JP7422128B2 - 配列特異的なインビボ細胞標的化 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年4月3日に出願された米国仮特許出願第62/652,150号、2018年8月29日に出願された米国仮特許出願第62/724,199号、および2018年3月27日に出願された韓国特許出願第KR 10-2018-0035298号の利益を主張するものであり、当該文献はあらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるすべての公報、特許、および特許出願は、あたかも個々の公報、特許、または特許出願がそれぞれ参照により組み込まれると特別かつ個々に示されるかのような同じ程度だけ参照によって本明細書に組み込まれ、当該文献は2018年3月27日に出願された韓国特許出願KR 10-2018-0035298を含み、これは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施形態は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列を詳述する。場合によっては、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列は、非限定的である。その他の場合において、本明細書に開示される特徴の組み合わせの順列は限定されている。特徴の組み合わせのその他の順列も考慮される。特に、これらの番号を付けた実施形態の各々は、列挙されるような順序とは無関係に、前述または後述の番号を付けた実施形態に依存するものとして、またはそれらに関連するものとして考慮される。本明細書に列挙されるいくつかの方法は、以下の要素a、b、およびcまですべてを含む。上記方法は、追加の要素をさらに含んでもよい。1.細胞死を誘導する組成物であって、上記組成物は:a)配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含む、キメラポリペプチドと;b)細胞の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含み、ここで、標的核酸は疾患に関連する、組成物。2.上記疾患は癌である、実施形態1に記載の組成物。3.癌は肺癌または膵臓癌である、実施形態2に記載の組成物。4.標的核酸はRNAまたはDNAを含む、実施形態1に記載の組成物。5.標的核酸は上記疾患に関連する配列である、実施形態1に記載の組成物。6.標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態1に記載の組成物。7.染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態5に記載の組成物。8.標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型、転座、または癌の進行に関連する配列を含む、実施形態1に記載の組成物。9.標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、およびHER2からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態1に記載の組成物。10.キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態1に記載の組成物。11.誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的切断によって活性化される、実施形態10に記載の組成物。12.第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメイン、Cas12aドメイン、Cas12bドメイン、Cas12cドメイン、Cas12dドメイン、Cas12eドメイン、Cas12fドメイン、Cas12gドメイン、Cas12hドメイン、Cas12iドメイン、Cas13aドメイン、Cas13bドメイン、Cas14ドメイン、あるいはCas9ドメインを含む、実施形態1に記載の組成物。13.第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態1に記載の組成物。14.ガイド核酸は、表6および段落[0268]または表7および段落[0270]に表記される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態1に記載の組成物。15.ガイド核酸は第1の部分と第2の部分とを含み、ここで、上記第1の部分はAATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagatに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態1に記載の組成物。16.ガイド核酸は、第1の部分と、第2の部分と、第3の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、配列:attctaatacgactcactataggに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第3の部分は、配列:gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcに対して少なくとも約85%の配列同一性を含む、実施形態1に記載の組成物。17.第1のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態1に記載の組成物。18.誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、第1のドメインによる標的核酸の部位特異的切断によって活性化される、実施形態17に記載の組成物。19.第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態1に記載の組成物。20.キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態1に記載の組成物。21.キメラポリペプチドは陥凹3’OHを露出させる、実施形態1に記載の組成物。22.第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態1に記載の組成物。23.第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態1に記載の組成物。24.キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態1に記載の組成物。25.ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態1に記載の組成物。26.上記組成物は経口投与のために製剤化される、実施形態1に記載の組成物。27.上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態1に記載の組成物。28.上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態1に記載の組成物。29.上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態1に記載の組成物。30.上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態1に記載の組成物。31.上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態1に記載の組成物。32.上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態1に記載の組成物。33.上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態1に記載の組成物。34.細胞死を誘導するための方法であって、上記方法は、細胞中の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含むキメラポリペプチドと接触させ、それにより、細胞死を誘導する工程を含む、方法。35.上記細胞は癌細胞である、実施形態34に記載の方法。36.上記標的核酸は疾患に関連する配列を含む、実施形態34に記載の方法。37.上記疾患は癌である、実施形態36に記載の方法。38.上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態36に記載の方法。39.上記標的核酸はRNAまたはDNAを含む、実施形態34に記載の方法。40.上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態34に記載の方法。41.上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態34に記載の方法。42.上記標的核酸は、転座、癌に特異的な一塩基多型、または癌の進行に関連する配列を含む、実施形態34に記載の方法。43.上記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、またはHER2からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態34に記載の方法。44.上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例34に記載の方法。45.上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態44に記載の方法。46.キメラポリペプチドによって標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例34に記載の方法。47.細胞中の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施例46に記載の方法。48.キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態34に記載の方法。49.誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態58に記載の方法。50.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメイン、Cas12aドメイン、Cas12bドメイン、Cas12cドメイン、Cas12dドメイン、Cas12eドメイン、Cas12fドメイン、Cas12gドメイン、Cas12hドメイン、Cas12iドメイン、Cas13aドメイン、Cas13bドメイン、Cas14ドメイン、またはCas9ドメインを含む、実施形態34に記載の方法。51.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態34に記載の方法。52.ガイド核酸は、表6および段落[0268]または表7および段落[0270]に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態34に記載の方法。53.上記ガイド核酸は、第1の部分と第2の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagatに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態34に記載の方法。54.上記ガイド核酸は、第1の部分と、第2の部分と、第3の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、配列:attctaatacgactcactataggに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第3の部分は、配列:gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcに対して少なくとも約85%の配列同一性を有する、実施形態34に記載の方法。55.上記第1のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態34に記載の方法。56.上記第1のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第1のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態55に記載の方法。57.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T4ドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態34に記載の方法。58.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態34に記載の方法。59.上記キメラポリペプチドは陥凹3’OHを露出させる、実施形態34に記載の方法。60.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態34に記載の方法。61.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態34に記載の方法。62.上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態34に記載の方法。63.上記キメラポリペプチドによる標的核酸の切断後、被験体のキメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例34に記載の方法。64.上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体またはZnSO4の少なくとも1つを被験体に投与することにより実施される、実施形態63に記載の方法。65.組成物であって、上記組成物は:a)配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含む、キメラポリペプチドと;b)正常細胞の第1染色体の一部に完全な相補性を含む連続する少なくとも5つの塩基を含む、第1の部分と、正常細胞の第2染色体の一部に完全な相補性を含む連続する少なくとも5つの塩基を含む、第2の部分とを含む、ガイド核酸と、を含む、組成物。66.上記第1の部分はBCR遺伝子の一部に相補性を含み、および、上記第2の部分は、ABL遺伝子の一部に相補性を含む、実施形態65に記載の組成物。67.上記第1の部分はTEL遺伝子の一部に相補性を含み、および、上記第2の部分はAML遺伝子の一部に相補性を有する、実施形態65に記載
