ ＩＴ實λＧＡＧＡＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣ）を使用したことを除０て実施例Ｉと同 様にしてプライマー伸張反応を行った。３°末端の１９塩基は７２塩基環に対し て相補的であるが、Ｓ°末端の１８の塩基は７２塩基環に対して相補的でない。

７２塩基の一本鎖環を用いて生成した環状相補体の平均の大きさは１５０から２ ５０塩基であった。

実施例■ ７３００　−　の　およ　による ２プライマーの この実施例は、５ａｕ３Ａエンドヌクレアーゼが、増幅生成物である７３００塩 基の一本鎖環を切断して、伸長反応の次のサイクルで第２のプライマーとして用 いる線状相補体を生成する能力を示す。

１９μｌ容積の反応液は、２００μＭのｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ％ｄＡＴＰ％ｄＴ ＴＰおよび０．３３μＭのα３２Ｐ−ｄＡＴＰを含有する伸長緩衝液（２０ａ＋ ＭトリスｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２５ｍＭ　ＮａＣ１，６，５ｍＭ 　ＤＴＴ）中に５０ｎＭのＭ１３ｍｐ１ｇ一本鎖環（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）と５μＭ　Ｍ１３プライマー（１０ ０ｆｍｏｌｅ）を含有した液がある。３２Ｐ−ｄＡＴＰの最終の比活性は９．　 ＯＯＯｃｐｍ／ｐｍｏｌｅであった。伸長反応は、１μｌのＤＮＡポリメラーゼ クレノウクラグメント（６単位／μｍ、　ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ 、　ＭＤ）を添加して開始させ５０℃で１時間行つた。８単位／μｌの５ａｕ３ ＡＩ酵素（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）　２ｕ　１を、上記 反応混合物の２０μｍに添加して３７℃にて１時間消化させた。２０μｌの反応 混合物の４μｌを新しい試験管に移し、ヒートブロック（シリコーン油／砂また は沸騰水）によって１００°Ｃにて２分間変性させ、続いてドライアイス浴内で １分間冷却した。４０ｎＭのＭ１３ｍｐＨｌ一本鎖環と同濃度の上記伸長緩衝液 を含有する新しい反応混合液１６μｌを、上記の４μｌの冷却試料に添加した。

１μｌのＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントを添加し、伸長反応を５０℃ で１時間行った。切断／変性／伸長の上記のサイクルをさらに２回繰返した。切 断し伸長させた生成物を、ゲル法と全ＤＮＡ合成法で分析した。各試験管の２μ ｌを、０．５％アルカリ性アガロース変性ゲルに負荷し、１５０■Ａにて一夜泳 動させた。各試験管の１：１０希釈保存液を作り、その２μｌを使って、ＤＥ８ １　Ｗｈａｔｍａｎ紙上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７゜３の 液中で３回洗浄し、シンチレーシ冨ンカウンターで計数して全カウント分析を行 った、変性させて伸長させた試料を対照として使用した。結果は、伸長生成物が 切断され、その切断されたフラグメントが伸長反応の次のラウンドのプライマー として作動することを示した。Ｍ１３ｓｐ１８相浦体の各分子は約１７６０のア デニン残基を含有しているので、９．　ＯＯＯｃｐｍ／ｐｍｏｌの”Ｐ−ｄＡＴ Ｐを組み込むと比活性が１６．　ＯＯＯｃｐｍ／ｆｍｏｌの相補体生成物が得ら れる。結果は下記のとおりである（Ｅ＝伸長、Ｒ＝溶切断Ｄ＝熱変性）。

これらの結果は、１．３７５分子の環状相補体がポリヌクレオチドブライマーの もとの分子毎に形成されること；すなわちもとの標的ポリヌクレオチドの１３７ ５倍の増幅を示している。反応を５０℃の等温条件で繰り返したところ類似の結 果を得た。

実施例ｌＸ ７２　−　の　およ　による ２のプライマーの フレノウを３７℃で使用する代わりにＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ 、　Ｅｍｅｒｙｙｉｌｌｅ、　ＣＡ）を６０℃で使用することを除いて、実施例 ■と同様にしてプライマー伸長反応を行った。伸長生成物は、５ｍＭのＤＴＴと １μＭの３８塩基の制限リンカ−（配列は５゛−ｄＴＧ入ＣＴ入ＴＣＣＴＧＴＡ ＡＴ入Ａ入ＧＡＴＣ入入τＧＣにＴＣＣＧＧＴＣＴＡＣ−ＮＨ２）とで得られた 。この制限リンカ−が環状相補体に対して相補的で該相補体を２本鎖にする。１ ０単位のＨｐａ　ＩＩ制限エンドヌクレアーゼを添加し、反応混合物を３７℃で ３０分間インキュベートした。生成物をオートラジオグラフィーで目視できるよ うにした。環状相補体をこの手順に続いて７２塩基のフラングメントに切断した 。

