CN115361954A - 用于翻译的组合物及其使用方法 - Google Patents

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CN115361954A CN202180024986.4A CN202180024986A CN115361954A CN 115361954 A CN115361954 A CN 115361954A CN 202180024986 A CN202180024986 A CN 202180024986A CN 115361954 A CN115361954 A CN 115361954A
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Abstract

本发明一般涉及多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的药物组合物和制剂以及其用途。

Description

用于翻译的组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年1月29日提交的美国临时申请号62/967,547的优先权及权益，将所述申请的全部内容通过引用并入本文中。
背景
某些环状多核糖核苷酸普遍存在于人的组织和细胞中，包括健康个体的组织和细胞。
概述
本披露一般涉及包含经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的组合物。在一些实施例中，本文所述的组合物是进一步包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本披露进一步涉及使用包含含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的组合物来翻译所述环状多核糖核苷酸的表达序列的方法。在一些实施例中，与单独的环状多核糖核苷酸的组合物中所述环状多核糖核苷酸的表达序列的翻译相比，包含含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的组合物中所述环状多核糖核苷酸的表达序列的翻译增加。在一些实施例中，与单独的环状多核糖核苷酸的组合物中所述环状多核糖核苷酸的表达序列的翻译相比，包含含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的组合物中所述环状多核糖核苷酸的表达序列的翻译延长。
在第一方面，本发明的特征在于药物组合物，其包含：(a)含有经5’修饰的鸟苷帽和第一结合区的多核糖核苷酸；(b)环状多核糖核苷酸；和(c)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含第二结合区。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区特异性地结合。在一些实施例中，当包含经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，所述多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。在一些实施例中，多核糖核苷酸通过间接结合与环状多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，多核糖核苷酸通过直接结合与环状多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，多核糖核苷酸通过共价结合与环状多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，多核糖核苷酸通过非共价结合与环状多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区互补。
在一些实施例中，多核糖核苷酸募集核糖体。在一些实施例中，多核糖核苷酸的经5’修饰的鸟苷帽募集核糖体。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含表达序列。在一些实施例中，包含经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸驱动环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。
在一些实施例中，多核糖核苷酸进一步包含UTR。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5’UTR。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含3’UTR。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含聚A区。在一些实施例中，第一结合区是UTR的3’的结合区。在一些实施例中，第一结合区包含5至100个核苷酸的长度。
在一些实施例中，经5’修饰的鸟苷帽是7-甲基鸟苷帽。在一些实施例中，经5’修饰的鸟苷帽是抗反向帽类似物。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含一个或多个经5’修饰的鸟苷帽。在一些实施例中，多核糖核苷酸是线性的。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是未经修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含IRES。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少IRES。在一些实施例中，第二结合区包含5至100个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含终止密码子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含位于终止密码子与起始密码子之间的非翻译区中的第二结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含加密原、调节元件、复制元件或准双链二级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在第二结合区与交错元件之间包含终止密码子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含蛋白质翻译起始位点。在一些实施例中，蛋白质翻译起始位点包含科扎克(Kozak)序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至20000个核苷酸的长度。
在第二方面，本发明的特征在于药物组合物，其包含：(a)含有经5’修饰的鸟苷帽和第一结合区的第一多核糖核苷酸；(b)含有经5’修饰的鸟苷帽和第三结合区的第二多核糖核苷酸；(c)环状多核糖核苷酸；和(d)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含第二结合区和第四结合区。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区特异性地结合，并且第三结合区与第四结合区特异性地结合。在一些实施例中，当第一多核糖核苷酸和第二多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，所述多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。在一些实施例中，与当所述第一多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达相比，或与当所述第二多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达相比，当所述第一多核糖核苷酸和所述第二多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时，所述第一多核糖核苷酸和所述第二多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达增加。
在第三方面，本发明的特征在于包含经5’修饰的鸟苷帽和第一结合区的多核糖核苷酸，其中所述第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区特异性地结合。
在第四方面，本发明的特征在于包含第二结合区的环状多核糖核苷酸，其中所述第二结合区与多核糖核苷酸的第一结合区特异性地结合，且其中所述多核糖核苷酸包含经5’修饰的鸟苷帽。
在第五方面，本发明的特征在于复合物，其包含：前述实施例中任一项所述的多核糖核苷酸；及前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸的所述第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的所述第二结合区结合。
在第六方面，本发明的特征在于产生复合物的方法，所述方法包括将前述实施例中任一项所述的多核糖核苷酸的第一结合区与前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸的第二结合区结合，由此产生所述复合物。
在第七方面，本发明的特征在于在细胞中表达来自环状多核糖核苷酸的表达序列的方法，所述方法包括将前述实施例中任一项所述的复合物递送至所述细胞，其中所述复合物的所述环状多核糖核苷酸包含表达序列。
在第八方面，本发明的特征在于前述实施例中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于在通过疗法治疗人体或动物体的方法中使用。
在第九方面，本发明的特征在于前述实施例中任一项所述的复合物，所述复合物用作药剂或药物。
在第十方面，本发明的特征在于前述实施例中任一项所述的复合物，所述复合物用于在通过疗法治疗人体或动物体的方法中使用。
在第十一方面，本发明的特征在于前述实施例中任一项所述的复合物或前述实施例中任一项所述的多核糖核苷酸以及前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸，在制备药剂或药物中的用途。
在第十二方面，本发明的特征在于前述实施例中任一项所述的复合物或前述实施例中任一项所述的多核糖核苷酸及前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸，在制备用于通过疗法治疗人体或动物体的药剂或药物中的用途。
定义
本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但本发明不限于此，而是仅受权利要求书限制。除非另有说明，否则通常应以其常见意义来理解下文中所陈述的术语。
术语“药物组合物”旨在披露包含在药物组合物中的环状多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。因此，这意味着等同于“用于在疗法中使用的环状多核糖核苷酸”。
如本文所用，术语“circRNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”可互换使用，并意指具有不含游离端(即，没有游离的3’和/或5’端)的结构的多核糖核苷酸，例如通过共价键或非共价键形成环状结构的多核糖核苷酸分子。
如本文所用，术语“加密原”是环状多核糖核苷酸的核酸序列或结构，所述核酸序列或结构有助于降低、逃避和/或避免免疫细胞的检测和/或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的诱导。
如本文所用，术语“表达序列”是编码产物，例如肽或多肽或调节核酸的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可包含多个核苷酸三联体，其中的每一种都可编码氨基酸并被称为“密码子”。
如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有对未经修饰的天然核糖核苷酸的化学组成(诸如天然未经修饰的核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鸟嘌呤(G)、胞苷(C))的一个或多个化学修饰的任何核糖核苷酸类似物或衍生物。在一些实施例中，经修饰的核糖核苷酸的化学修饰是对核糖核苷酸的任何一个或多个官能团，诸如糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。
如本文所用，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。
如本文所用，短语“准双链二级结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生内部双链。
如本文所用，术语“调节元件”是修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的一部分，例如核酸序列。
如本文所用，术语“重复核苷酸序列”是一段DNA或RNA内或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚TG(UG)序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子Alu家族中的重复序列。
如本文所用，术语“复制元件”是可用于复制或者起始环状多核糖核苷酸转录的序列和/或基序。
如本文所用，术语“交错元件”是在翻译期间诱导核糖体暂停的一部分，例如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可包含化学部分，例如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸，或其任何组合。
如本文所用，术语“基本上对……有抗性”是指与参考物相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性的物质。
如本文所用，术语“翻译起始序列”是起始环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的核酸序列。
如本文所用，术语“终止元件”是终止环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的一部分，例如核酸序列。
如本文所用，术语“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可表达为每给定量的编码蛋白质或肽的转录物所产生的蛋白质或肽的量，例如在给定时间周期内，例如在给定翻译系统中，例如在体外翻译系统(像兔网织红细胞裂解物)或体内翻译系统(像真核细胞或原核细胞)中。
如本文所用，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其起始材料的测量。
如本文所用，术语“免疫原性”是在特定免疫应答测定中诱导对物质的应答高于预定阈值的的潜力。所述测定可以是例如某些炎性标志物的表达、抗体的产生或如本文中所述的免疫原性的测定。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于免疫原性物质时，可诱导免疫应答。
可使用总抗体测定、确认试验、抗体的滴定及同种型分析以及中和抗体评估来评价受试者血浆或血清中的抗体，从而评估免疫原性应答。总抗体测定测量作为免疫应答的一部分在已施用免疫原性物质的受试者的血清或血浆中产生的抗体。检测抗体最常用的试验是ELISA(酶联免疫吸附测定)，其检测测试血清中与目的抗体结合的抗体，包括IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。可通过确认测定来进一步评估免疫原性应答。在总抗体评估之后，可使用确认测定来确认总抗体测定的结果。竞争测定可用于确认抗体与靶标特异性地结合，以及筛选测定中的阳性发现不是测试血清或检测试剂与所述测定中的其他物质发生非特异性相互作用的结果。
可通过同种型分析和滴定来评估免疫原性应答。同种型测定可用于仅评估相关抗体的同种型。例如，所预期同种型可以是IgM和IgG，其可通过同种型分析和滴定来进行特异性检测和定量，并然后与存在的总抗体进行比较。
可通过中和抗体测定(nAb)来评估免疫原性应答。中和抗体测定(nAb)可用于确定响应于免疫原性物质而产生的抗体是否中和了免疫原性物质，由此抑制了免疫原性物质对靶标的影响并导致异常的药物代谢动力学行为。nAb测定通常是基于细胞的测定，其中靶细胞与抗体一起被孵育。可使用多种基于细胞的nAb测定，包括但不限于细胞增殖、生存力、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、细胞病变效应抑制(CPE)、凋亡、配体刺激的细胞信号传导、酶活性、报告基因测定、蛋白质分泌、代谢活性、应激及线粒体功能。检测读数包括吸光度、荧光、发冷光、化学发光或流式细胞术。配体结合测定还可用于体外测量免疫原和抗体的结合亲和力，以评价中和功效。
此外，可通过使用从受试者获得的T细胞上的细胞标志物测量受试者中的T细胞活化来评估细胞免疫应答的诱导。可从受试者收集血液样品、淋巴结活检样品或组织样品，并评价来自样品的T细胞中的以下活化标志物中的一种或多种(例如，2、3、4种或更多种)：CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154、CD40L、CD134、CD69、CD62L或CD44。也可在体内动物模型中使用相同方法来评估T细胞活化。还可通过向体外T细胞(例如，从受试者、动物模型、储存库或商业来源获得的T细胞)添加免疫原性物质并测量上述标志物以评价T细胞活化来进行此测定。类似方法可用于评估对其他免疫细胞的活化的影响，所述免疫细胞是例如嗜酸性粒细胞(标志物：CD35、CD11b、CD66、CD69和CD81)、树突细胞(标志物：IL-8、MHC II类、CD40、CD80、CD83和CD86)、嗜碱性粒细胞(CD63、CD13、CD4和CD203c)及中性粒细胞(CD11b、CD35、CD66b和CD63)。可使用流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交和其他允许测量细胞标志物的测定来评估这些标志物。来自施用免疫原性物质前后的比较结果可用于确定其效果。
术语“非免疫原性”是指当通过特定免疫应答测定来测量时，缺少或不存在高于预定阈值的免疫应答。例如，当使用先天免疫应答测定来测量针对环状多核糖核苷酸的先天免疫应答(例如测量炎性标志物)时，如本文中所提供的非免疫原性多核糖核苷酸可导致产生水平低于预定阈值的先天免疫应答。预定阈值可以是例如由针对对照参考物的先天免疫应答产生的一种或多种标志物水平的至多1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
如本文所用，术语“直接结合”是彼此具有亲和力的至少两个部分(例如，化学部分或生物化学部分)之间的关联。实例包括两个部分的共价结合，通过点击化学的结合，非共价结合，规范的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或非规范的碱基配对，或静电相互作用，例如离子相互作用、氢键合和卤素键合、π效应、范德华(van der Waals)力及疏水效应。
如本文所用，术语“间接结合”是指至少两个部分之间通过中间部分的关联，其中所述中间部分对至少两个部分具有亲和力。实例包括共结合配偶体，例如化学物质、小分子、蛋白质、肽、药剂或因子，其中的每一种分别与至少两个部分结合。
如本文所用，术语“载剂”意指便于通过环状多核糖核苷酸的共价修饰、经由部分或完全包封剂或其组合将组合物(例如，环状多核糖核苷酸)转运或递送到细胞中的化合物、组合物、试剂或分子。载剂的非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，经酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接与环状多核糖核苷酸结合的纳米颗粒)、脂质体、融合体、离体分化的网织红细胞、外来体、蛋白质载剂(例如，与环状多核糖核苷酸共价连接的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。
如本文所用，术语“裸递送”意指用于在不借助载剂并且不对有助于递送到细胞的部分进行共价修饰的情况下递送到细胞的配制品。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含无共价修饰的环状多核糖核苷酸并且不含载剂的配制品。
术语“稀释剂”意指包含本文中所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)可稀释或溶解于其中的非活性溶剂的媒介物。稀释剂可以是RNA增溶剂、缓冲液、等渗剂或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包含水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及1,3-丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉或糖粉。
如本文所用，术语“肠胃外可接受的稀释剂”是用于肠胃外施用组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)的稀释剂。
如本文所用，术语“线性对应物”是与环状多核糖核苷酸具有相同或类似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或其间的任何百分比的序列类似性)且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是与环状多核糖核苷酸具有相同或类似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或其间的任何百分比序列类似性)以及相同或类似的核酸修饰，且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物是与环状多核糖核苷酸具有相同或类似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或其间的任何百分比的序列类似性)以及不同的核酸修饰或不具有核酸修饰，且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的任何部分，所述任何部分短于线性对应物多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5'帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包含聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包含3'UTR。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5'UTR。
通过引用并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地指示以通过引用并入本文中。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明实施例的以下详细描述。出于图解说明本发明的目的，在附图中显示了目前示例的实施例。然而，应理解，本发明不限于附图中所显示的实施例的精确布置及手段。
图1显示环状RNA的示例性体外产生过程的示意图，所述环状RNA含有起始密码子、编码GFP的ORF(开放阅读框)、交错元件(2A)、加密原(可选)及IRES(内部核糖体进入位点)。
图2显示环状RNA的示例性体内产生过程的示意图。
图3A和图3B是示出两种不同环状RNA的体内化学计量蛋白质表达的示意图。
图4是示出示例性可自复制环状RNA的转录、自切割及连接的示意图。
图5A显示具有2A交错元件、退火区及科扎克NLuc ORF的示例性环状RNA的示意图。
图5B显示示例性多核糖核苷酸的示意图，所述多核糖核苷酸包含5’帽、5’UTR及退火到图5A的示例性环状RNA的反义退火序列。
图5C是显示加帽多核糖核苷酸退火到环状RNA增加了BJ成纤维细胞中功能性
Figure BDA0003866038070000111
荧光素酶(nLuc)的翻译的图表。
图5D是显示加帽多核糖核苷酸退火到环状RNA增加了SV40MEF中功能性
Figure BDA0003866038070000112
荧光素酶(nLuc)的翻译的图表。
图6A显示具有2A交错元件、3X终止密码子、退火区及科扎克NLuc ORF的示例性环状RNA的示意图。
图6B显示示例性多核糖核苷酸的示意图，所述多核糖核苷酸包含5’帽、5’UTR及退火到图6A的示例性环状RNA的反义退火序列。
图6C是显示加帽多核糖核苷酸退火到环状RNA增加了BJ成纤维细胞中功能性
Figure BDA0003866038070000113
荧光素酶(nLuc)的翻译的图表。
图6D是显示加帽多核糖核苷酸退火到环状RNA增加了SV40MEF中功能性
Figure BDA0003866038070000121
荧光素酶(nLuc)的翻译的图表。
图7A显示具有编码高斯荧光素酶的ORF(GLuc ORF)和终止密码子的示例性环状RNA的示意图。
图7B显示示例性多核糖核苷酸的示意图，所述多核糖核苷酸包含5’帽和与退火到图7A的示例性环状RNA的环状RNA(Oligo#0)的退火区互补的3’退火序列。
图7C显示示例性多核糖核苷酸的示意图，所述多核糖核苷酸包含5’帽和与退火到图7A的示例性环状RNA的Gluc ORF(Oligo#9)的终止密码子上游的44个核苷酸互补的3’退火序列。
图7D是显示用加帽多核糖核苷酸退火的环状RNA比仅环状RNA的对应物呈现更高GLuc表达的图表。
图8A显示具有编码高斯荧光素酶的ORF(GLuc ORF)、退火区及终止密码子的示例性环状RNA的示意图。
图8B显示示例性多核糖核苷酸的示意图，所述多核糖核苷酸包含5’帽和与退火到图8A的示例性环状RNA的环状RNA(Oligo#0)的退火区互补的3’退火序列。
图8C显示示例性多核糖核苷酸的示意图，所述多核糖核苷酸包含5’帽和与退火到图8A的示例性环状RNA的Gluc ORF(Oligo#9)的终止密码子上游的核苷酸互补的3’退火序列。
图8D显示与退火到图5A的示例性环状RNA的图8B的示例性加帽多核糖核苷酸及图8C的示例性加帽多核糖核苷酸的示意图。
图8E是显示加帽多核糖核苷酸退火到环状RNA增加了SV40MEF中功能性
Figure BDA0003866038070000122
荧光素酶(nLuc)的翻译的图表。
具体实施方式
本发明一般涉及环状多核糖核苷酸与包含5’帽的多核糖核苷酸的药物组合物和制剂以及其用途。
本文中所述的本发明包含含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸(本文称为加帽多核糖核苷酸)与环状多核糖核苷酸的组合物。环状多核糖核苷酸可以进一步包含表达序列。有时，本文所述的组合物是进一步包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸进一步包含与环状多核糖核苷酸结合的结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含与加帽多核糖核苷酸结合的结合区。加帽多核糖核苷酸的结合区可以包含与环状多核糖核苷酸结合区的序列反义的序列。
本文中所述的本发明可进一步包含由加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸形成的复合物。加帽多核糖核苷酸可与环状多核糖核苷酸一起形成复合物，其中加帽多核糖核苷酸的结合区与环状多核糖核苷酸的结合区结合。
如本文中所述的组合物用于翻译环状多核糖核苷酸的表达序列的方法中。申请人已发现，所述组合物与单独的环状多核糖核苷酸的组合物(例如，缺少加帽多核糖核苷酸的组合物)相比增加了环状多核糖核苷酸表达序列的翻译。申请人已发现，所述组合物与单独的环状多核糖核苷酸的组合物(例如，缺少加帽多核糖核苷酸的组合物)或环状多核糖核苷酸的线性对应物相比增加了环状多核糖核苷酸表达序列的表达，从而导致蛋白质产量增加。申请人还发现，所述组合物与单独的环状多核糖核苷酸的组合物(例如，缺少加帽多核糖核苷酸的组合物)相比延长了环状多核糖核苷酸表达序列的翻译。在某些应激条件下，帽依赖性翻译是优选的翻译方法(例如，优于使用IRES的翻译方法)。
加帽多核糖核苷酸
如本文中所述的多核糖核苷酸包含经5’修饰的鸟苷帽，其在本文中也称为加帽多核糖核苷酸。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸进一步包含与环状多核糖核苷酸结合的结合区。加帽多核糖核苷酸的结合区可包含与环状多核糖核苷酸的结合区的序列反义的序列。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸可进一步包含UTR。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸可进一步包含聚A区。加帽多核糖核苷酸可与环状多核糖核苷酸一起形成复合物，其中环状多核糖核苷酸包含表达序列。与环状多核糖核苷酸复合的加帽多核糖核苷酸可募集核糖体以启动环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。在一些实施例中，如本文中所述的加帽多核苷酸是多种加帽多核苷酸。在一些实施例中，多种加帽多核苷酸包含至少两种相同的加帽多核苷酸。在一些实施例中，多个加帽多核苷酸包含一种或多种不同的加帽多核苷酸。
帽
在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5’末端帽，其被称为加帽多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含经5’修饰的鸟苷帽。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含一个或多个经5’修饰的鸟苷帽。在一些实施例中，经5’修饰的鸟苷帽是7-甲基鸟苷帽。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含生理性经5’修饰的鸟苷帽。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含合成的5’末端帽类似物。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含使用与抗反向帽类似物(ARCA)的共转录加帽来产生的经5’修饰的鸟苷帽结构。在一些实施例中，经5’修饰的鸟苷帽是抗反向帽类似物。例如，在一些实施例中，多核糖核苷酸包含m7Gp3G。对于另一个实例，在一些实施例中，多核糖核苷酸包含m73’dGp3G、m2 7,3’-OGp3G、m2 7,2’-OGp3G、m72’dGp3G、m72’dGp4G、m2 7,2’-OGp4G、m2 7,3’-OGp4G、m7Gp5G、m2 7,3’-OGp5G、m7Gp4G或m7Gp5G。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含如下的示例性实施例：合成的5’末端帽类似物或使用与抗反向帽类似物(ARCA)的共转录加帽来产生的经5’修饰的鸟苷帽结构，如由Jemielity J.等人(RNA.2003；9(9):1108-22)或由Kowalska,J.等人.(RNA 2008；14:1119-1131)所述。在一些实施例中，多核糖核苷酸的经5’修饰的鸟苷帽募集核糖体。在一些实施例中，多核糖核苷酸的经5’修饰的鸟苷帽与核糖体结合。在一些实施例中，核糖体的募集会启动表达序列的翻译。
加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸
加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸可以是核糖核酸的任何连续段。在一些实施例中，多核糖核苷酸是未经修饰的多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸是经修饰的多核糖核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸可以是线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸是寡多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸是单链多核糖核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸是假双链的(例如，单链多核糖核苷酸自杂交的一部分)。在一些实施例中，加帽多核苷酸的多核苷酸包含多种多核苷酸。在一些实施例中，多种多核苷酸包含至少两种相同的多核苷酸。在一些实施例中，多个多核苷酸包含一种或多种不同的多核苷酸。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含5至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至1150个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至1000个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至950个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至900个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至850个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至800个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至750个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至700个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至650个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至600个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至550个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至500个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含10至450个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含10至400个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至350个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至300个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至250个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至200个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至150个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至55个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至50个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至45个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至40个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至35个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至30个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至25个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至20个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至15个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含5至10个核苷酸的长度。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含10至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含15至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含20至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含25至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含30至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含35至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含40至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含45至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含50至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含55至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含60至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含65至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含70至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含75至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含80至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含85至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含90至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含95至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含100至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含150至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含200至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含250至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含300至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含350至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含400至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含450至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含500至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含550至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含600至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含650至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含700至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含750至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含800至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含850至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含900至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含950至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含1000至1100个核苷酸的长度。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含1050至1100个核苷酸的长度。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt、100nt、120nt、140nt、160nt、180nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、450nt、或500nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少10nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少15nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少20nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少25nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少30nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少35nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少40nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少45nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少50nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少55nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少60nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少65nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少70nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少75nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少80nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少85nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少90nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少95nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少100nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少120nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少140nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少160nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少180nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少200nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少250nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少300nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少350nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少400nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少450nt。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含至少500nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt、100nt、120nt、140nt、160nt、180nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、450nt或500nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含10nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含15nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含20nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含25nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含30nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含35nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含40nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含45nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含50nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含55nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含60nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含65nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含70nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含75nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含80nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含85nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含90nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含95nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含100nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含120nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含140nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含160nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含180nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含200nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含250nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含300nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含350nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含400nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含450nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含500nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt、59nt、60nt、61nt、62nt、63nt、64nt、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt或85nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少50nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少51nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少52nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少53nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少54nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少55nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少56nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少57nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少58nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少59nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少60nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少61nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少62nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少63nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少64nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少65nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少66nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少67nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少68nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少69nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少70nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少71nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少72nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少73nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少74nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少75nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少76nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少77nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少78nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少79nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少80nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少81nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少82nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少83nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少84nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含至少或85nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt、59nt、60nt、61nt、62nt、63nt、64nt、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt或85nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含50nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含51nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含52nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含53nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含54nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含55nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含56nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含57nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含58nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含59nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含60nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含61nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含62nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含63nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含64nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含65nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含66nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含67nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含68nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含69nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含70nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含71nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含72nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含73nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含74nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含75nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含76nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含77nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含78nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含79nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含80nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含81nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含82nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含83nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含84nt。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含85nt。
UTR
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含UTR(非翻译区)。包含基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。UTR可参与翻译调节，影响多核糖核苷酸的定位和稳定性，并可包含调节蛋白和微RNA的结合位点。在一些实施例中，UTR包含核糖体结合位点。
在一些实施例中，UTR包含调节翻译的二级结构，例如发夹环。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含内嵌有一段或多段的腺苷及尿苷的UTR。这些AU富集签名可能会增加表达产物的转化率。
UTR AU富集元件(ARE)的引入、移除或修饰可用于调节多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。当工程化特定的多核糖核苷酸时，可以将ARE的一个或多个拷贝引入到多核糖核苷酸，并且ARE的这些拷贝可调节表达产物的翻译及/或产生。同样，可以对ARE进行鉴别和去除或工程化至多核糖核苷酸以调节细胞内稳定性，从而影响所得蛋白质的翻译和产生。
应理解，可将来自任何基因的任何UTR掺入到多核糖核苷酸的相应侧接区中。作为非限制性实例，可掺入的UTR或其片段是在美国临时申请号US 61/775,509和US 61/829,372或国际专利申请号PCT/US2014/021522中列出的UTR；将其各自的内容通过引用以其全文并入本文中。此外，可利用任何已知基因的多个野生型UTR。提供不是野生型基因的变体的人工UTR也在本发明的范围内。这些UTR或其部分可以放置在与选择它们的转录物中相同的方向，或者可以变更方向或位置。因此，可以将5'或3'UTR反向、缩短、加长、与一个或多个其他5'UTR或3'UTR制成嵌合体。如本文所用，当与UTR序列有关时，术语“变更的”是指UTR已相对于参考序列以某种方式改变。例如，3'或5'UTR可通过如上文所教导的方向或位置的改变相对于野生型或天然UTR来变更，或者可通过额外核苷酸的纳入、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来变更。这些产生“变更的”UTR的任何改变(无论是3'还是5')都包含变体UTR。
在一个实施例中，可以使用双、三或四UTR，如5'或3'UTR。如本文所用，“双”UTR是其中相同UTR的两个拷贝被串联或基本上串联地编码的一种情况。例如，可如美国专利公开20100129877中所述使用双β球蛋白3'UTR，其内容通过引用以其全文并入本文中。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含5’UTR。5’UTR可以是多核糖核苷酸的结合区的5’，其中结合区与环状多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含聚A区。5’UTR可以是加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸的聚A区的5’。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含3’UTR。3’UTR可以是多核糖核苷酸的结合区的3’，其中结合区与环状多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸缺少UTR。
聚A区
加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸可包含聚A区。在一些实施例中，聚A区的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，聚A区的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，聚A区是约10至约3,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500和2,500至3,000)。在一些实施例中，聚A区是15个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是10个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是15个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是20个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是25个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是30个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是35个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是40个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是45个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是50个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是55个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是60个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是70个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是80个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是90个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是100个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是120个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是140个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是160个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是180个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是200个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是250个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是300个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是350个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是400个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是450个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是500个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是600个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是700个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是800个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是900个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,000个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,100个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,200个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,300个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,400个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,500个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,600个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,700个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,800个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是1,900个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是2,000个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是2,500个核苷酸的长度。在一些实施例中，聚A区是3,000个核苷酸。
在一个实施例中，相对于整个多核糖核苷酸的长度设计聚A区。此设计可基于编码区的长度、特定特征或区域(例如第一或侧接区)的长度。在此上下文中，聚A区的长度可以比环状多核糖核苷酸或其特征长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。聚A区也可设计为其所属的多核糖核苷酸的一部分。在此上下文中，聚A区可以是构建体的总长度的或构建体总长度减去聚A区后的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。此外，工程化结合位点和多核糖核苷酸与聚A结合蛋白的缀合可增强表达。
在一个实施例中，将多核糖核苷酸设计为包含聚A-G四分体(quartet)。G-四分体是四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键阵列，可以由DNA和RNA两者中富含G的序列形成。在一个实施例中，G-四分体被掺入聚A序列的端部。测定所得多核糖核苷酸构建体的稳定性、蛋白质产量和/或其他参数，包括在不同时间点的半衰期。在一些实施例中，聚A-G四分体产生的蛋白质产量等于单独使用120个核苷酸的聚A序列所得的蛋白质产量的至少75％。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包含聚A。在一些实施例中，多核糖核苷酸缺少聚A。在一些实施例中，多核糖核苷酸具有经修饰的聚A以调节多核糖核苷酸的一种或多种特性。在一些实施例中，缺少聚A或具有经修饰的聚A的多核糖核苷酸改善了一种或多种功能性特性，例如免疫原性、半衰期、表达效率等。
结合区