の組成物。68.キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態65に記載の組成物。69.上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態65に記載の組成物。70.上記第1のドメインがCas9ドメインを含む、実施形態65に記載の組成物。71.第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態65に記載の組成物。72.上記第1のドメインはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態65に記載の組成物。73.第1のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態65に記載の組成物。74.上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第1のドメインによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態73に記載の組成物。75.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex1ドメインを含む、実施形態65に記載の組成物。76.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態65に記載の組成物。77.上記キメラポリペプチドは陥凹3’OHを露出させる、実施形態65に記載の組成物。78.上記第2のドメインは、切断された末端切除活性を有するドメインを含む、実施形態65に記載の組成物。79.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態65に記載の組成物。80.上記キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態65に記載の組成物。81.上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態65に記載の組成物。82.上記組成物は経口投与のために製剤化される、実施形態65に記載の組成物。83.上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態65に記載の組成物。84.上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態65に記載の組成物。85.上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態65に記載の組成物。86.上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態65に記載の組成物。87.上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態65に記載の組成物。88.上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態65に記載の組成物。89.上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態65に記載の組成物。90.癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、前記方法は、被験体の標的核酸を、実施形態65~89のいずれか1つに記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。91.上記標的核酸は、第1染色体の一部と第2染色体の一部とを含む染色体転座の領域にある、実施形態90に記載の方法。92.上記標的核酸は、上記ガイド核酸の第1の部分および第2の部分にハイブリダイズする、実施形態90に記載の方法。93.上記組成物を被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、上記組成物中のリボ核タンパク質複合体内にある、実施例90に記載の方法。94.上記キメラポリペプチドによる標的核酸の切断後、被験体のキメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例90に記載の方法。95.上記停止させる工程は、キメラポリペプチドに特異的な抗体を被験体に投与することにより実施される、実施形態90に記載の方法。96.上記停止させる工程は、ZnSO4を被験体に投与することにより実施される、実施形態90に記載の方法。97.病原体を標的とするための組成物であって、上記組成物は:a)配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含む、キメラポリペプチドと;b)病原体の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、組成物。98.上記標的核酸はRNAを含む、実施形態97に記載の組成物。99.上記標的核酸はDNAを含む、実施形態97に記載の組成物。100.上記病原体はウイルスである、実施形態97に記載の組成物。101.上記病原体は細菌である、実施形態97に記載の組成物。102.上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態97に記載の組成物。103.誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、キメラポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態102に記載の組成物。104.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態97に記載の組成物。105.上記第1のドメインはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態97に記載の組成物。106.上記第1のドメインが、Cas9ドメインを含む、実施形態97に記載の組成物。107.上記第1のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態97に記載の組成物。108.上記第1のドメインの誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第1のドメインによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態107に記載の組成物。109.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態97に記載の組成物。110.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態97に記載の組成物。111.上記キメラポリペプチドは陥凹3’OHを露出させる、実施形態97に記載の組成物。112.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態97に記載の組成物。113.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態97に記載の組成物。114.上記キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、組成物中にリボ核タンパク質複合体として存在する、実施形態97に記載の組成物。115.上記ガイド核酸は宿主核酸に結合しない、実施形態97に記載の組成物。116.上記組成物は、経口投与のために製剤化される、実施形態97に記載の組成物。117.上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態97に記載の組成物。118.上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態97に記載の組成物。119.上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態97に記載の組成物。120.上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態97に記載の組成物。121.上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態97に記載の組成物。122.上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態97に記載の組成物。123.上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態97に記載の組成物。124.被験体の病原体を標的とするための方法であって、上記方法は、上記被験体の病原体の標的核酸を、実施形態97~123のいずれか1つに記載の組成物と接触させる工程を含む、方法。125.キメラポリペプチドは上記標的核酸を切断する、実施形態124に記載の方法。126.上記組成物を上記被験体に投与する工程をさらに含み、ここで、キメラポリペプチドおよびガイド核酸は、上記組成物中のリボ核タンパク質複合体内にある、実施例124に記載の方法。127.上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例124に記載の方法。128.上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態124に記載の方法。129.上記停止させる工程は、ZnSO4を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態124に記載の方法。130.疾患を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は、上記被験体にリボ核タンパク質複合体を投与することを含み、上記リボ核タンパク質複合体は:(i)配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含むポリペプチドと;(ii)上記被験体の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、方法。131.上記疾患は癌である、実施形態130に記載の方法。132.上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態130に記載の方法。133.上記標的核酸は、上記疾患に関連する配列を含む、実施形態130に記載の方法。134.上記標的核酸はRNAを含む、実施形態130に記載の方法。135.上記標的核酸はDNAを含む、実施形態130に記載の方法。136.上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態130に記載の方法。137.上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態130に記載の方法。