JP6284181B2 - 環状rna及びタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
[1] タンパク質をコードし、全長の塩基数が102以上402以下の3の倍数であり、少なくとも1の開始コドンを有し、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、前記開始コドンを含むKozak配列を有し、さらにIRES(Internal ribosome entry site)を含んでいない、環状RNA。
[2] 真核細胞の発現系において、環状RNAを鋳型として、当該環状RNAがコードしているタンパク質を発現させ、前記環状RNAが、タンパク質をコードし、全長の塩基数が102以上402以下の3の倍数であり、少なくとも1の開始コドン及び当該開始コドンを含むKozak配列を有し、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、さらにIRESを含んでいない環状RNA、又は前記[1]に記載の環状RNAである、タンパク質の製造方法。
[3] 前記環状RNAを真核細胞に導入する、又は前記環状RNAを真核細胞由来の無細胞発現系に添加することにより、当該環状RNAがコードしているタンパク質を発現させる前記[2]に記載のタンパク質の製造方法。
[4] 前記真核細胞が哺乳細胞である前記[2]又は[3]に記載のタンパク質の製造方法。
本発明の環状RNAのうち、真核細胞の翻訳系において回転式タンパク質翻訳の鋳型となる環状RNA(以下、「本発明の真核細胞用環状RNA」ということがある)は、タンパク質をコードし、全長の塩基数が102以上の3の倍数であり、少なくとも1の開始コドンを有しており、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、さらにIRESを含んでいないことを特徴とする。IRESとは、キャップ構造の代替として機能し得るリボソーム結合部位をいう。IRESを有していない環状RNAを鋳型とした場合に動物細胞翻訳系において回転式タンパク質翻訳が可能であることや、無細胞系ではなく、動物細胞内で回転式タンパク質翻訳が起こることは、本発明者らによって初めて明らかにされた。
本発明の環状RNAのうち、原核細胞の翻訳系において回転式タンパク質翻訳の鋳型となる環状RNA(以下、「本発明の原核細胞用環状RNA」ということがある)は、タンパク質をコードし、全長の塩基数が102以上360以下の3の倍数であり、1の原核細胞由来のリボソームが認識するリボソーム結合部位と、前記リボソーム結合部位の下流1〜20塩基以内に少なくとも1の開始コドン(例えば、AUG)を有しており、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有していないことを特徴とする。全長の塩基数が102以上360以下であることにより、原核細胞の翻訳系において、翻訳効率を顕著に高めることができる。
本発明の真核細胞用環状RNA及び本発明の原核細胞用環状RNA(以下、合わせて「本発明の環状RNA」ということがある)の合成方法は特に限定されるものではない。例えば、公知の化学合成反応により一本鎖RNAを合成した後、これをリガーゼにより連結することで環状RNAを合成することができる。複数本の一本鎖RNAを合成した後、これらをそれぞれ適切な順番にリガーゼにより連結することによっても、環状RNAを合成することができる。リガーゼ反応の際に、非特許文献2に記載の環状RNAの合成方法と同様に、連結させる2本の一本鎖RNAの両端とハイブリダイズするDNAプローブを用いることにより、効率よくリガーゼ反応を行うことができる。その他、非特許文献1に記載の環状RNAの合成方法と同様に、スプライシング反応を利用して調製してもよい。
本発明の真核細胞用環状RNAを真核細胞に導入する、又は真核細胞由来の無細胞発現系に添加することにより、当該真核細胞用環状RNAがコードしているタンパク質を繰り返し配列構造として有するタンパク質リピートが翻訳され、合成される。同様に、本発明の原核細胞用環状RNAを原核細胞に導入する、又は原核細胞由来の無細胞発現系に添加することにより、当該原核細胞用環状RNAがコードしているタンパク質を繰り返し配列構造として有するタンパク質リピートが翻訳され、合成される。本発明の環状RNAを鋳型とする回転式タンパク質翻訳においては、リボソームが一度環状RNAに結合し、タンパク質合成を開始すると、原理的には永久にタンパク質合成が進行する。つまり、翻訳開始の律速段階は最初のリボソーム結合時のみであり、それ以降のタンパク質合成は効率よく行われるという利点がある。
