BR112014016228B1 - Composição de proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, complexos de ribonucleoproteína, e método in vitro para modificar, visualizar, ativar a transcrição ou reprimir a transcrição de um ácido nucleico alvo - Google Patents

Composição de proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, complexos de ribonucleoproteína, e método in vitro para modificar, visualizar, ativar a transcrição ou reprimir a transcrição de um ácido nucleico alvo Download PDF

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Abstract

RIBONUCLEOPROTEÍNAS EM CASCATAS MODIFICADAS E SEUS USOS. A presente invenção refere-se a um complexo associado a repetição palindrômica curta regularmente interespaçada e aglomerada (CRISPR) para defesa antiviral adaptável (Cascata); o Complexo de proteína em cascata compreendendo pelo menos as subunidades de proteína associada a CRISPR Cas7, Cas5 e Cas6 que incluem pelo menos uma subunidade com uma sequência de aminoácido adicional possuindo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição. O Complexo em cascata com atividade adicional é combinado com uma molécula de RNA para produzir um complexo de ribonucleoproteína. A molécula de RNA é selecionada para ter complementaridade substancial à sequência alvo. As ribonucleoproteínas alvejadas podem ser empregadas como ferramentas da engenharia genética para precisar o corte dos ácidos nucleicos na recombinação homóloga, união da extremidade não homóloga, modificação do gene, integração do gene, reparo da mutação ou para sua visualização, repressão ou ativação transcricional. Um par de ribonucleotídeos fundidos aos dímeros FokI pode ser empregado para gerar rupturas de filamento duplo no DNA para facilitar estas aplicações de um modo de sequência específica.

Description

[001] A invenção se refere ao campo da engenharia genética e mais particularmente à área de modificação do gene e/ou genoma dos organismos, incluindo os procariotas e eucariotos. A invenção, também, diz respeito aos métodos da preparação das ferramentas específicas do local para uso nos métodos de análise de genoma e modificação genética, se in vivo ou in vitro. A invenção mais particularmente se refere ao campo das ribonucleoproteínas que reconhecem e se associam com as sequências de ácidos nucleicos em um modo específico da sequência.
[002] As bactérias e archaea têm uma grande variedade de mecanismos de defesa contra DNA invasivo. Os sistemas de defesa, assim chamados, CRISPR/Cas fornecem a imunidade adaptativa por meio da integração de plasmídeo e fragmentos de DNA viral em loci das repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas (CRISPR) no cromossoma hospedeiro. As sequências derivadas do plasmídeo ou virais, conhecidas como espaçadores, são separadas umas das outras por meio da repetição das sequências derivadas do hospedeiro. Estes elementos repetitivos são a memória genética deste sistema imune e cada localização da CRISPR contém um repertório diversificado das sequências de um único ‘espaçador’ adquiridas durante os encontros anteriores com os elementos genéticos estrangeiros.
[003] Aquisição de DNA estanho é a primeira etapa de imunização, mas a proteção requer que a CRISPR está transcrita e que estas transcrições longas são processadas nos RNAs derivados de CRISPR curta (crRNAs) em que cada um contém uma sequência de espaçados único complementar a um ácido nucléico estranho do desafiador.
[004] Além do crRNA, as experiências genéticas em vários organismos têm revelado que um conjunto único de proteínas associadas a CRISPR (Cas) é necessário para as etapas de aquisição da imunidade, para a biogênese do crRNA e para interferência alvejada. Da mesma forma, um subconjunto das proteínas Cas a partir dos sistemas da CRISPR filogeneticamente distintos tem mostrado se montar em grandes complexos que incluem um crRNA.
[005] Uma recente reavaliação da diversidade dos sistemas CRISPR/Cas tem resultado em uma classificação em três tipos distintos (Makarova K. e outros, (2011) Nature Reviews Microbiology - AOP 9 de maio de 2011; doi:10.1038/nrmicro2577) que variam no teor do gene cas, e apresentam maiores diferenças ao longo da via de defesa da CRISPR. (A nomenclatura e a classificação Makarova para os genes associados a CRISPR é adotado na presente especificação.) As transcrições de RNA de loci CRISPR (pre-crRNA) são divididas especificamente nas sequências de repetição por meio de endoribonucleases associada a CRISPR (Cas) nos sistemas tipo I e tipo III ou por meio de RNase III nos sistemas tipo II; os crRNAs gerados são utilizados por meio de complexo de proteína Cas como um RNA guia para detectar as sequências complementares ou de RNA ou DNA invasor. A clivagem dos ácidos nucleicos alvos tem sido demonstrada in vitro para o sistema de Pyrococcus furiosus tipo III-B, que cliva o RNA em um mecanismo fixado a régua, e, mais recentemente, in vivo para o sistema Streptococcus thermophiles tipo II, que cliva o DNA na sequência alvo complementar (protoespaçador). Em comparação, para os sistemas tipo I o mecanismo da interferência de CRISPR é ainda em grande parte desconhecido.
[006] O organismo modelo da linhagem Escherichia coli K12 possui uma CRISPR/Cas tipo I-E (anteriormente conhecida como CRISPR subtipo E (Cse)). Contém oito genes cas (cas1, cas2, cas3 e cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e) e uma CRISPR a jusante (repetições tipo 2). Na Escherichia coli K12 os oito genes cas são codificados a montante da localização da CRISPR. A Cas1 e a Cas2 não parecem ser necessárias para a interferência alvo, mas são passíveis de participar em nova aquisição da sequência. Em comparação, seis proteínas Cas: Cse1, Cse2, Cas3, Cas7, Cas5 e Cas6e (anteriormente, da mesma forma, conhecida como CasA, CasB, Cas3, CasC/Cse4, CasD e CasE/Cse3 respectivamente) são essenciais para a proteção contra o desafio fago lambda. Cinco destas proteínas: Cse1, Cse2, Cas7, Cas5 e Cas6e (anteriormente conhecida como CasA, CasB, CasC/Cse4, CasD e CasE/Cse3 respectivamente) montadas com um crRNA para formar uma multi-subunidade de ribonucleoproteína (RNP) referida como Cascata.
[007] Na E. coli, Cascata é um complexo de ribonucleoproteína 405 kDa composto de uma estequiometria desigual de cinco proteínas Cas funcionalmente essenciais: Cse11Cse22Cas76Cas51Cas6e1 (isto é, CasA1B2C6D1E1) e um RNA derivado de CRISPR-61-nt. A Cascata é uma RNP obrigatória que depende do crRNA para a estabilidade e montagem complexa, e para a identificação das sequências de ácidos nucleicos invasoras. A Cascata é um complexo da vigilância que constata e se liga aos ácidos nucleicos estranhos que são complementares à sequência espaçadora do crRNA.
[008] Jore e outros, (2011) intitulado "Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade" Nature Structural & Molecular Biology 18: 529 - 537 descreve como existe uma clivagem da transcrição pré-crRNA pela subunidade Cas6e em cascata, resultando no crRNA de 61 nt maduro sendo retido pelo complexo CRISPR. O crRNA serve como um RNA guia para a ligação específica sequência em cascata das moléculas de DNA de fita dupla (ds) por meio do emparelhamento da base entre o espaçador do crRNA e o protoespaçador complementar, formando um, assim chamado, circuito R. Este é conhecido ser um processo independente de ATP.
[009] Brouns S.J.J., e outros, (2008) intitulado "Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes" Science 321: 960-964 apresenta que a Cascata carregada com um crRNA requer Cas3 para a resistência ao fago in vivo.
[0010] Marraffini L. & Sontheimer E. (2010) intitulado "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea" Nature Reviews Genetics 11: 181 - 190 é um artigo da revisão que resume o estado do conhecimento na técnica no campo. Algumas sugestões são feitas sobre as tecnologias e aplicações com base na CRISPR, mas está principalmente na área de geração das linhagens resistentes ao fago das bactérias domesticadas para a indústria de laticínios. A clivagem específica das moléculas de RNA in vitro por meio de um complexo de crRNP em Pyrococcus furiosus é sugerida como alguma coisa que aguarda outro desenvolvimento. A manipulação dos sistemas CRISPR é também sugerida como uma forma possível de redução da transmissão das linhagens bacterianas resistentes ao antibiótico nos hospitais. Os autores resultam que mais esforço da pesquisa deve ser necessário para explorar a utilidade potencial da tecnologia nestas áreas.
[0011] US 2011236530 A1 (Manoury e outros,) intitulado "Genetic cluster of strains of Streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation" descreve certas linhagens de S. thermophilus que fermentam o leite de modo que é altamente viscoso e fracamente pegajoso. Uma localização específica da CRISPR da sequência definida é descrita.
[0012] US 2011217739 A1 (Terns e outros,) intitulado "Cas6 polypeptides and methods of use" descreve os polipeptídeos que têm a atividade da endoribonuclease Cas6. Os polipeptídeos clivam um polinucleotídeo de RNA alvo tendo um domínio de reconhecimento Cas6 e local de clivagem. A clivagem pode ser realizada in vitro ou in vivo. Os micróbios, tais como, E. coli ou Haloferax volcanii são geneticamente modificados a fim de expressar a atividade da endoribonuclease Cas6.
[0013] WO 2010054154 (Danisco) intitulado "Bifidobacteria CRISPR sequences" descreve várias sequências de CRISPR encontradas na Bifidobactéria e seu uso na preparação de linhagens geneticamente alteradas das bactérias que são alteradas em suas características de resistência ao fago.
[0014] US 2011189776 A1 (Terns e outros,) intitulado "Prokaryotic RNAi-like system and methods of use" descreve os métodos de inativação dos polinucleotídeos alvo in vitro ou nos micróbios procarióticos in vivo. Os métodos de uso de um psiRNA tendo uma região 5’ de 5 - 10 nucleotídeos escolhidos a partir de uma repetição de uma localização da CRISPR imediatamente a montante de um espaçador. A região 3’ é substancialmente complementar a uma porção do polinucleotídeo alvo. Também descritos são os polipeptídeos tendo a atividade da endonuclease na presença de psiRNA e polinucleotídeo alvo.
[0015] EP2341149 A1 (Danisco) intitulado "Use of CRISPR associated genes (CAS) descreve como um ou mais genes Cas pode ser empregado para a modulação da resistência das células bacterianas contra o bacteriófago; particularmente as bactérias que fornecem uma cultura iniciadora ou cultura probiótica nos produtos lácteos.
[0016] WO 2010075424 (The Regents of the University of California) intitulado "Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes" descreve um polinucleotídeo isolado compreendendo um arranjo de CRISPR. Pelo menos um espaçador da CRISPR é complementar a um gene de um procariota de modo que é capaz da expressão sub-regular do gene; particularmente em que o gene é associado com a produção de biocombustível.
[0017] WO 2008108989 (Danisco) intitulado "Cultures with improved phage resistance" descreve a seleção de linhagens resistentes ao das bactérias e também a seleção das linhagens que têm um espaçador adicional tendo 100 % de identidade com uma região do fago de RNA. As combinações de linhagens melhoradas e as rotações da cultura iniciadora são descritas para uso na indústria de laticínios. Certos fagos são descritos para uso como os agentes de biocontrole.
[0018] WO 2009115861 (Institut Pasteur) intitulado ""Molecular typing and subtyping of Salmonella by identification of the variable nucleotide sequences of the CRISPR loci" descreve os métodos para a detecção e a identificação bacteriana da Salmonella genus por meio do uso de suas sequências de nucleotídeos variáveis contidas em loci CRISPR.
[0019] WO 2006073445 (Danisco) intitulado "Detection and typing of bacterial strains" descreve a detecção e a tipagem das linhagens bacterianas nos produtos alimentícios, suplementos dietéticos e amostras ambientais. As linhagens de Lactobacillus são identificadas por meio das sequências de nucleotídeos da CRISPR específicas.
[0020] Urnov F e outros, (2010) intitulado "Genome editing with engineered zinc finger nucleases" Nature 11: 636 - 646 é um artigo da revisão sobre as nucleases de dedo de zinco e como tem sido fundamental no campo da genética reversa em uma faixa de organismos modelos. As nucleases de dedo de zinco têm sido desenvolvidas a fim de que a clivagem do genoma precisamente alvejado seja possível seguida pela modificação do gene no processo de reparo subsequente. De qualquer modo, as nucleases de dedo de zinco são geradas por meio da fusão de um número de domínios de ligação ao DNA de dedo de zinco ao domínio de clivagem do DNA. A especificidade da sequência de DNA é obtida por meio do acoplamento de diversos dedos de zinco em série, cada um reconhecendo um motivo de três nucleotídeos. Uma desvantagem significante com a tecnologia é que novos dedos de zinco necessitam para ser desenvolvidos para cada nova localização de DNA que requer ser dividida. Isto requer a engenharia de proteína e triagem extensa para assegurar a especificidade da ligação ao DNA.
[0021] Nos campos da engenharia genética e da pesquisa genômica existe uma necessidade contínua de agentes melhorados para a sequência/clivagem e/ou detecção do ácido nucléico específico do local.
[0022] Os inventores fizeram uma descoberta surpreendente em que certas bactérias expressando o Cas3, que tem atividade helicase e nuclease, expressa Cas3 com uma fusão com Cse1. Os inventores também têm inesperadamente sido capazes de produzir fusões artificiais de Cse1 com outras enzimas de nuclease.
[0023] Os inventores também têm descoberto que o reconhecimento do DNA alvo independente de Cas3 por meio de em Cascata marca DNA para a clivagem por meio de Cas3, e que a ligação ao DNA Cascata é governada por meio de requisitos topológicos do DNA alvo.
[0024] Os inventores ainda têm constatado que Cascata é incapaz de ligar os plasmídeos alvo relaxados, mas surpreendentemente em Cascata apresenta elevada afinidade para os alvos que têm uma topologia negativamente superenrolada (nSC).
[0025] Desse modo em um primeiro aspecto a presente invenção fornece um complexo associado a repetição palindrômica curta agrupada e regularmente espaçada (CRISPR) para a defesa antiviral (Cascata), o Complexo de proteína em cascata, ou porção deste, compreendendo pelo menos as subunidades de proteína associada a CRISPR:
[0026] - Cas7 (ou COG 1857) tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 3 ou uma sequência de pelo menos 18 % de identidade a partir desta,
[0027] - Cas5 (ou COG1688) tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 4 ou uma sequência de pelo menos 17 % de identidade a partir desta, e
[0028] - Cas6 (ou COG 1583) tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 5 ou uma sequência de pelo menos 16 % de identidade a partir desta;
[0029] e em que pelo menos uma das subunidades inclui uma sequência de aminoácido adicional fornecendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição.
[0030] Uma subunidade que inclui uma sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição é um exemplo o qual pode ser chamada "uma subunidade ligada a pelo menos uma porção funcional"; uma porção funcional sendo o polipeptídeo ou a proteína composta da sequência de aminoácido adicional. A atividade de ativação da transcrição pode ser aquela levando a ativação ou a super-regulação de um dos genes desejados; a atividade da repressão da transcrição levando a repressão ou a sub-regulação de um dos genes desejados. A seleção do gene sendo devido ao alvejamento do complexo em cascata da invenção com uma molécula de RNA, como descrito mais abaixo.
[0031] A sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição é de preferência formada de resíduos de aminoácido contíguo. Estes aminoácidos adicionais podem ser vistos como um polipeptídeo ou proteína que é contígua e forma parte da subunidade Cas ou Cse relacionada. Uma tal sequência de proteína ou polipeptídeo não é de preferência normalmente parte de qualquer sequência de aminoácido de subunidade Cas ou Cse. Em outras palavras, a sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição pode ser diferente de uma sequência de aminoácido de subunidade Cas ou Cse, ou sua parte, isto é, pode ser diferente de uma Cas3 submetida a sequência de aminoácido ou sua parte.
[0032] A sequência de aminoácido adicional com ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição pode, quando desejado, ser obtida ou derivada do mesmo organismo, por exemplo, E. coli, como as subunidade Cas ou Cse.
[0033] Adicionalmente e/ou alternativamente ao acima, a sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição pode ser "heteróloga" à sequência de aminoácido das subunidade Cas ou Cse. Por esse motivo, a sequência de aminoácido adicional pode ser obtida ou derivada de um organismo diferente do organismo do qual as subunidade(s) Cas e/ou Cse são derivadas ou originadas.