138.上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態130に記載の方法。139.上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態138に記載の方法。140.上記標的核酸は転座を含む、実施形態139に記載の方法。141.上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態130に記載の方法。142.上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態130に記載の方法。143.上記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、またはHER2からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態130に記載の方法。144.上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態130に記載の方法。145.上記ポリペプチドによって標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態130に記載の方法。146.上記ポリペプチドによって、標的核酸を含む細胞中の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態130に記載の方法。147.上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態130に記載の方法。148.誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記ポリペプチドによる標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態147に記載の方法。149.上記ポリペプチドはCas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態130に記載の方法。150.上記ポリペプチドはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態130に記載の方法。151.上記ポリペプチドはCas9ドメインを含む、実施形態130に記載の方法。152.上記ガイド核酸は、表6および段落[0268]または表7および段落[0270]に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態130に記載の方法。153.上記ガイド核酸は第1の部分と第2の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagatに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態130に記載の組成物。154.上記ガイド核酸は、第1の部分と、第2の部分と、第3の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、配列:attctaatacgactcactataggに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第3の部分は、配列:gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa
aaagtggcaccgagtcggtgcに対して少なくとも約85%の配列同一性を含む、実施形態130に記載の組成物。155.上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態130に記載の方法。156.上記ポリペプチドは、上記配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含む、キメラポリペプチドである、実施形態155に記載の方法。157.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態156に記載の方法。158.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態156に記載の方法。159.上記キメラポリペプチは陥凹3’OHを露出させる、実施形態156に記載の方法。160.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態156に記載の方法。161.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態156に記載の方法。162.上記ポリペプチドによる標的核酸の切断後、上記被験体の上記ポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例130に記載の方法。163.上記停止させる工程は、上記ポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態130に記載の方法。164.上記停止させる工程は、ZnSO4を被験体に投与することにより実施される、実施形態130に記載の方法。165.癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は:a)化学療法、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される療法を、被験体に施す工程と;b)上記被験体の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含む、キメラポリペプチドと接触させる工程と、を含む、方法。166.上記療法は免疫療法である、実施形態165に記載の方法。167.上記免疫療法はCAR T細胞療法を含む、実施形態166に記載の方法。168.上記免疫療法はトラスツズマブ169を投与することを含む、実施形態166に記載の方法。上記療法は化学療法である、実施形態165に記載の方法。170.上記化学療法はイマチニブメシレートを投与することを含む、実施形態169に記載の方法。171.a)とb)の組み合わせは、a)単独またはb)単独の治療効果と比較して、増強された治療効果をもたらす、実施形態165に記載の方法。172.上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態165に記載の方法。173.上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態165に記載の方法。174.上記標的核酸は、癌に関連する配列を含む、実施形態165に記載の方法。175.上記標的核酸はRNAを含む、実施形態165に記載の方法。176.上記標的核酸はDNAを含む、実施形態165に記載の方法。177.上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態165に記載の方法。178.上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態177に記載の方法。179.上記標的核酸は転座を含む、実施形態177に記載の方法。180.上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態165に記載の方法。181.上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態165に記載の方法。182.上記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、またはHER2からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態165に記載の方法。183.上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例165に記載の方法。184.上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態183に記載の方法。185.上記ガイド核酸は、表6および段落[0268]または表7および段落[0270]に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態183に記載の方法。186.上記ガイド核酸は第1の部分と第2の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagatに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態183に記載の方法。187.上記ガイド核酸は、第1の部分と、第2の部分と、第3の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、配列:attctaatacgactcactataggに対して少なくとも約85%の配列同一性を有し、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第3の部分は、配列:gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcに対して少なくとも約85%の配列同一性を含む、実施形態183に記載の方法。188.上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例165に記載の方法。189.上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態165に記載の方法。190.キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態165に記載の方法。191.上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態165に記載の方法。192.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態165に記載の方法。193.上記第1のドメインはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態165に記載の方法。194.上記第1のドメインが、Cas9ドメインを含む、実施形態165に記載の方法。195.上記第1のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態165に記載の方法。196.上記第1のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第1のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態195に記載の方法。197.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態195に記載の方法。198.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態165に記載の方法。199.上記キメラポリペプチは陥凹3’OHを露出させる、実施形態165に記載の方法。200.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態165に記載の方法。201.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態165に記載の方法。202.上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態165に記載の方法。203.上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例165に記載の方法。204.上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態203に記載の方法。205.上記停止させる工程は、ZnSO4を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態203に記載の方法。206.癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は:a)第1の時点で上記被験体の第1の健康状態を定量化する工程と;b)化学療法、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される療法を上記被験体に投与する工程と;c)上記療法の後の第2の時点で、上記被験体の第2の健康状態を定量化する工程と;d)上記被験体の標的核酸を、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を有する第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとの含むキメラポリペプチドと接触させる工程と;e)接触させた後の第3の時点で、上記被験体の第3の健康状態を定量化する工程と、を含む、方法。