FR3082208A1 - Methode de modification d'une sequence cible d'acide nucleique d'une cellule hote - Google Patents

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Didier Raoult
Said Azza
Bernard La Scola
Eric Chabriere
Anthony Levasseur
Pierre Perrin
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Fondation Mediterranee Infection
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Aix Marseille Universite
Fondation Mediterranee Infection
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Abstract

La présente invention concerne une méthode de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant : - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et - un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.

Description

tLa présente invention concerne une méthode de moation par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant:
- un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
- un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.
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Méthode de modification d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte.
La présente invention concerne une méthode de modification d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique.
Les procaryotes sont capables d'acquérir une immunité adaptative contre l'invasion d'éléments génétiques, tels que les plasmides ou les phages, via l'incorporation dans leur génome de courtes séquences d'ADN étranger (de 21 à 72 nucléotides [nt]), système appelé CRISPRCas (courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacée) [1, 2] . L'acquisition de ces séquences d'ADN étranger survient de façon adjacente aux gènes Cas qui ont pour rôle de cliver l'ADN étranger en fragments de petites tailles. CRISPR-Cas confère ainsi une résistance face à une seconde infection [14, 15]
À ce jour, le système CRISPR-Cas n'avait été observé que chez les bactéries et les archées [16], mais pas chez des virus [1, 2].
La découverte des virus géants d'amibes, vivant en compétition avec d'autres microbes, a contesté la définition classique d'un virus [4,
5]. Depuis leur découverte, les virus géants ont révélé des caractéristiques phénotypiques et génotypiques uniques qui vont à l'encontre de la définition classique d'un virus, les plaçant à proximité de certains microbes. Les Mimivirus au diamètre supérieur à 0,5 micromètre, sont aisément visibles avec un simple microscope optique. Ils possèdent un génome large et complexe qui contient des séquences provenant d'autres organismes [6]. En outre, leur infection possible par des virus, les virophages, qui se multiplient dans l'usine à virus des Mimivirus, et la présence des éléments mobiles (transpovirons, polintons) ont suscité de vifs débats sur l'origine de ces virus [7]. De plus, les virophages, comme les bactériophages, peuvent s'intégrer au génome de Mimivirus sous la forme de provirophage [9].Un des virophages qui parasite la famille des Mimivirus a été baptisé zamilon [10].
Dans cette étude publiée dans le journal Nature [8], les chercheurs ont observé qu'un groupe parmi les Mimivirus (appelé lignées A) a développé une résistance contre l'infection par un virophage nommé zamilon, alors que les virus géants des lignées B et C sont sensibles à l'infection par ce virophage. Les chercheurs ont trouvé la présence d'une séquence répétée d'ADN de zamilon qui sert à accrocher le virophage uniquement dans la lignée A. Ce complexe a ainsi été nommé MIMIVIRE (Mimivirus Virophage Résistance Elément) et présente des similarités fonctionnelles avec le système de défense CRISPR-Cas existant jusqu'alors uniquement chez les bactéries et les archées et comportant une enzyme déroulant l'ADN (hélicase R350) et une autre le coupant (nucléase R354). L'inactivation du complexe MIMIVIRE a permis de restaurer la susceptibilité de Mimivirus à l'infection par le virophage. Les protéines partenaires comprises dans ce complexe MIMIVIRE sont impliquées dans la dégradation spécifique de l'ADN étranger. Le système de défense virale, MIMIVIRE, confère ainsi une immunité aux virus géants qui ont pu intégrer dans leur génome l'ADN du virophage infectant.
Plus précisément, 59 souches de la collection des virus géants de la famille des Mimiviridae d'Acanthamoeba polyphaga (dont 28 de la lignée A, 8 de la lignée B et 23 de la lignée C), ont été infectées par les virophages zamilon ou Sputnik, un autre virophage [11]. Après 24 heures, une augmentation de l'ADN de Sputnik a été observée dans l'ensemble des trois lignées de Mimiviridae. En revanche, zamilon a été capable de se répliquer uniquement avec les souches des lignées B et C de Mimiviridae, mais aucune souche de la lignée A. Une séquence de 28 nucléotides (nt), spécifique de zamilon, et trois répétitions de 15 nt ont été retrouvées dans l'ensemble des génomes de la lignée A contrairement aux deux autres lignées (B et C). Ces séquences sont localisées dans un gène codant une transposase-A chez zamilon, et sont intégrées dans le gène R349 de Mimivirus et dans les gènes orthologues, chez tous les Mimivirus de la lignée A. Ces séquences répétées sont séparées par des séquences de 9,48 et 63 nt respectivement. L'étude de l'environnement génomique au voisinage des séquences répétées de zamilon a mis en évidence des ORF (open reading frame, cadre de lecture ouvert) conservés chez les Mimiviruses. Ces ORF possèdent une similarité distante avec les Cas protéines qui sont de type hélicase et nucléase. Silencés par RNA interférence, l'inactivation des ORF contenant la séquence répétée d'ADN de zamilon, ou des ORF proche des Cas protéines, a permis de restaurer la susceptibilité de la lignée A des Mimivirus à l'infection par zamilon. En outre, l'expression des gènes a confirmé qu'ils codent une hélicase R350 et une nucléase R354.
Désormais, les virus géants des lignée B et C sont dénommés respectivement Momovirus pour la lignée B et Mégavirus pour la lignée C, Mimivirus étant réservé à la lignée A. Dans la suite de la présente demande de brevet lorsqu'il est indiqué Mimivirus, il s'agit donc de virus géant Mimivirus de la lignée A dont la séquence du génome est déposée dans Genebank sous la référence AY653733.1 et/ou qui a été déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur (Paris) selon le traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-5322 le 31 Mai 2018 sous la référence APBC1.
Dans un article récent [17] la structure et l'activité nucléase de la protéine R354 ont été étudiées.
Les protéines R350 et R354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été décrite [8,17] et reproduites dans les séquences SEQ. ID. N°: 1 et 2 du listage de séquences.
Ce système de défense virale confère ainsi une immunité adaptative aux virus géants qui ont pu intégrer dans leur génome l'ADN du virophage infectant. C'est pourquoi ce complexe a été nommé Mimivire (Mimivirus virophage resistance element) [11].
Suite à l'étude de Nature 2016 (8), il a été toutefois contesté que Mimivirus puisse être également capable de développer un outil de type ciseaux biologiques analogue à celui de CRISPR-Cas [12].
Toutefois, selon la présente invention, on a démontré que le système MIMIVIRE peut être adapté - mais différemment que le système CRISPR-Cas tel que décrit par exemple dans EP 2 800 811- pour offrir un nouvel outil biologique du type « ciseaux biologiques » comparable au système CRISPR-Cas pour des gènes étrangers autres que zamilon.
Le but de la présente invention est donc de rechercher les modalités selon lesquelles le système Mimivire peut être adapté pour fournir un système de « ciseaux biologiques » analogue au système CRISPR-Cas pour cibler des gènes autres que le gène zamilon dans Mimivirus et ainsi pour modifier des gènes ou séquences non codantes de bactéries ou cellules eucaryotes notamment.
Pour ce faire, la présente invention fournit une méthode de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant :
- un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
- un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides.
La séquence cible peut être une séquence d'ADN ou une séquence d'ARN transcrite du génome d'une dite cellule hôte. On comprend que ladite séquence spécifique de ladite séquence cible est autre qu'une séquence répétée du virophage zamilon contenue dans ledit gène R349.
La cellule hôte peut être une cellule de bactérie ou d'archée ou une cellule eucaryote unicellulaire ou pluricellulaire, notamment de plante ou d'animal.
Les protéines R350 et R354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été décrites ci-après dans les séquences SEQ. ID. N°: 1 et 2 du listage de séquences.
Ces protéines R350 et R354 sont connues comme ayant des propriétés de d'hélicase et respectivement nucléase comprenant des activités d'exonuclease et d'endonucléase de sorte que la modification de la dite séquence cible peut comprendre une coupure en un site spécifique et/ou une dégradation totale ou partielle de la dite séquence cible.
On entend par « séquence complémentaire d'une séquence spécifique de 15 nucléotides de ladite séquence cible », une séquence d'ADN ou d'ARN qui s'hybride avec la dite séquence cible et qui ne s'hybride avec aucune autre séquence d'une dite cellule hôte et desdits gènes R349, R350 ou R354.
En revanche on comprend que les dites séquences flanquantes sont tirées dudit gène R349.
Le gène R349 de Mimivirus est connu de l'homme de l'art et a été décrit ci-après dans la séquence SEQ. ID. N°: 5 du listage de séquences.
Des séquences des gènes R350 et 354 codant pour les protéines 350 et 354 de Mimivirus sont connues de l'homme de l'art et ont été décrites dans les séquences SEQ. ID. N°: 3 et 4 du listage de séquences.
Plus particulièrement, ledit deuxième composant comprend la dite la séquence d'affinité sous forme d'ADN ou de préférence sous forme d'ARN.
De préférence, ladite la séquence d'affinité comprend au moins 2 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, de préférence de 2 à 4, de préférence encore 4 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, répétées de façon espacée.
De préférence encore, la dite ou chaque dite séquence complémentaire de la même dite séquence spécifique de la séquence d'affinité comprend est flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.
De préférence encore, les dites même séquences complémentaires de la même séquence spécifique de la séquence cible sont flanquées en 3' et 5' de séquences flanquantes différentes les unes des autres entre les différentes mêmes séquences complémentaires et les dites séquences flanquantes correspondant respectivement aux séquences flanquantes des différentes mêmes séquences répétées du virophage zamilon contenues dans ledit gène R349 de Mimivirus.
On comprend que les dites séquences flanquantes sont tirées de la séquence de 28 nucléotides (SEQ.ID. N 24) incluant la dite séquence répétée de 15 nucléotides du virophage zamilon (SEQ.ID. N 6) dans le gène R349 ou tirées des séquences de 9, 48 et respectivement 63 nucléotides (SEQ. ID. N°26-28) qui séparent les séquences répétées du virophage zamilon dans le gène R349, ou une séquence flanquante en 3' de la dernière séquence spécifique répétée en 3' de 15 nucleotides du virophage zamilon dans le gène R349.
Plus particulièrement, ladite séquence d'affinité comprend le gène R349 modifié dans lequel seules les 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon sont remplacées aux mêmes localisations par les dites 4 mêmes séquences complémentaires d'une dite séquence spécifique de la dite séquence cible.
Un tel gène R349 modifié est illustré par la séquence SEQ.ID N° 7 incluant une séquence spécifique de 15 nucléotides du gène de résistance à la tétracycline de la séquence SEQ.ID N°23.
Plus particulièrement encore, ladite séquence d'affinité est intégrée dans un vecteur de clonage de la dite séquence d'affinité apte à transformer ou transfecter une dite cellule hôte et y répliquer la dite séquence d'affinité.
Plus particulièrement encore, ladite séquence d'affinité est intégrée sous forme d'ADN placée sous le contrôle d'un promoteur de transcription apte à transcrire la dite séquence d'affinité d'ADN en ARN dans la dite cellule hôte.
Plus particulièrement encore, ladite cellule hôte est une bactérie ou une cellule eucaryote.
Plus particulièrement encore, ledit premier composant comprend un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique R350 et/ou R354 codant pour et apte à exprimer respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354 dans une dite cellule hôte.
Plus particulièrement, les séquences d'acides nucléiques codant pour les protéines R350 et/ou R354 sont intégrés dans un plasmide, sous le contrôle d'un promoteur d'expression, par exemple le promoteur T7 pour une bactérie et le promoteur CMV pour une cellule eucaryote, et encadrés des séquences de localisation nucléaire (NLS) afin d'adresser les protéines dans le noyau de la cellule eucaryote le cas échéant.
Plus particulièrement encore, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur, de préférence un plasmide.
Selon la présente invention, on a en particulier découvert que la protéine R350 n'est pas une simple hélicase avec mais présente une activité endonucléase spécifique qui coupe spécifiquement les dites séquences spécifiques répétées au sein de la séquence cible de la cellule hôte.
Dans un mode préféré de réalisation, la présente invention fournit une méthode pour au moins couper en un site spécifique la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique du gène R350 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350.
Plus particulièrement, la présente invention fournit une méthode pour au moins couper en un site spécifique et dégrader au moins partiellement la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 et la protéine R354 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins des séquences d'acides nucléiques des gènes R350 et R354 codant pour respectivement au moins les dites protéines R350 et R354.
Plus particulièrement encore, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant :
- au moins une partie modifiée du gène R349, de préférence le gène R349 modifié complet, ladite partie modifiée du gène R349 incluant une partie du gène 349 incluant au moins une des 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349, de préférence les 4 séquences répétées, la dite modification de la dite partie modifiée du gène R349 consistant en ce que la (ou les) dite(s) séquence(s) répétée(s) de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène
R349 est (ou sont) remplacée(s) par une même dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de la dite séquence cible, et
- une séquence permettant la transcription en ARN dans une dite cellule hôte de ladite partie modifiée du gène R349, de préférence du gène R349 modifié complet, et
- les gènes R350 et 354, ainsi que des séquences permettant l'expression des gènes R350 et R354 dans une dite cellule hôte.
Plus particulièrement encore, pour une cellule hôte de bactérie, les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant l'une des séquences SEQ.ID.N°22 ou SEQ.IDN°25 dans laquelle la séquence répétée 4 fois spécifique du gène de résistance à la tétracycline SEQ.ID.N°23 est remplacée par une dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de 15 nucléotides de la séquencé cible.
La présente invention fournit aussi un système biologique utile pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'invention de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo, tel que définie ci-dessus comprenant :
- un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique de(s) gène(s) R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
- un deuxième composant comprenant une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de préférence la ou chaque dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.
La présente invention couvre également des dites méthodes et systèmes biologiques selon l'invention mis en œuvre avec des dites séquences d'acides ou de protéines qui sont homologues voire orthologues à celles des dites séquences, et/ou présentant des similarités notamment avec au moins 90% d'identité de dites séquences.
D’autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur lesquels :
Les figures 1A-1B et 2A-2B représentent des gels d'électrophorèse d'agarose de diverses séquences d'acides nucléiques en présence ou non des protéines R350 et/ou R354.
La figure 3 est un schéma du mode d'action hypothétique de l'hélicase R350 et la nucléaseR354.
La figure 4 représente un gel d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) montrant l'effet de l'ARN.
La figure 5 est un schéma illustrant le mode d'action .de l'ARN sur la réplication de l'ADN en présence d'ADN polymérase.
La figure 6 montre les constructions des plasmides PP20 et PP21 d'expression des protéines R350 et R354.
Les figures 7A-7B représentent des gels SDS-PAGE et analyse par Western-blot des protéines extraites des cellules eucaryotes transfectées ou non par les plasmides PP20 et/ou PP21 sur une membrane de nitrocellulose hybridée avec un anticorps anti-FLAG.
La figure 8A représente le vecteur PP14 comprenant la séquence SEQ.ID.N°25 incluant le système Mimivire modifié de la séquence SEQ. ID. N°22 comprenant une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline de la séquence SEQ.ID.N°23.
La figure 8B représente le vecteur pACYC184 portant une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline (SEQ.ID.N°23).
Les figures 9 à 12 montrent des résultats comparatifs de culture de bactéries avec abolition la résistance à la tétracycline pour les bactéries transformées par le vecteur PP14.
Les résultats des exemples d'expériences réalisées sont rapportés ci-après (paragraphes I.A, I.B et I.C) et les matériels et méthodes sont explicités en fin de description (Paragraphe II). Un listage de séquences reprend des séquences SEQ.ID.N°1 à 33 mentionnées ci-après.
On a réalisé ci-après deux séries d'expériences. La première série d'expériences (I.A) vise à expliciter la compréhension du mécanisme d'action du système Mimivire. La deuxième série d'expériences (I.B, I.C) vise à confirmer les résultats mis en évidence précédemment en utilisant le système MIMIVIRE pour modifier une séquence spécifique du gène de résistance à la tétracycline dans un système procrayote {E.co/i} (I.C) et modification d'un gène reporteur dans des cellules eucaryote (I.B) en réalisant l'inactivation d'un gène rapporteur sera facilement identifiable.
I.A) Première série d'expériences vise à expliciter la compréhension du mécanisme d'action du système Mimivire.
1) On a utilisé les 2 protéines recombinantes R354 (Nucléase) et R350 (Hélicase) sur différents substrats nucléiques notamment (a)
IORF4 du virophage zamilon de 594 nucléotides (produit amplifié par les amorces SEQ. ID. N° 12 et 13 du tableau 1 ci-après) qui porte la séquence répétée de 15 nucléotides du virophahe zamilon (SEQ. ID. N°6) ainsi que (b) le gène R349 (SEQ. ID. N°5), tous 2 obtenus par PCR avec les amorces de séquences SEQ.ID.N0 10 à 13 du tableau 1).
Les figures IA et IB représentent des gels d'électrophorèse d'agarose (1%) de séquences d'ADN des gènes amplifiés par PCR de la séquence ORF4 de zamilon (fig.lA) et du gène R349 de Mimivire (fig.lB) traités avec une protéine R354 (N), une protéine R350 (N), les deux protéines (N + H) et un contrôle sans protéine (C).
Seule une activité exonucléasique de la protéine R354 a été observée avec dégradation totale non spécifique de l'ADN (Figures IA et IB).
2) On a recherché si l'action du système Mimivire impliquerait l'assistance de l'ARN correspondant à la séquence répétée, qui formerait ainsi un hétéroduplexe avec le simple brin de IORF4 notamment lors de la réplication de l'ADN du virophage et provoquerait ainsi l'arrêt de la réplication de l'ADN virophage.
Pour ce faire, on a réalisé des tests \n vitro utilisant une matrice d'ADN synthétique correspondant à (a) une zone de 130 nucléotides de IORF4 de zamilon incluant la séquence répétée (séquence sens ou « forward » SEQ. ID. N° 8 et séquence anti-sens ou« reverse SEQ. ID. N° 9) et (b) un ARN de 15 nucléotides correspondant la séquence répétée (séquence sens ou « forward » SEQ. ID. N° 18 et séquence anti-sens ou « reverse » SEQ. ID. N° 19). Après hybridation, l'action de la nucléase R354, hélicase R350ou nucléase + hélicase a été testée.
