CN117568374A - 合成细胞器辅助的基因表达方法、dna构建体和表达系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种合成细胞器辅助的基因表达方法、DNA构建体和表达系统及其应用。本发明提供了一种高效可行的方法来消除基因表达产物对宿主的压力和/或毒性，并为基因表达产物提供合适、可控的成熟环境，从而优化基因表达。

Description

合成细胞器辅助的基因表达方法、DNA构建体和表达系统及其 应用
技术领域
本发明涉及工程领域，具体而言涉及合成细胞器辅助的基因表达方法、DNA构建体和表达系统及其应用。
背景技术
基因表达通常是指将目的基因在宿主中合成和表达的过程。宿主常用的是各种细胞表达体系，例如细菌表达体系(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)，酵母表达体系、动物细胞表达体系(昆虫细胞、人源细胞)，宿主也可以是无细胞表达体系，如细胞裂解液。这一过程在生物技术、分子生物学和药物研发等领域中具有重要作用，因为它允许人们制备大量的目标产物，特别是目标重组蛋白的表达，用于研究、治疗或工业应用。
然而，表达过程与宿主的相互作用，会造成一系列复杂的技术和生物学挑战：
a.表达过程的能量物质负担：当试图表达外源基因时，宿主必须分配能量和资源来满足表达需求。这会导致细胞负担的增加，可能限制细胞的正常生长和健康状态。
b.表达产物造成的宿主压力：这增加了表达基因的困难，因为必须在宿主正常活性和蛋白表达之间找到平衡。特别的，当宿主为细胞表达系统时，细胞生长会被抑制、甚至停止。根据机制分类，宿主压力的来源包括：
a)外源产物会占据宿主中的空间，从而非特异性地干扰正常生理活性过程，产生一般性压力(general stress)。
b)有一些产物具有特异性的毒性，即使在极低表达水平下也会对宿主造成损害。例如，目标产物为核酸酶，会切割、降解宿主中的DNA、RNA；目标产物为外源tRNA，会导致蛋白翻译错误。
c.宿主内环境下，表达产物无法成熟：目标产物的成熟过程需要特定的理化环境和生化反应，是宿主中可能不具备的，会导致目标产物不能正确成熟。例如：
a)过表达外源蛋白时，常常会发生错误折叠，这些错误折叠的蛋白可能不具备正常的生物活性，并倾向于聚集成为难溶的包涵体。
b)在大肠杆菌中表达具有二硫键的蛋白质的时候，由于大肠杆菌细胞质基质的还原性环境，二硫键无法形成，蛋白质不能正确折叠。
c)一些目标产物，需要后处理才能具有正确活性，比如酶原的剪切，抗体的糖基化，RNA的内含子切除，RNA编辑。
这些困难是表达中常见的挑战，研究人员一直在探索各种方法和策略，以克服这些问题，以实现高效和可控的蛋白表达。
本发明旨在应对挑战b(宿主压力)和c(产物成熟)，提供一种创新的方法来改善表达，为相关领域的研究和应用带来新的可能性。
在本发明中，我们解决2个主要挑战，即表达产物造成的宿主压力(例如毒性蛋白的表达)以及宿主内环境下，表达产物无法成熟(例如蛋白质错误折叠)。这些挑战在生物技术和分子生物学领域经常出现，限制了表达的效率和可行性。以下是一些与这两个挑战相关的情况和现有技术，这些方法通常需要复杂的工作，而且不一定成功，目前还没有较为普适的解决方案：
a.选择合适的宿主系统：针对目标基因的特质，选择最适合的宿主表达系统。例如，使用无细胞体系表达细胞毒性蛋白，使用人源细胞系表达人源抗体。针对有二硫键的蛋白质，可以使用大肠杆菌Shuffle等还原性酶缺失的突变菌株进行基因表达。但是许多宿主表达体系的使用成本和操作复杂度较高。而且这样的方法，仅适用于单基因表达，或若干性质相似的基因，而不能泛化到更复杂的DNA构建体的表达。
b.表达载体工程：例如选择适当的启动子、调节表达强度、使用增强子等，来调整表达量。然而，这些方法很难同时满足多个目标，例如弱启动子可以避免过高的表达水平从而避免包涵体的形成，但该方法无法实现外源蛋白的高效表达。而强启动子会导致细胞负担增加，从而限制了目标蛋白的高效表达。
c.表达条件优化：控制细胞培养条件，如温度、pH值、氧气供应等，以及使用诱导表达系统，并调试诱导的条件，可以对表达量产生影响。例如，针对容易错误折叠形成沉淀的蛋白，可以使用低温的表达条件，促进正确折叠。但是，在某些情况下，这些优化可能无法有效地改善表达。
d.代谢工程：通过改变宿主的代谢途径，可以提高目标产物的产量。
e.蛋白工程：对于毒性蛋白或易形成包涵体的蛋白，已经提出了一些方法，例如改变蛋白结构、调整表达速率、使用特定的标签或分割蛋白，以减轻其对细胞的不利影响。但这些方法可能会导致表达效率下降。
f.后处理：可以对宿主产生的无活性的目标产物进行纯化后变复性、切割、修饰，从而恢复到正确的结构。但是后处理是一个非常复杂且昂贵的过程，对许多目标产物并不适用。
但是目前没有通用的解决方案，能够兼顾高表达、低压力/毒性、正确折叠、表达后修饰。
现有技术一涉及表达载体和表达条件的优化。
现有技术一的技术方案如下：在现有技术一中，通常采用表达载体和表达条件的工程策略来优化表达。
表达载体：选择适当的启动子、表达载体和受控元件，来控制基因表达，以优化表达。这可以通过调整表达载体中的拷贝数、启动子的活性等方式来实现。
表达条件：调整培养条件，如温度、pH值、氧气供应和培养基成分，如果诱导表达载体，还包括调整诱导条件。通过改变表达条件，以改善表达效率，也可以改善蛋白的折叠和稳定性。
现有技术一具有如下缺点：虽然现有技术一在一定程度上可以优化表达，但缺少明确的理论指导，针对不同的目的基因需要做大量的试错，且不一定有效。
现有技术二涉及表达宿主的优化。
现有技术二的技术方案如下：
针对目标基因的特质，选择合适的宿主，进行表达，然后再匹配相应的后处理步骤。
例如，使用人源细胞系或者昆虫动物细胞，表达动物来源的蛋白质。优化宿主的代谢网络，以及转录、翻译系统，可以进一步提高表达，例如使用工程化改造的CHO细胞株用于抗体高表达生产，例如改造大肠杆菌内部的还原性环境获得的SHuffle菌株，可以用于含二硫键的蛋白质的生产。
例如，使用无细胞表达体系作为一种替代方案，以应对细胞表达中的困难。无细胞表达体系通常包括以下关键步骤：
①细胞裂解和制备细胞提取物：从细胞中提取细胞质和核酸物质，以获得含有细胞的基本生物分子的提取物。
②添加外源DNA或RNA：向提取物中添加目标蛋白的编码DNA或RNA，通常是由合成生物学方法合成的。
③翻译和蛋白质合成：在体外环境中，使用细胞提取物中的细胞机器，如核糖体、tRNA和氨基酸，将目标蛋白进行翻译和合成。
④蛋白质纯化和提取：从反应体系中纯化和提取目标蛋白质，通常使用亲和层析、凝胶电泳或其他分离技术。
⑤分析和确认：对蛋白质进行分析和确认，以确保其结构和功能符合预期。
现有技术二具有如下缺点：
a)操作复杂度高：不同宿主的转化、转染步骤有显著的区别，学习门槛较高，而且部分宿主，较难进行遗传操作和培养。
b)成本高：一些宿主系统的使用成本较高。例如哺乳动物细胞系，需要昂贵的血清培养，无细胞体系往往需要添加昂贵的外源因子，如能量物质、氨基酸、离子和蛋白质因子，以支持蛋白质的合成。
c)宿主可能只具备一些性质，而缺乏另一些所需性质：例如无细胞体系不受细胞毒性的影响，但是缺乏翻译后修饰限制，无细胞表达体系通常不能提供与细胞中相同水平的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等，这可能影响一些蛋白质的功能和稳定性；在无细胞体系中，蛋白质的表达水平可能相对不稳定，受到反应条件和组分浓度的影响。例如Shuffle菌株可以促进二硫键形成，但本身的生理活性和压力耐受也会因此下降。