207.上記第1の健康状態、上記第2の健康状態、または上記第3の健康状態を定量化する工程は、生検、画像検査、遺伝子検査、腫瘍分子プロファイリング、臨床検査、あるいは核酸配列決定の1つ以上の使用を含む、実施形態206に記載の方法。208.上記療法は免疫療法である、実施形態206に記載の方法。209.上記免疫療法はCAR T細胞療法を含む、実施形態208に記載の方法。210.上記免疫療法はトラスツズマブ211を投与することを含む、実施形態208に記載の方法。上記療法は化学療法である、実施形態206に記載の方法。205.上記化学療法はイマチニブメシレートを投与することを含む、実施形態211に記載の方法。213.上記被験体の上記第3の健康状態は、上記第1の健康状態および上記第2の健康状態よりも良好である、実施形態206に記載の方法。214.上記標的核酸は上記被験体の癌細胞中にある、実施形態206に記載の方法。215.上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態206に記載の方法。216.上記標的核酸は癌に関連する配列を含む、実施形態206に記載の方法。217.上記標的核酸はRNAを含む、実施形態206に記載の方法。218.上記標的核酸はDNAを含む、実施形態206に記載の方法。219.上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態206に記載の方法。220.上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態206に記載の方法。221.上記標的核酸は転座を含む、実施形態219に記載の方法。222.上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態206に記載の方法。223.上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態206に記載の方法。224.上記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、またはHER2からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態206に記載の方法。225.上記標的核酸を、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と接触させる工程をさらに含む、実施例206に記載の方法。226.上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態225に記載の方法。227.上記ガイド核酸は、表6および段落[0268]または表7および段落[0270]に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態225に記載の方法。228.上記ガイド核酸は第1の部分と第2の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagatに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態225に記載の方法。229.上記ガイド核酸は、第1の部分と、第2の部分と、第3の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、配列:attctaatacgactcactataggに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第3の部分は、
配列:gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcに対して少なくとも約85%の配列同一性を含む、実施形態225に記載の方法。230.上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施例206に記載の方法。231.上記キメラポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態206に記載の方法。232.上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態206に記載の方法。233.上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態232に記載の方法。234.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態206に記載の方法。235.上記第1のドメインはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態206に記載の方法。236.上記第1のドメインが、Cas9ドメインを含む、実施形態206に記載の方法。237.上記第1のドメインは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態206に記載の方法。238.上記第1のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第1のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態237に記載の方法。239.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態206に記載の方法。240.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態206に記載の方法。241.上記キメラポリペプチは陥凹3’OHを露出させる、実施形態206に記載の方法。242.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態206に記載の方法。243.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態206に記載の方法。244.上記キメラポリペプチドは、上記キメラポリペプチドと、上記標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸とを含むリボ核タンパク質複合体中の細胞へと送達される、実施形態206に記載の方法。245.上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施例206に記載の方法。246.上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態245に記載の方法。247.上記停止させる工程は、ZnSO4を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態245に記載の方法。248.被験体におけるポリペプチドの活性を停止させるための方法であって、上記方法は:a)配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含むポリペプチドを用いて、上記被験体の標的核酸を切断する工程と;b)上記被験体のポリペプチドの活性を停止させる工程と、を含む、方法。249.上記停止させる工程は、上記ポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することを含む、実施形態248に記載の方法。250.上記停止させる工程は、上記被験体にZnSO4を投与することを含む、実施形態248に記載の方法。251.上記被験体は疾患を患っている、実施形態248に記載の方法。252.上記疾患は癌である、実施形態251に記載の方法。253.上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態251に記載の方法。254.上記標的核酸は上記疾患に関連する配列を含む、実施形態251に記載の方法。255.上記標的核酸はRNAを含む、実施形態248に記載の方法。256.上記標的核酸はDNAを含む、実施形態248に記載の方法。257.上記標的核酸は上記被験体の癌細胞中にある、実施形態248に記載の方法。258.上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態248に記載の方法。259.上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態248に記載の方法。260.上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態248に記載の方法。261.上記標的核酸は転座を含む、実施形態260に記載の方法。262.上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態248に記載の方法。263.上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態248に記載の方法。264.上記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、またはHER2からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態248に記載の方法。265.上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態248に記載の方法。266.上記ポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態248に記載の方法。267.上記ポリペプチドによって、上記標的核酸を含む細胞の他の核酸を非特異的に切断する工程をさらに含む、実施形態248に記載の方法。268.上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態248に記載の方法。269.上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記ポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態248に記載の方法。270.上記ポリペプチドはCas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態248に記載の方法。271.上記ポリペプチドはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態248に記載の方法。272.上記ポリペプチドはCas9ドメインを含む、実施形態248に記載の方法。273.上記ポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態248に記載の方法。274.上記ポリペプチドは、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含む、キメラポリペプチドである、実施形態248に記載の方法。275.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態248に記載の方法。276.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態248に記載の方法。277.上記キメラポリペプチは陥凹3’OHを露出させる、実施形態248に記載の方法。278.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態248に記載の方法。279.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態248に記載の方法。280.2つ以上の核酸を標的とするための組成物であって、上記組成物は、a)配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含む、キメラポリペプチドと;b)2つ以上のガイド核酸であって、ここで、上記ガイド核酸はそれぞれ、細胞の異なる標的核酸に相補的な配列を含む、2つ以上のガイド核酸とを含む、組成物。281.上記標的核酸はRNAを含む、実施形態280に記載の組成物。282.上記標的核酸はDNAを含む、実施形態280に記載の組成物。283.上記標的核酸は疾患に関連する配列を含む、実施形態280に記載の組成物。284.上記疾患は癌である、実施形態283に記載の組成物。285.上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態283に記載の組成物。286.