当該大腸菌S30細胞抽出液は、大腸菌A19(rna、met)、BL21、BL21star、BL21コドンプラス株等から公知の方法(Pratt, J.M. et al., Transcription and translation - a practical approach, (1984), pp.179-209, Henes, B.D.とHiggins, S.J.編、IRL Press, Oxford参照)に従って調製できる。また、プロメガ社やノバジェン社から市販されるものを使用してもよい。また、バッチ法、フロー法の他、従来公知の技術(例えば、Spirin, A et al., Methods in Enzymol., 217, 123-142, 1993参照)がいずれも適用可能である。
1又は複数のFLAGペプチドをコードする領域を有する原核細胞用環状RNAを合成し、これらを鋳型として無細胞系においてタンパク質を合成した。
<環状RNAの合成>
(1)オリゴヌクレオチドの調製
具体的には、まず、環状RNA又は直鎖状RNAのフラグメントである4種類のRNAオリゴヌクレオチド(F35、F49、F42、F42’)、及び酵素T4 DNAリガーゼを用いた連結反応に鋳型として用いる5種類のDNAオリゴヌクレオチド(G1、G2、G3、G3’、G4)をそれぞれ化学合成した。なお、F42’は、F42の3’末端にUAAUAAを付加した48塩基長である。各オリゴヌクレオチドの配列を表1、及び配列表の配列番号1〜9に示す。表1中、囲み部分はリボソーム結合配列を表し、太字の塩基(AUG)は開始コドンを表し、下線部位はFLAGコード配列を表し、二重下線部は終止コドンを表す。pは5’末端がリン酸化されていることを示す。
2分子のFLAGペプチドをコードする領域を有する84塩基の環状RNA(C84)及び4分子のFLAGペプチドをコードする領域を有する168塩基の環状RNA(C168)は、F35及びF49を、G1及びG4を鋳型として連結することにより合成した。3分子のFLAGペプチドをコードする領域を有する126塩基の環状RNA(C126)及び6分子のFLAGペプチドをコードする領域を有する252塩基の環状RNA(C252)は、F35、F49、及びF42を、G1、G2、及びG3を鋳型として連結することにより合成した。各合成スキームを模式的に図1に示す。
また、3分子のFLAGペプチドをコードする領域を有する126塩基の直鎖状RNA(L126)は、F35、F49、及びF42を、G1及びG2を鋳型として連結することにより合成した。3分子のFLAGペプチドをコードする領域及び終止コドンを有する132塩基の直鎖状RNA(L126+stop)は、F35、F49、及びF42’を、G1及びG2を鋳型として連結することにより合成し、3分子のFLAGペプチドをコードする領域及び終止コドンを有する132塩基の環状RNA(C126+stop)は、F35、F49、及びF42’を、G1、G2、及びG3’を鋳型として連結することにより合成した。
C84、C126、C168、C252、C126+stopの配列を表2、及び配列表の配列番号10〜14に示す。表2中、囲み部分はリボソーム結合配列を表し、太字の塩基(AUG)は開始コドンを表し、下線部位はFLAGコード配列を表し、二重下線部は終止コドンを表す。また、いずれも、5’末端及び3’末端の両末端で連結された環状構造を形成する。なお、L126及びL126+stopは、それぞれC126及びC126+stopと同じ塩基配列を有しているが、環状構造を有しない直鎖状RNAである。
L126は、F35、F49、及びF42を、G1及びG2を鋳型としてリガーゼにより連結することによって合成した。リガーゼ反応は、5μMのF35、5μMのF49、15μMのF42、10μMのG1、20μMのG2、35units/μLのT4 DNAリガーゼ(タカラバイオ社製)、66mMのTris−HCl(pH7.6)、6.6mMのMgCl2、10mMのDTT、0.1mMのATP、10%(w/v)のPEG6000を含む反応液(反応液量:1.7mL)で行った。
