JP6408914B2 - 改変されたcascadeリボ核タンパク質およびそれらの用途 - Google Patents
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Description
したがって、第1の態様では、本発明は、少なくとも以下のCRISPRタンパク質関連サブユニット:
−配列番号3のアミノ酸配列またはこれと少なくとも18%同一の配列を有するCas7(またはCOG1857)、
−配列番号4のアミノ酸配列またはこれと少なくとも17%同一の配列を有するCas5(またはCOG1688)、および
−配列番号5のアミノ酸配列またはこれと少なくとも16%同一の配列を有するCas6(またはCOG1583)を含み、
前記サブユニットの少なくとも1つが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列を含む、抗ウイルス防御のためのクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復(CRISPR)関連複合体(Cascade)、Cascadeタンパク質複合体、またはその一部を提供する。
>gi|16130667|ref|NP_417240.1|Cascade抗ウイルス複合体タンパク質を含むCRISP RNA(crRNA)[大腸菌K−12株MG1655亜株]
>gi|16130666|ref|NP_417239.1|Cascade抗ウイルス複合体タンパク質を含むCRISP RNA(crRNA)[大腸菌K−12株MG1655亜株]
>gi|16130665|ref|NP_417238.1|Cascade抗ウイルス複合体タンパク質を含むCRISP RNA(crRNA)[大腸菌K−12株MG1655亜株]
>gi|90111483|ref|NP_417237.2|Cascade抗ウイルス複合体タンパク質を含むCRISP RNA(crRNA)[大腸菌K−12株MG1655亜株]
>gi|16130663|ref|NP_417236.1|CRISPR RNA前駆体切断酵素;Cascade抗ウイルス複合体タンパク質を含むCRISP RNA(crRNA)[大腸菌K−12株MG1655亜株]
a.配列番号1のアミノ酸配列またはこれと少なくとも9%同一の配列を有するCse1サブユニット;
b.配列番号2のアミノ酸配列またはこれと少なくとも20%同一の配列を有するCse2サブユニット;
c.配列番号3のアミノ酸配列またはこれと少なくとも18%同一の配列を有するCas7サブユニット;
d.配列番号4のアミノ酸配列またはこれと少なくとも17%同一の配列を有するCas5サブユニット;
e.配列番号5のアミノ酸配列またはこれと少なくとも16%同一の配列を有するCas6サブユニットから選択され、
ここで、少なくともa、b、c、d、またはeが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質サブユニットをコードする核酸分子を提供する。
非常に高ストリンジェンシー(少なくとも90%同一の配列がハイブリッド形成可能)
ハイブリッド形成:5×SSCにて65℃で16時間
2回洗浄:2×SSCにて室温(RT)でそれぞれ15分間
2回洗浄:0.5×SSCにて65℃でそれぞれ20分間
高ストリンジェンシー(少なくとも80%同一の配列がハイブリッド形成可能)
ハイブリッド形成:5×〜6×SSCにて65℃〜70℃で16〜20時間
2回洗浄:2×SSCにてRTでそれぞれ5〜20分間
2回洗浄:1×SSCにて55℃〜70℃でそれぞれ30分間
低ストリンジェンシー(少なくとも50%同一の配列がハイブリッド形成可能)
ハイブリッド形成:6×SSCにてRT〜55℃で16〜20時間
少なくとも2回洗浄:2×〜3×SSCにてRT〜55℃でそれぞれ20〜30分間。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
少なくとも以下のCRISPR関連タンパク質サブユニット:
−配列番号3のアミノ酸配列またはこれと少なくとも18%同一の配列を有するCas7、
−配列番号4のアミノ酸配列またはこれと少なくとも17%同一の配列を有するCas5、および
−配列番号5のアミノ酸配列またはこれと少なくとも16%同一の配列を有するCas6を含み、
該サブユニットの少なくとも1つが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列を含む、
抗ウイルス防御のための、クラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復(CRISPR)関連複合体(Cascade)、Cascadeタンパク質複合体、またはその一部。
(項目2)