上記ガイド核酸は、表6および段落[0268]または表7および段落[0270]の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態283に記載の組成物。287.上記ガイド核酸は第1の部分と第2の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagatに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含む、実施形態283に記載の組成物。288.上記ガイド核酸は、第1の部分と、第2の部分と、第第3の部分とを含み、ここで、上記第1の部分は、配列:attctaatacgactcactataggに対して少なくとも約85%の配列同一性を含み、上記第2の部分は、癌に関連する遺伝子の領域に相補的な配列を含み、上記第3の部分は配列:gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcに対して少なくとも約85%の配列同一性を含む、実施形態283に記載の組成物。289.上記細胞は癌細胞である、実施形態280に記載の組成物。290.上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態280に記載の組成物。291.上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態290に記載の組成物。292.上記標的核酸は癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態280に記載の組成物。293.上記標的核酸は転座を含む、実施形態291に記載の組成物。294.上記標的核酸は癌の進行に関連する配列を含む、実施形態280に記載の組成物。295.上記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、またはHER2からなる群から選択される、遺伝子の一部を含む、実施形態280に記載の組成物。296.キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態280に記載の組成物。297.上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態296に記載の組成物。298.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態280に記載の組成物。299.上記第1のドメインはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態280に記載の組成物。300.上記第1のドメインが、Cas9ドメインを含む、実施形態280に記載の組成物。301.上記第1のドメインは、上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態280に記載の組成物。302.上記第1のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第1のドメインの上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態301に記載の組成物。303.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態280に記載の組成物。304.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態280に記載の組成物。305.上記キメラポリペプチは陥凹3’OHを露出させる、実施形態280に記載の組成物。306.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態280に記載の組成物。307.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態280に記載の組成物。308.上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態280に記載の組成物。309.上記組成物は1つ以上のリボ核タンパク質複合体
を含み、ここで、各リボ核タンパク質複合体は、上記キメラポリペプチドおよび上記2つ以上のガイド核酸の1つガイド核酸を含む、実施形態280に記載の組成物。310.上記組成物は、経口投与のために製剤化される実施形態280に記載の組成物。311.上記組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤として製剤化される、実施形態280に記載の組成物。312.上記組成物は腸溶コーティングで製剤化される、実施形態280に記載の組成物。313.上記組成物は局所投与のために製剤化される、実施形態280に記載の組成物。314.上記組成物は非経口投与のために製剤化される、実施形態280に記載の組成物。315.上記組成物は髄腔内投与のために製剤化される、実施形態280に記載の組成物。316.上記組成物は、標的核酸を含む細胞への組成物の侵入を促進する薬剤をさらに含む、実施形態280に記載の組成物。317.上記組成物は緩衝剤を含む、実施形態280に記載の組成物。318.疾患を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は、上記被験体の標的核酸を、実施形態280~317のいずれか1つの組成物と接触させる工程を含む、方法。319.上記疾患は癌である、実施形態318に記載の方法。320.上記疾患は肺癌または膵臓癌である、実施形態318に記載の方法。321.キメラポリペプチドによって標的核酸を切断する工程をさらに含む、実施形態318に記載の方法。322.細胞死を誘導する工程をさらに含む、実施形態318に記載の方法。323.上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の切断後、上記被験体の上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程をさらに含む、実施形態318に記載の方法。324.上記停止させる工程は、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態323に記載の方法。325.上記停止させる工程は、ZnSO4を上記被験体に投与することにより実施される、実施形態323に記載の方法。326.癌を患う被験体の症状を改善するための方法であって、上記方法は:a)上記被験体から生体サンプルを得る工程と;b)上記生体サンプル中の核酸の配列情報を決定する工程と;c)上記配列情報から標的核酸を同定する工程であって、上記標的核酸は、癌に関連している、工程と;d)配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインとエキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含むキメラポリペプチドを含むリボ核タンパク質複合体と、上記標的核酸の一部に相補的な配列を含むガイド核酸と、を含む、組成物を投与する工程と;e)上記被験体の癌細胞のキメラポリペプチドによって、上記標的核酸を部位特異的に切断する工程と;f)上記キメラポリペプチドによる癌細胞の他の核酸を非特異的に切断し、それによって、上記癌細胞の細胞死を引き起こす、工程と;g)上記被験体にターミネーターを投与し、それによって、上記キメラポリペプチドの活性を停止させる工程と、を含む、方法。327.上記生体サンプルは、血液、血漿、唾液、体液、腫瘍サンプル、生検サンプル、無細胞核酸を含むサンプル、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態326に記載の方法。328.上記決定する工程は、配列決定することをさらに含む、実施形態326に記載の方法。329.上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態326に記載の方法。330.上記ターミネーターは、上記キメラポリペプチドに特異的な抗体である、実施形態326に記載の方法。331.上記ターミネーターはZnSO4である、実施形態326に記載の方法。332.上記標的核酸はRNAを含む、実施形態326に記載の方法。333.上記標的核酸はDNAを含む、実施形態326に記載の方法。334.上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態326に記載の方法。335.上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態334に記載の方法。336.上記標的核酸は転座を含む、実施形態334に記載の方法。337.上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型を含む、実施形態326に記載の方法。338.上記標的核酸は、癌の進行に関連する配列を含む、実施形態326に記載の方法。339.上記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、またはHER2からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態326に記載の方法。340.上記ガイド核酸は正常細胞中の核酸に結合しない、実施形態326に記載の方法。341.上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態326に記載の方法。342.上記非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態341に記載の方法。343.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態326に記載の方法。344.上記第1のドメインはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態326に記載の方法。345.上記第1のドメインが、Cas9ドメインを含む、実施形態326に記載の方法。346.上記ガイド核酸は、表6および段落[0268]または表7および段落[0270]の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態326に記載の方法。347.上記第1のドメインは、上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性を含むCRISPR関連(Cas)タンパク質ドメインである、実施形態326に記載の方法。348.上記第1のドメインの上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記第1のドメインによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態347に記載の方法。349.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態326に記載の方法。350.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態326に記載の方法。351.上記キメラポリペプチは陥凹3’OHを露出させる、実施形態326に記載の方法。352.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態326に記載の方法。353.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態326に記載の方法。354.細胞中の細胞死を選択的に誘導する方法であって、上記方法は:a)配列に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む第2のドメインとを含むキメラポリペプチドと、上記細胞の標的核酸に相補的な配列を含むガイド核酸と、を投与する工程と;b)上記標的核酸を切断し、それによって、細胞死を誘導する工程と、を含む、方法。355.上記標的核酸は疾患に関連している、実施形態354に記載の方法。356.上記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、実施形態354に記載の方法。357.上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態354に記載の方法。358.上記標的核酸は、癌に関連する配列を含む、実施形態354に記載の方法。359.上記標的核酸はRNAを含む、実施形態354に記載の方法。360.上記標的核酸はDNAを含む、実施形態354に記載の方法。361.上記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、実施形態354に記載の方法。362.