[0034] Ao longo, a identidade de sequência pode ser determinada por meio da forma de BLAST e alinhamento de sequências múltiplas Cobalto subsequente no servidor National Center for Biotechnology Information, em que a sequência em questão é comparada a uma sequência de referência (por exemplo, SEQ ID #No. 3, 4 ou 5). As sequências de aminoácidos podem ser definidas em termos da similaridade da sequência de porcentagem com base em uma matriz BLOSUM62 ou identidade da porcentagem com uma determinada sequência de referência (por exemplo, SEQ ID #No. 3, 4 ou 5). A similaridade ou a identidade de uma sequência envolve uma etapa inicial da preparação do melhor alinhamento antes de calcular a conservação da porcentagem com a referência e reflete uma calculo da relação evolutiva das sequências.
[0035] A Cas7 pode ter uma similaridade da sequência de pelo menos 31 % com a SEQ ID #No. 3; a Cas5 pode ter uma similaridade da sequência de pelo menos 26 % com a SEQ ID #No. 4. A Cas6 pode ter uma similaridade da sequência de pelo menos 27 % com a SEQ ID #No. 5.
[0036] Para Cse1/CasA (502 AA): >gi|16130667|ref|NP_417240.1| RNA de CRISP (crRNA) contendo a Proteína do complexo antiviral em cascata [Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655] MNLLIDNWIPVRPRNGGKVQIINLQSLYCSRDQWRLSLPRD DMELAALALLVCIGQIIAPAKDDVEFRHRIMNPLTEDEFQQLIAPWIDM FYLNHAEHPFMQTKGVKANDVTPMEKLLAGVSGATNCAFVNQPGQ GEALCGGCTAIALFNQANQAPGFGGGFKSGLRGGTPVTTFVRGIDLR STVLLNVLTLPRLQKQFPNESHTENQPTWIKPIKSNESIPASSIGFVRG LFWQPAHIELCDPIGIGKCSCCGQESNLRYTGFLKEKFTFTVNGLWP HPHSPCLVTVKKGEVEEKFLAFTTSAPSWTQISRVVVDKIIQNENGNR VAAVVNQFRNIAPQSPLELIMGGYRNNQASILERRHDVLMFNQGWQ QYGNVINEIVTVGLGYKTALRKALYTFAEGFKNKDFKGAGVSVHETAE RHFYRQSELLIPDVLANVNFSQADEVIADLRDKLHQLCEMLFNQSVA PYAHHPKLISTLALARATLYKHLRELKPQGGPSNG [SEQ ID #No. 1]
[0037] Para Cse2/CasB (160 AA): >gi|16130666|ref|NP_417239.1| RNA de CRISP (crRNA) contendo a Proteína do complexo antiviral em cascata [Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655] MADEIDAMALYRAWQQLDNGSCAQIRRVSEPDELRDIPAF YRLVQPFGWENPRHQQALLRMVFCLSAGKNVIRHQDKKSEQTTGIS LGRALANSGRINERRIFQLIRADRTADMVQLRRLLTHAEPVLDWPLMA RMLTWWGKRERQQLLEDFVLTTNKNA [SEQ ID #No. 2]
[0038] Para Cas7/CasC/Cse4 (363 AA): >gi|16130665|ref|NP_417238.1| RNA de CRISP (crRNA) contendo a Proteína do complexo antiviral em cascata [Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655] MSNFINIHVLISHSPSCLNRDDMNMQKDAIFGGKRRVRISS QSLKRAMRKSGYYAQNIGESSLRTIHLAQLRDVLRQKLGERFDQKIID KTLALLSGKSVDEAEKISADAVTPWVVGEIAWFCEQVAKAEADNLDD KKLLKVLKEDIAAIRVNLQQGVDIALSGRMATSGMMTELGKVDGAMSI AHAITTHQVDSDIDWFTAVDDLQEQGSAHLGTQEFSSGVFYRYANIN LAQLQENLGGASREQALEIATHVVHMLATEVPGAKQRTYAAFNPAD MVMVNFSDMPLSMANAFEKAVKAKDGFLQPSIQAFNQYWDRVANG YGLNGAAAQFSLSDVDPITAQVKQMPTLEQLKSWVRNNGEA [SEQ ID #No. 3]
[0039] Para Cas5/CasD (224 AA): >gi|90111483|ref|NP_417237.2| RNA de CRISP (crRNA) contendo a Proteína do complexo antiviral em cascata [Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655] MRSYLILRLAGPMQAWGQPTFEGTRPTGRFPTRSGLLGLL GACLGIQRDDTSSLQALSESVQFAVRCDELILDDRRVSVTGLRDYHT VLGAREDYRGLKSHETIQTWREYLCDASFTVALWLTPHATMVISELE KAVLKPRYTPYLGRRSCPLTHPLFLGTCQASDPQKALLNYEPVGGDI YSEESVTGHHLKFTARDEPMITLPRQFASREWYVIKGGMDVSQ [SEQ ID #No. 4]
[0040] Para Cas6e/CasE (199 AA): >gi|16130663|ref|NP_417236.1| enzima de clivagem precursora do RNA de CRISPR; RNA de CRISP (crRNA) contendo a Proteína do complexo antiviral em cascata [Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655] MYLSKVIIARAWSRDLYQLHQGLWHLFPNRPDAARDFLFH VEKRNTPEGCHVLLQSAQMPVSTAVATVIKTKQVEFQLQVGVPLYFR LRANPIKTILDNQKRLDSKGNIKRCRVPLIKEAEQIAWLQRKLGNAARV EDVHPISERPQYFSGDGKSGKIQTVCFEGVLTINDAPALIDLVQQGIG PAKSMGCGLLSLAPL [SEQ ID #No. 5]
[0041] Na definição da faixa das variantes da sequência que se enquadram dentro do escopo da invenção, para se evitar dúvidas, os que seguem são cada um dos limites opcionais na extensão da variação, para ser aplicada a cada uma das SEQ ID #No. 1, 2, 3, 4 ou 5 partindo da relação da faixa mais ampla das variantes como especificado nos termos da respectiva identidade da porcentagem acima. A faixa de variantes, por esse motivo, pode, por esse motive, incluir: pelo menos 16 %, ou pelo menos 17 %, ou pelo menos 18 %, ou pelo menos 19 %, ou pelo menos 20 %, ou pelo menos 21 %, ou pelo menos 22 %, ou pelo menos 23 %, ou pelo menos 24 %, ou pelo menos 25 %, ou pelo menos 26 %, ou pelo menos 27 %, ou pelo menos 28 %, ou pelo menos 29 %, ou pelo menos 30 %, ou pelo menos 31 %, ou pelo menos 32 %, ou pelo menos 33 %, ou pelo menos 34 %, ou pelo menos 35 %, ou pelo menos 36 %, ou pelo menos 37 %, ou pelo menos 38 %, ou pelo menos 39 %, ou pelo menos 40 %, ou pelo menos 41 %, ou pelo menos 42 %, ou pelo menos 43 %, pelo menos 44 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 46 %, ou pelo menos 47 %, ou pelo menos 48 %, ou pelo menos 49 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 51 %, ou pelo menos 52 %, ou pelo menos 53 %, ou pelo menos 54 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 56 %, ou pelo menos 57 %, ou pelo menos 58 %, ou pelo menos 59 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 61 %, ou pelo menos 62 %, ou pelo menos 63 %, ou pelo menos 64 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 66 %, ou pelo menos 67 %, ou pelo menos 68 %, ou pelo menos 69 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 71 %, pelo menos 72 %, ou pelo menos 73 %, ou pelo menos 74 %, ou pelo menos 75 %, ou pelo menos 76 %, ou pelo menos 77 %, ou pelo menos 78 %, ou pelo menos 79 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 81 %, ou pelo menos 82 %, ou pelo menos 83 %, ou pelo menos 84 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 86 %, ou pelo menos 87 %, ou pelo menos 88 %, ou pelo menos 89 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 91 %, ou pelo menos 92 %, ou pelo menos 93 %, ou pelo menos 94 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, ou 100 % da identidade da sequência de aminoácido.
[0042] Através de, o Makarova e outros, (2011) a nomenclatura está sendo empregada na definição das subunidades da proteína Cas. A Tabela 2 na página 5 do Makarova e outros, o artigo lista os genes Cas e os nomes das famílias e as superfamílias as quais pertencem. Através de, a referência para uma subunidade da proteína Cas ou proteína Cse inclui referência cruzada à família ou a superfamília as quais estas subunidades fazem parte.
[0043] Através de, as sequências de referência das subunidades Cas e Cse da invenção podem ser definidas como uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido. Por exemplo, a sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 3 para a Cas7 também inclui todas as sequências de ácidos nucleicos que codificam aquela sequência de aminoácido. As variantes da Cas7 incluída dentro do escopo da invenção por esse motivo incluem as sequências de nucleotídeos de pelo menos as semelhanças ou as identidades da porcentagem de aminoácido definidas com a referência da sequência de ácido nucléico; assim como, todas as semelhanças ou identidades da porcentagem possível entre esse limite inferior e 100 %.
[0044] Os Complexos em cascata da invenção podem ser compostos de subunidades derivadas ou modificadas a partir de mais do que uma diferente procariota archaeal ou bacteriana. Da mesma forma, as subunidades dos diferentes subtipos de Cas podem ser misturadas.
[0045] Em um aspecto preferido, a subunidade Cas6 é uma subunidade Cas6e da SEQ ID #No. 17 abaixo, ou uma sequência de pelo menos 16 % de identidade a partir desta.
[0046] A sequência de uma subunidade Cas6e preferida é >gi|16130663|ref|NP_417236.1| enzima de clivagem precursora do RNA de CRISPR; RNA da CRISP (crRNA) contendo a Proteína do complexo antiviral em cascata [Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655]: MYLSKVIIARAWSRDLYQLHQGLWHLFPNRPDAARDFLFH VEKRNTPEGCHVLLQSAQMPVSTAVATVIKTKQVEFQLQVGVPLYFR LRANPIKTILDNQKRLDSKGNIKRCRVPLIKEAEQIAWLQRKLGNAARV EDVHPISERPQYFSGDGKSGKIQTVCFEGVLTINDAPALIDLVQQGIG PAKSMGCGLLSLAPL [SEQ ID #No. 17]
[0047] Os Complexos em cascata, ou suas porções, da invenção - que compreende pelo menos uma subunidade que inclui uma sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição - também pode compreender uma subunidade Cse2 (ou tipo YgcK) tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 2 ou uma sequência de pelo menos 20 % de identidade a partir desta, ou uma parte desta. Alternativamente, a subunidade Cse é definida como tendo pelo menos 38 % de similaridade com a SEQ ID #No. 2. Opcionalmente, dentro do complexo de proteína da invenção é a subunidade Cse2 que inclui a sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou a atividade modificadora da cromatina.
[0048] Adicionalmente ou alternativamente, os Complexos em cascata da invenção também pode compreender uma subunidade Cse1 (ou tipo YgcL) tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 1 ou uma sequência de pelo menos 9 % de identidade a partir desta, ou uma parte desta. Opcionalmente dentro do complexo de proteína da invenção é a subunidade Cse1 que inclui a sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição.
[0049] Nas modalidades preferidas, um Complexo em cascata da invenção é um complexo de proteína do sistema CRISPR-Cas Tipo I; mais de preferência um complexo de proteína CRISPR-Cas subtipo I-E ou pode ser com base em um complexo Tipo I-A ou Tipo I-B. Um complexo Tipo I-C, D ou F é possível. Nas modalidades particularmente preferidas com base no sistema E. coli, as subunidades podem ter as estequiometrias que seguem: Cse11Cse22Cas76Cas51 Cas61 ou Cse11Cse22Cas76Cas51Cas6e1.
[0050] A sequência de aminoácido adicional tendo ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição pode ser traducionalmente fundida por meio da expressão nos sistemas naturais ou artificiais da expressão da proteína, ou covalentemente ligada por meio de uma etapa de síntese química à pelo menos uma subunidade; de preferência pelo menos uma porção funcional é fundida ou ligada pelo menos à região do terminal de N e/ou à região do terminal de C de pelo menos uma de uma subunidade Cse1, Cse2, Cas7, Cas5, Cas6 ou Cas6e. Nas modalidades particularmente preferidas, a sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou a atividade modificadora da cromatina é fundida ou ligada ao terminal de N ou o terminal de C de uma subunidade Cse1, uma Cse2 ou uma Cas5; mais de preferência a ligação está na região do terminal de N de uma subunidade Cse1, o terminal de N de uma subunidade Cse2, ou o terminal de N de uma subunidade Cas7.
[0051] A sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, ativação, repressão ou atividade de visualização pode ser uma proteína; opcionalmente selecionada a partir de uma helicase, uma nuclease, uma nuclease- helicase, uma metiltransferase de DNA (por exemplo, Dam), ou a desmetilase de DNA, uma histona metiltransferase, uma histona desmetilase, uma acetilase, uma deacetilase, uma fosfatase, uma cinase, um (co-)ativador de transcrição, uma subnidade de RNA polimerase, um repressor de transcrição, uma proteína de ligação de DNA, uma proteína de estruturação de DNA, uma proteína marcadora, uma proteína repórter, uma proteína fluorescente, uma proteína de ligação do ligando (por exemplo, mCherry ou uma proteína de ligação de metal pesado), um peptídeo sinal (por exemplo, sequência de sinal- Tat), uma sequência de localização subcelular (por exemplo, sequência de localização nuclear) ou um epítopo do anticorpo.
[0052] A proteína envolvida pode ser uma proteína heteróloga de uma espécie diferente da espécie bacteriana da qual as subunidades da proteína em Cascata tem sua origem de sequência.
[0053] Quando a proteína é uma nuclease, pode ser uma selecionada a partir de uma endonuclease de restrição tipo II, tal como, FokI, ou um mutante ou uma porção ativa desta. Outras endonucleases de restrição tipo II que podem ser empregadas incluem EcoR1, EcoRV, BgII, BamHI, BsgI e BspMI. De preferência, um complexo de proteína da invenção pode ser fundido ao domínio do terminal de N de FokI e outro complexo de proteína da invenção pode ser fundido ao domínio do terminal de C de FokI. Estes dois complexos de proteínas podem em seguida ser empregado para se obter uma localização vantajosa específica do corte de fita dupla em um ácido nucléico, de acordo com o qual o local do corte no material genético está no plano e escolha do usuário, como administrado pelo componente do RNA (definido e descrito abaixo) e devido a presença de uma sequência assim chamada "motivo adjacente ao protoespaçador" (PAM) na fita do ácido nucléico alvo (também descrito em mais detalhes abaixo).
[0054] Em uma modalidade preferida, um complexo de proteína da invenção tem uma sequência de aminoácido adicional que é uma endonuclease de restrição modificada, por exemplo, FokI. A modificação está, de preferência, do domínio catalítico. Nas modalidades preferidas, a FokI modificada é KKR Sharkey ou ELD Sharkey que é fundida à proteína Cse1 do complexo de proteína. Em uma aplicação preferida destes complexos da invenção, dois destes complexos (KKR Sharkey e ELD Sharkey) podem estar juntos em combinação. Um par de heterodímero dos complexos de proteínas empregando FokI diferentemente modificada é ter a vantagem específica no corte de fita dupla alvejado de ácido nucléico. Se os homodímeros são empregados em seguida é possível que exista mais clivagem em locais não alvos devido a atividade não específica. Uma metodologia de heterodímero vantajosamente aumenta a fidelidade da clivagem em uma amostra de material.
[0055] O Complexo de cascata com sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição definida e descrita acima é um parte componente de um sistema global da invenção que vantajosamente permite ao usuário selecionar de uma matéria predeterminada de uma localização genética precisa que é desejada ser dividida, rotulada ou de outra forma alterada de alguma forma, por exemplo, metilação, empregando qualquer um do ácido nucléico ou do modificador da cromatina, visualização, entidades de ativação da transcrição ou de repressão da transcrição definidas aqui. A outra parte do componente do sistema é uma molécula de RNA que funciona como uma guia para orientar o Complexo em cascata da invenção à corrigir a localização no DNA ou RNA planejando ser modificado, cortado ou rotulado.