前記Cas6サブユニットが、配列番号17のアミノ酸配列またはこれと少なくとも16%同一の配列を有するCas6eサブユニットである、項目1に記載のタンパク質複合体。
(項目3)
配列番号2のアミノ酸配列またはこれと少なくとも20%同一の配列を有するCse2サブユニットをさらに含み、必要に応じて、さらなるアミノ酸配列を含むのはCse2サブユニットである、項目1または項目2に記載のタンパク質複合体。
(項目4)
配列番号1のアミノ酸配列またはこれと少なくとも9%同一の配列を有するCse1サブユニットをさらに含み、必要に応じて、さらなるアミノ酸配列を含むのはCse1サブユニットである、項目1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質複合体。
(項目5)
I型CRISPR−Casシステムタンパク質複合体、好ましくはI−E亜型CRISPR−Casタンパク質複合体である、項目4に記載のタンパク質複合体。
(項目6)
前記さらなるアミノ酸配列が、前記少なくとも1つのサブユニットに翻訳的に融合するかまたは共有結合しており、好ましくは、前記さらなるアミノ酸配列が、Cse1、Cse2、Cas7、Cas5、Cas6、またはCas6eサブユニットのうちの少なくとも1つの少なくともN末端および/またはC末端に融合または連結している、項目1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質複合体。
(項目7)
前記さらなるアミノ酸配列がCse1、Cse2、またはCas5サブユニットのN末端またはC末端、好ましくは、Cse1サブユニットのN末端、Cse2サブユニットのN末端、またはCas7サブユニットのN末端に融合または連結している、項目6に記載のタンパク質複合体。
(項目8)
前記さらなるアミノ酸配列がタンパク質であり、該タンパク質が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ(例えば、Cas3)、DNAメチルトランスフェラーゼ(例えば、Dam)、またはDNAデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写(コ)アクチベーター、RNAポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、DNA結合タンパク質、DNA構造化タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質(例えば、mCherryまたは重金属結合タンパク質)、シグナルペプチド(例えば、Tat−シグナル配列)、細胞内局在配
列(例えば、核局在配列)、または抗体エピトープから必要に応じて選択される、項目7に記載のタンパク質複合体。
(項目9)
前記ヌクレアーゼが、II型制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはFokI、より好ましくは改変FokI(例えば、KKR SharkeyまたはELD Sharkey)から選択される、項目8に記載のタンパク質複合体。
(項目10)
標的核酸配列と少なくとも50%同一のリボヌクレオチド配列を含むRNA分子をさらに含む前記いずれかの項目に記載のタンパク質複合体であって、該タンパク質複合体および該RNA分子がリボ核タンパク質複合体を形成する、タンパク質複合体。
(項目11)
前記RNA分子の一部が前記標的配列と少なくとも50%同一である、項目10に記載のリボ核タンパク質複合体。
(項目12)
前記RNA分子の前記一部がその長さに沿って前記標的配列と少なくとも実質的に相補的である、項目11に記載のリボ核タンパク質複合体。
(項目13)
前記RNA分子の長さが35〜75残基の範囲である、項目10〜12のいずれか1項に記載のリボ核タンパク質複合体。
(項目14)
所望の核酸配列をターゲティングするために使用した前記RNA分子の前記一部が32または33残基長である、項目10〜13のいずれか1項に記載のリボ核タンパク質複合体。
(項目15)
前記RNA分子が前記標的配列と少なくとも実質的な相補性を有するRNA配列の5’側にある8残基を含む、項目10〜14のいずれか1項に記載のリボ核タンパク質複合体。
(項目16)
前記RNA分子が、前記標的配列に少なくとも実質的な相補性を有する前記RNA配列の3’側にヘアピンおよびテトラヌクレオチドループ形成配列を有する、項目10〜15のいずれか1項に記載のリボ核タンパク質複合体。
(項目17)
a.配列番号1のアミノ酸配列またはこれと少なくとも9%同一の配列を有するCse1サブユニット;
b.配列番号2のアミノ酸配列またはこれと少なくとも20%同一の配列を有するCse2サブユニット;
c.配列番号3のアミノ酸配列またはこれと少なくとも18%同一の配列を有するCas7サブユニット;