d)单一宿主只适用于一系列性质相似的基因，而难以泛化到多基因共表达，以及更复杂的DNA构建体的表达。
CN112575016A公开了一种“原核生物中无膜细胞器的构建及其应用”，其利用重组蛛丝蛋白和类节肢弹性蛋白成功在大肠杆菌中构建了无膜区室，通过DNA重组技术将蛛丝蛋白或类节肢弹性蛋白与不同货物蛋白融合，实现目标功能蛋白的胞内共定位，以此构建具有生物活性的无膜区室。
WO2023015190A1中公开了一种通过合成细胞器控制哺乳动物细胞中的细胞过程的方法，其利用能进行液-液相分离(LLPS)的富精氨酸/甘氨酸(RGG)蛋白结构域融合高亲和力的螺旋标签(high-affinity coiled-coil tag)，富集同样融合有螺旋标签的内源蛋白，从而通过隔绝或释放内源蛋白来控制细胞的行为。
然而上述两个申请中，没有涉及到合成细胞器能够辅助目标基因产物/目标蛋白正确折叠的应用可能性，且已有数据也并不支持这样的结论。实际上，两个申请中的描述都明确表述目标蛋白本身能够正确表达并行使功能，其中CN112575016A描述为具有生物活性的蛋白，WO2023015190A1描述为内源蛋白，能够调节细胞功能。此外，CN112575016A中，目标蛋白与蛛丝蛋白和类节肢弹性蛋白通过融合方法连接，目标蛋白的折叠和成熟可能会被蛋白质聚集的过程干扰，且该性质难以被测量和调控。WO2023015190A1中，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞表达的蛋白质通常总是被适当修饰，因此表达产物直接就有功能。其缺点是操作技术难、费时、不经济。
原核表达体系如大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系,其优点是培养放大简单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺；缺点是表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰；表达的蛋白质常常形成不溶合性的包涵体，欲使其具有活性尚需要进行复杂的复性处理；在大肠杆菌表达体系不易获得大量的可溶合性蛋白质。
综上所述，尽管已经提出了一些方法来优化表达，但本发明旨在提供一种综合的、通用性更高的方法，能够同时解决上述挑战。这一创新将有助于推动相关领域的研究和应用，为更广泛的科研和工程应用提供新的可能性。
发明内容
本发明的主要目的是解决细胞表达中的2个关键技术问题，即，消除基因表达产物对宿主的压力和/或毒性，并为基因表达产物提供合适、可控的成熟环境，从而优化基因表达。
表达产物会对宿主的生理活动产生压力、甚至毒性。因此，本发明旨在宿主中分离表达产物和宿主原有的生理活性，从而解耦连外源表达对内源生理的影响。具体而言，表达产物会占据宿主中的空间，从而非特异性地干扰正常生理活性过程，产生一般性压力，可能对宿主的正常生理活性造成不利影响。因此，本发明旨在提供一种方法，可以显著增加基因表达，同时降低宿主压力，以实现高效表达。特别的，有一些产物具有特异性的毒性，即使在低表达水平下也会对宿主造成损害。特别的，当宿主是细胞系统时，表达这些基因通常会对细胞造成不利影响，甚至导致细胞死亡。本发明旨在提供一种方法，可以优化毒性产物的表达，减轻其对宿主的不利影响，同时保持高表达水平。
宿主内环境，会造成表达产物的错误成熟。目标产物的成熟过程需要特定的理化环境和生化反应，是宿主中可能不具备的，会导致目标产物不能正确成熟，产生失活的表达产物。例如，在表达外源蛋白，尤其是高效表达时，蛋白常会在宿主中折叠成不正确的三维结构，从而失去正常的生物活性，并形成难溶的聚集物。例如在大肠杆菌中，由于胞质内的还原环境，蛋白无法形成稳定的二硫键，故使用大肠杆菌生产的胰岛素原(proinsulin)一般以折叠错误的包涵体存在。本发明旨在提供一种方法，为表达产物提供与宿主内环境解耦连的成熟环境，在不破坏宿主原有生理的条件下，减少表达产物的错误成熟，从而高效获得有活性的目标产物。
综合而言，本发明旨在提供一种综合的、高效的方法，能够同时解决宿主压力、产物成熟的关键技术问题。通过解决这些问题，本发明的目标是为生物工程、药物研发、蛋白制备和其他相关领域的研究和应用提供更有效、更可行的解决方案，推动科学和技术的发展。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案：
本发明在宿主中构建合成细胞器，使得目的基因表达后，表达产物能够及时进入合成细胞器，从而实现：
1.消除对宿主的压力和/或毒性：从宿主中分离表达产物，减少了表达产物与宿主内其他分子的接触概率，不仅最大程度避免了该产物对宿主的影响，还可以通过降低宿主中产物的浓度从而改变基因表达的动力学平衡和反馈抑制，促进表达产物的生成。
2.为表达产物提供可控、合适的成熟环境：合成细胞器提供了一个与宿主内环境不同的、且可编程调控的正交环境，在该合成细胞器中富集的表达产物可以完成正确的折叠、修饰、剪切等成熟过程。
在一个方面，本发明提供了一种合成细胞器辅助的基因表达方法，其包括下述步骤：
a.在宿主中，构建合成细胞器，
b.使所述合成细胞器与基因表达产物共表达，所述基因表达产物能够定位至合成细胞器。
在一个实施方式中，所述宿主包括无细胞表达体系和细胞宿主，优选的是，原核细胞宿主，更优选的是，大肠杆菌。
在一个实施方式中，所述合成细胞器指人工设计的区室化结构，优选地，所述合成细胞器是无膜细胞器，是多肽和/或蛋白和/或DNA和/或RNA和/或核酸蛋白复合体在宿主中构建形成的生物分子凝聚体(biomolecular condensates)，优选的是，构建合成细胞器地生物大分子为连续重复10-1000次的核苷酸序列，例如三联体CAG，CCUG，GGGAA，GGGGCC等；连续重复3-500次的氨基酸序列，例如树脂蛋白样肽(resilin-like peptides，RLP)的重复；内在非结构区域，例如FUS蛋白，ParB蛋白；多元生物大分子的多聚化，例如PTB蛋白与UCUCU序列重复，人工设计的二元蛋白质二维结构，人工设计的二元RNA二维结构。
在一个实施方式中，所述基因表达产物为RNA、蛋白质、核酸蛋白复合物，或者是异源DNA编码合成的小分子，优选的是，重组蛋白质，例如，超折叠绿色荧光蛋白、限制性内切酶DpnI、限制性内切酶BsaI、人胰岛素原或ROR-alpha，优选的是，所述基因表达产物在所述合成细胞器中成熟。
在一个实施方式中，所述步骤b中，所述基因表达产物通过非特异性和/或特异性的结合定位至合成细胞器，优选地，使用特异性的受体/配体对，所述合成细胞器具有受体，所述基因表达产物连接有配体，使得所述合成细胞器能够特异性地结合所述基因表达产物，优选地，所述受体/配体对包括：互补配对的核酸分子；MS2、PP7、Qbeta等RNA噬菌体的衣壳蛋白和翻译操纵子RNA发卡；分裂蛋白的两段，例如裂绿色荧光蛋白、beta-半乳糖苷酶的alpha片段和omega片段，裂T7 RNA聚合酶。