具体的には、PEG6000及びT4 DNAリガーゼ以外を全て添加した反応液を90℃で3分間加熱した後、室温まで徐冷した。その後、当該反応液にPEG6000及びT4 DNAリガーゼを加え、37℃で約5時間インキュベートした。当該反応液に等量のクロロホルムを加えてPEG6000を抽出・除去した後、3Mの酢酸ナトリウム水溶液(pH5.2)及びイソプロピルアルコールを加えて冷却し、RNAを沈殿させて回収した。回収されたRNAの一部を変性PAGE分析(8% ポリアクリルアミド、7.5M 尿素、25% ホルムアミド、1×TBE)し、ゲルをSYBR Green II(タカラバイオ社製)により染色して可視化し、リガーゼ反応の進行を確認した後、同じく変性PAGEを用いて、残りのRNAから連結生成物(L126)を単離した。UV shadowing法により、目的物を含むバンドを可視化して切り出して細かく粉砕した後、溶出液[10mM EDTA(pH 8.0)]1mLで2回RNAを抽出した。得られた抽出液を遠心エバポレーターにより濃縮し、さらにマイクロコンYM−3(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮後の前記抽出液からRNAを、アルコール沈殿により脱塩・回収した。得られたRNA(L126) は超純水に溶解し、適宜希釈後UV吸収スペクトルを測定し、収量を算出した(収量:2.17nmol、収率:26%)。図2に、SYBR Green II(タカラバイオ社製)により変性PAGEゲル中の核酸を染色した結果に得られた染色像を示す。レーン1はssRNAマーカーを、レーン2は酵素反応前の反応液を、レーン3は酵素反応後の反応液を、それぞれアプライした。図2に示すように、酵素反応後には、F35、F49、及びF42からL126が合成された。
L126をリガーゼ反応により環状にすることによって、C126を合成した。リガーゼ反応は、1μMのL126、1μMのG3、17.5units/μLのT4 DNAリガーゼ(タカラバイオ社製)、6mMのTris−HCl(pH7.6)、6.6mMのMgCl2、10mMのDTT、0.1mMのATP、10%(w/v)のPEG6000を含む反応液(反応液量:2mL)で行った。
具体的には、PEG6000及びT4 DNAリガーゼ以外を全て添加した反応液を90℃で3分間加熱した後、室温まで徐冷した。その後、当該反応液にPEG6000及びT4 DNAリガーゼを加え、37℃で7時間インキュベートした。当該反応液に等量のクロロホルムを加えてPEG6000を抽出・除去した後、3Mの酢酸ナトリウム水溶液(pH5.2)及びイソプロピルアルコールを加えて冷却し、RNAを沈殿させて回収した。回収されたRNAの一部を変性PAGE分析(6% ポリアクリルアミド、7.5M 尿素、25% ホルムアミド、1×TBE)し、ゲルをSYBR Green II(タカラバイオ社製)により染色して可視化し、リガーゼ反応の進行を確認した後、同じく変性PAGEを用いて、残りのRNAから連結生成物(C126)を単離した。UV shadowing法により、目的物を含むバンドを可視化して切り出して細かく粉砕した後、溶出液[10mM EDTA(pH 8.0) ]0.5mLで2回RNAを抽出した。得られた抽出液を遠心エバポレーターにより濃縮し、さらにマイクロコンYM−3(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮後の前記抽出液からRNAを、アルコール沈殿により脱塩・回収した。得られたRNA(L126) は超純水に溶解し、適宜希釈後UV吸収スペクトルを測定し、収量を算出した(収量:0.40nmol、収率:20%)。図3に、SYBR Green II(タカラバイオ社製)により変性PAGEゲルを染色した結果に得られた染色像を示す。レーン1はssRNAマーカーを、レーン2は酵素反応前の反応液を、レーン3は酵素反応後の反応液を、それぞれアプライした。図3に示すように、酵素反応後には、L126からC126が合成された。
F42に代えてF42’を、G3に代えてG3’を、それぞれ用いた以外は、上記(2)及び(3)と同様にして、L126+stop及びC126+stopを合成した。
図1及び上記(2)で示すように、各フラグメントを適宜用いた以外は、上記(3)L126の合成及び(4)C126の合成と同様にして、C84、C168、C252を合成した。