d.配列番号4のアミノ酸配列またはこれと少なくとも17%同一の配列を有するCas5サブユニット;
e.配列番号5のアミノ酸配列またはこれと少なくとも16%同一の配列を有するCas6サブユニットから選択され、
ここで、少なくともa、b、c、d、またはeが、核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列を含む、少なくとも1つのクラスター化された等間隔に間隔が置かれた短いパリンドローム反復(CRISPR)関連タンパク質サブユニットをコードする単離核酸分子。
(項目18)
前記核酸またはクロマチンを改変する活性、視覚化する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を提供するさらなるアミノ酸配列が前記CRISPR関連タンパク
質サブユニットに融合している、項目17に記載の単離核酸分子。
(項目19)
前記さらなるアミノ酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−ヘリカーゼ(例えば、Cas3)、DNAメチルトランスフェラーゼ(例えば、Dam)、DNAデメチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写(コ)アクチベーター、RNAポリメラーゼサブユニット、転写リプレッサー、DNA結合タンパク質、DNA構造化タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質(例えば、mCherryまたは重金属結合タンパク質)、シグナルペプチド(例えば、Tat−シグナル配列)、細胞内局在配列(例えば、核局在配列)、または抗体エピトープから選択される、項目18に記載の単離核酸分子。
(項目20)
項目17〜19のいずれか1項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
(項目21)
項目10〜16のいずれか1項に定義のRNA分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目20に記載の発現ベクター。
(項目22)
標的核酸の改変、視覚化、転写活性化、または転写抑制の方法であって、該核酸を、
a.項目10〜16のいずれか1項に記載のリボ核タンパク質複合体、または
b.項目1〜9のいずれか1項に記載のタンパク質複合体および項目10〜16のいずれか1項に定義のRNA分子
と接触させる工程を含む、方法。
(項目23)
細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を項目22に記載の発現ベクターおよび項目10〜18のいずれか1項に定義のRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入する工程を含む、方法。
(項目24)
細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を項目22に記載の発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入し、次いで、項目10〜18のいずれか1項に定義のRNA分子を該細胞へまたは該細胞内に投与する工程を含む、方法。
(項目25)
細胞内の標的核酸を改変するか、視覚化するか、転写活性化するか、または転写抑制する方法であって、該細胞を項目21に記載の発現ベクターでトランスフェクションするか、形質転換するか、または形質導入する工程を含む、方法。
(項目26)
前記核酸またはクロマチンを改変または視覚化する活性を有するさらなるアミノ酸配列がマーカーであり、前記マーカーが前記標的核酸またはクロマチンと会合し、好ましくは、前記マーカーがタンパク質であり、該タンパク質は必要に応じて蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)または黄色蛍光タンパク質(YFP))である、項目22〜25のいずれか1項に記載の標的核酸を改変するかまたは視覚化する方法。
(項目27)
前記標的核酸がDNA、好ましくはdsDNAである、項目22〜26のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記標的核酸がRNA、好ましくはmRNAである、項目22〜26のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記核酸がdsDNAであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性を有するさらなるアミノ酸配列がヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ−ヘリカーゼであり、前記改変が所望の遺伝子座での一本鎖切断または二本鎖切断である、項目22〜26のいずれか1項に記載の標的核酸を改変する方法。