如本文中所述的加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸可包含与如本文中所述的环状多核糖核苷酸结合的结合区。结合区可以是多核糖核苷酸中UTR的3'。结合区可以是多核糖核苷酸中UTR的5'。结合区可以是聚A区的5'。通常，结合区是包含与第二结合区的序列反义的序列的第一结合区，其中环状多核糖核苷酸包含第二结合区。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸的第一结合区包含5至100个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至55个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至50个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至45个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至40个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至35个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至30个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至25个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至20个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至15个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含5至10个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第一结合区包含5至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含10至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含15至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含20至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含25至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含30至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含35至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含40至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含45至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含50至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含55至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含60至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含65至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含70至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含75至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含80至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含85至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含90至95个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第一结合区包含10至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含15至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含20至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含25至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含30至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含35至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含40至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含45至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，第一结合区包含50至55个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第一结合区包含至少5个核苷酸(nt)、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt或100nt。在一些实施例中，第一结合区包含5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt或100nt。在一些实施例中，第一结合区包含至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。在一些实施例中，第一结合区包含5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。
在一些实施例中，第一结合区包含5个核苷酸。在一些实施例中，第一结合区包含10nt。在一些实施例中，第一结合区包含15nt。在一些实施例中，第一结合区包含20nt。在一些实施例中，第一结合区包含25nt。在一些实施例中，第一结合区包含30nt。在一些实施例中，第一结合区包含35nt。在一些实施例中，第一结合区包含40nt。在一些实施例中，第一结合区包含45nt。在一些实施例中，第一结合区包含50nt。在一些实施例中，第一结合区包含55nt。在一些实施例中，第一结合区包含60nt。在一些实施例中，第一结合区包含65nt。在一些实施例中，第一结合区包含70nt。在一些实施例中，第一结合区包含75nt。在一些实施例中，第一结合区包含80nt。在一些实施例中，第一结合区包含85nt。在一些实施例中，第一结合区包含90nt。在一些实施例中，第一结合区包含95nt。在一些实施例中，第一结合区包含100nt。
在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区特异性地结合。通常，结合区是包含与第二结合区的序列反义的序列的第一结合区，其中环状多核糖核苷酸包含第二结合区。在一些实施例中，多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区互补，这允许多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸之间的碱基配对。在一些实施例中，多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区100％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或更多互补。在一些实施例中，多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区100％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少99％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少98％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少97％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少96％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少95％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少94％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少93％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少92％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少91％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少90％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少85％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少80％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少75％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少70％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少65％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少60％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少55％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少50％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少45％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少40％互补。在一些实施例中，第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区至少35％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区至少30％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或更多互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区99％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区98％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区97％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区96％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区95％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区94％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区93％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区92％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区91％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区90％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区85％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区80％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区75％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区70％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区65％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区60％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区55％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区50％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区45％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区40％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区35％互补。在一些实施例中，第一结合区与第二结合区30％互补。
在一些实施例中，如本文中所述的加帽多核苷酸是多种加帽多核苷酸。在一些实施例中，多个加帽多核苷酸包含一种或多种不同的加帽多核苷酸。在一些实施例中，一种或多种不同的加帽多核苷酸包含不同的结合区。例如，第三加帽多核苷酸包含与环状多核苷酸的第四结合区结合的第三结合区，并且第四加帽多核苷酸包含与环状多核糖核苷酸结合的第三结合区。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸的第三结合区包含5至100个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至55个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至50个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至45个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至40个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至35个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至30个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至25个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至20个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至15个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含5至10个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第三结合区包含5至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含10至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含15至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含20至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含25至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含30至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含35至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含40至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含45至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含50至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含55至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含60至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含65至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含70至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含75至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含80至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含85至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含90至95个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第三结合区包含10至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含15至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含20至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含25至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含30至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含35至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含40至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含45至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，第三结合区包含50至55个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第三结合区包含至少5个核苷酸(nt)、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt或100nt。在一些实施例中，第三结合区包含5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt或100nt。在一些实施例中，第三结合区包含至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。在一些实施例中，第三结合区包含5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。
在一些实施例中，第三结合区包含5个核苷酸。在一些实施例中，第三结合区包含10nt。在一些实施例中，第三结合区包含15nt。在一些实施例中，第三结合区包含20nt。在一些实施例中，第三结合区包含25nt。在一些实施例中，第三结合区包含30nt。在一些实施例中，第三结合区包含35nt。在一些实施例中，第三结合区包含40nt。在一些实施例中，第三结合区包含45nt。在一些实施例中，第三结合区包含50nt。在一些实施例中，第三结合区包含55nt。在一些实施例中，第三结合区包含60nt。在一些实施例中，第三结合区包含65nt。在一些实施例中，第三结合区包含70nt。在一些实施例中，第三结合区包含75nt。在一些实施例中，第三结合区包含80nt。在一些实施例中，第三结合区包含85nt。在一些实施例中，第三结合区包含90nt。在一些实施例中，第三结合区包含95nt。在一些实施例中，第三结合区包含100nt。
在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区特异性地结合。通常，结合区是包含与第四结合区的序列反义的序列的第三结合区，其中环状多核糖核苷酸包含第四结合区。在一些实施例中，多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区互补，这允许多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸之间的碱基配对。在一些实施例中，多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区100％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或更多互补。在一些实施例中，多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区100％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少99％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少98％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少97％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少96％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少95％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少94％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少93％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少92％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少91％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少90％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少85％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少80％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少75％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少70％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少65％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少60％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少55％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少50％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少45％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少40％互补。在一些实施例中，第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区至少35％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区至少30％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或更互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区99％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区98％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区97％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区96％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区95％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区94％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区93％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区92％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区91％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区90％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区85％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区80％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区75％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区70％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区65％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区60％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区55％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区50％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区45％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区40％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区35％互补。在一些实施例中，第三结合区与第四结合区30％互补。
在一些实施例中，第一结合区与第三结合区相同。在一些实施例中，第一结合区与第三结合区不同。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸通过直接结合来与环状多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，多核糖核苷酸通过共价结合与环状多核糖核苷酸结合。例如，多核糖核苷酸通过点击化学来与环状多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，多核糖核苷酸通过非共价结合与环状多核糖核苷酸结合。例如，多核糖核苷酸通过规范的沃森-克里克碱基配对或非规范的碱基配对与环状多核糖核苷酸结合。作为另一个实例，多核糖核苷酸通过静电相互作用(例如，离子相互作用、氢键合和卤素键合、π效应、范德华力及疏水效应)与环状多核糖核苷酸结合。
在一些实施例中，多核糖核苷酸通过间接结合与环状多核糖核苷酸结合。例如，在一些实施例中，多核糖核苷酸通过共结合配偶体之间的相互作用与环状多核糖核苷酸结合，所述共结合配偶体为例如化学物质、小分子、蛋白质、肽、药剂或因子，其中的每一种分别与多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸结合。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包含经5’修饰的鸟苷帽和第一结合区，其中所述第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区特异性地结合。例如，在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸是用人类α珠蛋白5’UTR和与环状RNA的结合区(退火区)互补的3’结合区(也可称为退火区)编码的线性RNA寡核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含如由SEQ ID NO:4代表的序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸包含如由SEQ ID NO:5代表的序列。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含如由SEQ ID NO:1代表的序列。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸是如由SEQ ID NO:1代表的序列。
核糖体募集
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸募集核糖体。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸包含核糖体结合部分。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸包含募集核糖体的部分。在一些实施例中，核糖体结合部分募集核糖体。
环状多核糖核苷酸
如本文中所述的环状多核糖核苷酸包含与如本文中所述的加帽多核糖核苷酸特异性地结合的结合区。环状多核糖核苷酸的结合区可包含与加帽多核糖核苷酸的结合区的序列正义的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含表达序列。环状多核糖核苷酸可进一步包含UTR。环状多核糖核苷酸可进一步包含聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是未经修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是经修饰的环状多核糖核苷酸。环状多核糖核苷酸可与加帽多核糖核苷酸一起形成复合物。与环状多核糖核苷酸复合的加帽多核糖核苷酸的帽可募集核糖体以启动环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸与多个加帽多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，多种加帽多核苷酸包含至少两种相同的加帽多核苷酸。在一些实施例中，多个加帽多核苷酸包含一种或多种不同的加帽多核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一或多个结合区，所述结合区与一或多个加帽多核糖核苷酸的一个或多个结合区特异性地结合。例如，环状多核糖核苷酸包含第二结合区和第四结合区，其中第二结合区与第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区结合，并且第四结合区与第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区结合。在一些实施例中，第二结合区与第四结合区相同。在一些实施例中，第二结合区与第四结合区不同。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含如WO 2019/118919和WO 2020/023655中所披露的任何特征或特征的任何组合，其各自通过引用以其全文特此并入。
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可包含50至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至19000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至18500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至18000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至17500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至17000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至16500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至16000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至15500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至15000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至14500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至14000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至13500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至13000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至12500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至12000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至11500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至11000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至11500个核苷酸的长度。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至10000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至9500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至9000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至8500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至8000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至7500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至7000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至6500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至6000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至5500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至5000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至4500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至4000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至3500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至3000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至2500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至2000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至1500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至1000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至950个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至900个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至850个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至800个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至750个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至700个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至650个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至600个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至550个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至500个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至450个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至400个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50至350个核苷酸的长度。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含100至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含150至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含200至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含250至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含300至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含350至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含400至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含450至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含550至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含600至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含650至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含700至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含750至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含800至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含850至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含900至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含950至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含1000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含1500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含2000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含2500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含3000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含3500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含4000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含4500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含5000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含5500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含6000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含6500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含7000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含7500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含8000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含8500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含9000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含9500至20000个核苷酸的长度。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10050至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10100至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10150至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10200至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10250至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10300至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10350至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10400至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10450至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10550至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10600至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10650至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10700至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10750至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10800至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10850至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10900至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10950至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含11000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含11500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含12000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含12500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含13000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含13500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含14000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含14500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含15000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含15500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含16000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含16500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含17000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含17500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含18000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含18500至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含19000至20000个核苷酸的长度。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含19500至20000个核苷酸的长度。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少600nt、605nt、610nt、615nt、620nt、625nt、630nt、635nt、640nt、645nt、650nt、6650nt、660nt、665nt、670nt、675nt、680nt、685nt、690nt、695nt或700nt。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含600nt、605nt、610nt、615nt、620nt、625nt、630nt、635nt、640nt、645not、650nt、6650nt、660nt、665nt、670nt、675nt、680nt、685nt、690nt、695nt或700nt。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少620nt、621nt、622nt、623nt、624nt、625nt、626nt、627nt、628nt、629nt、630nt、631nt、632nt、633nt、634nt、635nt、636nt、637nt、638nt、639nt、640nt、641nt、642nt、643nt、644nt、645nt、646nt、647nt、648nt、649nt、650nt、651nt、652nt、653nt、654nt、655nt、656nt、657nt、658nt、659nt、660nt、661nt、662nt、663nt、664nt、665nt、666nt、667nt、668nt、669nt、670nt、671nt、672nt、673nt、674nt或675nt。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含620nt、621nt、622nt、623nt、624nt、625nt、626nt、627nt、628nt、629nt、630nt、631nt、632nt、633nt、634nt、635nt、636nt、637nt、638nt、639nt、640nt、641nt、642nt、643nt、644nt、645nt、646nt、647nt、648nt、649nt、650nt、651nt、652nt、653nt、654nt、655nt、656nt、657nt、658nt、659nt、660nt、661nt、662nt、663nt、664nt、665nt、666nt、667nt、668nt、669nt、670nt、671nt、672nt、673nt、674nt或675nt。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受理论的束缚，有可能的是，可以从DNA产生RNA的多个区段并且其5'游离端和3'游离端退火以产生一“串”RNA，当仅留有一个5'游离端和一个3'游离端时，所述“串”RNA最终可以被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小可能受包封RNA并将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸的长度可能是有用的。
在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸在哺乳动物(例如，人)中是非免疫原性的。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸能够在来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎及熊等)的细胞、来自家畜动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合中复制或者在其中复制。在一些实施例中，本发明包括包含本文所述的环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎及熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合。在一些实施例中，细胞被修饰以包含环状多核糖核苷酸。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期至少是线性对应物(例如，线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸)的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期相对于线性对应物的半衰期延长。在一些实施例中，半衰期增加了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性是至少约1小时至约30天，或是至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为不超过约10分钟至约7天，或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行细胞分裂的细胞中具有半衰期或持续性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在分裂后的细胞中具有半衰期或持续性。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行分裂的细胞中的半衰期或持续性大于约10分钟至约30天，或是至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸例如瞬时地或长期地调节细胞功能。在某些实施例中，细胞功能发生稳定变更，例如调节持续存在至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，细胞功能发生瞬时变更，例如调节持续存在不超过约30分钟至约7天，或不超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文其他处所述的元件。在一些实施例中，这些元件可通过间隔子序列或接头彼此隔开。在一些实施例中，这些元件可通过1个核糖核苷酸、2个核苷酸、约5个核苷酸、约10个核苷酸、约15个核苷酸、约20个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约80个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸、约900个核苷酸、约1000个核苷酸、最多约1kb、至少约1000个核苷酸、其间任何量的核苷酸彼此隔开。在一些实施例中，一个或多个元件彼此邻接，例如，在缺少间隔子元件的情况下。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个元件是构象柔性的。在一些实施例中，构象柔性是由于序列基本上不含二级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含二级结构或三级结构，所述二级结构或三级结构容纳本文中所述的一种或多种所期望的功能或特性，例如容纳核糖体的结合位点，例如翻译，例如滚环翻译。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含特定序列特性。例如，环状多核糖核苷酸可包含特定核苷酸组成。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可包含一个或多个嘌呤富集区(腺嘌呤或鸟苷)。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可包含一个或多个嘌呤富集区(腺嘌呤或鸟苷)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含一个或多个AU富集区或元件(ARE)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含一个或多个腺嘌呤富集区。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含一个或多个本文中其他处所述的重复元件。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文中其他处所述的修饰。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是本领域中已知的那些(例如，美国专利公开20150079630和中国专利公开106222174，其内容通过引用以其全文并入本文中)。例如，在一些实施例中，环状RNA编码蛋白质，具有等于或大于102的全长碱基数且是3的倍数，具有至少一个起始密码子，在与起始密码子相同的阅读框中没有终止密码子，并且不含有内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施例中，环状RNA的全长碱基数为561或更少。在一些实施例中，环状RNA在起始密码子上游具有科扎克序列。在一些实施例中，环状RNA作为模板用于在真核细胞表达系统中产生蛋白质的方法。在一些实施例中，将环状RNA引入真核细胞以表达由环状RNA编码的蛋白质。在一些实施例中，将环状RNA添加至来源于真核细胞的无细胞表达系统中，以表达由环状RNA编码的蛋白质。在一些实施例中，环状RNA编码蛋白质，具有102至360的全长碱基数且是3的倍数，并且具有在IRES下游1至20个碱基内的至少一个IRES和一个起始密码子，并且在与起始密码子相同的阅读框中没有终止密码子。在一些实施例中，环状RNA用于在原核细胞表达系统中产生蛋白质的方法。
结合区
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可包含与如本文中所述的加帽多核糖核苷酸结合的结合区。结合区可位于环状多核糖核苷酸中终止密码子与起始密码子之间的UTR中。在一些实施例中，终止密码子位于结合区与交错元件之间。通常，环状多核糖核苷酸的结合区是包含与第一结合区的序列有义的序列的第二结合区，其中加帽多核糖核苷酸包含第一结合区。环状多核糖核苷酸可包含多个结合区。例如，环状多核糖核苷酸包含2个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含3个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含4个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含5个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含6个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含7个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含8个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含9个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含10个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含15个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含20个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含30个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含40个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含50个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含60个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含70个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含80个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含90个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含100个结合区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含200。
在一些实施例中，第二结合区包含5至100个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至55个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至50个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至45个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至40个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至35个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至30个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至25个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至20个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至15个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含5至10个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第二结合区包含5至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含10至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含15至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含20至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含25至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含30至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含35至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含40至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含45至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含50至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含55至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含60至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含65至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含70至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含75至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含80至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含85至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含90至95个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第二结合区包含10至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含15至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含20至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含25至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含30至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含35至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含40至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含45至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，第二结合区包含50至55个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第二结合区包含至少5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt或100nt。在一些实施例中，第二结合区包含5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt或100nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。在一些实施例中，第二结合区包含5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少5nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少10nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少15nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少20nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少25nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少30nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少35nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少40nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少45nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少50nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少55nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少60nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少65nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少70nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少75nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少80nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少85nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少90nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少95nt。在一些实施例中，第二结合区包含至少100nt。在一些实施例中，第二结合区包含5nt。在一些实施例中，第二结合区包含10nt。在一些实施例中，第二结合区包含15nt。在一些实施例中，第二结合区包含20nt。在一些实施例中，第二结合区包含25nt。在一些实施例中，第二结合区包含30nt。在一些实施例中，第二结合区包含35nt。在一些实施例中，第二结合区包含40nt。在一些实施例中，第二结合区包含45nt。在一些实施例中，第二结合区包含50nt。在一些实施例中，第二结合区包含55nt。在一些实施例中，第二结合区包含60nt。在一些实施例中，第二结合区包含65nt。在一些实施例中，第二结合区包含70nt。在一些实施例中，第二结合区包含75nt。在一些实施例中，第二结合区包含80nt。在一些实施例中，第二结合区包含85nt。在一些实施例中，第二结合区包含90nt。在一些实施例中，第二结合区包含95nt。在一些实施例中，第二结合区包含100nt。