在另一方面，本发明提供了一种DNA构建体，其包含引导宿主构建上述定义的合成细胞器的核苷酸序列1，和/或引导、调控所述基因表达产物生成的核苷酸序列2，优选地，DNA构建体由所述核苷酸序列1、2与质粒载体构成，所述质粒载体例如pACYC184，pACYC177，pET28a(+)、pET28b(+)、pET-5a(+)、pET43.1a、pET-37b(+)、pCDFDuet-1,pCOLADuet-1,pRSFDuet-1,pETDuet-1、pUC57、pUC19、pBAD，pBluescript II SK(+)、pTrcHis C、pTrcHisA、pTrcHis2C、pBV221、pQE-70、pCold III、pRSET-CFP、pRSET-BFP、pGFPuv、pKD46、pKD4、pTYB1、PinPoint Xa-2、pTWIN1、pRSET C、pSB1C3、pSB3C5、pSB4C5、pSB4K5，优选的是，上游启动子是常表达启动子或诱导型启动子。
在又一方面，本发明提供了一种表达系统，其包含上述DNA构建体，优选的是，所述表达系统指在原核细胞中同时构建所述合成细胞器、并生成所述基因表达产物的系统，更优选地，所述表达系统是大肠杆菌表达系统。
在又一方面，本发明提供了合成细胞器在消除基因表达对宿主的压力和/或毒性以及/或者将基因表达产物与宿主内环境解耦连的方面的应用，其包括使所述合成细胞器与基因表达产物在所述宿主中共表达，所述基因表达产物能够定位至合成细胞器。
在一个实施方式中，所述应用包括改善宿主的生理活性和耐受性、同等条件下的生物量、基因表达速率、细胞生长速率。
在另一个实施方式中，上述方法或应用包括促进所述基因表达产物的成熟，优选所述成熟包括以下中的一种或多种：生物大分子的折叠；表达后修饰，如二硫键形成，糖基化修饰，甲基化修饰，乙酰化修饰；切割、连接，如酶原切割活化，RNA剪切，内含肽介导的蛋白质剪切，自身环化；非共价组装，如二聚化，多聚化。
有益效果
本发明的技术方案带来了多个有益效果，旨在解决现有技术中存在的问题，并提供更高效、更可行的方法来消除表达产物对宿主的压力和/或毒性，并为表达产物提供合适、可控的成熟环境，从而优化基因表达。以下是本发明技术方案的一些有益效果：
①高产量：本发明的技术方案能够在提高表达量的同时，而不引起宿主负担的增加。这意味着可以实现更高产量的表达产物，从而满足工业和研究应用中对高表达的需求。
②降低毒性产物的不利影响：本发明的方法能够优化毒性产物的表达，减轻其对宿主的不利影响。这可以改善宿主健康，降低死亡率，并有助于生产更多的对宿主有毒的表达产物，在药物研发和生物工程中具有重要作用。
③减少错误折叠：本发明的方法能够避免外源蛋白在胞质中形成错误折叠，并减少包涵体等难溶物的生成。
④提供正确修饰的环境：本发明的方法能够为产物的表达后修饰提供一个合适的环境，例如二硫键形成。
⑤高表达一致性：本发明的技术方案可以提供更一致的蛋白表达效果，减少批次之间的差异。这有助于稳定的实验结果和可重复的生产过程。
⑥资源效益：通过减少能量和细胞资源的浪费，本发明的方法可以提高表达效率，降低研究和生产成本。
⑦广泛适用性：与一些现有方法仅适用于特定类型的蛋白或细胞系统不同，本发明的技术方案具有广泛的适用性，适用于各种蛋白质和细胞类型。
综合而言，本发明的技术方案旨在提供一个综合的、高效的方法，以解决细胞表达中的关键问题，为科学研究、生物制药和其他相关领域的应用提供更可行、更高效的解决方案。这些有益效果将促进技术的发展，并为生物科学领域的创新和进步提供了新的机会。
附图说明
图1显示三种表达条件下大肠杆菌(E.coli)的生长曲线，蓝线色曲线表示无GFP表达时的生长曲线，绿色表示仅诱导表达tdMCP-GFP的生长曲线，红色表示同时共表达了tdMCP-GFP和rCAG细胞器后的生长曲线，竖线显示标准差std，横轴表示生长时间，纵轴表示600nm吸光值。
图2显示目的蛋白为DpnI时的凝胶电泳图像。其中，M表示蛋白质标记物(marker)，P：不可溶沉淀产物，S:纯化后的可溶性蛋白产物，红色星号标记DpnI蛋白(30kDa)。
图3显示目的蛋白BsaI酶时的凝胶电泳图像。其中，M表示蛋白质标记物，P：不可溶沉淀产物，S:纯化后的可溶性蛋白产物，红色星号标记BsaI蛋白(～60kDa)，蓝色星号标记切割前的tdMCP-BsaI。
图4显示目的蛋白为胰岛素原(proinsulin)时的凝胶电泳图像。其中，M表示蛋白质标记物，P：不可溶沉淀产物，S:纯化后的可溶性蛋白产物，红色星号标记胰岛素原蛋白(12kDa)。
图5显示目的蛋白为ROR-alpha时的凝胶电泳图像。其中，M为蛋白标记物；S:纯化后的可溶性蛋白产物，红色星号标记ROR-alpha蛋白(～60kDa)。
具体实施方式
以下将更详细得描述本发明。
1.合成细胞器
细胞一般具有复杂的空间组织，其中一种空间组织方式被称为区室化(compartmentalizaiton)，即在细胞内形成的空间组织结构，用于执行特定的功能和生化反应。这类区室化结构，也常常被称为细胞器(organelle)，其之于细胞，类比器官之于个体。
细胞器或者是单独封闭在自身的脂质双分子层中，称为膜细胞器(membrane-bound organelle)，例如线粒体、叶绿体等细胞器；或者是空间上独立的功能单元，周围没有脂质双分子层，称为无膜细胞器(membraneless organelle)，也是光学显微镜下可观察的区室，2009年，Hyman和Brangwynne发现并揭示了，无膜细胞器由细胞内由生物大分子通过相分离(phase separation)形成(1.C.P.Brangwynne et al.,Germline P granulesare liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation.Science 324,1729-1732(2009))。
合成细胞器(synthetic organelle)，是一种创新性的生物工程概念，也称“类细胞器结构”(organelle-like structure)、“人工合成细胞器”、“人造细胞器”(artificialorganelle)。合成细胞器旨在设计和构建与自然界细胞器类似的微小功能单元，用于在细胞内(或体外试管环境中)实现区室化，应用于控制生物合成、代谢途径或其他生物学过程。合成细胞器的构建涉及将外源DNA构建体导入宿主细胞，这些外源DNA，包括外源编码基因，非编码DNA，调控元件等，用于引导无细胞表达体系或宿主细胞，合成特定的多肽、蛋白质、DNA、RNA、酶或其他生物分子。其中一部分分子起到构建合成细胞器结构的作用，而另一部分分子则行使合成细胞器的预设功能，如生物催化、受体识别、蛋白质分选等。合成细胞器的构建可以通过蛋白质、DNA、RNA的异源多聚体自组装形成，也可以通过改造细胞的膜结构形成。自无膜细胞器的相分离机制被揭示后，合成细胞器的构建也可以通过能够发生相分离的生物大分子聚集形成。
本发明提供了利用合成细胞器将基因表达产物与宿主内环境解耦连的方法。合成细胞器可基本上由多肽和/或蛋白和/或DNA和/或RNA和/或核酸蛋白复合体构建形成，例如，重复三联核糖核酸(CAG)n在细胞内转录后通过液-液相分离(liquid-liquid phaseseparation)自发聚集形成RNA凝聚体/液滴(RNA condensates/droplets)。合成细胞器也可以根据目标产物的特点，包含其他物质，例如，表达φ6噬菌体的P9和P12蛋白可以募集脂质分子形成膜结构。
构建合成无膜细胞器的生物大分子组分选自下述组：连续重复10-1000次的核苷酸序列，例如三联体CAG，CCUG，GGGAA，GGGGCC等；连续重复3-500次的氨基酸序列，例如树脂蛋白样肽(resilin-like peptides，RLP)的重复；内在非结构区域，例如FUS蛋白，ParB蛋白；多元生物大分子的多聚化，例如PTB蛋白与UCUCU序列重复，人工设计的二元蛋白质二维结构，人工设计的二元RNA二维结构。