[0056] O Complexo em cascata da invenção de preferência também compreende uma molécula de RNA que compreende uma sequência de ribonucleotídeo de pelo menos 50 % de identidade para uma sequência de ácido nucléico desejada alvo, e em que o complexo de proteína e a molécula de RNA formam um complexo de ribonucleoproteína. De preferência, o complexo de ribonucleoproteína se forma quando a molécula de RNA é hibridizada com sua sequência de ácido nucléico alvo planejada. O complexo de ribonucleoproteína se forma quando os componentes necessários da combinação da porção em Cascata funcional e a molécula de RNA e o ácido nucléico (DNA ou RNA) estão presentes juntos em condições fisiológicas adequadas, se in vivo ou in vitro. Sem querer ficar preso à qualquer teoria específica, os inventores acreditam que no contexto de dsDNA, DNA particularmente negativamente superenrolado, o Complexo em cascata associando-se com o dsDNA causa um desenrolamento parcial dos fitas duplas que em seguida permite ao RNA se associar com uma fita; o complexo de ribonucleoproteína total em seguida migra ao longo da fita do DNA até uma sequência alvo substancialmente complementar a pelo menos uma parte da sequência de RNA é atingida, ponto em que uma interação estável entre a fita de RNA e DNA ocorre, e a função da porção funcional produz efeito, se por meio de modificação, corte de nuclease ou etiquetagem do DNA naquela localização.
[0057] Nas modalidades preferidas, uma parte da molécula de RNA tem pelo menos 50 % de identidade para a sequência de ácido nucléico alvo; mais de preferência pelo menos 95 % de identidade para a sequência alvo. Nas modalidades mais preferidas, a porte da molécula de RNA é substancialmente complementar ao longo do seu comprimento com a sequência de DNA alvo; isto é, existe apenas uma, dois, três, quatro ou cinco combinações malsucedidas que podem ser contíguas ou não contíguas. A molécula de RNA (ou sua parte) pode ter pelo menos 51 %, ou pelo menos 52 %, ou pelo menos 53 %, ou pelo menos 54 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 56 %, ou pelo menos 57 %, ou pelo menos 58 %, ou pelo menos 59 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 61 %, ou pelo menos 62 %, ou pelo %, ou o mínimo de 65 %, ou pelo %, ou pelo menos 68 %, ou pelo %, ou pelo menos 71 %, ou pelo %, ou pelo menos 74 %, ou pelo %, ou pelo menos 77 %, ou pelo %, ou pelo menos 80 %, ou pelo %, ou pelo menos 83 %, ou pelo %, ou pelo menos 86 %, ou pelo %, ou pelo menos 89 %, ou pelo %, ou pelo menos 92 %, ou pelo %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 96 %, ou pelo menos 97 %, ou pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade para a sequência alvo.
[0058] O ácido nucléico alvo pode ser DNA (ss ou ds) ou RNA.
[0059] Em outras modalidades preferidas, a molécula de RNA ou sua parte tem pelo menos 70 % de identidade com o ácido nucléico alvo. Em tais níveis de identidade, o ácido nucléico alvo é, de preferência, dsDNA.
[0060] A molécula de RNA deve, de preferência, requerer uma elevada especificidade e afinidade para a sequência de ácido nucléico alvo. Uma constante de dissociação (Kd) na faixa de 1 pM a 1 μM, de preferência 1 - 100 nM é desejável como determinado por meio de, de preferência, eletroforese de gel nativo, ou calorimetria de titulação alternativamente isotérmica, ressonância de plasma de superfície, ou os métodos de titulação com base na fluorescência. A afinidade pode ser determinada empregando um ensaio de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA), também chamado ensaio de retardamento em gel (ver, Semenova E e outros, (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 10098 - 10103).
[0061] A molécula de RNA é, de preferência, modelada em que são conhecidos a partir da natureza nos procariotas como moléculas de RNA de CRISPR RNA (crRNA). A estrutura das moléculas de crRNA já está estabelecida e explicada de forma mais detalhada em Jore e outros, (2011) Nature Structural & Molecular Biology 18:529 - 537. Em resumo, um crRNA maduro do tipo I-E é muitas vezes de 61 nucleotídeos de comprimento e consiste em um "puxador" da região 5’ de 8 nucleotídeos, a seqüência "espaçadora" de 32 nucleotídeos, e uma seqüência 3’ de 21 nucleotídeos que forma um grampo de cabelo com um circuito de tetranucleotídeo. De qualquer modo, o RNA empregado na invenção não tem de ser projetado rigorosamente para o plano do crRNA de ocorrência natural, se em comprimento, as regions ou as sequências específicas de RNA. O que é claro também, é que as moléculas de RNA para uso na invenção podem ser projetadas com base na informação de sequência de gene nos bases de dados públicas ou recentemente descobertas, e em seguida feitas artificialmente, por exemplo, por meio de síntese química no todo ou em parte. As moléculas de RNA da invenção também podem ser projetadas e produzidas por meio da forma de expressão nas células geneticamente modificadas ou sistemas de expressão livres de células e esta opção pode incluir a síntese de alguma ou de toda a sequência de RNA.
[0062] A estrutura e os requisitos de crRNA também têm sido descritos em Semenova E e outros, (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 10098 - 10103. Existe um parte assim chamada "SEED" formando a extremidade 5’ da sequência espaçadora e que está 5’ flanqueado também pelo 5’ puxador dos 8 nucleotídeos. Semenova e outros, (2011) têm constatado que todos os resíduos da sequência SEED devem ser complementares à sequência alvo, se bem que para o resíduo na posição 6, uma combinação mau-sucedida pode ser tolerada. Semelhantemente, quando a planejamento e a preparação de um componente do RNA de um complexo de ribonucleoproteína da invenção direcionada a uma localização alvo (isto é, sequência), a combinação necessária e as regras da combinação malsucedida para a sequência SEED podem ser aplicadas.
[0063] A invenção por esse motivo inclui um método de detecção e/ou de localização de uma mudança única de base em uma molécula de ácido nucléico alvo compreendendo o contato de uma amostra de ácido nucléico com um complexo de ribonucleoproteína da invenção como descrito mais acima, ou com um Complexo em cascata e componente de RNA separado da invenção como descrito mais acima, e em que a seqüência do componente do RNA (incluindo quando no complexo de ribonucleoproteína) é de modo que se discrimina entre um alelo normal e um alelo mutante em virtude de uma mudança única de base na posição 6 de uma sequência contígua de 8 resíduos de nucleotídeo.
[0064] Nas modalidades da invenção, a molécula de RNA pode ter um comprimento na faixa de 35 a 75 resíduos. Nas modalidades preferidas, a porção do RNA que é complementar a e empregada para alvejar uma sequência de ácido nucléico desejada é de 32 ou de 33 resíduos de comprimento. (No contexto de um crRNA de ocorrência natural, isto corresponderia à parte espaçadora; como mostrado na Figura 1 de Semenova e outros, (2011)).
[0065] Um complexo de ribonucleoproteína da invenção pode adicionalmente ter um componente do RNA compreendendo 8 resíduos 5’ para a sequência de RNA a qual tem pelo menos complementaridade substancial à sequência alvo de ácido nucleico. (A sequência de RNA tendo pelo menos complementaridade substancial à sequência alvo de ácido nucléico seria entendida corresponder no contexto de um crRNA como sendo a sequência espaçadora. A 5’ sequência de flanqueamento do RNA seria considerada corresponder ao puxador 5’de um crRNA.
[0066] Isto é mostrado na Figura 1 de Semenova e outros, (2011)).
[0067] Um complexo de ribonucleoproteína da invenção pode ter uma 3’ sequência de formação de circuito de tetranucleotídeo e grampo de cabelo para a sequência de RNA a qual tem pelo menos complementaridade substancial à sequência alvo do DNA. (No contexto de crRNA, isto corresponderia a um flanqueamento do puxador 3’ da sequência espaçadora como mostrado na Figura 1 de Semenova e outros, (2011)).
[0068] Em algumas modalidades, o RNA pode ser um RNA de CRISPR (crRNA).
[0069] Os complexos e as proteínas em Cascata da invenção podem ser caracterizados in vitro nos termos de sua atividade de associação com o componente de guia do RNA para formar um complexo de ribonucleoproteína na presença do ácido nucléico alvo (que pode ser DNA ou RNA). Um ensaio de desvio de mobilidade eletroforética (EMSA) pode ser empregado como um ensaio funcional para a interação dos complexos da invenção com seus alvos de ácido nucléico. Basicamente, o complexo de porção em Cascata funcional da invenção é misturado com os alvos de ácido nucléico e a interação estável do complexo de porção em Cascata funcional é monitorado por meio de EMSA ou por meio de leitura específica da porção funcional, por exemplo, clivagem endonucleolítica de DNA alvo no local desejado. Isto pode ser determinado por meio de outra análise de comprimentos de fragmento de restrição empregando as enzimas comercialmente disponíveis com as especificidades conhecidas e os locais de clivagem em uma molécula de DNA alvo.
[0070] A visualização da ligação dos complexos e proteínas em Cascata da invenção para o DNA ou o RNA na presença de RNA guia pode ser obtida empregando imageamento de microscópio de força atômica/varredura (SFM/AFM) e isto pode fornecer um ensaio para a presença de complexos funcionais da invenção.
[0071] A invenção também fornece uma molécula de ácido nucléico codificando pelo menos uma subunidade de proteína associada a repetição palindrômica curta agrupada e regularmente espaçada (CRISPR) selecionada a partir de: uma subunidade Cse1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 1 ou uma sequência de pelo menos 9 % de identidade a partir desta; uma subunidade Cse2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 2 ou uma sequência de pelo menos 20 % de identidade a partir desta; uma subunidade Cas7 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 3 ou uma sequência de pelo menos 18 % de identidade a partir desta; uma subunidade Cas5 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 4 ou uma sequência de pelo menos 17 % de identidade a partir desta; uma subunidade Cas6 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID #No. 5 ou uma sequência de pelo menos 16 % de identidade a partir desta; e em que pelo menos a, b, c, d ou e inclui uma sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição.
[0072] A sequência de aminoácido adicional tendo o ácido nucléico ou o modificador da cromatina, visualização, ativação da transcrição ou atividade da repressão da transcrição é, de preferência, fundida à subunidade de proteína associada a CRISPR.
[0073] Nos ácidos nucleicos da invenção definidos acima, a sequência de nucleotídeos pode ser aquela que codifica as respectivas SEQ ID #No. 1, SEQ ID #No. 2, SEQ ID #No. 3, SEQ ID #No. 4 ou SEQ ID #No. 5, ou na definição da faixa das sequência variantes também, pode ser uma sequência hibridizável para aquela sequência de nucleotídeos, de preferência, sob condições rigorosas, mais de preferência condições de severidade muito elevadas. Uma variedade de condições de rigorosa hibridização deve ser familiar para o leitor versado na matéria. A hibridização de uma molécula de ácido nucléico ocorre quando duas moléculas complementar de ácidos nucleicos suportam uma quantidade de ligação de hidrogênio entre si conhecida como emparelhamento da base Watson-Crick. A severidade da hibridização pode variar de acordo com as condições ambientais (isto é, química/física/biológica) circundando os ácidos nucleicos, temperatura, a natureza do método de hibridização, e a composição e comprimento das moléculas de ácidos nucleicos empregados. Os cálculos quanto às condições de hibridização necessários para alcançar os graus específicos de severidade são descritos em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); e Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York, 1993). A Tm é a temperatura em que 50 % de uma dada fita de uma molécula de ácido nucléico é hibridizada para sua fita complementar. A seguir está um conjunto exemplar de condições de hibridização e não é limitante: Severidade muito elevada (leva em conta a sequência que partilha pelo menos 90 % de identidade para hibridizar) Hibridização:5 x SSC a 65 °C durante 16 horas Lavar duas vezes:2 x SSC em temperatura ambiente (RT) durante 15 minutos cada Lavar duas vezes:0,5x SSC a 65 °C durante 20 minutos cada Severidade elevada (leva em conta a sequência que partilha pelo menos 80 % de identidade para hibridizar) Hibridização:5x-6x SSC a 65 °C a 70 °C durante 16 a 20 horas Lavar duas vezes:2x SSC em RT durante 5 a 20 minutos cada Lavar duas vezes:1x SSC a 55 °C a 70 °C durante 30 minutos cada Baixa severidade (leva em conta a sequência que partilha pelo menos 50 % de identidade para hibridizar) Hibridização:6x SSC em RT a 55 °C durante 16 - 20 horas Lavar pelo menos duas vezes:2x-3x SSC em RT a 55 °C durante 20 a 30 minutos cada.
[0074] A molécula de ácido nucléico pode ser uma molécula de ácido nucléico isolado e pode ser um molécula de RNA ou um DNA.
[0075] A sequência de aminoácido adicional pode ser selecionada a partir de uma helicase, uma nuclease, uma nuclease-helicase (por exemplo, Cas3), uma metiltransferase de DNA (por exemplo, Dam), uma desmetilase de DNA, uma histona metiltransferase, uma histona desmetilase, uma acetilase, uma deacetilase, uma fosfatase, uma cinase, um (co-)ativador de transcrição, uma subnidade de RNA polimerase, um repressor de transcrição, uma proteína de ligação de DNA, uma proteína de estruturação de DNA, uma proteína marcadora, uma proteína repórter, uma proteína fluorescente, uma proteína de ligação do ligando (por exemplo, mCherry ou uma proteína de ligação de metal pesado), um peptídeo sinal (por exemplo, sequência de sinal- Tat), uma sequência de localização subcelular (por exemplo, sequência de localização nuclear), ou um epítopo do anticorpo. A sequência de aminoácido adicional pode ser, ou de uma proteína diferente do organismo cujo subunidade(s) de proteína em Cascata relevante são derivadas.
[0076] A invenção inclui um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucléico como definido mais acima. Um vetor de expressão pode conter a sequência de nucleotídeos codificando uma subunidade única de proteína em Cascata e também a sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácido adicional, de acordo com a qual na expressão a subunidade e a sequência adicional são fundidas. Outros vetores de expressão podem compreender as sequências de nucleotídeos codificando apenas uma ou mais subunidades de proteína em Cascata que não são fundidas a qualquer sequência de aminoácido adicional.
[0077] A sequência de aminoácido adicional com o ácido nucléico ou a atividade modificadora da cromatina pode ser fundida a qualquer uma das subunidades em Cascata através deum polipeptídeo ligador. O ligador pode ser de qualquer comprimento até cerca de 60 ou até cerca de 100 resíduos de aminoácido. De preferência, o ligador tem um número de aminoácidos na faixa de 10 a 60, mais de preferência de 10 a 20. Os aminoácidos são, de preferência aminoácidos polares e/ou pequenos e/ou carregados (por exemplo, Gln, Ser, Thr, Pro, Ala, Glu, Asp, Lys, Arg, His, Asn, Cys, Tyr). O peptídeo ligador é, de preferência, projetado para se obter o posicionamento e o espaçamento correto da porção funcional fundida e a subunidade de em Cascata para a qual a porção é fundida para permitir a interação apropriada com o nucleotídeo alvo.
[0078] Um vetor de expressão da invenção (com ou sem a sequência de nucleotídeos codificando resíduos de aminoácido que na expressão devem ser fundidos a uma subunidade de proteína em Cascata) também pode compreender uma sequência codificando uma molécula de RNA como definido mais acima. Por conseguinte, tais vetores de expressão podem ser empregados em um hospedeiro apropriado para gerar uma ribonucleoproteína da invenção que pode atingir uma sequência de nucleotídeos desejada.
[0079] Desse modo, a invenção, da mesma forma, fornece um método de modificação, visualização, ou ativação ou transcrição da repressão de um ácido nucléico alvo compreendendo o contato do ácido nucléico com um complexo de ribonucleoproteína como definido mais acima. A modificação pode ser por meio de clivagem do ácido nucléico ou ligação ao mesmo.
[0080] A invenção, da mesma forma, inclui um método de modificação, visualização, ou ativação ou transcrição da repressão de um ácido nucléico alvo compreendendo o contato do ácido nucléico com um Complexo de proteína em cascata como definido mais acima, mais uma molécula de RNA como definido mais acima.
[0081] De acordo com os métodos acima, a modificação, visualização, ou ativação ou transcrição da repressão de um ácido nucléico alvo pode, por esse motive, ser realizada in vitro e em um ambiente livre de célula; isto é, o método é realizado como uma reação bioquímica se livre na solução ou se envolvendo uma fase sólida. O ácido nucléico alvo pode ser ligado a uma fase sólida, por exemplo.
[0082] Em um ambiente livre de célula, a ordem de adição de cada um dos ácidos nucleicos alvo, o Complexo de proteína em cascata e a molécula de RNA está na opção do perito versado médio. Os três componentes podem ser adicionados simultaneamente, sequencialmente em qualquer ordem desejada, ou separadamente em diferentes momentos e em uma ordem desejada. Deste modo, é possível para o ácido nucléico alvo e o RNA serem adicionados simultaneamente a uma mistura da reação e então o Complexo de proteína em cascata da invenção a ser adicionado separadamente e mais tarde em uma sequência das etapas do método específico.