在一些实施例中，第四结合区包含5至100个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至55个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至50个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至45个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至40个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至35个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至30个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至25个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至20个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至15个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含5至10个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第四结合区包含5至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含10至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含15至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含20至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含25至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含30至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含35至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含40至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含45至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含50至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含55至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含60至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含65至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含70至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含75至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含80至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含85至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含90至95个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第四结合区包含10至95个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含15至90个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含20至85个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含25至80个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含30至75个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含35至70个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含40至65个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含45至60个核苷酸的长度。在一些实施例中，第四结合区包含50至55个核苷酸的长度。
在一些实施例中，第四结合区包含至少5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt或100nt。在一些实施例中，第四结合区包含5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt或100nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。在一些实施例中，第四结合区包含5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少5nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少10nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少15nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少20nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少25nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少30nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少35nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少40nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少45nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少50nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少55nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少60nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少65nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少70nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少75nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少80nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少85nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少90nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少95nt。在一些实施例中，第四结合区包含至少100nt。在一些实施例中，第四结合区包含5nt。在一些实施例中，第四结合区包含10nt。在一些实施例中，第四结合区包含15nt。在一些实施例中，第四结合区包含20nt。在一些实施例中，第四结合区包含25nt。在一些实施例中，第四结合区包含30nt。在一些实施例中，第四结合区包含35nt。在一些实施例中，第四结合区包含40nt。在一些实施例中，第四结合区包含45nt。在一些实施例中，第四结合区包含50nt。在一些实施例中，第四结合区包含55nt。在一些实施例中，第四结合区包含60nt。在一些实施例中，第四结合区包含65nt。在一些实施例中，第四结合区包含70nt。在一些实施例中，第四结合区包含75nt。在一些实施例中，第四结合区包含80nt。在一些实施例中，第四结合区包含85nt。在一些实施例中，第四结合区包含90nt。在一些实施例中，第四结合区包含95nt。在一些实施例中，第四结合区包含100nt。
非翻译区
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可包含UTR(非翻译区)。包含基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。UTR可参与翻译调节，影响多核糖核苷酸的定位和稳定性，并可包含调节蛋白和微RNA的结合位点。在一些实施例中，UTR包含核糖体结合位点。
在一些实施例中，UTR包含调节翻译的二级结构，例如发夹环。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含内嵌有一或多段腺苷和尿苷的UTR。这些AU富集签名可能会增加表达产物的转化率。
UTR AU富集元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。工程化特定的多核糖核苷酸时，可以将ARE的一个或多个拷贝引入环状多核糖核苷酸中，并且ARE的这些拷贝可以调节表达产物的翻译和/或产生。同样，可以对ARE进行鉴别和去除或工程化至环状多核糖核苷酸以调节细胞内稳定性，从而影响所得蛋白质的翻译和产生。
应理解，可将来自任何基因的任何UTR掺入环状多核糖核苷酸的相应侧接区中。作为非限制性实例，可掺入的UTR或其片段是在美国临时申请号US 61/775,509和US 61/829,372或国际专利申请号PCT/US2014/021522中列出的UTR；将其各自的内容通过引用以其全文并入本文中。此外，可利用任何已知基因的多个野生型UTR。提供不是野生型基因的变体的人工UTR也在本发明的范围内。这些UTR或其部分可以放置在与选择它们的转录物中相同的方向，或者可以变更方向或位置。因此，可以将5'或3'UTR反向、缩短、加长、与一个或多个其他5'UTR或3'UTR制成嵌合体。如本文所用，当与UTR序列有关时，术语“变更的”是指UTR已相对于参考序列以某种方式改变。例如，3'或5'UTR可通过如上文所教导的方向或位置的改变相对于野生型或天然UTR来变更，或者可通过额外核苷酸的纳入、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来变更。这些产生“变更的”UTR的任何改变(无论是3'还是5')都包含变体UTR。
在一个实施例中，可以使用双、三或四UTR，如5'或3'UTR。如本文所用，“双”UTR是其中相同UTR的两个拷贝被串联或基本上串联地编码的一种情况。例如，可如美国专利公开20100129877中所述使用双β球蛋白3'UTR，其内容通过引用以其全文并入本文中。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含5’UTR。5’UTR可以是环状多核糖核苷酸的结合区的5’，其中结合区与加帽多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含聚A区。5’UTR可以是环状多核糖核苷酸的聚A区的5’。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含3’UTR。3’UTR可以是与环状多核糖核苷酸的结合区的3’，其中结合区与加帽多核糖核苷酸结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少UTR。
聚A区
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可包含聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含单个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少2、3、4、5、6个或更多个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少2个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少3个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少4个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少5个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少6个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含2个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含3个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含4个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含5个聚A区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含6个聚A区。
在一些实施例中，聚A区的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，聚A区的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，聚A区大于约10个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约15个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约20个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约25个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约30个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约35个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约40个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约45个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约50个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约55个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约60个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约70个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约80个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约90个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约100个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约120个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约140个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约160个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约180个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约200个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约250个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约300个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约350个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约400个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约450个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约600个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约700个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约800个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约900个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,100个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,200个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,300个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,400个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,600个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,700个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,800个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约1,900个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约2,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约2,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区大于约3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约10个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约15个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约20个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约25个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约30个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约35个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约40个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约45个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约50个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约55个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约60个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约70个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约80个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约90个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约100个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约120个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约140个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约160个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约180个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约200个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约250个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约300个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约350个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约400个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约450个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约600个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约700个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约800个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约900个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,100个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,200个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,300个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,400个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,600个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,700个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,800个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约1,900个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约2,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约2,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是至少约3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是约10至约3,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500和2,500至3,000)。在一些实施例中，聚A区是10至3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至50个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至100个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至250个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至750个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至1,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至1,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至2,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是50至2,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是50至2,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是50至3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是100至500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是100至750个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是100至1,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是100至1,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是100至2,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是100至2,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是100至3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是500至750个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是500至1,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是500至1,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是500至2,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是500至2,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是500至3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是1,000至1,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是1,000至2,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是1,000至2,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是1,000至3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是1,500至2,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是1,500至2,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是1,500至3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是2,000至3,000个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是2,000至2,500个核苷酸。在一些实施例中，聚A区是2,500至3,000个核苷酸。
在一个实施例中，相对于整个环状多核糖核苷酸的长度设计聚A区。此设计可基于编码区的长度、特定特征或区域(例如第一或侧接区)的长度，或者基于环状多核糖核苷酸表达的最终产物的长度。在此上下文中，聚A序列的长度可以比环状多核糖核苷酸或其特征长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。聚A区也可设计为其所属的环状多核糖核苷酸的一部分。在此上下文中，聚A区可以是构建体的总长度的或构建体总长度减去聚A区后的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多。此外，工程化结合位点和环状多核糖核苷酸与聚A结合蛋白质的缀合可增强表达。
在一个实施例中，将环状多核糖核苷酸设计为包含聚A-G四分体。G-四分体是四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键阵列，可以由DNA和RNA两者中富含G的序列形成。在一个实施例中，G-四分体被掺入聚A序列的端部。测定所得环状多核糖核苷酸构建体的稳定性、蛋白质产量和/或其他参数，包括在不同时间点的半衰期。在一些实施例中，聚A-G四分体产生的蛋白质产量等于单独使用120个核苷酸的聚A序列所得的蛋白质产量的至少75％。
在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸表达序列的3’末端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸表达序列的5’末端处。在一些实施例中，聚A区不位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸表达序列的3’末端处。
在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的UTR的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的UTR的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的翻译起始序列的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的翻译起始序列的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的IRES的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的IRES的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的终止元件的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的终止元件的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的交错元件的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的交错元件的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的加密原的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的加密原的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的结合区的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的结合区的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的第一结合区的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的第一结合区的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的第三结合区的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的第三结合区的3’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的间隔子序列的5’端处。在一些实施例中，聚A区位于如本文中所披露的环状多核糖核苷酸的间隔子序列的3’端处。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含聚A。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有经修饰的聚A以调节环状多核糖核苷酸的一种或多种特性。在一些实施例中，缺少聚A或具有经修饰的聚A的环状多核糖核苷酸改善了一种或多种功能性特性，例如免疫原性、半衰期、表达效率等。在一些实施例中，与缺少聚A区的环状多核糖核苷酸相比，包含聚A区的环状多核糖核苷酸具有增加的稳定性。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与RNA结合蛋白质功能性地结合的聚A区。聚A结合蛋白质单体与约38个核苷酸的多段结合。例如，功能性聚A区包含与至少4个聚A结合蛋白结合的一定长度的核苷酸，例如约80个核苷酸或160个核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与RNA结合蛋白质功能性地结合的聚A区(例如，缺少功能性聚A区)。例如，长度不足以结合与至少4个聚A结合蛋白的单体结合的聚A区。
翻译起始序列
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可包含编码多肽的序列及蛋白质翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的蛋白质翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，蛋白质翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，蛋白质翻译起始序列(例如，科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧上，从而导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个蛋白质翻译起始序列。在一些实施例中，蛋白质翻译起始序列为环状多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，蛋白质翻译起始序列基本上在环状多核糖核苷酸的单链区内。
在一些实施例中，蛋白质翻译起始序列可充当调节元件。在一些实施例中，翻译起始序列包含AUG密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包含任何真核起始密码子，例如AUG、CUG、GUG、UUG、ACG、AUC、AUU、AAG、AUA或AGG。在一些实施例中，翻译起始序列包含科扎克序列。
已知侧接起始翻译的密码子(例如但不限于起始密码子或替代性起始密码子)的核苷酸会影响环状多核糖核苷酸的翻译效率、长度和/或结构。(参见例如，Matsuda和MauroPlos ONE[公共科学图书馆综合],2010 5:11；将其内容通过引用以其全文并入本文中)。掩蔽侧接起始翻译的密码子的任何核苷酸可用于改变环状多核糖核苷酸的翻译起始位置、翻译效率、长度和/或结构。
环状多核糖核苷酸可包含多于1个起始密码子，例如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含多于1个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少2个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少3个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少4个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少5个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少6个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少7个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少8个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少9个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少10个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少11个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少12个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少13个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少14个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少15个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少16个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少17个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少18个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少19个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少20个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少25个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少30个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少35个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少40个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少50个起始密码子。环状多核糖核苷酸可包含至少60个起始密码子。翻译可以在第一起始密码子上起始或可以在第一起始密码子的下游起始。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以起始于不是第一起始密码子的密码子，例如AUG。环状多核糖核苷酸的翻译可起始于替代性翻译起始序列处，例如但不限于ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG(参见Touriol等人,Biology ofthe Cell[细胞生物学]95(2003)169-178以及Matsuda和Mauro,PLoS ONE[公共科学图书馆综合],2010 5:11；其各自的内容通过引用以其全文并入本文中)。在一些实施例中，翻译在例如应激诱导条件的选择性条件下在替代性蛋白质翻译起始序列处开始。作为非限制性实例，环状多核糖核苷酸的翻译可以在替代性蛋白质翻译起始序列(例如ACG)处开始。作为另一非限制性实例，环状多核糖核苷酸翻译可以在替代性蛋白质翻译起始序列CTG/CUG处开始。作为又另一非限制性实例，环状多核糖核苷酸翻译可以在替代性蛋白质翻译起始序列GTG/GUG处开始。作为又另一非限制性实例，环状多核糖核苷酸可在重复相关的非AUG(RAN)序列(例如包含短片段的重复RNA(例如CGG、GGGGCC、CAG、CTG)的替代性蛋白质翻译起始序列)处开始翻译。
在一些实施例中，翻译是通过用Rocaglates处理真核起始因子4A(eIF4A)来起始的(通过阻断43S扫描来阻遏翻译，从而导致过早的上游翻译起始以及携带RocA-eIF4A靶序列的转录物的蛋白质表达降低，参见例如，www.nature.com/articles/nature17978)。
IRES
在一些实施例中，本文中所述的环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)元件。包含于环状多核糖核苷酸中的合适的IRES元件包括能够接合真核核糖体的RNA序列。在一些实施例中，IRES元件是至少约5nt、至少约8nt、至少约9nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约40nt、至少约50nt、至少约100nt、至少约200nt、至少约250nt、至少约350nt或至少约500nt。在一个实施例中，IRES元件衍生自生物体的DNA，所述生物体包括但不限于病毒、哺乳动物及果蝇(Drosophila)。此类病毒DNA可以衍生自但不限于小核糖核酸病毒互补DNA(cDNA)、脑心肌炎病毒(EMCV)cDNA和脊髓灰质炎病毒cDNA。在一个实施例中，衍生IRES元件的果蝇DNA包括但不限于来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的触角足基因。
在一些实施例中，IRES元件至少部分地衍生自病毒，例如，它可以衍生自病毒IRES元件，例如ABPV_IGRpred、AEV、ALPV_IGRpred、BQCV_IGRpred、BVDV1_1-385、BVDV1_29-391、CrPV_5NCR、CrPV_IGR、crTMV_IREScp、crTMV_IRESmp75、crTMV_IRESmp228、crTMV_IREScp、crTMV_IREScp、CSFV、CVB3、DCV_IGR、EMCV-R、EoPV_5NTR、ERAV_245-961、ERBV_162-920、EV71_1-748、FeLV-Notch2、FMDV_型_C、GBV-A、GBV-B、GBV-C、gypsy_env、gypsyD5、gypsyD2、HAV_HM175、HCV_type_1a、HiPV_IGRpred、HIV-1、HoCV1_IGRpred、HRV-2、IAPV_IGRpred、idefix、KBV_IGRpred、LINE-1_ORF1_-101_至_-1、LINE-1_ORF1_-302_至_-202、LINE-1_ORF2_-138_至_-86、LINE-1_ORF1_-44_至_-1、PSIV_IGR、PV_型1_Mahoney、PV_型3_Leon、REV-A、RhPV_5NCR、RhPV_IGR、SINV1_IGRpred、SV40_661-830、TMEV、TMV_UI_IRESmp228、TRV_5NTR、TrV_IGR或TSV_IGR。在一些实施例中，IRES元件至少部分地衍生自细胞IRES，例如AML1/RUNX1、Antp-D、Antp-DE、Antp-CDE、Apaf-1、Apaf-1、AQP4、AT1R_var1、AT1R_var2、AT1R_var3、AT1R_var4、BAG1_p36delta236nt、BAG1_p36、BCL2、BiP_-222_-3、c-IAP1_285-1399、c-IAP1_1313-1462、c-jun、c-myc、Cat-1_224、CCND1、DAP5、eIF4G、eIF4GI-ext、eIF4GII、eIF4GII-长、ELG1、ELH、FGF1A、FMR1、Gtx-133-141、Gtx-1-166、Gtx-1-120、Gtx-1-196、无毛(hairless)、HAP4、HIF1a、hSNM1、Hsp101、hsp70、hsp70、Hsp90、IGF2_leader2、Kv1.4_1.2、L-myc、LamB1_-335_-1、LEF1、MNT_75-267、MNT_36-160、MTG8a、MYB、MYT2_997-1152、n-MYC、NDST1、NDST2、NDST3、NDST4L、NDST4S、NRF_-653_-17、NtHSF1、ODC1、p27kip1、p53_128-269、PDGF2/c-sis、Pim-1、PITSLRE_p58、Rbm3、收割者(reaper)、Scamper、TFIID、TIF4631、Ubx_1-966、Ubx_373-961、UNR、Ure2、UtrA、VEGF-A_-133_-1、XIAP_5-464、XIAP_305-466或YAP1。在一些实施例中，IRES元件包含合成IRES，例如，(GAAA)16、(PPT19)4、KMI1、KMI1、KMI2、KMI2、KMIX、X1或X2。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含侧接至少一个(例如，2、3、4、5或更多个)表达序列的至少一个IRES。在一些实施例中，IRES侧接至少一个(例如2、3、4、5或更多个)表达序列的两侧。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧上包括一个或多个IRES序列，导致所得的一种或多种肽和/或一种或多种多肽的隔开。
终止元件
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可包含一个或多个表达序列，并且每个表达序列可具有或可不具有终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且表达序列缺少终止元件，使得环状多核糖核苷酸被连续翻译。由于缺少核糖体停滞或脱落，终止元件的排除可能导致表达产物例如肽或多肽的滚环翻译或连续表达。在此种实施例中，滚环翻译通过每个表达序列来表达连续表达产物。在一些其他实施例中，表达序列的终止元件可以是交错元件的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个表达序列包含终止元件。然而，在环状多核糖核苷酸中进行滚环翻译或后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的表达。在此类例子中，当核糖体遇到终止元件(例如，终止密码子)并终止翻译时，表达产物可从核糖体脱落。在一些实施例中，在核糖体例如核糖体的至少一个亚基与环状多核糖核苷酸保持接触时翻译终止。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在一个或多个表达序列的端部包含终止元件。在一些实施例中，一个或多个表达序列连续包含两个或更多个终止元件。在此类实施例中，终止翻译并且终止滚环翻译。在一些实施例中，核糖体与环状多核糖核苷酸完全脱离。在一些此类实施例中，在环状多核糖核苷酸中后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的产生可能需要核糖体在起始翻译之前与环状多核糖核苷酸重新接合。通常，终止元件包括发出翻译终止信号的框内核苷酸三联体，例如UAA、UGA、UAG。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个终止元件是阅读框移位的终止元件，例如但不限于，可终止翻译的脱框(off-frame)或-1及+1移位的阅读框(例如，隐藏的终止)。阅读框移位的终止元件包括出现在表达序列的第二阅读框和第三阅读框中的核苷酸三联体，TAA、TAG和TGA。阅读框移位的终止元件可能对防止通常对细胞有害的mRNA误读很重要。
交错元件
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可包含与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，终止密码子位于环状多核糖核苷酸的结合区(例如，第二结合区)与交错元件之间。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且所述一个或多个表达序列中的每一个通过环状多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列隔开。在一些实施例中，所述交错元件阻止由(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单一多肽。在一些实施例中，交错元件是与一个或多个表达序列隔开的序列。在一些实施例中，交错元件包含一个或多个表达序列中的表达序列的一部分。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含交错元件。为了避免在保持滚环翻译的同时产生连续表达产物，例如肽或多肽，可以包括交错元件以在翻译期间诱导核糖体暂停。在一些实施例中，交错元件在一个或多个表达序列中的至少一个的3'端。交错元件可以被配置为在环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。交错元件可包括但不限于2A样或CHYSEL(顺式作用的水解酶元件)序列。在一些实施例中，交错元件编码具有C末端共有序列为X1X2X3EX5NPGP的序列，其中X1不存在或是G或H，X2不存在或是D或是G，X3是D或V或I或S或M，并且X5是任何氨基酸。在一些实施例中，此序列包含具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。交错元件的一些非限制性实例包含GDVESNPGP、GDIEENPGP、VEPNPGP、IETNPGP、GDIESNPGP、GDVELNPGP、GDIETNPGP、GDVENPGP、GDVEENPGP、GDVEQNPGP、IESNPGP、GDIELNPGP、HDIETNPGP、HDVETNPGP、HDVEMNPGP、GDMESNPGP、GDVETNPGP、GDIEQNPGP和DSEFNPGP。
在一些实施例中，本文中所述的交错元件切割表达产物，例如介于本文中所述的共有序列的G与P之间。作为一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸包含至少一个交错元件以切割表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与至少一个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含在每一表达序列之后的交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含存在于每个表达序列的一侧或两侧的交错元件，导致由每个表达序列翻译一种或多种单独肽和/或一种或多种多肽。
在一些实施例中，交错元件包含一个或多个在翻译过程中诱导核糖体暂停的经修饰的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可包含肽核酸(PNA)、吗啉代及锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。诸如此类的实例通过改变分子主链而不同于天然存在的DNA或RNA。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)进行的可在翻译期间诱导核糖体暂停的任何修饰以及其任何组合。本文提供的一些示例性修饰在本文其他处描述。
在一些实施例中，交错元件以其他形式存在于环状多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性环状多核糖核苷酸中，交错元件包含环状多核糖核苷酸中的第一表达序列的终止元件，以及将终止元件与第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些实例中，第一表达序列的第一交错元件在环状多核糖核苷酸中的第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一表达序列和第一表达序列后继表达序列是环状多核糖核苷酸中的两个隔开的表达序列。第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离可以使得第一表达序列及其后继表达序列能够连续翻译。在一些实施例中，第一交错元件包括终止元件，并且将第一表达序列的表达产物与其后继表达序列的表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状多核糖核苷酸中后继序列的第一翻译起始序列上游包含第一交错元件的环状多核糖核苷酸被连续翻译，而在第二表达序列后继表达序列的第二翻译起始序列的上游包含第二表达序列的交错元件的对应环状多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，环状多核糖核苷酸中仅存在一个表达序列，并且第一表达序列及其后继表达序列是相同的表达序列。在一些示例性环状多核糖核苷酸中，交错元件包含环状多核糖核苷酸中第一表达序列的第一终止元件，和将终止元件与下游翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些此类实例中，环状多核糖核苷酸中第一交错元件在第一表达序列的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一交错元件与第一蛋白质翻译起始序列之间的距离使得能够连续翻译第一表达序列及任何后继表达序列。在一些实施例中，第一交错元件将第一表达序列的一轮表达产物与第一表达序列的下一轮表达产物隔开，由此产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状多核糖核苷酸中第一表达序列的第一蛋白质翻译起始序列上游包含第一交错元件的环状多核糖核苷酸被连续翻译，而在对应环状多核糖核苷酸中第二表达序列的第二蛋白质翻译起始序列上游包含交错元件的对应环状多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，对应环状多核糖核苷酸中第二交错元件与第二蛋白质翻译起始序列之间的距离是环状多核糖核苷酸中第一交错元件与第一蛋白质翻译起始序列之间的距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍大。在一些情况下，第一交错元件与第一蛋白质翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或更大。在一些实施例中，第二交错元件与第二蛋白质翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或者大于第一交错元件与第一蛋白质翻译起始之间的距离。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含多于一个表达序列。
表达序列
如本文中所述的多核糖核苷酸包含编码肽或多肽的至少一个表达序列。这种肽可以包括但不限于小肽、拟肽(例如，类肽)、氨基酸、和氨基酸类似物。肽可以是直链或支链的。此种肽可具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量和此类化合物的盐、酯及其他药学上可接受的形式。此种肽可包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。
多肽可以是直链或支链的。多肽的长度可以是从约5至约40,000个氨基酸、约15至约35,000个氨基酸、约20至约30,000个氨基酸、约25至约25,000个氨基酸、约50至约20,000个氨基酸、约100至约15,000个氨基酸、约200至约10,000个氨基酸、约500至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸或者其间的任何范围。在一些实施例中，长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸或者更少的多肽可能是有用的。
肽或多肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标志物、抗原、治疗性肽、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽以及多种降解或自毁肽。本文中所述的可用于本发明的肽还包括抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，例如单链抗体、纳米抗体(参见，例如，Steeland等人2016.Nanobodies as therapeutics:big opportunities for small antibodies.[纳米抗体作为治疗剂：小抗体的巨大机会]Drug Discov Today[今日药物发现]:21(7):1076-113)。此类抗原结合肽可结合胞质抗原、核抗原、细胞器内抗原。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA表达序列，其中每一个都可以编码多肽。多肽可以大量产生。这样，多肽可以是可产生的任何蛋白质分子。多肽可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。一些多肽包括但不限于以下中的至少一部分：病毒包膜蛋白、代谢调节酶(例如，调节脂质或类固醇的产生)、抗原、耐受原、细胞因子、毒素、其不存在与疾病相关的酶、和在动物体内没有活性直至被切割(例如，在动物的肠道中)的多肽、以及激素。
治疗性肽或多肽
在一些实施例中，表达序列编码治疗性效应子，例如治疗性肽或多肽，例如细胞内肽或细胞内多肽、分泌的多肽或蛋白质替代治疗剂。在一些实施例中，表达序列包括编码蛋白质例如治疗性蛋白质的序列。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于激素、细胞因子、酶、抗体(例如，编码至少重链或轻链的一种或多种多肽)、转录因子、受体(例如膜受体)、配体、膜转运蛋白、分泌的蛋白质、肽、载剂蛋白、结构蛋白、核酸酶或其组分。
治疗性表达序列可以是上文中任一种的功能性变体或其片段，例如，与本文表中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码蛋白质例如治疗性蛋白质的表达序列。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载剂活性、分子功能调节物、分子换能器活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性、或转运蛋白活性。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白疫苗、抗原(例如，肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如，癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调节的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或其组分。
在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括人蛋白，例如受体结合蛋白、激素、生长因子、生长因子受体调节子和再生蛋白质(例如，增殖和分化涉及的蛋白质，例如用于伤口愈合的治疗性蛋白质)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸可以的示例性蛋白质包括EGF(上皮生长因子)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括酶，例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、非ATP依赖型蛋白酶和去饱和酶。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括细胞内蛋白质或胞质蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达
Figure BDA0003866038070000671
萤光素酶(nLuc)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括分泌蛋白，例如分泌酶。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达如下的分泌蛋白，所述分泌蛋白可以在血液中具有较短半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白，或者是具有分泌信号肽的蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达高斯萤光素酶(gLuc)。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达非人蛋白，例如荧光蛋白、能量转移受体或蛋白标签像Flag、Myc或His。在一些实施例中，可由环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括GFP。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达标签蛋白，例如含有蛋白质标签的融合蛋白或工程化蛋白，例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Fc标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)、钙调蛋白标签(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、聚谷氨酸标签(EEEEEE)、E标签(GAPVPYPDPLEPR)、FLAG标签(DYKDDDDK)、HA标签(YPYDVPDYA)、His标签(HHHHHH)、Myc标签(EQKLISEEDL)、NE标签(TKENPRSNQEESYDDNES)、S标签(KETAAAKFERQHMDS)、SBP标签(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)、Sof标签1(SLAELLNAGLGGS)、Sof标签3(TQDPSRVG)、Spot标签(PDRVRAVSHWSS)、Strep标签(Strep标签II：WSHPQFEK)、TC标签(CCPGCC)、Ty标签(EVHTNQDPLD)、V5标签(GKPIPNPLLGLDST)、VSV标签(YTDIEMNRLGK)、或Xpress标签(DLYDDDDK)。
治疗性表达序列可以是结合上文任一种的抗体或抗体片段，例如，针对与本文中的表中通过其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质的抗体。术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段和替代性支架结合蛋白质，只要其表现出所需的抗原结合活性。“抗体片段”是指包含至少一个重链或轻链并结合抗原的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。替代性支架蛋白质可以包括，例如Darpin蛋白、FN3结构域、Centyrin蛋白、扭结菌素(Knottin)、抗运载蛋白(anticalin)、纳米抗体，以及被选择或工程化以结合靶分子的其他单结构域及多结构域蛋白质。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体，例如抗体片段或其一部分。在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型的，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，例如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段或Fab片段、其另外的部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包含多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包含一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。在一些情况下，当环状多核糖核苷酸在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。
示例性分泌的多肽效应子
能够被表达的示例性分泌的蛋白质在本文中描述，例如在下表中描述。
细胞因子和细胞因子受体：
在一些实施例中，本文所述的效应子包含表1的细胞因子或其功能性变体或片段，例如，与表1中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体与对应细胞因子受体结合，其Kd比对应的野生型细胞因子在相同条件下对于相同受体的Kd高或低不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，效应子包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一区(例如，表1的细胞因子多肽或其功能性变体或片段)和第二异源区。在一些实施例中，第一区是表1的第一细胞因子多肽。在一些实施例中，第二区是表1的第二细胞因子多肽，其中所述第一和第二细胞因子多肽在野生型细胞中彼此形成细胞因子异二聚体。在一些实施例中，表1的多肽或其功能性变体包含信号序列，例如效应子内源性的信号序列，或者异源信号序列。
在一些实施例中，本文中所述的效应子包含结合表1的细胞因子的抗体或其变体。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
表1.示例性细胞因子和细胞因子受体
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Figure BDA0003866038070000721
多肽激素和受体
在一些实施例中，本文中所述的效应子包含表2的激素或其功能性变体，例如，与表2中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体与对应受体结合，其Kd比对应的野生型激素在相同条件下对于相同受体的Kd高不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表2的多肽或其功能性变体包含信号序列，例如效应子内源性的信号序列，或者异源信号序列。
在一些实施例中，本文中所述的效应子包含与表2的激素结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，本文中所述的效应子包含与表2的激素受体结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
表2.示例性多肽激素和受体
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Figure BDA0003866038070000731
Figure BDA0003866038070000741
生长因子：
在一些实施例中，本文中所述的效应子包含表3的生长因子或其功能性变体，例如，与表3中通过参考其UniProt ID来披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体与对应受体结合，其Kd比对应的野生型生长因子在相同条件下对于相同受体的Kd高不超过10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表3的多肽或其功能性变体包含信号序列，例如效应子内源性的信号序列，或者异源信号序列。
在一些实施例中，本文中所述的效应子包含与表3的生长因子结合的抗体或其变体。在一些实施例中，本文中所述的效应子包含与表3的生长因子受体结合的抗体分子(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子包含信号序列。
表3.示例性生长因子
Figure BDA0003866038070000751
Figure BDA0003866038070000761
Figure BDA0003866038070000771
凝血因子：
在一些实施例中，本文中所述的效应子包含表4的多肽或其功能性变体，例如，与表4中通过参考其UniProt ID来披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体催化与对应的野生型蛋白相同的反应，例如，催化速率比野生型蛋白低或高不少于10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施例中，表4的多肽或其功能性变体包含信号序列，例如效应子内源性的信号序列，或者异源信号序列。
表4.凝血相关联的因子
Figure BDA0003866038070000772
Figure BDA0003866038070000781
酶替代治疗剂：
在一些实施例中，本文中所述的效应子包含表5的酶或其功能性变体，例如，与表5中通过参考其UniProt ID披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。在一些实施例中，功能性变体催化与对应的野生型蛋白相同的反应，例如，催化速率比野生型蛋白低不少于或不多于10％、20％、30％、40％或50％。
表5.用于酶缺乏症的示例性酶效应子
Figure BDA0003866038070000782
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Figure BDA0003866038070000801
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Figure BDA0003866038070000851
Figure BDA0003866038070000861
其他非酶效应子：
在一些实施例中，本文中所述的治疗性多肽包含表6的多肽或其功能性变体，例如，与表6中通过参考其UniProt ID来披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。
表6.示例性非酶效应子和对应适应症
Figure BDA0003866038070000871
Figure BDA0003866038070000881
Figure BDA0003866038070000891
再生、修复和纤维化因子
本文中所述的治疗性多肽还包含如在表7中披露的生长因子或其功能性变体，例如，与表7中通过参考其UniProt ID来披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。还包括针对此类生长因子的抗体或其片段，或者促进再生及修复的miRNA。
表7：
Figure BDA0003866038070000901
转化因子：
本文中所述的治疗性多肽还包含转化因子，例如将成纤维细胞转化为分化细胞的蛋白质因子，例如在表8中披露的因子或其功能性变体，例如，与表8中通过参考其UniProtID来披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。
表8
Figure BDA0003866038070000911
刺激细胞再生的蛋白质：
本文中所述的治疗性多肽还包含刺激细胞再生的蛋白质，例如在表9中披露的蛋白质或其功能性变体，例如，与表9中通过参考其UniProt ID来披露的蛋白质序列具有至少80％、85％、90％、95％、967％、98％、99％同一性的蛋白质。
表9.