上記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、コピー数多型、インデル、および同腕染色体からなる群から選択される、実施形態361に記載の方法。353.上記細胞は複数の細胞中にある、実施形態354に記載の方法。364.上記複数の細胞は正常細胞を含む、実施形態364に記載の方法。365.投与後に、上記正常細胞は生きている、実施形態364に記載の方法。366.投与後に、上記正常細胞は増殖する、実施形態364に記載の方法。367.上記切断は、前記細胞内の1つ以上の切断部位で切断することを含む、実施形態364に記載の方法。368.上記疾患は癌である、実施形態355に記載の方法。369.上記癌は肺癌または膵臓癌を含む、実施形態368に記載の方法。370.上記標的核酸は、癌に特異的な一塩基多型、転座、または癌の進行に関連する配列を有する、実施形態354に記載の方法。371.上記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、HER2、KIF5A、IRX1、ADAMTS16、GNPDA2、KCNE2、SLC15A5、SMIM11、DACH2、HERC2P2、CD68SHBG、ERBB2、KRT16、LINC00536、TRPS1、CDK8、TRAPPC9、HERC2P2、SIRPB1、MRC1、ATP11A、POTEB、HERC2P2、PRDM9、CDKN2B、HPV、LINE2(MT2)、CCR5、またはHPRT1からなる群から選択される遺伝子の一部を含む、実施形態354に記載の方法。372.上記キメラポリペプチドは、誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含む、実施形態354に記載の方法。373.上記誘導可能な非特異的ヌクレアーゼ活性は、上記キメラポリペプチドによる上記標的核酸の部位特異的な切断によって活性化される、実施形態372に記載の方法。374.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメイン、Cas12aドメイン、Cas12bドメイン、Cas12cドメイン、Cas12dドメイン、Cas12eドメイン、Cas12fドメイン、Cas12gドメイン、Cas12hドメイン、Cas12iドメイン、Cas13aドメイン、Cas13bドメイン、Cas14ドメイン、またはCas9ドメインを含む、実施形態354に記載の方法。375.上記第1のドメインは、Cas12a(またはCpf1)ドメインを含む、実施形態354に記載の方法。376.上記第1のドメインはCas13aまたはCas13bのドメインを含む、実施形態354に記載の方法。377.上記第1のドメインが、Cas9ドメインを含む、実施形態354に記載の方法。378.上記ガイド核酸は、表6および段落[0268]または表7および段落[0270]に列挙される配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態354に記載の方法。379.上記第2のドメインは、RecEドメイン、RecJドメイン、T5ドメイン、ラムダエキソヌクレアーゼドメイン、RecBCDドメイン、DNAポリメラーゼI小断片ドメイン、ExoIドメイン、ExoIIドメイン、ExoVIIドメイン、Exo Tドメイン、Trex1ドメイン、またはTrex2ドメインを含む、実施形態354に記載の方法。380.上記キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、実施形態354に記載の方法。381.上記キメラポリペプチは陥凹3’OHを露出させる、実施形態354に記載の方法。382.上記第2のドメインは切断された末端切除活性を有する酵素を含む、実施形態354に記載の方法。383.上記第2のドメインはマングビーンヌクレアーゼを含む、実施形態354に記載の方法。384.上記標的核酸は上記被験体の正常細胞にはない、実施形態364に記載の方法。
多くのCRISPR/Cas複合体は本明細書の開示と一致している。例示的なCas配列であるSpyCas9の配列が、ヌクレオチドおよびアミノ酸の形態で以下に提供される。
例示的なCas代替物であるCpf1が、ヌクレオチドおよびアミノ酸の形態で以下に提供される。
多くのエキソヌクレアーゼは本明細書の開示に一致している。エキソヌクレアーゼの部分的なリストが以下に提供されるが、他のものも本明細書の開示と一致している。
MSDNAQLTGLCDRFRGFYPVVIDVETAGFNAKTDALLEIAAITLKMDEQGWLMPDTTLHFHVEPFVGANLQPEALAFNGIDPNDPDRGAVSEYEALHEIFKVVRKGIKASGCNRAIMVAHNANFDHSFMMAAAERASLKRNPFHPFATFDTAALAGLALGQTVLSKACQTAGMDFDSTQAHSALYDTERTAVLFCEIVNRWKRLGGWPLSAAEEV
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MKLQKQLLEAVEHKQLRPLDVQFALTVAGDEHPAVTLAAALLSHDAGEGHVCLPLSRLENNEASHPLLATCVSEIGELQNWEECLLASQAVSRGDEPTPMILCGDRLYLNRMWCNERTVARFFNEVNHAIEVDEALLAQTLDKLFPVSDEINWQKVAAAVALTRRISVISGGPGTGKTTTVAKLLAALIQMADGERCRIRLAAPTGKAAARLTESLGKALRQLPLTDEQKKRIPEDASTLHRLLGAQPGSQRLRHHAGNPLHLDVLVVDEASMIDLPMMSRLIDALPDHARVIFLGDRDQLASVEAGAVLGDICAYANAGFTAERARQLSRLTGTHVPAGTGTEAASLRDSLCLLQKSYRFGSDSGIGQLAAAINRGDKTAVKTVFQQDFTDIEKRLLQSGEDYIAMLEEALAGYGRYLDLLQARAEPDLIIQAFNEYQLLCALREGPFGVAGLNERIEQFMQQKRKIHRHPHSRWYEGRPVMIARNDSALGLFNGDIGIALDRGQGTRVWFAMPDGNIKSVQPSRLPEHETTWAMTVHKSQGSEFDHAALILPSQRTPVVTRELVYTAVTRARRRLSLYADERILSAAIATRTERRSGLAALFSSRE
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VKQQIQLRRREVDETADLPAELPPLLRRLYASRGVRSAQELERSVKGMLPWQQLSGVEKAVEILYNAFREGTRIIVVGDFDADGATSTALSVLAMRSLGCSNIDYLVPNRFEDGYGLSPEVVDQAHARGAQLIVTVDNGISSHAGVEHARSLGIPVIVTDHHLPGDTLPAAEAIINPNLRDCNFPSKSLAGVGVAFYLMLALRTFLRDQGWFDERNIAIPNLAELLDLVALGTVADVVPLDANNRILTWQGMSRIRAGKCRPGIKALLEVANRDAQKLAASDLGFALGPRLNAAGRLDDMSVGVALLLCDNIGEARVLANELDALNQTRKEIEQGMQIEALTLCEKLERSRDTLPGGLAMYHPEWHQGVVGILASRIKERFHRPVIAFAPAGDGTLKGSGRSIQGLHMRDALERLDTLYPGMMLKFGGHAMAAGLSLEEDKFKLFQQRFGELVTEWLDPSLLQGEVVSDGPLSPAEMTMEVAQLLRDAGPWGQMFPEPLFDGHFRLLQQRLVGERHLKVMVEPVGGGPLLDGIAFNVDTALWPDNGVREVQLAYKLDINEFRGNRSLQIIIDNIWPI
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MASRRNLMIVDGTNLGFRFKHNNSKKPFASSYVSTIQSLAKSYSARTTIVLGDKGKSVFRLEHLPEYKGNRDEKYAQRTEEEKALDEQFFEYLKDAFELCKTTFPTFTIRGVEADDMAAYIVKLIGHLYDHVWLISTDGDWDTLLTDKVSRFSFTTRREYHLRDMYEHHNVDDVEQFISLKAIMGDLGDNIRGVEGIGAKRGYNIIREFGNVLDIIDQLPLPGKQKYIQNLNASEELLFRNLILVDLPTYCVDAIAAVGQDVLDKFTKDILEIAEQ
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MPKKNEAPASFEKALSELEQIVTRLESGDLPLEEALNEFERGVQLARQGQAKLQQAEQRVQILLSDNEDASLTPFTPDNE
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CRISPR/Cas12aヌクレアーゼ複合体をDHCR7核酸ガイドのまわりでアセンブルした。標的配列を含むDNA#1および非標的対照であるDNA#2に対して、活性を分析した。出力をゲル電気泳動によって測定して、「切断されたDNA#1」バンドの存在によって証明されるエンドヌクレアーゼ活性と、バンドの不在によって証明されるエキソヌクレアーゼ活性とについて検定する。活性を、図3の1.5時間(上)および24時間の(下)で分析する。
CRISPR/Casヌクレアーゼが、特定のヌクレアーゼ活性依存性様式で、細胞に対する細胞毒性効果を有しているか否かを調べるために、CRISPR/Cas12a(Cpf1)ヌクレアーゼでトランスフェクトされたヒトの不死化細胞の生存率を時間依存性様式で評価した。ヌクレアーゼの特異的な標的化活性を誘導するために、2つのcrRNA(ヒトDHCR7遺伝子を特異的に標的とする非常に特異的なもの(DHCR7)と、イネ萎縮(rice dwarf)5遺伝子に特異的であり、かつヒトゲノム中の配列に部分的に結合する第2のガイド(OsDwarf5_1))を使用した。
個体は癌に苦しんでいると識別される。癌は腫瘍に局在する場合がある。腫瘍は配列決定され、および、腫瘍細胞の少なくとも一部に対応するものとして、多くの突然変異が同定される。
実施例7の個体は、持続的な腫瘍成長を含むいくつかの症状を示し続けることがある。そのような場合では、処置されて減少した腫瘍を、再配列決定することができる。標的配列はもはや存在しないが、さらなる突然変異が同定され得ることが観察される。
別の例として、患者は白血病に苦しんでいる。上記患者に、イマチニブメシレート(Gleevec)の処置を施す。何らかの症状改善が観察されるが、疾患の進行は継続し、上記患者は、上記処置のいくつかの副作用に苦しむ。
この実施例では、癌などの疾患に関連する核酸を標的とするガイド核酸を設計するための、例示的な方法が説明される。
1.ヒト参照ゲノム配列(例えば、hg19、GRCh37)
2.癌細胞株百科事典(CCLE)からの癌細胞株の突然変異情報
3.MSK-IMPACT(商標)中に表記される410の癌突然変異(メモリアル・スローン・ケタリング癌センター-実用的な癌標的の統合された突然変異プロファイリング)。
1.遺伝子ID:NCBI GenBank識別子
2.遺伝子記号:HUGO欧州バイオインフォマティクス研究所(EMBL-EBI)の遺伝子命名法
3.ヒトゲノムアセンブリバージョン(GRCh):ゲノム・リファレンス・コンソーシアム・ヒトゲノム・ビルド(Genome Reference Consortium Human Build)のヒトゲノムアセンブリのバージョン
4.染色体数:標的遺伝子が位置する染色体対の数
5.突然変異開始位置:ヒトリファレンスゲノム中の突然変異の開始位置
6.突然変異終了位置:ヒトリファレンスゲノム中の突然変異の終了位置
7.突然変異クラス:突然変異のクラス
8.突然変異型:突然変異の型(例えば、挿入、欠失、一塩基多型(SNP)、ジヌクレオチド多型(DNP))
9.参照配列:標的遺伝子座中のヒトリファレンスゲノムの配列
10.突然変異配列:標的遺伝子座中の癌細胞株のゲノムの配列
11.アミノ酸変化:ヌクレオチド突然変異によるアミノ酸変化
12.癌細胞株名:突然変異を有する癌細胞株の名称
13.腫瘍の起原の組織:癌細胞株が由来するか、または初めに分離された組織
14.Ensembl転写物ID(ENST ID):Ensemblゲノムデータベースからの標的遺伝子転写物識別子
15.crRNA配列:癌細胞株の標的突然変異遺伝子座から抽出されたcrRNA配列。PAM配列が含まれており、配列の長さは入力crRNA長さに応じて変わる。
16.突然変異とPAMとの間の距離:crRNAにおける突然変異からPAMまでの距離。PAMがcrRNAの上流にある場合、PAMの最終位置は位置0になり、PAM中の突然変異は負の位置になり、および、標的切断部位中の突然変異は正の位置になる。Cas9の場合には、PAMがcrRNAの下流にある。したがって、PAMの第1位は位置0であり、PAM中の突然変異は負の位置であり、および、標的切断部位中の突然変異は正の位置である。