本発明は、現時点で好ましい実施態様を参照して記載したが、本発明の思想から 逸脱することなく各種の変形を実施できると解すべきである。従って本発明は請 求の範囲によってのみ限定される。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ 「　８ ８　「 国際調査報告 に□＆―−−１“−１″ＤＩ”？／ｌ言ぐ１１＋ＭｅＱｔ、７

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つの切断部位を含有する一本鎖環状核酸鋳型の多数の線状相補 体を生成させる方法であって、（ａ）該一本鎖環状核酸鋳型を、ハイブリダイゼ ーションを行うのに充分な条件下でポリヌクレオチドプライマーと結合せ；次い で （ｂ）該ポリオヌクレオチドプライマーを該環のまわりを１回以上伸長させて、 該一本鎖環状核酸鋳型の１つ以上の連続相補体を含む相補的置換生成物を生成さ せること；を包含する、方法。
2. ２．少なくとも１つの切断部位を含有する一本鎖環状核酸鋳型の多数の線状相補 体を生成させる方法であって、（ａ）該一本鎖環状核酸鋳型を、ハイブリダイゼ ーションを行うのに充分な条件下でポリヌクレチドプライマーと結合させ；（ｂ ）該ポリヌクレオチドプライマーを該環のまわりを１回以上伸長させて、該一本 鎖環状核酸鋳型の１つ以上の連続相補体を含む相補的置換生成物を生成させ；（ ｃ）該置換生成物を切断して、環状鋳型の線状相補体を生成させ； （ｄ）工程（ａ）の一本鎖環状鋳型を、ハイブリダイゼーションを行うのに充分 な条件下で、工程（ｃ）で生成した線状相補体と結合させ；次いで （ｅ）工程（ｂ）から（ｄ）を少なくとも１回繰返して環状鋳型の線状相補体を 生成させ、最後の繰返しサイクルが工程（ｂ）もしくは（ｃ）で終わること； を包含する、方法。
3. ３．工程（ａ）の環状鋳型を工程（ｄ）で使用する前に変性する、請求項２に記 載の方法。
4. ４．工程（ｃ）の生成物を工程（ｄ）で使用する前に変性する、請求項２に記載 の方法。
5. ５．全工程を等温条件下で実施する、請求項１または２に記載の方法。
6. ６．前記ポリヌクレオチドプライマーが、二本鎖核酸、一本領核酸またはその混 合物である、請求項１または２に記載の方法。
7. ７．前記核酸が生物学的試料由来である、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記ポリヌクレオチドプライマーが二本鎖であり、そのストランドが工程（ ａ）の前もしくは工程（ａ）中で変性することによって分離される、請求項６に 記載の方法。
9. ９．前記変性が熱変性である、請求項８に記載の方法。
10. １０．前記ポリヌクレオチドプライマーが合成オリゴヌクレオチドである、請求 項１または２に記載の方法。
11. １１．前記ポリヌクレオチドプライマーが、ストランド置換合成をポリメラーゼ で行わせるように選択される、請求項１または２に記載の方法。
12. １２．前記ポリヌクレオチドプライマーの５′末端が、前記環状鋳型に対して非 相補的である、請求項１または２に記載の方法。
13. １３．前記ヌクレオチドプライマーの５′末端がブロックされている、請求項１ または２に記載の方法。
14. １４．（ａ）線状ポリヌクレオチドを化学的に合成し；（ｂ）該線状ポリヌクレ オチドを、ハイブリダイゼーションを行うのに充分な条件で、相補的連結オリゴ ヌクレオチドと結合させ；次いで （ｃ）該線状ポリヌクレオチドを連結して、一本鎖環状核酸を生成すること； を包含する、一本鎖環状核酸の合成方法。
15. １５．前記環状核酸が、２つ以上の線状ポリヌクレオチドとして合成される、請 求項１４に記載の方法。
16. １６．前記核酸が３０と２２００との間のヌクレオチドを有する、一本鎖環状核 酸。
17. １７．前記核酸が３０と７５０との間のヌクレオチドを有する、請求項１６に記 載の一本鎖環状核酸。
18. １８．前記核酸が５０と３００との間のヌクレオチドを有する、請求項１７に記 載の一本鎖環状核酸。
19. １９．前記環状核酸がさらに少なくとも１つの切断部位を有する、請求項１８に 記載の一本鎖環状核酸。
20. ２０．前記環状核酸の一部分が、二本鎖核酸、一本鎖核酸またはその混合物を含 む生物学的試料由来のポリヌクレオチドプライマーに対して相補的である、請求 項１９に記載の一本鎖環状核酸。
21. ２１．前記一本鎖環状核酸鋳型がファージ複製で誘導される、請求項１または２ に記載の方法。
22. ２２．前記一本鎖環状核酸鋳型が５０と２２００との間のヌクレオチドである、 請求項１または２に記載の方法。
23. ２３．前記一本鎖環状核酸鋳型が、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドまた はポリヌクレオチドでできている、請求項１または２に記載の方法。
24. ２４．前記一本鎖環状核酸鋳型が、５０と７５０との間のヌクレオチドである、 請求項２３に記載の方法。