当然，本发明的合成细胞器，也可以由其他序列的多肽和/或蛋白和/或DNA和/或RNA和/或核酸蛋白复合体构建形成，例如：
·RNA：
重复三联核糖核酸，例如(CAG)n、(GGU)n、(AUG)n、(CGG)n、(GUU)n、(CGU)n、(AUU)n、(ACG)n、(AAU)n、(AUC)n、(CCG)n、(AGC)n、(AGU)n、(ACU)n，其中n为10～1000；
重复四联核糖核酸，例如(CCUG)n，其中n为10～1000；
重复五联核糖核酸，例如(GGGAA)n，其中n为10～1000；
重复六联核糖核酸，例如GGGGCC(rGGGGCC),即(GGGGCC)n，(AGGGCC)n、(GGAGCC)n、(GGGGAC)n、(AGGACC)n，其中n为10～1000；
一元合成RNA脚手架，例如(下划线与加粗的“XX--XX”代表可插入行使功能的核酸适配体或核酶的位点)：GGGTAGGCGCCTAGCCTAATGTACATTAAGTTATTTTTCCGGATGAATAGAATATATTCTAATAACGCAGGXX--XXCCTCGAATACGAGCTGGGXX--XXCCCAGGAAGTGTTCGCACTTCTCTCGTATTCGATTGCGACTAGT；
二元合成RNA脚手架，例如(下划线与加粗的“XX--XX”代表可插入行使功能的核酸适配体或核酶的位点)：d2-1GGGTCAGGAATCCTCCTGATAGCTATTTGGACAATTACGTACGTAGTTGATGACAACTACATGAAAATAAGGGXX--XXCCCTCTAGA与d2-2GGGTAGTTGTTATGGATTCCTGATTTATGGGXX--XXCCACTAGT；
·DNA：
与上述RNA序列相同的ssDNA序列；
能够形成纳米聚合物的ssDNA，例如下述四种ssDNA的纳米聚合物(下划线的“XX--XX”代表可插入行使功能的核酸适配体或核酶的位点)：oligo-1TGCGCAATCCCXX--XXCTTGAGCACGCCAACATCACCGTATTT，oligo-2GCGGCTAGCAGAGCATTCGGGAXX--XXGACTATGGCTGTATTT，oligo-3GGCGTGCTCACXX--XXTCGGATTGCGCATGCTAGCCGCTATTT，oligo-4CGGTGATGTTCAGCCATAGTAGXX--XXGCCGAATGCTCTATTT等；
·蛋白质：
自组装的蛋白质纳米颗粒和纳米结构，例如：羧酶体(Carboxysomes)壳蛋白；代谢体(Metabolosomes)壳蛋白；细菌微区室(bacterial microcompartment，BMC)壳蛋白BMC-H，BMC-T，和BMC-P；苍黄海无柄孢囊粘细菌(Haliangium ochraceum)细菌微区室衣壳蛋白T1(HO BMC Shell T1)；海栖热袍菌(Thermotoga maritima)封装蛋白EncTm；混合噬菌体Qβ病毒样颗粒；铁蛋白(Ferritin)；人工合成蛋白质纳米笼(nanocage)，如抗体Fc纳米笼；人工合成蛋白质自组装纤维，如CC-Di-B–PduA蛋白；人工合成蛋白质自组装二维结构；人工合成蛋白质自组装三维结构，如ATC-HL3蛋白；
内在非结构蛋白(intrinsically disordered protein，IDP)，例如：树脂蛋白样肽(resilin-like peptides，RLP)；弹性蛋白样肽(Elastin-like peptides，ELP)；RNA螺旋酶LAF-1RGG结构域重复；RNA螺旋酶DDX4；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)核酸酶E(RNaseE)；IDP同源蛋白序列(GRGDSPYS)n，以及突变体(GRGDSPYSGRGDSPYSGRGDSPYSGRGDSPVS)n，(GRGDSPYSGRGDSPVS)n，其中n为3-500；ParB蛋白质；FUS蛋白质；IbpA蛋白；PopZ蛋白；PodJ蛋白；保守核极蛋白纤维蛋白FIB-1；
蛋白淀粉样沉淀，例如：AEAEAKAKAEAEAKAK，LELELKLKLELELKLK，人源的b-淀粉样蛋白肽Ab42(F19D)；
其他会产生聚集化的蛋白质，例如：大肠杆菌(E.coli)beta-半乳糖苷酶；麦芽糖结合蛋白突变体MalE31；纤维素梭菌(Clostridium cellulovorans)纤维素结合域蛋白(CBD)；热梭菌(Clostridium thermocellum)内切葡聚糖酶D(EGD)；布鲁氏菌(Brucellaabortus)来源的下述蛋白与荧光蛋白的融合蛋白，PdhS-mCherry，FumC-YFP，DivK-YFP；大肠杆菌(E.coli)来源的下述蛋白与荧光蛋白的融合蛋白，ClpX-sfGFP，ClpP-sfGFP，ClpP-mCherry，ClpX-mCherry，ClpX-mCherry2，ClpX-Venus，LacZ-Dronpa，TetR-Dronpa，P22C2-Dronpa，HKCI-Dronpa；串联重复SH3(polySH3)与串联重复PRM(polyPRM)；串联重复SIM(polySIM)与串联重复SUMO(polySUMO)；五聚核极蛋白Npm1等；
·核酸蛋白多聚化复合物：
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)以及RNA结合蛋白形成的聚集体，其中核酸脚手架例如：旁斑中的哺乳动物核旁斑组装转录物1同种型2(mammaliannuclear paraspeckle assembly transcript 1isoform 2)；类淀粉小体中的基因间间隔区lncRNA；核应激体中的人卫星III(SatIII)lncRNA；果蝇热休克RNA(Hsr)ω；裂殖酵母meiRNA；RNA结合蛋白例如：PTB蛋白；FUS蛋白；组蛋白BRD4
多肽序列与聚核苷酸，例如多肽RRASLRRASL与分子量在600–1,000kDa的聚尿苷酸(polyuridylic acid，polyU)；合成多肽RP3、SR8和polyU等。
合成细胞器既可以是完全由外源DNA构建体引导宿主合成的生物分子构建而成，也可以由部分外源分子结合宿主内源分子构建而成，也可以对宿主中原有的内源细胞器或细胞骨架结构改造而成，例如，EP 19157257.7公开的一种使用合成细胞器实现密码子扩展的方法中，合成细胞器由外源表达的PylRS::FUS::KIF16B1-400融合蛋白、MCP::EWSR1::KIF16B1-400融合蛋白与内源的微管细胞骨架结构共同形成。
2.合成细胞器与目标产物的共定位
细胞器一般具有选择透过性和对生物分子分选的性质，因此在细胞器的区室内的生物分子构成以及物理化学性质明显得差异于细胞器外的组分(例如细胞质基质)，从而使得细胞器能够行使特使的功能。
本发明中，目标产物可以通过非特异性和/或特异性的结合定位至人工细胞器，优选地，使用特异性的受体/配体对，可以根据需要对受体和配体二者进行选择，例如，在一个例中，被招募的配体是串联二聚体MS2衣壳蛋白(tandem-dimer MS2 coat protein，tdMCP)，受体为MS2发卡RNA适体(MS2 hairpin RNA aptamer)，也可以根据需要使用其他配体/受体对，例如：
·任意序列互补配对的核酸分子；
·RNA结合蛋白与对应的RNA，例如：
οRNA噬菌体的衣壳蛋白和翻译操纵子RNA发卡，RNA噬菌体包括MS2、PP7、Qbeta等；