[0083] A modificação, visualização, ou ativação ou transcrição da repressão de um ácido nucléico alvo pode ser feita in situ em uma célula, se uma célula isolada ou como parte de um tecido multicelular, órgão ou organismo. Por esse motivo no contexto todo o tecido e os órgãos, e no contexto de um organismo, o método pode ser realizado in vivo ou pode ser realizado por meio do isolamento de uma célula de todo o tecido, órgão ou organismo e então retornando a célula tratada com o complexo de ribonucleoproteína para seu local formador, ou um local diferente, se dentro do mesmo ou um diferente organismo. Deste modo, o método incluiria aloenxertos, autoenxertos, isoenxertos e xenoenxertos.
[0084] Nestas modalidades, o complexo de ribonucleoproteína ou o Complexo de proteína em cascata da invenção requerem uma forma apropriada de liberação na célula, que deve ser bem conhecido pelas pessoas de versatilidade na técnica, incluindo microinjeção, se no citoplasma da célula ou no núcleo.
[0085] Da mesma forma, quando presente separadamente, a molécula de RNA requer uma forma apropriada de liberação em uma célula, se simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com o Complexo de proteína em cascata. Tais formas de introdução de RNA nas células são bem conhecidas por uma pessoa de versatilidade na técnica e pode incluir liberação in vitro ou ex vivo através dos métodos convencionais de transfecção. Os métodos físicos, tais como, a microinjeção e a eletroporação, assim como, a co-precipitação de cálcio, e os lipídeos e os polímeros catiônicos comercialmente disponíveis, e os peptídeos de penetração na célula, as partículas de penetração na célula (pistola de gene) podem ser cada uma empregadas. Por exemplo, as viroses podem ser empregadas como veículos de liberação, se para o citoplasma e/ou núcleo - por exemplo, através da fusão (reversível) do Complexo de proteína em cascata da invenção ou um complexo de ribonucleoproteína da invenção com a partícula viral. A liberação viral (por exemplo, liberação de adenovírus) ou a liberação mediada pela Agrobacterium podem ser empregadas.
[0086] A invenção, da mesma forma, inclui um método de modificação visualização, ou ativação ou transcrição da repressão de um ácido nucléico alvo em uma célula, compreendendo transfecção, transformação ou transdução da célula com qualquer um dos vetores de expressão como descrito mais acima. Os métodos de transfecção, transformação ou transducção são dos tipos bem conhecido por uma pessoa de versatilidade na técnica. Onde existe um vetor de expressão empregado para gerar a expressão de um Complexo em cascata da invenção e quando o RNA é adicionado diretamente à célula então o mesmo ou um diferente método de transfecção, de transformação ou de transdução pode ser empregado. Semelhantemente, quando existe um vetor de expressão sendo empregado para gerar a expressão de um complexo de fusão em Cascata funcional da invenção e quando outro vetor de expressão está sendo empregado para gerar o RNA in situ através da expressão, e em seguida o mesmo ou um diferente método de transfecção, de transformação ou de transdução pode ser empregado.
[0087] Em outras modalidades, o mRNA codificando o Complexo em cascata da invenção é introduzido em uma célula a fim de que o Complexo em cascata seja expresso na célula. O RNA que guia o Complexo em cascata para a sequência alvo desejada também é introduzido na célula, se simultaneamente, separadamente ou sequencialmente do mRNA, de modo que o complexo de ribonucleoproteína necessário é formado na célula.
[0088] Nos métodos acima mencionados de modificação ou de visualização de um ácido nucléico alvo, a sequência de aminoácido adicional pode ser um marcador e o marcador de associa com o ácido nucléico alvo; de preferência, onde o marcador é uma proteína; opcionalmente uma proteína fluorescente, por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) ou proteína fluorescente amarela (YFP) ou mCherry. Se in vitro, ex vivo ou in vitro, e em seguida os métodos da invenção podem ser empregados para visualizar diretamente uma localização alvo em uma molécula de ácido nucléico, de preferência na forma de uma estrutura de ordem superior, tal como, um cromossoma ou plasmídeo superenrolado, ou um ácido nucléico alvo de fita única, tal como, mRNA. A visualização direta de uma localização pode empregar a micrografia eletrônica, ou a microscopia de fluorescência.
[0089] Outras espécies de rótulo podem ser empregadas para marcar o ácido nucléico alvo incluindo as moléculas corantes orgânicas, radiorótulos e rótulos de movimento giratório que podem ser moléculas pequenas.
[0090] Nos métodos da invenção descritos acima, o ácido nucléico alvo é DNA; de preferência dsDNA se bem que o alvo pode ser RNA; de preferência mRNA.
[0091] Nos métodos da invenção para a modificação, a visualização, a transcrição da ativação ou a transcrição da repressão de um ácido nucléico alvo em que o ácido nucléico alvo é dsDNA, a sequência de aminoácido adicional com o ácido nucléico ou a atividade modificadora da cromatina pode ser uma nuclease ou uma helicase-nuclease, e a modificação é, de preferência, uma ruptura de fita única ou de fita dupla em uma localização desejada. Nesta forma o corte específico de sequência única de DNA pode ser planejado por meio do uso dos complexos de porção em Cascata funcional. A sequência escolhida do componente do RNA do complexo final de ribonucleoproteína fornece a especificidade da sequência desejada para a ação da sequência de aminoácido adicional.
[0092] Por esse motivo, a invenção, da mesma forma, fornece um método de união da extremidade não homóloga de uma molécula de dsDNA em uma célula em uma localização desejada para remover pelo menos uma parte de uma sequência de nucleotídeo da molécula de dsDNA; opcionalmente para tornar inoperante a função de um gene ou genes, em que o método compreende a preparação de rupturas de fitas duplas empregando qualquer um dos métodos de modificação de um ácido nucléico alvo como descrito mais acima.
[0093] A invenção, da mesma forma, fornece um método de recombinação homóloga de um ácido nucléico em uma molécula de dsDNA em uma célula em uma localização desejada a fim de modificar uma sequência de nucleotídeo existentes ou inserir uma sequência de nucleotídeo desejadas, em que o método compreende a preparação de uma ruptura de fita única ou dupla na localização desejada empegando qualquer um dos métodos de modificação de um ácido nucléico alvo como descrito mais acima.
[0094] A invenção por esse motivo, da mesma forma, fornece um método de modificação, ativação ou de repressão da expressão de gene em um organismo compreendendo modificação, transcrição da ativação ou transcrição da repressão de uma sequência de ácido nucléico alvo de acordo com qualquer um dos métodos descritos mais acima, onde o ácido nucléico é dsDNA e a porção funcional é selecionada a partir de uma enzima de modificação de DNA (por exemplo, uma desmetilase ou deacetilase), um ativador de transcrição ou um repressor de transcrição.
[0095] A invenção adicionalmente fornece um método de modificação, ativação ou de repressão da expressão de gene em um organismo compreendendo modificação, transcrição da ativação ou transcrição da repressão de uma sequência de ácido nucléico alvo de acordo com qualquer um dos métodos descritos mais acima, onde o ácido nucléico é um mRNA e a porção funcional é uma ribonuclease; opcionalmente selecionada a partir de uma endonuclease, uma exonuclease 3’ ou uma exonuclease 5’.
[0096] Em qualquer um dos métodos da invenção como descrito acima, a célula que é submetida ao método pode ser um procariota. Semelhantemente, a célula pode ser uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de vegetal, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de fungo, uma célula de mamífero ou uma célula de humano. Quando a célula é de um mamífero ou humano então pode ser uma célula-tronco (mas não pode ser qualquer célula-tronco embriônica humana). Tais células-tronco para uso na invenção são, de preferência, células-tronco isoladas. Opcionalmente de acordo com qualquer método a invenção uma célula é transfectada in vitro.
[0097] De preferência também, em qualquer um dos métodos da invenção, o ácido nucléico alvo tem uma estrutura terciária específica, opcionalmente superenrolada, mais de preferência onde o ácido nucléico alvo é negativamente superenrolado. Vantajosamente, os complexos de ribonucleoproteínas da invenção, se produzidos in vitro, ou se formados dentro das células, ou se formados dentro das células através do maquinário de expressão da célula, podem ser empregados para atingir uma localização que deve, de outra forma, ser difícil de obter acesso a fim de aplicar a atividade funcional de um componente desejado, se a rotulação ou a etiquetagem de uma sequência específica, modificação da estrutura do ácido nucléico, ligando ou se desligando da expressão de gene, ou da modificação da própria sequência alvo envolvendo o corte de fita única ou dupla seguido pela inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo ou um cassete.
[0098] A invenção, da mesma forma, inclui uma composição farmacêutica compreendendo um Complexo de proteína em cascata ou um complexo de ribonucleoproteína da invenção como descrito mais acima.
[0099] A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucléico isolado ou um vetor de expressão da invenção como descrito mais acima.
[00100] Da mesma forma, é fornecido um kit compreendendo um Complexo de proteína em cascata da invenção como descrito mais acima mais uma molécula de RNA da invenção como descrito mais acima.
[00101] A invenção inclui um Complexo de proteína em cascata ou um complexo de ribonucleoproteína ou um ácido nucléico ou um vetor, como descrito mais acima para uso como um medicamento.
[00102] A invenção permite uma variedade de possibilidades de fisicamente alterar o DNA dos hospedeiros procarióticos ou eucarióticos em uma localização genômica específica, ou alterar os padrões de expressão de um gene em uma determinada localização. O DNA genômico do hospedeiro pode ser dividido ou modificado por meio de metilação, visualizado por meio de fluorescência, transcricionalmente ativado ou reprimido por meio de domínios funcionais, tais como, nucleases, metilases, proteínas fluorescentes, ativadores de transcrição ou repressores respectivamente, fundidos as subunidades em Cascata adequadas. Além do mais, a capacidade de ligação do RNA ao RNA administrado de em Cascata permite o monitoramento do tráfego de RNA nas células vivas empregando as proteínas de fusão em Cascata fluorescente, e fornece as formas de isolar ou de destruir os mRNAs hospedeiros causando interferência com os níveis de expressão de gene de uma célula hospedeira.
[00103] Em qualquer um dos métodos da invenção, o ácido nucléico alvo pode ser definido, de preferência assim sendo dsDNA, pela presença de pelo menos um dos tripletos de nucleotídeo que seguem: 5’-CTT-3’, 5’-CAT-3’, 5’-CCT-3’, ou 5’-CTC-3’ (ou 5’-CUU-3’, 5’-CAU-3’, 5’-CCU-3’, ou 5’-CTC-3’ se o alvo é um RNA). O local do tripleto está na fita alvo adjacente à sequência com o qual o componente da molécula de RNA de uma ribonucleoproteína da invenção se hibridiza. O tripleto marca o ponto na sequência de fita alvo em que o emparelhamento da base com o componente da molécula de RNA da ribonucleoproteína não tem lugar em uma direção 5’ a 3’ (a jusante) do alvo (embora toma lugar a montante da sequência alvo a partir desse ponto submetido ao comprimento preferido da sequência de RNA do componente da molécula de RNA da ribonucleoproteína da invenção). No contexto de um sistema de CRISPR tipo I nativo, os tripletos correspondes ao que é conhecido como um "PAM" (motivo adjacente ao protoespaçador). Para os alvos de ssDNA ou de ssRNA, a presença dos tripletos não é tão necessária.
[00104] A invenção será agora descrita em detalhes e em relação aos desenhos e exemplos específicos em que:
[00105] A Figura 1 mostra os resultados de ensaios de desvio em gel, onde se liga em cascata negativamente super-enrolados (NSC) DNA de plasmídeo de DNA, mas não relaxado. A) Gel-shift de DNA plasmídeo nSC com J3-Cascata, contendo uma segmentação (J3) crRNA. pUC-À foi misturado com duas vezes quantidades crescentes de J3-cascata, a partir de um pUC-À: Cascata relação molar de 1: 0,5 até 1 uma razão molar de 256. Os primeiros e os últimos faixas contêm apenas pUC-À. B) Gel-shift como em (A) com R44-Cascata contendo um cRNA não alvo (R44). C) Gel-shift como em (A) com Nt.BspQI cortado PUC-À. D) Gel-shift como em (A) com PDMI linearizada PUC-À. E) Ajuste da fração pUC-À ligado a J3-cascata em função da concentração de livre J3-Cascata dá a constante de dissociação (Kd) para a ligação específica. F) apto a fração de pUC-À ligado a R44-cascata em função da concentração de livre R44- Cascata dá a constante (Kd) para a ligação não específica de dissociação. Ligação L) específico de cascata para o protospacer monitorizada por análise de restrição, utilizando o local de restrição Bsml único na sequência protospacer. Faixa 1 e 5 contêm apenas pUC-À. Faixa 2 e 6 contêm PUC-À misturado com Cascata. Faixa 3 e 7 contêm PUC-À misturado com Cascata e posterior adição BsmI. Faixa 4 e 8 contêm pUC-À misturado com BsmI. H) Gel-shift da PUC-À ligado a Cascata com posterior clivagem Nt.BspQI de uma vertente do plasmídeo. Faixa 1 e 6 contêm apenas PUC-À. Faixa 2 e 7 contêm pUC-À misturado com cascata. Faixa 3 e 8 contêm PUC-À misturado com Cascata e posterior nicking Nt.BspQI. Faixa 4 e 9 contêm pUC-À misturado com cascata, seguido por adição de uma sonda de ADNcs complementar da cadeia deslocada no loop R e nicking subsequente com Nt.BspQI. Faixa 5 e 10 contêm pUC-À cortado com Nt.BspQI. H) Gel-shift da PUC-À ligado a Cascata com subseqüente nicking Nt.BspQI do plasmídeo. Faixa 1 e 6 contêm apenas PUC-À. Faixa 2 e 7 contêm pUC-À misturado com cascata. Faixa 3 e 8 contêm PUC-À misturado com Cascata e posterior clivagem Nt.BspQI. Faixa 4 e 9 contêm pUC-À misturado com cascata, seguido por adição de uma sonda de ADNcs complementar da cadeia deslocada no loop R e subsequente clivagem com Nt.BspQI. Faixa 5 e 10 contêm pUC-À clivado com Nt.BspQI. I) Gel-shift da PUC-À ligado a Cascata com posterior clivagem EcoRI de ambas as vertentes do plasmídeo. Faixa 1 e 6 contêm apenas PUC-À. Faixa 2 e 7 contêm pUC-À misturado com cascata. Faixa 3 e 8 contêm PUC-À misturado com Cascata e posterior clivagem EcoRI. Faixa 4 e 9 contêm pUC-À misturado com cascata, seguido por adição de uma sonda de ADNcs complementar da cadeia deslocada no loop R e subsequente clivagem com EcoRI. Faixa 5 e 10 contêm pUC-À clivado com EcoRI.
[00106] A Figura 2 mostra micrografias de varredura de força que demonstram como Cascata induz flexão de DNA alvo ao se ligar protoespaçador. A-P) Digitalização de imagens de microscopia de força de plasmídeo de DNA nSC com J3-Cascata contendo uma segmentação (J3) crRNA. pUC-À foi misturado com J3-cascata a um pUC-À: Cascata relação de 1: 7. Cada imagem mostra uma área de superfície de 500 x 500 nm. Pontos brancos correspondem a Cascata.
[00107] A Figura 3 mostra como a análise BiFC revela que Cascata e Cas3 interagir no reconhecimento alvo. A) Vênus fluorescência de células que expressam e CascataΔCse1 7Tm de CRISPR, que tem como alvo 7 protoespaçadores no genoma do fago, e À CSEL- N155Venus e proteínas de fusão Cas3-C85Vênus. Imagem À Campo brilhante das células (A). C) Sobreposição de (A) e (B). D) Vênus fluorescência de células infectadas que expressam fago À CascataΔCse1 e 7Tm de CRISPR, e Cse1-N155Venus e proteínas de fusão Cas3-C85Vênus. Imagem E) Campo brilhante das células em (L). F) Sobreposição de (G) e (H). G) Vênus de fluorescência de células infectadas fago À expressando CascataΔCsel e não alvo R44 de CRISPR e proteínas N155Venus e C85Venus. Imagem H) Campo brilhante das células em (J). I) Sobreposição de (J) e (K). J) médio da intensidade da fluorescência de 4 a 7 células individuais de todas as estirpes, como determinado usando a ferramenta de perfil do espectador LSM (Carl Zeiss).