図4に、L84(2分子のFLAGペプチドをコードする領域を有する84塩基の直鎖状RNA)を合成するためのリガーゼ反応の反応物を8%変性PAGE分析した結果に得られた染色像を示す。レーン1は酵素反応前の反応液を、レーン2は酵素反応後の反応液を、レーンMはssRNAマーカーを、それぞれアプライした。図4に示すように、酵素反応後には、F35及びF49からL84が合成された。
図5に、環状RNA合成反応の反応物を8%変性PAGE分析した結果に得られた染色像を示す。レーン1はL84を鋳型としたリガーゼ反応の反応前の反応液を、レーン2はL84を鋳型としたリガーゼ反応の反応後の反応液を、レーンMはssRNAマーカーを、レーン3はL126を鋳型としたリガーゼ反応の反応前の反応液を、レーン4はL126を鋳型としたリガーゼ反応の反応後の反応液を、それぞれ示す。図5に示すように、酵素反応後には、L84からC84及びC168が、L126からC126及びC252が、それぞれ合成された。
(7)L126、L126+stop、C126、C126+stopを鋳型とした無細胞翻訳反応
L126、L126+stop、C126、又はC126+stopを1μMとなるように無細胞翻訳液(PURExpress、New England Biolabs社製) に加え、37℃で3時間インキュベートした(反応液量:25μL)。対照として、RNA無添加の反応液も同様にインキュベートした。反応液から1μLサンプリングし、5μLの2×サンプル緩衝液[0.125M Tris−HCl(pH8.0)、2% SDS、30% グリセロール、0.02% ブロモフェノールブルー、5% 2−メルカプトエタノール]及び4μLの超純水と混合した。これを95℃で5分間加熱後、10−20% 勾配ポリアクリルアミドゲル(ATTO社製)を用いて電気泳動した(泳動用緩衝液: 25mM Tris−HCl、0.1% SDS、192mM グリシン)。ゲル中に展開されたタンパク質をPVDF膜(ミリポア社製)に転写後、マウス産生抗FLAG抗体、抗マウスIgG抗体ペルオキシダーゼ(HRP)複合体(いずれもSigma−Aldrich社製)と反応させ、HRP基質(SuperSignal West Femto Maximun Sensitivity Substrate、Thermo社製)を用いて、FLAG配列特異的にバンドを可視化(Light−Capture、ATTO社製)した。図6に、FLAGを含むタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。レーン1はL126を添加した反応液、レーン2はL126+stopを添加した反応液、レーン3はC126+stopを添加した反応液、レーン4はC126を添加した反応液、レーン5はRNA無添加の反応液を、それぞれアプライした。図6に示すように、C126を添加した反応液では、C126+stopやL126を添加した反応液で合成された15〜20kDaのタンパク質よりもはるかに長鎖のタンパク質が多く発現していた。特に、250kDa以上のタンパク質が発現しており、C126では、リボソームが10回以上回転して連続的に翻訳反応が進行し、タンパク質リピートが合成されていることが示唆された。
鋳型として、C84、C126、C168、又はC252を用いた以外は、上記(7)と同様にして、無細胞翻訳反応を行い、その後反応液を10−20% 勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中に展開されたタンパク質をPVDF膜に転写後、FLAG配列特異的にバンドを可視化した。図7に、FLAGを含むタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。レーン1及び3はRNA無添加の反応液、レーン2はC84を添加した反応液、レーン4はC126を添加した反応液、レーン5はC168を添加した反応液、レーン6はC252を添加した反応液を、それぞれアプライした。図7に示すように、C84を鋳型とした場合には、連続的翻訳反応の反応産物である長鎖ペプチドは生成しなかった。一方、C126、C168、及びC252を鋳型とした場合には、連続的翻訳反応の反応産物である長鎖ペプチド(タンパク質リピート)の生成が観察された。特に、C126及びC168を鋳型とした場合には、C252を鋳型とした場合よりも、翻訳効率が高く、より大量のタンパク質リピートが合成されていた。
複数のFLAGペプチドをコードする領域を有する真核細胞用環状RNAを合成し、これらを鋳型としてウサギ由来の無細胞系においてタンパク質を合成した。
<環状RNAの合成>