οDNA噬菌体的蛋白N和B盒(boxB)RNA发卡，DNA噬菌体包括λ、21、P22等；
οCRISPR Cas蛋白和CRISPR RNA发卡，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA14菌株来源的Csy4(Cas6f)与PA14 RNA发卡；
ο其他结合配对，例如PUF-8和5′-UGUANAUA-3′；FBF-2和5′-UGURNNAUA-3′；蛋白A与蛋白A结合适体；古细菌RNA结合蛋白L7Ae与RNA C/D盒等；
·DNA结合蛋白与对应的DNA，例如：TetR与tetO操纵子；cI阻遏蛋白与cI操纵子；Gal4与对应的DNA；Zif268 DNA结合域与GATGCTGCA序列；Gli-1 DNA结合域与GACCACCCAAGACGA序列；LexA DNA结合域与CTGTATATATATACAG序列；类转录激活剂(Transcription activator-like，TAL)结构域与对应的DNA；
·同源二聚体或多聚体，例如：可逆绿色荧光蛋白Dronpa；
·裂蛋白(split protein)，例如：断裂荧光蛋白，例如断裂绿色荧光蛋白GFP1-10和GFP11；断裂β-半乳糖苷酶(splitβ-galactosidase)；断裂T7聚合酶(split T7polymerase)；断裂酯酶(split esterase)；断裂TEV蛋白酶(split TEV protease)；断裂二氢叶酸还原酶(split dihydrofolate reductase)；断裂β-内酰胺酶(splitβ-lactamase)；断裂萤火虫荧光素酶(split firefly luciferase)；断裂胸苷激酶(split thymidinekinase)；断裂分支酸变位酶(split chorismate mutase)；断裂CRISPR-Cas9；断裂辣根过氧化物酶(split horseradish peroxidase)等；
·抗原和特异性抗体，例如：His标签与anti-his抗体；flag标签与anti-flag抗体；HA标签与anti-HA抗体；Myc标签与anti-Myc抗体；GST蛋白与anti-GST抗体；
·其他蛋白-蛋白结合配对，例如：SYNZIP肽对；SZ17和SZ18配对；Fos和Jun配对；拟南芥(Arabiodopsis thaliana)光敏素B(PhyB)和PIF3蛋白或PIF6蛋白；
当然，受体和配体也不必要是二分子之间的配对，也可以由多组分之间形成复杂多元复合物，例如CRISPR-Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA、与crRNA靶向DNA的四元复合物；FKBP蛋白、FRB蛋白和雷帕霉素(rapamycin)的三元复合物。
在合成细胞器中，受体可以与构建合成细胞器结构的组分共价连接，例如，在一个实施例中，受体MS2发卡RNA适体与构建合成细胞器结构的CAG重复核苷酸，构成融合RNA分子，例如，在另一个实施例中，受体dCsy4与构建合成细胞器结构的蛋白A，构成融合蛋白质分子。当然，受体也可以通过非共价的分子间相互作用，组装进入于合成细胞器中。例如，构建合成细胞器结构的CAG重复核苷酸与MS2发卡RNA适体融合，MS2发卡RNA适体非共价结合tdMCP-His tag，His tag非公家结合anti-His antibody和PhyB的融合蛋白，则PhyB作为受体，合成细胞器可以特异性地结合连接有配体PIF3或PIF6的蛋白。所述合成细胞器中可以拥有一个到多个不同性质的受体。
配体与表达产物的连接可以是共价连接，例如，在一个实施例中，配体tdMCP与目标产物绿色荧光蛋白，构成融合蛋白。当然，配体也可以通过非共价的分子间相互作用，连接目标产物。例如，通过分子间相互作用，目标产物Dronpa145N突变体能和配体tdMCP-Dronpa145K，形成异源二聚体，后者可以被具有MS2发卡RNA的合成细胞器特异性募集。所述目标产物也可以连接一个到多个配体。
3.基因表达产物
本发明中涉及的基因表达产物，可以是RNA、蛋白质、核酸蛋白复合物，或者是异源DNA编码合成的小分子，优选的是重组蛋白质，例如超折叠绿色荧光蛋白、限制性内切酶DpnI、限制性内切酶BsaI、人胰岛素原、ROR-alpha、红色荧光蛋白mKate2、T4 DNA连接酶、人工设计多肽；或重组RNA，例如大肠杆菌16S rRNA；或DNA，例如重组质粒、单链DNA；或重组大分子与内源大分子形成的复合物，例如重组表达的16S rRNA与内源核糖体蛋白组装形成的30S核糖体亚基；或有别于所述合成细胞器的其他细胞结构，例如细胞骨架、其他细胞器。
4.DNA构建体
本发明在宿主中导入人工设计的DNA构建体(DNAconstruct)。DNA构建体是包含多个编码基因、非编码DNA、调控元件等的聚核苷酸。
DNA构建体能够引导宿主构建合成细胞器。例如，在一个实施例，合成细胞器由CAG三联核苷酸重复的RNA分子构建而成，则DNA构建体包含表达该RNA分子的核苷酸序列，包括CAG三联核苷酸重复序列、转录终止子、以及调控诱导表达的启动子。
本发明中涉及的DNA构建体可以是一个或多个质粒、粘粒、人工染色体，也可以整合在宿主基因组中的单个或多个位点，以及上述方案的排列组合。优选地，DNA构建体是质粒，由所述引导宿主构建合成细胞器以及生产目标产物的核苷酸序列与质粒载体构成。其中上游启动子可以为常表达启动子或诱导型启动子。质粒载体可以是商用载体，如pACYC184，pACYC177，pET28a(+)、pET28b(+)、pET-5a(+)、pET43.1a、pET-37b(+)、pCDFDuet-1,pCOLADuet-1,pRSFDuet-1,pETDuet-1、pUC57、pUC19、pBAD，pBluescript II SK(+)、pTrcHis C、pTrcHis A、pTrcHis2C、pBV221、pQE-70、pCold III、pRSET-CFP、pRSET-BFP、pGFPuv、pKD46、pKD4、pTYB1、PinPoint Xa-2、pTWIN1或pRSET C，或商用载体的改造结构，或者非商用载体，例如pSB1C3、pSB3C5、pSB4C5、pSB4K5，或者是人工设计的其他能够在宿主细胞中稳定复制的核苷酸序列。
5.表达系统
将上述DNA构建体引入宿主中进行表达，引导宿主构建合成细胞器，和/或调控宿主生产所述目标产物。表达系统可以是无细胞表达系统和/或细胞表达系统。其中细胞表达系统包括原核细胞与真核细胞，真核细胞例如酵母、真菌细胞、动物细胞或者植物细胞，或者原核生物细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌、链霉菌。原核生物表达系统具有细胞繁殖快速、培养成本低、产量高等优点，是优选的，其中更优选大肠杆菌。
6.将基因表达产物与宿主内环境解耦连的方法
本发明提供了一种利用合成细胞器将基因表达产物与宿主内环境解耦连的方法其包括下述步骤：
a.在宿主中，构建合成细胞器，
b.将基因表达产物定位至合成细胞器，使所述合成细胞器与基因表达产物共表达。
更具体而言，所述步骤a指，向宿主中导入DNA构建体，引导宿主构建合成细胞器；所述步骤b指将基因表达产物定位至合成细胞器，使所述合成细胞器与基因表达产物共表达；优选地，步骤a和b为单一宿主细胞中同时构建合成细胞器，生物合成目标产物，以及目标产物被合成细胞器特异性富集的过程。
7.应用