[00108] A Figura 4 mostra cas3 nuclease e helicase atividades durante CRISPR-interferência. A) células BL21-AI competentes expressando Cascata, um mutante Cas3 e CRISPR J3 foram transformadas com a PUC-À. Unidades formadoras de colônias por micrograma de pUC-À (ADN ufc/mg) estão representados por cada uma das estirpes que expressam um mutante Cas3. Células que expressam peso Cas3 e J3 CRISPR OU R44 de CRISPR servem como controles positivos e negativos, respectivamente. B) células BL21-AI transportando Cascata, Cas3 mutante, e os plasmídeos de codificação CRISPR, assim como pUC-À são cultivadas sob condições que suprimem a expressão dos genes cas e CRISPR. Em t = 0 a expressão é induzida. A percentagem de células que perderam o pUC- À ao longo do tempo é mostrado, como determinado pela proporção de células resistentes à ampicilina e sensíveis à ampicilina.
[00109] A Figura 5 mostra como um complexo de fusão Cascata- Cas3 fornece na resistência in vivo e in vitro, tem atividade de nuclease. A) Coomassie azul manchado SDS-PAGE de purificada complexo de fusão Cascata e Cascata-Cas3. B) A eficiência de plaqueamento de fago À em células que expressam complexo de fusão Cascata-Cas3 e um direcionamento (J3) ou não alvo (R44) CRISPR e em células que expressam cascata e Cas3 separadamente em conjunto com um (J3) CRISPR de segmentação. C) Gel-shift (na ausência de íons metálicos bivalentes) de nSC alvo plasmídeo com complexo de fusão J3-Cascata-Cas3. pUC-À foi misturado com duas vezes quantidades crescentes de J3-Cascata-Cas3, a partir de um pUC-À: razão molar J3-Cascata-Cas3 de 1: 0,5 até 1 uma razão molar de 128. A primeira e a última faixa conter apenas PUC-À. D) Gel-shift (na ausência de íons metálicos bivalentes) de nSC não alvo plasmídeo com complexo de fusão J3-Cascata-Cas3. pUC-p7 foi misturado com duas vezes quantidades crescentes de J3-Cascata-Cas3, a partir de um pUC-P7: razão molar J3-Cascata-Cas3 de 1: 0,5 até 1 uma razão molar de 128. A primeira e a última faixa conter apenas PUC-P7. E) A incubação de nSC plasmídeo alvo (pUC-À, esquerda) ou nSC não alvo do plasmídeo (pUC-p7, direita), J3-Cascata-Cas3, na presença de 10 mM de MgCl2. Faixa 1 e 7 contêm apenas o plasmídeo. F) Ensaio como em (E), na presença de ATP 2 mM. L) Ensaio como em (E) com o mutante complexo J3-Cascata-Cas3K320N. H) Ensaio como em (G) na presença de ATP 2 mM.
[00110] A Figura 6 é um diagrama esquemático, que mostra um modelo do tipo CRISPR interferência I via em E. coli.
[00111] A Figura 7 é um diagrama esquemático, que mostra como uma forma de realização de fusão Cascata-FokI do invento é utilizado para criar dímeros FokI que corta dsDNA a produzir extremidades rombas, como parte de um processo de extremidade não homóloga aderir ou recombinação homóloga.
[00112] A Figura 8 mostra como a análise BiFC revela que Cascata e Cas3 interagir no reconhecimento alvo. Cobertura imagem Campo brilhante e Vênus fluorescência das células que expressam Cascata sem Cse1, Cse1-N155Venus e Cas3-C85Venus e quer 7Tm de CRISPR, que tem como alvo 7 protoespaçadores no fago Lambda genoma, ou o não direcionamento R44 de CRISPR de. As células que expressam 7Tm de CRISPR são fluorescente apenas quando infectadas com fago lambda, enquanto que as células que expressam R44 de CRISPR são não fluorescente. Os altamente intensos pontos fluorescentes (células externas) são devido aos cristais que refletem a luz de sal. As barras brancas correspondem a 10 mícron.
[00113] A Figura 9 mostra as sequências de pUC-À de quatro clones de [SEQ ID NOS: 39-42] codificam CRISPR J3, Cascata e Cas3 (em peso ou S483AT485A) indicam que estes são mutantes de escape transportam deleções (parciais) do protoespaçador ou transportando um único ponto mutação na região da semente, o que explica a incapacidade para curar estes plasmídeos.
[00114] A Figura 10 mostra os alinhamentos de sequências de genes cas3 de organismos contendo o sistema Tipo IE CRISPR/Cas. Alinhamento de genes cas3-cse1 de Streptomyces sp. SPB78 (primeira sequência, Número de acesso: ZP_07272643.1) [SEQ ID NO: 43], em Streptomyces griseus (segunda sequência, o Número de Acesso YP_001825054) [SEQ ID NO: 44], e em Catenulispora acidiphila DSM 44928 (sequência 3, Adesão Número YP_003114638) [SEQ ID NO: 45] e uma proteína artificial E. coli Cas3-Cse1 fusão [SEQ ID NO: 46], que inclui a sequência de ligação do polipeptídeo de S. griseus.
[00115] A Figura 11 mostra o plano de um par de nuclease CascataKKR/ELD em os domínios nuclease FokI são mutados de modo a que apenas os heterodímeros constituídos por KKR e DRA domínios são nuclease e a distância entre os locais de ligação opostas podem ser variadas para determinar a distância ideal entre uma cascata par nuclease.
[00116] A Figura 12 é um diagrama, mostrando esquemática do genoma alvo por um par de nuclease Cascata-FokI.
[00117] A Figura 13 mostra uma página de gel de complexos Cascata-nuclease SDS.
[00118] A Figura 14 mostra os géis de eletroforese dos ensaios de clivagem in vitro de CascataKKR/ELD no DNA do plasmídeo.
[00119] A Figura 15 mostra os padrões de clivagem CascataKKR/ELD e a frequência [SEQ ID NO: 47].
Exemplos - Materiais e métodos empregados Linhagens, Gene de clonagem, Plasmídeos e Vetores
[00120] E. coli BL21-AI e de E. coli BL21 (DE3) foram utilizados ao longo estirpes. A Tabela 1 lista todos os plasmídeos utilizados neste estudo. O pWUR408 descrito anteriormente, pWUR480, pWUR404 e pWUR547 foram utilizados para produção de Strep-tag II R44- Cascata, e pWUR408, pWUR514 e pWUR630 foram utilizados para produção de Strep-tag II J3-Cascata (Jore e outros, (2011) Nature Structural & Molecular Biology 18, 529-536;.. Semenova e outros, (2011) Anais da Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos da América 108, 10098-10103) PUC-À (pWUR610) e da PUC-P7 ( pWUR613) têm sido descritas em outro lugar (Jore e outros, 2011;. Semenova e outros, 2011). A proteína é codificada por C85Venus pWUR647, o que corresponde a pET52b (Novagen) contendo a construção sintética GA1070943 (Tabela 2) (Geneart) clonado entre os locais BamHI e NotI. A proteína é codificada por N155Venus pWUR648, o que corresponde a pRSF1b (Novagen) contendo a construção sintética GA1070941 (Tabela 2) (Geneart) clonado entre os locais NotI e XhoI. A proteína de fusão Cas3-C85Venus é codificada por pWUR649, o que corresponde a pWUR647 contendo o produto de amplificação, utilizando iniciadores Cas3 BG3186 e BG3213 (Tabela 3) entre os locais Ncol e BamHI. A proteína de fusão CASA-N155Venus é codificada por pWUR650, o que corresponde a pWUR648 contendo o produto de amplificação, utilizando iniciadores CasA BG3303 e BG3212 (Tabela 3) entre os locais Ncol e BamHI. 7Tm de CRISPR é codificada por pWUR651, o que corresponde a pACYCDuet-1 (Novagen) contendo a construção sintética GA1068859 (Tabela 2) (Geneart) clonado entre os locais Ncol e Kpnl. Os pWUR400 codificação cascata, a codificação WUR401 CascataΔCse1 e pWUR397 codificação cas3 foram descritos anteriormente (Jore e outros, 2011). A codificação pWUR652 Cas3H74A foi construído utilizando mutagênese dirigida ao local com os iniciadores de pWUR397 BG3093, BG3094 (Tabela 3). Tabela 1 - Plasmídeos empregados
Figure img0001
Figure img0002
Fonte 1 na tabela acima é Brouns e outros, (2008) Science 321, 960964. Fonte 2 na tabela acima é Jore e outros, (2011) Nature Structural & Molecular Biology 18:529 - 537. Tabela 2 - Construções Sintéticas
Figure img0003
Figure img0004
Tabela 3 - Iniciadores
Figure img0005
Produção e purificação de proteínas
[00121] Cascata foi expressa e purificada como descrito (Jore e outros, 2011). Ao longo de purificação de um tampão contendo 20 mM de HEPES pH 7,5, NaCl 75 mM, DTT 1 mM, EDTA 2 mM foi utilizado para ressuspensão e lavagem. Eluição das proteínas foi realizada no mesmo tampão contendo 4 mM de destiobiotina. O complexo de fusão Cascata-Cas3 foi expressa e purificada da mesma maneira, com as etapas de lavagem foram realizadas com 20 mM de HEPES pH 7,5, NaCl 200 mM e DTT a 1 mM, e a eluição em 20 mM de HEPES pH 7,5, 75 mM de NaCl, 1 mM DTT contendo 4 mM de destiobiotina. Ensaio de Desvio de Mobilidade Eletroforética
[00122] Purificados cascata ou cascata subsomplexes foram misturados com pUC-À num tampão contendo 20 mM de HEPES pH 7,5, NaCl 75 mM, DTT 1 mM, EDTA 2 mM, e incubados a 37 °C durante 15 minutos. As amostras foram corridas durante a noite em 0,8% de TAE agarose gel e pós-coradas com SYBR segura (Invitrogen) 1:10000 diluição em TAE durante 30 minutos. A clivagem com BsmI (Fermentas) ou Nt.BspQI (New England Biolabs) foi realizada em tampão de reação de HEPES suplementado com 5 mM de MgCl2. Microscópio de força de varredura
[00123] Purificada Cascata foi misturado com pUC-À (na proporção de 7:1, 250 nM cascata, 35 de ADN nM) num tampão contendo 20 mM de HEPES pH 7,5, NaCl 75 mM, DTT 0,2 mM, EDTA 0,3 mM e incubou-se a 37 °C durante 15 minutos. Subsequentemente, para a preparação da amostra de AFM, a mistura de incubação foi diluída 10 vezes em água duplamente destilada e MgCl2 foram adicionados a uma concentração final de 1,2 mM. A deposição dos complexos proteína-ADN e de imagem foi realizada como se descreveu antes (Dame e outros, (2000) Ácidos nucleicos Res. 28:.. 3504-3510).
Microscopia de fluorescência
[00124] Células BL21-AI transportando CRISPR em cas plasmídeos de codificação do gene, foram cultivadas durante a noite a 37 ° C em caldo de Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina (100 ug/ml), canamicina (50 ug/ml), estreptomicina (50 ug/ml ) e cloranfenicol (34 mg/ml). Cultura durante a noite foi diluída 1:100 em fresco contendo antibiótico LB e cresceu durante 1 hora a 37 ° C. Expressão de genes cas e CRISPR foi induzida durante 1 hora pela adição de L-arabinose a uma concentração final de 0,2% e de IPTG até a uma concentração final de 1 mM. Para a infecção, as células foram misturadas com o fago lambda a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 4. Células foram aplicadas a poli-L-lisina cobertas lâminas de microscópio, e analisadas utilizando um microscópio Zeiss LSM510 com foco a laser com base em um microscópio invertido Axiovert, com uma objetiva de imersão em óleo de 40X (NA de 1,3) e um laser de árgon como fonte de excitação (514 nm) e detecção a 530-600 nm. O furo foi fixado em 203 mm para todas as medições. Estudo transformação de pUC-À
[00125] LB contendo canamicina (50 ug/ml), estreptomicina (50 ug/ml) e cloranfenicol (34 mg/ml) foi inoculado a partir de uma pré- inoculo durante a noite e cultivadas a uma DO600 de 0,3. Expressão de genes cas e CRISPR foi induzida durante 45 minutos com 0,2% de L-arabinose e IPTG 1 mM. As células foram recolhidas por centrifugação a 4 ° C e tornada competente por ressuspensão em tampão gelado contendo RbCl2 100 mM, MnCl2 50 mM, acetato de potássio 30 mM, CaCl2 10 mM e 15% de glicerol, pH 5,8. Após uma incubação de 3 horas, as células foram recolhidas e ressuspensas em tampão contendo 10 mM de MOPS, 10 mM RbCl, CaCl2 75 mM, 15% de glicerol, pH 6,8. A transformação foi realizada adicionando 80 ng de pUC-À, seguido de um choque de calor 1 minuto a 42 ° C, e 5 minutos a frio de choque em gelo. Próximo células foram cultivadas em meio LB por 45 minutos a 37 °C antes do plaqueamento em placas de LB- agar contendo 0,2% de L-arabinose, 1 mM de IPTG, ampicilina (100 ug/ml), canamicina (50 ug/ml), estreptomicina (50 ug/ml) e cloranfenicol (34 mg/ml).
[00126] O plasmídeo de cura foi analisada por transformar células BL21-AI contendo gene cas e CRISPR plasmídeos de codificação com pUC-À, enquanto o crescimento das células na presença de 0,2% de glucose para suprimir a expressão do gene da T7 polimerase. Expressão de genes cas e CRISPR foi induzida através da recolha das células e ressuspensão em LB contendo 0,2% de arabinose e 1 mM de IPTG. As células foram plaqueadas em LB-ágar contendo ou estreptomicina, canamicina e cloranfenicol (não selectivos para pUC-À) ou a ampicilina, estreptomicina, canamicina e cloranfenicol (seletiva para pUC-À). Após crescimento durante a noite a percentagem de perda de plasmídeo pode ser calculada a partir da razão de unidades formadoras de colônias nas placas seletivas e não seletivas. Estudos de infecção do fago lambda
[00127] Sensibilidade hospedeira à infecção por fagos foi testada usando um fago virulento Lambda (Àvir), Como em (Brouns e outros, (2008) Science 321, 960-964.). A sensibilidade do hospedeiro à infecção foi calculada como a eficiência de plaqueamento (o rácio de contagem de placa de uma estirpe contendo um anti-CRISPR À ao da estirpe contendo um não alvo R44 CRISPR) como descrito no Brouns e outros, (2008) .
Exemplo 1 - Cascata se liga exclusivamente ADN alvo super-enrolado negativamente
[00128] A 3 kb do plasmídeo pUC19-derivado denotado pUC-À, contém um fragmento de ADN de 350 pb, correspondente a uma parte do gene J de fago À, que é dirigido pela J3-cascata (Cascata associada com crRNA contendo espaçador J3 (Westra e outros, (2010 ) Molecular Microbiology 77, 1380-1393). Os ensaios de desvios de mobilidade electroforética indicam que Cascata tem alta afinidade somente para super-enrolado negativamente (NSC) alvo plasmídeo. A uma razão molar de J3-Cascata para pUC-À de 06:01 todos nSC plasmídeo foi ligado pela cascata, (ver Figura 1A), enquanto cascata que leva a não específica não alvo crRNA R44 (R44-Cascata) exibido ligação a uma razão molar de 128:1 (ver Figura 1B). A constante de dissociação ( Kd) de nSC PUC-À estava determinado a ser de 13 ± 1,4 nM para J3-Cascata (ver Figura 1E) e 429 ± 152 nM para R44-Cascata (ver Figura 1F).
[00129] J3-Cascata foi incapaz de se ligar ao DNA alvo descontraído com afinidade mensurável, como cortado (ver Figura 1C) ou PUC-À linear (ver Figura 1D), mostrando que Cascata tem alta afinidade por substratos de DNA maiores, com uma topologia nSC.
[00130] Para distinguir a ligação não específica da ligação específica, utilizou-se o sítio de restrição Bsml localizado dentro do protoespaçador. Enquanto a adição de enzima para Bsml pUC-À dá um produto linear, na presença de R44-cascata (ver Figura 1G, faixa 4), pUC-À está protegido de Bsml de clivagem na presença de J3- cascata (ver Figura 1G, faixa 7), indicando ligação específica ao protoespaçador. Isto mostra que Cas3 não é necessário in vitro para ligação específica da sequência de cascata para uma sequência protoespaçador num plasmídeo nSC.