17.突然変異の長さ:参照配列と突然変異配列の長さの差
18.参照標的配列:標的遺伝子座の参照配列からの±10ヌクレオチド配列
19.突然変異標的配列:標的遺伝子座の癌細胞株突然変異配列からの±10ヌクレオチド配列。
20.ガイドRNA配列(表5aおよび6):ハンドルを有するgRNA配列およびT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列
ガイドRNA配列(表5bおよび7):ハンドルを有するgRNA配列、tracrRNA、およびT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列。
多くのガイドRNA配列は、本明細書の開示と一致している。
CRISPR gRNA ID: GF-CCELg12-1 : [crRNA配列] : crRNA sequence: TTTCCTCACTGGCTTCAGCGATTCCACA : LbgRNA: AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagat CTCACTGGCTTCAGCGATTCCACA : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 29123 : Symbol: ANKRD11 : Ensembl_Transcript_ID: ENST00000301030.4 : GRCh: 37 : Chr: 16 : [標的癌突然変異情報] : mut_start: 89351168 : mut_end: 89351168 : mut_class: Silent : mut_type: SNP : ref_seq: C : mut_seq: T : mut_aa: p.K594K : mutation info source: CCLE : ref_target(-10 +10): GCTCCTGCCTCTTCCTCACTG : mut_target(-10 +10): GCTCCTGCCTTTTCCTCACTG : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH1573 : cancer_type: LUNG : PAM_dist: -3 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg12-2 : [crRNA配列] : crRNA sequence: TTTTCCTCACTGGCTTCAGCGATTCCAC : LbgRNA: AATTCTAATACGACTCACTATAGgtaatttctactaagtgtagat CCTCACTGGCTTCAGCGATTCCAC : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 29123 : Symbol: ANKRD11 : Ensembl_Transcript_ID: ENST00000301030.4 : GRCh: 37 : Chr: 16 : [標的癌突然変異情報] : mut_start: 89351168 : mut_end: 89351168 : mut_class: Silent : mut_type: SNP : 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ID: ENST00000285071.4 : GRCh: 37 : Chr: 17 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 17117112 : mut end: 17117112 : mut class: Nonsense Mutation : mut type: SNP : ref seq: G : mut seq: A : mut aa: p.Q533* : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): AGCAGCTTCTGTGTGTCCTCT : mut target(-10 +10): AGCAGCTTCTATGTGTCCTCT : [モデル細胞株情報] : cell: SW1990 : cancer type: PANCREAS : PAM dist: 20 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg9-297 : [crRNA配列] : crRNA sequence: ACTTTTATCTTCT
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cgactcactataggTACTTGGACTTAGCTCTGGTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 7046 : Symbol: TGFBR1 : Ensembl Transcript ID: ENST00000374994.4 : GRCh: 37 : Chr: 9 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 101904835 : mut end: 101904835 : mut class: Nonsense Mutation : mut type: SNP : ref seq: C : mut seq: T : mut aa: p.Q275* : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): TACTTGGACTCAGCTCTGGTT : mut target(-10 +10): TACTTGGACTTAGCTCTGGTT : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH1573 : cancer type: LUNG : PAM dist: 10 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg9-919 : [crRNA配列] : crRNA sequence: ACACGCACCTCAAAGCTGTTCGG : SpgRNA: attctaatacgactcactataggACACGCACCTCAAAGCTGTTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 7157 : Symbol: TP53 : Ensembl Transcript ID: ENST00000269305.4 : GRCh: 37 : Chr: 17 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 7577138 : mut end: 7577138 : mut class: Missense Mutation : mut type: SNP : ref seq: C : mut seq: G : mut aa: p.R267P : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): AAAGCTGTTCCGTCCCAGTAG : mut target(-10 +10): AAAGCTGTTCGGTCCCAGTAG : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH1437 : cancer type: LUNG : PAM dist: -1 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg9-920 : [crRNA配列] : crRNA sequence: ACTGGGACCGAACAGCTTTGAGG : SpgRNA: attctaatacgactcactataggACTGGGACCGAACAGCTTTGgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 7157 : Symbol: TP53 : Ensembl Transcript ID: ENST00000269305.4 : GRCh: 37 : Chr: 17 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 7577138 : mut end: 7577138 : mut class: Missense Mutation : mut type: SNP : ref seq: C : mut seq: G : mut aa: p.R267P : mutation info source: CCLE : ref target(-10 +10): AAAGCTGTTCCGTCCCAGTAG : mut target(-10 +10): AAAGCTGTTCGGTCCCAGTAG : [モデル細胞株情報] : cell: NCIH1437 : cancer type: LUNG : PAM dist: 12 : indel length: 0 : CRISPR gRNA ID: GF-CCELg9-921 : [crRNA配列] : crRNA sequence: GGTACAGTCAGAGCCAACCCAGG : SpgRNA: attctaatacgactcactataggGGTACAGTCAGAGCCAACCCgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc : [標的遺伝子情報] : Gene ID: 7157 : Symbol: TP53 : Ensembl Transcript ID: ENST00000269305.4 : GRCh: 37 : Chr: 17 : [標的癌突然変異情報] : mut start: 7577610 : mut end: 7577610 : mut class: Splice Site : mut type: SNP : ref seq: T : mut seq: C : mut aa: - 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個体は肺癌に苦しんでいると識別される。個体の肺癌細胞に関連する配列情報を決定し、肺癌に対応する突然変異を同定する。
個体は膵臓癌に苦しんでいると識別される。個体の癌細胞に関連する配列情報を決定し、癌に対応する突然変異を同定する。
本明細書中の実施例のいずれかの個体に、DNA二重鎖切断修復の高分子阻害剤を投与して、ゲノム編集効率を増強する。ガイドRNAは、例えば、BRCA経路またはBRCA遺伝子に関連する、二重鎖切断修復に関与する遺伝子を標的とするように設計される。ガイドRNAは、Cas9またはCas12aなどのCasヌクレアーゼと共に個体に投与される。併用療法を施すと、症状の改善および肺癌の寛解が個体において観察される。
突然変異体特異ガイドRNAを有するCas9発現ベクター(PX459、Addgeneプラスミド#62988)を使用して、EGFR突然変異体肺癌ゲノム中の複数の切断を誘導した。Cas9/sgRNA発現ベクターを送達するために、肺腺癌細胞株であるHCC827を電気穿孔した。HCC827はそのEGFR遺伝子中にE2突然変異を有しており、特定のゲノム内に突然変異配列の18を超えるコピーがある。ガイドRNAを、HCC827細胞株中の18を超える遺伝子座を標的とするように設計した。RPMI-1640(10%のウシ胎仔血清)を使用して、細胞を、75Tフラスコにおいて面積の約50%を埋めるまで増やし、トリプシン処理し、PBSで洗浄し、および、Neonエレクトロポレーション緩衝液R(Neon Electroporation Buffer R)において再懸濁した。500ngのCas9/sgRNA発現を有する150,000の細胞を、10μLのNeonピペットチップに充填し、および、最適化された条件(1300V、20ミリセカンド、2パルス)下で電気穿孔した。細胞を増殖培地において6日間回復させ、計数した。図6では、CNVを標的とするPX459プラスミドDNAのneonエレクトロポレーションの6日後の、EGFR突然変異体肺癌細胞株であるHCC827における、Cas9ガイドRNA由来の複数の切断の誘導および細胞死が示される。ベクターを用いず、あるいは野生型のEGFR配列を標的とするベクターを用いて電気穿孔された対照群と比較して、HCC827特異的突然変異を標的とするベクターを用いて電気穿孔された実験群は、細胞が有意に少なかった。上記結果は、実験群(EGFR_E2)が83%の細胞死を示したことをさらに示した。上記結果は、Cas9および標的特異的ガイドRNAによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させることを示していた。
H1299細胞を、24ウェルプレート中の1ウェル当たり1.5x105の細胞で蒔き、500ngのプラスミドを下記の表8に記載されるように各ウェルへと導入した。