真核細胞用環状RNAは、ポリメラーゼによる転写反応を利用して合成した。まず、DNAオリゴヌクレオチドをDNA合成機で合成し(表3のFragment1〜Fragment3;これらの配列を、配列番号15〜17に示した)、T4 DNAリガーゼで連結させた後、アニーリング又はPCR法によって155、284、290、413塩基対の二本鎖DNAオリゴヌクレオチド(鋳型DNA)を合成した(表4及び5)。次いで、当該二本鎖DNAオリゴヌクレオチドを鋳型としてT7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写を行い、129、258、264、387塩基の直鎖状の一本鎖RNAを合成し(表6及び7)、T4 RNAリガーゼを用いて5’末端と3’末端を連結して環状RNAを合成した。詳細を以下に示す。
ポリメラーゼ反応の鋳型とした各種オリゴヌクレオチドの配列を表3に示す。表3中、pは5’末端がリン酸化されていることを示す。
表3中、DNAオリゴヌクレオチドはβ−シアノエチルホスホロアミダイト試薬(Glen Research社製)を用い、H−8−SE DNA合成機(ジーンワールド社製)により合成した。Fragment1及びFragment2は、化学リン酸化試薬(Glen Research社製)を用いて5’末端をモノリン酸化した。各オリゴヌクレオチドは、定法に従い脱保護し、Micropure IIカートリッジ(Biosearch Technologies社製)により精製した。Fragment1、Fragment2、Fragment3、及びFragment1 DNA senseは、さらに変性PAGEにより精製した。
表3、及び配列表の配列番号18〜35に記載の各種オリゴヌクレオチドを用いて、表4及び5に記載のin vitro転写反応の鋳型DNAを合成した。表4及び5中、下線部位はT7プロモーター配列を表す。
8×FLAG DNA(配列番号37)は、Adaptor1(配列番号18)を鋳型として、Fragment1(配列番号15)及びFragment2(配列番号16)をT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、得られた連結物を変性PAGEにより精製することによってアンチセンス鎖を合成し、当該アンチセンス鎖とForward primer1(配列番号21)をPrimeSTAR(登録商標)HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用いてPCR法により二本鎖DNAを合成し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製することによって得た。
12×FLAG DNA(配列番号38)は、Adaptor2(配列番号19)及びAdaptor3(配列番号20)を鋳型として、Fragment1(配列番号15)、Fragment2(配列番号16)、及びFragment3(配列番号17)をT4 DNAリガーゼを用いて連結させ、得られた連結物を変性PAGEにより精製することによってアンチセンス鎖を合成し、当該アンチセンス鎖とForward primer1(配列番号21)をPrimeSTAR(登録商標)HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用いてPCR法により二本鎖DNAを合成し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製することによって得た。
8×FLAG(2) DNA(配列番号39)及び8×FLAG(stop) DNA(配列番号40)は、12×FLAG DNA(配列番号38)を鋳型として、それぞれForward primer1(配列番号21)及びReverse primer3(配列番号24)、又はForward primer1(配列番号21)及びReverse primer4(配列番号28)をプライマーとして、PrimeSTAR(登録商標)HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用いてPCR法により二本鎖DNAを合成し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製することによって得た。