[00131] Ligação a nSC pUC-À Cascata foi seguido por entalhamento com Nt.BspQI, dando origem a uma topologia de OC. Cascata é libertado a partir do plasmídeo após vertente corte, como pode ser visto a partir da ausência de um desvio de mobilidade (ver Figura 1H, comparar faixa 8 a faixa 10). Em contraste, Cascata permanece ligada ao seu ADN alvo, quando uma sonda de ADNcs complementar da cadeia deslocada é adicionado à reação antes da clivagem do ADN pela Nt.BspQI (ver Figura 1H, faixa 9). A sonda estabiliza artificialmente o circuito R de Cascata no DNA alvo relaxado. Observações similares são feitas quando ambas as cadeias de DNA de pUC-À são clivadas após ligação em cascata (ver Figura 1I, faixa 8 e faixa 9).
Exemplo 2 - Cascata induz flexão de DNA alvo encadernado
[00132] Complexos formados entre purificada Cascata e da PUC-À foram visualizados. Complexos específicos que contêm um único complexo J3-cascata ligados foram formadas, enquanto inespecífica R44-Cascata não produz complexos de DNA ligado a este ensaio, sob condições idênticas. Fora de 81 moléculas de DNA observados 76% foram encontrados para ter J3-Cascata obrigada (ver Figura 2A-P). Desses complexos, na maioria dos casos Cascata foi encontrado no topo de um arco (86%), a etapa que apenas uma pequena fração foi encontrada em posições não apicais (14%). Estes dados mostram que as causas de ligação em cascata de flexão e, possivelmente, de embrulho do ADN, provavelmente, para facilitar a fusão local do duplex de ADN.
Exemplo 3 - fusões de Cas3 e Cse1 que ocorrem naturalmente: Cas3 interage com Cascata no reconhecimento protoespaçador
[00133] Figura S3 mostra análise da sequência de genes CAS3 de organismos contendo o tipo de sistema de IE CRISPR/Cas revela que Cas3 e Cse1 ocorrer como proteínas de fusão em Streptomyces sp. SPB78 (Número de acesso: ZP_07272643.1), em Streptomyces griseus (Número de Acesso YP_001825054), e em Catenulispora acidiphila DSM 44928 (Número de Acesso YP_003114638).
Exemplo 4 - Bimolecular fluorescência complementação (BiFC) mostra como uma proteína de fusão Cse1 formando parte da cascata continua para interagir com Cas3.
[00134] Experimentos BiFC foram utilizados para monitorar as interações entre Cas3 e Cascata in vivo antes e depois da infecção do fago À. Experimentos BIFC invocar a capacidade das metades não fluorescentes de uma proteína fluorescente, por exemplo, proteína fluorescente amarela (YFP) e redobrar para formar uma molécula fluorescente quando as duas metades de ocorrer na proximidade. Como tal, proporciona uma ferramenta para revelar interações proteína-proteína, uma vez que a eficiência de redobragem é grandemente melhorada se as concentrações locais são elevados, por exemplo, quando as duas metades da proteína fluorescente são fundidos com os parceiros de interação. Cse1 foi fundido no terminal C com o terminal N de 155 aminoácidos de Vênus (Cse1-N155Venus), uma versão melhorada de YFP (Nagai e outros, (2002) Nature Biotechnology 20, 87-90). Cas3 era C-terminal fundido aos 85 aminoácidos do terminal C de Vênus (Cas3-C85Venus).
[00135] A análise revela que BiFC Cascata não interage com Cas3 na ausência de invadir o ADN (Figura 3ABC, Figura 3P e. Figura 8). Após a infecção com fago À, no entanto, as células que expressam CascataΔCsel, CSEL-N155Venus e Cas3-C85Vênus são fluorescentes se que co-expressam o anti-À 7Tm de CRISPR (Figura 3DEF, Figura 3P e. Figura 8). Quando co-expressa uma não alvo R44 de CRISPR (Figura 3GHI, Figura 3P e. Figura 8), as células permanecem não fluorescente. Isso mostra que a Cascata e Cas3 interagir especificamente durante a infecção no momento do reconhecimento protoespaçador e que Cse1 e Cas3 estão em estreita proximidade um do outro no complexo binário efetor da Cascata-Cas3.
[00136] Estes resultados também mostram claramente que uma fusão de Cse1 com uma proteína heteróloga não perturbar a formação de ribonucleoproteína cascata e crRNA, nem afetar a interação de cascata e Cas3 com o ADN do fago alvo, mesmo quando a própria Cas3 é também uma proteína de fusão.
Exemplo 5 - Preparação de um projetado fusão Cas3-Cse1 dá uma proteína com atividade funcional in vivo
[00137] Prover à evidência vitro para Cas3 atividade de clivagem de DNA exigido purificada e ativo Cas3. Apesar das várias estratégias de solubilização, Cas3 superproduzido (Howard e outros, (2011) Biochem. J. 439, 85-95), em E. coli BL21 está presente principalmente nos agregados inativos e corpos de inclusão. Cas3, por conseguinte, foi produzido como uma proteína de fusão Cas3-Cse1, contendo um ligante idêntico ao da proteína de fusão Cas3-Cse1 em S. griseus (ver Figura 10.). Quando co-expressa com CascataΔCse1 CRISPR e J3, a fusão do complexo era solúvel e foi obtido com elevado grau de pureza com a mesma estequiometria aparente como cascata (Figura 5A). Quando a funcionalidade deste complexo foi testada para proporcionar resistência contra a infecção À fago, a eficiência de plaqueamento (EOP) em células que expressam a fusão do complexo J3-Cascata-Cas3 era idêntico em células que expressam as proteínas separadas (Figura 5B).
[00138] Uma vez que a fusão do complexo J3-Cascata-Cas3 era funcional in vivo, os ensaios in vitro de clivagem de DNA foram realizadas usando este complexo. Quando J3-Cascata-Cas3 foi incubada com pUC-À na ausência de metais divalentes, a ligação do plasmídeo foi observada em proporções molares semelhantes aos observados para Cascata (Figura 5C), ao etapa que um específico de ligação a um plasmídeo não alvo ( pUC-p7, um plasmídeo derivado de pUC19 com o mesmo tamanho como pUC-À, mas falta um protoespaçador), ocorreu somente em elevadas razões molares (Figura 5D), que indica que um ADN específico de ligação do complexo é também semelhante ao do cascata sozinho.
[00139] Curiosamente, a fusão J3-Cascata-Cas3 exibe complexas magnésio atividade endonuclease dependente NSC plasmídeos alvo. Na presença de 10 mM de Mg2++ nicks J3-Cascata-cas3 nSC pUC-À (Figura 5E, faixas 3-7), mas não é observado para a clivagem de substratos que não contêm a sequência alvo (Figura 5E, faixa 9 - 13), ou que possuem uma topologia relaxado. Nenhuma mudança da banda OC resultante é observada, em conformidade com as observações anteriores de que Cascata dissocia espontaneamente após a clivagem, sem a necessidade de atividade de helicase dependente de ATP Cas3. Em vez disso, a atividade de helicase de Cas3 parece estar envolvida na degradação exonucleolítica plasmídeo. Quando ambos de magnésio e ATP são adicionadas à reação, a degradação do plasmídeo completo ocorreu (Figura 5H).
[00140] Os inventores descobriram que por si só cascata é incapaz de se ligar protoespaçadores no ADN relaxado. Em contraste, os inventores descobriram que a cascata localiza eficientemente alvos de ADN super-enrolado negativamente, e subsequentemente recruta Cas3 através da subunidade Cse1. Clivagem endonucleolítica pelo domínio HD-nuclease Cas3 provoca a liberação espontânea de Cascata do DNA através da perda de super-enrolamento, remobilizando a Cascata para localizar novas metas. O alvo é em seguida progressivamente desenrolada e clivada pela atividade de helicase dependente de ATP das articulações e a atividade de nuclease de HD Cas3, levando à completa degradação do ADN alvo e a neutralização do invasor.
[00141] Referindo-se à Figura 6, e sem querer estar ligado a qualquer teoria em particular, um mecanismo de operação para o tipo de interferência CRISPR-I via em E. coli podem envolver (1) Em primeiro lugar, uma cascata realização crRNA digitaliza o plasmídeo de ADN de um nSC protoespaçador, com PAM adjacente. Se durante essa separação fase vertente ocorre é desconhecida. (2) protoespaçador específica sequência de ligação é conseguida através de emparelhamento de bases entre a crRNA e a cadeia complementar de DNA, formando um laço-R. Após a ligação, Cascata induz flexão do DNA. (3) A subunidade Cse1 de Cascata recruta Cas3 mediante ligação ao DNA. Isto pode ser conseguido por alterações conformacionais da cascata que ocorrem após ligação de ácido nucleico. (4) A-HD domínio (parte mais escura) de Cas3 catalisa corte Mg2+ dependentes da cadeia deslocada do circuito de R-, alterando, assim, a topologia do plasmídeo alvo de NSC OC relaxado. (5-A e 5-B) O relaxamento plasmídeo provoca dissociação espontânea de Cascata. Entretanto Cas3 exibe atividade de exonuclease dependente de ATP no plasmídeo alvo, exigindo o domínio da helicase para ADNcd alvo de desenrolamento e o domínio de HD-nuclease para a atividade de clivagem sucessiva. (6) Cas3 degrada todo o plasmídeo de uma maneira dependente de ATP, uma vez que se move ao longo através de um processo, desenrola e se unirá a meta dsDNA.
Exemplo 6 - preparação de proteínas artificiais fusão tag Cas-strep e montagem de Cascata complexos
[00142] Complexos de cascata são produzidos e purificados como descrito em Brouns e outros, (2008) Science 321: 960 4 (2008), utilizando os plasmídeos de expressão enumerados na Tabela 3 complementar de Jore e outros, (2011) Nature Structural & Molecular Biology 18: 529-537 . Cascata é rotineiramente purificado com um N terminal de Strep-tag II fundido a CASB (ou CASC em CasCDE). Cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex 200 HR 10/30 (EG)) é realizada utilizando 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 M de NaCl, 1 mM de ditiotreitol. Preparações Cascata (~ 0,3 mg) foram incubadas com ADNase I (Invitrogen) na presença de MgCl2 2,5 mM durante 15 min a 37 ° C antes da análise de exclusão de tamanho. Os ácidos nucleicos que co-purificados são isolados por extração utilizando um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) a pH 8,0 (Fluka), e incubadas com ADNase I (Invitrogen) suplementado com MgCl2 a 2,5 mM ou de RNase A ( Fermentas) durante 10 min a 37 °C. Proteínas de subunidade Cas fundidos com a sequência de aminoácidos de Strep-Tag são produzidos.
[00143] Ensaios de placas, mostrando a atividade biológica dos Strep-Tag subunidades Cascata são realizadas utilizando bacteriófago lambda e a eficiência de plaqueamento (EOP), foi calculado conforme descrito no Brouns e outros, (2008).
[00144] Para a purificação de crRNA, as amostras são analisadas por par iónico inverteu-faseado-HPLC num Agilent 1100 HPLC com detector de UV260nm (Agilent), utilizando uma coluna de 50 mm x DNAsep 4,6 mm Dl (Transgenomic, San Jose, CA). A análise cromatográfica é realizada utilizando as seguintes condições tampão: A) de 0,1 M de acetato de trietilamónio (TEAA) (pH 7,0) (Fluka); B) tampão A com 25% LC MS acetonitrilo de grau (v/v) (Fisher). crRNA é obtido por injeção de Cascata intacta purificada a 75 ° C usando um gradiente linear começando a 15% de tampão B e que se estende para 60% B em 12,5 min, seguido de uma extensão linear de 100% de B durante 2 minutos com uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min. A hidrólise do terminal fosfato cíclico foi realizada incubando a crRNA purificado por HPLC numa concentração final de HCl 0,1 M a 4 ° C durante 1 hora. As amostras são concentradas até 5-10 ul num concentrador de vácuo (Eppendorf) antes da análise por ESI-MS.
[00145] Análise por espectrometria de massa de ionização Electrospray crRNA é realizada no modo negativo usando um espectrômetro de massa UHR-TOF (Maxis) ou um Ultra instrumento PTM Descoberta HCT (ambos Bruker Daltonics), acoplado a um sistema de cromatografia líquida capilar on-line (Ultimate 3000, Dionex, Reino Unido ). Separações de RNA são realizadas utilizando um monolítico (PS-DVB) coluna capilar (200 um x 50 mm de diâmetro, Dionex, Reino Unido). A cromatografia é realizada utilizando as seguintes condições tampão: C) 0,4 M de 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2- propanol (HFIP, Sigma-Aldrich) ajustado com trietilamina (TEA) até pH 7,0 e 0,1 TEAA mM, e D) de tampão C, com 50% de metanol (v/v) (Fisher). Análise de RNA é realizada a 50 ° C com 20% de tampão D, que se estende a 40% de D, em 5 minutos, seguido de uma extensão linear de 60% D ao longo de 8 min a uma taxa de fluxo de 2 mL/min.
[00146] Cascata proteína é analisada por espectrometria de massa nativa em 0,15 M de acetato de amônio (pH 8,0) a uma concentração de proteína de 5 uM. A preparação de proteína é obtido por concentração e de diluição de cinco etapas sequenciais a 4 ° C, utilizando um filtro centrífugo com um corte de 10 kDa (Millipore). Proteínas são pulverizados de capilares de vidro de borosilicato e analisadas em um LCT electrospray time-of-flight ou modificados instrumentos quadrupolo time-of-flight (tanto Waters, UK) ajustados para um ótimo desempenho na detecção de alta massa (ver Tahallah N e outros, (2001) Rápido Commun Mass Spectrom 15:. 596-601 (2001) e van den Heuvel, RH e outros, Anal Chem 78:. 7473-83 (2006) medições de massa exata do Cas proteínas individuais foram adquiridos sob condições de desnaturação (50% de acetonitrila, . MQ 50%, ácido fórmico a 0,1%) Sub-complexos em solução foi gerada pela adição de 2-propanol à solução de pulverização a uma concentração final de 5% (v/v), as configurações do instrumento foram os seguintes: voltagem. agulha ~ 1,2 kV, voltagem do cone ~ 175 V, fonte de pressão 9 mbar. Xenon foi utilizado como gás de colisão para mbar. colisão A tensão variou entre 10-200 V.
[00147] Eletroforéticos ensaios de desvio de mobilidade (EMSA) são usados para demonstrar a atividade funcional dos complexos de cascata de ácidos nucleicos alvo. EMSA é realizada por incubação de cascata, ou CasBCDE CasCDE com 1 nM de ácido nucleico marcado em 50 mM Tris-Cl pH 7,5, 100 mM de NaCl. ADN de esperma de salmão (Invitrogen) é utilizado como competidor. As reacções de EMSA foram incubadas a 37 ° C durante 20-30 minutos antes da electroforese em géis de 5% de poliacrilamida. Os géis são secos e analisados por meio de telas de armazenamento de fósforo e um gerador de imagens de fósforo de PMI (Bio-Rad). De ligação ao ADN alvo e a atividade de clivagem de cascata é testado na presença de Ca 1-10 mM, Mg ou Mn-ions.
[00148] Alvos de DNA são longos oligonucleotídeos purificado de gel (Isogen Ciências da Vida ou Biolegio), listadas na Tabela Suplementar 3 de Jore e outros, (2011). Os oligonucleótidos são usando Y32 P-ATP (PerkinElmer) e cinase de T4 (Fermentas) marcado na extremidade. Alvos de cadeia dupla de DNA são preparados por emparelhamento de oligonucleótidos complementares e digestão de ADNcs restantes com exonuclease I (Fermentas). Alvos são rotulados RNA transcrito in vitro utilizando T7 Maxiscript ou T7 mega kits Shortscript (Ambion) com α32P- CTP (PerkinElmer) e remoção de modelo por DNase I (Fermentas) digestão. Duplo alvos de ARN de cadeia são preparados por emparelhamento RNAs complementares e digerindo excedente ARNcs com RNase T1 (Fermentas), seguido por extração com fenol.
[00149] Ensaios de mudança de mobilidade do plasmídeo são realizadas utilizando pWUR613 plasmídeo contendo o protoespaçador R44. O fragmento contendo o protoespaçador é amplificado por PCR a partir de ADN genômico utilizando iniciadores P7 bacteriófago BG3297 e BG 3298 (ver Tabela 3 complementar de Jore e outros, (2011). Plasmídeo (0,4 mg) e Cascata foram misturadas numa proporção de 1:10 molar em num tampão contendo Tris-HCl a 5 (pH 7,5) e NaCl 20 mM e proteínas da cascata incubados a 37 ° C durante 30 minutos. foram, em seguida, removido por tratamento com proteinase K (Fluka) (0,15 L, 15 min, 37 ° C) seguido por extração com fenol/clorofórmio. complexos de ARN-ADN foram tratados com ARNase H (Promega) (2 U, 1 h, 37 °C).