La figure 2A représente des gels d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) de séquences d'acides nucléiques comprenant l'ADN simple brin du gène ORF4 de zamilon et une séquence d'ARN de 15 nucléotides complémentaires à la séquence répétées du virophage zamilon, avec une protéine R354 (N), une protéine R350 (N), les deux protéines (N + H) et un contrôle sans protéine (C).
La figure 2B représente des gels d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) de séquences d'acides nucléiques comprenant l'ADN double brin du gène ORF4 de zamilon et une séquence d'ARN de 15 nucléotides complémentaires à la séquence répétées du virophage zamilon, avec une protéine R354 (colonnes N), une protéine R350 (N), les deux protéines (N + H) et un contrôle sans protéine (C).
Le résultat montre de façon surprenante que l'hélicase coupe au niveau du l'héteroduplexe alors que le nucléase dégrade totalement la matrice ADN (Figure 2A). Parallèlement, aucune action des deux protéines n'a été observée sur le double brin (Figure 2B).
Ces résultats suggèrent que la protéine codée par le gène R350 a une fonction d'endonucléase contrairement aux prédictions bioinformatique (hélicase). Afin de déterminer le site de coupure de manière exact, les fragments issus de cette digestion ont été séquencés. Le séquençage nous a permis de situer entre la 8ieme et 9ieme nucléotide de la séquence répétée le site de coupure (TGATAATG v AATCTGA).
Ceci suggère que son action n'intervient que sur l'hétéroduplexe ADN/ARN retrouvé notamment lors de la réplication de l'ADN. Le mécanisme de résistance de Mimivirus envers zamilon pourrait s'opérer à travers l'introduction de cette coupure au niveau de IORF4 de zamilon par la protéine codée par le gène R350 suivie par la dégradation par la nucléase R354 comme illustré sur le schéma de la figure 3 sur laquelle l'ARN est référencé par A, la protéine R350 par B, et la protéine R354 par C.
La figure 3 illustre le mode d'action de l'hélicase et la nucléase sur IORF4 de zamilon in vivo.
De plus, on a observé que la présence de cet ARN de séquence répétée bloque la polymérisation d'une zone de IORF4 de zamilon incluant la séquence répétée et génère des formes tronquées (Figure 4). On peut donc en inférer qu'à l'échelle de la réplication de zamilon, la réplication est stoppée comme illustré dans la figure 5 au niveau de IORF4.
La Figure 4 représente un gel d'électrophorèse de polyacrylamide (15%) montrant l'effet de l'ARN de séquence complémentaire (SEQ. ID. N° 18 et 19) à l'unité de séquence répétée sur la réplication d'un oligonucléotide de 130 bases (SEQ. ID. N° 8 et 9) correspondant la séquence de IORF4. On a réalisé l'electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (15 % PAGE) d'un ADN synthétique (sens (SEQ. ID. N° 8) ou anti-sens (SEQ. ID. N° 9) utilisé comme matrice par l'ADN polymérase ADN dépendante (Klenow) après une hybridation préalable avec un ARN complémentaire correspondant à l'unité de séquence répétée (SEQ. ID. N° 18 et 19). Les contrôles ont été réalisés dans les mêmes conditions en absence de Klenow (C= sans Klenow) ou d'ARN ( + = avec ARN ou - = sans ARN).
La figure 5 est un schéma illustrant le mode d'action .de l'ARN complémentaire à l'unité de séquence répétée (1) sur la réplication de l'ADN (2) en présence d'ADN polymérase (3) montrant l'importance cruciale de cet ARN dans le processus d'action du système Mimivire.
I.B) Utilisation du système MIMIVIRE dans des cellules eucaryotes.
On a cherché à confirmer les résultats précédemment mis en évidence en utilisant le système MIMIVIRE dans un système eucaryote en effectuant l’inactivation d’un gène rapporteur facilement identifiable.
On a choisi d'inactiver le gène de la Green Fluorescent Protein (GFP) dans la lignée de cellules humaines HEK293. Dans un premier temps, on a cloné respectivement les gènes R350 et R354 étiquetés
FLAG et flanqués des séquences NLS dans les plasmides pcDNA3.1/Hygro ou pcDNA3.1/Zeo comme illustré dans la figure 6
La figure 6 montre les constructions des plasmides de transfection PP20 et PP21 utilisées dans cette étude pour valider le système MIMIVIRE dans lesquels les gènes MIMI_R354 (nucléase) et MIMI_R350 (hélicase) sont sous le contrôle du promoteur CMV et encadrés des séquences de localisation nucléaire (NLS) afin d'adresser l'hélicase et la nucléase dans le noyau de la cellule.
On a transfecté les cellules 293GFP avec ces plasmides afin d'établir une nouvelle lignée de cellules HEK293 GFP qui exprime les protéines R350 et R354. L'expression de la nucléase et de l'hélicase a été confirmée par Western Blot avec un anticorps monoclonal anti-FLAG (figures 7A-7B). Cet anticorps anti-FLAG reconnaît les bandes a 101.6 KDa pour l'hélicase et 70.8 KDa pour la nucléase.
Les Figures 7A-7B représentent des gels SDS-PAGE et analyse par Western-blot des protéines extraites des cellules 293GFP. On a réalisé des électrophorèses sur gel 10% SDS-PAGE de 50 pg d'un extrait protéique provenant des cellules 293GFP transfectées ou non par les plasmides PP20 et/ou PP21(Fig.7A) sur une membrane de nitrocellulose hybridée avec un anticorps anti-FLAG au 1:1000 (Fig.7B). Les tailles sont indiquées à gauche en KDa.
Dans un second temps, on a fait synthétiser un ARN de 45 nucléotides (séquences sens et antisens SEQ.ID.N°20-21, tableau 1) comprenant 2 unités de séquence spécifique répétées de 15 nucléotides provenant de la GFP (séquences sens et antisens SEQ.ID.N°29-30, tableau 1) et encadrée de la même séquence que l'on peut trouver dans le gène R349 de Mimivirus (tableau 1, séquences sens SEQ.ID.N°20 incluant la séquence SEQ.ID. N°29 et séquences antisens SEQ.ID.N°21 incluant la séquence SEQ.ID. N°30). Cette séquence 15 nucléotides est une partie du guide ARN utilisé pour inactiver le gène de la GFP avec le système CRISPR/Cas9 tel que décrit dans l'article Science. 2014 Jan 3;343:84-87.
On a transfecté cet ARN dans les cellules HEK293 GFP qui expriment les gènes R350 et R354. La lecture de ces expérimentations a permis de suivre l'extinction relative de la fluorescence de la GFP par FACS.
I.C) Utilisation du système MIMIVIRE dans des cellules procaryotes.
On a vectorisé le système dans un vecteur d'expression PP14 (SEQ. ID. N°25) pour procaryote sous contrôle du promoteur T7 inductible par l'IPTG. La séquence du gène R349 a été modifiée (SEQ. ID. N°7) afin d'agir contre le gène de la résistance à la tétracycline en remplaçant les 15 nucléotides de la séquence répétée de zamilon par 15 nucléotides spécifique du gène de résistance à la tétracycline (SEQ. ID. N°23 : CACCCTGGATGCTGT). Les gènes R350 et R354 ont été ajoutés à la suite du R349 et sont organisés en opéron sous contrôle du promoteur inductible T7 (annexe 1, SEQ. ID. N°22).
Les figures 8A-8B représentent le vecteur Mimivire (PP14-figure 8A) portant la séquence SEQ. ID. N°25 incluant la séquence SEQ.ID.N°22 avec le gène R349 modifié (SEQ. ID. N°7) par une séquence dirigée contre le gène de résistance à la tétracycline (SEQ. ID. N°23) ainsi que des gènes R350 (SEQ. ID. N°3) et R354 (SEQ. ID. N°4) sous la commande d'un même promoteur T7 (SEQ. ID. N°31) avec une organisation en « opéron » à l'aide de séquences d'opéron Lac (SEQ. ID. N°32), séquence de Shine-Dalgarno et terminateur T7 (SEQ. ID. N°33).
Le vecteur PP14 dans lequel sont clonés les gènes R349, R350 et R354 fait partie de la famille des vecteurs pET qui sont des vecteurs d'expression chez les bactéries. Ces vecteurs embarquent entres autres, un promoteur T7 inductible c'est-à-dire que l'expression ne se fait qu'en présence d'un certain composé dans le milieu de culture à savoir l'IPTG (Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside). Ce vecteur permet de synthétiser de manière constitutive une protéine appelée lacl qui se fixe sur la séquence Lac operator et ainsi bloque la transcription du gène cloné en aval du promoteur T7 du fait que la T7 ARN polymérase fixée au préalable sur le promoteur T7 ne peut pas transcrire le gène à cause de l'encombrement stérique que lui crée la présence de la protéine lacl. Néanmoins, en présence d'IPTG, la protéine lacl se complexe avec cette molécule IPTG entraînant un changement de conformation de la protéine lacl la rendant incapable de se fixer sur la séquence lac operator, ce qui permet à la T7 RNA polymérase de transcrire le gène cloné en aval du promoteur T7. Et, le terminateur T7 stoppe la T7 RNA polymérase à la fin de la transcription.
La séquence Shine-Dalgarno est reconnue par le ribosome de la bactérie. Chez les bactéries il est possible de faire traduire un ARN messager dit « polycistronique » c'est-à-dire qui contient la transcription de plusieurs gènes à la suite selon une organisation en « opéron ». Pour ce faire, chaque partie de l'ARN messager qui contient la transcription d'un gène doit être précédée d'une séquence ShineDalgarno reconnue par le ribosome qui pourra donc se fixer dessus et initier la traduction de l'ARN messager.
En présence de l'IPTG dans le milieu, on réalise la transcription en ARN du R349 modifié qui embarque les 4 unités repeat correspondant à la tétracycline d'une part et d'autre part, on réalise la transcription d'un autre ARN messager qui embarque les gènes R350 (hélicase) et R354 (nucléase). Les 2 transcriptions sont indépendantes l'une de l'autre.
Ce vecteur PP14 est ensuite transféré par électroporation dans des bactéries E.coli BL21 préalablement transformées par le vecteur pACYC184 (figure 8B) permettant l'expression du gène de la résistance à la tétracycline. Les bactéries sont établies selon différentes dilutions sur boite LB/agar contenant soit Ampiciline/Tetracycline/IPTG (50pg/ml ; 12pg/ml ; O.lpM respectivement) soit Ampiciline/IPTG (50pg/ml ; O.lpM respectivement).
Les figures 9 à 11 et 13 montrent des résultats comparatifs de culture de bactéries avec abolition de la résistance à la tétracycline pour les bactéries transformées par le vecteur PP14.
La Figure 9 montre les résultats de le la première expérience. Sur les boites Amp/IPTG on dénombre (de gauche à droite) 16 ; 3 et 48 bactéries pour des dilutions étalées correspondantes respectivement au 1/10 ; 1/50 ; et au reste de la transformation. Sur les boites Amp/Tet/IPTG, on dénombre respectivement 0 ; 0 et 8 bactéries.
La Figure 10 montre les résultats de la seconde expérience. Sur les boites Amp/IPTG on dénombre (de gauche à droite) 5 et 28 bactéries pour des dilutions étalées correspondantes respectivement au 1/5 et au reste de la culture. Volume de départ de 1ml. Sur les boites Amp/Tet/IPTG, on dénombre respectivement 9 et 4 bactéries.
Ces résultats montrent que le système Mimivire permet bien d'abolir la résistance à la tétracycline. Ces résultats ont été confirmés par d'autres expériences assurant de la présence ou l'absence du vecteur conférant la résistance à la tétracycline.
Dans un premier temps, on a testé l'induction de l'expression des gènes du système Mimivire par l'IPTG sur la croissance d'E. coli BL21DE3 doublement transformée (pACYC184 et PP14).
La Figure 11 montre l'effet de l'induction du système Mimivire : Les bactéries contenant le vecteur pACYC184 sont électroporées avec le vecteur PP14 contenant le système Mimivire et étalées à volume égal sur des boites LB/Agar Ampicilline/Tétracycline +ou- IPTG.
Sur la figure 11, on voit clairement que l'induction de l'expression des gènes du système Mimivire se traduit par la diminution drastique du nombre de colonies quel que soit l'antibiotique.
Suite à ces résultats, on a voulu caractériser des clones bactériens doublement transformés du système Mimivire. Pour ce faire, on a mis en culture les clones bactériens issus des boites LB/Agar Ampicilline/Tétracycline sans IPTG, en milieu Ampicilline +IPTG dans le but d'activer le système Mimivire et en parallèle, les mêmes clones sont mis en culture en milieu Ampicilline sans IPTG comme control négatif. L'action du système Mimivire est testée à l'aide d'une amplification (PCR.) du gène de résistance à la Tétracycline à partir de la culture bactérienne. Dans l'hypothèse d'une action du système Mimivire, cette amplification devrait être impossible.
Un test de l'action du système Mimivire. PCR a été réalisée à partir de la culture bactérienne de 10 clones issus de la boite LB/Agar Ampicilline/Tétracycline et poussé 16h en Ampicilline seul ou Ampicilline + IPTG.
Le résultat de la PCR montre l'amplification d'un fragment de 1.3 kb correspondant au gène de résistance de la tétracycline.
Dans les conditions expérimentales utilisées pour l'amplification du gène de résistance à la tétracycline, ce résultat ne permet pas de visualiser une absence totale ou partielle du vecteur pACYC184 portant le gène de résistance à la Tétracycline. Une faible présence de vecteur intact peut engendrer un fragment lors de l'amplification et expliquer ainsi les résultats obtenus dans la figure 12. Une amplification en temps réel (qPCR) a permis une meilleure interprétation de l'action du système Mimivire.
Il est à noter que sur les 10 clones, 2 seulement ont poussé en milieu Ampicilline/IPTG (clone 7 et 10) alors que les 10 clones ont poussé en milieu Ampicilline seul. Ce dernier résultat montre majoritairement que l'induction du système Mimivire à un effet sur la pousse des bactéries tout comme le résultat issue de la figure 11.
La Figure 12 montre l'étalement du clone 7 sur boite Tétracycline (284 bactéries) avec IPTG et sur boite Tétracycline (402 bactéries) sans IPTG à une dilution correspondante à 103 CFU théorique.
Le clone 7 répond à l'induction du système Mimivire via l'IPTG car on passe de 346 (boites Ampicilline/IPTG) à 284 bactéries (boites Tétracycline/IPTG) soit une diminution d'environ 18%, alors que l'on ne montre pas de différences notable sur le contrôle sans IPTG (passage de 393 à 402 bactéries).
L'absence de colonies sur tétracycline confirme une action du système Mimivire sur l'inhibition de la résistance à la Tétracycline.
II) Matériels et Méthodes
1) Traitement enzymatique
Les réactions enzymatiques ont été effectuées en incubant chaque produit de PCR, de transcription in vitro (IVT) ou d’amorce avec la nucléase (R354), l’hélicase (R350) ou les deux enzymes. Les réactions enzymatiques ont été conduites dans du tampon CutSmart® (Ref: B7204S) de New England Biolabs (acétate de potassium 50 mM, acétate de trisium 20 mM, acétate de magnésium 10 mM, 100 ug ml-1 de BSA, pH 7,9) à 32° C pendant 2 heures, en utilisant une concentration de protéine de 0,5 mg.ml-1 pour chaque enzyme. Après incubation, toutes les réactions ont été traitées par la protéinase K pour éviter que l’ADN ou l’ARN ne se répande dans les puits des gels. Après incubation, les produits des réactions enzymatiques ont été soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose (1,5%) ou de PolyAcrylamide dénaturant (dPAGE) à 15%. Les contrôles ont été effectués avec les mêmes conditions, en absence de l’enzyme R354 ou R350.
2) Conditions de cultures.
2.1) Dans des cellules eucaryotes :
Les amibes Acanthamoeba castellanii (ATCC 30010) ont été ensemencées à 5 x 106 dans le milieu salin amibien (PAS) de Page comme décrit précédemment (7). La lignée HEK293 GFP (cellules humaine de rein embryonnaire, Clinisciences) a été cultivée à 37°C dans un incubateur à CO2 à 5% dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de FBS (Gibco), GlutaMAX 2 mM (Life Technologies), 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml. Streptomycine et 100 pg / ml d'acide aminé non essentiel.
2.2) Dans des cellules procaryotes :
Les bactéries Escherichia Coii One Shot™ BL21 (DE3) chimiquement compétente (Thermo Fischer, Réf: C600003) ont été cultivées dans du milieu Luria-Bertani (LB) avec un antibiotique approprié. Les bactéries ont été étalées sur LB-agar avec un antibiotique approprié (12pg / ml pour la tétracycline et 50pg / ml pour l'ampicilline). Le système Mimivire a été induit par l'ajout de 0,2 pM d'isopropyl β-D-l-thigalactopyranoside (IPTG) sur des plaques de LBagar.
3) Test d'infection et de transfection.
Les amibes A. Casteiianii ont été infectées ou co-infectées respectivement avec Mimivirus ou Mimivirus et le virophage zamilon en utilisant une MOI de 10. Les cellules ont ensuite été incubées à 32 ° C et à des points réguliers post-infection, les cellules ont été recueillies pour l'extraction d'ARN avec le Kit d'isolation mirRena™ miRNA (Ambion). Les cellules 293GFP ont été ensemencées sur des plaques 6 puits (Corning) 48 h avant la transfection à une densité de 300 000 cellules/puits. Les cellules ont été transfectées à 80-90% de confluence en utilisant la Lipofectamine 2000 (Life Technologies) en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Un total de 4 ug de PP20vector/PP21vector (hébergeant respectivement la séquence NLSR350-NLS et NLS-R354-NLS) ont été utilisés pour la transfection. MIMI_R354 (Nucléase) et MIMI_R350 (Hélicase) sont marqués par 3 séquences FLAG à l'extrémité N-terminale (3xDYKDDDDK) pour confirmer l'expression des protéines correspondantes par des expériences de Western Blot avec un anticorps monoclonal anti-FLAG (Clone M2, Sigma). Le lendemain, ces cellules sont ensemencées dans une flask T75. Une sélection avec de l'hygromycine (100 ug / ml) et de la zéocine (100 ug / ml) a été appliquée au jour 3 après la transfection. Ces cellules ont été cultivées dans ces conditions pendant 3 semaines afin d'isoler des cellules doublement transfectée stables (lignée 293GFP [PP20 / PP21]).