(項目30)
dsDNA分子からヌクレオチド配列の少なくとも一部を除去するため(必要に応じて、遺伝子の機能をノックアウトするため)の所望の遺伝子座での細胞内のdsDNA分子の非相同末端結合方法であって、項目29に記載の標的核酸を改変する方法を使用して二本鎖切断をつくる工程を含む、方法。
(項目31)
既存のヌクレオチド配列を改変するかまたは所望のヌクレオチド配列を挿入するための所望の遺伝子座での細胞内のdsDNA分子中への核酸の相同組換え方法であって、項目29に記載の標的核酸を改変する方法を使用して所望の遺伝子座で一本鎖または二本鎖切断をつくる工程を含む、方法。
(項目32)
項目22〜25のいずれか1項に記載の方法で標的核酸配列を改変する工程を含む生物における遺伝子発現を改変するか、活性化するか、または抑制する方法であって、前記核酸がdsDNAであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性、転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列が、DNA改変酵素(例えば、デメチラーゼまたはデアセチラーゼ)、転写アクチベーター、または転写リプレッサーから選択される、方法。
(項目33)
項目22〜25のいずれか1項に記載の方法に記載のとおりに標的核酸配列を改変する工程を含む生物における遺伝子発現を改変するか、活性化するか、または抑制する方法であって、前記核酸がmRNAであり、前記核酸またはクロマチンを改変する活性、または転写活性化する活性、または転写抑制する活性を有するさらなるアミノ酸配列が、リボヌクレアーゼであり、該リボヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、3’エキソヌクレアーゼ、または5’エキソヌクレアーゼから必要に応じて選択される、方法。
(項目34)
前記細胞が原核生物である、項目22〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記細胞が、真核細胞であり、例えば、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞である、項目22〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記哺乳動物またはヒトの細胞がヒト胚性幹細胞以外の幹細胞、好ましくは単離幹細胞である、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記細胞をin vitroでトランスフェクションする、項目33〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
前記標的核酸が三次構造を有し、該三次構造が必要に応じてスーパーコイルであり、好ましくは、前記標的核酸が負のスーパーコイルである、項目22〜36のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
項目1〜9のいずれか1項に記載のCascadeタンパク質複合体を含む薬学的組成物。
(項目40)
項目10〜16のいずれか1項に記載のリボ核タンパク質複合体を含む薬学的組成物。
(項目41)
項目17〜19のいずれか1項に記載の単離核酸または項目20もしくは項目21に記載の発現ベクターを含む薬学的組成物。
(項目42)
項目1〜9のいずれか1項に記載のCascadeタンパク質複合体および項目10〜16のいずれか1項に定義のRNA分子を含むキット。
(項目43)
医薬として使用するための項目1〜9のいずれか1項に記載のCascadeタンパク質複合体。
(項目44)
医薬として使用するための項目10〜16のいずれか1項に記載のリボ核タンパク質複合体。
(項目45)
医薬として使用するための項目17〜19のいずれか1項に記載の単離核酸。
(項目46)
医薬として使用するための項目20または項目21に記載の発現ベクター。
株、遺伝子クローニング、プラスミド、およびベクター
Cascadeを、記載のように発現および精製した(Joreら、2011)。精製を通して、20mM HEPES(pH7.5)、75mM NaCl、1mM DTT、2mM EDTAを含む緩衝液を、再懸濁および洗浄のために使用した。4mM デスチオビオチンを含む同一の緩衝液中でタンパク質溶離を行った。Cascade−Cas3融合複合体を同一の様式で発現および精製し、20mM HEPES(pH7.5)、200mM NaCl、および1mM DTTを使用して洗浄工程を行い、4mMデスチオビオチンを含む20mM HEPES(pH7.5)、75mM NaCl、1mM DTTで溶離した。