[00150] Strep-Tag-Cas fusões de proteínas de subunidade, que formam complexos de proteínas da cascata ou sub-complexos ativos com o componente de ARN (equivalente a um crRNA), têm a atividade biológica e funcional esperado de digitalização e de ligação e de clivagem de alvos de ácidos nucleicos específicas. As fusões das subunidades Cas com as cadeias de aminoácidos de corantes fluorescentes também formar complexos de cascata e sub-complexos com o componente de ARN (equivalente a crRNA) que retém a atividade biológica e funcional e permite a visualização da localização de uma sequência de ácido nucleico alvo em ds DNA, por exemplo.
Exemplo 7 - Um par Cascata de nuclease e teste de atividade in vitro de nuclease
[00151] Seis mutações designadas "Sharkey" foram introduzidas por mutagênese ao acaso, e rastreio para melhorar a atividade de nuclease e estabilidade do domínio nuclease não específica de Flavobacterium okeanokoites enzima de restrição Fokl (ver Guo, J. e outros, (2010) J. Mol. Biol 400:. 96-107). Outras mutações foram introduzidas que reduzir a atividade off-alvo clivagem. Isto é conseguido por engenharia interações eletrostáticas na interface do dímero FokI de um par ZFN, criando uma variante FokI com uma interface com carga positiva (KKR, E490K, I538K, H537R) e outro com uma interface com carga negativa (ELD, Q486E, I499L, N496D ) (. ver Doyon, Y., e outros, (2011) Nature Methods 8: 74-9). Cada uma destas variantes é cataliticamente inactivo como um homodímero, reduzindo, assim, a frequência de corte para fora do alvo. Plano Cascata-nuclease
[00152] Nós fundida na tradução com melhorados nucleases FokI para o N-terminal de Cse1 para gerar variantes de Cse1 sendo FokIKKR-Cse1 e FokIELD-Cse1, respectivamente. Estas duas variantes são co-expressa com subunidades Cascata (Cse2, CAS7, cas5 e Cas6e), e um dos dois plasmídeos CRISPR distintos com espaçadores uniformes. Isso carrega o complexo CascataKKR com uniforme P7- crRNA, eo complexo CascataELD com uniforme M13 g8-crRNA. Estes complexos são purificados usando o N-terminal marcado com StrepII Cse2 como descrito no Jore, MM, e outros, (2011) Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (5): 529-536. Além disso, um etapa de purificação adicional pode ser realizada utilizando um FokI N-terminal marcado com His, para assegurar a purificação de comprimento completo e os complexos de fusão da cascata de nuclease intactas.
[00153] As sequências de aminoácidos e nucleotídeo das proteínas de fusão empregadas neste exemplo foram como segue: >sequência de nucleotídeos de FokI-(Sharkey-ELD)-Cse1 ATGGCTCAACTGGTTAAAAGCGAACTGGAAGAGAAAAAAA AGTGAACTGCGCCACAAACTGAAATATGTGCCGCATGAATATATC GAGCTGATTGAAATTGCACGTAATCCGACCCAGGATCGTATTCTG GAAATGAAAGTGATGGAATTTTTTATGAAAGTGTACGGCTATCGCG GTGAACATCTGGGTGGTAGCCGTAAACCGGATGGTGCAATTTATA CCGTTGGTAGCCCGATTGATTATGGTGTTATTGTTGATACCAAAGC CTATAGCGGTGGTTATAATCTGCCGATTGGTCAGGCAGATGAAAT GGAACGTTATGTGGAAGAAAATCAGACCCGTGATAAACATCTGAA TCCGAATGAATGGTGGAAAGTTTATCCGAGCAGCGTTACCGAGTT TAAATTCCTGTTTGTTAGCGGTCACTTCAAAGGCAACTATAAAGCA CAGCTGACCCGTCTGAATCATATTACCAATTGTAATGGTGCAGTTC TGAGCGTTGAAGAACTGCTGATTGGTGGTGAAATGATTAAAGCAG GCACCCTGACCCTGGAAGAAGTTCGTCGCAAATTTAACAATGGCG AAATCAACTTTGCGGATCCCACCAACCGCGCGAAAGGCCTGGAA GCGGTGAGCGTGGCGAGCatgaattt gcttattgataactggattcctgtacgcccgcgaaacggggggaaagtccaaatcataaatctgc aatcgctatactgcagtagagatcagtggcgattaagtttgccccgtgacgatatggaactggccg 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AACTGGTTAAAAGCGAACTGGAAGAGAAAAAAAGTGAACTGCGCC ACAAACTGAAATATGTGCCGCATGAATATATCGAGCTGATTGAAAT TGCACGTAATCCGACCCAGGATCGTATTCTGGAAATGAAAGTGAT GGAATTTTTTATGAAAGTGTACGGCTATCGCGGTGAACATCTGGG TGGTAGCCGTAAACCGGATGGTGCAATTTATACCGTTGGTAGCCC GATTGATTATGGTGTTATTGTTGATACCAAAGCCTATAGCGGTGGT TATAATCTGCCGATTGGTCAGGCAGATGAAATGGAACGTTATGTG GAAGAAAATCAGACCCGTGATAAACATCTGAATCCGAATGAATGG TGGAAAGTTTATCCGAGCAGCGTTACCGAGTTTAAATTCCTGTTTG TTAGCGGTCACTTCAAAGGCAACTATAAAGCACAGCTGACCCGTC TGAATCATATTACCAATTGTAATGGTGCAGTTCTGAGCGTTGAAGA ACTGCTGATTGGTGGTGAAATGATTAAAGCAGGCACCCTGACCCT GGAAGAAGTTCGTCGCAAATTTAACAATGGCGAAATCAACTTTGC GGATCCCACCAACCGCGCGAAAGGCCTGGAAGCGGTGAGCGTG GCGAGCatgaatttgcttattgataactggattcctgtacgcccgcgaaacggggggaaagtc caaatcataaatctgcaatcgctatactgcagtagagatcagtggcgattaagtttgccccgtgac gatatggaactggccgctttagcactgctggtttgcattgggcaaattatcgccccggcaaaagat gacgttgaatttcgacatcgcataatgaatccgctcactgaagatgagtttcaacaactcatcgcgc cgtggatagatatgttctaccttaatcacgcagaacatccctttatgcagaccaaaggtgtcaaag caaatgatgtgactccaatggaaaaactgttggctggggtaagcggcgcgacgaattgtgcattt gtcaatcaaccggggcagggtgaagcattatgtggtggatgcactgcgattgcgttattcaaccag gcgaatcaggcaccaggttttggtggtggttttaaaagcggtttacgtggaggaacacctgtaaca acgttcgtacgtgggatcgatcttcgttcaacggtgttactcaatgtcctcacattacctcgtcttcaaa aacaatttcctaatgaatcacatacggaaaaccaacctacctggattaaacctatcaagtccaatg agtctatacctgcttcgtcaattgggtttgtccgtggtctattctggcaaccagcgcatattgaattatg cgatcccattgggattggtaaatgttcttgctgtggacaggaaagcaatttgcgttataccggttttctt aagga aaaatttacctttacagttaatgggctatggccccatccgcattccccttgtctggtaacagtcaaga aaggggaggttgaggaaaaatttcttgctttcaccacctccgcaccatcatggacacaaatcagc cgagttgtggtagataagattattcaaaatgaaaatggaaatcgcgtggcggcggttgtgaatcaa ttcagaaatattgcgccgcaaagtcctcttgaattgattatggggggatatcgtaataatcaagcatc tattcttgaacggcgtcatgatgtgttgatgtttaatcaggggtggcaacaatacggcaatgtgataa acgaaatagtgactgttggtttgggatataaaacagccttacgcaaggcgttatatacctttgcaga agggtttaaaaataaagacttcaaaggggccggagtctctgttcatgagactgcagaaaggcatt tctatcgacagagtgaattattaattcccgatgtactggcgaatgttaatttttcccaggctgatgaggt aatagctgatttacgagacaaacttcatcaattgtgtgaaatgctatttaatcaatctgtagctccctat gcacatcatcctaaattaataagcacattagcgcttgcccgcgccacgctatacaaacatttacgg gagttaaaaccgcaaggagggccatcaaatggctga [SEQ ID NO: 24] >sequência de proteína de His6-Dual-monopartido NLS SV40-FokI- (Sharkey-ELD)- Cse1 MHHHHHHPKKKRKVDPKKKRKVEDPKDMAQLVKSELEE KKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNPTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGE HLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMERYV EENQTRDKHLNPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLN HITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFADPTNRA KGLEAVSVASMNLLIDNWIPVRPRNGGKVQIINLQSLYCSRDQWRLSLP RDDMELAALALLVCIGQIIAPAKDDVEFRHRIMNPLTEDEFQQLIAPWID MFYLNHAEHPFMQTKGVKANDVTPMEKLLAGVSGATNCAFVNQPGQ GEALCGGCTAIALFNQANQAPGFGGGFKSGLRGGTPVTTFVRGIDLRS TVLLNVLTLPRLQKQFPNESHTENQPTWIKPIKSNESIPASSIGFVRGLF WQPAHIELCDPIGIGKCSCCGQESNLRYTGFLKEKFTFTVNGLWPHPH SPCLVTVKKGEVEEKFLAFTTSAPSWTQISRVVVDKIIQNENGNRVAAV VNQFRNIAPQSPLELIMGGYRNNQASILERRHDVLMFNQGWQQYGNVI NEIVTVGLGYKTALRKALYTFAEGFKNKDFKGAGVSVHETAERHFYRQ SELLIPDVLANVNFSQADEVIADLRDKLHQLCEMLFNQSVAPYAHHPKLI STLALARATLYKHLRELKPQGGPSNG* [SEQ ID NO: 25] Ensaio da clivagem do DNA
[00154] A especificidade e atividade dos complexos foi testada usando um plasmídeo alvo artificialmente construído como um substrato. Este plasmídeo contém os locais de ligação de M13 e P7 em cadeias opostas de tal modo que ambos os domínios FokI enfrentam uns aos outros (ver Figura 11). A distância entre os locais de ligação em cascata varia entre 25 e 50 pares de bases, com incrementos de 5 pb. À medida que os sítios de ligação de Cascata precisam ser ladeado por qualquer um dos quatro sequências PAM conhecidos (5'-protoespaçador- CTT/CAT/CTC/CCT-3 'esta distância dá flexibilidade suficiente para projetar um tal par para quase qualquer sequência.
[00155] As sequências dos plasmídeos alvo utilizadas são como se segue. O número indica a distância entre os locais alvo M13 e P7. Protoespaçadores são mostrados em negrito, sublinhado PAMs:
[00156] Sequências dos plasmídeos alvo. O número indica a distância entre os locais alvo M13 e P7. (protoespaçadores em negrito, PAMs sublinhado) >50 bp gaattcACAACGGTGAGCAAGTCACTGTTGGCAAGCCAGGA ATCTGAACAATACCGTCTTGCTTTCGAGCGCTAGCTCTAGAACTA GTCCTCAGCCTAGGCCTCGTTCCGAAGCTGTCTTTCGCTGCTGAG GGTGACGATCCCGCATAGGCGGCCTTTAACTCggatcc [SEQ ID NO: 26] >45 bp gaattcACAACGGTGAGCAAGTCACTGTTGGCAAGCCAGG ATCTGAACAATACCGTCTTTTCGAGCGCTAGCTCTAGAACTAGTC CTCAGCCTAGGCCTCGTTCAAGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGA CGATCCCGCATAGGCGGCCTTTAACTCggatcc [SEQ ID NO: 27] >40 bp gaattcACAACGGTGAGCAAGTCACTGTTGGCAAGCCAGG ATCTGAACAATACCGTCTTCGAGCGCTAGCTCTAGAACTAGTCCT CAGCCTAGGCCTCGAAGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGAT CCCGCATAGGCGGCCTTTAACTCggatcc [SEQ ID NO: 28] >35 bp gaattcACAACGGTGAGCAAGTCACTGTTGGCAAGCCAGGA TCTGAACAATACCGTCTTGCGCTAGCTCTAGAACTAGTCCTCAGC CTAGGCCTAAGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCA TAGGCGGCCTTTAACTCggatcc [SEQ ID NO: 29] >30 bp gaattcACAACGGTGAGCAAGTCACTGTTGGCAAGCCAGG ATCTGAACAATACCGTCTTGCTAGCTCTAGAACTAGTCCTCAGCC TAGGAAGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCATAGG CGGCCTTTAACTCggatcc [SEQ ID NO: 30] >25 bp gaattcACAACGGTGAGCAAGTCACTGTTGGCAAGCCAGG ATCTGAACAATACCGTCTTCTCTAGAACTAGTCCTCAGCCTAGGA AGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCATAGGCGGCC TTTAACTCggatcc [SEQ ID NO: 31]
[00157] A clivagem dos plasmídeos alvo foi analisado em géis de agarose, em que super-enrolado negativamente (NSC) plasmídeo pode ser distinguido a partir do plasmídeo linearizado, ou cortada. O local de clivagem do par CascataKKR/ELD num vector alvo foi determinada isolando os produtos de clivagem lineares de um gel de agarose e o preenchimento do recesso 3 'extremidades esquerda por FokI clivagem com o fragmento Klenow da polimerase de E. coli ADN para criar extremidades embotadas . O vetor linear foi auto-ligado, transformada, amplificado, isolado e sequenciado. O preenchimento do recesso 3 'e re-ligação vai levar a nucleotídeos extras na sequência que representa o excesso deixado por FokI clivagem. Ao alinhar a sequência lê para a sequência original, os locais de clivagem pode ser encontrada em um nível clonal e mapeados. Abaixo, as bases adicionais incorporados na sequência após o preenchimento de recesso extremidades 3 'deixado por FokI clivagem são sublinhadas: FokI cleavage 5’ CTTGCGCTAGCTCTAGAA CTAGTCCTCAGCCTAGGCCTAAG 3’ 3’ GAACGCGATCGAGATCTTGATC AGGAGTCGGATCCGGATTC 5’ 3’ fill in, ligation 5’ CTTGCGCTAGCTCTAGAACTAG - CTAGTCCTCAGCCTAGGCCTAAG 3’ 3’ GAACGCGATCGAGATCTTGATC - GATCAGGAGTCGGATCCGGATTC 5’
[00158] A leitura a partir de cima para baixo, as extremidades 5 '- 3' sequências acima são SEQ ID NO: 32 a 35, respectivamente.
[00159] A clivagem de um localização alvo em células humanas.
[00160] O gene CCR5 humano codifica a proteína do tipo receptor 5 de quimiocina CC, que serve como o receptor para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) na superfície de células brancas do sangue. O gene de CCR5 é orientada através de um par de nucleases CascataKKR/ELD além de um localização artificial GFP. Um par sítio de ligação adequado é selecionado na região codificadora de CCR5. Duas matrizes CRISPR separados contendo espaçadores uniformes de segmentação de cada um dos locais de ligação são construídos usando a síntese de ADN (Geneart).
[00161] A seleção do gene alvo CCR5 humano e os modelos de CRISPR empregados são como segue:
[00162] Parte da sequência CCR5humana genômica, contendo toda ORF (posição 347-1446). GGTGGAACAAGATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCAATCT ATGACATCAATTATTATACATCGGAGCCCTGCCAAAAAATCAATGT GAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTGCCTCCGCTCTACTCACTGGT GTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGCTGGTCATCCTCATCCTG ATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACATCTACCTGCTC AACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCCCCTTCT GGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAATGT GTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGGAAT CTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCTGTCGTC CATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTG GTGACAAGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTC CCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACA CCTGCAGCTCTCATTTTCCATACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAA TTTCCAGACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCT GCTTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAAAAACTCTGCTT CGGTGTCGAAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTAT CTTCACCATCATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCCTACAACA TTGTCCTTCTCCTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAA TTGCAGTAGCTCTAACAGGTTGGACCAAGCTATGCAGGTGACAGA GACTCTTGGGATGACGCACTGCTGCATCAACCCCATCATCTATGC CTTTGTCGGGGAGAAGTTCAGAAACTACCTCTTAGTCTTCTTCCAA AAGCACATTGCCAAACGCTTCTGCAAATGCTGTTCTATTTTCCAGC AAGAGGCTCCCGAGCGAGCAAGCTCAGTTTACACCCGATCCACT GGGGAGCAGGAAATATCTGTGGGCTTGTGACACGGACTCAAGTG GGCTGGTGACCCAGTC [SEQ ID NO: 36]
[00163] Vermelho 1/2: locais alvo escolhidos (distância: 34 bp, PAM 5’-CTT-3’). "Vermelho 1 é primeiro aparecimento da sequência sublinhada no acima. Vermelho 2 é a segunda sequência sublinhada.