4) Test de transformation.
Les plasmides utilisés dans ces expériences sont le PP14 synthétisé par Genscript hébergeant une expression inductible du système Mimivire sous le contrôle du promoteur T7 (voir l'annexe 1 et la figure 8 A) et le vecteur pACYC184 (société Mo Bi Tec Ref: V32402). Les bactéries Escherichia Coii One Shot™ BL21 (DE3) a été transformé par le plasmide pACYC184 selon le protocole et les instructions du fabricant. Les bactéries ont été étalées sur une plaque de LB-agar tétracycline (Tet) (jour 1). Le lendemain, un clone a été prélevé et cultivé dans 10 ml de milieu LB sélectif Tet pendant une nuit à 37° C sous agitation à 200 tr/min. Au jour 3, 200 pi de la culture ont été inoculés dans 20 ml de milieu LB+Tet frais jusqu'à ce que la DO à 600 nm atteigne 0,7. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 7000 tr / min pendant 1 minute à 4° C et lavées trois fois avec du glycérol 10%. Après la première centrifugation, toutes les étapes ont été réalisées sur glace et en chambre froide. Les bactéries ont été remises en suspension dans 50 ul de glycérol 10% et 200 ng de vecteur PP14 ont été ajoutés. Le mélange a été transféré dans une cuvette Gene Puiser® avec un espace de 0,1 cm (Bio-Rad, Réf 165-2089) et une impulsion électrique a été produite avec le MicroPulser Electroporator (Bio-Rad, Réf: 165-2100) en utilisant le programme Ecl. Le temps d'électroporation indiqué par le dispositif après l'impulsion était de 5,8 ms. Après électroporation, 1 ml de LB a été ajouté immédiatement et incubé pendant 1 heure à 37° C sous agitation à 200 tr/min. Plusieurs dilutions ont été étalées sur des plaques de LB-agar sélectif Tet / Amp/IPTG ou Amp/IPTG et incubées pendant une nuit à 37° C. Le lendemain, les colonies ont été comptées.
5) Clonage, expression et purification.
Les séquences des gènes codant pour la protéine R350 et R354 de Mimivirus ont été optimisées pour maximiser l'expression dans E.coli et synthétisé par GenScript. La protéine R354 inclut une étiquette polyhistidine (SEQ.ID.N°34) à l’extrémité C-terminale. La séquence du R349 reste inchangée à l'exception de l'unité repeat de 15 nucléotides qui correspond à une séquence de la tétracycline (SEQ.ID. N°7 incluant SEQ.ID. N°23 répétée 4 fois). Ces gènes ont été inséré entre les sites de coupure Xbal et Xhol du plasmide pET22b ( + ) (annexe 1, SEQ.ID. N°22).
Les protéines recombinantes ont été exprimées dans E. coli BL21 (DE3) -pGro7 / GroEL (TaKaRa) en utilisant un milieu ZYP-5052. Chaque culture a été cultivée à 37° C jusqu'à obtention d'une absorbance à 600 nm de 0,8 suivie de l'addition de L-arabinose (0,2% m / v) et d'une induction avec une transition de température à 18° C pendant 20 h. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (5 000 g, 30 min, 4° C) et les culots résultants ont été remis en suspension dans du tampon de charge (20 mM MES pH 6,0) et conservés à -80° C pendant une nuit. Les cellules congelées ont été décongelées et incubées sur de la glace pendant 1 h après addition de lysozyme et de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) à des concentrations finales respectives de 0,25 mg ml-1 et 0,1 mM. Les cellules partiellement lysées ont ensuite été perturbées par trois cycles consécutifs de sonication (30 s, amplitude 45) effectués sur un système de sonication Q700 (QSonica). Les débris cellulaires ont été jetés après une étape de centrifugation (11 000 g, 20 min, 4° C).
La protéine recombinante a été purifiée en utilisant une colonne échangeuse de cations à partir de 6 ml de RESOURCE S (GE Heathcare) en utilisant un tampon MES 20 mM pH 6,0 et un gradient linéaire à 0,5 M de NaCI dans 10 volumes de colonne. Les fractions ont été analysées par SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie (10%) et les activités d'hélicase ont été évaluées sur une électrophorèse sur gel de Polyacrylamide dénaturant comme décrit précédemment (15% de dPAGE). Les fractions actives (générant un clivage au niveau de l'unité répétée de 15 nucléotides de zamilon) ont été regroupées et purifiées davantage en utilisant une Chromatographie d’affinité sur métal immobilisé (tampon de chargement et de lavage: Tris 50 mM pH 8, NaCI 300 mM, imidazole 20 mM, tampon d’élution: Tris 50 mM pH 8, NaCI 300 mM, imidazole 250 et 500 mM) sur une colonne de 5 ml d’HisTrap FF brut (GE Healthcare). Les fractions ont été analysées en utilisant SDSPAGE à 10% (coloration de Coomassie) et évaluées en utilisant l’activité hélicase comme décrit précédemment.
6) Extraction ARN et caractérisation
Les cultures obtenues ont été traitées avec le kit mirVana™ miRNA (Ambion). Des fractions enrichies de petits ARN (<200 nt), ainsi que de l’ARN total ont été obtenus. Les échantillons d’ARN ont été caractérisés en utilisant des puces RNA 6000 Pico Total RNA (Agilent) combinées avec le Bioanalyzer Agilent 2100 ou une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (dPAGE-15% acrylamide) pour les petits ARN.
7) Analyse par Northern Blot
Pour confirmer l’expression et la taille de l’ARN repeat, des hybridations par Northern Blot ont été effectuées en utilisant 10 ug d’ARN total ou 2 ug de petit ARN. Les échantillons d’ARN ont été dénaturés pendant 5 minutes à 95° C dans un tampon de charge contenant 50% de formamide suivi d’un refroidissement immédiat sur de la glace. Des échantillons d’ARN ont été passés sur des gels de Polyacrylamide dénaturants à 15% d’urée (dPAGE), électrobiotés sur des membranes Hybond N + (GE Helathcare) à 20 V pendant 1 heure en utilisant un transfert semi-sec (Hoefer TE 77, GE Healthcare). La membrane est ensuite cross-linked aux UV pendant 2min.
Les sondes (LNA), par ex. 5’-TCA-GAT-TCA-TTA-TCA-G-3 ’et 5’CTG-ATA-ATG-AAT-CTG-A-3’, avec de la digoxigénine (DIG) aux deux extrémités, ont été acheté auprès d’Eurogentec. La pré-hybridation et l’hybridation ont été réalisées en utilisant un tampon Easy Hybridization (Roche Applied Science) à 37° C. Après hybridation, les membranes ont été lavées deux fois en utilisant une solution tampon de faible stringence (2X SSC, 0,1% SDS) et une solution tampon de stringence élevée (O,1X SSC, 0,1% SDS), pendant dix minutes à température ambiante et quinze minutes à 60°C, respectivement.
Les membranes ont ensuite été hybridées avec une sonde marquée au DIG comme recommandé par le fabricant (DIG-System, Roche Diagnostics), à l'exception de la détection de la sonde hybridée qui a été réalisée en utilisant un anti-digoxine monoclonal conjugué à la peroxydase de raifort (Jackson Immunoresearch, 1: 5000). Après plusieurs lavages, des transferts ont été révélés par des tests de chimioluminescence (ECL, GE Healthcare). Le signal résultant a été détecté sur Hyperfilm ™ ECL (GE Healthcare) en utilisant un processeur de film automatisé (Hyperprocessor™, GE Healthcare).
8) Transcription in vitro
Toutes les transcriptions in vitro ont été réalisées selon les instructions et les recommandations du fabricant (Kit MegashortscriptTM de Thermofisher, ref: AM1354). Brièvement, les matrices ADN ont été hybridées avec des amorces incluant les promoteur T7et operon lac (SEQ.ID.N°14-15 et 16-17) et mélangées avec le tampon de réaction T7 (1 x), une solution de T7 NTP (7,5 mM), l'enzymes T7 (2 ul pour une réaction de 20 ul) pendant 4 heures à 37° C. Les matrices d'ADN ont été dégradées par TURBO DNase (2 U) pendant 15 minutes à 37° C. Les transcrits d'ARN ont été précipités à l'éthanol. Les culots finaux ont été remis en suspension dans de l'eau exempte de nucléase.
9) PCR avortée
Les matrices ADN ont été incubées avec les ARN complémentaire correspondant à l'unité repeat de zamilon de 15 nucléotides (SEQ.ID.N°18-19) ainsi qu'une amorce d'élongation à 95°C pendant 5 minutes puis en les refroidissant progressivement jusqu'à 25°C. Tous les mélanges ont été incubés avec 5 U de Klenow exo-, provenant de
ThermoFisher (réf: EP0422) pendant 1 heure à 37°C. Les contrôles ont été effectués avec les mêmes conditions à sans l'ARN ou Klenow.
10) Purification des ARNs ou ADNs à partir de gel de polyacrylamide
La récupération d'acide nucléique à partir de bandes de polyacrylamide excisées à partir de gels a été réalisée par la méthode d'écrasement et de trempage comme décrit précédemment (18).
11) Séquençage des ARN et ADN
Les échantillons d'ADN simple brin de 65 nucléotides ont été séquencés sur la technologie MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). L'approche RNAseq a été choisie et les banques ont été construites en utilisant Truseq stranded mRNA strategy et ont été barre-codé avec un autre projet RNAseq.
Les échantillons ont été mesurés sur le Nanodrop et le volume maximum de 16,5 pL, compris entre 36 et 160ng, a été impliqué pour synthétiser l'ADN du second brin. La procédure d'ARNm brin Truseq a été suivie à partir de là et toutes les étapes de purifications d'Ampure ont été remplacées par une précipitation alcoolique en raison de la petite taille des fragments d'ADN. Les profils de bibliothèques ont été visualisés par bioanalyseur DNA1000 (Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA, USA) à 71, 78, 130 paire de bases. La concentration finale des banques ont été de 143 et 333 nmol/l pour les 6 échantillons.
Les banques ont été normalisées à 2 nM et regroupées. Après une étape de dénaturation et une dilution à 15 pM, le pool a été chargé sur la cartouche de réactif, puis sur l'instrument avec la cellule d'écoulement. La génération automatisée de grappe et l'exécution de séquençage ont été effectuées sur le kit MiSeq Reagent V3 en 150 cycles.
Une information totale de 5 Gb a été obtenue à partir d'une densité de grappe de 1618 K / mm2 avec un filtre de contrôle de qualité passant de 85,6% (18 644 000 lectures de paires appariées). Au sein de cette série, les représentations de l'indice ont été déterminées comme étant respectivement de 0,69%, 0,47%, 0,84%, 0,65%, 0,76% à 0,94%. Le minimum de 152 675 au maximum de 302 220 lectures appariées en fonction des échantillons conduit à un nombre global de 1 407 155 lectures appariées qui ont été ajustées puis analysées.
12) Test Mimivire
Les cellules 293GFP [PP20 / PP21] ont été ensemencées sur des plaques à 6 puits à 150000 cellules/puits 24h avant la transfection. Les cellules ont été transfectées en utilisant la lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Un total de 30 pmol d'ARN a été utilisé pour la transfection. Les cellules transfectées ont été analysées par FACS trois jours après la transfection.
13) SDS-PAGE et Western Blot
Les cellules transfectées ou non ont été lysées par sonication dans un tampon de solubilisation (urée 7 M, thiourée 2 M, Tris 30 mM, CHAPS 4% (p / v) et centrifugées à 10 000 g, 20 min, 4 ° C. Les protéines solubles ont été collectées et la concentration a été déterminée en utilisant le Bio-Rad De Protein Assay (Bio-rad).
Cinquante microgrammes de protéines solubles ont été fractionnés sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% puis révélés par InstantBlue Protein Stain (Expedeon). De plus, des protéines résolues ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (Trans-blot Transfer Medium, Biorad, Hercules, CA, USA) à 100 V pendant 1 h en utilisant une unité de transfert semi-sèche (Hoefer TE 77, GE Healthcare, Vélizy-ViIlacoublay, France). Les membranes ont ensuite été bloquées dans du PBS additionné de 0,3% de Tween-20 et de 5% de lait écrémé en poudre (PBS-Tween-Milk) pendant 1,5 h et incubées avec des anticorps anti-FLAG monoclonaux de souris (1: 1000). Les bandes immunoréactives ont été détectées en utilisant une immunoglobuline de chèvre anti-souris conjuguée à de la peroxydase (GE Healthcare, VélizyVillacoublay, France) diluée à 1: 5000 dans le tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante. Trois lavages de 15 min ont été appliqués entre chaque étape. Les bandes immunocolorées ont été visualisées avec le kit à base de chimioluminescence, tel que décrit par le fabricant (GE Healthcare, Vélizy-ViIlacoublay, France). Le signal résultant a été capturé par un système d'imagerie Fusion FX7 (Vilber Lourmat, France).
14) Prédiction de structure secondaire pour l'ARN hébergeant deux séquences répétées de GFP de 15 nucléotides
Les structures secondaires ont été prédites en utilisant le serveur web Mfold. Nous avons conservé la structure secondaire avec l'énergie libre minimale.
15) Digestion sur gel et spectrométrie MALDI-TOF
Les bandes excisées des gels ont été décolorées et soumises à une digestion dans le gel avec de la trypsine (Proteomics grade trypsine, Agilent Technologies, Cedar Creek, TX). Les peptides tryptiques ont ensuite été extraits du gel par des traitements successifs avec de l'eau et de l'acétonitrile (qualité HPLC). Les extraits ont été regroupés et concentrés dans un évaporateur Speedvac. La solution de peptides a ensuite été déposée sur la cible d'ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI). Les analyses de masse ont été effectuées sur un spectromètre de vitesse Brüker Autoflex Speed MALDItemps de vol (MALDI-TOF) (Brüker Daltonique, Wissembourg, France). Les spectres de masse ont été calibrés de manière externe en utilisant des peptides de digestion trypsique de sérum albumine bovine (Brüker). Des listes de masse de peptides tryptiques ont été utilisées pour identifier les protéines, en utilisant le logiciel Mascot (Matrixscience). Les recherches ont été effectuées contre une base de données interne contenant la séquence étiquetée de MIMI_R350 (Helicase like), y compris une étiquette de polyhistidine à l'extrémité amino-N-terminale.
Tableau 1 :
Gene d'origine noms séquences Expériences
MimiR349 R349_Fwd SEQ.ID.N°10 : ATGGAATTAATTAGTCGTGTC PCRMIMI_R349 (SEQ.ID.N°5 de 2895 nt)
R349_Rev SEQ.ID.N°11 : TTAATCTTTGAATCCTTGAGC
Zamilon ORF4 ORF4ZA_Fwd SEQ.ID.N°12 : ATGTCTGTTCTAGAAAACCT PCR Zamilon ORF4 (594 nt)
ORF4ZA_Rev SEQ.ID.N°13 : TTAAGTTATAATTTTGTATA
Zamilon ORF4 DNASyntFwd SEQ.ID.N°8 : ATAGAACAACCAAAAAAATATCAAA ATCTAGAGATGAATCAAGTGAATC AGAAGAATCTGATAATGAATCTGAT AATGAATCCGATGAGGAAGTTGAA TCAGAAACTGAGATAGAACCAGTC AAATCTAA Séquences sens et anti sens de I'ADN synthétique (130 nt) utilisé comme substrat pour des traitements enzymatiques et les expériences de polymérisation avortées
DNASyntRev SEQ.ID.N°9 : TTAGATTTGACTGGTTCTATCTCAG TTTCTGATTCAACTTCCTCATCGGA TTCATTATCAGATTCATTATCAGAT TCTTCTGATTCACTTGATTCATCTC TAGATTTTGATATTTTTTTGGTTGT TCTAT
MimiR349 T7-4repeat Fwd SEQ.ID.N°14 :TAATACGACTCACT ATAGGGTACTCCCATAAATAATATC AC Amorces de PCR du
T7-4repeat Rev SEQ.ID.N°15 GAGACAAAATTTCA TCTACC produit sens utilisées comme matrice de transcription in vitro pour obtenir l'ARN MIMI_R349 + (311 nt))
MimiR349 T7-4Revrepeat Fwd SEQ.ID.N°16 TAATACGACTCACTA TAGGGAGACAAAATTTCATCTACC Amorces de PCR du produit anti sens utilisées comme matrice de transcription in vitro pour obtenir l'ARN MIMI_R349 + (311 nt))
T7-Rev Repeat.Rev SEQ.ID.N°17 TACTCCCATAAATAA TATCAC
Zamilon ORF4 Repeat_RNA _Fwd SEQ.ID.N°18 : UGAUAAUGAAUCU GA Séquence sens et antisens ARN de 15 nucléotides utilisée avec les traitements enzymatiques et des expériences de polymérisation avortée
Repeat_RNA _Rev SEQ.ID.N°19 : UCAGAUUCAUUAU CA
GFP/MIMI _R349 GFP repeat Fwd SEQ.ID.N°20 : AAUCGCUGGACGG CGACGUUAAUGAAUCGCUGGACGG CGACGUCA Séquences sens et antisens du gène GFP utilisé dans le test Mimivire dans les cellules eucaryotes
GFP repeat Rev SEQ.ID.N°21 : UGACGUCGCCGUC CAGCGAUUCAUUAACGUCGCCGUC CAGCGAUU
Annexe 1:
SEQ.ID.N°22 =insert synthétisé et cloné par genscript dans pET22b( + ) aux sites de restriction Xba I/Xho I comprenant successivement les séquences des :
a) promoteur T7 (SEQ.ID.N°31) TAATACGACTCACTATAG ;
b) opéronLac(SEQ.ID.N°32) GAATTGTGAGCGGATAACAATTCC;
c) site de restriction Xba 1= TCTAGA ;
d) séquence Shine-Dalgarno: AAGGAGA ;
e) première séquence soulignée= SEQ.ID.N°7 du gène 349 modifié incluant l'unité répétée 4 fois tirée du gène de résistance à la tétracycline SEQ.ID.N°23 = CACCCTGGATGCTGT___avec les 3 séquences de spacer intercalées SEQ.ID.N°26,27 et 28,
f) premier spacer entre les première et deuxième séquences soulignées incluant le terminateur T7 SEQ.ID.N°33 CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTT TTG, la séquence du Promoteur T7, SEQ.ID.N0 31 TAATACGACTCACTATAG et la séquence du Lac operator, SEQ.ID.N°32: GAATTGTGAGCGGATAACAATTCC et une Séquence Shine-Dalgarno;
g) deuxième séquence soulignée= Séquence du gène R350 ;
h) deuxième spacer entre les deuxième et troisième séquences soulignées incluant une séquence Shine-Dalgarno, et
i) troisième séquence soulignée = Séquence du gène R354 ;
j) site de restriction Xho I = CTCGAG ;
k) séquence de l'étiquette poly histidine
SEQ.ID.N°34 . CACC ACC ACC ACC ACC AC,
l) le terminateur T7 SEQ.ID.N°33.