精製したCascadeまたはCascadeサブ複合体を、20mM HEPES(pH7.5)、75mM NaCl、1mM DTT、2mM EDTAを含む緩衝液中でpUC−λと混合し、37℃で15分間インキュベーションした。サンプルを0.8%TAEアガロースゲル上で一晩泳動し、SybR safe(Invitrogen)のTAEでの10000倍希釈物で30分間後染色した。BsmI(Fermentas)またはNt.BspQI(New England Biolabs)での切断を、5mM MgCl2を補足したHEPES反応緩衝液中で行った。
精製したCascadeを、20mM HEPES(pH7.5)、75mM NaCl、0.2mM DTT、0.3mM EDTAを含む緩衝液中でpUC−λ(7:1の比、250nM Cascade、35nM DNA)と混合し、37℃で15分間インキュベーションした。その後、AFMサンプル調製のために、インキュベーション混合物を、2回蒸留水で10倍希釈し、最終濃度1.2mMまでMgCl2を添加した。タンパク質−DNA複合体の沈着およびイメージングを以前に記載のように行った(Dameら,(2000)Nucleic Acids Res.28:3504−3510)。
CRISPR en cas遺伝子をコードするプラスミドを保有するBL21−AI細胞を、アンピシリン(100μg/ml)、カナマイシン(50μg/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、およびクロラムフェニコール(34μg/ml)を含むLuria−Bertaniブロス(LB)中にて37℃で一晩成長させた。一晩培養物を新鮮な抗生物質含有LBで100倍希釈し、37℃で1時間成長させた。cas遺伝子群およびCRISPRの発現を、最終濃度0.2%のL−アラビノースおよび最終濃度1mMのIPTGの添加によって1時間誘導した。感染のために、細胞を感染多重度(MOI)4でλファージと混合した。細胞をポリ−L−リジン被覆顕微鏡スライドに適用し、40倍油浸対物レンズ(開口数1.3)、励振源(514nm)としてのアルゴンレーザー、および530〜600nmでの検出を使用したAxiovert倒立顕微鏡に基づいてZeiss LSM510共焦点レーザ走査型顕微鏡を使用して分析した。全測定のためにピンホールを203μmに設定した。
カナマイシン(50μg/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、およびクロラムフェニコール(34μg/ml)を含むLBに一晩前接種材料を接種し、0.3のOD600まで成長させた。cas遺伝子群およびCRISPRの発現を、0.2%L−アラビノースおよび1mM IPTGで45分間誘導した。細胞を4℃の遠心分離によって回収し、100mM RbCl2、50mM MnCl2、30mM酢酸カリウム、10mM CaCl2、および15%グリセロール(pH5.8)を含む氷冷緩衝液での再懸濁によってコンピテントにした。インキュベーション3時間後、細胞を回収し、10mM MOPS、10mM RbCl、75mM CaCl2、15%グリセロール(pH6.8)を含む緩衝液に再懸濁した。80ngのpUC−λを添加し、その後に42℃で1分間熱ショックを与え、氷上で5分間寒冷ショックを与えることによって形質転換させた。次に、細胞をLB中にて37℃で45分間成長させ、0.2%L−アラビノース、1mM IPTG、アンピシリン(100μg/ml)、カナマイシン(50μg/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、およびクロラムフェニコール(34μg/ml)を含むLB−寒天プレート上にプレートした。
ファージ感染に対する宿主感受性を、(Brounsら(2008)Science 321,960−964)において見られるように病原性λファージ(λvir)を使用して試験した。宿主の感染感受性を、Brounsら(2008)に記載のようにプラーク形成効率(アンチ−λ CRISPRを含む株の非ターゲティングR44 CRISPRを含む株に対するプラーク数の比)として計算した。
本発明者らは、改良されたFokIヌクレアーゼをCse1のN末端に翻訳的に融合して、それぞれFokIKKR−Cse1およびFokIELD−Cse1であるCse1のバリアントを生成した。これら2つのバリアントを、Cascadeサブユニット(Cse2、Cas7、Cas5、およびCas6e)および均一なスペーサーを有する2つの異なるCRISPRプラスミドのうちの1つと同時発現させる。これにより、CascadeKKR複合体に均一のP7−crRNAが負荷され、CascadeELD複合体に均一のM13 g8−crRNAが負荷される。これらの複合体を、Jore、M.M.、ら、(2011)Nat.Struct.Mol.Biol.18(5):529−536に記載のようにN末端StrepIIタグ化Cse2を使用して精製する。さらに、N末端HISタグ化FokIを使用したさらなる精製工程を行って、全長およびインタクトなCascade−ヌクレアーゼ融合複合体を確実に精製することができる。