Figure BDA0003866038070000921
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且被配置用于在受试者体内细胞中的持续表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在此类实施例中，一个或多个表达序列的表达可维持在相对稳定的水平下或可以随时间增加。表达序列的表达可以在延长的时间段内相对稳定。例如，在一些情况下，一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的时间周期内的表达不会减少50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些情况下，在一些情况下，一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的表达维持在变化不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的水平。
加密原
如本文中所述，环状多核糖核苷酸可以进一步包含加密原以降低、逃避或避免细胞的先天免疫应答。在一个方面，本文中提供了环状多核糖核苷酸，当所述环状多核糖核苷酸被递送至细胞时，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，导致宿主的免疫应答减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的免疫原性比缺少加密原的对应物的免疫原性小。
在一些实施例中，加密原增强了稳定性。关于UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调节作用的证据越来越多。UTR的调节特征可包含于加密原中，以增强环状多核糖核苷酸的稳定性。
在一些实施例中，5'或3'UTR可构成环状多核糖核苷酸中的加密原。例如，UTR AU富集元件(ARE)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。
在一些实施例中，去除表达序列中的AU富集元件(ARE)的修饰(例如可翻译区)可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。
在一些实施例中，加密原包含miRNA结合位点或与任何其他非编码RNA的结合位点。例如，将miR-142位点掺入本文中所述的环状多核糖核苷酸中不仅可调节造血细胞中的表达，还可降低或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的免疫应答。
在一些实施例中，加密原包含一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质(例如，免疫蛋白质)能够与RNA序列结合。通过将蛋白质结合位点工程化至环状多核糖核苷酸中，通过掩蔽环状多核糖核苷酸而免受宿主免疫系统组分的影响，环状多核糖核苷酸可以逃避宿主的免疫系统的检测或具有减少的宿主的免疫系统的检测、具有经调节的降解、或经调节的翻译。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白质结合位点，例如以逃避免疫应答，例如CTL应答。在一些实施例中，免疫蛋白质结合位点是与免疫蛋白质结合并有助于掩蔽为外源环状多核糖核苷酸的核苷酸序列。
在一些实施例中，加密原包含一种或多种经修饰的核苷酸。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)及其任何组合进行的可防止或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的任何修饰。以下详细描述了本文提供的一些示例性修饰。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个如本文其他处所述的修饰，以与由参考化合物(例如缺少修饰的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，降低宿主的免疫应答。特定来说，已显示添加一个或多个肌苷区分RNA是内源性还是病毒性。参见例如，Yu,Z等人,(2015)RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as“self”.[通过ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自身”]Cell Res.[细胞研究]25,1283-1284，将所述文献通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个shRNA的表达序列或可被加工成siRNA的RNA序列，并且shRNA或siRNA靶向RIG-1并降低RIG-1的表达。RIG-1可以感测外来环状RNA，并且导致外来环状RNA降解。因此，具有靶向RIG-1的shRNA、siRNA或任何其他调节核酸的序列的环状多核苷酸可降低针对环状多核糖核苷酸的免疫力，例如宿主细胞免疫力。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少有助于环状多核糖核苷酸减少、逃避或避免细胞先天免疫应答的序列、元件或结构。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可能缺少聚A序列、5'端、3'端、磷酸酯基团、羟基基团或其任何组合。
结构
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，A-U和C-G)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。在一些实施例中，具有准双链二级结构的区段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个配对核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有准双链二级结构的区段(例如2、3、4、5、6个或更多个)。在一些实施例中，区段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸隔开。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可影响环状多核糖核苷酸的功能性。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上是单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或RNA结合位点。在一些实施例中，基本上是单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包含此类二级结构，从而结合蛋白质或核酸或者增加蛋白质或核酸结合。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸序列基本上是双链的。在一些实施例中，基本上是双链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可包含构象辨识位点，例如核糖开关或适体酶。在一些实施例中，基本上是双链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象刚性的。在一些此类例子中，构象刚性序列可能在空间上阻碍环状多核糖核苷酸结合蛋白质或核酸。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包含此类二级结构，从而避免或减少蛋白质或核酸结合。
有16种可能的碱基配对，但其中的六种(AU、GU、GC、UA、UG、CG)可形成实际的碱基对。其余的被称为错配，并且以极低的频率出现在螺旋中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的结构不容易被破坏，从而对其功能无影响且无致命后果，这提供了维持二级结构的选择。在一些实施例中，茎的一级结构(即其核苷酸序列)仍可变化，同时仍保持螺旋区。碱基的性质是高阶结构的第二位，并且只要其保留二级结构，就可以进行取代。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准螺旋结构的区段。在一些实施例中，具有准螺旋结构的区段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有准螺旋结构的区段(例如，2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，区段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含富U或富A序列或其组合中的至少一个。在一些实施例中，富U和/或富A序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有双准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有双准螺旋结构的区段(例如，2、3、4、5、6个或更多个)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含富C和/或富G的序列中的至少一种。在一些实施例中，富C和/或富G序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有有助于稳定的分子内三联准螺旋结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有两个准螺旋结构(例如，通过磷酸二酯键隔开)，使得它们末端的碱基对堆叠，并且准螺旋结构变为共线性，导致“同轴堆叠”的子结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含具有一个或多个基序的三级结构，例如假结结构、g-四链体、螺旋和同轴堆叠。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个结合位点，例如，至少一个蛋白质结合位点、至少一个miRNA结合位点、至少一个lncRNA结合位点、至少一个tRNA结合位点、至少一个rRNA结合位点、至少一个snRNA结合位点、至少一个siRNA结合位点、至少一个piRNA结合位点、至少一个snoRNA结合位点、至少一个snRNA结合位点、至少一个exRNA结合位点、至少一个scaRNA结合位点、至少一个Y RNA结合位点、至少一个hnRNA结合位点、和/或至少一个tRNA基序。
调节元件
在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸进一步包含调节元件，例如修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。
调节元件可包含与编码表达产物的表达序列相邻定位的序列。调节元件可以与相邻序列可操作地连接。如与不存在调节元件时表达的产物的量相比，调节元件可增加表达的产物的量。另外，一个调节元件可增加串联附接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一个调节元件可增强一个或多个表达序列的表达。多个调节元件是本领域普通技术人员熟知的。
如本文中所提供的调节元件可包含选择性翻译序列。如本文使用的，术语“选择性翻译序列”可以指在环状多核糖核苷酸中选择性地起始或激活表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调节元件还可包含选择性降解序列。如本文所用，术语“选择性降解序列”可以指起始环状多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。示例性选择性降解序列可包含核糖开关适体酶和miRNA结合位点。
在一些实施例中，调节元件是翻译调节子。翻译调节子可调节环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与至少一个表达序列相邻的至少一个翻译调节子。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与每一表达序列相邻的翻译调节子。在一些实施例中，翻译调节子存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。
调节核酸
在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸包含一种或多种编码调节核酸(例如，修饰内源性基因和/或外源性基因的表达)的表达序列。在一些实施例中，如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的表达序列可以包含与调节核酸像非编码RNA，例如但不限于tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、YRNA和hnRNA反义的序列。
在一个实施例中，调节核酸靶向宿主基因。调节核酸可包括但不限于与内源基因杂交的核酸(例如，如本文其他地方所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA)、与外源核酸(例如病毒DNA或RNA)杂交的核酸、与RNA杂交的核酸、干扰基因转录的核酸、干扰RNA翻译的核酸、稳定RNA或去稳定RNA的核酸(例如通过靶向降解)，以及调节DNA或RNA结合因子的核酸。在一个实施例中，序列是miRNA。在一些实施例中，调节核酸靶向宿主基因的正义链。在一些实施例中，调节核酸靶向宿主基因的反义链。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含调节核酸，例如指导RNA(gRNA)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含指导RNA或编码指导RNA。gRNA短合成RNA由与不完整的效应子部分结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸靶向序列构成。在实践中，指导RNA序列通常被设计为具有17-24个核苷酸(例如，19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶向的核酸序列互补。定制的gRNA生成器和算法可商购获得，用于在设计有效的指导RNA中使用。还已使用嵌合的“单指导RNA”(“sgRNA”)(一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并含有tracrRNA(用于结合核酸酶)及至少一个crRNA(以将核酸酶指导至被靶向进行编辑的序列)的工程化(合成)单RNA分子)实现了基因编辑。也已证明，在基因组编辑中，经化学修饰的sgRNA是有效的；参见例如，Hendel等人(2015)NatureBiotechnol[自然生物技术].,985-991。
gRNA可识别特定DNA序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或位于其内的序列)。
在一个实施例中，gRNA被用作CRISPR系统的一部分用于基因编辑。出于基因编辑的目的，可以将环状多核糖核苷酸设计为包含一个或多个与所期望的靶DNA序列相对应的指导RNA序列；参见例如，Cong等人(2013)Science[科学],339:819–823；Ran等人(2013)Nature Protocols[自然实验手册],8:2281-2308。为了发生DNA切割，Cas9需要gRNA序列的至少约16或17个核苷酸；对于Cpf1，需要gRNA序列的至少约16个核苷酸来实现可检测的DNA切割。
某些调节核酸可通过RNA干扰(RNAi)的生物过程来抑制基因表达。RNAi分子包含RNA或RNA样结构，这些结构典型地含有15-50个碱基对(如约18-25个碱基对)，并且具有与细胞内的表达的靶基因中的编码序列同一的(互补的)或接近同一的(基本上互补的)核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体和dicer底物(美国专利号8,084,599、8,349,809和8,513,207)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含调节核酸，该调节核酸是RNA或RNA样结构，典型地在约5-500个碱基对之间(取决于特定的RNA结构，例如miRNA 5-30bp，lncRNA200-500bp)并且可以具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。
长非编码RNA(lncRNA)被定义为长于100个核苷酸的非蛋白质编码转录物。此有些随意的限制将lncRNA与小型调节RNA(例如微RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)及其他短RNA)区分开来。通常，大多数(约78％)的lncRNA的特征为组织特异性的。以与附近蛋白质编码基因相反的方向转录的发散lncRNA(占哺乳动物基因组中总lncRNA的约20％大比例)可能会调节附近基因的转录。在一个实施例中，本文中所提供的环状多核糖核苷酸包含lncRNA的正义链。在一个实施例中，本文中所提供的环状多核糖核苷酸包含lncRNA的反义链。
环状多核糖核苷酸可编码与内源基因或基因产物(例如，mRNA)的全部或片段基本上互补或完全互补的调节核酸。调节核酸可与内含子和外显子之间的边界处、外显子之间的内部或邻近外显子的序列互补，从而防止特异性基因的新生成的核RNA转录物成熟化为用于转录的mRNA。与特定基因互补的调节核酸可与所述基因的mRNA杂交并阻止其翻译。反义调节核酸可以是DNA、RNA或其衍生物或杂交体。在一些实施例中，调节核酸包含可以与参与内源基因或外源基因表达调节的蛋白质结合的蛋白质结合位点。
可编码与目的转录物杂交的调节核酸的环状多核糖核苷酸的长度在5至30个核苷酸之间，在约10至30个核苷酸之间，或者约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸。调节核酸与靶向转录物的同一性程度应为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
环状多核糖核苷酸可编码与靶基因的约5至约25个连续核苷酸相同的微RNA(miRNA)分子。在一些实施例中，miRNA序列靶向mRNA并从二核苷酸AA开始，其GC含量为约30％-70％(约30％-60％、约40％-60％或约45％-55％)，并且例如通过标准BLAST搜索测定，与要引入其中的哺乳动物基因组中的靶标以外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一种miRNA，例如2、3、4、5、6个或更多个。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码miRNA的序列，所述miRNA与所述核苷酸序列中的任一个或与靶序列互补的序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性。
siRNA和shRNA类似于内源性微RNA(miRNA)基因的处理途径中的中间体(Bartel,Cell[细胞]116:281-297,2004)。在一些实施例中，siRNA可以作为miRNA起作用，反之亦然(Zeng等人,Mol.Cell[分子细胞学]9:1327-1333,2002；Doench等人,Genes Dev[基因与发育]17:438-442,2003)。像siRNA一样，微RNA使用RISC来下调靶基因，但与siRNA不同，大多数动物miRNA都不切割mRNA。相反，miRNA通过翻译抑制或聚A去除和mRNA降解降低蛋白质输出(Wu等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]103:4034-4039,2006)。已知的miRNA结合位点位于mRNA 3'UTR内；miRNA似乎靶向与miRNA 5'端的2-8个核苷酸几乎完全互补的位点(Rajewsky,Nat Genet[自然遗传学]38增刊:S8-13,2006；Lim等人,Nature[自然]433:769-773,2005)。此区被称为种子区。由于siRNA和miRNA是可互换的，因此外源siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,Nat Methods[自然方法]3:199-204,2006。3'UTR内的多个靶位点会产生更强的下调(Doench等人,Genes Dev[基因与发育]17:438-442,2003)。
已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，这些组织如维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、斯隆凯特灵癌症中心(Memorial Sloan KetteringCancer Center)和欧洲分子生物学实验室(European Molecule Biology Laboratory)等。已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子易于设计及产生。另外，存在增加发现有效并且特异性的基序的机会的计算工具(Lagana等人,Methods Mol.Bio.[分子生物学方法],2015,1269:393-412)。
环状多核糖核苷酸可调节基因编码的RNA的表达。因为多个基因可能彼此共享一定程度的序列同源性，所以在一些实施例中，可以设计环状多核糖核苷酸以靶向具有充分序列同源性的一类基因。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以含有与在不同基因靶标中共享的序列或对于特异性基因靶标而言是独特的序列具有互补性的序列。在一些实施例中，可以设计环状多核糖核苷酸以靶向在若干基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，从而靶向一个基因家族中的若干基因(例如，不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些实施例中，可以将环状多核糖核苷酸设计为靶向单一基因的特定RNA序列所特有的序列。
在一些实施例中，表达序列的长度少于5000bp(例如，少于约5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp或更少)。在一些实施例中，表达序列的长度独立地或另外地大于10bp(例如，至少约10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。
在一些实施例中，表达序列包含本文所述的一种或多种特征，例如，编码一种或多种肽或蛋白质的序列、一种或多种调节元件、一种或多种调节核酸(例如，一种或多种非编码RNA)、其他表达序列及其任何组合。
RNA结合
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA结合位点。微RNA(或miRNA)是短非编码RNA，其与核酸分子的3'UTR结合并通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可包含一个或多个微RNA靶序列、微RNA序列或微RNA种子。此类序列可对应于任何已知的微RNA，例如在美国公开2005/0261218和美国公开2005/0059005中教导的那些，其内容通过引用以其全文并入本文中。
微RNA序列包含“种子”区，即成熟微RNA的第2-8位区域中的序列，所述序列与miRNA靶序列具有完美的沃森-克里克互补性。微RNA种子可包含成熟微RNA的第2-8位或第2-7位。在一些实施例中，微RNA种子可包含7个核苷酸(例如，成熟微RNA的第2-8个核苷酸)，其中对应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与微RNA第1位相对的腺嘌呤(A)。在一些实施例中，微RNA种子可包含6个核苷酸(例如，成熟微RNA的第2-7个核苷酸)，其中对应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与微RNA第1位相对的腺嘌呤(A)。参见，例如，Grimson A,Farh K,Johnston WK,Garrett-Engele P,Lim LP,Barrel DP；Mol Cell[分子细胞].2007年7月6日；27(1):91-105；其各自通过引用以其全文并入本文中。
微RNA种子的碱基与靶序列基本上互补。通过将微RNA靶序列工程化到环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可逃避或被宿主免疫系统检测到，可以调节降解或调节翻译，只要可获得相关的微RNA。此过程将减少环状多核糖核苷酸递送时脱靶效应的危险。已报道对微RNA、微RNA靶区及其在生物学中的表达模式和作用的鉴定(Bonauer等人，Curr DrugTargets[当前药物靶标]2010 11：943-949；Anand和Cheresh Curr Opin Hematol[血液学新见]2011 18：171-176；Contreras和Rao Leukemia[白血病]2012 26:404-413(2011年12月20日doi:10.1038/leu.2011.356)；Barrel Cell[细胞]2009 136:215-233；Landgraf等人,Cell[细胞],2007 129:1401-1414；将其各自通过引用以其全文并入本文中。
相反，可将微RNA结合位点工程化出(即从其去除)环状多核糖核苷酸，以调节特定组织中的蛋白质表达。对多个组织中表达的调节可通过引入或去除或一或几个微RNA结合位点来实现。
已知微RNA调节mRNA并由此调节蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-ld、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。微RNA还可调节复杂的生物过程，例如血管生成(miR-132)(Anand和Cheresh,Curr Opin Hematol[血液学新见]2011 18:171-176；将其通过引用以其全文并入本文中)。在本文所述的环状多核糖核苷酸中，可以去除或引入与此类过程有关的微RNA的结合位点，以使环状多核糖核苷酸的表达适应生物学相关的细胞类型或相关生物学过程的情况。微RNA、miR序列和miR结合位点列于2013年1月17日提交的美国临时申请61/753,661的表9中、2013年1月18日提交的美国临时申请61/754,159的表9中以及2013年1月31日提交的美国临时申请号61/758,921的表7中，其各自通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，微RNA结合位点包括例如miR-7。
本文中所披露的环状多核糖核苷酸可包含与任何miRNA杂交的miRNA结合位点，例如在例如以下的miRNA数据库中披露的那些中的任一者：miRBase、deepBase、miRBase、microRNA.org、miRGen 2.0、miRNAMap、PMRD、TargetScan或VIRmiRNA。在一些情况下，miRNA结合位点可以是与miRNA互补的任何位点，其靶基因已在例如以下的微RNA靶基因数据中披露：StarBase、StarScan、Cupid、TargetScan、TarBase、Diana-microT、miRecords、PicTar、PITA、RepTarm RNA22、miRTarBase、miRwalk或MBSTAR。
通过理解微RNA在不同细胞类型中的表达模式，可以将本文所述的环状多核糖核苷酸工程化用于在特定细胞类型中或仅在特定生物学条件下的更有靶向性的表达。通过引入组织特异性微RNA结合位点，环状多核糖核苷酸可以设计用于组织中或在生物学条件下的最佳蛋白质表达。列出了使用微RNA来驱动组织或疾病特异性基因表达的实例(Getner和Naldini,Tissue Antigens[组织抗原].2012,80:393-403；将其通过引用以其全文并入本文中)。
另外，可以将微RNA种子位点掺入环状多核糖核苷酸中以调节某些细胞中的表达，这导致生物学改善。此方面的一个实例是miR-142位点的掺入。将miR-142位点掺入本文中所述的环状多核糖核苷酸中可调节造血细胞中的表达，还可减少或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的免疫应答。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个大型基因间非编码RNA(lincRNA)结合位点。大型基因间非编码RNA(lincRNA)构成了大部分长链非编码RNA。LincRNA是非编码转录物，且在一些实施例中，长度超过约200个核苷酸。在一些实施例中，它们具有外显子-内含子-外显子结构，类似于蛋白质编码基因，但是不包含开放阅读框并且不编码蛋白质。近来已描述8,000多种lincRNA，且被认为是RNA的最大亚类，起源于人类的非编码转录组。已知有成千上万的lincRNA，且有些似乎是各种细胞过程的关键调节因子。确定个体lincRNA的功能仍然是一个挑战。与编码基因相比，lincRNA表达具有显著的组织特异性，并且尽管与邻近蛋白质编码基因对的表达程度相似，但它们通常与邻近基因共表达。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一种或多种lincRNA，例如FIRRE、LINC00969、PVT1、LINC01608、JPX、LINC01572、LINC00355、C1orf132、C3orf35、RP11-734、LINC01608、CC-499B15.5、CASC15、LINC00937、RP11-191等，或其他lincRNA或lncRNA，例如来自已知lncRNA数据库的那些。
蛋白质结合
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质(例如，核糖体)能够与RNA序列中的内部位点结合。通过将蛋白质结合位点(例如，核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，通过掩蔽宿主免疫系统成分中的环状多核糖核苷酸来调节降解或调节翻译。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白质结合位点，例如以逃避免疫应答，例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)应答。在一些实施例中，免疫蛋白质结合位点是与免疫蛋白质结合并有助于掩蔽为外源环状多核糖核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白质结合位点是与免疫蛋白质结合并有助于将环状多核糖核苷酸隐藏为外源或外来的核苷酸序列。
核糖体与线性RNA接合的传统机制包括核糖体与RNA的加帽5'端的结合。核糖体从5'端迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本发明，环状多核糖核苷酸的翻译的内部起始(即，非帽依赖性)不需要游离端或加帽端。而是，核糖体与未加帽的内部位点结合，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA序列，所述一个或多个RNA序列包含核糖体结合位点，例如起始密码子。
天然5'UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们带有类似科扎克序列的签名，这些序列众所周知参与核糖体起始多种基因的翻译的过程。科扎克序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)的三个碱基上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，后接另一个“G”。还已知5'UTR形成参与延长因子结合的二级结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码与蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位到特定靶标。在一些实施例中，蛋白质结合序列特异性地结合蛋白质的精氨酸富集区。
在一些实施例中，蛋白质结合位点包括但不限于与蛋白质的结合位点，例如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1和任何其他结合RNA的蛋白质。
核糖开关
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个核糖开关。
核糖开关通常被认为是环状多核糖核苷酸的一部分，所述部分可直接结合一个小的靶分子，并且其与靶标的结合会影响RNA翻译、表达产物的稳定性和活性(Tucker B J、Breaker R R(2005),Curr Opin Struct Biol[结构生物学新见]15(3):342-8)。因此，根据靶分子的存在或不存在，包括核糖开关的环状多核糖核苷酸直接参与调控其自身的活性。在一些实施例中，核糖开关具有适体样亲和力区，以用于单独分子。因此，在本发明的更广泛的上下文中，包含在非编码核酸中的任何适体都可用于从大体积中螯合分子。经由“(核糖)开关”活性的事件的下游报告可能是特别有利的。
在一些实施例中，核糖开关可对基因表达具有影响，包括但不限于转录终止、翻译起始抑制、mRNA自切割以及在真核生物中剪接途径的变更。核糖开关可通过触发分子的结合或去除来控制基因表达。因此，使包括核糖开关的环状多核糖核苷酸经受激活、失活或阻断核糖开关的条件以变更表达。表达可由于例如转录终止或核糖体与RNA结合的阻断而改变。取决于核糖开关的性质，触发分子或其类似物的结合可减少或阻止RNA分子的表达或者促进或增加RNA分子的表达。本文中描述了核糖开关的一些实例。
在一些实施例中，核糖开关是钴胺素核糖开关(也称为B12-元件)，所述核糖开关结合腺苷钴胺素(维生素B12的辅酶形式)以调节钴胺素和类似代谢物的生物合成及转运。
在一些实施例中，核糖开关是环状二-GMP核糖开关，所述核糖开关结合环状二-GMP以调节多种基因。分为非结构相关的两类，即环状二-GMP-l和环状二-GMP-ll。
在一些实施例中，核糖开关是FMN核糖开关(也称为RFN元件)，所述核糖开关结合黄素单核苷酸(FMN)以调节核黄素的生物合成和转运。
在一些实施例中，核糖开关是glmS核糖开关，当存在足够浓度的葡萄糖胺-6-磷酸酯时，所述核糖开关自切割。
在一些实施例中，核糖开关是谷氨酰胺核糖开关，所述核糖开关结合谷氨酰胺以调节涉及谷氨酰胺和氮代谢的基因。它们还结合未知功能的短肽。此类核糖开关分为结构上相关的两类：glnA RNA基序和下游肽基序。
在一些实施例中，核糖开关是甘氨酸核糖开关，所述核糖开关结合甘氨酸以调节甘氨酸代谢基因。甘氨酸核糖开关在同一mRNA中包含两个相邻的适体结构域，并且是已知唯一显示出协同结合的天然RNA。
在一些实施例中，核糖开关是赖氨酸核糖开关(也称为L-box)，所述核糖开关结合赖氨酸以调节赖氨酸的生物合成、分解代谢和转运。
在一些实施例中，核糖开关是PreQ1核糖开关，所述核糖开关结合前Q核苷以调节参与所述前体的合成或转运到Q核苷的基因。已知两种完全不同的PreGI核糖开关类别：PreQ1-l核糖开关和PreQ1-ll核糖开关。在天然存在的核糖开关中，PreQ1-l核糖开关的结合结构域异常小。仅在链球菌和乳球菌属的某些物种中发现的PreGI-II核糖开关具有完全不同的结构，且更大。
在一些实施例中，核糖开关是嘌呤核糖开关，所述核糖开关结合嘌呤以调节嘌呤的代谢和转运。嘌呤核糖开关的不同形式结合鸟嘌呤(一种最初称为G-box的形式)或腺嘌呤。鸟嘌呤或腺嘌呤的特异性完全取决于与核糖开关中Y74位处单个嘧啶的沃森-克里克相互作用。在鸟嘌呤核糖开关中，此残基是胞嘧啶(即C74)，在腺嘌呤中，此残基总是尿嘧啶(即U74)。嘌呤核糖开关的同源类型结合脱氧鸟苷，但比单核苷酸突变具有更显著差异。
在一些实施例中，核糖开关是SAH核糖开关，所述核糖开关结合S-腺苷高半胱氨酸以调节参与回收此代谢物的基因，所述代谢产物是在甲基化反应中使用S-腺苷甲硫氨酸时产生的。
在一些实施例中，核糖开关是SAM核糖开关，所述核糖开关结合S-腺苷甲硫氨酸(SAM)以调节甲硫氨酸和SAM的生物合成和转运。已知三个截然不同的SAM核糖开关：SAM-I(最初称为S-box)、SAM-II和SMK box核糖开关。SAM-I广泛存在于细菌中，但SAM-II仅在α-变形菌门、β-变形菌门和少数γ-变形菌门中发现。仅在乳酸杆菌目中发现SMK box核糖开关。这三种核糖开关变体在序列或结构上没有明显相似性。第四种变体SAM-IV似乎具有与SAM-I类似的配体结合核心，但在不同的支架的情况下。
在一些实施例中，核糖开关是SAM-SAH核糖开关，所述核糖开关以类似的亲和力结合SAM和SAH两者。由于总是在调节编码甲硫氨酸腺苷转移酶基因的位置中发现它们，因此提出仅它们与SAM的结合在生理学上相关。
在一些实施例中，核糖开关是四氢叶酸核糖开关，所述核糖开关结合四氢叶酸以调节合成并转运基因。
在一些实施例中，核糖开关是茶碱结合核糖开关或结合焦磷酸胸腺嘧啶的核糖开关。
在一些实施例中，核糖开关是腾冲嗜热菌(T.tengcongensis)glmS催化性核糖开关，该核糖开关感测葡萄糖胺-6磷酸酯(Klein和Ferre-D'Amare 2006)。
在一些实施例中，核糖开关是TPP核糖开关(也称THI-box)，所述核糖开关结合硫胺素焦磷酸盐(TPP)以调节硫胺素的生物合成和转运，以及类似代谢物的转运。这是迄今为止在真核细胞中发现的唯一核糖开关。
在一些实施例中，核糖开关是Moco核糖开关，所述核糖开关结合钼辅助因子以调节参与该辅酶的生物合成和转运的基因，以及使用所述辅酶或其衍生物作为辅因子的酶。
在一些实施例中，核糖开关是在创伤弧菌的腺嘌呤脱氨酶编码基因的5'UTR中发现的腺嘌呤感测add-A核糖开关。
适体酶
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适体酶。适体酶是用于条件性表达的开关，在所述条件性表达中适体区用作变构控制元件并且偶联到催化性RNA区(如下文所述的“核酶”)。在一些实施例中，适体酶在细胞类型特异性翻译中具有活性。在一些实施例中，适体酶在细胞状态特异性翻译(例如，病毒感染的细胞或存在病毒核酸或病毒蛋白)下具有活性。
核酶(来自核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化性RNA)是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化其自身的磷酸二酯键中的一者的水解，或催化其他RNA中的键的水解，但也发现天然核酶催化核糖体的氨基转移酶活性。最近显示催化RNA可通过体外方法“进化”[1.Agresti J J,Kelly B T,Jaschke A,Griffiths A D:Selection of ribozymes thatcatalyse multiple-turnover Diels-Alder cycloadditions by using in vitrocompartmentalization[通过体外区室化选择催化多周转环加成的核酶].Proc Natl AcadSci USA[美国国家科学院院刊]2005,102:16170-16175；2.Sooter L J,Riedel T,Davidson E A,Levy M,Cox J C,Ellington AD:Toward automated nucleic acid enzymeselection[自动化核酸酶选择].Biological Chemistry[生物化学]2001,382(9):1327-1334.].Winkler等人.已经显示[Winkler W C,Nahvi A,Roth A,Collins J A,Breaker RR:Control of gene expression by a natural metabolite-responsive ribozyme[天然代谢物响应核酶对基因表达的控制].Nature[自然]2004,428:281-286.]，类似于上文所论述的核糖开关活性，核酶及其反应产物可调节基因表达。在本发明的上下文中，将催化性RNA或核酶置于较大的非编码RNA中可能特别有利，使得核酶以许多拷贝存在于细胞内，用于从大体积化学中转化分子。此外，在同一非编码RNA中同时编码适体和核酶可能是特别有利的。
核酶的一些非限制性实例包含锤头状核酶、VL核酶、铅酶、发夹核酶。
在一些实施例中，适体酶是可切割RNA序列并且可由于结合配体/调节子而被调节的核酶。核酶也可以是自切割核酶。这样，适体酶组合了核酶和适体的特性。适体酶由于其在途翻译活性的潜力相较于常规适体提供更多优势，事实上适体酶具有催化作用以使表达失活，且由于其自身或异源转录物的切割，失活是不可逆的。
在一些实施例中，适体酶包含于环状多核糖核苷酸的非翻译区中，并且在不存在配体/调节子时是失活的，从而允许转基因的表达。可通过添加配体来关闭(或下调)表达。应注意，响应于特定调节子的存在而被下调的适体酶可用于需要响应调节子的基因表达上调的控制系统中。
适体酶还可允许形成用于环状多核糖核苷酸表达自调节的系统。例如，环状多核糖核苷酸的蛋白质产物是特定小分子合成中的速率决定酶，可对所述小分子进行修饰，以包含选择用于在所述分子存在下催化活性更强的适体酶，从而为所述小分子合成提供自调节反馈回路。替代性地，适体酶活性可被选择为对环状多核糖核苷酸或任何其他细胞大分子的蛋白质产物积累敏感。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含适体序列。一些非限制性实例包括结合溶菌酶的RNA适体、Toggle-25t(包括2'氟嘧啶核苷酸的RNA适体，以高特异性和亲和力结合凝血酶)、结合人免疫缺陷病毒反式作用应答元件(HIV TAR)的RNATat、结合血红素的RNA适体、结合干扰素γ的RNA适体、结合血管内皮生长因子(VEGF)的RNA适体、结合前列腺特异性抗原(PSA)的RNA适体、结合多巴胺的RNA适体和结合非经典致癌基因-热休克因子1(HSF1)的RNA适体。
复制元件
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可进一步编码可用于复制的序列和/或基序。环状多核糖核苷酸的复制可以通过生成互补的环状多核糖核苷酸来发生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含起始转录的基序，其中转录由环状多核糖核苷酸编码的内源性细胞机制(DNA依赖性RNA聚合酶)或RNA依赖性RNA聚合酶驱动。滚环转录事件的产物可被核酶切割，以生成单位长度的互补或增殖环状多核糖核苷酸。核酶可由环状多核糖核苷酸、其互补体或由反式RNA序列编码。在一些实施例中，编码的核酶可包含调节(抑制或促进)核酶的活性以控制环状RNA增殖的序列或基序。在一些实施例中，单位长度序列可通过细胞RNA连接酶连接成环状形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含有助于自扩增的复制元件。此类复制元件的实例包括但不限于本文中其他处所述的HDV复制结构域、马铃薯纺锤块茎类病毒的RNA启动子(参见例如Kolonko2005Virology[病毒学])以及具有复制能力的环状RNA正义和/或反义核酶，例如反基因组5'-CGGGUCGGCAUGGCAUCUCCACCUCCUCGCGGUCCGACCUGGGCAUCCGAAGGAGGACGCACGUCCACUCGGAUGGCUAAGGGAGAGCCA-3'或基因组5'-UGGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACAUUCCGAGGGGACCGUCCCCUCGGUAAUGGCGAAUGGGACCCA-3'。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含如本文中所述的至少一个交错元件以帮助复制。环状多核糖核苷酸中的交错元件可以将环状多核糖核苷酸复制所得的长转录物切割至特定长度，其后可以环化以形成环状多核糖核苷酸的互补物。
在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个核酶序列，以将环状多核糖核苷酸复制所得的长转录物切割至特定长度，其中另一种编码的核酶在核酶序列处切割转录物。环化形成环状多核糖核苷酸的互补物。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上对例如核酸外切酶的降解有抗性。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内进行复制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内的复制速率是在约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-99％之间或其之间的任何百分比。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制并传递给子细胞。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将至少一种环状多核糖核苷酸传递给子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递给子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递给子细胞。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主细胞内进行复制。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸能够在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中进行复制。
虽然在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主细胞中进行复制，但环状多核糖核苷酸未整合到宿主的基因组中，例如未与宿主的染色体进行整合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有例如与宿主的染色体的可忽略的重组频率。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸例如与宿主的染色体的重组频率例如小于约1.0cM/Mb、0.9cM/Mb、0.8cM/Mb、0.7cM/Mb、0.6cM/Mb、0.5cM/Mb、0.4cM/Mb、0.3cM/Mb、0.2cM/Mb、0.1cM/Mb或更低。
其他序列
在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸进一步包含另一种核酸序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包含其他序列，这些其他序列包括DNA、RNA、或人工核酸。其他序列可包括但不限于基因组DNA，cDNA或编码tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子的序列。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸包含siRNA，以靶向与环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸包含siRNA，以靶向与环状多核糖核苷酸不同的基因表达产物。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度与不存在核酸外切酶时相当或类似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸降解减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'帽。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR，且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-UTR，且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列，且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件，且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点，且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽，且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR、3'-UTR和IRES，且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白质的序列、编码外源性基因的序列、编码治疗剂的序列、调节元件(例如，翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源性基因的一种或多种调节核酸(siRNA、lncRNA、shRNA)和编码治疗性mRNA或蛋白质的序列。
其他序列的长度可以是从约2至约10000nt、约2至约5000nt、约10至约100nt、约50至约150nt、约100至约200nt、约150至约250nt、约200至约300nt、约250至约350nt、约300至约500nt、约10至约1000nt、约50至约1000nt、约100至约1000nt、约1000至约2000nt、约2000至约3000nt、约3000至约4000nt、约4000至约5000nt或其间的任何范围。
作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包括某些使其区别于线性RNA的特征。例如，如与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸较不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸比线性RNA更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。环状多核糖核苷酸与线性RNA相比的增加的稳定性使得环状多核糖核苷酸作为产生多肽的细胞转化试剂更加有用，并且与线性RNA相比，存储更容易且时间更长。可使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，这些方法确定是否已发生RNA降解(例如，通过凝胶电泳)。
此外，与线性RNA不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶(例如小牛肠磷酸酶)一起孵育时，环状多核糖核苷酸较不易去磷酸化。
核苷酸间隔子序列
在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸编码蛋白质。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个间隔子序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7个或更多个间隔子序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含的环状多核糖核苷酸间隔子序列与非间隔子序列(例如，表达序列)的比率为约0.05:1、约0.06:1、约0.07:1、约0.08:1、约0.09:1、约0.1:1、约0.12:1、约0.125:1、约0.15:1、约0.175:1、约0.2:1、约0.225:1、约0.25:1、约0.3:1、约0.35:1、约0.4:1、约0.45:1、约0.5:1、约0.55:1、约0.6:1、约0.65:1、约0.7:1、约0.75:1、约0.8:1、约0.85:1、约0.9:1、约0.95:1、约0.98:1、约1:1、约1.02:1、约1.05:1、约1.1:1、约1.15:1、约1.2:1、约1.25:1、约1.3:1、约1.35:1、约1.4:1、约1.45:1、约1.5:1、约1.55:1、约1.6:1、约1.65:1、约1.7:1、约1.75:1、约1.8:1、约1.85:1、约1.9:1、约1.95:1、约1.975:1、约1.98:1或约2:1。
在一些实施例中，间隔子序列包含的环状多核糖核苷酸的间隔子序列与下游(例如，间隔子序列的3')非间隔子元件的比率为约0.5:1、约0.06:1、约0.07:1、约0.08:1、约0.09:1、约0.1:1、约0.12:1、约0.125:1、约0.15:1、约0.175:1、约0.2:1、约0.225:1、约0.25:1、约0.3:1、约0.35:1、约0.4:1、约0.45:1、约0.5:1、约0.55:1、约0.6:1、约0.65:1、约0.7:1、约0.75:1、约0.8:1、约0.85:1、约0.9:1、约0.95:1、约0.98:1、约1:1、约1.02:1、约1.05:1、约1.1:1、约1.15:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约1.95:1、约1.975:1、约1.98:1、约2.1:1、约2.2:1、约2.3:1、约2.4:1、约2.5:1、约2.6:1、约2.7:1、约2.8:1、约2.9:1、约3:1、约3.1:1、约3.2:1、约3.3:1、约3.4:1、约3.5:1、约3.6:1、约3.7:1、约3.8:1、约3.85:1、约3.9:1、约3.95:1、约3.98:1或约4:1。在一些实施例中，间隔子序列包含的环状多核糖核苷酸的间子隔序列与上游(例如，间隔子序列的5')非间隔子元件的比率为约0.5:1、约0.06:1、约0.07:1、约0.08:1、约0.09:1、约0.1:1、约0.12:1、约0.125:1、约0.15:1、约0.175:1、约0.2:1、约0.225:1、约0.25:1、约0.3:1、约0.35:1、约0.4:1、约0.45:1、约0.5:1、约0.55:1、约0.6:1、约0.65:1、约0.7:1、约0.75:1、约0.8:1、约0.85:1、约0.9:1、约0.95:1、约0.98:1、约1:1、约1.02:1、约1.05:1、约1.1:1、约1.15:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约1.95:1、约1.975:1、约1.98:1、约2.1:1、约2.2:1、约2.3:1、约2.4:1、约2.5:1、约2.6:1、约2.7:1、约2.8:1、约2.9:1、约3:1、约3.1:1、约3.2:1、约3.3:1、约3.4:1、约3.5:1、约3.6:1、约3.7:1、约3.8:1、约3.85:1、约3.9:1、约3.95:1、约3.98:1或约4:1。
在一些实施例中，间隔子序列包含的序列具有至少3个核糖核苷酸、至少4个核糖核苷酸、至少5个核糖核苷酸、至少约8个核糖核苷酸、至少约10个核糖核苷酸、至少约12个核糖核苷酸、至少约15个核糖核苷酸、至少约20个核糖核苷酸、至少约25个核糖核苷酸、至少约30个核糖核苷酸、至少约40个核糖核苷酸、至少约50个核糖核苷酸、至少约60个核糖核苷酸、至少约70个核糖核苷酸、至少约80个核糖核苷酸、至少约90个核糖核苷酸、至少约100个核糖核苷酸、至少约120个核糖核苷酸、至少约150个核糖核苷酸、至少约200个核糖核苷酸、至少约250个核糖核苷酸、至少约300个核糖核苷酸、至少约400个核糖核苷酸、至少约500个核糖核苷酸、至少约600个核糖核苷酸、至少约700个核糖核苷酸、至少约800个核糖核苷酸、至少约900个核糖核苷酸或至少约100个核糖核苷酸。