SEQ.ID.N°22
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCC CtctagaaataattttgtttaactttaagAAGGAGAtatagatatggaa TTAATTAGTCGTGTCTTTACTCATGGAGAAAATATTTTACTTGTTAGTTC TACAAATAAGTTATATATTATGGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGT TTCAAAATAGGTACAGATAAAACTTATATTGAAAGTCCAGTATATATTG ACATTAAATTAGATGATGATGATTCTGTTAAAGCGTTTTATTCTTGTAAT TTATTCACGATGATTCATACATCCAAAGGAAAAATTTATCTATCAAGAT CATTTATTTGTGGTGGAGGTGAAATCGATGCATATGATAGTGAAAGTGA TGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGCTGAGTCTGATGCTGAATCAGAT TCAGAAAATCATACTCAAAATAATACAAATACTCCCATAAATAATATCA cactaattaatttggattcatcaaataattccactcaatcCACCCTGG atgctgttaatgaatccaccctggatgctgtcaatgaatctgatc aatcatgtagtgattttgactgtggacctcgatcCACCCTGGATGCT GTtgaagaagtttttgttgatcgtaatgataataattcagataatattg gtaattcaaatagtatCACCCTGGATGCTGTatctatgactgaaaaa GCTGGAATAATTTTGTTAAACGAAATTAAAACCATGGTAGATGAAATTT TGTCTCAAAAAAATATTAATTCTGTTGGAATTAACGATATTGTTATTCGT CCAAGCGGACAGTATGTGAGTAATATGGGATATATTACAGAATCAGGT AGTGTATCATTTCATACCAATAAAAATGGTTTCTTATTATTCAAGTCCAA TGTTCATGAAATCCTTTTCGTTGAAGAAATGTTTATGTACTCTAAAAATA ATTTTATTTATTTGGCCATACCATTTAAAAAATACCAGGCATCTCTAAGA GATATTGCTCCTTTTCATACAATTAATAAAACAAAAAATGGTATTAAAT GGAAGTATTTCAAAATAGTGTTTCCATTTGACACTGAAAAAATAGAATT TTGTGATAATTTCTTTTATACTTATGAATCCAATACTTGTTATCATCATG TTATTTCATTCTACAAAAATGTAAATTATTATCCTTCTTGGATATATTTC
AAATCTGAGATTGATATTAATAGTAAAAATATGTTCTTTTCAAGTGATA CTAATAGTGTGTATGTTAAAGATAATAACAACGTGTATAAATACCATAA TTTCAATAATTCTCTTGAAAAATACATCGATAACAAACTCGACTTGGAT GTCGTAATTGTGCCTGATAGTTATAGACCAATGGAAATGAGACTACTAT TAAAGTTAGGTATAACATTGTATAGCGATTACAATTTTAATGGATGTGA GGATGATGAAGAACATATTTTCGAAATTATGAAAAATCAATATGTACCT CATATTATCGGTCTGAATTATTTTGAAAGTTTCATTGTAGTTATTGTCAA TAATCCAAATATGTTGACGATAACAACTGACGATGGTAAAATTTTCTTT AACATTCATGATATTACTTTTTACAAAAGATTTTATAATGGAATCGTTTA TCTTGATAATGGTTCGTTATTTTATCTCACAGATAGTGAAATTTCAGATC AAAATGTATGGAAACTAACTGGATGTCAATTGTGTGAGCTAGCTGATTC TACCATATATAGTTACCTATTTAATTTACCGGACAAAATTGATGAAATTT ACTCTTCGTCTGAATTTATTGTTCTAAAATTAATTGGAAACAAATATTTT TATTATCCGGTTGAAAATTTTGATACTGCTCAAGATTTTAAGACAAGAT GTGGGGAAATTTCATTGAAAAATAATTCAGTTCTTGAACTCGTTAATAC TAGTATTATTAACAGACAATCTAAAAGTTATCATACTACAGTATCTATTA ATATTGATACGGATTGTACTACTCATAATTCTTTCGAGAGATTGTTTATC CTGACACAATCTCTTAGTTATTCCGCAGAATATTCTATTCGAATTGTAG ACGACAAAAATATTGGTTTTGGTGATGGGCCTAAAATTGAATTTTGTGA ATCGGCTATTATGCAATTTTATTATAAGTATTTAATTGCTCATAATTTTC ACACAGAGTTTAATTTACAAGAATTTGCCAAACTGAAACCCACCGAAAT TAAATATTTGGGATCAATGTTTCATATGGTTATCTGTCAAAATAATTCTT CGTTACCGATTAGATTACCTCTAGCTTTTGCTGTAGAAATTTATGGAAA AGAACCCACAATTGATGAATTGGAATATTTTGCTTGTAATGAAGATGAA ACTGGATTCAAACATATTTATCCAGCCAAATACAATCCCGAATTAGTTA AAGAATTCGGTTATGAATCTTATGAACATTGTCTAAAAACTTTGTGTAA ATATAATTATGAAGATGATACTGATAAAAATATCTTGACGAAAAAATAT TGCGAGCAATTAGCTGCCGGTTTTAAAAGATACGGCAATATCAAGAACA TAAAACAAATGAATTTACCCACATTGGACTATTACATTTCTGGCCCATA CAAAATTAATAGAACCATATTAATTAATAATCTTGTTTTATCGGGAGGT AAGGATAAAAATAATAATTATTTGGAAATGTTCAAAGAATTTATTAACT CTTTGTCTGAAAATGAATTAAAAATCTTGCTAAAAAATTGGACAGCATC
AACTTGTGTAAGACCAGATAACAAATATAGAATTATCATTATTTCCAAA TCTAAAAACGCTAAAGCAGGTATTCGATTTGGTACTTGTAATTTAGAAA TTCATATCGACGAAAAAATGTTGGATGAACATAATATTGATACAGTCAA AGAGGTTTTAATTACACCTGCTCAAGGATTCAAAGATTAAGATCCGGCT GCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAG CAAAAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGG GGTTTTTTGAGAACACGAACCCGCGAAAATAATACGACTCACTATAG GGGAA TTGTGAGCGGA TAA CAA rrCCCCACTAGAAATAATTTTGTTT aactttaagAAGGAGAtatagcaatgaaccgtcgtaaccgtagcaacg ACCTGAACCCGGAGCCGAGCATCGAAAACCCGAACAACCAGATTGCGG AGGAATTCCCGGGTAACAACAGCGTGTATAAAAGCGACGGCTACGTTG ATCTGAAGAACAACGGTCGTCTGTTCCCGATCTGGATTCTGAAGAACTT TAAACAATACAAGCTGCCGGAGATCATTCGTAAAGAGAACGAAGACCC GTGCAACGTGCAGGTTAAGCTGGAGCTGCGTAAATATCAGGAATTCGT GGGCCAATACCTGAACCCGCAGGGTCCGTATACCAGCATCCTGCTGTA CCATGGTCTGGGTAGCGGCAAGACCGCGAGCGCGATCAACCTGATGAA CATTCTGTACAACTATGACAACGGCACCAACTTTATCGTTCTGATTAAA GCGAGCCTGCACAACGACCCGTGGATGCAGGACCTGAAGGAGTGGCTG GGTCGTGATCCGAGCGAACAGAACGTGGACAACGTTACCAAGCTGGAT CGTTACAAAAACATCCACTTCGTGCACTATGACAGCCCGTTCGCGGATA GCAGCTTTATGAGCGTTATTAAGACCCTGGACCTGAGCAAACCGACCAT GTACATCATTGATGAGGCGCACAACTTTATCCGTAACGTGTATAGCAAC ATTAACAGCAAACTGGGCAAGCGTGCGAAAGTTATCTACGAGTACATC ATGAAGGACAAGCGTGAAAACAAGAACACCCGTATCGTGCTGATTAGC GCGACCCCGGCGATCAACACCCCGTTCGAACTGGCGCTGATGTTTAAC CTGCTGCGTCCGGGTATTTTCCCGAGCAGCGAGCTGGATTTCAACCGT ACCTTTGTGACCGAAAGCAGCTACCCGATCCTGAACCCGATGAAGAAA AACATGTTTGAGCGTCGTATCCTGGGCCTGGTTAGCTACTATATTGGTG CGACCCCGGACCTGTATGCGCGTCAAGAACTGAAGTACATCAACCTGC CGATGAGCGCGTACCAGTATGATATCTACCGTATTTTCGAGAAACTGGA GGCGGAAATTCAAGAACGTGCGCGTCGTCGTGGCAAGCAGAGCCAACT GTACCGTACCTATACCCGTCAGGCGTGCAACTTCGTGTTTCCGTACGTT
AACATGAACGTGAACGGTGAACTGCGTCCGCGTCCGGGCAAGTTCCGT CTGAGCGAAAAACTGGCGGACGATTTTAGCAAGGGCAAAAACCTGGAC GTTCCGGATACCGAGAAAGAAATCCTGAACAAGTATACCAAAGCGATT GAGAACTACCTGAACGAGACCGAACGTTATTTTCAGAACATCAACAAGA AAGACGCGGAGAACGGTCGTACCATCATTAACGACCTGGATGAATTCA AGAAAGGCTTTGGTACCAAGTTCAACAGCTTTCTGCAGTACTATCAAAG CGAGGGTCCGCGTAGCAGCCTGCTGACCGAAATGTACAACTGCAGCCC GAAAATGCTGGCGATCGCGTTCATGACCTATATTAGCCCGGGCAAGGT GATGATCTACAGCAACTATGTGGTTATGGAAGGCATCGACGTTATGAAA ATTTACTTTCGTCTGATCGGTTTCAACGATTTTACGATCGCGCGTGAGT ACATGGGCTATTGCGAATACCACGGTCGTATCGACCCGAAGGATCGTG TGCGTATCAAGAACATGTTCAACGACAAGAACAACGTGTACGGCAACA AGTGCAAAGTTATCATGCTGAGCCCGAGCGCGACCGAGGGTATTCAAC TGCTGGATATCCGTCAGGAGCACATTATGGAACCGTATTGGACCGAAG TTCGTATCCAGCAAGTGATTGGCCGTGGTGTTCGTCAATGCAGCCACC GTGACCTGCCGATGAGCGAGCGTATCGTGGATATTTACCGTTATAAGG TTATCAAACCGGAAAACCTGGACCCGGACGATACCGTGCGTCAAAGCA CCGACGAGTACGTTGAAGATCAGGCGAAGAGCAAAGCGAACCTGATTG AGAGCTTCCTGGGCGCTATGAAAGAAGCGGCGGTTGATTGCGAGCTGT TTAAGGAACACAACATGATGAGCCAGAGCTACTATTGCTTCAAATTTCC GGAGAGCGCGGTGACCAAGACCAACGTTGGCCCGGCGTACCGTGAAGA CATCAAGGACGATGTGAAATATGATAGCGGTCTGAACAGCAAAAACAG CATCGTTGAGCGTATTCGTGTGGTTAAGGTGAACGCGGTTTACCAAATC AACACCGACAACAACAACCCGGTGTATAGCAGCCCGACCAAGTACTGG TATAACAAGAAAACCGGCATGGTTTATGACTTCGAGACCCACTACCCGG TGGGTCAGGTTGAATTTATCGATAACCTGCCGAACAAGCTGGACAAAG ATACCTACATCATGCGTATTGATGTGATCATTCCGAGCATTACCGGTAG cgttaacacctaacactagaaataattttgtttaactttaagAAGGAG Atatagcgatgaccgacattagctactataacaacgagatcgataaaat TCTGTGGAACATCCTGGGTGACGATTATTTCACCCAAGACGAATTTGAC GATCTGGTGAACAGCGTTGCGAACACCATTTACCAGTATGACAACGAA GTGAGCATCGATAAGCTGAAAGTGATCATCGAATTCGTTATCCTGAACA
AGTTCAAGCTGTGCTACATCTACGATAACGACAGCATCCTGAACCAAGT GAAATACGAGAAGAAAAGCGTTGGTAGCAAAACCATCGGCAAGAACAG CACCAACGACGATGAGGACGATGACGAAGATATCGCGGTGATTAAGCT GAGCGATATTGAGGCGGGCGAAAACTGGTTCAAGAAAAGCCCGAAAAT CAGCAGCAAGCAGTTTCAAAGCGTTGACAAAGTTGAGGTGGCGACCTA CGAAGACCTGATCAGCCACAAGCACGATTACCCGAAAGAGATTTATAA GGAAAGCCACTACATCCGTCGTAACACCCGTCTGGATGTGATCAAGAA AATTCCGCAATTCGAGCAGAAGAGCAAAGAATGGCTGAAACAACGTAC CGAGAGCCTGACCGCGACCGCGATTAGCGTGGTTTTTGATGAAGACCC GTATAAACACCCGATCGTTATTCTGCTGGACAAGTGCGGTCGTGGCCT GCCGTTCGTGGAGAACAAATTTGTTCACCACGGTAACAAGTATGAACAA ATCGGCACCATGTTCTACAGCTTTCGTAACAACGTTGAGGTGGGTGAGT ACGGCCTGCTGCAGCACAGCGGTCACAAGTTTATCGCGGCGAGCCCGG ATGGCATCTGCAGCAAGAAAGCGAACACCGGTGGCCTGAGCAAACTGG TGGGTCGTCTGCTGGAGATTAAGTTCCCGTTTAGCCGTGAAATCAACAA CAGCGGTGATCTGGACGGCGATATCTGCCCGCACTACTATTTTCTGCAG GTGCAAACCCAGCTGTATGTTACCGAGATGGACGAATGCGACTTCCTG CAGTGCAAAATTGACGAGTACGATAGCTGGGAAGACTTTGTGAAGGAT AGCAACCCGATCGTTCCGGGTCTGAGCAAAACCACCAACCTGGAGAAG GGCTGCCTGATTCAGCTGAGCGACAAAAACCTGATCGGCAGCGACGAC AAGGAAAAATGCCTGTATAACAGCAAATACATCTATCCGCCGAAGCTGC ACATGACCAACGAGGAAATCGAGAAGTGGATTAGCAGCGAAATCATGA ACTACCACAACAACGACCTGAGCGAGAACTATATGATTGATCGTGTGAT CTACTGGCGTCTGAGCCAAGTTACCTGCAACCTGATTAAGCTGAACAAA GAAGCGTTCGAGGAAAAAATCCCGCTGCTGCAGCAATTCTGGGACTAC GTTCTGTTTTATCGTCAGCACAGCGACAAGCTGGATAAACTGATTAAGT TTGTGGAGAAGGTTAAAGAAGATAACAGCGCGGAGATTTTCAGCTACA TCAACGAAGACTTTCTGAGCCTGAACAAAGATAGCAAGTACGAGCCGC TGTATCAGGAAGAGACCGAATGGCGTAAGAAATATAACCAAATCAAGG CGAAGAAAGCGCAGATGTACAAGAACAAGAGCTACAACAAGTACACCA agttcagcaacctcgagCACCACCACCACCACCACtgagatccggct GCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAG
CAAAAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGG
GGTTTTTTG.