8×FLAG(3) DNA(配列番号41)は、8×FLAG(2) DNA(配列番号39)を鋳型として、Forward primer2(配列番号35)及びReverse primer5(配列番号31)をプライマーとして、PrimeSTAR(登録商標)HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用いてPCR法により二本鎖DNAを合成し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製することによって得た。
8×FLAG(3 stop) DNA(配列番号42)は、8×FLAG(stop) DNA(配列番号40)を鋳型として、Forward primer2(配列番号35)及びReverse primer6(配列番号32)をプライマーとして、PrimeSTAR(登録商標)HS DNA Polymerase(タカラバイオ社製)を用いてPCR法により二本鎖DNAを合成し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製することによって得た。
表4に記載の鋳型DNAを用いて、表6及び7に記載の直鎖状の転写RNAを合成した。表6及び7中、囲み部分はKozak配列を表し、太字の塩基(AUG)は開始コドンを表し、下線部位はFLAGコード配列を表し、二重下線部は終止コドン(UGA、UAG、UAA)を表す。
Adaptor1(配列番号18)を用いて4×FLAG RNA(配列番号43)から4×FLAG RNA環化体(4×FLAG RNAの環状RNA)を、Adaptor2(配列番号19)を用いて8×FLAG RNA(配列番号44)から8×FLAG RNA環化体を、Adaptor3(配列番号20)を用いて12×FLAG RNA(配列番号45)から12×FLAG RNA環化体を、Adaptor4(配列番号29)を用いて8×FLAG(2) RNA(配列番号46)から8×FLAG(2) RNA環化体を、Adaptor5(配列番号30)を用いて8×FLAG(stop) RNA(配列番号47)から8×FLAG(stop) RNA環化体を、Adaptor6(配列番号33)を用いて8×FLAG(3) RNA(配列番号48)から8×FLAG(3) RNA環化体を、Adaptor7(配列番号34)を用いて8×FLAG(3 stop) RNA(配列番号49)から8×FLAG(3 stop) RNA環化体を、それぞれリガーゼ反応により合成した。リガーゼ反応は、1μMの転写RNA、5μMのDNAオリゴヌクレオチド(Adaptor1〜7)、0.0125units/μLのT4 RNA リガーゼ2(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)、50mM Tris−HCl(pH 7.5)、2mM MgCl2、1mM DTT、 0.4mM ATPを含む反応液(反応液量:800μL(但し、4×FLAG RNAの反応液は3000μL、8×FLAG RNA及び12×FLAG RNAの反応液は5000μL、8×FLAG(3) RNAの反応液は600μL、8×FLAG(3 stop) RNAの反応液は1000μLとした)で行った。
(5)ウサギ網状赤血球抽出液を用いた翻訳反応
1.843μMのRNA環化体又は1.843μMの環化前の直鎖状の転写RNAを65℃、3分間加熱後、氷水で急冷した後、ウサギ網状赤血球抽出液に添加し、翻訳反応を行った。具体的には、479.2nMの急冷後のRNA、70% Rabbit Reticulocyte Lysate(プロメガ社製)、10μM Amino Acid Mixture Minus Methionine、10μM Amino Acid Mixture Minus Leucine(いずれも、Rabbit Reticulocyte Lysate System(プロメガ社製)に付属)、0.8units/μL RNase Inhibitor(東洋紡社製)からなる反応液(反応液量:25μL)とし、各反応液を30℃で1.5〜19時間インキュベートし、翻訳反応を行った。その後、各反応液から2.5μLをサンプリングし、2×SDSサンプル緩衝液[0.125M Tris−HCl(pH 8.0)、2% SDS、 30% グリセロール、0.02% ブロモフェノールブルー、5% 2−メルカプトエタノール]5μLと混合し、70℃で15分間加熱後、5%ポリアクリルアミドゲル又は10−20%勾配ポリアクリルアミドゲル(ATTO社製)を用いて電気泳動した(泳動用緩衝液: 25mM Tris−HCl、0.1% SDS、192mM グリシン)。