在一些实施例中，间隔子序列可以是具有低GC含量的核酸序列或分子，例如低于跨间隔子全长或者跨间隔子的至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％连续核酸残基的65％、60％、55％、50％、55％、50％、45％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一些实施例中，间隔子序列可包含至少95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、20％或其间任何百分比的腺嘌呤核糖核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列包含至少5个或更多个连续腺嘌呤核糖核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列包含至少6个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少7个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少8个连续核糖核苷酸、至少约10个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约12个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约15个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约20个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约25个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约30个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约40个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约50个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约60个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约70个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约80个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约90个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约95个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约100个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约150个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约200个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约250个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约300个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约350个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约大400个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约450个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约500个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约550个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约600个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约700个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约800个连续腺嘌呤核糖核苷酸、至少约900个连续腺嘌呤核糖核苷酸或至少约1000个连续腺嘌呤核糖核苷酸。
在一些实施例中，间隔子序列位于一个或多个元件之间。在一些实施例中，间隔子序列提供元件之间的构象柔性。在一些实施例中，构象柔性是由于间隔子序列基本上不含二级结构。在一些实施例中，间隔子序列基本上不含二级结构，例如小于40kcal/mol，小于-39、-38、-37、-36、-35、-34、-33、-32、-31、-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2或-1kcal/mol。间隔子可包含核酸，例如DNA或RNA。
在一些实施例中，间隔子序列可编码RNA序列，且优选地是蛋白质或肽序列，包含分泌信号肽。
在一些实施例中，间隔子序列可以是非编码的。在间隔子是非编码序列的情况下，可在相邻序列的编码序列中提供翻译起始序列。在一些实施例中，设想编码序列的第一核酸残基可以是翻译起始序列(例如AUG)的A残基。如果间隔子编码RNA或蛋白质或肽序列，则可在间隔子序列中提供翻译起始序列。
在一些实施例中，间隔子与本文中所述的另一序列可操作地连接。
非核酸接头
本文中所述的环状多核糖核苷酸可进一步包含非核酸接头。在一些实施例中，本文中所述的环状多核糖核苷酸在本文中所述的一个或多个序列或元件之间具有非核酸接头。在一个实施例中，本文中所述的一个或多个序列或元件与接头连接。非核酸接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施例中，非核酸接头是肽接头或蛋白质接头。此种接头可介于2-30个氨基酸之间，或者更长。接头包含本文中所述的任何柔性、刚性或可切割的接头。
最常用的柔性接头具有的序列主要由Gly和Ser残基(“GS”接头)段组成。柔性接头可以有用于连接需要一定程度的移动或相互作用的结构域，并且可以包括小的、非极性的(例如Gly)或极性的(例如Ser或Thr)氨基酸。Ser或Thr的掺入还可通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，且因此减少了接头与蛋白质部分之间的不利相互作用。
刚性接头有用于保持各结构域之间的固定距离并维持其独立功能。当结构域的空间分离对于保持融合中一种或多种组分的稳定性或生物活性至关重要时，刚性接头也可以是有用的。刚性接头可具有α螺旋结构或富含脯氨酸的序列(Pro-rich sequence)、(XP)n，其中X表示任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。
可切割接头可在体内释放游离的功能性结构域。在一些实施例中，接头可以在特异性条件下(例如在还原试剂或蛋白酶的存在下)切割。体内可切割接头可利用二硫键的可逆性质。一个实例包括两个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(例如，PRS)。CPRSC的体外凝血酶处理导致凝血酶敏感性序列的切割，而可逆的二硫键保持完整。此类接头是已知的，且例如在Chen等人,2013.Fusion Protein Linkers:Property,Design and Functionality[融合蛋白接头：属性、设计和功能性].Adv Drug Deliv Rev.[先进药物输送评论]65(10):1357-1369中所描述。融合蛋白中接头的体内切割也可通过蛋白酶进行，索虎蛋白酶在病理条件下(例如癌症或炎症)在体内、在特定细胞或组织中或者在受限的某些细胞区室内表达。许多蛋白酶的特异性在受限的区室中提供了对接头的较缓慢切割。
连接分子的实例包含疏水接头，例如带负电荷的磺酸根基团；脂质，例如聚(--CH2--)烃链，例如聚乙二醇(PEG)基团、其不饱和变体、其羟基化变体、其酰胺化或其他含N的变体、非碳接头；碳水化合物接头；磷酸二酯接头，或者能够共价连接两个或更多个多肽的其他分子。也可包含非共价接头(例如多肽与之连接的疏水性脂质小球)例如通过多肽的疏水区或多肽的疏水延伸，例如富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或者也可能是丙氨酸、苯丙氨酸或甚至酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸的一系列残基或其他疏水残基。多肽可以使用基于电荷的化学连接，使得多肽的带正电荷的部分与另一种多肽或核酸的带负电荷的部分连接。
稳定性/半衰期
在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸具有比参考物，例如具有相同核苷酸序列但未被环化的线性多核糖核苷酸(线性对应物)增加的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上对例如核酸外切酶的降解有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸对自降解有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少酶促切割位点，例如，dicer切割位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期长于参考物(例如，线性对应物)至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％、至少约1000％或至少约10000％。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞分裂期间持续存在于细胞中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在有丝分裂后持续存在于子细胞中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制并传递给子细胞。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含介导环状多核糖核苷酸的自复制的复制元件。在一些实施例中，复制元件介导环状多核糖核苷酸转录成与环状多核糖核苷酸互补的线性多核糖核苷酸(线性互补)。在一些实施例中，线性互补的多核糖核苷酸可在细胞中体内环化为互补的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，互补的多核糖核苷酸可进一步自复制成另一环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸具有与起始环状多核糖核苷酸相同或类似的核苷酸序列。一种示例性自复制元件包含HDV复制结构域(如Beeharry等人,Virol[病毒学],2014,450-451:165-173所描述)。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将至少一种环状多核糖核苷酸传递给子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递给子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递给子细胞。
产生方法
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可如下所示地由如本文中所述的环状多核糖核苷酸的线性版本产生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含非天然存在的脱氧核糖核酸序列，且可使用重组技术(下文所详细描述的方法；例如，使用DNA质粒体外衍生)或化学合成产生。
在本发明的范围内，用于产生RNA环的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修饰形式、或编码通常未在自然界中发现的合成多肽的DNA序列(例如，嵌合分子或融合蛋白)。DNA和RNA分子可以使用多种技术修饰，这些多种技术包括但不限于经典诱变技术和重组技术，诸如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶切割核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物及其组合。
环状多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，所述技术包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mRNA可被环化或者连环化以产生本文中所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可通过例如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。
制成本文中所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下文献中：例如，Khudyakov和Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRCPress[CRC出版社](2002)；Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具与应用](第一版),Academic Press[学术出版社](2013)；以及Egli和Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH[威利-VCH出版社](2012)。
多种合成环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号6210931、美国专利号5773244、美国专利号5766903、美国专利号5712128、美国专利号5426180、美国公开号20100137407、国际公开号WO 1992001813和国际公开号WO2010084371；其各自的内容通过引用以其全文并入本文中)。
在一些实施例中，可在产生后清理环状多核糖核苷酸以去除产生杂质，例如游离的核糖核酸、线性或微缺RNA、DNA、蛋白质等。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可通过本领域中任何通常已知的方法来纯化。非限制性纯化方法的实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。
环化
如本文中所述的环状多核糖核苷酸可如下所示地由如本文中所述的环状多核糖核苷酸的线性版本环化。在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸可被环化或被连环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可在配制和/或递送之前被体外环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可在细胞内环化。
细胞外环化
在一些实施例中，使用化学方法来环化或连环化线性环状多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸(例如，线性环状多核糖核苷酸)的5'端和3'端包括化学反应性基团，当所述化学反应性基团彼此靠近时，可在分子的3'端与5'端之间形成新的共价键。5'端可含有NHS酯反应性基团，并且3'端可含有3'-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性RNA分子3'端上的3'-氨基末端的核苷酸将在5'-NHS-酯部分上经历亲核攻击，从而形成新的5'-/3'-酰胺键。
在一个实施例中，DNA或RNA连接酶可用于将5'-磷酸化的核酸分子(例如，线性环状多核糖核苷酸)酶促连接到核酸(例如，线性核酸)的3'-羟基，从而形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将线性环状多核糖核苷酸与1-10个单位的T4 RNA连接酶(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物学实验室公司(New England Biolabs,Ipswich,MA))在37℃下孵育1小时。连接反应可在存在线性核酸时发生，所述线性核酸能够与并列的5’和3'区两者碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一个实施例中，连接是夹板连接。例如，可使用夹板连接酶(像
Figure BDA0003866038070001231
连接酶)来进行夹板连接。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)(像单链RNA)可被设计成与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可将两个末端并列。因此，夹板连接酶可催化线性多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，生成环状多核糖核苷酸。
在一个实施例中，DNA或RNA连接酶可用于环状多核苷酸的合成。作为非限制性实例，连接酶可以是circ连接酶或环状连接酶。
在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸的5'或3'端可以编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得线性环状多核糖核苷酸包括活性核酶序列，该活性核酶序列能够连接线性环状多核糖核苷酸的5'端至线性环状多核糖核苷酸的3'端。连接酶核酶可衍生自第I组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)来进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1至24小时。
在一个实施例中，可通过使用至少一个非核酸部分将线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在一个方面，至少一个非核酸部分可与线性环状多核糖核苷酸的5'末端附近和/或3'末端附近的区或特征反应，以环化或连环化线性环状多核糖核苷酸。在另一方面，至少一个非核酸部分可位于或连接到或邻近线性环状多核糖核苷酸的5'末端和/或3'末端。所设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为非限制性实例，非核酸部分可以是键，例如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可切割的键。作为另一非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又另一非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，例如如本文中所述的适体或非核酸接头。
在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以由于非核酸部分而被环化或连环化，所述非核酸部分引起位于、邻近或连接到线性环状多核糖核苷酸的5’端和3'端的原子、分子表面之间的吸引力。作为非限制性实例，可通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包含偶极-偶极力、偶极诱导的偶极力、诱导的偶极诱导的偶极力、范德华力和伦敦色散力(Londondispersion force)。分子内作用力的非限制性实例包含共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnostic bond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。
在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸可在5'末端附近和3'末端附近包含核酶RNA序列。当序列暴露于核酶的剩余部分时，核酶RNA序列可共价地连接到肽。在一个方面，共价地连接至5'末端和3'末端附近的核酶RNA序列的肽可以彼此缔合，从而引起线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，共价地连接到核酶RNA序列5'末端和3'末端附近的肽可致使线性初级构建体或线性mRNA在使用本领域已知的方法(例如但不限于蛋白质连接)进行连接后环化或连环化。用于在本发明的线性初级构建体或线性RNA中使用的核酶的非限制性实例，或者掺入和/或共价地连接肽的方法的非穷举列表在美国专利申请号US20030082768中描述，将所述专利申请案的内容通过引用以其全文并入本文中。
在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可包括被转化为5'单磷酸的核酸的5'三磷酸，例如通过使5'三磷酸与RNA5'焦磷酸水解酶(RppH)或ATP二磷酸水解酶(脱磷酸酶)接触。替代性地，将线性环状多核糖核苷酸的5'三磷酸转化为5'单磷酸可通过两步反应发生，所述两步反应包含：(a)使线性环状多核糖核苷酸的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以去除所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单一磷酸的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。
在一些实施例中，本文中所提供的环化方法的环化效率是至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％。在一些实施例中，本文中所提供的环化方法的环化效率是至少约40％。
剪接元件
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个剪接元件。在本文中所提供的环状多核糖核苷酸中，剪接元件可以是可介导环状多核糖核苷酸的剪接的完整剪接元件。替代性地，剪接元件也可以是来自完成的剪接事件的剩余剪接元件。举例来说，在一些情况下，线性多核糖核苷酸的剪接元件可介导导致线性多核糖核苷酸环化的剪接事件，由此所得环状多核糖核苷酸包含来自此种剪接介导的环化事件的剩余剪接元件。在一些情况下，剩余剪接元件无法介导任何剪接。在其他情况下，剩余剪接元件在某些情况下仍可介导剪接。在一些实施例中，剪接元件与至少一个表达序列相邻。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与每个表达序列相邻的剪接元件。在一些实施例中，剪接元件在每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内部剪接元件，所述内部剪接元件在被复制时，剪接端部被连接在一起。一些实例包含具有剪接位点序列及短反向重复序列(30-40nt)的微型内含子(<100nt)，例如AluSq2、AluJr及AluSz、侧接内含子中的反向序列、侧接内含子中的Alu元件以及在接近反向剪接事件的(suptable4富集基序)顺式序列元件中发现的基序，例如带有侧接外显子的反向剪接位点(backsplice site)之前(上游)或之后(下游)200bp中的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个本文其他处所述的重复核苷酸序列作为内部剪接元件。在此类实施例中，重复核苷酸序列可以包括来自Alu家族内含子的重复序列。在一些实施例中，剪接相关的核糖体结合蛋白质可调节环状多核糖核苷酸的生物发生(例如盲肌蛋白和震动蛋白(QKI)剪接因子)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含侧接环状多核糖核苷酸的头尾接合点处的规范的剪接位点。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含隆起-螺旋-隆起基序，所述基序包含侧接两个3-核苷酸隆起的4-碱基对茎。切割发生在隆起区域的一个位点处，生成末端为5'-羟基和2',3'-环状磷酸酯的特征片段。通过将5'-OH基团亲核攻击到形成3',5'-磷酸二酯桥的同一分子的2',3'-环状磷酸酯上来进行环化。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含具有HPR元件的多聚重复RNA序列。HPR包含2',3'-环状磷酸酯和5'-OH末端。HPR元件自处理线性环状多核糖核苷酸的5’端和3'端，由此将端连接在一起。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含介导自连接的序列。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可包含HDV序列(例如，HDV复制结构域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC或GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC)以进行自连接。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可包含环E序列(例如，在PSTVd中)以进行自连接。在另一实施例中，环状多核糖核苷酸可包含自环化内含子，例如，5’和3'剪接接合，或者自环化催化内含子，例如I族、II族或III族内含子。I型内含子自剪接序列的非限制性实例可包含衍生自T4噬菌体基因td的自剪接置换内含子-外显子序列以及四膜虫的插入序列(IVS)rRNA。
其他环化方法
在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可包含互补序列，包括单独内含子内或跨侧接内含子的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包含聚CA序列或聚UG序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，来自两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单一环化多核糖核苷酸，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列存在于线性环状多核糖核苷酸的5'端和3'端处。在一些实施例中，互补序列包含约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个配对的核苷酸。
在一些实施例中，环化化学方法可用于产生环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半缩醛胺-亚胺交联、碱基修饰、及其任何组合。
在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，连接酶(例如，DNA或RNA连接酶)可用于生成环状多核糖核苷酸或互补体的模板、环状多核糖核苷酸的互补链、或环状多核糖核苷酸。
环状多核糖核苷酸的环化可通过本领域已知的方法来完成，所述方法为例如，Petkovic和Muller,“RNA circularization strategies in vivo and in vitro[体内外核糖核酸环化策略]”Nucleic Acids Res[核酸研究],2015,43(4):2454-2465；以及Muller和Appel,“In vitro circularization of RNA[RNA的体外环化]”RNA Biol[RNA生物学],2017,14(8):1018-1027中所述的那些方法。
环状多核糖核苷酸可编码可用于复制的序列和/或基序。示例性复制元件包括RNA聚合酶的结合位点。在WO 2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了复制元件的其他类型，所述专利特此通过引用以其全文并入。在一些实施例中，如本文中所披露的环状多核糖核苷酸缺少复制元件，例如，缺少RNA依赖性RNA聚合酶结合位点。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列和复制元件。
翻译效率
在一些实施例中，如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率大于参考物，例如，线性对应物、线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率比参考物的翻译效率高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％或更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率比线性对应物的翻译效率高10％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率比线性对应物的翻译效率高300％。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地以基本上当量的比率产生表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上当量的比率产生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如，来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。
滚环翻译
在一些实施例中，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，与环状多核糖核苷酸结合的核糖体不会从环状多核糖核苷酸脱离。在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，与环状多核糖核苷酸结合的核糖体不会从环状多核糖核苷酸脱离。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致产生多肽产物，所述多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含交错元件，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，所述多肽产物由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译产生(“离散”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间产生的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统(例如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞)中测试量比。
修饰
在一些方面，本披露提供了包含经修饰的加帽多核糖核苷酸和经修饰的环状多核糖核苷酸的组合物和方法。术语“经修饰的核苷酸”是指具有针对未经修饰的天然核糖核苷酸(如由表10中的化学式所显示，例如天然未经修饰的核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鸟嘌呤(G)、胞苷(C))和单磷酸酯的化学组成的一个或多个化学修饰的任何核苷酸类似物或衍生物。经修饰的核糖核苷酸的化学修饰可以是对核糖核苷酸的任何一个或多个官能团，例如糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。
表10.未经修饰的天然核糖核苷
Figure BDA0003866038070001301
相对于参考序列(特别是亲本多核糖核苷酸)，如本文中所述的加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸可包括本发明范围内所包括的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。相对于参考序列(特别是亲本多核糖核苷酸)，如本文中所述的环状多核糖核苷酸可包括本发明范围内所包括的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸包括一个或多个转录后修饰(例如，加帽、切割、聚腺苷酸化、剪接、聚A序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化以和硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。一个或多个转录后修饰可以是任何转录后修饰，例如已在RNA中鉴定的一百多种不同核苷修饰中的任何一种(Rozenski,J,Crain,P和McCloskey,J.(1999).The RNA ModificationDatabase:1999 update[RNA修饰数据库:1999年更新].Nucl Acids Res[核酸研究]27:196-197)。在一些实施例中，第一分离核酸包含信使RNA(mRNA)。在一些实施例中，mRNA包含选自下组的至少一种核苷，该组由以下组成：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基尿苷、1-牛磺酸基甲基假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸基甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。在一些实施例中，mRNA包含选自下组的至少一种核苷，该组由以下组成：5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假异胞苷、1-甲基-1-去氮-假异胞苷、折布拉林(zebularine)、5-氮杂-折布拉林、5-甲基-折布拉林、5-氮杂-2-硫代-折布拉林、2-硫代-折布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在一些实施例中，mRNA包含选自下组的至少一种核苷，该组由以下组成：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在一些实施例中，mRNA包含至少一种选自下组的核苷，该组由以下组成：1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-去氮-鸟苷、7-去氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-去氮-鸟苷、6-硫代-7-去氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸可包括任何有用的修饰，例如对糖、核碱基或核苷间键(例如，对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)。嘧啶核碱基的一个或多个原子可被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤代(例如，氯代或氟代)替代或取代。在某些实施例中，在每个糖和核苷间键中存在修饰(例如，一个或多个修饰)。修饰可以是对脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交体的核糖核酸(RNA)的修饰。本文中描述了额外的修饰。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸包括至少一个N(6)甲基腺苷(m6A)修饰以增加翻译效率。在一些实施例中，N(6)甲基腺苷(m6A)修饰可降低环状多核糖核苷酸的免疫原性。
在一些实施例中，修饰可包括化学或细胞诱导的修饰。例如，细胞内RNA修饰的一些非限制性实例由Lewis和Pan,“RNA modifications and structures cooperate toguide RNA-protein interactions[RNA修饰和结构协作指导RNA-蛋白质相互作用]”,NatReviews Mol Cell Biol[自然评论：分子细胞生物学],2017,18:202-210描述。
在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸的核糖核苷酸的化学修饰可增强免疫逃避。环状多核糖核苷酸可通过本领域众所周知的方法来合成和/或修饰，例如在Currentprotocols in nucleic acid chemistry[核酸化学现行方案],Beaucage,S.L等人(编辑),美国纽约州纽约约翰威利公司(John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA)(特此通过引用以其全文特此并入本文中)中描述的那些方法。修饰包括例如端部修饰，如5'端修饰(磷酸化(单、二和三磷酸化)、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)、碱基修饰(例如，用稳定的碱基、不稳定的碱基或与扩展的亲本库碱基配对的碱基替代)、碱基去除(脱碱基核苷酸)或碱基缀合。经修饰的核糖核苷酸碱基还可包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些实施例中，举几个功能性效应，碱基修饰可调节环状多核糖核苷酸的表达、免疫应答、稳定性、亚细胞定位。在一些实施例中，修饰包括双正交核苷酸，例如，非天然碱基。参见例如，Kimoto等人,Chem Commun(Camb)[化学通讯(剑桥)],2017,53:12309,DOI:10.1039/c7cc06661a，将所述文献通过引用以其全文特此并入。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的一个或多个核糖核苷酸的糖修饰(例如，在2'位置或4'位置处)或糖替代以及主链修饰可包括磷酸二酯键的修饰或替代。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的具体实例包括但不限于包括经修饰主链或非天然核苷间键(例如核苷间修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代)的加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸。具有经修饰主链的加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸尤其包含在主链中不具有磷原子的那些主链。出于本申请案的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰RNA也可被认为是寡核苷。在特定实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸将包含在其核苷间主链中具有磷原子的核糖核苷酸。
加帽环状多核糖核苷酸的经修饰多核糖核苷酸或经修饰的环状多核糖核苷酸主链可包括例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(例如3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(例如3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物以及具有相反极性的那些，其中相邻核苷单元对3'-5’至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可带负电荷或带正电荷。
可掺入加帽环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸中的经修饰的核苷酸可在核苷间键(例如，磷酸酯主链)上被修饰。在本文中，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可通过用不同取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述的另一个核苷间键进行的对未经修饰的磷酸酯部分的整体替代。经修饰磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酸硒酸酯、硼酸磷酸酯、硼酸磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。
提供a-硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链键赋予RNA和DNA聚合物稳定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增强的核酸酶抗性，并且因此在细胞环境中具有更长的半衰期。与环状多核糖核苷酸连接的硫代磷酸酯有望通过减弱细胞先天免疫分子的结合/激活来降低先天免疫应答。
在特定实施例中，经修饰核苷包括α-硫代-核苷(例如，5'-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-胞苷(α-硫代胞苷)、5'-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷)。
本文中描述了可根据本发明所采用的其他核苷间键，包括不含有磷原子的核苷间键。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸可包含一个或多个细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可被掺入环状多核糖核苷酸中，例如双功能性修饰。细胞毒性核苷可包括但不限于阿糖腺苷、5-氮杂胞苷、4'-硫代阿糖胞苷、环戊烯基胞嘧啶、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、吉西他滨、替加氟和尿嘧啶的组合、替加氟((RS)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)、曲沙他滨、替扎西他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(DMDC)和6-巯基嘌呤。其他实例包含氟达拉滨磷酸酯、N4-山嵛酰基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰基-1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055(阿糖胞苷5'-花生酸酯)。
加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸沿着分子的整个长度可被或者可不被均一地修饰。例如，一或多种类型或所有类型的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中的任一种或多种或全部)在加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸中或者在其给定预定序列区中可被均一地修饰或可以不如此。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸可包含假尿苷。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸包含肌苷，相对于病毒RNA，肌苷可帮助免疫系统将加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸表征为内源性。肌苷的掺入还可介导改善RNA稳定性/减少降解。参见例如，Yu,Z等人,(2015)RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as“self”.[通过ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自身”]Cell Res.[细胞研究]25,1283-1284，将所述文献通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸(或其给定序列区)中的所有核苷酸均被修饰。在一些实施例中，修饰可包括可增强表达的m6A；可减弱免疫应答的肌苷；可增加RNA稳定性或翻译通读(交错元件)的假尿苷；可增加稳定性的m5C；以及有助于亚细胞易位(例如，核定位)的2,2,7-三甲基鸟苷。
在环状多核糖核苷酸的各个位置上可存在不同糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键(例如，主链结构)。所属领域的技术人员将了解，核苷酸类似物或其他一个或多个修饰可位于加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的任何一个或多个位置处，使得加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修饰也可以是非编码区修饰。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸可包含从约1％至约100％经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于核苷酸的一或多种类型，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比的经修饰的核苷酸。例如，加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从1％至20％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从1％至25％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从1％至50％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从1％至60％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从1％至70％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从1％至80％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从1％至90％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从1％至95％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至20％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至25％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至50％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至60％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至70％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至80％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至90％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至95％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从10％至100％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从20％至25％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从20％至50％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从20％至60％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从20％至70％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从20％至80％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从20％至90％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从20％至95％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从20％至100％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从50％至60％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从50％至70％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从50％至80％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从50％至90％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从50％至95％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从50％至100％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从70％至80％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从70％至90％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从70％至95％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从70％至100％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从80％至90％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从80％至95％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从80％至100％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从90％至95％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从90％至100％经修饰的核苷酸。加帽多核糖核苷酸的多核糖核苷酸包含从95％至100％经修饰的核苷酸。例如，环状多核糖核苷酸包含从1％至20％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从1％至25％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从1％至50％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从1％至60％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从1％至70％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从1％至80％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从1％至90％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从1％至95％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至20％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至25％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至50％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至60％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至70％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至80％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至90％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至95％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从10％至100％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从20％至25％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从20％至50％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从20％至60％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从20％至70％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从20％至80％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从20％至90％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从20％至95％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从20％至100％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从50％至60％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从50％至70％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从50％至80％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从50％至90％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从50％至95％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从50％至100％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从70％至80％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从70％至90％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从70％至95％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从70％至100％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从80％至90％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从80％至95％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从80％至100％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从90％至95％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从90％至100％经修饰的核苷酸。环状多核糖核苷酸包含从95％至100％经修饰的核苷酸。
复合物
本发明包括产生复合物的方法，所述方法包括将如本文中所述的加帽多核糖核苷酸的第一结合区与如本文中所述的环状多核糖核苷酸的第二结合区结合，由此产生复合物。此外，本发明包括包含此复合物的组合物，其中所述组合物包含如本文中所述的加帽多核糖核苷酸和如本文中所述的环状多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合。