[00164] Arranjo da CRISPR vermelho 1 (itálico = espaçadores, = repetições de negrito) ccatggTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTAGCTGATCT TTAATAATAAGGAAATGTTACATTAAGGTTGGTGGGTTGTTTTTATG GGAAAAAATGCTTTAAGAACAAATGTATACTTTTAGAGAGTTCCCC GCGCCAGCGGGGATAAACCGCAAACACAGCATGGACGACAGCC AGGTACCTAGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGCAAACA CAGCATGGACGACAGCCAGGTACCTAGAGTTCCCCGCGCCAGCG GGGATAAACCGCAAACACAGCATGGACGACAGCCAGGTACCTAG AGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAACAAAAGGCTCAG TCGGAAGACTGGGCCTTTTGTTTTAACCCCTTGGGGCCTCTAAAC GGGTCTTGAGGGGTTTTTTGggtacc [SEQ ID NO: 37]
[00165] Arranjo de CRISPR vermelho 2 (itálicos: espaçadores, negrito: repetições) ccatggTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTAGCTGATCT TTAATAATAAGGAAATGTTACATTAAGGTTGGTGGGTTGTTTTTATG GGAAAAAATGCTTTAAGAACAAATGTATACTTTTAGAGAGTTCCCC GCGCCAGCGGGGATAAACCGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGT GTTTGCGTGAGTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGTGTGATC ACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTGAGTTCCCCGCGCCAGCGG GGATAAACCGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTGA GTTCCCCGCGCCAGCGGGGATAAACCGAAAACAAAAGGCTCAGT CGGAAGACTGGGCCTTTTGTTTTAACCCCTTGGGGCCTCTAAACG GGTCTTGAGGGGTTTTTTGggtacc [SEQ ID NO: 38] Liberação de CascataKKR/ELD no núcleo das células de humanos
[00166] Cascata é muito estável como um multi-subunidade da proteína-RNA complexo e é facilmente produzida em quantidades mg, em E. coli. Transfecção ou micro-injeção do complexo na sua forma intacta como purificada a partir de E. coli é usada como método de entrega (ver Figura 12). Como mostrado na Figura 12, nucleases Cascata-FokI são purificados a partir de E. coli e encapsulado em vesículas de proteínas de transfecção. Estes são então fundidas com a membrana celular de células HepG2 humanas liberando as nucleases no citoplasma (etapa 2). Sequências NLS são, então, ser reconhecido por proteínas importantes, que facilitam a passagem nucleopore (etapa 3). CascataKKR (retângulo aberto) e CascataELD (retângulo preenchido), em seguida, encontrar e unir seu local de destino (etapa 4.), Induzindo vias de reparo de DNA que irá alterar o site de destino que leva a alterações desejadas. Nucleases CascataKKR/ELD precisam agir apenas uma vez e não necessitam de presença permanente no celular codificado em DNA.
[00167] Para liberar a Cascata em células humanas, reagentes de transfecção de proteínas são usadas a partir de várias fontes, incluindo Pierce, NEB, Fermentas e Clontech. Estes reagentes foram recentemente desenvolvidas para a administração de anticorpos, e são úteis para transfecção de uma ampla gama de linhas de células humanas com eficiências de até 90%. As células HepG2 humanas são transfectadas. Além disso, outras linhas de células, incluindo células CHO-K1, COS-7, HeLa, e células estaminais embrionárias não, são transfectadas.
[00168] Para importar o par de nuclease CascataKKR/ELD no núcleo, um conjunto monopartidos sinal de localização nuclear (NLS) do grande antigénio T do vírus símio 40 (SV40) é fundida com o terminal N de FokI. Isso garante importação de apenas intacta CascataKKR/ELD para o núcleo. (O complexo do poro nuclear transloca polimerases de RNA (550 kDa) e outros grandes complexos de proteínas). Como uma verificação antes de transformações, a atividade nuclease do par nuclease CascataKKR/ELD é verificada in vitro utilizando complexos purificados e amplicons CCR5 PCR para excluir transfecção pares nuclease CascataKKR/ELD não produtiva. Ensaio de sobrevivência
[00169] As células transfectadas são cultivadas e passadas por vários dias. A eficiência in vivo da clivagem do ADN alvo é então avaliada utilizando o ensaio de Surveyor Guschin, DY, et. al, (2010) Methods Mol. Biol, 649:. 247-256. Resumidamente, fragmentos amplificados por PCR do localização de ADN alvo serão misturados 1:1 com amplicons de PCR a partir de células não tratadas. Estes são aquecidos e deixados a hibridar, dando origem a incompatibilidades em locais-alvo que tenham sido erroneamente reparados por NHEJ. Uma nuclease incompatibilidade é então usada para clivar moléculas de ADN só incompatíveis, dando um máximo de 50% de clivagem em que o ADN alvo por clivagem CascataKKR/ELD é completa. Este procedimento foi seguido por sequenciação dos produtos de amplificação do DNA alvo de células tratadas. O ensaio permite a avaliação rápida e otimização do processo de entrega. Produção de pares de Cascata-nuclease Produção de pares Cascata-nuclease
[00170] Os complexos de cascata de nuclease foram construídos como se explicou acima. A purificação por afinidade a partir de E. coli utilizando a subunidade Cse2 StrepII-etiquetado produz um complexo com a estequiometria esperada quando comparado com Cascata nativa. Referindo-se a Figura 13, isto mostra a estequiometria de Cascata nativa (1), CascataKKR com P7 CrRNA e CascataELD com M13 CrRNA 24h após purificação usando apenas Streptactin. Bandas em Cascata nativa (1) são de cima para baixo: Cse1, CAS7, Cas5, Cas6e, Cse2. CascataKKR/ELD mostrar a banda fusion FokI-Cse1 e uma banda adicional representando Cse1 com uma pequena parte de FokI como resultado da degradação proteolítica.
[00171] Além de uma proteína de fusão intacta FokI-Cse1, observou-se que uma fração da proteína FokI-Cse1-fusão é clivada proteoliticamente, resultando numa proteína Cse1 com apenas o ligante e uma pequena parte de FokI ligado a ele (como confirmado por Mass Espectrometria, dados não mostrados). Na maioria dos isolamentos de proteína da fração da proteína de fusão degradada é de aproximadamente 40%. A proteína isolada é armazenado de forma estável no tampão de eluição (HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 75 mM, DTT 1 mM, destiobiotina 4 mM), com adicional de Tween 20 a 0,1% e 50% de glicerol a -20 ° C. Nestas condições de armazenagem, da integridade e da atividade do complexo ter sido encontrada estável durante pelo menos três semanas (dados não mostrados). Introdução de um His6-tag e NLS em Cascata-nuclease
[00172] O plano de fusão de nuclease Cascata foi modificado para incorporar um sinal de localização nucleolar (NLS) para permitir o transporte para o núcleo de células eucarióticas. Para isso um conjunto monopartidos NLS do antigênio T grande de SV40 Vírus Símio (sequência: PKKKRKVDPKKKRKV) foi fundida na tradução com a região N-terminal da proteína de fusão FokI-Cse1, directamente precedido por uma etiqueta de His6 na extremidade N-terminal. A tag His6 (sequência: MHHHHHH) permite uma +-resina de afinidade etapa adicional de purificação Ni2 após StrepII purificação. Esta etapa adicional assegura a isolação de apenas parte do comprimento do complexo de fusão da Cascata-nuclease e aumenta a eficiência da clivagem eliminando a ligação do complexo intacto da Cascata no site alvo formando um par de nuclease improdutivo. Ensaio de clivagem in vitro
[00173] Atividade CascataKKR/ELD e especificidade foi ensaiada in vitro, como descrito acima. A Figura 14A mostra os plasmídeos com as distâncias entre protoespaçadores de 25-50 pb (incrementos de 5 pb, faixas 1-6) foram incubadas com CascataKKR/ELD durante 30 minutos a 37 °C. Faixa 10 contém o plasmídeo alvo nas suas três topologias possíveis: a banda de menor representa o inicial, super-enrolado negativamente (NSC) sob forma de plasmídeo, a banda do meio representa a forma linearizada (clivada por XbaI), ao etapa que a banda superior representa o circular aberta formulário (OC) (após corte com Nt.BbrCI). A faixa 7 mostra a incubação de um plasmídeo com sítios tanto de ligação removidos (controlo negativo). Portanto, a Figura 14A mostra um ensaio de clivagem típico usando vários plasmídeos alvo em que os locais de ligação são separados por 25 a 50 pares de bases, em incrementos de 5 bp (faixas 1-6). Estes plasmídeos com distâncias de 25-50 pb foram incubadas com CascataKKR/ELD transportando anti P7 e M13 crRNA respectivamente. Um plasmídeo contendo sítios de ligação não serviu como controlo (faixa 7). O plasmídeo original existe na forma super-enrolado negativamente (NSC, faixa de controle 8), e cortado ou produtos linearizados são claramente distinguíveis. Após a incubação de um produto de clivagem linear é formado, quando os sítios de ligação foram separados em 30, 35 e 40 pares de bases (faixas 2, 3, 4). Aos 25, 45 e 50 pares de bases a distância (faixas 1, 5, 6), o plasmídeo alvo parecia ser incompletamente clivada conduz à forma entalhada (OC). Estes resultados mostram o melhor decote em plasmídeos com distâncias entre 30 e 40 pb, dando flexibilidade suficiente na concepção de um par crRNA para qualquer lugar. Ambas as distâncias mais curtas e mais longas resultam em aumento da atividade corte ao criar menos LAP. Existe muito pouca atividade em um plasmídeo em que os dois protoespaçadores foram removidos, mostrando a especificidade alvo (faixa 7). Condições de clivagem
[00174] Para avaliar as condições de tampão ótimas para ensaios de clivagem, e para avaliar se a atividade do complexo é esperado em condições fisiológicas, foram selecionados os dois tampões seguintes: (1) NEB4 (New England Biolabs, acetato de potássio 50 mM, 20 mM Tris-acetato , acetato de magnésio 10 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9) e (2) Tampão S (Fermentas, 50 mM Tris-HCl, 10 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1 mg/mL de BSA, pH 7,5). Dos dois, NEB4 é recomendado para uma atividade ótima da enzima comercial FokI intacta. Tampão S foi escolhido a partir de uma tela rápida para dar uma boa atividade e especificidade (resultados não apresentados). A Figura 14B mostra a incubação com diferentes tampões e diferentes tempos de incubação. As faixas 1-4 foram incubadas com Fermentas Tampão S (faixa 1, 2, durante 15 minutos, a faixa 3, 4, durante 30 minutos), as faixas 5, 6, foram incubadas com NEB4 (30 minutos). Lanes 1, 3, 5 usado o plasmídeo alvo com 35 espaçamento bp, faixas 2, 4, 6 utilizado o plasmídeo não alvo (sem sítios de ligação). Lanes 7, 8 foram incubadas com apenas CascataKKR ou CascataELD respectivamente (tampão O). Faixa 9 é o marcador de topologia, como em (A). Faixa 10 e 11 mostram o plasmídeo alvo e não alvo incubadas sem adição de cascata. Portanto, na Figura 14B, a atividade foi testada no plasmídeo alvo com 35 pares de bases a distância (faixa 1, 3, 5) e um plasmídeo de controlo não alvo (faixa 2, 4, 6). Havia uma quantidade elevada de corte inespecífica e menos de clivagem em NEB4 (faixa 5,6), enquanto tampão S mostra somente atividade no plasmídeo alvo, com uma quantidade elevada de clivagem específica e pouco corte (faixa 1-4). A diferença é provavelmente causado pela concentração de NaCl em tampão O, maior força iônica enfraquece interações proteína-proteína, levando à menor atividade inespecífica. A incubação de 15 ou 30 minutos mostra pouca diferença no alvo e não alvo do plasmídeo (faixa 1,2 ou 3,4, respectivamente). A adição de apenas um tipo de cascata (P7KKR ou M13ELD) não resulta em atividade de clivagem (faixa 7, 8), como esperado. Esta experiência mostra que a atividade de nuclease da cascata específico por um par concebido ocorre quando a concentração de NaCl seja de, pelo menos, 100 mm, o que é próximo da concentração salina fisiológica dentro de células (137 mM de NaCl). O par nuclease Cascata é esperado para ser totalmente ativo in vivo, em células eucarióticas, durante a exibição de atividade desprezível off-alvo clivagem. Local de clivagem
[00175] O local de clivagem no plasmídeo alvo, com um espaçamento de 35 pb (pTarget35) foi determinada. A Figura 15 mostra como o sequenciamento revela a montante ea jusante sítios de clivagem por CascataKKR/ELD no plasmídeo alvo com 35 par de bases espaçamento. Na Figura 15A) está representada a região alvo dentro pTarget35 com potenciais locais de clivagem anotados. Partes das protoespaçadores são indicados em vermelho e azul. B) O gráfico de barras mostra quatro diferentes padrões de clivagem e sua abundância relativa dentro de clones sequenciados. As barras azuis representam o balanço gerado, enquanto a esquerda e borda direita de cada barra representa o sítio de clivagem esquerda e direita (ver B para anotação).
[00176] Figura 15A mostra a sequência original de pTarget35, com sítios de clivagem numeradas de -7 a +7 onde 0 fica no meio entre os dois protoespaçadores (indicados em vermelho e azul). Dezessete clones foram sequenciados e todos estes mostram a clivagem em torno da posição 0, a criação de diferentes saliências entre 3 e 5 pb (ver Figura 15B). Saliências de 4 são mais abundantes (cumulativamente 88%), enquanto que de pende de 3 e 5 ocorrer apenas uma vez (6% cada). A cisão ocorreu exatamente como o esperado, sem clones mostrando clivagem alvo. Clivagem de uma localização alvo nas células de humanos.
[00177] Nucleases da CascataKKR/ELD foram modificadas com sucesso para conter um His6-tag N-terminal seguido de uma Nucleolar Localização sinal mono-partido dupla. Estas proteínas de fusão de nuclease Cascata modificados foram co-expressos com qualquer uma das duas matrizes CRISPR sinteticamente construídas, cada uma delas com um sítio de ligação no gene CCR5 humano. Primeiro a atividade deste novo par de nuclease é validado in vitro testando-se a atividade em um plasmídeo contendo esta região do gene CCR5. O par de nuclease é transfectado para uma linha de células humanas, por exemplo, Linhagem de células HeLa. Eficiência de clivagem alvo é avaliada por meio do ensaio de peritos, como descrito acima.

Claims (9)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão artificial de uma subunidade de proteína Cse1 associada a uma repetição palindrômica curta agrupada e regularmente espaçada (CRISPR) e uma endonuclease FokI, em que a sequência de aminoácidos da proteína de fusão Cse1-Fok1 é selecionada a partir de SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 21.
2. Composição de proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um sinal de localização nuclear (NLS), em que o NLS é NLS de SV-40.
3. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que apresenta sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 22 ou 24 que codifica a proteína de fusão compreendida na composição como definida na reivindicação 1 ou 2, em que a sequência de aminoácidos da proteína de fusão Cse1-Fok1 com NLS é selecionada a partir de SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 25, respectivamente.
4. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 3.
5. Complexo de ribonucleoproteína, caracterizado pelo ato de que compreende a proteína de fusão compreendida na composição como definida na reivindicação 1 ou 2 e uma molécula CRISPR RNA (crRNA).
6. Complexo de ribonucleoproteína, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma subunidade de proteína Cas6, uma subunidade de proteína Cas5, uma subunidade de proteína Cse2 e uma subunidade de proteína Cas7.
7. Método para modificar, visualizar, ativar a transcrição ou reprimir a transcrição de um ácido nucleico alvo in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o ácido nucleico alvo com um complexo de ribonucleoproteína como definido na reivindicação 5 ou 6.
8. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é um método para modificar que liga e/ou cliva o ácido nucleico alvo.
9. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico alvo é um DNA de fita dupla (dsDNA).
BR112014016228-0A 2011-12-30 2012-12-21 Composição de proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, complexos de ribonucleoproteína, e método in vitro para modificar, visualizar, ativar a transcrição ou reprimir a transcrição de um ácido nucleico alvo BR112014016228B1 (pt)

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