LISTAGE DE SEQUENCE
SEQ. ID. N°1 : protéine R350 de Mimivirus
MNRRNRSNDLNPEPSIENPNNQIAEEFPGNNSVYKSDGYVDLKNNGRLFPIWILKN FKQYKLPEIIRKENEDPCNVQVKLELRKYQEFVGQYLNPQGPYTSILLYHGLGSGKT ASAINLMNILYNYDNGTNFIVLIKASLHNDPWMQDLKEWLGRDPSEQNVDNVTKL DRYKNIHFVHYDSPFADSSFMSVIKTLDLSKPTMYIIDEAHNFIRNVYSNINSKLGK RAKVIYEYIMKDKRENKNTRIVLISATPAINTPFELALMFNLLRPGIFPSSELDFNRT FVTESSYPILNPMKKNMFERRILGLVSYYIGATPDLYARQELKYINLPMSAYQYDIY RIFEKLEAEIQERARRRGKQSQLYRTYTRQACNFVFPYVNMNVNGELRPRPGKFRL SEKLADDFSKGKNLDVPDTEKEILNKYTKAIENYLNETERYFQNINKKDAENGRTII NDLDEFKKGFGTKFNSFLQYYQSEGPRSSLLTEMYNCSPKMLAIAFMTYISPGKVMI YSNYVVMEGIDVMKIYFRLIGFNDFTIAREYMGYCEYHGRIDPKDRVRIKNMFNDK NNVYGNKCKVIMLSPSATEGIQLLDIRQEHIMEPYWTEVRIQQVIGRGVRQCSHRD LPMSERIVDIYRYKVIKPENLDPDDTVRQSTDEYVEDQAKSKANLIESFLGAMKEAA VDCELFKEHNMMSQSYYCFKFPESAVTKTNVGPAYREDIKDDVKYDSGLNSKNSIV ERIRVVKVNAVYQINTDNNNPVYSSPTKYWYNKKTGMVYDFETHYPVGQVEFIDN LPNKLDKDTYIMRIDVIIPSITGSVNT
SEQ. ID. N°2: protéine R354 de Mimivirus
MTDISYYNNEIDKILWNILGDDYFTQDEFDDLVNSVANTIYQYDNEVSIDKLKVIIE FVILNKFKLCYIYDNDSILNQVKYEKKSVGSKTIGKNSTNDDEDDDEDIAVIKLSDIE AGENWFKKSPKISSKQFQSVDKVEVATYEDLISHKHDYPKEIYKESHYIRRNTRLDV IKKIPQFEQKSKEWLKQRTESLTATAISVVFDEDPYKHPIVILLDKCGRGLPFVENKF VHHGNKYEQIGTMFYSFRNNVEVGEYGLLQHSGHKFIAASPDGICSKKANTGGLSK LVGRLLEIKFPFSREINNSGDLDGDICPHYYFLQVQTQLYVTEMDECDFLQCKIDEY DSWEDFVKDSNPIVPGLSKTTNLEKGCLIQLSDKNLIGSDDKEKCLYNSKYIYPPKL HMTNEEIEKWISSEIMNYHNNDLSENYMIDRVIYWRLSQVTCNLIKLNKEAFEEKI PLLQQFWDYVLFYRQHSDKLDKLIKFVEKVKEDNSAEIFSYINEDFLSLNKDSKYEP LYQEETEWRKKYNQIKAKKAQMYKNKSYNKYTKFSN
SEQ. ID. N°3: gène R350 de Mimivirus
ATGAACCGTCGTAACCGTAGCAACGACCTGAACCCGGAGCCGAGCATCGAAAAC CCGAACAACCAGATTGCGGAGGAATTCCCGGGTAACAACAGCGTGTATAAAAGC GACGGCTACGTTGATCTGAAGAACAACGGTCGTCTGTTCCCGATCTGGATTCTG AAGAACTTTAAACAATACAAGCTGCCGGAGATCATTCGTAAAGAGAACGAAGACC CGTGCAACGTGCAGGTTAAGCTGGAGCTGCGTAAATATCAGGAATTCGTGGGCC AATACCTGAACCCGCAGGGTCCGTATACCAGCATCCTGCTGTACCATGGTCTGG GTAGCGGCAAGACCGCGAGCGCGATCAACCTGATGAACATTCTGTACAACTATG ACAACGGCACCAACTTTATCGTTCTGATTAAAGCGAGCCTGCACAACGACCCGTG GATGCAGGACCTGAAGGAGTGGCTGGGTCGTGATCCGAGCGAACAGAACGTGG ACAACGTTACCAAGCTGGATCGTTACAAAAACATCCACTTCGTGCACTATGACAG CCCGTTCGCGGATAGCAGCTTTATGAGCGTTATTAAGACCCTGGACCTGAGCAA ACCGACCATGTACATCATTGATGAGGCGCACAACTTTATCCGTAACGTGTATAGC AACATTAACAGCAAACTGGGCAAGCGTGCGAAAGTTATCTACGAGTACATCATGA AGGACAAGCGTGAAAACAAGAACACCCGTATCGTGCTGATTAGCGCGACCCCGG CGATCAACACCCCGTTCGAACTGGCGCTGATGTTTAACCTGCTGCGTCCGGGTA TTTTCCCGAGCAGCGAGCTGGATTTCAACCGTACCTTTGTGACCGAAAGCAGCT ACCCGATCCTGAACCCGATGAAGAAAAACATGTTTGAGCGTCGTATCCTGGGCC TGGTTAGCTACTATATTGGTGCGACCCCGGACCTGTATGCGCGTCAAGAACTGA AGTACATCAACCTGCCGATGAGCGCGTACCAGTATGATATCTACCGTATTTTCGA GAAACTGGAGGCGGAAATTCAAGAACGTGCGCGTCGTCGTGGCAAGCAGAGCCA ACTGTACCGTACCTATACCCGTCAGGCGTGCAACTTCGTGTTTCCGTACGTTAAC ATGAACGTGAACGGTGAACTGCGTCCGCGTCCGGGCAAGTTCCGTCTGAGCGAA AAACTGGCGGACGATTTTAGCAAGGGCAAAAACCTGGACGTTCCGGATACCGAG AAAGAAATCCTGAACAAGTATACCAAAGCGATTGAGAACTACCTGAACGAGACCG AACGTTATTTTCAGAACATCAACAAGAAAGACGCGGAGAACGGTCGTACCATCAT TAACGACCTGGATGAATTCAAGAAAGGCTTTGGTACCAAGTTCAACAGCTTTCTG CAGTACTATCAAAGCGAGGGTCCGCGTAGCAGCCTGCTGACCGAAATGTACAAC TGCAGCCCGAAAATGCTGGCGATCGCGTTCATGACCTATATTAGCCCGGGCAAG GTGATGATCTACAGCAACTATGTGGTTATGGAAGGCATCGACGTTATGAAAATT TACTTTCGTCTGATCGGTTTCAACGATTTTACGATCGCGCGTGAGTACATGGGCT ATTGCGAATACCACGGTCGTATCGACCCGAAGGATCGTGTGCGTATCAAGAACA TGTTCAACGACAAGAACAACGTGTACGGCAACAAGTGCAAAGTTATCATGCTGA GCCCGAGCGCGACCGAGGGTATTCAACTGCTGGATATCCGTCAGGAGCACATTA TGGAACCGTATTGGACCGAAGTTCGTATCCAGCAAGTGATTGGCCGTGGTGTTC GTCAATGCAGCCACCGTGACCTGCCGATGAGCGAGCGTATCGTGGATATTTACC GTTATAAGGTTATCAAACCGGAAAACCTGGACCCGGACGATACCGTGCGTCAAA GCACCGACGAGTACGTTGAAGATCAGGCGAAGAGCAAAGCGAACCTGATTGAGA GCTTCCTGGGCGCTATGAAAGAAGCGGCGGTTGATTGCGAGCTGTTTAAGGAAC ACAACATGATGAGCCAGAGCTACTATTGCTTCAAATTTCCGGAGAGCGCGGTGA CCAAGACCAACGTTGGCCCGGCGTACCGTGAAGACATCAAGGACGATGTGAAAT ATGATAGCGGTCTGAACAGCAAAAACAGCATCGTTGAGCGTATTCGTGTGGTTA AGGTGAACGCGGTTTACCAAATCAACACCGACAACAACAACCCGGTGTATAGCA GCCCGACCAAGTACTGGTATAACAAGAAAACCGGCATGGTTTATGACTTCGAGA CCCACTACCCGGTGGGTCAGGTTGAATTTATCGATAACCTGCCGAACAAGCTGG ACAAAGATACCTACATCATGCGTATTGATGTGATCATTCCGAGCATTACCGGTAG CGTTAACACCTAA
SEQ. ID. N°4 : gène R354 de Mimivirus
ATGACCGACATTAGCTACTATAACAACGAGATCGATAAAATTCTGTGGAACATCC TGGGTGACGATTATTTCACCCAAGACGAATTTGACGATCTGGTGAACAGCGTTG CGAACACCATTTACCAGTATGACAACGAAGTGAGCATCGATAAGCTGAAAGTGAT CATCGAATTCGTTATCCTGAACAAGTTCAAGCTGTGCTACATCTACGATAACGAC AGCATCCTGAACCAAGTGAAATACGAGAAGAAAAGCGTTGGTAGCAAAACCATC GGCAAGAACAGCACCAACGACGATGAGGACGATGACGAAGATATCGCGGTGATT AAGCTGAGCGATATTGAGGCGGGCGAAAACTGGTTCAAGAAAAGCCCGAAAATC AGCAGCAAGCAGTTTCAAAGCGTTGACAAAGTTGAGGTGGCGACCTACGAAGAC CTGATCAGCCACAAGCACGATTACCCGAAAGAGATTTATAAGGAAAGCCACTACA TCCGTCGTAACACCCGTCTGGATGTGATCAAGAAAATTCCGCAATTCGAGCAGAA GAGCAAAGAATGGCTGAAACAACGTACCGAGAGCCTGACCGCGACCGCGATTAG CGTGGTTTTTGATGAAGACCCGTATAAACACCCGATCGTTATTCTGCTGGACAAG TGCGGTCGTGGCCTGCCGTTCGTGGAGAACAAATTTGTTCACCACGGTAACAAG TATGAACAAATCGGCACCATGTTCTACAGCTTTCGTAACAACGTTGAGGTGGGT GAGTACGGCCTGCTGCAGCACAGCGGTCACAAGTTTATCGCGGCGAGCCCGGAT GGCATCTGCAGCAAGAAAGCGAACACCGGTGGCCTGAGCAAACTGGTGGGTCGT CTGCTGGAGATTAAGTTCCCGTTTAGCCGTGAAATCAACAACAGCGGTGATCTG GACGGCGATATCTGCCCGCACTACTATTTTCTGCAGGTGCAAACCCAGCTGTAT GTTACCGAGATGGACGAATGCGACTTCCTGCAGTGCAAAATTGACGAGTACGAT AGCTGGGAAGACTTTGTGAAGGATAGCAACCCGATCGTTCCGGGTCTGAGCAAA ACCACCAACCTGGAGAAGGGCTGCCTGATTCAGCTGAGCGACAAAAACCTGATC GGCAGCGACGACAAGGAAAAATGCCTGTATAACAGCAAATACATCTATCCGCCG AAGCTGCACATGACCAACGAGGAAATCGAGAAGTGGATTAGCAGCGAAATCATG AACTACCACAACAACGACCTGAGCGAGAACTATATGATTGATCGTGTGATCTACT GGCGTCTGAGCCAAGTTACCTGCAACCTGATTAAGCTGAACAAAGAAGCGTTCG AGGAAAAAATCCCGCTGCTGCAGCAATTCTGGGACTACGTTCTGTTTTATCGTCA GCACAGCGACAAGCTGGATAAACTGATTAAGTTTGTGGAGAAGGTTAAAGAAGA TAACAGCGCGGAGATTTTCAGCTACATCAACGAAGACTTTCTGAGCCTGAACAAA GATAGCAAGTACGAGCCGCTGTATCAGGAAGAGACCGAATGGCGTAAGAAATAT AACCAAATCAAGGCGAAGAAAGCGCAGATGTACAAGAACAAGAGCTACAACAAG TACACCAAGTTCAGCAAC
SEQ. ID. N°5 : gène R349 de Mimivirus
ATGGAATTAATTAGTCGTGTCTTTACTCATGGAGAAAATATTTTACTTGTTAGTT CTACAAATAAGTTATATATTATGGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGTTTCAA AATAGGTACAGATAAAACTTATATTGAAAGTCCAGTATATATTGACATTAAATTA GATGATGATGATTCTGTTAAAGCGTTTTATTCTTGTAATTTATTCACGATGATTC ATACATCCAAAGGAAAAATTTATCTATCAAGATCATTTATTTGTGGTGGAGGTGA AATCGATGCATATGATAGTGAAAGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGC TGAGTCTGATGCTGAATCAGATTCAGAAAATCATACTCAAAATAATACAAATACT CCCATAAATAATATCACACTAATTAATTTGGATTCATCAAATAATTCCACTCAATC TGATAATGAATCTGATAATGAATCTGATAATGAATCTGACAATGAATCTGATCAA TCATGTAGTGATTTTGACTGTGGACCTCGATCTGATAATGAATCTGATGAAGAAG TTTTTGTTGATCGTAATGATAATAATTCAGATAATATTGGTAATTCAAATAGTAT TGATAATGAATCTGAATCTATGACTGAAAAAGCTGGAATAATTTTGTTAAACGAA ATTAAAACCATGGTAGATGAAATTTTGTCTCAAAAAAATATTAATTCTGTTGGAA TTAACGATATTGTTATTCGTCCAAGCGGACAGTATGTGAGTAATATGGGATATAT TACAGAATCAGGTAGTGTATCATTTCATACCAATAAAAATGGTTTCTTATTATTC AAGTCCAATGTTCATGAAATCCTTTTCGTTGAAGAAATGTTTATGTACTCTAAAA
ATAATTTTATTTATTTGGCCATACCATTTAAAAAATACCAGGCATCTCTAAGAGA TATTGCTCCTTTTCATACAATTAATAAAACAAAAAATGGTATTAAATGGAAGTAT TTCAAAATAGTGTTTCCATTTGACACTGAAAAAATAGAATTTTGTGATAATTTCT TTTATACTTATGAATCCAATACTTGTTATCATCATGTTATTTCATTCTACAAAAAT GTAAATTATTATCCTTCTTGGATATATTTCAAATCTGAGATTGATATTAATAGTA AAAATATGTTCTTTTCAAGTGATACTAATAGTGTGTATGTTAAAGATAATAACAA CGTGTATAAATACCATAATTTCAATAATTCTCTTGAAAAATACATCGATAACAAA CTCGACTTGGATGTCGTAATTGTGCCTGATAGTTATAGACCAATGGAAATGAGA CTACTATTAAAGTTAGGTATAACATTGTATAGCGATTACAATTTTAATGGATGTG AGGATGATGAAGAACATATTTTCGAAATTATGAAAAATCAATATGTACCTCATAT TATCGGTCTGAATTATTTTGAAAGTTTCATTGTAGTTATTGTCAATAATCCAAAT ATGTTGACGATAACAACTGACGATGGTAAAATTTTCTTTAACATTCATGATATTA CTTTTTACAAAAGATTTTATAATGGAATCGTTTATCTTGATAATGGTTCGTTATT TTATCTCACAGATAGTGAAATTTCAGATCAAAATGTATGGAAACTAACTGGATGT CAATTGTGTGAGCTAGCTGATTCTACCATATATAGTTACCTATTTAATTTACCGG ACAAAATTGATGAAATTTACTCTTCGTCTGAATTTATTGTTCTAAAATTAATTGG AAACAAATATTTTTATTATCCGGTTGAAAATTTTGATACTGCTCAAGATTTTAAG ACAAGATGTGGGGAAATTTCATTGAAAAATAATTCAGTTCTTGAACTCGTTAATA CTAGTATTATTAACAGACAATCTAAAAGTTATCATACTACAGTATCTATTAATATT GATACGGATTGTACTACTCATAATTCTTTCGAGAGATTGTTTATCCTGACACAAT CTCTTAGTTATTCCGCAGAATATTCTATTCGAATTGTAGACGACAAAAATATTGG TTTTGGTGATGGGCCTAAAATTGAATTTTGTGAATCGGCTATTATGCAATTTTAT TATAAGTATTTAATTGCTCATAATTTTCACACAGAGTTTAATTTACAAGAATTTG CCAAACTGAAACCCACCGAAATTAAATATTTGGGATCAATGTTTCATATGGTTAT CTGTCAAAATAATTCTTCGTTACCGATTAGATTACCTCTAGCTTTTGCTGTAGAA ATTTATGGAAAAGAACCCACAATTGATGAATTGGAATATTTTGCTTGTAATGAAG ATGAAACTGGATTCAAACATATTTATCCAGCCAAATACAATCCCGAATTAGTTAA AGAATTCGGTTATGAATCTTATGAACATTGTCTAAAAACTTTGTGTAAATATAAT TATGAAGATGATACTGATAAAAATATCTTGACGAAAAAATATTGCGAGCAATTAG CTGCCGGTTTTAAAAGATACGGCAATATCAAGAACATAAAACAAATGAATTTACC CACATTGGACTATTACATTTCTGGCCCATACAAAATTAATAGAACCATATTAATT AATAATCTTGTTTTATCGGGAGGTAAGGATAAAAATAATAATTATTTGGAAATGT TCAAAGAATTTATTAACTCTTTGTCTGAAAATGAATTAAAAATCTTGCTAAAAAA TTGGACAGCATCAACTTGTGTAAGACCAGATAACAAATATAGAATTATCATTATT TCCAAATCTAAAAACGCTAAAGCAGGTATTCGATTTGGTACTTGTAATTTAGAAA TTCATATCGACGAAAAAATGTTGGATGAACATAATATTGATACAGTCAAAGAGGT TTTAATTACACCTGCTCAAGGATTCAAAGATTAA
SEQ. ID. N°6 : séquence répétée du virophage zamilon
TGATAATGAATCTGA
SEQ. ID. N°7: Gène R349 modifié avec des séquences répétées du gène de résistance à la tétracycline
ATGGAATTAATTAGTCGTGTCTTTACTCATGGAGAAAATATTTTACTTGTTAGTT CTACAAATAAGTTATATATTATGGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGTTTCAA AATAGGTACAGATAAAACTTATATTGAAAGTCCAGTATATATTGACATTAAATTA GATGATGATGATTCTGTTAAAGCGTTTTATTCTTGTAATTTATTCACGATGATTC ATACATCCAAAGGAAAAATTTATCTATCAAGATCATTTATTTGTGGTGGAGGTGA
AATCGATGCATATGATAGTGAAAGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGC TGAGTCTGATGCTGAATCAGATTCAGAAAATCATACTCAAAATAATACAAATACT CCCATAAATAATATCACACTAATTAATTTGGATTCATCAAATAATTCCACTCAATC CACCCTGGATGCTGTTAATGAATCCACCCTGGATGCTGTCAATGAATCTGATCAA TCATGTAGTGATTTTGACTGTGGACCTCGATCCACCCTGGATGCTGTTGAAGAA GTTTTTGTTGATCGTAATGATAATAATTCAGATAATATTGGTAATTCAAATAGTA TCACCCTGGATGCTGTATCTATGACTGAAAAAGCTGGAATAATTTTGTTAAACGA AATTAAAACCATGGTAGATGAAATTTTGTCTCAAAAAAATATTAATTCTGTTGGA ATTAACGATATTGTTATTCGTCCAAGCGGACAGTATGTGAGTAATATGGGATATA TTACAGAATCAGGTAGTGTATCATTTCATACCAATAAAAATGGTTTCTTATTATT CAAGTCCAATGTTCATGAAATCCTTTTCGTTGAAGAAATGTTTATGTACTCTAAA AATAATTTTATTTATTTGGCCATACCATTTAAAAAATACCAGGCATCTCTAAGAG ATATTGCTCCTTTTCATACAATTAATAAAACAAAAAATGGTATTAAATGGAAGTA TTTCAAAATAGTGTTTCCATTTGACACTGAAAAAATAGAATTTTGTGATAATTTC TTTTATACTTATGAATCCAATACTTGTTATCATCATGTTATTTCATTCTACAAAAA TGTAAATTATTATCCTTCTTGGATATATTTCAAATCTGAGATTGATATTAATAGT AAAAATATGTTCTTTTCAAGTGATACTAATAGTGTGTATGTTAAAGATAATAACA ACGTGTATAAATACCATAATTTCAATAATTCTCTTGAAAAATACATCGATAACAA ACTCGACTTGGATGTCGTAATTGTGCCTGATAGTTATAGACCAATGGAAATGAG ACTACTATTAAAGTTAGGTATAACATTGTATAGCGATTACAATTTTAATGGATGT GAGGATGATGAAGAACATATTTTCGAAATTATGAAAAATCAATATGTACCTCATA TTATCGGTCTGAATTATTTTGAAAGTTTCATTGTAGTTATTGTCAATAATCCAAA TATGTTGACGATAACAACTGACGATGGTAAAATTTTCTTTAACATTCATGATATT ACTTTTTACAAAAGATTTTATAATGGAATCGTTTATCTTGATAATGGTTCGTTAT TTTATCTCACAGATAGTGAAATTTCAGATCAAAATGTATGGAAACTAACTGGATG TCAATTGTGTGAGCTAGCTGATTCTACCATATATAGTTACCTATTTAATTTACCG GACAAAATTGATGAAATTTACTCTTCGTCTGAATTTATTGTTCTAAAATTAATTG GAAACAAATATTTTTATTATCCGGTTGAAAATTTTGATACTGCTCAAGATTTTAA GACAAGATGTGGGGAAATTTCATTGAAAAATAATTCAGTTCTTGAACTCGTTAAT ACTAGTATTATTAACAGACAATCTAAAAGTTATCATACTACAGTATCTATTAATAT TGATACGGATTGTACTACTCATAATTCTTTCGAGAGATTGTTTATCCTGACACAA TCTCTTAGTTATTCCGCAGAATATTCTATTCGAATTGTAGACGACAAAAATATTG GTTTTGGTGATGGGCCTAAAATTGAATTTTGTGAATCGGCTATTATGCAATTTTA TTATAAGTATTTAATTGCTCATAATTTTCACACAGAGTTTAATTTACAAGAATTT GCCAAACTGAAACCCACCGAAATTAAATATTTGGGATCAATGTTTCATATGGTTA TCTGTCAAAATAATTCTTCGTTACCGATTAGATTACCTCTAGCTTTTGCTGTAGA AATTTATGGAAAAGAACCCACAATTGATGAATTGGAATATTTTGCTTGTAATGAA GATGAAACTGGATTCAAACATATTTATCCAGCCAAATACAATCCCGAATTAGTTA AAGAATTCGGTTATGAATCTTATGAACATTGTCTAAAAACTTTGTGTAAATATAA TTATGAAGATGATACTGATAAAAATATCTTGACGAAAAAATATTGCGAGCAATTA GCTGCCGGTTTTAAAAGATACGGCAATATCAAGAACATAAAACAAATGAATTTAC CCACATTGGACTATTACATTTCTGGCCCATACAAAATTAATAGAACCATATTAAT TAATAATCTTGTTTTATCGGGAGGTAAGGATAAAAATAATAATTATTTGGAAATG TTCAAAGAATTTATTAACTCTTTGTCTGAAAATGAATTAAAAATCTTGCTAAAAA ATTGGACAGCATCAACTTGTGTAAGACCAGATAACAAATATAGAATTATCATTAT TTCCAAATCTAAAAACGCTAAAGCAGGTATTCGATTTGGTACTTGTAATTTAGAA ATTCATATCGACGAAAAAATGTTGGATGAACATAATATTGATACAGTCAAAGAGG TTTTAATTACACCTGCTCAAGGATTCAAAGATTAA