本发明进一步包括产生复合物的方法，所述方法包括将如本文中所述的第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与如本文中所述的环状多核糖核苷酸的第二结合区结合；并且将如本文中所述的第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合，由此产生复合物。此外，本发明包括包含复合物的组合物，其中所述组合物包含如本文中所述的第一加帽多核糖核苷酸、如本文中所述的第二加帽多核糖核苷酸和如本文中所述的环状多核糖核苷酸，其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合，并且所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合。
本发明进一步包括产生复合物的方法，所述方法包括将如本文中所述的多种加帽多核糖核苷酸的多个结合区与如本文中所述的环状多核糖核苷酸的多个结合区结合，由此产生复合物。此外，本发明包括一种包含此复合物的组合物，其中所述组合物包含如本文中所述的多个加帽多核苷酸和如本文中所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多个加帽多核苷酸的多个结合区与所述环状多核糖核苷酸的多个结合区结合。
在一些实施例中，与环状多核糖核苷酸结合的加帽多核糖核苷酸的复合物的产生在体外进行。举例来说，加帽多核糖核苷酸的第一结合区体外与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合，并然后，将复合物施用于细胞、组织或有需要的受试者。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区体外结合，并然后将复合物施用于细胞。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区体外结合，并然后，将复合物施用于组织。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区体外结合，并然后，将复合物施用于有需要的受试者。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的复合物的产生在体内进行。例如，将加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸施用于细胞、组织或有需要的受试者，然后，加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区体内结合。举例来说，第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区体外结合，并且第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区体外结合，并然后，将复合物施用于细胞、组织或有需要的受试者。在一些实施例中，第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区体外结合，并且第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区体外结合，并然后，将复合物施用于细胞。在一些实施例中，第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区体外与环状多核糖核苷酸的第二结合区体外结合，并且第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区体外结合，并然后，将复合物施用于组织。在一些实施例中，第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区体外与环状多核糖核苷酸的第二结合区体外结合，并且第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区体外结合，并然后，将复合物施用于有需要的受试者。在一些实施例中，加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的复合物的产生在体内进行。例如，将第一加帽多核糖核苷酸、第二加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸施用于细胞、组织或有需要的受试者，并然后，所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区体内结合，并且所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区体内结合。
药物组合物
在一些方面，本文中所述的本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含如本文中所述的加帽多核糖核苷酸和如本文中所述的环状多核糖核苷酸。在一些其他方面，本文中所述的本发明包含药物组合物，所述药物组合物包含含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸。在一些其他方面，本文中所述的本发明包括包含复合物的药物组合物，其中所述复合物包含如本文中所述的加帽多核糖核苷酸和如本文中所述的环状多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以形成复合物。
在一些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是非载剂赋形剂。非载剂赋形剂用作组合物(例如如本文中所述的环状多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、润滑剂、油及其混合物。非载剂赋形剂可以是经美国食品和药物管理局(FDA)批准并列在非活性成分数据库中的不表现出细胞穿透作用的任一种非活性成分。药物组合物可任选地包含一种或多种额外活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可在以下文献中找到药剂的配制和/或制造中的一般考虑：例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践]第21版,Lippincott Williams&Wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],2005(通过引用并入本文中)。
本文中所述的药物组合物可用于治疗和兽医。在一些实施例中，本文中所提供的药物组合物(例如，包含如本文中所述的环状多核糖核苷酸和加帽多核糖核苷酸)适合于施用于受试者，其中所述受试者是非人动物，例如适合于兽用。为了使组合物适合于施用于各种动物而对适合于施用于人的药物组合物的修饰是熟知的，并且普通兽医药理师可仅通过普通实验(如果有的话)来设计和/或进行此种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于任何动物，诸如人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如宠物和牲畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括与商业有关的鸟类，诸如鹦鹉、家禽、鸡、鸭、鹅、母鸡或公鸡和/或火鸡；动物园动物，例如猫科动物；非哺乳类动物，例如爬行动物、鱼类、两栖动物等。
本文中所述的药物组合物的配制品可通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。
在一些实施例中，药物组合物包含含有环状多核糖核苷酸结合部分和核糖体结合部分的分子。在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸结合部分和核糖体结合部分进行直接或间接连接或缀合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸结合部分和核糖体结合部分独立地是例如多核苷酸、多核糖核苷酸、多肽或蛋白质，例如，抗体和核糖体结合蛋白、小分子、碳水化合物或脂质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸结合部分(即例如，多核苷酸、多核糖核苷酸、多肽或蛋白质，例如抗体和核糖体结合蛋白、小分子、碳水化合物或脂质)与环状多核糖核苷酸结合。
表达方法
本发明包括用于蛋白质表达的方法，所述方法包括使用如本文中所述的加帽多核糖核苷酸来翻译如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的至少一个区。在一些实施例中，如本文中所述的加帽多核糖核苷酸通过募集核糖体来驱动环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。在一些实施例中，当加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，如本文中所述的加帽多核糖核苷酸驱动环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。在一些实施例中，当加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，如本文中所述的一种或多种加帽多核糖核苷酸驱动环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。
在一些实施例中，使用本文中所述的任何递送方法来进行环状多核糖核苷酸的施用。在一些实施例中，经由静脉内注射向受试者施用环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的施用包括但不限于产前施用、新生儿施用、产后施用、口服、通过注射(例如，静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、皮下和肌肉内)、眼科施用和鼻内施用。
在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括翻译产物的修饰、折叠或其他翻译后修饰。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括体内翻译后修饰，例如经由细胞机器。
在一些实施例中，细胞是真核细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是人细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，组织是结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织。在一些实施例中，组织是器官(例如，肝、肺、脾、肾等)。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是宠物。在一些实施例中，受试者是牲畜动物。
表达
在一些方面，本文中所述的本发明包括在细胞、组织或受试者中表达来自环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的方法，所述方法包括将如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸的第一结合区与如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以产生复合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列；并且将复合物递送至细胞；其中所述复合物影响细胞中环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的表达。与不存在加帽多核糖核苷酸时来自环状多核糖核苷酸的翻译相比，当加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，复合物可通过增加翻译来影响表达。
在一些其他方面，本文中所述的本发明包括在细胞中表达来自环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：将如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸递送至细胞；并且将如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸递送至细胞；其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合，以产生影响细胞中环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列表达的复合物。与不存在加帽多核糖核苷酸时来自环状多核糖核苷酸的翻译相比，当加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，复合物可通过增加翻译来影响表达。
在一些方面，本文中所述的本发明包括在细胞、组织或受试者中表达来自环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：将如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的第二结合区结合，并且如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合以产生复合物，其中环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列；并且将复合物递送至细胞；其中所述复合物影响细胞中环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的表达。与不存在第一加帽多核糖核苷酸时来自环状多核糖核苷酸的翻译相比，当所述第一加帽多核糖核苷酸和所述第二加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，复合物可通过增加翻译来影响表达。与不存在第二加帽多核糖核苷酸时来自环状多核糖核苷酸的翻译相比，当所述第一加帽多核糖核苷酸和所述第二加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，复合物可通过增加翻译来影响表达。与不存在第一加帽多核糖核苷酸和第二加帽多核糖核苷酸时来自环状多核糖核苷酸的翻译相比，当所述第一加帽多核糖核苷酸和第二加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，复合物可通过增加翻译来影响表达。
在一些其他方面，本文中所述的本发明包括在细胞中表达来自环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：将如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸和第二加帽多核糖核苷酸递送至细胞；并且将如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸递送至细胞；其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合，并且所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合，以产生影响细胞中环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列表达的复合物。与不存在第一加帽多核糖核苷酸时来自环状多核糖核苷酸的翻译相比，当所述第一加帽多核糖核苷酸和所述第二加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，复合物可通过增加翻译来影响表达。与不存在第二加帽多核糖核苷酸时来自环状多核糖核苷酸的翻译相比，当所述第一加帽多核糖核苷酸和所述第二加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，复合物可通过增加翻译来影响表达。与不存在第一加帽多核糖核苷酸和第二加帽多核糖核苷酸时来自环状多核糖核苷酸的翻译相比，当所述第一加帽多核糖核苷酸和第二加帽多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸结合时，复合物可通过增加翻译来影响表达。
在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸的总长度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％翻译成多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成具有至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、至少500个氨基酸、至少600个氨基酸、至少700个氨基酸、至少800个氨基酸、至少900个氨基酸或至少1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少5个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少10个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少15个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少20个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少50个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少100个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少150个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少200个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少250个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少300个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少400个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少500个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少600个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少700个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少800个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少900个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成至少1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成具有约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸、约700个氨基酸、约800个氨基酸、约900个氨基酸或约1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约5个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约10个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约15个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约20个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约50个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约100个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约150个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约200个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约250个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约300个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约400个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约500个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约600个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约700个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约800个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约900个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成约1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，这些方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成如本文中所提供的连续多肽、如本文中所提供的离散多肽或两者。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的至少一个区的翻译在体外发生，例如兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的至少一个区的翻译在体内发生，例如，在真核细胞的转染或原核细胞(例如细菌)的转化之后。
在一些方面，本披露提供了在受试者体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：将加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸施用于受试者的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列；并且在细胞中表达环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列。
增加的体外表达
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合；并且向细胞体外施用复合物，其中细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸的组合物)的表达。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体外施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核糖核苷酸)的表达。
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)及如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)；并且向细胞体外施用复合物，其中细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸的组合物)的表达。在一些方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)及如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)；并且向细胞体外施用复合物，其中细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于来自与第一加帽多核糖核苷酸结合的环状多核糖核苷酸的表达。在一些方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)及如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)；并且及将复合物体外施用于细胞，其中细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于来自与第二加帽多核糖核苷酸结合的环状多核糖核苷酸的表达。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体外施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)以及向细胞施用如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与所述环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核糖核苷酸)的表达。在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体外施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)以及向细胞施用如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于来自与第一加帽多核糖核苷酸结合的环状多核糖核苷酸的表达。在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体外施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)以及向细胞施用如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于来自与第二加帽多核糖核苷酸结合的环状多核糖核苷酸的表达。
在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核苷酸(例如，缺少加帽多核糖核苷酸)的表达高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核苷酸(例如，缺少加帽多核糖核苷酸)的表达高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、50000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10000倍。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体外施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核糖核苷酸)的表达。
在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更高。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少95倍。
在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、50000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高50000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10000倍。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体外施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸的表达相比有所增加。
在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、50000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了50000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10000倍。
增加的体内表达
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合；并且向细胞体内施用复合物，其中细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体内施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达。
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)及如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)；并且向细胞体内施用复合物，其中细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达。在一些方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)及如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)；并且向细胞体内施用复合物，其中细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于来自与第一加帽多核糖核苷酸结合的环状多核糖核苷酸的表达。在一些方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)及如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)；并且向细胞体内施用复合物，其中细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于来自与第二加帽多核糖核苷酸结合的环状多核糖核苷酸的表达。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体内施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)以及向细胞施用如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核糖核苷酸)的表达。在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体内施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)以及向细胞施用如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于来自与第一加帽多核糖核苷酸结合的环状多核糖核苷酸的表达。在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体内施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸、如本文中所提供的第一加帽多核糖核苷酸(其中所述第一加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合)以及向细胞施用如本文中所提供的第二加帽多核糖核苷酸(其中所述第二加帽多核糖核苷酸的第三结合区与环状多核糖核苷酸的第四结合区结合)以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于来自与第二加帽多核糖核苷酸结合的环状多核糖核苷酸的表达。
在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸的表达高至少10000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10000倍。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体内施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达高于单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达。
在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高至少10000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达高10000倍。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向细胞体内施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以在细胞中形成复合物，并且细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比有所增加。在一些实施例中，所增加的表达导致更高的总体蛋白质产量。
在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了至少10000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的表达相比增加了10000倍。
在一些实施例中，细胞中来自复合物的增加的表达导致蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比有所增加。在一些实施例中，来自复合物的在细胞中的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、5000％、10000％或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了10％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了20％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了30％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了40％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了50％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了60％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了70％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了80％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了90％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了100％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了200％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了300％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了400％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了500％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了600％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了700％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了800％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了900％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了1000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了5000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了10000％。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了至少10000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000倍或更多。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了2倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了3倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了4倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了5倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了6倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了7倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了8倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了9倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了10倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了15倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了20倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了25倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了30倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了35倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了40倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了45倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了50倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了55倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了60倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了65倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了70倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了75倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了80倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了85倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了90倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了95倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了100倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了200倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了300倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了400倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了500倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了600倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了700倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了800倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了900倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了1000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了5000倍。在一些实施例中，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比增加了10000倍。在一些实施例中，在施用后的一段时间间隔内，细胞中来自复合物的蛋白质产量与单独来自环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的蛋白质产量相比有所增加。施用后的时间间隔可以是至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或更长。施用后的时间间隔可以是至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更长。施用后的时间间隔可以是至少1小时。施用后的时间间隔可以是至少2小时。施用后的时间间隔可以是至少3小时。施用后的时间间隔可以是至少4小时。施用后的时间间隔可以是至少5小时。施用后的时间间隔可以是至少6小时。施用后的时间间隔可以是至少7小时。施用后的时间间隔可以是至少8小时。施用后的时间间隔可以是至少9小时。施用后的时间间隔可以是至少10小时。施用后的时间间隔可以是至少11小时。施用后的时间间隔可以是至少12小时。施用后的时间间隔可以是至少13小时。施用后的时间间隔可以是至少14小时。施用后的时间间隔可以是至少15小时。施用后的时间间隔可以是至少16小时。施用后的时间间隔可以是至少17小时。施用后的时间间隔可以是至少18小时。施用后的时间间隔可以是至少19小时。施用后的时间间隔可以是至少20小时。施用后的时间间隔可以是至少21小时。施用后的时间间隔可以是至少22小时。施用后的时间间隔可以是至少23小时或更长。施用后的时间间隔可以是至少1天。施用后的时间间隔可以是至少2天。施用后的时间间隔可以是至少3天。施用后的时间间隔可以是至少4天。施用后的时间间隔可以是至少5天。施用后的时间间隔可以是至少6天。施用后的时间间隔可以是至少7天。施用后的时间间隔可以是至少8天。施用后的时间间隔可以是至少9天。施用后的时间间隔可以是至少10天。施用后的时间间隔可以是至少11天。施用后的时间间隔可以是至少12天。施用后的时间间隔可以是至少13天。施用后的时间间隔可以是至少14天。施用后的时间间隔可以是至少15天。施用后的时间间隔可以是至少16天。施用后的时间间隔可以是至少17天。施用后的时间间隔可以是至少18天。施用后的时间间隔可以是至少19天。施用后的时间间隔可以是至少20天。施用后的时间间隔可以是至少21天。施用后的时间间隔可以是至少22天。施用后的时间间隔可以是至少23天。施用后的时间间隔可以是至少24天。施用后的时间间隔可以是至少25天。施用后的时间间隔可以是至少26天。施用后的时间间隔可以是至少27天。施用后的时间间隔可以是至少28天。施用后的时间间隔可以是至少29天。施用后的时间间隔可以是至少30天。
延长的表达
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含：如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合；并且向受试者的细胞施用复合物，其中受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后更长。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：将如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸施用于受试者，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以在受试者中形成复合物，并且受试者的细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独施用环状多核糖核苷酸的线性对应物(例如，缺少加帽多核苷酸)之后更长。
在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或更长。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少1小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少2小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少3小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少4小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少5小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少6小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少7小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少8小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少9小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少10小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少11小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少12小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少13小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少14小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少15小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少16小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少17小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少18小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少19小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少20小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少21小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少22小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少23小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或更长。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长1小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长2小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长3小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长4小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长5小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长6小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长7小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长8小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长9小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长10小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长11小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长12小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长13小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长14小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长15小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长16小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长17小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长18小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长19小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长20小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长21小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长22小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长23小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更多。