ゲル中に展開されたタンパク質をPVDF膜(ミリポア社製)に転写後、マウス産生抗FLAG抗体、抗マウスIgG抗体ペルオキシダーゼ(HRP)複合体(いずれもSigma−Aldrich社製)と反応させ、HRP基質(SuperSignal West Femto Maximun Sensitivity Substrate、Thermo社製)を用いて、FLAG配列特異的にバンドを可視化(Light−Capture、ATTO社製)した。図11〜14に、FLAGを含むタンパク質のバンドを可視化した結果を示す。図11〜14の各レーンには、それぞれ、表8〜11に記載の反応液をアプライした。
実施例2で合成されたRNA環化体及び環化前の直鎖状の転写RNAを鋳型として、ヒト由来の無細胞系においてタンパク質を合成した。
鋳型RNAを終濃度1.2μMとなるように、AvidExpress(登録商標)Cell−Free Translation System(ヒトHeLaS3細胞由来、Avidity社製)を用いて製品マニュアルどおりに翻訳反応を行った。反応終了後、各反応液から2.5μLをサンプリングし、実施例2と同様にして10−20%勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中に展開されたタンパク質をPVDF膜に転写後、抗FLAG抗体、抗マウスIgG抗体HRP複合体を反応させ、HRP基質と反応させることでFLAG配列特異的なタンパク質のバンドを可視化した。
実施例2で合成されたRNA環化体及び環化前の直鎖状の転写RNAを鋳型として、ヒト細胞内の翻訳系を用いてタンパク質を合成した。
まず、細胞培養用12ウェルプレート(日本ベクトン・ディッキンソン社製)に、1ウェルあたりOpti−MEM I Reduced−Serum Medium(インビトロジェン社製)145μL及び2.4μMの鋳型RNA溶液5μLを混合し、Lipofectamine RNAiMAX(インビトロジェン社製)2μLを添加して混合し、15分間静置した。その後、10%ウシ胎児血清(インビトロジェン社製)を含有させたDulbecco’s Modified Eagle Medium(和光純薬工業社製)を用いて1mLあたり100,000個に希釈したHeLa細胞(ヒト子宮頸部癌由来の培養細胞株、理化学研究所バイオリソースセンターより提供)を850μL添加して37℃、5% CO2環境下で24時間培養した(RNA終濃度:12nM)。1ウェルあたり細胞溶解バッファー(CSTジャパン社製)200μLを添加して細胞を溶解させた後、遠心分離処理を行った。得られた上清7.5μLをサンプリングし、実施例2と同様にして10−20%勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中に展開されたタンパク質をPVDF膜に転写した。その後、抗FLAG抗体又は抗アクチン抗体(Santa Cruz Biotechnology社製)、抗マウスIgG抗体HRP複合体を反応させ、HRP基質と反応させることによって、FLAG配列特異的なタンパク質のバンド又はアクチンタンパク質のバンドを可視化した。
本実施例により、本発明の真核細胞用環状RNAを哺乳細胞内へ導入することにより、回転式タンパク質翻訳を行うことが可能であることが示された。
実施例2で合成されたRNA環化体及び環化前の直鎖状の転写RNAを鋳型として、ヒト細胞内の翻訳系を用いてタンパク質を合成した。
まず、細胞培養用24ウェルプレート(日本ベクトン・ディッキンソン社製)に、1ウェルあたりOpti−MEM I Reduced−Serum Medium(インビトロジェン社製)45μL及び2μMの鋳型RNA溶液4μLを混合し、Lipofectamine RNAiMAX(インビトロジェン社製)1μLを添加して混合し、15分間静置した。その後、10%ウシ胎児血清を含有したDulbecco’s Modified Eagle Medium(和光純薬工業社製)を用いて1mLあたり143,000個に希釈したHeLa細胞を350μL添加して37℃、5% CO2環境下で24時間培養した(RNA終濃度:20nM)。1ウェルあたり細胞溶解バッファー(CSTジャパン社製)30μLを添加して細胞を溶解させた後、遠心分離処理を行った。得られた上清のタンパク量をCoomassie Plus(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて測定し、細胞溶解バッファーを用いてタンパク濃度を1.5 mg/mLに調製した。