SEQ. ID. N°8 séquence sens de 130 nucléotides de IORF4 de zamilon
ATAGAACAACCAAAAAAATATCAAAATCTAGAGATGAATCAAGTGAATCAGAAGA ATCTGATAATGAATCTGATAATGAATCCGATGAGGAAGTTGAATCAGAAACTGAG ATAGAACCAGTCAAATCTAA
SEQ. ID. N°9 séquence anti sens de 130 nucléotides de IORF4 de zamilon
TTAGATTTGACTGGTTCTATCTCAGTTTCTGATTCAACTTCCTCATCGGATTCAT TATCAGATTCATTATCAGATTCTTCTGATTCACTTGATTCATCTCTAGATTTTGA TATTTTTTTGGTTGTTCTAT
SEQ.ID.N°10 : amorce du gène R349 de mimivirus
ATGGAATTAATTAGTCGTGTC
SEQ.ID.N°11 : amorce du gène R349 de mimivirus
TTAATCTTTGAATCCTTGAGC
SEQ.ID.N°12 : amorce du gène de IORF4 du virophage zamilon
ATGTCTGTTCTAGAAAACCT
SEQ.ID.N°13 : amorce du gène de IORF4 du virophage zamilon TTAAGTTATAATTTTGTATA
SEQ.ID.N°14 : amorce d'une séquence sens incluant les séquences des promoteur T7 et opéron Lac
TAATACGACTCACTATAGGGTACTCCCATAAATAATATCAC
SEQ.ID.N°15 : amorce d'une séquence sens incluant les séquences des promoteur T7 et opéron Lac
GAGACAAAATTTCATCTACC
SEQ.ID.N°16 : amorce d'une séquence antisens incluant les séquences des promoteur T7 et opéron Lac
TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAAATTTCATCTACC
SEQ.ID.N°17 : amorce d'une séquence antisens incluant les séquences des promoteur T7 et opéron Lac
TACTCCCATAAATAATATCAC
SEQ.ID.N°18 : séquence sens de l'ARN de la séquence répétée du virophage zamilon
UGAUAAUGAAUCUGA
SEQ.ID.N°19 : séquence anti sens de l'ARN de la séquence répétée du virophage zamilon
UCAGAUUCAUUAUCA
SEQ.ID.N°20 : séquence sens de l'ARN de la séquence répétée du gène GFP
AAUCGCUGGACGGCGACGUUAAUGAAUCGCUGGACGGCGACGUCA
SEQ.ID.N°21 : séquence anti sens de l'ARN de la séquence répétée du gène GFP
UGACGUCGCCGUCCAGCGAUUCAUUAACGUCGCCGUCCAGCGAUU
SED.ID.N0 22: séquences organisées en opéron incluant le gène R349 modifié avec séquence spécifique de 15 nucléotides du gène de résistance à la tétracycline et les gènes R350 et 354.
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAAT AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAGATATGGAATTAATTAGTCGTGTCT TTACTCATGGAGAAAATATTTTACTTGTTAGTTCTACAAATAAGTTATATATTAT GGGTAATAATGAATATGGTTCATGTGGTTTCAAAATAGGTACAGATAAAACTTAT ATTGAAAGTCCAGTATATATTGACATTAAATTAGATGATGATGATTCTGTTAAAG CGTTTTATTCTTGTAATTTATTCACGATGATTCATACATCCAAAGGAAAAATTTA TCTATCAAGATCATTTATTTGTGGTGGAGGTGAAATCGATGCATATGATAGTGAA AGTGATGTTGGAAGTGATGCTGAGTCTGATGCTGAGTCTGATGCTGAATCAGAT TCAGAAAATCATACTCAAAATAATACAAATACTCCCATAAATAATATCACACTAAT TAATTTGGATTCATCAAATAATTCCACTCAATCCACCCTGGATGCTGTTAATGAA TCCACCCTGGATGCTGTCAATGAATCTGATCAATCATGTAGTGATTTTGACTGTG GACCTCGATCCACCCTGGATGCTGTTGAAGAAGTTTTTGTTGATCGTAATGATAA TAATTCAGATAATATTGGTAATTCAAATAGTATCACCCTGGATGCTGTATCTATG ACTGAAAAAGCTGGAATAATTTTGTTAAACGAAATTAAAACCATGGTAGATGAAA TTTTGTCTCAAAAAAATATTAATTCTGTTGGAATTAACGATATTGTTATTCGTCC AAGCGGACAGTATGTGAGTAATATGGGATATATTACAGAATCAGGTAGTGTATC ATTTCATACCAATAAAAATGGTTTCTTATTATTCAAGTCCAATGTTCATGAAATC CTTTTCGTTGAAGAAATGTTTATGTACTCTAAAAATAATTTTATTTATTTGGCCA TACCATTTAAAAAATACCAGGCATCTCTAAGAGATATTGCTCCTTTTCATACAAT TAATAAAACAAAAAATGGTATTAAATGGAAGTATTTCAAAATAGTGTTTCCATTT GACACTGAAAAAATAGAATTTTGTGATAATTTCTTTTATACTTATGAATCCAATA CTTGTTATCATCATGTTATTTCATTCTACAAAAATGTAAATTATTATCCTTCTTGG ATATATTTCAAATCTGAGATTGATATTAATAGTAAAAATATGTTCTTTTCAAGTG ATACTAATAGTGTGTATGTTAAAGATAATAACAACGTGTATAAATACCATAATTT CAATAATTCTCTTGAAAAATACATCGATAACAAACTCGACTTGGATGTCGTAATT GTGCCTGATAGTTATAGACCAATGGAAATGAGACTACTATTAAAGTTAGGTATAA CATTGTATAGCGATTACAATTTTAATGGATGTGAGGATGATGAAGAACATATTTT CGAAATTATGAAAAATCAATATGTACCTCATATTATCGGTCTGAATTATTTTGAA AGTTTCATTGTAGTTATTGTCAATAATCCAAATATGTTGACGATAACAACTGACG ATGGTAAAATTTTCTTTAACATTCATGATATTACTTTTTACAAAAGATTTTATAAT GGAATCGTTTATCTTGATAATGGTTCGTTATTTTATCTCACAGATAGTGAAATTT CAGATCAAAATGTATGGAAACTAACTGGATGTCAATTGTGTGAGCTAGCTGATTC TACCATATATAGTTACCTATTTAATTTACCGGACAAAATTGATGAAATTTACTCT TCGTCTGAATTTATTGTTCTAAAATTAATTGGAAACAAATATTTTTATTATCCGG TTGAAAATTTTGATACTGCTCAAGATTTTAAGACAAGATGTGGGGAAATTTCATT
GAAAAATAATTCAGTTCTTGAACTCGTTAATACTAGTATTATTAACAGACAATCT AAAAGTTATCATACTACAGTATCTATTAATATTGATACGGATTGTACTACTCATA ATTCTTTCGAGAGATTGTTTATCCTGACACAATCTCTTAGTTATTCCGCAGAATA TTCTATTCGAATTGTAGACGACAAAAATATTGGTTTTGGTGATGGGCCTAAAATT GAATTTTGTGAATCGGCTATTATGCAATTTTATTATAAGTATTTAATTGCTCATA ATTTTCACACAGAGTTTAATTTACAAGAATTTGCCAAACTGAAACCCACCGAAAT TAAATATTTGGGATCAATGTTTCATATGGTTATCTGTCAAAATAATTCTTCGTTA CCGATTAGATTACCTCTAGCTTTTGCTGTAGAAATTTATGGAAAAGAACCCACAA TTGATGAATTGGAATATTTTGCTTGTAATGAAGATGAAACTGGATTCAAACATAT TTATCCAGCCAAATACAATCCCGAATTAGTTAAAGAATTCGGTTATGAATCTTAT GAACATTGTCTAAAAACTTTGTGTAAATATAATTATGAAGATGATACTGATAAAA ATATCTTGACGAAAAAATATTGCGAGCAATTAGCTGCCGGTTTTAAAAGATACGG CAATATCAAGAACATAAAACAAATGAATTTACCCACATTGGACTATTACATTTCT GGCCCATACAAAATTAATAGAACCATATTAATTAATAATCTTGTTTTATCGGGAG GTAAGGATAAAAATAATAATTATTTGGAAATGTTCAAAGAATTTATTAACTCTTT GTCTGAAAATGAATTAAAAATCTTGCTAAAAAATTGGACAGCATCAACTTGTGTA AGACCAGATAACAAATATAGAATTATCATTATTTCCAAATCTAAAAACGCTAAAG CAGGTATTCGATTTGGTACTTGTAATTTAGAAATTCATATCGACGAAAAAATGTT GGATGAACATAATATTGATACAGTCAAAGAGGTTTTAATTACACCTGCTCAAGGA TTCAAAGATTAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCT GCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTC TTGAGGGGTTTTTTGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG GGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAG AAGGAGATATAGCAATGAACCGTCGTAACCGTAGCAACGACCTGAACCCGGAGC CGAGCATCGAAAACCCGAACAACCAGATTGCGGAGGAATTCCCGGGTAACAACA GCGTGTATAAAAGCGACGGCTACGTTGATCTGAAGAACAACGGTCGTCTGTTCC CGATCTGGATTCTGAAGAACTTTAAACAATACAAGCTGCCGGAGATCATTCGTAA AGAGAACGAAGACCCGTGCAACGTGCAGGTTAAGCTGGAGCTGCGTAAATATCA GGAATTCGTGGGCCAATACCTGAACCCGCAGGGTCCGTATACCAGCATCCTGCT GTACCATGGTCTGGGTAGCGGCAAGACCGCGAGCGCGATCAACCTGATGAACAT TCTGTACAACTATGACAACGGCACCAACTTTATCGTTCTGATTAAAGCGAGCCTG CACAACGACCCGTGGATGCAGGACCTGAAGGAGTGGCTGGGTCGTGATCCGAGC GAACAGAACGTGGACAACGTTACCAAGCTGGATCGTTACAAAAACATCCACTTCG TGCACTATGACAGCCCGTTCGCGGATAGCAGCTTTATGAGCGTTATTAAGACCCT GGACCTGAGCAAACCGACCATGTACATCATTGATGAGGCGCACAACTTTATCCGT AACGTGTATAGCAACATTAACAGCAAACTGGGCAAGCGTGCGAAAGTTATCTAC GAGTACATCATGAAGGACAAGCGTGAAAACAAGAACACCCGTATCGTGCTGATT AGCGCGACCCCGGCGATCAACACCCCGTTCGAACTGGCGCTGATGTTTAACCTG CTGCGTCCGGGTATTTTCCCGAGCAGCGAGCTGGATTTCAACCGTACCTTTGTG ACCGAAAGCAGCTACCCGATCCTGAACCCGATGAAGAAAAACATGTTTGAGCGT CGTATCCTGGGCCTGGTTAGCTACTATATTGGTGCGACCCCGGACCTGTATGCG CGTCAAGAACTGAAGTACATCAACCTGCCGATGAGCGCGTACCAGTATGATATCT ACCGTATTTTCGAGAAACTGGAGGCGGAAATTCAAGAACGTGCGCGTCGTCGTG GCAAGCAGAGCCAACTGTACCGTACCTATACCCGTCAGGCGTGCAACTTCGTGT TTCCGTACGTTAACATGAACGTGAACGGTGAACTGCGTCCGCGTCCGGGCAAGT TCCGTCTGAGCGAAAAACTGGCGGACGATTTTAGCAAGGGCAAAAACCTGGACG TTCCGGATACCGAGAAAGAAATCCTGAACAAGTATACCAAAGCGATTGAGAACTA CCTGAACGAGACCGAACGTTATTTTCAGAACATCAACAAGAAAGACGCGGAGAA CGGTCGTACCATCATTAACGACCTGGATGAATTCAAGAAAGGCTTTGGTACCAA GTTCAACAGCTTTCTGCAGTACTATCAAAGCGAGGGTCCGCGTAGCAGCCTGCT
GACCGAAATGTACAACTGCAGCCCGAAAATGCTGGCGATCGCGTTCATGACCTA TATTAGCCCGGGCAAGGTGATGATCTACAGCAACTATGTGGTTATGGAAGGCAT CGACGTTATGAAAATTTACTTTCGTCTGATCGGTTTCAACGATTTTACGATCGCG CGTGAGTACATGGGCTATTGCGAATACCACGGTCGTATCGACCCGAAGGATCGT GTGCGTATCAAGAACATGTTCAACGACAAGAACAACGTGTACGGCAACAAGTGC AAAGTTATCATGCTGAGCCCGAGCGCGACCGAGGGTATTCAACTGCTGGATATC CGTCAGGAGCACATTATGGAACCGTATTGGACCGAAGTTCGTATCCAGCAAGTG ATTGGCCGTGGTGTTCGTCAATGCAGCCACCGTGACCTGCCGATGAGCGAGCGT ATCGTGGATATTTACCGTTATAAGGTTATCAAACCGGAAAACCTGGACCCGGAC GATACCGTGCGTCAAAGCACCGACGAGTACGTTGAAGATCAGGCGAAGAGCAAA GCGAACCTGATTGAGAGCTTCCTGGGCGCTATGAAAGAAGCGGCGGTTGATTGC GAGCTGTTTAAGGAACACAACATGATGAGCCAGAGCTACTATTGCTTCAAATTTC CGGAGAGCGCGGTGACCAAGACCAACGTTGGCCCGGCGTACCGTGAAGACATCA AGGACGATGTGAAATATGATAGCGGTCTGAACAGCAAAAACAGCATCGTTGAGC GTATTCGTGTGGTTAAGGTGAACGCGGTTTACCAAATCAACACCGACAACAACAA CCCGGTGTATAGCAGCCCGACCAAGTACTGGTATAACAAGAAAACCGGCATGGT TTATGACTTCGAGACCCACTACCCGGTGGGTCAGGTTGAATTTATCGATAACCTG CCGAACAAGCTGGACAAAGATACCTACATCATGCGTATTGATGTGATCATTCCGA GCATTACCGGTAGCGTTAACACCTAACACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAG AAGGAGATATAGCGATGACCGACATTAGCTACTATAACAACGAGATCGATAAAAT TCTGTGGAACATCCTGGGTGACGATTATTTCACCCAAGACGAATTTGACGATCTG GTGAACAGCGTTGCGAACACCATTTACCAGTATGACAACGAAGTGAGCATCGAT AAGCTGAAAGTGATCATCGAATTCGTTATCCTGAACAAGTTCAAGCTGTGCTACA TCTACGATAACGACAGCATCCTGAACCAAGTGAAATACGAGAAGAAAAGCGTTG GTAGCAAAACCATCGGCAAGAACAGCACCAACGACGATGAGGACGATGACGAAG ATATCGCGGTGATTAAGCTGAGCGATATTGAGGCGGGCGAAAACTGGTTCAAGA AAAGCCCGAAAATCAGCAGCAAGCAGTTTCAAAGCGTTGACAAAGTTGAGGTGG CGACCTACGAAGACCTGATCAGCCACAAGCACGATTACCCGAAAGAGATTTATAA GGAAAGCCACTACATCCGTCGTAACACCCGTCTGGATGTGATCAAGAAAATTCCG CAATTCGAGCAGAAGAGCAAAGAATGGCTGAAACAACGTACCGAGAGCCTGACC GCGACCGCGATTAGCGTGGTTTTTGATGAAGACCCGTATAAACACCCGATCGTT ATTCTGCTGGACAAGTGCGGTCGTGGCCTGCCGTTCGTGGAGAACAAATTTGTT CACCACGGTAACAAGTATGAACAAATCGGCACCATGTTCTACAGCTTTCGTAACA ACGTTGAGGTGGGTGAGTACGGCCTGCTGCAGCACAGCGGTCACAAGTTTATCG CGGCGAGCCCGGATGGCATCTGCAGCAAGAAAGCGAACACCGGTGGCCTGAGCA AACTGGTGGGTCGTCTGCTGGAGATTAAGTTCCCGTTTAGCCGTGAAATCAACA ACAGCGGTGATCTGGACGGCGATATCTGCCCGCACTACTATTTTCTGCAGGTGC AAACCCAGCTGTATGTTACCGAGATGGACGAATGCGACTTCCTGCAGTGCAAAA TTGACGAGTACGATAGCTGGGAAGACTTTGTGAAGGATAGCAACCCGATCGTTC CGGGTCTGAGCAAAACCACCAACCTGGAGAAGGGCTGCCTGATTCAGCTGAGCG ACAAAAACCTGATCGGCAGCGACGACAAGGAAAAATGCCTGTATAACAGCAAATA CATCTATCCGCCGAAGCTGCACATGACCAACGAGGAAATCGAGAAGTGGATTAG CAGCGAAATCATGAACTACCACAACAACGACCTGAGCGAGAACTATATGATTGAT CGTGTGATCTACTGGCGTCTGAGCCAAGTTACCTGCAACCTGATTAAGCTGAAC AAAGAAGCGTTCGAGGAAAAAATCCCGCTGCTGCAGCAATTCTGGGACTACGTT CTGTTTTATCGTCAGCACAGCGACAAGCTGGATAAACTGATTAAGTTTGTGGAG AAGGTTAAAGAAGATAACAGCGCGGAGATTTTCAGCTACATCAACGAAGACTTTC TGAGCCTGAACAAAGATAGCAAGTACGAGCCGCTGTATCAGGAAGAGACCGAAT GGCGTAAGAAATATAACCAAATCAAGGCGAAGAAAGCGCAGATGTACAAGAACA AGAGCTACAACAAGTACACCAAGTTCAGCAACCTCGAGCACCACCACCACCACCA
CTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCAC CGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGG TTTTTTG.