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少1天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少2天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少3天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少4天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少5天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少6天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少7天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少8天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少9天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少10天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少11天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少12天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少13天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少14天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少15天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少16天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少17天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少18天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少19天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少20天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少21天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少22天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少23天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少24天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少25天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少26天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少27天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少28天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少29天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长至少30天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更多天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长1天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长2天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长3天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长4天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长5天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长6天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长7天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长8天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长9天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长10天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长11天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长12天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长13天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长14天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长15天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长16天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长17天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长18天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长19天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长20天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长21天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长22天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长23天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长24天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长25天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长26天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长27天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长28天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长29天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长30天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或更多个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少1个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少2个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少3个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少4个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少5个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少6个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少7个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少8个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少9个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少10个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少11个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少12个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少13个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少14个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少15个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少16个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少17个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少18个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少19个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少20个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少21个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少22个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少23个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少24个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或更多个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长1个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长2个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长3个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长4个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长5个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长6个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长7个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长8个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长9个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长10个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长11个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长12个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长13个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长14个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长15个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长16个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长17个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长18个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长19个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长20个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长21个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长22个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长23个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)的线性对应物之后长24个月。
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：提供了复合物，所述复合物包含：如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合；并且向受试者施用复合物，其中受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：向受试者施用如本文中所提供的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸和如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸，其中所述加帽多核糖核苷酸的第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区结合以在受试者中形成复合物，并且受试者的细胞中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长。
在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或更多个小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少1小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少2小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少3小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少4小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少5小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少6小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少7小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少8小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少9小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少10小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少11小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少12小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少13小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少14小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少15小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少16小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少17小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少18小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少19小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少20小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少21小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少22小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少23小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或更多个小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长1小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长2小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长3小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长4小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长5小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长6小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长7小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长8小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长9小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长10小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长11小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长12小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长13小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长14小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长15小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长16小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长17小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长18小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长19小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长20小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长21小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长22小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长23小时。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更多天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少1天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少2天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少3天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少4天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少5天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少6天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少7天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少8天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少9天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少10天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少11天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少12天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少13天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少14天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少15天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少16天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少17天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少18天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少19天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少20天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少21天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少22天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少23天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少24天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少25天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少26天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少27天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少28天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少29天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少30天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或更多天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长1天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长2天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长3天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长4天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长5天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长6天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长7天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长8天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长9天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长10天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长11天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长12天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长13天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长14天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长15天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长16天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长17天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长18天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长19天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长20天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长21天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长22天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长23天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长24天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长25天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长26天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长27天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长28天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长29天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长30天。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或更多个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少1个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少2个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少3个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少4个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少5个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少6个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少7个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少8个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少9个月、10个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少11个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少12个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少13个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少14个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少15个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少16个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少17个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少18个月、19个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少20个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少21个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少22个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少23个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长至少24个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或更多个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长1个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长2个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长3个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长4个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长5个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长6个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长7个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长8个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长9个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长10个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长11个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长12个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长13个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长14个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长15个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长16个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长17个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长18个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长19个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长20个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长21个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长22个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长23个月。在一些实施例中，受试者中来自复合物的一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸(例如，缺少加帽多核苷酸)之后长24个月。
治疗方法
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸和如本文中所提供的环状多核糖核苷酸，其中所述施用对治疗受试者有效。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用与如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的加帽多核糖核苷酸，其中所述施用对治疗受试者有效。
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括如本文中所述的药物组合物，所述药物组合物用于在通过疗法治疗人体或动物体的方法中使用。
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括如本文中所公开的复合物，所述复合物用作药剂或药物。
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括如本文中所公开的复合物，所述复合物用于在通过疗法治疗人体或动物体的方法中使用。
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括如本文中所公开的复合物或如本文中所公开的多核糖核苷酸及如本文中所公开的环状多核糖核苷酸在制造药剂或药物中的用途。
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括如本文中所公开的复合物或如本文中所公开的多核糖核苷酸以及如本文中所公开的环状多核糖核苷酸在制造用于通过疗法治疗人体或动物体的药剂或药物中的用途。
在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是宠物。在一些实施例中，受试者是宠物牲畜动物。
在一些实施例中，所述方法包括施用包括如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括施用包含含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括施用包含加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的复合物的药物组合物，其中通过将如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸的第一结合区与如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的第二结合区结合来产生所述复合物。
在一些实施例中，所述方法包括施用包含加帽多核糖核苷酸的第一药物组合物以及包含如本文中所提供的环状多核糖核苷酸的第二药物组合物。在一些实施例中，所述方法包括施用包含含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸的第一药物组合物以及含有环状多核糖核苷酸的第二药物组合物。在一些实施例中，将包含加帽多核糖核苷酸的第一药物组合物和包含环状多核糖核苷酸的第二药物组合物同时、分别或连续地施用于有需要的受试者。在一些实施例中，将包含含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸的第一药物组合物和含有环状多核糖核苷酸的第二药物组合物同时、分别或连续地施用于有需要的受试者。
在一些实施例中，所述方法进一步包括将与如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸和如本文中所提供的环状多核糖核苷酸组合的第二或额外治疗剂或疗法施用于有需要的受试者。在一些实施例中，所述方法进一步包括将与如本文中所提供的环状多核糖核苷酸结合的加帽多核糖核苷酸组合的第二或额外治疗剂或疗法施用于有需要的受试者。
本文中所使用的术语“治疗(treat,treating和treatment)”等一般意指获得所期望的药理学和/或生理学效果。就预防或部分预防疾病、其症状或病症来说，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病、病症、归因于所述疾病的症状或副作用来说，所述效果可以是治疗性的。如本文所用，术语“治疗”涵盖哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止在可能易患疾病但尚未被诊断为患有所述疾病的受试者中发生所述疾病；(b)抑制疾病，即阻止其发育；或(c)缓解疾病，即减轻或改善所述疾病和/或其症状或病症。本文中所使用的术语“预防”是指为预防或部分预防疾病或病症而采取的一或多种措施。
藉由“治疗或预防疾病或病症”是指在障碍发生之前或之后改善与障碍相关联的任何病症或体征或症状。如与等效的未经治疗的控制相比，如通过任何标准技术来测量，此种减少或预防程度为至少3％、5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％。因疾病或病症正在接受治疗的患者是指被执业医师诊断为患有此种疾病或病症的患者。可通过任何适合方法来进行诊断。被阻止发育为疾病或病症的患者可能接受过或者也可能没有接受过此种诊断。所属领域的技术人员将理解，这些患者可能已接受如上文所述的相同标准测试，或者可能已在没有检查的情况下被鉴定为由于一或多种风险因素(例如，家族史或遗传易感性)的存在而处于高风险中。
所述病症或疾病的实例包括但不限于增殖性疾病、代谢性疾病或障碍、心血管疾病或障碍、感染性疾病、神经学或神经变性疾病或障碍以及炎性疾病或障碍。
举例来说，增殖性疾病的实例包括但不限于恶性、恶性前期或良性癌症。使用所披露的方法来治疗的癌症包括例如实体瘤、淋巴瘤或白血病。在一个实施例中，癌症可以是例如脑肿瘤(例如，恶性、恶性前期或良性脑肿瘤，例如像成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤或外周神经外胚层肿瘤)、癌(例如，胆囊癌、支气管癌、基底细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、腺瘤、囊腺瘤等)、基底细胞瘤、畸胎瘤、成视网膜细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、肉瘤(例如，尤文氏肉瘤、横纹肌肉瘤、颅咽瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、阿斯金氏瘤、淋巴肉瘤、神经肉瘤、卡波西氏肉瘤、皮肤纤维肉瘤、血管肉瘤等)、浆细胞瘤、头颈部肿瘤(例如，口腔、喉、鼻咽、食管等)、肝脏肿瘤、肾脏肿瘤、肾细胞肿瘤、鳞状细胞癌、子宫肿瘤、骨肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤(包括但不限于是Her2-和/或ER-和/或PR-的乳腺肿瘤)、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、子宫内膜肿瘤、鳞状细胞癌、胃肿瘤、神经胶质瘤、结肠直肠肿瘤、睾丸肿瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、卵巢肿瘤、子宫颈肿瘤、眼肿瘤、中枢神经系统肿瘤(例如，原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤等)、甲状腺肿瘤、肺肿瘤(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌)、白血病或淋巴瘤(例如，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、非皮肤外周T细胞淋巴瘤、与人T细胞淋巴瘤相关联的淋巴瘤(HTLV)(例如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、B细胞淋巴瘤、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤)、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴白血病(CLL)、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、成人T细胞白血病淋巴瘤、急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)或肝细胞性肝癌等)、多发性骨髓瘤、皮肤肿瘤(例如，基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤(例如恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤或眼内黑色素瘤)、隆突性皮肤纤维肉瘤、默克尔细胞癌或卡波西肉瘤等)、妇科肿瘤(例如,子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌等)、何杰金氏病、小肠癌、内分泌系统癌(例如，甲状腺、甲状旁腺或肾上腺癌等)、间皮瘤、尿道癌、阴茎癌、与戈林综合征相关的肿瘤(例如，髓母细胞瘤、脑膜瘤等)、来源不明的肿瘤；或其他任何转移。在一些实施例中，癌症是肺肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、结肠直肠肿瘤、头颈部肿瘤、肝脏肿瘤、前列腺肿瘤、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、卵巢肿瘤或甲状腺肿瘤；或其他任何转移。在一些其他实施例中，癌症是子宫内膜肿瘤、膀胱肿瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肾肿瘤、肉瘤、宫颈肿瘤、白血病和神经母细胞瘤。
对于另一例子，代谢性疾病或障碍的实例包括但不限于糖尿病、代谢综合征、肥胖、高脂血症、高胆固醇、动脉硬化、高血压、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病、肝脂肪变性及其任何组合。
例如，炎性障碍或障碍部分或全部由肥胖、代谢综合征、免疫疾病、肿瘤、感染性疾病、化学试剂、炎性肠病、再灌注损伤、坏死或其组合引起。在一些实施例中，炎性障碍是自身免疫性障碍、变态反应、白细胞缺陷、移植物抗宿主病、组织移植排斥或其组合。在一些实施例中，炎性障碍是细菌感染、原生动物感染、原生动物感染、病毒感染、真菌感染或其组合。在一些实施例中，炎性障碍是急性播散性脑脊髓炎；阿狄森氏病(Addison's disease)；强直性脊柱炎；抗磷脂抗体综合征；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳疾病；大疱性类天疱疮；查加斯病；慢性阻塞性肺疾病；腹腔疾病；皮肌炎；1型糖尿病；2型糖尿病；子宫内膜异位；古德帕斯彻综合征(Goodpasture's syndrome)；格雷夫氏病；格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)；桥本氏病(Hashimoto's disease)；特发性血小板减少性紫癜；间质性膀胱炎；系统性红斑狼疮(SLE)；代谢综合征、多发性硬化症；重症肌无力；心肌炎、发作性睡病；肥胖；寻常型天疱疮；恶性贫血；多发性肌炎；原发性胆汁性肝硬化；类风湿关节炎；精神分裂症；硬皮病；干燥综合征；血管炎；白癜风；韦格纳肉芽肿病；过敏性鼻炎；前列腺癌；非小细胞肺癌；卵巢癌；乳腺癌；黑素瘤；胃癌；结直肠癌；脑癌；转移性骨障碍；胰腺癌；淋巴瘤；鼻息肉；胃肠癌；溃疡性结肠炎；克罗恩障碍；胶原性结肠炎；淋巴细胞性结肠炎；缺血性结肠炎；分流性结肠炎；贝氏综合征
Figure BDA0003866038070002421
感染性结肠炎；不确定性结肠炎；炎性肝病、内毒素休克、类风湿性脊椎炎、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、风湿性多肌痛、阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、癫痫、艾滋病性痴呆、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、支气管炎、囊性纤维化、急性白细胞介导的肺损伤、远端直肠炎、韦格纳肉芽肿病、纤维肌痛、支气管炎、囊性纤维化、葡萄膜炎、结膜炎、银屑病、湿疹、皮炎、平滑肌增殖障碍、脑膜炎、带状疱疹、脑炎、肾炎、结核病、视网膜炎、特应性皮炎、胰腺炎、牙周牙龈炎、凝固性坏死、液化性坏死、纤维蛋白样坏死、超急性移植排斥反应、急性移植排斥反应、慢性移植排斥、急性移植物抗宿主病、慢性移植物抗宿主病、腹主动脉瘤(AAA)；或其组合。
对于另一例子，神经学或神经变性疾病或障碍的实例包括但不限于阿尔斯科综合征(Aarskog syndrome)、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症(卢氏格赫里希病(LouGehrig's disease))、失语症、贝尔麻痹、克雅氏病、脑血管疾病、科妮莉亚德朗格综合征(Cornelia de Lange syndrome)、癫痫和其他严重癫痫障碍、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、脆性X染色体综合征、伊藤黑变病、朱伯特综合症(Joubert syndrome)、肯尼迪病、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph's disease)、偏头痛、莫比斯综合征(Moebiussyndrome)、肌强直性营养不良、神经肌肉疾病、格林-巴尔(Guillain-Barre)、肌肉萎缩症、神经肿瘤障碍、神经纤维瘤病、神经免疫障碍、多发性硬化、疼痛、儿科神经病学、自闭症、阅读障碍、神经耳科疾病、梅尼埃病、帕金森病和运动障碍、苯丙酮尿症、鲁宾斯坦-泰比综合征(Rubinstein-Taybi syndrome)、睡眠障碍、脊髓小脑性共济失调I型、史密斯-莱姆利-奥皮茨综合征(Smith-Lemli-Opitz syndrome)、索托斯综合征(Sotos syndrome)、脊髓延髓萎缩、1型显性小脑共济失调、图雷特综合征(Tourette syndrome)、结节性硬化症和威廉氏综合征。
递送
如本文中所述的药物组合物可配制为例如包含药物赋形剂或载剂。本文中所述的药物组合物可与递送载剂一起包含于药物组合物中。在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物可包含于不含任何载剂的药物组合物中。在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物可包含于包含肠胃外可接受的稀释剂的药物组合物中。如本文中所披露的方法包括体内递送如本文中所披露的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或者如本文中所披露的药物组合物的方法，所述方法包括将如本文中所披露的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或者如本文中所披露的药物组合物肠胃外施用于受试者的细胞或组织，或者施用于受试者。
可将如本文中所述的药物组合物配制为例如包含药物赋形剂或载剂。药物载剂可以是膜、脂质双层和/或聚合物载剂，例如脂质体，例如纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒，并且通过已知方法例如经由部分或完全包封环状多核糖核苷酸递送至有需要的受试者(例如，人或非人农业或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。此类方法包括但不限于转染(例如，脂质介导的阳离子聚合物、磷酸钙、树状聚合物)；病毒递送(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV病毒)、fugene、原生质体融合、外来体介导的转移、脂质纳米颗粒介导的转移及其任何组合。Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo[阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内实现高效的基于蛋白质的基因组编辑].Nat Biotechnol[自然生物技术].2014年10月30日；33(1):73-80。递送方法也描述于例如Gori等人,Delivery and Specificity ofCRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy[用于人类基因疗法的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的递送和特异性].Human Gene Therapy[人类基因疗法疗].2015年7月26日(7)：443-451.doi：10.1089/hum.2015.074；和Zuris等人。
额外的递送方法包括电穿孔(例如，使用流动电穿孔装置)或其他膜破裂方法(例如，核转染)、微注射、微注射轰击(“基因枪”)、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、穿刺、磁转染及其任何组合。例如，流动电穿孔装置包括用于容纳待穿孔的细胞(诸如如本文所述的细胞(例如，分离的细胞))悬浮液的腔室，所述腔室至少部分由可反向充电的电极限定，其中所述腔室的热阻小于大约110℃/瓦。
在一些实施例中，本文中所披露的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或药物组合物可作为裸递送配制品递送。裸递送配制品将环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或药物组合物递送至细胞，而无需借助于载剂并且无需对环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物进行修饰或部分或完全包封。
裸递送配制品是不含载剂的配制品，并且其中环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，或者没有对环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物进行部分或完全包封。在一些实施例中，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物可以是未与蛋白质、小分子、颗粒、聚合物或生物聚合物共价结合的多核糖核苷酸。没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物可能不含有经修饰磷酸基团。例如，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物可能不含有硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些实施例中，裸递送配制品可以不含以下中的任一种或全部：转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。例如，裸递送配制品可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐修饰的植物糖原β-糊精、lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸酯(DOSPA)、3B-[N—(N\N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HCl)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、或球蛋白。
裸递送配制品可包含非载剂赋形剂。在一些实施例中，非载剂赋形剂可包含不表现出细胞穿透效果的非活性成分。在一些实施例中，非载剂赋形剂可包括缓冲液，例如PBS。在一些实施例中，非载剂赋形剂可以是溶剂、非水性溶剂、稀释剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂或油。
在一些实施例中，裸递送配制品可包含稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂可以是RNA增溶剂、缓冲液或等渗剂。RNA增溶剂的实例包含水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺和2-丙醇。缓冲液的实例包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、2-[(2-氨基-2-氧乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙烷磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、或蔗糖。
本发明进一步涉及宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞包含如本文所述的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物。在一些实施例中，是脊椎动物、哺乳动物(例如，人)或其他生物体或细胞。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物在宿主中是非免疫原性的。在一些实施例中，与由参考化合物(例如，对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸、未经修饰的环状多核糖核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物降低或不能产生宿主免疫系统应答。一些免疫应答包括但不限于体液免疫应答(例如，抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如，淋巴细胞增殖)。
在一些实施例中，使宿主或宿主细胞接触(例如，递送或施用)环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，例如人。可以在施用之后的任何时间测量宿主中环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物、表达产物或两者的量。在某些实施例中，测定培养物中宿主生长的时程。如果在环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或者表达产物或两者存在时生长增加或减少，则其被鉴定为在增加或减少宿主的生长方面是有效的。
递送方法
将如本文中所述的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或者如本文所述的其药物组合物递送至细胞、组织或受试者的方法包括将如本文中所述的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或者药物组合物施用于细胞、组织或受试者。
在一些实施例中，递送方法是体内方法。例如，递送环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物的方法包括向有需要的受试者进行肠胃外施用。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的量有效地对受试者的细胞或组织具有生物学作用。在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物包含载剂。在一些实施例中，如本文中所述的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物包含稀释剂且不含任何载剂。在一些实施例中，肠胃外施用是静脉内施用。在一些实施例中，肠胃外施用是肌内施用。在一些实施例中，肠胃外施用是眼部施用。在一些实施例中，肠胃外施用是局部施用。