タンパク質濃度調整後に、7.5μLをサンプリングし、実施例2と同様にして10−20%勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中に展開されたタンパク質をPVDF膜に転写した。その後、抗FLAG抗体又は抗アクチン抗体(Santa Cruz Biotechnology社製)、抗マウスIgG抗体HRP複合体を反応させ、HRP基質と反応させることによって、FLAG配列特異的なタンパク質のバンド又はアクチンタンパク質のバンドを可視化(ChemiDoc XRS Plus、バイオ・ラッド ラボラトリーズ社製)した。
実施例2の(4)で合成された8×FLAG RNAの環状RNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、蛍光標識した抗-FALG抗体を用いた細胞染色により、細胞内に導入したRNAの翻訳産物の検出を行った。
まず、カバーガラスを各ウェルに入れた細胞培養用24ウェルプレート(日本ベクトン・ディッキンソン社製)に、10%ウシ胎児血清を含有したDulbecco’s Modified Eagle Medium(和光純薬工業社製)を用いて、1mLあたり100,000個に希釈したHeLa細胞を1ウェル当たり500μl添加して、37℃、5% CO2環境下で一晩培養した。その後、各ウェルから培地を除き、Opti−MEM I Reduced−Serum Medium(インビトロジェン社製)を200μL添加した。Opti−MEM I Reduced−Serum Medium(インビトロジェン社製)32.5μL及び2μg/mLの鋳型RNA溶液2.5μLを混合し、この溶液にOpti−MEM I Reduced−Serum Medium(インビトロジェン社製)12μL及びOligofectamine(インビトロジェン社製)3μLを混合した溶液を添加し、15分間静置した後、各ウェルに加え、37℃、5% CO2環境下で6時間培養した。
トランスフェクション6時間後、培地を取り除き、10%ウシ胎児血清を含有したDulbecco’s Modified Eagle Medium(和光純薬工業社製)を1ウェル当たり500μL加え、更に37℃、5%CO2環境下で24時間培養した。その後、培地を取り除き、洗浄後、4%PFA/PBSで細胞を固定化した。0.3%Triton X−100/PBSで細胞を処理し、次いで1%BSA/PBSでブロッキングを行った後、1%BSA/PBSで調製したマウス抗-FLAG抗体(シグマアルドリッチジャパン合同会社製)を添加して、1時間インキュベートした。洗浄後、1%BSA/PBSで調製したAlexa Flour 488標識抗-マウスIgG抗体(ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社製)を添加して、1時間インキュベートした。洗浄後、顕微鏡観察を行った。結果を図18、19に示す。
Claims (4)
- タンパク質をコードし、全長の塩基数が102以上402以下の3の倍数であり、少なくとも1の開始コドンを有し、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、前記開始コドンを含むKozak配列を有し、さらにIRES(Internal ribosome entry site)を含んでいない、環状RNA。
- 真核細胞の発現系において、環状RNAを鋳型として、当該環状RNAがコードしているタンパク質を発現させ、
前記環状RNAが、タンパク質をコードし、全長の塩基数が102以上402以下の3の倍数であり、少なくとも1の開始コドン及び当該開始コドンを含むKozak配列を有し、前記開始コドンと同じ読み枠の終止コドンを有しておらず、さらにIRESを含んでいない環状RNA、又は請求項1に記載の環状RNAである、
タンパク質の製造方法。 - 前記環状RNAを真核細胞に導入する、又は前記環状RNAを真核細胞由来の無細胞発現系に添加することにより、当該環状RNAがコードしているタンパク質を発現させる請求項2に記載のタンパク質の製造方法。
- 前記真核細胞が哺乳細胞である、請求項2又は3に記載のタンパク質の製造方法。
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