本发明的用途主要在于两个方面，一方面在于改善表达产物对宿主的影响，包括改善宿主的生理活性和耐受性、同等条件下的生物量、基因表达速率、细胞生长速率。例如，在一个实施例中，使用合成细胞器，可以消除sfGFP基因表达造成的一般性的宿主压力。例如，在另一个实施例中，使用合成细胞器可以避免N端结合的毒性蛋白表达。
另一方面在于避免宿主内环境对表达产物的影响，包括促进所述基因表达产物的成熟，优选地，生物大分子的折叠；表达后修饰，如二硫键形成，糖基化修饰，甲基化修饰，乙酰化修饰；切割、连接，如酶原切割活化，RNA剪切，内含肽介导的蛋白质剪切，自身环化；非共价组装，如二聚化，多聚化。例如，在一个实施例中，使用合成细胞器提供了二硫键的生成环境从而降低蛋白质错误折叠。例如，在另一个实施例中，使用合成细胞器促进了ROR-alpha的折叠，获得可溶性蛋白，
因此，本发明提供了一种通用的解决方案，能够兼顾高表达、低压力/毒性、正确折叠、表达后修饰。
实施例
实施例1.GFP实例
系统设计
本实例中表达，超折叠绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescentprotein，sfGFP)，是一种被广泛使用的荧光蛋白标签，一般认为不具有细胞毒性。本例中构成合成细胞器的分子为46个CAG重复的RNA片段，该RNA可以通过相互作用产生液液相分离。本例通过串联二聚体MS2衣壳蛋白(tandem-dimer MS2 coat protein，tdMCP)作为配体，MS2 RNA发卡作为受体，富集超折叠绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescentprotein，sfGFP)。tdMCP分别通过蛋白融合铰链(fusion linker)连接至sfGFP的N-端和C-端。本例所对应的表达载体为pET28a，对应筛选抗性为卡那霉素抗性。
实验流程
将pGFP和prCAG-MS2共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(全式金)。每个蛋白对应挑取3个单克隆，在37℃、220rpm震荡培养16小时。过夜菌分别在96孔板和100mL摇瓶两种条件下，稀释200倍并培养3小时后，加入诱导剂至0.5mM异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)(生工)、150ng/ml盐酸脱水四环素(aTc)(百灵威)，并诱导表达、培养过夜约12小时。其中96孔板在tecan spark酶标仪中培养的同时过夜读数测量生长曲线。并诱导表达、培养过夜约12小时。
结果
结果如图1所示，表明共表达合成细胞器，能够显著地提高宿主细胞的生长。这说明使用合成细胞器，能够消除基因表达造成的一般性的宿主压力。
序列详情
其中，sfGFP的大小：26kDa，蛋白序列如以下SEQ ID NO:1所示：
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHG(SEQ ID NO:1)。
rCAG-MS2的RNA序列如以下SEQ ID NO:2所示：
cagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagagacggagcucgucgacgcggccgcaagcuugguaccgagcucggauccuaagguaccuaauugccuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaggucgacucuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaguauucccggguucauuagauccuaagguaccuaauugccuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaggucgacucuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaguauucccggguucauuagauccuaagguaccuaauugccuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaggucgacucuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaguauucccggguucauuagauccuaagguaccuaauugccuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaggucgacucuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaguauucccggguucauuagauccuaagguaccuaauugccuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaggucgacucuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaguauucccggguucauuagauccuaagguaccuaauugccuagaaaacaugaggaucacccaugucugcaggucgacucuagaaaacaugaggaucacccaugu(SEQ ID NO:2)
tdMCP的蛋白序列如以下SEQ ID NO:3所示：
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYANFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY(SEQ ID NO:3)
实施例2.DpnI实例
系统设计
本实例中表达，切割具有6mA甲基化GATC的DNA链的限制性核酸内切酶DpnI，对常见的大肠杆菌表达宿主具有致死性。本例中构成合成细胞器的分子为46个CAG重复的RNA片段，该RNA可以通过相互作用产生液液相分离。本例通过串联二聚体MS2衣壳蛋白(tandem-dimer MS2 coat protein，tdMCP)作为配体，MS2RNA发卡做为受体，富集识别并切割具有6mA甲基化GATC的DNA链的限制性核酸内切酶DpnI。tdMCP分别通过蛋白融和铰链(fusionlinker)连接至DpnI的N-端，其中融合铰链使用可受二价镍离子诱导自切割的SNAC-tag。本例所对应表达载体为pET28a，对应筛选抗性为卡那霉素抗性。
实验流程
将pET28a-DpnI和prCAG-MS2共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(全式金)。每个蛋白对应挑取3个单克隆，在37℃、220rpm震荡培养16小时。过夜菌稀释200倍并培养3小时后，加入诱导剂至0.5mM异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)(生工)、150ng/ml盐酸脱水四环素(aTc)(百灵威)，并诱导表达、培养过夜约12小时。将pET28a-DpnI和prCAG-MS2共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(全式金)。每个蛋白对应挑取3个单克隆，在37℃、220rpm震荡培养16小时。过夜菌稀释200倍并培养3小时后，加入诱导剂至0.5mM异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)(生工)、150ng/ml盐酸脱水四环素(aTc)(百灵威)，并诱导表达、培养过夜约12小时。取菌液离心并去上清。向沉淀中加入裂解液(一步法裂菌试剂盒，生工)，吹打混匀，室温反应30min，然后离心，弃上清，回收沉淀。将上一步所获得的沉淀中加入含镍离子的切割洗脱剂，并置于旋转混匀仪上室温切割。将进行切割反应后的样本离心，回收上清液，即含有目标产物蛋白的溶液。使用SDS PAGE电泳检测(SurePAGETM，金斯瑞)，用于验证目标蛋白的可溶性，并评估回收蛋白的表达量。