複合体の特異性および活性を、基質として人為的に構築した標的プラスミドを使用して試験した。このプラスミドは、両FokIドメインが相互に対面するように相反する鎖上にM13およびP7結合部位を含む(図11を参照のこと)。Cascade結合部位間の距離は、25塩基対と50塩基対との間(5bpづつ増加)で変化する。Cascadeの結合部位が4つの公知のPAM配列のいずれかと隣接する必要があるので(5’−プロトスペーサー−CTT/CAT/CTC/CCT−3’)、この距離範囲により、ほとんどの任意の所与の配列のためのかかる対をデザインするのに十分な柔軟性が得られる。
標的プラスミドの配列。数字は、M13標的部位とP7標的部位との間の距離を示す(プロトスペーサーは太字、PAMに下線)。
使用したヒトCCR5標的遺伝子選択およびCRISPRデザインは以下である。
>CRISPRアレイred1(斜体=スペーサー、太字=リピート)
Cascadeは、多サブユニットタンパク質−RNA複合体として非常に安定しており、mg単位の量にて大腸菌内で容易に産生される。大腸菌から精製されたそのインタクトな形態での複合体のトランスフェクションまたは微量注入を、送達方法として使用する(図12を参照のこと)。図12に示すように、Cascade−FokIヌクレアーゼを大腸菌から精製し、タンパク質トランスフェクション小胞中に被包する。次いで、これらをヒトHepG2細胞の細胞膜と融合して細胞質内にヌクレアーゼを放出させる(工程2)。次いで、NLS配列は、核孔通過を容易にするインポーチンタンパク質によって認識される(工程3)。次いで、CascadeKKR(白抜きの四角)およびCascadeELD(黒塗りの四角)は、その標的部位を見出して切断し(工程4)、それにより、標的部位を変化させるDNA修復経路を誘導して所望の変化を誘導するであろう。CascadeKKR/ELDヌクレアーゼは1回のみ作用することが必要であり、DNA上にコードされて細胞内に恒久的に存在する必要はない。
トランスフェクションした細胞を、数日間培養および継代する。次いで、in vivoでの標的DNA切断効率を、Guschin,D.Y.,ら(2010)Methods Mol.Biol.,649:247−256のサーベイヤーアッセイの使用によってアッセイする。簡潔に述べれば、標的DNA遺伝子座のPCRアンプリコンを、未処置細胞由来のPCRアンプリコンと1:1で混合するであろう。これらを加熱し、アニーリングさせ、NHEJによって誤って修復された標的部位でミスマッチが生じる。次いで、ミスマッチヌクレアーゼを使用して、ミスマッチしたDNA分子のみを切断し、これにより、CascadeKKR/ELDによる標的DNA切断の完了時に最大で50%切断される。次いで、この手順を、処置した細胞の標的DNAアンプリコンの配列決定によって追跡した。本アッセイにより、送達手順が迅速に評価および至適化される。
上記で説明するようにCascade−ヌクレアーゼ複合体を構築した。StrepIIタグ化Cse2サブユニットを使用した大腸菌からの親和性精製により、未変性Cascadeと比較した場合に予想される化学量論を有する複合体が得られる。図13を参照すると、これは、Streptactinのみを使用した精製24時間後の未変性Cascade(1)、P7 CrRNAを有するCascadeKKR、およびM13 CrRNAを有するCascadeELDの化学量論を示す。未変性Cascade(1)中のバンドは、上から下に以下を示す:Cse1、Cas7、Cas5、Cas6e、Cse2。CascadeKKR/ELDは、FokI−Cse1融合バンドおよびタンパク質分解の結果としてのFokIの小部分を有するCse1を示すさらなるバンドを示す。
Cascadeヌクレアーゼ融合物のデザインを、真核細胞の核内輸送を可能にするための核小体局在シグナル(NLS)が組み込まれるように改変した。この目的のために、サルウイルスSV40のラージT抗原由来のタンデムモノパータイトNLS(配列:PKKKRKVDPKKKRKV)をFokI−Cse1融合タンパク質のN末端に翻訳的に融合し、N末端にはHis6−タグが直接先行していた。His6−タグ(配列:MHHHHHH)により、StrepII精製後にさらなるNi2+−樹脂による親和性精製工程が可能である。このさらなる工程により、全長Cascade−ヌクレアーゼ融合複合体のみの単離が保証され、非産生性ヌクレアーゼ対を形成する標的部位への非インタクトなCascade複合体の結合を排除することによって切断効率が増大する。