SEQ. ID. N°23 : séquence spécifique de 15 nucléotides du gène de résistance à la tétracycline
CACCCTGGATGCTGT
SEQ.ID. N 24 : séquence de 28 nt du virophage zamilon
AATCTGATAATGAATCTGATAATGAATC
SEQ.ID. N°25 : vecteur PP14
CCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGG AGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGT CGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGG GCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTT TTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGAT AACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACC GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTT CTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTAC AATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTG ACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGAC GGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGA GCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGC GGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCAT CCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAA GCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTA AGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCT CACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGG TAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCA ATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCA TCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTC CAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCA GACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTC TGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGC ACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCG CCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAA GATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCG GTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCAT GATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCG GAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGC CTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAG TCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGA GGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGG CAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTC CACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGG GATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCA CCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGA
TCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATG GTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCT GAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCG AGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGA CCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTT GATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGC AGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCA CTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCG CTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATT TAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAA CGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAA TGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAAC GTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATA CTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTC TCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTG TCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAG TAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGA GATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAA ACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTC GGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGAT GCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACT ATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACT TTAAGAAGGAGATATAGATATGGAATTAATTAGTCGTGTCTTTACTCATGGAGAA AATATTTTACTTGTTAGTTCTACAAATAAGTTATATATTATGGGTAATAATGAAT ATGGTTCATGTGGTTTCAAAATAGGTACAGATAAAACTTATATTGAAAGTCCAGT ATATATTGACATTAAATTAGATGATGATGATTCTGTTAAAGCGTTTTATTCTTGT AATTTATTCACGATGATTCATACATCCAAAGGAAAAATTTATCTATCAAGATCAT TTATTTGTGGTGGAGGTGAAATCGATGCATATGATAGTGAAAGTGATGTTGGAA GTGATGCTGAGTCTGATGCTGAGTCTGATGCTGAATCAGATTCAGAAAATCATA CTCAAAATAATACAAATACTCCCATAAATAATATCACACTAATTAATTTGGATTCA TCAAATAATTCCACTCAATCCACCCTGGATGCTGTTAATGAATCCACCCTGGATG CTGTCAATGAATCTGATCAATCATGTAGTGATTTTGACTGTGGACCTCGATCCAC CCTGGATGCTGTTGAAGAAGTTTTTGTTGATCGTAATGATAATAATTCAGATAAT ATTGGTAATTCAAATAGTATCACCCTGGATGCTGTATCTATGACTGAAAAAGCTG GAATAATTTTGTTAAACGAAATTAAAACCATGGTAGATGAAATTTTGTCTCAAAA AAATATTAATTCTGTTGGAATTAACGATATTGTTATTCGTCCAAGCGGACAGTAT GTGAGTAATATGGGATATATTACAGAATCAGGTAGTGTATCATTTCATACCAATA AAAATGGTTTCTTATTATTCAAGTCCAATGTTCATGAAATCCTTTTCGTTGAAGA AATGTTTATGTACTCTAAAAATAATTTTATTTATTTGGCCATACCATTTAAAAAAT ACCAGGCATCTCTAAGAGATATTGCTCCTTTTCATACAATTAATAAAACAAAAAA TGGTATTAAATGGAAGTATTTCAAAATAGTGTTTCCATTTGACACTGAAAAAATA GAATTTTGTGATAATTTCTTTTATACTTATGAATCCAATACTTGTTATCATCATG TTATTTCATTCTACAAAAATGTAAATTATTATCCTTCTTGGATATATTTCAAATCT GAGATTGATATTAATAGTAAAAATATGTTCTTTTCAAGTGATACTAATAGTGTGT ATGTTAAAGATAATAACAACGTGTATAAATACCATAATTTCAATAATTCTCTTGA AAAATACATCGATAACAAACTCGACTTGGATGTCGTAATTGTGCCTGATAGTTAT AGACCAATGGAAATGAGACTACTATTAAAGTTAGGTATAACATTGTATAGCGATT ACAATTTTAATGGATGTGAGGATGATGAAGAACATATTTTCGAAATTATGAAAAA TCAATATGTACCTCATATTATCGGTCTGAATTATTTTGAAAGTTTCATTGTAGTT ATTGTCAATAATCCAAATATGTTGACGATAACAACTGACGATGGTAAAATTTTCT
TTAACATTCATGATATTACTTTTTACAAAAGATTTTATAATGGAATCGTTTATCTT GATAATGGTTCGTTATTTTATCTCACAGATAGTGAAATTTCAGATCAAAATGTAT GGAAACTAACTGGATGTCAATTGTGTGAGCTAGCTGATTCTACCATATATAGTTA CCTATTTAATTTACCGGACAAAATTGATGAAATTTACTCTTCGTCTGAATTTATT GTTCTAAAATTAATTGGAAACAAATATTTTTATTATCCGGTTGAAAATTTTGATA CTGCTCAAGATTTTAAGACAAGATGTGGGGAAATTTCATTGAAAAATAATTCAGT TCTTGAACTCGTTAATACTAGTATTATTAACAGACAATCTAAAAGTTATCATACT ACAGTATCTATTAATATTGATACGGATTGTACTACTCATAATTCTTTCGAGAGAT TGTTTATCCTGACACAATCTCTTAGTTATTCCGCAGAATATTCTATTCGAATTGT AGACGACAAAAATATTGGTTTTGGTGATGGGCCTAAAATTGAATTTTGTGAATCG GCTATTATGCAATTTTATTATAAGTATTTAATTGCTCATAATTTTCACACAGAGT TTAATTTACAAGAATTTGCCAAACTGAAACCCACCGAAATTAAATATTTGGGATC AATGTTTCATATGGTTATCTGTCAAAATAATTCTTCGTTACCGATTAGATTACCT CTAGCTTTTGCTGTAGAAATTTATGGAAAAGAACCCACAATTGATGAATTGGAAT ATTTTGCTTGTAATGAAGATGAAACTGGATTCAAACATATTTATCCAGCCAAATA CAATCCCGAATTAGTTAAAGAATTCGGTTATGAATCTTATGAACATTGTCTAAAA ACTTTGTGTAAATATAATTATGAAGATGATACTGATAAAAATATCTTGACGAAAA AATATTGCGAGCAATTAGCTGCCGGTTTTAAAAGATACGGCAATATCAAGAACAT AAAACAAATGAATTTACCCACATTGGACTATTACATTTCTGGCCCATACAAAATT AATAGAACCATATTAATTAATAATCTTGTTTTATCGGGAGGTAAGGATAAAAATA ATAATTATTTGGAAATGTTCAAAGAATTTATTAACTCTTTGTCTGAAAATGAATT AAAAATCTTGCTAAAAAATTGGACAGCATCAACTTGTGTAAGACCAGATAACAAA TATAGAATTATCATTATTTCCAAATCTAAAAACGCTAAAGCAGGTATTCGATTTG GTACTTGTAATTTAGAAATTCATATCGACGAAAAAATGTTGGATGAACATAATAT TGATACAGTCAAAGAGGTTTTAATTACACCTGCTCAAGGATTCAAAGATTAAGAT CCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAG CAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGA TAACAATTCCCCACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAGCAA TGAACCGTCGTAACCGTAGCAACGACCTGAACCCGGAGCCGAGCATCGAAAACC CGAACAACCAGATTGCGGAGGAATTCCCGGGTAACAACAGCGTGTATAAAAGCG ACGGCTACGTTGATCTGAAGAACAACGGTCGTCTGTTCCCGATCTGGATTCTGA AGAACTTTAAACAATACAAGCTGCCGGAGATCATTCGTAAAGAGAACGAAGACCC GTGCAACGTGCAGGTTAAGCTGGAGCTGCGTAAATATCAGGAATTCGTGGGCCA ATACCTGAACCCGCAGGGTCCGTATACCAGCATCCTGCTGTACCATGGTCTGGG TAGCGGCAAGACCGCGAGCGCGATCAACCTGATGAACATTCTGTACAACTATGA CAACGGCACCAACTTTATCGTTCTGATTAAAGCGAGCCTGCACAACGACCCGTGG ATGCAGGACCTGAAGGAGTGGCTGGGTCGTGATCCGAGCGAACAGAACGTGGAC AACGTTACCAAGCTGGATCGTTACAAAAACATCCACTTCGTGCACTATGACAGCC CGTTCGCGGATAGCAGCTTTATGAGCGTTATTAAGACCCTGGACCTGAGCAAAC CGACCATGTACATCATTGATGAGGCGCACAACTTTATCCGTAACGTGTATAGCAA CATTAACAGCAAACTGGGCAAGCGTGCGAAAGTTATCTACGAGTACATCATGAA GGACAAGCGTGAAAACAAGAACACCCGTATCGTGCTGATTAGCGCGACCCCGGC GATCAACACCCCGTTCGAACTGGCGCTGATGTTTAACCTGCTGCGTCCGGGTAT TTTCCCGAGCAGCGAGCTGGATTTCAACCGTACCTTTGTGACCGAAAGCAGCTA CCCGATCCTGAACCCGATGAAGAAAAACATGTTTGAGCGTCGTATCCTGGGCCT GGTTAGCTACTATATTGGTGCGACCCCGGACCTGTATGCGCGTCAAGAACTGAA GTACATCAACCTGCCGATGAGCGCGTACCAGTATGATATCTACCGTATTTTCGAG AAACTGGAGGCGGAAATTCAAGAACGTGCGCGTCGTCGTGGCAAGCAGAGCCAA CTGTACCGTACCTATACCCGTCAGGCGTGCAACTTCGTGTTTCCGTACGTTAACA
TGAACGTGAACGGTGAACTGCGTCCGCGTCCGGGCAAGTTCCGTCTGAGCGAAA AACTGGCGGACGATTTTAGCAAGGGCAAAAACCTGGACGTTCCGGATACCGAGA AAGAAATCCTGAACAAGTATACCAAAGCGATTGAGAACTACCTGAACGAGACCGA ACGTTATTTTCAGAACATCAACAAGAAAGACGCGGAGAACGGTCGTACCATCATT AACGACCTGGATGAATTCAAGAAAGGCTTTGGTACCAAGTTCAACAGCTTTCTGC AGTACTATCAAAGCGAGGGTCCGCGTAGCAGCCTGCTGACCGAAATGTACAACT GCAGCCCGAAAATGCTGGCGATCGCGTTCATGACCTATATTAGCCCGGGCAAGG TGATGATCTACAGCAACTATGTGGTTATGGAAGGCATCGACGTTATGAAAATTTA CTTTCGTCTGATCGGTTTCAACGATTTTACGATCGCGCGTGAGTACATGGGCTAT TGCGAATACCACGGTCGTATCGACCCGAAGGATCGTGTGCGTATCAAGAACATG TTCAACGACAAGAACAACGTGTACGGCAACAAGTGCAAAGTTATCATGCTGAGCC CGAGCGCGACCGAGGGTATTCAACTGCTGGATATCCGTCAGGAGCACATTATGG AACCGTATTGGACCGAAGTTCGTATCCAGCAAGTGATTGGCCGTGGTGTTCGTC AATGCAGCCACCGTGACCTGCCGATGAGCGAGCGTATCGTGGATATTTACCGTT ATAAGGTTATCAAACCGGAAAACCTGGACCCGGACGATACCGTGCGTCAAAGCA CCGACGAGTACGTTGAAGATCAGGCGAAGAGCAAAGCGAACCTGATTGAGAGCT TCCTGGGCGCTATGAAAGAAGCGGCGGTTGATTGCGAGCTGTTTAAGGAACACA ACATGATGAGCCAGAGCTACTATTGCTTCAAATTTCCGGAGAGCGCGGTGACCA AGACCAACGTTGGCCCGGCGTACCGTGAAGACATCAAGGACGATGTGAAATATG ATAGCGGTCTGAACAGCAAAAACAGCATCGTTGAGCGTATTCGTGTGGTTAAGG TGAACGCGGTTTACCAAATCAACACCGACAACAACAACCCGGTGTATAGCAGCCC GACCAAGTACTGGTATAACAAGAAAACCGGCATGGTTTATGACTTCGAGACCCAC TACCCGGTGGGTCAGGTTGAATTTATCGATAACCTGCCGAACAAGCTGGACAAA GATACCTACATCATGCGTATTGATGTGATCATTCCGAGCATTACCGGTAGCGTTA ACACCTAACACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAGCGATGA CCGACATTAGCTACTATAACAACGAGATCGATAAAATTCTGTGGAACATCCTGGG TGACGATTATTTCACCCAAGACGAATTTGACGATCTGGTGAACAGCGTTGCGAAC ACCATTTACCAGTATGACAACGAAGTGAGCATCGATAAGCTGAAAGTGATCATCG AATTCGTTATCCTGAACAAGTTCAAGCTGTGCTACATCTACGATAACGACAGCAT CCTGAACCAAGTGAAATACGAGAAGAAAAGCGTTGGTAGCAAAACCATCGGCAA GAACAGCACCAACGACGATGAGGACGATGACGAAGATATCGCGGTGATTAAGCT GAGCGATATTGAGGCGGGCGAAAACTGGTTCAAGAAAAGCCCGAAAATCAGCAG CAAGCAGTTTCAAAGCGTTGACAAAGTTGAGGTGGCGACCTACGAAGACCTGAT CAGCCACAAGCACGATTACCCGAAAGAGATTTATAAGGAAAGCCACTACATCCGT CGTAACACCCGTCTGGATGTGATCAAGAAAATTCCGCAATTCGAGCAGAAGAGC AAAGAATGGCTGAAACAACGTACCGAGAGCCTGACCGCGACCGCGATTAGCGTG GTTTTTGATGAAGACCCGTATAAACACCCGATCGTTATTCTGCTGGACAAGTGCG GTCGTGGCCTGCCGTTCGTGGAGAACAAATTTGTTCACCACGGTAACAAGTATG AACAAATCGGCACCATGTTCTACAGCTTTCGTAACAACGTTGAGGTGGGTGAGT ACGGCCTGCTGCAGCACAGCGGTCACAAGTTTATCGCGGCGAGCCCGGATGGCA TCTGCAGCAAGAAAGCGAACACCGGTGGCCTGAGCAAACTGGTGGGTCGTCTGC TGGAGATTAAGTTCCCGTTTAGCCGTGAAATCAACAACAGCGGTGATCTGGACG GCGATATCTGCCCGCACTACTATTTTCTGCAGGTGCAAACCCAGCTGTATGTTAC CGAGATGGACGAATGCGACTTCCTGCAGTGCAAAATTGACGAGTACGATAGCTG GGAAGACTTTGTGAAGGATAGCAACCCGATCGTTCCGGGTCTGAGCAAAACCAC CAACCTGGAGAAGGGCTGCCTGATTCAGCTGAGCGACAAAAACCTGATCGGCAG CGACGACAAGGAAAAATGCCTGTATAACAGCAAATACATCTATCCGCCGAAGCTG CACATGACCAACGAGGAAATCGAGAAGTGGATTAGCAGCGAAATCATGAACTAC CACAACAACGACCTGAGCGAGAACTATATGATTGATCGTGTGATCTACTGGCGT CTGAGCCAAGTTACCTGCAACCTGATTAAGCTGAACAAAGAAGCGTTCGAGGAA
AAAATCCCGCTGCTGCAGCAATTCTGGGACTACGTTCTGTTTTATCGTCAGCACA GCGACAAGCTGGATAAACTGATTAAGTTTGTGGAGAAGGTTAAAGAAGATAACA GCGCGGAGATTTTCAGCTACATCAACGAAGACTTTCTGAGCCTGAACAAAGATA GCAAGTACGAGCCGCTGTATCAGGAAGAGACCGAATGGCGTAAGAAATATAACC AAATCAAGGCGAAGAAAGCGCAGATGTACAAGAACAAGAGCTACAACAAGTACA CCAAGTTCAGCAACCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAA CAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGC ATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGG AACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCG GCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCG CCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCC GTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGC ACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGC CCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGG ACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGAT TTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAAC AAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCAC TTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCA AATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAA AAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGAT GCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGC GGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTT TTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGC AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGT CACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGC CATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGA CCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTT GATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACC ACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTAC TTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTG CAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAAT CTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATG GTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGG ATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGT AACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTT TTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATC CCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAG GATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAA ACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTT CCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTG TAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCG CTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTA CCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAA CGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGA GATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTT
SEQ. ID. N°26 : séquence du premier spacer du gène R349 modifié (N.B. : ne pas tenir compte du premier nucléotide A ajouté uniquement pour faire un total de 10 nt comme requis par le logiciel de listage de séquence)
ATAATGAATC
SEQID°27 : séquence du deuxième spacer du gène R349 modifié
CAATGAATCTGATCAATCATGTAGTGATTTTGACTGTGGACCTCGATC
SEQ. ID. N°28 : séquence du troisième spacer du gène R349 modifié
TGAAGAAGTTTTTGTTGATCGTAATGATAATAATTCAGATAATATTGGTAATTCA
AATAGTAT
SEQ. ID. N°29 : séquence sens d'ARN spécifique du gène GFP
GCUGGACGGCGACGA
SEQ. ID. N°30 : séquence anti sens d'ARN spécifique du gène GFP
ACGUCGCCGUCCAGC
SEQ.ID.N°31: séquence du Promoteur T7
TAATACGACTCACTATAG
SEQ.ID.N°32: séquence de l'opéron Lac
GAATTGTGAGCGGATAACAATTCC.