在一些实施例中，口服施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，经鼻施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，通过吸入施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，局部施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，眼部施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，直肠施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，通过注射来施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。施用可以是全身施用。施用可以是局部施用。在一些实施例中，肠胃外施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，静脉内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，动脉内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，腹腔内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，皮内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，颅内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，鞘内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，淋巴内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，皮下施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，肌内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，经由眼内施用来施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，经由耳蜗内(内耳)施用来施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，经由气管内施用来施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂进行如本文中所述的任何递送方法。在一些实施例中，用载剂来静脉内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来动脉内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来腹腔内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂皮内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来颅内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来鞘内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来淋巴内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来皮下施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来肌内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂经由眼内施用来施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来耳蜗内(内耳)施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，用载剂来气管内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施方案中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下进行如本文中所述的任何递送方法。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下静脉内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下动脉内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下腹腔内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下皮内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下颅内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下鞘内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下淋巴内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下皮下施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下肌内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下经由眼内施用来施用环状多核糖核苷酸分子、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下耳蜗内(内耳)施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一些实施例中，在不借助裸递送配制品中的载剂的情况下气管内施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。
在一些实施例中，细胞是真核细胞。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞是人细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，组织是结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织。在一些实施例中，组织是器官(例如，肝、肺、脾、肾等)。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是宠物。在一些实施例中，受试者是牲畜动物。
基于细胞和囊泡的载剂
可以将如本文中所述的环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或如本文中所述的其药物组合物施用于囊泡或其他基于膜的载剂中的细胞。
在实施例中，在细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂施用环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。在一个实施例中，可在脂质体或其他类似囊泡中配制环状多核糖核苷酸、加帽多核糖核苷酸或其复合物或其药物组合物。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并将其装载运输穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(关于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体作为药物载剂。用于制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，所述文献关于多层囊泡脂质制备的教导内容通过引用并入本文)。尽管当脂质膜与水性溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡形式施加力来加快囊泡形成(对于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of DrugDelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,Nature Biotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，所述文献关于挤出脂质制备的教导内容通过引用并入本文。
脂质纳米颗粒是为如本文中所述的环状多核糖核苷酸分子或其药物组合物提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一个实例。纳米结构化的脂质载剂(NLC)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(SLN)，所述经修饰的固体脂质纳米颗粒保留了SLN的特征，改善了药物稳定性和负载能力并且防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(PNP)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送引导至特定靶标并且改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(PLN)，即一种组合了脂质体和聚合物的新型载剂。这些纳米颗粒具有PNP和脂质体的互补优势。PLN由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，并且磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分增加了药物包封效率，促进了表面修饰并且防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见例如，Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。
载剂的额外非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、蛋白质载剂(例如，共价连接到环状多核糖核苷酸的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。碳水化合物载剂的非限制性实例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精和酸酐修饰的植物糖原β-糊精。阳离子载剂的非限制性实例包括lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸酯(DOSPA)、3B-[N—(N\N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HCl)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、和N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)。蛋白质载剂的非限制性实例包含人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。
外来体也可用作本文所述的环状多核糖核苷酸分子或其药物组合物的药物递送媒介物。对于综述，参见Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B.[药学学报]第6卷第4期,第287-296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
离体分化的红细胞也可用作本文中所述的环状多核糖核苷酸分子或其药物组合物的载剂。参见例如，WO 2015073587；WO 2017123646；WO 2017123644；WO 2018102740；wO2016183482；WO 2015153102；WO 2018151829；WO 2018009838；Shi等人2014.Proc NatlAcad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136；美国专利9,644,180；Huang等人2017.Nature Communications[自然通讯]8:423；Shi等人2014.Proc Natl Acad SciUSA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136中所描述。
例如，如WO 2018208728中所述的融合体组合物也可用作载剂来递送本文中所述的环状多核糖核苷酸分子或其药物组合物。
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作载剂以将本文中所述的环状多核糖核苷酸分子或其药物组合物递送至靶向的细胞。
例如国际专利公开号WO 2011097480、WO 2013070324、WO 2017004526或WO2020041784中所述的植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可用作载剂以递送如本文中所述的环状RNA。
微泡也可用作载剂来递送本文中所述的环状多核糖核苷酸分子。微泡也可用作载剂来递送本文中所述的线性多核糖核苷酸。参见，例如，US 7115583；Beeri,R.等人，Circulation.[循环]2002年10月1日；106(14):1756-1759；Bez,M.等人，Nat Protoc.[自然实验手册]2019年4月；14(4):1015-1026；Hernot,S.等人，Adv Drug Deliv Rev.[高级药物递送综述]2008年6月30日；60(10):1153-1166；Rychak,J.J.等人，Adv Drug Deliv Rev.[高级药物递送综述]2014年6月；72:82-93。在一些实施例中，微泡是白蛋白包被的全氟化碳微泡。
丝心蛋白也可用作载剂来递送本文中所述的环状多核糖核苷酸分子。参见，例如Boopathy,A.V.等人，PNAS.[美国国家科学院院刊]116.33(2019):16473-1678；和He,H.等人.,ACS Biomater.Sci.Eng.[ACS生物材料科学与工程]4.5(2018):1708-1715。
试剂盒
在一些方面，如本文中所提供的本发明包括试剂盒，所述试剂盒包括如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸、如本文中所提供的环状多核糖核苷酸以及用于将所述加帽多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸施用于细胞的说明书。
在一些其他方面，如本文中所提供的本发明包括试剂盒，所述试剂盒包括复合物和用于将所述复合物施用于细胞的说明书，所述复合物包含与如本文中所提供的环状多核糖核苷酸结合的如本文中所提供的加帽多核糖核苷酸。
编号实施例
[1]一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a.含有经5’修饰的鸟苷帽的多核糖核苷酸；和
b.环状多核糖核苷酸。
[2]根据编号实施例1所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
[3]根据编号实施例[1]-[2]中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸包含第一结合区。
[4]根据编号实施例[1]-[3]中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含第二结合区。
[5]根据编号实施例[1]-[4]中任一项所述的药物组合物，其中所述第一结合区与所述第二结合区特异性地结合。
[6]一种多核糖核苷酸，其包含经5’修饰的鸟苷帽和第一结合区，其中所述第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区特异性地结合。
[7]一种包含第二结合区的环状多核糖核苷酸，其中所述第二结合区与多核糖核苷酸的第一结合区特异性地结合，并且其中所述多核糖核苷酸包含经5’修饰的鸟苷帽。
[8]一种组合物，所述组合物其包含：
a.含有经5’修饰的鸟苷帽结构和第一结合区的多核糖核苷酸；
b.和
c.含有第二结合区的环状多核糖核苷酸；
d.其中所述第一结合区与所述第二结合区结合。
[9]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中当包含所述经5’修饰的鸟苷帽的所述多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时，所述多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。
[10]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸通过间接结合与所述环状多核糖核苷酸结合。
[11]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸通过直接结合与所述环状多核糖核苷酸结合。
[12]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸通过共价结合与所述环状多核糖核苷酸结合。
[13]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸通过非共价结合与所述环状多核糖核苷酸结合。
[14]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述第一结合区与所述第二结合区互补。
[15]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸募集核糖体。
[16]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸的所述经5’修饰的鸟苷帽募集核糖体。
[17]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含表达序列。
[18]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中包含所述经5’修饰的鸟苷帽的所述多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中所述表达序列的表达。
[19]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸进一步包含UTR。
[20]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸包含5’UTR。
[21]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸包含3’UTR。
[22]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸包含聚A区。
[23]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述第一结合区是UTR的3’的结合区。
[24]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述第一结合区包含5至100个核苷酸的长度。
[25]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述经5’修饰的鸟苷帽是7-甲基鸟苷帽。
[26]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述经5’修饰的鸟苷帽是抗反向帽类似物。
[27]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸包含一个或多个所述经5’修饰的鸟苷帽。
[28]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸是线性的。
[29]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述多核糖核苷酸包含5至1100个核苷酸的长度。
[30]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸是未经修饰的环状多核糖核苷酸。
[31]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含UTR。
[32]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含聚A区。
[33]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含IRES。
[34]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸缺少IRES。
[35]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述第二结合区包含5至100个核苷酸的长度。
[36]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含终止密码子。
[37]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含位于所述终止密码子与起始密码子之间的非翻译区中的第二结合区。
[38]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含加密原、调节元件、复制元件或准双链二级结构。
[39]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含交错元件。
[40]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述终止密码子位于所述第二结合区与所述交错元件之间。
[41]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含蛋白质翻译起始位点。
[42]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述蛋白质翻译起始位点包含科扎克序列。
[43]根据前述编号实施例中任一项所述的药物组合物、多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含50至20000个核苷酸的长度。
[44]一种产生复合物的方法，所述方法包括：
将根据编号实施例[6]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸的所述第一结合区与根据编号实施例[7]-[43]中任一项所述的环状多核糖核苷酸的所述第二结合区结合，由此产生所述复合物。
[45]一种递送方法，所述方法包括
将编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸递送至细胞、组织或受试者，
将编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞、组织或受试者。
[46]一种递送方法，所述方法包括
提供复合物，其中将根据编号实施例6或9-43中任一项所述的多核糖核苷酸的所述第一结合区与根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的环状多核糖核苷酸的所述第二结合区结合，以产生所述复合物，并且
将所述复合物递送至细胞、组织或受试者。
[47]一种在细胞中表达来自环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的方法，所述方法包括
将根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸的所述第一结合区与根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的环状多核糖核苷酸的所述第二结合区结合，以产生复合物，
a.其中所述环状多核糖核苷酸包含所述一个或多个表达序列；
并且
将所述复合物递送至所述细胞；
其中所述复合物影响所述细胞中所述一个或多个表达序列的表达。
[48]一种在细胞中表达来自环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列的方法，所述方法包括
将编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸递送至所述细胞；并且
将根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸递送至所述细胞；
其中所述第一结合区与所述第二结合区结合，以产生影响所述细胞中所述一个或多个表达序列表达的复合物。
[49]一种体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
提供了复合物，所述复合物包含：
根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的所述环状多核糖核苷酸，以及根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸，
a.其中所述第一结合区与所述第二结合区结合；
并且
向细胞体外施用所述复合物，
其中细胞中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达比单独来自所述环状多核糖核苷酸的表达高。
[50]一种体外表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
向细胞体外施用：
向细胞施用根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸以及根据编号实施例6或9-43中任一项所述的多核糖核苷酸，
其中所述第一结合区与所述第二结合区结合以在所述细胞中形成复合物，并且所述细胞中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达比单独来自所述环状多核糖核苷酸的表达高。
[51]一种体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
提供了复合物，所述复合物包含：
a.根据编号实施例[7]或[9]-[4]3中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸；
b.根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸；
c.其中所述第一结合区与所述第二结合区结合；
并且
向细胞体内施用所述复合物，
其中细胞中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达比单独来自所述环状多核糖核苷酸的表达高。
[52]一种体内表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
体内施用于细胞：
a.将根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸，和
b.根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸施用于细胞，
其中所述第一结合区与所述第二结合区结合以在所述细胞中形成复合物，并且所述细胞中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达比单独来自所述环状多核糖核苷酸的表达高。
[53]一种表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
提供了复合物，所述复合物包含：
a.根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸，和
b.根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸；
c.其中所述第一结合区与所述第二结合区结合；
并且
将所述复合物施用于细胞，
其中细胞中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达导致蛋白质产量相比单独来自所述环状多核糖核苷酸的表达有所增加。
[54]一种表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
施用于细胞：
a.将根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸，和
b.根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸施用于细胞，
其中所述第一结合区与所述第二结合区结合以在所述细胞中形成复合物，并且在所述细胞中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达导致蛋白质产量相比单独来自所述环状多核糖核苷酸的表达有所增加。
[55]根据编号实施例[53]或[54]所述的方法，其中在施用之后1天的蛋白质产量与单独的环状多核糖核苷酸相比有所增加。
[56]一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
提供了复合物，所述复合物包含：
a.根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸，和
b.根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸；
c.其中所述第一结合区与所述第二结合区结合；
并且
将所述复合物施用于所述受试者的细胞，
其中所述受试者中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达比在单独施用环状多核糖核苷酸之后长至少6小时。
[57]一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用：
a.根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸，和
b.根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸，
其中所述第一结合区与所述第二结合区结合以在所述受试者中形成复合物，并且所述受试者的细胞中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达比在单独施用所述环状多核糖核苷酸之后长至少6小时。
[58]一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
提供了复合物，所述复合物包含：
a.根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸，和
b.根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸，
c.其中所述第一结合区与所述第二结合区结合；
并且
将所述复合物施用于所述受试者的细胞，
其中所述受试者中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达比在单独施用所述环状多核糖核苷酸的线性对应物之后长至少6小时。
[59]一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用：
a.根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的包含所述一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸，和
b.根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸，
其中所述第一结合区与所述第二结合区结合以在所述受试者中形成复合物，并且所述受试者的细胞中来自所述复合物的所述一个或多个表达序列的表达比在单独施用所述环状多核糖核苷酸的线性对应物之后长至少6小时。
[60]根据编号实施例[45]-[59]中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
[61]根据编号实施例[45]-[60]中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
[62]根据编号实施例[45]-[61]中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
[63]根据编号实施例[45]-[62]中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
[64]一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸和根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的环状多核糖核苷酸。
[65]一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用与根据编号实施例[7]-[43]中任一项所述的环状多核糖核苷酸结合的根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸。
[66]根据编号实施例[45]、[46]、[56]-[59]、[64]或[65]中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
[67]根据编号实施例[45]、[46]、[56]-[59]、[64]或[65]中任一项所述的方法，其中所述受试者是宠物。
[68]根据编号实施例[45]、[46]、[56]-[59]、[64]或[65]中任一项所述的方法，其中所述受试者是牲畜动物。
[69]根据编号实施例[45]、[46]、[56]-[59]、[64]或[65]中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[70]一种试剂盒，其包含：
根据编号实施例[6]或[9]-[43]中任一项所述的多核糖核苷酸；
根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的环状多核糖核苷酸；以及
用于向细胞施用所述多核糖核苷酸及所述环状多核糖核苷酸的说明书。
[71]一种试剂盒，其包含：
包含与根据编号实施例[7]或[9]-[43]中任一项所述的环状多核糖核苷酸结合的根据编号实施例[6]或[9]与[43]中任一项所述的多核糖核苷酸的复合物；以及
用于向细胞施用所述复合物的说明书。
本文引用的所有参考文献和出版物特此通过引用并入。
上述实施例可以组合以实现上述功能性特性。以下实例也说明了这一点，这些实例阐述了示例性的组合和所实现的功能性特征。
实例
提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但并非旨在限制本发明的范围；通过其示例性性质将理解，可以替代性地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实例1：环状RNA的帽依赖性翻译
此实例示出了用编码经5’修饰的鸟苷帽结构的单链线性RNA寡核苷酸退火的环状RNA的翻译。
RNA分子的翻译起始通常发生在起始密码子(AUG)处。在真核生物中，40S核糖体亚基被募集至mRNA的5’端处的帽结构中。然后扫描下游起始密码子，并且如果AUG位于优选的周围序列(A/GxxAUGG)中，则启动翻译。核糖体扫描过程不是经由逐个碱基检查RNA来进行的，而是在扫描过程中绕过了mRNA的一些区段。
在此实例中，环状RNA被设计成具有编码纳米荧光素酶的ORF、交错元件、退火区，并且在所述交错元件与退火区之间没有终止密码子(TAA)，如图5A中所显示。
在此实例中，包含5’帽的多核糖核苷酸是编码人α珠蛋白5’UTR、与环状RNA的退火区互补的3’退火区和使用具有抗反向帽类似物(ARCA)的共转录加帽生成的经5’修饰的鸟苷帽结构的线性RNA寡核苷酸。图5B中显示了加帽线性RNA寡核苷酸的示意图。
如下在体外生成环状RNA：使用T7 RNA聚合酶，从包含上文所述的NLuc ORF、交错元件和退火区的DNA模板，通过体外转录来合成未经修饰的线性RNA。使用
Figure BDA0003866038070002651
RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)来纯化所转录的RNA，按照制造商的说明用RNA5'磷酸水解酶(RppH)来进行处理，并再次使用
Figure BDA0003866038070002652
RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)来进行纯化。使用夹板DNA和T4 RNA连接酶来环化经RppH处理的线性RNA。通过尿素聚丙烯酰胺凝胶来纯化环状RNA，在缓冲液中洗脱，乙醇沉淀并重悬于RNA酶储存溶液(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，目录号AM7000)中。
为了生成加帽的单链线性RNA寡核苷酸，在7.2mM ARCA存在的情况下进行体外转录。用RNA清除试剂盒(新英格兰生物实验室，T2050)来纯化所转录的RNA。
为了使环状RNA退火到加帽线性RNA寡核苷酸，将加帽线性RNA和环状RNA在65℃下的缓冲液中孵育15分钟，并然后逐渐冷却至25℃。通过琼脂糖凝胶电泳来证实RNA退火。
为测量与仅环状RNA的对照相比，来自退火的环状RNA加帽线性RNA复合物的NLuc的表达效率，使用转染剂将退火的构建体和未退火的对照(仅环状RNA)转染到BJ成纤维细胞或SV40 MEF细胞中。在转染之后6、24和72小时测量NLuc活性。为测量NLuc活性，添加NLuc试剂(普洛麦格公司(Promega))并孵育2分钟以允许细胞裂解。使用光度计仪器来读取所裂解的细胞。
在这些条件下，与用作对照的仅环状RNA的对应物相比，用加帽线性RNA寡核苷酸退火的内在化环状RNA表现出更高的NLuc表达(图5C(BJ成纤维细胞)；图5D(SV40 MEF))。对于所有样品，在6小时观察到最大的NLuc表达。
此实例示出了用包含5’帽结构的线性RNA寡核苷酸退火的环状RNA可用于驱动细胞中环状RNA的功能性蛋白质表达。
实例2：包含终止密码子的环状RNA的帽依赖性翻译
此实例示出了用编码经5’修饰的鸟苷帽结构的单链线性RNA寡核苷酸退火的环状RNA的体外翻译。
在此实例中，环状RNA被设计成具有编码纳米荧光素酶的ORF、交错元件、退火区，并且在所述交错元件与退火区之间具有终止密码子(TAA)，如图6A中所显示。
在此实例中，包含5’帽的多核糖核苷酸是编码人α珠蛋白5’UTR、与环状RNA的退火区互补的3’退火区和使用具有抗反向帽类似物(ARCA)的共转录加帽生成的经5’修饰的鸟苷帽结构的线性RNA寡核苷酸。图6B中显示了加帽线性RNA序列的示意图。
如下在体外生成环状RNA：使用T7 RNA聚合酶，从包含上文所述的NLuc ORF、交错元件和退火区的DNA模板，通过体外转录来合成未经修饰的线性RNA。使用
Figure BDA0003866038070002661
RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)来纯化所转录的RNA，按照制造商的说明用RNA5'磷酸水解酶(RppH)来进行处理，并再次使用
Figure BDA0003866038070002662
RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)来进行纯化。使用夹板DNA和T4 RNA连接酶来环化经RppH处理的线性RNA。通过尿素聚丙烯酰胺凝胶来纯化环状RNA，在缓冲液中洗脱，乙醇沉淀并重悬于RNA酶储存溶液(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)，目录号AM7000)中。
为了生成加帽的单链线性RNA寡核苷酸，在7.2mM ARCA存在的情况下进行体外转录。用RNA清除试剂盒(新英格兰生物实验室，T2050)来纯化所转录的RNA。
为了使环状RNA退火到加帽线性RNA寡核苷酸，将加帽线性RNA和环状RNA在65℃下的缓冲液中孵育15分钟，并然后逐渐冷却至25℃。通过琼脂糖凝胶电泳来证实RNA退火。
为测量与仅环状RNA的对照相比，来自退火的环状RNA加帽线性RNA复合物的NLuc的表达效率，使用转染剂将退火的构建体和未退火的对照(仅环状RNA)转染到BJ成纤维细胞或SV40 MEF细胞中。在转染之后6、24和72小时测量NLuc活性。为测量NLuc活性，添加NLuc试剂(普洛麦格公司(Promega))并孵育2分钟以允许细胞裂解。使用光度计仪器来读取所裂解的细胞。
在这些条件下，与用作对照的仅含环状RNA的对应物相比，用加帽线性RNA寡核苷酸退火的内在化环状RNA表现出更高的NLuc表达(图6C(BJ成纤维细胞)；图6D(SV40 MEF))。对于所有样品，在6小时观察到最大的NLuc表达。
此实例示出了用包含5’帽结构的线性RNA寡核苷酸退火的环状RNA可用于驱动细胞中环状RNA的功能性蛋白质表达。
实例3：环状RNA的帽依赖性翻译
此实例示出了用编码经5’修饰的鸟苷帽结构的单链线性RNA寡核苷酸退火的环状RNA的翻译。
在此实例中，环状RNA被设计成具有编码高斯荧光素酶的ORF、退火区和终止密码子(TAA)，如图7A中所显示。
在此实例中，一种包含5’帽的多核糖核苷酸是线性RNA寡核苷酸和与环状RNA(Oligo#0)退火区互补的3’退火序列。在此实例中，包含5’帽的第二多核糖核苷酸是线性RNA寡核苷酸，其包含与Gluc ORF(Oligo#9)的终止密码子(TAA)上游的核苷酸互补的3’退火序列。两种不同帽结构用于加帽多核苷酸：使用抗反向帽类似物(ARCA)的共转录加帽生成Cap0，或者使用牛痘加帽系统和2’O-甲基转移酶生成Cap1。图7B和图7C中显示这些加帽线性RNA寡核苷酸的示意图。
如下在体外生成环状RNA：使用T7 RNA聚合酶，从包含上文所述的GLuc ORF和退火区的DNA模板，通过体外转录来合成未经修饰的线性RNA。使用
Figure BDA0003866038070002681
RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)来纯化所转录的RNA，按照制造商的说明用RNA 5'磷酸水解酶(RppH)来进行处理，并再次使用
Figure BDA0003866038070002682
RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)来进行纯化。使用夹板DNA和T4 RNA连接酶来环化经RppH处理的线性RNA。通过尿素聚丙烯酰胺凝胶来纯化环状RNA，在缓冲液中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。
为生成加帽线性多核糖核苷酸的Cap0形式，在7.2mM ARCA存在的情况下进行体外转录。用RNA清除试剂盒(新英格兰生物实验室，T2050)来纯化所转录的RNA。为生成加帽线性多核糖核苷酸的Cap1形式，进行体外转录并用RNA清除试剂盒(T2050，NEB)来进行纯化。对经纯化的RNA进行一步加帽和2’-O-甲基化，以用牛痘病毒加帽酶和加帽2’-O-甲基转移酶在5’端处添加Cap1。通过尿素聚丙烯酰胺凝胶来纯化加帽线性RNA寡核苷酸，在缓冲液中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。
为了使环状RNA退火到加帽线性RNA寡核苷酸，将1uM加帽线性RNA和0.5uM环状RNA在65℃下的缓冲液中孵育15分钟，并然后逐渐冷却至25℃。将没有加帽线性RNA寡核苷酸的环状RNA用作阴性对照。
为测量与仅环状RNA的对照相比，来自退火的环状RNA加帽线性RNA复合物的GLuc的表达效率，使用转染剂将具有不同5’端的退火构建体(CAP0或CAP1)和未退火的对照(仅环状RNA)转染到HeLa细胞。在24小时和48小时时间点处收获细胞培养基并用新鲜培养基替代以测量GLuc活性。使用光度计仪器来测量Gluc活性。
结果表明，在这些条件下，与仅环状RNA的对应物相比，用加帽线性RNA寡核苷酸退火的内在化环状RNA表现出更高的GLuc表达(图7D)；在Gluc起始密码子之前立即退火的加帽线性RNA寡核苷酸(寡核苷酸#0)显示出比在Gluc ORF(寡核苷酸#9)的3’端退火的寡核苷酸更好的翻译增强。另外，Cap1线性RNA寡核苷酸显示比Cap0线性RNA寡核苷酸更大的翻译增强。对于所有样品，在24小时观察到最高的GLuc表达。
此实例示出了用包含5’帽结构的线性RNA寡核苷酸退火的环状RNA可用于驱动细胞中环状RNA的功能性蛋白质表达。
实例4：多个加帽寡核苷酸退火额外增强了环状RNA的翻译
此实例示出了与单个寡核苷酸退火相比，退火到环状RNA的两个不同区的加帽寡核苷酸额外增强了来自环状RNA的翻译。
在此实例中，环状RNA被设计成具有编码高斯荧光素酶的ORF、退火区和终止密码子(TAA)，如图8A中所显示。
在此实例中，一种包含5’帽的多核糖核苷酸是线性RNA寡核苷酸，与环状RNA(Oligo#0)退火区互补的3’退火序列。在此实施例中，包含5’帽的第二多核糖核苷酸是线性RNA寡核苷酸，其是与Gluc ORF(Oligo#9)的终止密码子(TAA)上游的核苷酸互补的3’退火序列。加帽多核苷酸的帽结构是使用牛痘加帽系统和2’O-甲基转移酶生成的Cap1。图8B、图8C和图8D中显示了加帽线性RNA寡核苷酸的示意图。
如下在体外生成环状RNA：使用T7 RNA聚合酶，从包含上文所述的GLuc ORF和退火区的DNA模板，通过体外转录来合成未经修饰的线性RNA。使用
Figure BDA0003866038070002691
RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)来纯化所转录的RNA，按照制造商的说明用RNA 5'磷酸水解酶(RppH)来进行处理，并再次使用
Figure BDA0003866038070002692
RNA清除试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)来进行纯化。使用夹板DNA和T4 RNA连接酶来环化经RppH处理的线性RNA。通过尿素聚丙烯酰胺凝胶来纯化环状RNA，在缓冲液中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。
为生成加帽线性多核糖核苷酸的Cap1，进行体外转录并用RNA清除试剂盒(T2050，NEB)来进行纯化。对经纯化的RNA进行一步加帽和2’-O-甲基化，以用牛痘病毒加帽酶和加帽2’-O-甲基转移酶在5’端处添加Cap1。通过尿素聚丙烯酰胺凝胶来纯化加帽线性RNA寡核苷酸，在缓冲液中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。
为了使环状RNA退火到加帽线性RNA寡核苷酸，将1uM加帽线性RNA和0.5uM环状RNA在65℃下的缓冲液中孵育15分钟，并然后逐渐冷却至25℃。将加帽线性RNA #0和#9与环状RNA单独混合或合并。将不具有加帽线性RNA寡核苷酸的环状RNA用作阴性对照。
为测量与用一个加帽线性RNA退火的环状RNA相比，用两个加帽线性RNA退火的GLuc的表达效率，使用转染剂在HeLa细胞中转染退火的构建体和未退火的对照(单独的环状RNA)。在24小时和48小时时间点处收获细胞培养基并用新鲜培养基替代以测量GLuc活性。使用光度计仪器来测量Gluc活性。
结果令人惊讶地显示，在这些条件下，与仅用一种加帽线性RNA退火的环状RNA相比，用两种加帽线性RNA寡核苷酸退火的内在化环状RNA表现出额外的GLuc表达(图8E)。
此实例示出了通过将多个加帽线性RNA退火成环状RNA可实现更多的翻译增强。

Claims (53)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)含有经5’修饰的鸟苷帽和第一结合区的多核糖核苷酸；
(b)环状多核糖核苷酸；以及
(c)药学上可接受的赋形剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含第二结合区。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述第一结合区特异性地结合所述第二结合区。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中当包含所述经5’修饰的鸟苷帽的所述多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时，所述多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸通过间接结合与所述环状多核糖核苷酸结合。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸通过直接结合与所述环状多核糖核苷酸结合。
7.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸通过共价结合与所述环状多核糖核苷酸结合。
8.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸通过非共价结合与所述环状多核糖核苷酸结合。
9.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述第一结合区与所述第二结合区互补。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸募集核糖体。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸的所述经5’修饰的鸟苷帽募集所述核糖体。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含表达序列。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中包含所述经5’修饰的鸟苷帽的所述多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中所述表达序列的表达。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸进一步包含UTR。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸包含5’UTR。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸包含3’UTR。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸包含聚A区。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的药物组合物，其中所述第一结合区是UTR的3’的结合区。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述第一结合区包含5至100个核苷酸的长度。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中所述经5’修饰的鸟苷帽是7-甲基鸟苷帽。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中所述经5’修饰的鸟苷帽是抗反向帽类似物。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸包含一个或多个所述经5’修饰的鸟苷帽。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸是线性的。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸包含5至1100个核苷酸的长度。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸是未经修饰的环状多核糖核苷酸。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含UTR。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含聚A区。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含IRES。
29.根据权利要求1-27中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸缺少IRES。
30.根据权利要求2-29中任一项所述的药物组合物，其中所述第二结合区包含5至100个核苷酸的长度。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含终止密码子。
32.根据权利要求2-29中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含位于所述终止密码子与起始密码子之间非翻译区中的所述第二结合区。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含加密原、调节元件、复制元件或准双链二级结构。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含交错元件。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸在所述第二结合区与所述交错元件之间包含终止密码子。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含蛋白质翻译起始位点。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述蛋白质翻译起始位点包含科扎克序列。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含50至20000个核苷酸的长度。
39.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)含有经5’修饰的鸟苷帽和第一结合区的第一多核糖核苷酸；
(b)含有经5’修饰的鸟苷帽和第三结合区的第二多核糖核苷酸；
(c)环状多核糖核苷酸；以及
(d)药学上可接受的赋形剂。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述环状多核糖核苷酸包含第二结合区和第四结合区。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，其中所述第一结合区与所述第二结合区特异性地结合，并且所述第三结合区与所述第四结合区特异性地结合。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中当所述第一多核糖核苷酸和所述第二多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时，所述多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达。
43.根据权利要求41所述的药物组合物，其中与当所述第一多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达相比，或与当所述第二多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达相比，当所述第一多核糖核苷酸和所述第二多核糖核苷酸与所述环状多核糖核苷酸结合时，所述第一多核糖核苷酸和所述第二多核糖核苷酸驱动所述环状多核糖核苷酸中表达序列的表达增加。
44.一种包含经5’修饰的鸟苷帽和第一结合区的多核糖核苷酸，
其中所述第一结合区与环状多核糖核苷酸的第二结合区特异性地结合。
45.一种包含第二结合区的环状多核糖核苷酸，其中所述第二结合区与多核糖核苷酸的第一结合区特异性地结合，并且其中所述多核糖核苷酸包含经5’修饰的鸟苷帽。
46.一种复合物，所述复合物包含：
根据权利要求44所述的多核糖核苷酸；以及
根据权利要求45所述的环状多核糖核苷酸；
其中所述多核糖核苷酸的所述第一结合区与所述环状多核糖核苷酸的所述第二结合区结合。
47.一种产生复合物的方法，所述方法包括将根据权利要求44所述的多核糖核苷酸的所述第一结合区与根据权利要求45所述的环状多核糖核苷酸的所述第二结合区结合，由此产生所述复合物。
48.一种在细胞中表达来自环状多核糖核苷酸的表达序列的方法，所述方法包括将根据权利要求47所述的复合物递送至所述细胞，其中所述复合物的所述环状多核糖核苷酸包含表达序列。
49.根据权利要求1-43中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于在通过疗法治疗人体或动物体的方法中使用。
50.根据权利要求46所述的复合物，所述复合物用作药剂或药物。
51.根据权利要求46所述的复合物，所述复合物用于在通过疗法治疗人体或动物体的方法中使用。
52.根据权利要求46所述的复合物，或根据权利要求44所述的多核糖核苷酸以及根据权利要求45所述的环状多核糖核苷酸在制造药剂或药物中的用途。
53.根据权利要求46所述的复合物，或根据权利要求44所述的多核糖核苷酸以及根据权利要求45所述的环状多核糖核苷酸在制造用于通过疗法治疗人体或动物体的药剂或药物中的用途。
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