25. ２５．前記置換生成物の切断が１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで行われる、 請求項１または２に記載の方法。
26. ２６．前記一本鎖環状核酸鋳型の１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位が、少 なくとも改変されたストランドが切断されるのを阻止するように改変可能である 、請求項２５に記載の方法。
27. ２７．前記制限エンドヌクレアーゼ部位がＨｐａＩＩである、請求項２５に記載 の方法。
28. ２８．前記１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を、メチル化反応で改変する 、請求項２６に記載の方法。
29. ２９．前記制限ポリヌクレオチドが、切断されたときに、制限ポリヌクレオチド のフラグメントが置換生成物の５′末端とハイプリダイズしたままで残っている ように選択される、請求項１または２に記載の方法。
30. ３０．前記制限ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸であり、その３′末端が、 ポリメラーゼによるプライマー伸長に対して阻害性である、請求項１または２に 記載の方法。
31. ３１．前記ポリメラーゼが、Ｅ．ｏｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラ グメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、改変ポリメラー ゼ類、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ類あるいはＴ．ｆ ｌａｖｉｎｓポリメラーゼを含む群から選択される、請求項１または２に記載の 方法。
32. ３２．少なくとも１つの切断部位を含有する一本鎖環状核酸鋳型の多数の線状相 補体を検出する方法であって、（ａ）該一本鎖環状核酸鋳型を、ハイブリダイゼ ーションを行うのに充分な条件下でポリヌクレオチドプライマーと結合させ； （ｂ）該ポリヌクレオチドプライマーを該環のまわりを１回以上伸長させて、該 一本鎖環状核酸鋳型の１つ以上の連続相補体を含む相補的置換生成物を生成させ ； （ｃ）その線状相補体を検出すること；を包含する、方法。
33. ３３．少なくとも１つの切断部位を含有する一本鎖環状核酸鋳型の多数の線状相 補体を検出する方法であって、（ａ）該一本鎖環状核酸鋳型を、ハイブリダイゼ ーションを行うのに充分な条件下でポリヌクレオチドプライマーと結合させ； （ｂ）該ポリヌクレオチドプライマーを該環のまわりを１回以上伸長させて、該 一本鎖環状核酸鋳型の１つ以上の連続相補体を含む相補的置換生成物を生成させ ；（ｃ）該置換生成物を切断して環状鋳型の線状相補体を生成させ； （ｄ）工程（ａ）の一本鎖環状鋳型を、ハイブリダイゼーションを行うのに充分 な条件下で、工程（ｃ）で生成した線状相補体と結合させ； （ｅ）工程（ｂ）から（ｄ）を少なくとも１回繰り返して環状鋳型の線状相補体 を生成させ、その最後の繰り返し工程が工程（ｂ）もしくは（ｃ）で終わり；次 いで、 （ｆ）該線状相補体を検出すること； を包含する、方法。
34. ３４．前記検出する工程がハイブリダイゼーションによる、請求項３２または３ ３に記載の方法。
35. ３５．前記検出する工程が蛍光による、請求項３２または３３に記載の方法。
36. ３６．前記ポリヌクレオチドプライマーが二本鎖核酸、一本鎖核酸、またはその 混合物を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
37. ３７．前記核酸が生物学的試料由来である、請求項３６に記載の方法。
38. ３８．請求項１または２に記載の方法で生成された置換生成物。
39. ３９．請求項１または２に記載の方法で生成された制限ポリヌクレオチドとハイ ブリダイズした置換生成物。
40. ４０．請求項１または２に記載の方法で生成された線状相補体。
41. ４１．ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよび抗体からなる群から選択される、請 求項３８に記載の生成物でできた生成物。
42. ４２．ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよび抗体からなる群から選択される、請 求項３９に記載の生成物で生成された生成物。
43. ４３．ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよび抗体からなる群から選択される、請 求項４０に記載の生成物で生成された生成物。
44. ４４．さらに、置換生成物を切断し、環状鋳型の線状相補体を生成させる工程（ ｃ）を含む、請求項１に記載の方法。
45. ４５．前記ポリヌクレオチドプライマーが親和性で選択される、請求項１または ２に記載の方法。