SEQ.ID.N°33 : séquence du terminateur T7
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG
SEQ.ID.N°34 :séquence de l'étiquette polyhistidine
CACCACCACCACCACCAC
Références Bibliographiques
1. Barrangou R, Marraffini LA. CRISPR-Cas systems: prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell 2014 ; 54 : 234-244.
2. Desnues C, La SB, Yutin N, et al. Provirophages and transpovirons as the diverse mobilome of giant viruses. Proc Natl Acad Sci USA 2012 ; 109 : 18078-18083.
3. Filee J, Chandler M. Gene exchange and the origin of giant viruses. Intervirology 2010 ; 53 : 354-361.
4. Forterre P. Giant viruses: conflicts in revisiting the virus concept. Intervirology 2010 ; 53 : 362-378.
5. Gaia M, Benamar S, Boughalmi M, et al. Zamilon, a novel virophage with Mimiviridae host specificity. PLoS One 2014 ; 9 : e94923.
6. La Scola B, Audic S, Robert C, et al. A giant virus in amoebae. Science 2003 ; 299 : 2033.
7. La Scola B, Desnues C, Pagnier I, Robert C, Barrassi L, et al. (2008) The virophage as a unique parasite of the giant Mimivirus, Nature 2008 ; 455 : 100-104.
8. Levasseur A, Bekliz M, Chabrière E, et al. MIMIVIRE is a defence system in Mimivirus that confers resistance to virophage. Nature 2016 ; 531 : 249-252.
9. Makarova KS, Wolf Yl, Koonin EV. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Res 2013 ; 41 : 4360-4377.
10. Raoult D. How the virophage compels the need to readdress the classification of microbes. Virology 2015 ; 477 : 119-124
11. Sharma V, Colson P, Pontarotti P, Raoult D. Mimivirus inaugurated in the 21st century the beginning of a reclassification of viruses. Curr Opin Microbiol 2016 ; 31 : 16-24.
12. J. M. Claverie and C. Abergel, CRISPR-Cas-like system in giant viruses: why MIMIVIRE is not likely to be an adaptive immune system, Virol. Sin. 31(3), 193 (2016).
13. Yutin N, Raoult D, Koonin EV. Virophages, polintons, and transpovirons: a complex evolutionary network of diverse selfish genetic elements with different reproduction strategies. Virol J 2013 ; 10 : 158. [CrossRef] [PubMed] [Google Scholar]
14. Casane D, Laurenti P. Le cas CRISPR, mutations « readymade » et évolution lamarckienne d'un système immunitaire adaptatif. Med Sci (Paris) 2016 ; 32 : 640-645. [CrossRef] [EDP Sciences] [PubMed] [Google Scholar]
15. Tremblay JP. CRISPR, un système qui permet de corriger ou de modifier l'expression de gènes responsables de maladies héréditaires. Med Sci (Paris) 2015 ; 31 : 1014-1022. [CrossRef] [EDP Sciences] [PubMed] [Google Scholar]
16. La Gilgenkrantz H. révolution des CRISPR est en marche. Med Sci (Paris) 2014 ; 30 : 1066-1069. [CrossRef] [EDP Sciences] [PubMed] [Google Scholar]
17. Chao Dou et al « structural and mechanistic analyses reveal a unique cas4-like proetin in the Mimivirus virophage resistant elemnt system, ISCIENCE (2018), 10.1016/j.isci 2018.04.01.
18. Petrov A, Wu T, Puglisi EV, Purification d’ARN de Puglisi JD.
RNA purification by preparative polyacrylamide gel electrophoresis, Methods Enzymol 2013, 530: 315- 30.

Claims (15)

  1. REVENDICATIONS
    1. Méthode de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo avec un système biologique comprenant :
    - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
    - un deuxième composant comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides.
  2. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dit deuxième composant comprend la dite la séquence d'affinité sous forme d'ADN ou de préférence sous forme d'ARN.
  3. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la dite la séquence d'affinité comprend au moins 2 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, de préférence de 2 à 4, de préférence encore 4 mêmes dites séquences complémentaires d'une même séquence spécifique, répétées de façon espacée.
  4. 4. Méthode selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la dite ou chaque dite séquence complémentaire de la même dite séquence spécifique de la séquence d'affinité comprend est flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus.
  5. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les dites même séquences complémentaires de la même séquence spécifique de la séquence cible sont flanquées en 3' et 5' de séquences flanquantes différentes les unes des autres entre les différentes mêmes séquences complémentaires et les dites séquences flanquantes correspondant respectivement aux séquences flanquantes des différentes mêmes séquences répétées du virophage zamilon contenues dans ledit gène R349 de Mimivirus.
  6. 6. Méthode selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité comprend le gène R349 modifié dans lequel seules les 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon sont remplacées aux même localisations par les dites 4 mêmes séquences complémentaires dune dite séquence spécifique de la dite séquence cible.
  7. 7. Méthode selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité est intégrée dans un vecteur de clonage de la dite séquence d'affinité apte à transformer ou transfecter une dite cellule hôte et y répliquer la dite séquence d'affinité.
  8. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisé en ce que la dite séquence d'affinité est intégrée sous forme d'ADN placée sous le contrôle d'un promoteur de transcription apte à transcrire de la dite séquence d'affinité d'ADN en ARN dans la dite cellule hôte.
  9. 9. Méthode selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la dite cellule hôte est une bactérie ou une cellule eucaryote.
  10. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique de gène R350 et/ou R354 codant pour et apte à exprimer respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354 dans une dite cellule hôte.
  11. 11 Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur, de préférence un plasmide.
  12. 12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, pour au moins couper en un site spécifique la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique du gène R350 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350.
  13. 13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, pour au moins couper en un site spécifique et dégrader au moins partiellement la dite séquence cible, caractérisé en ce que le dit premier composant comprend au moins la protéine R350 et la protéine R354 ou au moins un vecteur d'expression d'au moins des séquences d'acides nucléiques des gènes R350 et R354 codant pour respectivement au moins les dites protéines R350 et R354.
  14. 14. Méthode selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que les dits premier et deuxième composants sont intégrés dans un même dit vecteur comprenant les séquences de Mimivirus de lignée A incluant :
    - au moins une partie modifiée du gène R349, de préférence le gène R349 modifié complet, ladite partie modifiée du gène R349 incluant une partie du gène 349 incluant au moins une des 4 séquences répétées de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349, de préférence les 4 séquences répétées, la dite modification de la dite partie modifiée du gène R349 consistant en ce que la (ou les ) dite(s) séquence(s) répétée(s) de 15 nucléotides du virophage zamilon du gène R349 est (ou sont) remplacée(s) par une même dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de la dite séquence cible, et
    - une séquence permettant la transcription en ARN de ladite partie modifiée du gène R349, de préférence du gène R349 modifié complet dans une dite cellule hôte, et
    - les gènes R350 et 354, ainsi que des séquences permettant l'expression des gènes R350 et R354 dans une dite cellule hôte.
  15. 15. Système biologique utile pour la mise en œuvre d'un procédé de modification par coupure et/ou dégradation totale ou partielle d'une séquence cible d'acide nucléique d'une cellule hôte comprenant la mise en contact de la dite cellule hôte in vitro ou ex vivo, tel que défini dans l'une des revendications 1 à 14 comprenant :
    - un premier composant comprenant au moins une protéine choisie parmi les protéines R350 et R354 de virus géant Mimivirus de lignée A ou au moins un vecteur d'expression d'au moins une séquence d'acide nucléique des gènes R350 et/ou R354 codant pour respectivement au moins une dite protéine R350 et/ou R354, et
    - un deuxième composant comprenant une séquence d'acide nucléique, dénommée séquence d'affinité, la dite séquence d'affinité comprenant au moins une séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible, la dite séquence spécifique de ladite séquence cible comprenant au moins 10 nucléotides, de préférence 15 nucléotides, de préférence la ou chaque dite séquence complémentaire d'une séquence spécifique de ladite séquence cible étant flanquée en 3' et 5' de séquences adjacentes encadrant une séquence de 15 nucléotides du virophage zamilon contenue et répétée 4 fois dans le gène R349 de virus géant Mimivirus de lignée A.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012139866A1 (fr) * 2011-04-15 2012-10-18 Universität Zürich Prorektorat Mnw Collagène hydroxylases
WO2013098244A1 (fr) * 2011-12-30 2013-07-04 Wageningen Universiteit Ribonucléoprotéines cascade modifiées et utilisations de celles-ci
EP2800811A1 (fr) 2012-05-25 2014-11-12 The Regents of The University of California Procédés et compositions permettant la modification de l'adn cible dirigée par l'arn et la modulation de la transcription dirigée par l'arn

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012139866A1 (fr) * 2011-04-15 2012-10-18 Universität Zürich Prorektorat Mnw Collagène hydroxylases
WO2013098244A1 (fr) * 2011-12-30 2013-07-04 Wageningen Universiteit Ribonucléoprotéines cascade modifiées et utilisations de celles-ci
EP2800811A1 (fr) 2012-05-25 2014-11-12 The Regents of The University of California Procédés et compositions permettant la modification de l'adn cible dirigée par l'arn et la modulation de la transcription dirigée par l'arn

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Genebank", Database accession no. AY653733.1
ANTHONY LEVASSEUR ET AL: "MIMIVIRE is a defence system in mimivirus that confers resistance to virophage", NATURE, vol. 531, no. 7593, 29 February 2016 (2016-02-29), London, pages 249 - 252, XP055553919, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/nature17146 *
BARRANGOU R; MARRAFFINI LA: "CRISPR-Cas systems: prokaryotes upgrade to adaptive immunity", MOL CELL, vol. 54, 2014, pages 234 - 244, XP055190330, DOI: doi:10.1016/j.molcel.2014.03.011
BERNARD LA SCOLA ET AL: "The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus", NATURE, vol. 455, no. 7209, 6 August 2008 (2008-08-06), London, pages 100 - 104, XP055554483, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/nature07218 *
CALLAWAY EWEN: "CRISPR-like 'immune' system discovered in giant virus : Nature News & Comment", 29 February 2016 (2016-02-29), XP055554104, Retrieved from the Internet <URL:https://www.nature.com/news/crispr-like-immune-system-discovered-in-giant-virus-1.19462#/related-links> [retrieved on 20190208] *
CASANE D; LAURENTI P: "Le cas CRISPR, mutations « ready-made » et évolution lamarckienne d'un système immunitaire adaptatif", MED SCI (PARIS, vol. 32, 2016, pages 640 - 645
CHAO DOU ET AL.: "structural and mechanistic analyses reveal a unique cas4-like proetin in the Mimivirus virophage résistant elemnt system", ISCIENCE, 2018
CHAO DOU ET AL: "Structural and Mechanistic Analyses Reveal a Unique Cas4-like Protein in the Mimivirus Virophage Resistance Element System", ISCIENCE, 25 May 2018 (2018-05-25), United States, pages 1 - 10, XP055553947, Retrieved from the Internet <URL:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004218300336/pdfft?md5=8f43599b625d13afdbbb26a7173795a4&pid=1-s2.0-S2589004218300336-main.pdf> DOI: 10.1016/j.isci.2018.04.001 *
CLAVERIE JEAN-MICHEL ET AL: "CRISPR-Cas-like system in giant viruses: why MIMIVIRE is not likely to be an adaptive immune system", VIROLOGICA SINICA, SPRINGER, DE, vol. 31, no. 3, 13 June 2016 (2016-06-13), pages 193 - 196, XP035991872, ISSN: 1674-0769, [retrieved on 20160613], DOI: 10.1007/S12250-016-3801-X *
DESNUES C; LA SB; YUTIN N ET AL.: "Provirophages and transpovirons as the diverse mobilome of giant viruses", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 109, 2012, pages 18078 - 18083
EUGENE V KOONIN ET AL: "Polintons, virophages and transpovirons: a tangled web linking viruses, transposons and immunity", CURRENT OPINION IN VIROLOGY, vol. 25, 30 June 2017 (2017-06-30), United Kingdom, pages 7 - 15, XP055553939, ISSN: 1879-6257, DOI: 10.1016/j.coviro.2017.06.008 *
FILEE J; CHANDLER M.: "Gene exchange and the origin of giant viruses", INTERVIROLOGY, vol. 53, 2010, pages 354 - 361
FORTERRE P.: "Giant viruses: conflicts in revisiting the virus concept", INTERVIROLOGY, vol. 53, 2010, pages 362 - 378
GAIA M; BENAMAR S; BOUGHALMI M ET AL.: "Zamilon, a novel virophage with Mimiviridae host specificity", PLOS ONE, vol. 9, 2014, pages e94923
J. M. CLAVERIE; C. ABERGEL: "CRISPR-Cas-like system in giant viruses: why MIMIVIRE is not likely to be an adaptive immune system", VIROL. SIN., vol. 31, no. 3, 2016, pages 193, XP035991872, DOI: doi:10.1007/s12250-016-3801-x
LA GILGENKRANTZ H: "révolution des CRISPR est en marche", MED SCI (PARIS, vol. 30, 2014, pages 1066 - 1069
LA SCOLA B; AUDIC S; ROBERT C ET AL.: "A giant virus in amoebae", SCIENCE, vol. 299, 2003, pages 2033
LA SCOLA B; DESNUES C; PAGNIER I; ROBERT C; BARRASSI L ET AL.: "The virophage as a unique parasite of the giant Mimivirus", NATURE, vol. 455, 2008, pages 100 - 104, XP055554483, DOI: doi:10.1038/nature07218
LEVASSEUR A; BEKLIZ M; CHABRIÈRE E ET AL.: "MIMIVIRE is a defence system in Mimivirus that confers résistance to virophage", NATURE, vol. 531, 2016, pages 249 - 252, XP055553919, DOI: doi:10.1038/nature17146
MAKAROVA KS; WOLF YI; KOONIN EV: "Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 41, 2013, pages 4360 - 4377, XP002784020
MERIEM BEKLIZ ET AL: "MIMIVIRE, un système de défense chez mimivirus qui illustre l'hypothèse de la Reine Rouge", M/S MEDECINE SCIENCES., vol. 32, no. 10, 1 October 2016 (2016-10-01), FR, pages 818 - 819, XP055555948, ISSN: 0767-0974, DOI: 10.1051/medsci/20163210009 *
MORGAN GAIA ET AL: "Zamilon, a Novel Virophage with Mimiviridae Host Specificity", PLOS ONE, vol. 9, no. 4, 18 April 2014 (2014-04-18), pages e94923, XP055554478, DOI: 10.1371/journal.pone.0094923 *
PETROV A; WU T; PUGLISI EV: "Purification d'ARN de Puglisi JD. RNA purification by preparative polyacrylamide gel electrophoresis", METHODS ENZYMOL, vol. 530, 2013, pages 315 - 30
RAOULT D: "How the virophage compels the need to readdress the classification of microbes", VIROLOGY, vol. 477, 2015, pages 119 - 124, XP029176796, DOI: doi:10.1016/j.virol.2014.11.014
SCIENCE, vol. 343, 3 January 2014 (2014-01-03), pages 84 - 87
SHARMA V; COLSON P; PONTAROTTI P; RAOULT D: "Mimivirus inaugurated in the 21st century the beginning of a reclassification of viruses", CURR OPIN MICROBIOL, vol. 31, 2016, pages 16 - 24, XP029571906, DOI: doi:10.1016/j.mib.2015.12.010
TREMBLAY JP: "CRISPR, un système qui permet de corriger ou de modifier l'expression de gènes responsables de maladies héréditaires", MED SCI (PARIS, vol. 31, 2015, pages 1014 - 1022
TUHIN K. GUHA ET AL: "Applications of Alternative Nucleases in the Age of CRISPR/Cas9", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, vol. 18, no. 12, 29 November 2017 (2017-11-29), pages 2565, XP055554937, DOI: 10.3390/ijms18122565 *
YUTIN N; RAOULT D; KOONIN EV: "Virophages, polintons, and transpovirons: a complex evolutionary network of diverse selfish genetic elements with différent reproduction stratégies", VIROL J, vol. 10, 2013, pages 158, XP021152425, DOI: doi:10.1186/1743-422X-10-158

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