CascadeKKR/ELDの活性および特異性を、上記のようにin vitroでアッセイした。図14Aは、CascadeKKR/ELDと37℃で30分間インキュベーションしたプロトスペーサー間の距離が25〜50bp(5bpずつ増加、レーン1〜6)であるプラスミドを示す。レーン10は、以下のその3つの可能なトポロジーでの標的プラスミドを含む:最も下のバンドはプラスミドの最初の負のスーパーコイル(nSC)形態を示し、真ん中のバンドは直鎖状化形態(XbaIによって切断)を示し、一方、上のバンドは開環(OC)形態(Nt.BbrCIでのニッキング後)を示す。レーン7は、両方の結合部位を除去したプラスミドのインキュベーションを示す(ネガティブコントロール)。したがって、図14Aは、結合部位が25〜50塩基対(5bpずつ増加)によって分離している種々の標的プラスミドを使用した典型的な切断アッセイを示す(レーン1〜6)。25〜50bpの距離を有するこれらのプラスミドを、それぞれアンチP7およびM13 crRNAを保有するCascadeKKR/ELDとインキュベーションした。結合部位を含まないプラスミドはコントロールとしての役割を果たした(レーン7)。元のプラスミドは負のスーパーコイル形態で存在し(nSC、コントロールレーン8)、ニッキングまたは直鎖状化した産物は明確に区別可能である。インキュベーションの際、結合部位が30、35、および40塩基対によって分離された場合に直鎖状切断産物が形成される(レーン2、3、4)。25、45、および50塩基対の距離で(レーン1、5、6)、標的プラスミドは不完全に切断されてニッキングされた形態(OC)が得られるようであった。これらの結果は、30bpと40bpとの間の距離を有するプラスミドにおける切断が最良であり、それにより、任意の所与の遺伝子座のためにcrRNA対をデザインする場合に十分な柔軟性が得られる。より短い距離およびより長い距離は共にニッキング活性が増加し、DSBが減少する。2つのプロトスペーサーが除去されたプラスミドはほとんど活性がなく、標的特異性を示す(レーン7)。
切断アッセイに最適な緩衝液条件を評価するためおよび複合体の活性が生理学的条件で予想されるかどうかを評価するために、以下の2つの緩衝液を選択した:(1)NEB4(New England Biolabs、50mM 酢酸カリウム、20mM Tris−酢酸塩、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオトレイトール、pH7.9)および(2)緩衝液O(Fermentas、50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、100mM NaCl、0.1mg/mL BSA、pH7.5)。2つのうちで、市販のインタクトなFokI酵素の最適な活性にはNEB4が推奨される。良好な活性および特異性を得るためにクイックスクリーンから緩衝液Oを選択した(データ示さず)。図14Bは、異なる緩衝液および異なるインキュベーション時間を使用したインキュベーションを示す。レーン1〜4は、Fermentas緩衝液Oを使用してインキュベーションし(レーン1、2は15分間、レーン3、4は30分間)、レーン5、6はNEB4とインキュベーションした(30分間)。レーン1、3、5は35bp間隔の標的プラスミドを使用し、レーン2、4、6は非標的プラスミド(結合部位なし)を使用した。レーン7、8は、CascadeKKRまたはCascadeELDのみをそれぞれ使用してインキュベーションした(緩衝液O)。レーン9は(A)と同様のトポロジーマーカーである。レーン10および11は、Cascadeを添加せずにインキュベーションした標的プラスミドおよび非標的プラスミドを示す。したがって、図14Bでは、35塩基対の距離を有する標的プラスミド(レーン1、3、5)および非標的コントロールプラスミド(レーン2、4、6)についての活性を試験した。NEB4において大量の非特異的ニッキングおよびより少ない切断が認められ(レーン5,6)、一方で緩衝液Oは大量の特異的切断およびわずかなニッキングを有する標的プラスミドにおける活性のみを示す(レーン1〜4)。この差異は緩衝液O中のNaCl濃度に原因する可能性が高く、イオン強度が高いほどタンパク質間相互作用が弱くなり、非特異的活性が少なくなる。15分間または30分間のインキュベーションは、標的プラスミドおよび非標的プラスミドの両方でほとんど差異がない(それぞれ、レーン1,2、または3,4)。予想通り、1つのCascade型のみ(P7KKRまたはM13ELD)の添加によって切断活性は得られない(レーン7、8)。この実験は、NaCl濃度が少なくとも100mM(細胞内の生理食塩水濃度(137mM NaCl)に近い)である場合にデザインされた対による特異的Cascadeヌクレアーゼ活性が生じることを示す。Cascadeヌクレアーゼ対はin vivo(真核細胞内)で完全な活性を示すことが予想される一方で、無視できるオフターゲット切断活性を示す。