结果
结果如图2所示，DpnI在大肠杆菌宿主中实现了大量的可溶性表达。说明合成细胞器充分地募集了细胞质基质中表达的DpnI，使大肠杆菌宿主能够在过表达DpnI的情况下，仍然有效地繁殖达到足够的生物量，从而提高DpnI的总产量。这说明使用合成细胞器和N端结合的毒性蛋白的共表达，能够消除毒性蛋白对宿主的毒性。
序列详情
其中，DpnI的蛋白序列如以下SEQ ID NO:4所示：
MELHFNLELVETYKSNSQKARILTEDWVYRQSYCPNCGNNPLNHFENNRPVADFYCNHCSEEFELKSKKGNFSSTINDGAYATMMKRVQADNNPNFFFLTYTKNFEVNNFLVLPKQFVTPKSIIQRKPLAPTARRAGWIGCNIDLSQVPSKGRIFLVQDGQVRDPEKVTKEFKQGLFLRKSSLSSRGWTIEILNCIDKIEGSEFTLEDMYRFESDLKNIFVKNNHIKEKIRQQLQILRDKEIIEFKGRGKYRKL(SEQ ID NO:4)
SNAC-tag蛋白序列如以下SEQ ID NO:5所示：
GSHHW(SEQ ID NO:5)
实施例3.BsaI实例
系统设计
本实例中表达，特异性识别GGTCTC并切割DNA链的限制性内切酶BsaI，对常见的大肠杆菌宿主具有毒性。本例中构成合成细胞器的分子为46个CAG重复的RNA片段，该RNA可以通过相互作用产生液液相分离。本例通过串联二聚体MS2衣壳蛋白(tandem-dimer MS2coat protein，tdMCP)作为配体，MS2 RNA发卡做为受体，富集识别并切割DNA链的限制性核酸内切酶BsaI。tdMCP分别通过蛋白融和铰链(fusion linker)连接至BsaI的N-端，其中融合铰链使用可受二价镍离子诱导自切割的SNAC-tag。本例所对应表达载体为pET28a，对应筛选抗性为卡那霉素抗性。
实验流程
将pET28a-tdMCP-BsaI和prCAG-MS2共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(全式金)。每个蛋白对应挑取3个单克隆，在37℃、220rpm震荡培养16小时。过夜菌稀释200倍并培养3小时后，加入诱导剂至0.5mM异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)(生工)、150ng/ml盐酸脱水四环素(aTc)(百灵威)，并诱导表达、培养过夜约12小时。取菌液离心并去上清。向沉淀中加入裂解液(一步法裂菌试剂盒，生工)，吹打混匀，室温反应30min，然后离心，弃上清，回收沉淀。将上一步所获得的沉淀中加入含镍离子的切割洗脱剂，并置于旋转混匀仪上室温切割。将进行切割反应后的样本离心，回收上清液，即含有目标产物蛋白的溶液。使用SDSPAGE电泳检测(SurePAGETM，金斯瑞)，用于验证目标蛋白的可溶性，并评估回收蛋白的表达量。
结果
结果如图3所示，BsaI在大肠杆菌宿主中实现了大量的可溶性表达。说明合成细胞器充分地募集了细胞质基质中表达的BsaI，使大肠杆菌宿主能够在过表达BsaI的情况下，仍然有效地繁殖达到足够的生物量，从而提高BsaI的总产量。这说明使用合成细胞器和N端结合的毒性蛋白的共表达，能够消除毒性蛋白对宿主的毒性。
序列详情
其中，BsaI的蛋白序列如以下SEQ ID NO:6所示：
MGKKAEYGQGHPIFLEYAEQIIQHKEYQGMPDLRYPDGRIQWEAPSNRKSGIFKDTNIKRRKWWEQKAISIGIDPSSNQWISKTAKLIHPTMRKPCKKCGRIMDLRYSYPTKNLIKRIRKLPYVDESFEIDSLEHILKLIKRLVLQYGDKVYDDLPKLLTCKAVKNIPRLGNDLDTWLNWIDSVYIPSEPSMLSPGAMANPPDRLDGFHSLNECCRSHADRGRWEKNLRSYTTDRRAFEYWVDGDWVAADKLMGLIRTNEQIKKETCLNDNHPGPCSADHIGPISLGFVHRPEFQLLCNSCNSAKNNRMTFSDVQHLINAENNGEEVASWYCKHIWDLRKHDVKNNENALRLSKILRDNRHTAMFILSELLKDNHYLFLSTFLGLQYAERSVSFSNIKIENHIITGQISEQPRDTKYTEEQKARRMRIGFEALKSYIEKENRNALLVINDKIIDKINEIKNILQDIPDEYKLLNEKISEQFNSEEVSDELLRDLVTHLPTKESEPANFKLARKYLQEIMEIVGDELSKMWEDERYVRQTFADLD(SEQ ID NO:6)
实施例4.proinsulin实例
实验设计
本实例中表达，人胰岛素原(proinsulin)，具有2个二硫键，在常见的大肠杆菌宿主中表达，会由于无法形成二硫键，导致形成不可溶的包涵体沉淀。本例中构成合成细胞器的分子为46个CAG重复的RNA片段，该RNA可以通过相互作用产生液液相分离，并通过隔绝大肠杆菌本身为细胞质基质提供还原性势能的酶，而维持氧化环境。本例通过串联二聚体MS2衣壳蛋白(tandem-dimer MS2 coat protein，tdMCP)作为配体，MS2 RNA发卡做为受体，富集胰岛素原(proinsulin)。tdMCP通过蛋白融和铰链(fusion linker)连接至proinsulin的N-端，其中融合铰链使用可受二价镍离子诱导自切割的SNAC-tag。本例所对应表达载体为pET28a，对应筛选抗性为卡那霉素抗性。
实验流程
将pET28a-tdMCP-proinsulin和prCAG-MS2共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(全式金)。每个蛋白对应挑取3个单克隆，在37℃、220rpm震荡培养16小时。过夜菌稀释200倍并培养3小时后，加入诱导剂至0.5mM异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)(生工)、150ng/ml盐酸脱水四环素(aTc)(百灵威)，并诱导表达、培养过夜约12小时。取菌液离心并去上清。向沉淀中加入裂解液(一步法裂菌试剂盒，生工)，吹打混匀，室温反应30min，然后离心，弃上清，回收沉淀。将上一步所获得的沉淀中加入含镍离子的切割洗脱剂，并置于旋转混匀仪上室温切割。将进行切割反应后的样本离心，回收上清液，即含有目标产物蛋白的溶液。使用SDS PAGE电泳检测(SurePAGETM，金斯瑞)，用于验证目标蛋白的可溶性，并评估回收蛋白的表达量。
结果
结果如图4所示，人胰岛素原在大肠杆菌宿主中实现了可溶性表达。这说明合成细胞器提供二硫键生成环境，减少蛋白质错误折叠，促进了人胰岛素原的折叠和二硫键形成，获得可溶性的人胰岛素原。
序列详情
其中，人胰岛素原的蛋白序列如以下SEQ ID NO:7所示：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:7)
实施例5.ROR-alpha实例
实验设计
本实例中表达，ROR-alpha，是人源的一种细胞核受体，该蛋白不存在特殊的修饰，但容易产生错误折叠，在常见的大肠杆菌宿主中表达会形成不可溶的包涵体沉淀。本例中构成合成细胞器的分子为46个CAG重复的RNA片段，该RNA可以通过相互作用产生液液相分离。本例通过串联二聚体MS2衣壳蛋白(tandem-dimer MS2 coat protein，tdMCP)作为配体，MS2 RNA发卡做为受体，富集ROR-alpha。tdMCP通过蛋白融和铰链(fusion linker)连接至ROR-alpha的N-端。本例所对应表达载体为pET28a，对应筛选抗性为卡那霉素抗性。
实验流程
将pET28a-tdMCP-ROR-alpha和prCAG-MS2共同转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(全式金)。每个蛋白对应挑取3个单克隆，在37℃、220rpm震荡培养16小时。过夜菌稀释200倍并培养3小时后，加入诱导剂至0.5mM异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)(生工)、150ng/ml盐酸脱水四环素(aTc)(百灵威)，并诱导表达、培养过夜约12小时。取菌液离心并去上清。向沉淀中加入裂解液(一步法裂菌试剂盒，生工)，吹打混匀，室温反应30min，然后离心，弃上清，回收沉淀。将上一步所获得的沉淀中加入含镍离子的切割洗脱剂，并置于旋转混匀仪上室温切割。将进行切割反应后的样本离心，回收上清液，即含有目标产物蛋白的溶液。使用SDS PAGE电泳检测(SurePAGETM，金斯瑞)，用于验证目标蛋白的可溶性，并评估回收蛋白的表达量。
结果
结果如图5所示，人ROR-alpha在大肠杆菌宿主中实现了可溶性表达。这说明合成细胞器减少蛋白质错误折叠，促进了ROR-alpha的折叠，获得可溶性蛋白。
序列详情
其中，人ROR-alpha的蛋白序列如以下SEQ ID NO:8所示：
AELEHLAQNISKSHLETCQYLREELQQITWQTFLQEEIENYQNKQREVMWQLCAIKITEAIQYVVEFAKRIDGFMELCQNDQIVLLKAGSLEVVFIRMCRAFDSQNNTVYFDGKYASPDVFKSLGCEDFISFVFEFGKSLCSMHLTEDEIALFSAFVLMSADRSWLQEKVKIEKLQQKIQLALQHVLQKNHREDGILTKLICKVSTLRALCGRHTEKLMAFKAIYPDIVRLHFPPLYKELFTS(SEQ ID NO:8)

Claims (10)

1.一种合成细胞器辅助的基因表达方法，其包括下述步骤：
a.在宿主中，构建合成细胞器，
b.使所述合成细胞器与基因表达产物共表达，所述基因表达产物能够定位至合成细胞器。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主包括无细胞表达体系和细胞宿主，优选的是，原核细胞宿主，更优选的是，大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成细胞器指人工设计的区室化结构，优选地，所述合成细胞器是无膜细胞器，是多肽和/或蛋白和/或DNA和/或RNA和/或核酸蛋白复合体在宿主中构建形成的生物分子凝聚体(biomolecular condensates)，优选的是，构建合成细胞器地生物大分子为连续重复10-1000次的核苷酸序列，例如三联体CAG，CCUG，GGGAA，GGGGCC等；连续重复3-500次的氨基酸序列，例如树脂蛋白样肽(resilin-likepeptides，RLP)的重复；内在非结构区域，例如FUS蛋白，ParB蛋白；多元生物大分子的多聚化，例如PTB蛋白与UCUCU序列重复，人工设计的二元蛋白质二维结构，人工设计的二元RNA二维结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因表达产物为RNA、蛋白质、核酸蛋白复合物，或者是异源DNA编码合成的小分子，优选的是，重组蛋白质，例如，超折叠绿色荧光蛋白、限制性内切酶DpnI、限制性内切酶BsaI、人胰岛素原或ROR-alpha，优选的是，所述基因表达产物在所述合成细胞器中成熟。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，所述基因表达产物通过非特异性和/或特异性的结合定位至合成细胞器，优选地，使用特异性的受体/配体对，所述合成细胞器具有受体，所述基因表达产物连接有配体，使得所述合成细胞器能够特异性地结合所述基因表达产物，优选地，所述受体/配体对包括：互补配对的核酸分子；MS2、PP7、Qbeta等RNA噬菌体的衣壳蛋白和翻译操纵子RNA发卡；分裂蛋白的两段，例如裂绿色荧光蛋白、beta-半乳糖苷酶的alpha片段和omega片段，裂T7 RNA聚合酶。
6.一种DNA构建体，其包含引导宿主构建权利要求1至5中任一项所述的方法中定义的合成细胞器的核苷酸序列1，和/或引导、调控权利要求1至5中任一项所述的方法中定义的基因表达产物生成的核苷酸序列2，优选地，DNA构建体由所述核苷酸序列1、2与质粒载体构成，所述质粒载体例如pACYC184，pACYC177，pET28a(+)、pET28b(+)、pET-5a(+)、pET43.1a、pET-37b(+)、pCDFDuet-1,pCOLADuet-1,pRSFDuet-1,pETDuet-1、pUC57、pUC19、pBAD，pBluescript II SK(+)、pTrcHis C、pTrcHis A、pTrcHis2C、pBV221、pQE-70、pColdIII、pRSET-CFP、pRSET-BFP、pGFPuv、pKD46、pKD4、pTYB1、PinPoint Xa-2、pTWIN1、pRSET C、pSB1C3、pSB3C5、pSB4C5、pSB4K5，优选的是，上游启动子是常表达启动子或诱导型启动子。
7.一种表达系统，其包括权利要求6要求所述的DNA构建体，优选的是，所述表达系统指在原核细胞中同时构建所述合成细胞器、并生成所述基因表达产物的系统，更优选地，所述表达系统是大肠杆菌表达系统。
8.合成细胞器在消除基因表达对宿主的压力和/或毒性以及/或者将基因表达产物与宿主内环境解耦连的方面的应用，其包括使所述合成细胞器与基因表达产物在所述宿主中共表达，所述基因表达产物能够定位至合成细胞器。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括改善宿主的生理活性和耐受性、同等条件下的生物量、基因表达速率和/或细胞生长速率。
10.如权利要求4所述的方法或者权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因表达产物在所述合成细胞器中成熟，优选所述成熟包括以下中的一种或多种：生物大分子的折叠；表达后修饰，如二硫键形成，糖基化修饰，甲基化修饰，乙酰化修饰；切割、连接，如酶原切割活化，RNA剪切，内含肽介导的蛋白质剪切，自身环化；非共价组装，如二聚化，多聚化。
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