35bpの間隔を有する標的プラスミド(pTarget35)中の切断部位を決定した。図15は、どのようにして配列決定によって35塩基対間隔を有する標的プラスミド中のCascadeKKR/ELDによる上流および下流の切断部位が明らかになるかを示す。図15Aは、注釈付きの潜在的切断部位を有するpTarget35内の標的領域を示す。プロトスペーサー部分を赤色および青色で示す。B)バーチャートは、配列決定したクローンにおける4つの異なる切断パターンおよびこれらの相対存在量を示す。青色バーは生成されたオーバーハングを示し、一方で、各バーの左または右の境界は左または右の切断部位を示す(注釈付けについてはBを参照のこと)。
CascadeKKR/ELDヌクレアーゼを、N末端His6−タグおよびその後に二重モノパータイト核小体局在シグナルを含むように首尾よく改変した。これらの改変されたCascadeヌクレアーゼ融合タンパク質を、2つの合成的に構築されたCRISPRアレイ(それぞれヒトCCR5遺伝子中の結合部位をターゲティングする)のうちのいずれか1つと同時発現させた。第1に、この新規のヌクレアーゼ対の活性を、このCCR5遺伝子領域を含むプラスミドの活性を試験することによってin vitroで確認する。ヌクレアーゼ対を、ヒト細胞株(例えば、HeLa細胞株)にトランスフェクションする。標的の切断効率を、上記のSurveyorアッセイを使用して評価する。
Claims (11)
- Cse1タンパク質サブユニットのN末端に融合したFokIを含む人為的な融合タンパク質、ここで当該人為的な融合タンパク質はさらに当該FokIとCse1タンパク質サブユニットの間にリンカーポリペプチドを含む;
Cas6タンパク質サブユニット;
Cas5タンパク質サブユニット;
Cse2タンパク質サブユニット;
Cas7タンパク質サブユニット;および、
標的核酸に相補的なスペーサ配列を含むCRISPR由来RNA(crRNA)、
を含む、I型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。 - 人為的な融合タンパク質がさらにN末端核局在シグナルを含む、請求項1に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。
- 人為的な融合タンパク質がさらにN末端His6−タグを含む、請求項1又は2に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。
- Cas6タンパク質サブユニット、Cas5タンパク質サブユニット、Cse2タンパク質サブユニット、又はCas7タンパク質サブユニットの少なくとも一つが、さらにN末端核局在シグナルを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。
- Cas6タンパク質サブユニット、Cas5タンパク質サブユニット、Cse2タンパク質サブユニット、又はCas7タンパク質サブユニットの少なくとも一つが、さらにN末端Strep−タグを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。
- Cas6タンパク質サブユニット、Cas5タンパク質サブユニット、Cse2タンパク質サブユニット、又はCas7タンパク質サブユニットの少なくとも一つが、さらにN末端His6−タグを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のI型のCRISPR−
Casシステムタンパク質複合体。 - FokIがKKR Sharkey ヌクレアーゼドメインを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。
- FokIがELD Sharkey ヌクレアーゼドメインを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。
- さらにスペーサ配列に相補的な標的DNAを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。
- 標的DNAがゲノムDNA中に存在する、請求項9に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のI型のCRISPR−Casシステムタンパク質複合体を含む、大腸菌(Escherichia coli)細胞。
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