24ウェルプレート中の1ウェル当たり1.5x10^5の細胞として、H1299細胞を蒔き、500ngのプラスミドを下記の表9に記載されるように各ウェルへと導入した。
H1563細胞を、24ウェルプレート中の1ウェル当たり1.5x105の細胞で蒔き、500ngのプラスミドを下記の表10に記載されるように各ウェルへと導入した。
図12-図13は、複数の標的2によるA549細胞の細胞死を示す。500ngのCas9タンパク質およびgRNA発現DNAを、エレクトロポレーションによってA549(膵臓)細胞へと導入した。培養したA549細胞を1XPBSで洗浄し、トリプシン-EDTAを使用して床から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、1XPBSで1回洗浄した。細胞を、20μL/各条件で、Lonza SF緩衝液で再懸濁し、それを各DNAと混合した。細胞とDNAの混合物をLonza エレクトロポレータに移し、電気ショックを与えた。対照として、ヒトゲノムに整列しないNT1(非標的)、ハウスキーピング遺伝子であるHPRT1、および1つのコピーを有するCCR5、ならびに電気ショックのみの条件を追加した。電気ショックによりDNA導入した後に、細胞を24ウェルに蒔くことを2回繰り返し、96ウェルに蒔くことを3回繰り返した。DNA導入の24、42、および72時間後に、50μLのCellTiter Glo試薬(Promega、G9241)を96ウェルプレートに加えた。プレートをFLUOstar omega reader機器上に置いて、2分間振盪させ、室温で10分間反応させた。その後、発光の程度を測定した。この方法は細胞中のATPの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定される。3つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の100を超える部位を標的とするMT2(複数の標的2)条件では、20~50%の細胞死が経時的に誘導された。加えて、CD68、DACH2、およびHERC2P2の3つのCNV標的は、MT2と同様の細胞死を誘導し、ならびに、SHBG2 CNV標的は、対照条件と比較して、70~80%の細胞死を誘導した。DNA導入の24時間後、1μg/mLのピューロマイシンを24ウェルに加え、ほぼ細胞死の時点で、細胞培養培地を変更することにより細胞を回復させた。5~7日間の回復後、細胞を各ウェルから取り除き、トリパンブルーで染色して、生存細胞の数を決定した。DNAが導入された後、ピューロマイシンを用いて細胞を選択し、その後、顕微鏡で観察して、細胞の数を測定した。細胞計数の結果と同様に、HPRT1、CCR5標的化処置は、細胞の50%より多くを回復させたが、MT2標的化処置では、90%の細胞死が観察され、および、細胞の10%のみが回復した。したがって、A549細胞において、Cas9タンパク質を使用して、CNV標的DNA切断が誘導されると、細胞死が誘導されることが確認された。
A549(膵臓)細胞を、エレクトロポレーションにより、500ngのCas9タンパク質、および個々のCNVの標的gRNAをコード化するDNAでトランスフェクトした。培養したA549細胞を1XPBSで洗浄し、トリプシン-EDTAを使用して床から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、1XPBSで1回洗浄した。細胞を、20μL/各条件で、Lonza SF緩衝液で再懸濁し、それを各DNAと混合した。細胞とDNAの混合物をLonza エレクトロポレータに移し、電気ショックを受けさせた。対照として、pET21aベクター大腸菌においてタンパク質を発現することができる条件、電気ショックのみの条件、および処置を追加しなかった。電気ショックによるDNA導入後に、各条件ごとに、細胞を96ウェルに加えることを3回繰り返した。DNA導入の24、44、および51時間後、50μLのCellTiter Glo試薬を各々のウェルに加えた。プレートをFLUOstar omega readerに置いて、2分間振盪させた。室温で10分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は、細胞中のATPの量に基づく代謝を含み、吸光度により生細胞の程度を決定する方法である。結果として、3つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の100を超える部位を標的とするMT2(標的2)条件において、20~50%の細胞死が経時的に誘導された。加えて、CD68、DACH2、およびHERC2P2の3つのCNV標的は、MT2条件と同様の程度の細胞死を観察し、SHBG CNV標的は、対照条件と比較して、70~80%の細胞死を誘導した。したがって、A549細胞において、Cas9タンパク質を使用して、CNVの標的DNA切断が誘導されると、細胞死が誘導されることが確認された。
乳癌細胞株であるSKBR3を、エレクトロポレーションによって、500ngのCas9タンパク質、および各CNV標的gRNAを発現するDNAで処理した。培養したSKBR3細胞を、1XPBSで洗浄し、その後、トリプシン-EDTAで処理し、底部から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、1XPBSで1回洗浄した。細胞を、20μL/各条件で、Lonza SF緩衝液で再懸濁し、それを各DNAと混合した。細胞とDNAの混合物をLonza エレクトロポレータ内に置いて、電気ショックを受けさせた。ヒトゲノムに整列しないNT1(非標的)、電気ショックのみの条件、および処置がない条件を、対照条件として加えた。電気ショックによるDNA導入後、各条件ごとに、細胞を96ウェルに挿入することを3回繰り返した。DNA導入の24、42、および48時間後に、50μLのCellTiter Glo試薬を96ウェルに加えた。プレートをFLUOstar omega readerに置いて、2分間振盪させた。室温で10分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は細胞中のATPの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定された。結果として、3つの対照条件と比較して、ヒトゲノム中の100を超える部位を標的とするMT2条件において、30%の細胞死が誘導された。加えて、2つのCNV標的であるERBB2とKRT16は、対照条件と比較して、40~50%の細胞死を誘導した。電気ショックによるDNA導入後、細胞を24ウェルに入れることを2回繰り返した。DNAの導入の48時間後に、細胞を24ウェルの各ウェルから取り除き、トリパンブルーで染色し、生細胞の数を測定した。結果として、対照条件と比較して、MT2条件において40%の細胞死が誘導され、2つの種類のERBB2とKRT16のCNV標的は、対照条件と比較して40~50%の細胞死を誘導した。したがって、SKBR3細胞の2つのCNVにおいて、Cas9タンパク質を使用した標的DNA切断の誘導によって、細胞死が誘導されたことが確認された。
図18Aに示されるのは、Adey, A. et al. (The haplotype-resolved genome and epigenome of the aneuploid HeLa cancer cell line. Nature 500, 207-211 (2013))からの、ヒーラーゲノムにおけるHPV複製遺伝子座マップである。紫はヒーラーを示し、緑はHPVを示す。FIGを示された。図18Bは、Meissner et al. (Nucleotide sequences and further characterization of human papillomavirus DNA present in the CaSki, SiHa and HeLa cervical carcinoma cell lines. J. Gen. Virol. 80, 1725-1733 (1999)), Landry et al. (The genomic and transcriptomic landscape of a HeLa cell line. G3:Genes|Genomes|Genetics 3, 1213-24 (2013)), Adey, and Liu et al. (Comprehensive mapping of the human papillomavirus (HPV) DNA integration sites in cervical carcinomas by HPV capture technology. Oncotarget 7, 5852-5864 (2016))から推論される、ヒーラー細胞中のHPV配列領域である。反復数がXとして標識され、開いている配列のみが矢印として標識される。図18Cに示されるのは、Meissner、Landry、AdeyとLiuに基づいた、ヒーラー細胞におけるHPV配列間の反復領域を示すPCR産物の電気泳動ゲルである。
HT29細胞を、24ウェルプレート中の1ウェル当たり1.5x105の細胞で蒔き、500ngのプラスミドを下記の表11に記載されるように各ウェルへと導入した。
図13に示されるH1563トランスフェクションと平行して、図22を実施した。H1563細胞を、24ウェルプレート中の1ウェル当たり1.5x105の細胞として蒔き、500ngのプラスミドを下記の表12に記載されるように各ウェルへと導入した。
トランスフェクションの1日前に、肺癌細胞株であるH1299細胞を、1.3×104で白い96ウェルプレートに蒔いた。その次の日、500ngのCas9タンパク質、および各CNV標的gRNAをコード化するDNAを、リポソームを使用して導入した。0.3μLのリポソーム試薬Iを、5μLのopti-MEMと混合して、管1を作成した。各実験条件で、0.2μLのリポソーム試薬IIを、5μLのopti-MEMおよび500ngのDNAと混合して、管2を作成した。管2を管1と混合し、室温で15分間インキュベートした。11μLのリポソームとDNAの混合物を96ウェルに加えた。3時間後に、AnnV試薬を加え、発光の程度をリポフェクションの24時間後に測定した。この方法は、アポトーシスが生じる際に、細胞外膜(outer cell membrane )に露出したPS(ホスファチジルセリン)部位にAnnVを加える場合の発光の程度に従って、アポトーシスの程度を測定する。その結果、H1299細胞の4つのCNVにおいてCas9タンパク質を使用することによって、標的DNA切断が誘導された際に、30%~40%の細胞死率が観察された。細胞膜をPSに露出して、アポトーシスを誘導した。図24は、各処置群についての細胞死を示す発光のグラフを示す。
突然変異体特異的ガイドRNAを有するCas9発現ベクター(PX459、Addgeneプラスミド#62988)を使用して、EGFR突然変異体肺癌ゲノムにおいて複数の切断を誘導した。Cas9-RecJタンパク質を発現するベクターをクローン化し、ここで、Cas9配列は、3’末端でヒトコドン最適化Rec J配列と隣接していた。肺腺癌細胞株であるHCC827を、Cas9/sgRNA発現ベクターの送達のために電気穿孔した。HCC827細胞は、そのEGFR遺伝子中にE2突然変異を有しており、特定のゲノムにおいて、突然変異配列の18を超えるコピーが存在する。ガイドRNAを、HCC827細胞株において18を超える遺伝子座を標的とするように設計した。RPMI-1640(10%のウシ胎仔血清)を使用して、細胞を、75Tフラスコにおいて面積の約50%を満たすまで増やし、トリプシン処理し、PBSで洗浄し、および、最後に、Neonエレクトロポレーション緩衝液Rにおいて再懸濁した。500ngのCas9/sgRNA発現を有する150,000の細胞を、10μLのNeonピペットチップに充填し、および、最適化された条件(1300V、20ミリセカンド、2パルス)で電気穿孔した。細胞を増殖培地において4日間回復させて、計数した。図25の下部は、各処置群における生細胞のグラフを示す。ベクターを用いず、または野生型のEGFR配列を標的とするベクターを用いて、または単一の遺伝子座を標的とするベクター(CCR5)を用いて電気穿孔された対照群と比較して、HCC827特異的突然変異を標的とするベクターを用いて電気穿孔された実験群は、細胞が有意に少なかった。EGFR_E2実験群において33%の細胞死が観察された。さらに、Cas9RecJタンパク質は、複数の切断の効果を増強しただけではなく、単一の遺伝子座標的化ガイドRNAに細胞死滅能力を与えたことも確認された。その結果は、Cas9および標的特異的ガイドRNAによる腺癌における複数の切断の誘導が、細胞増殖を減少させたことを示し、その効果は、ヒトコドン最適化Rec Jタンパク質で増強された。CCR5群において50%の細胞死を観察し、EGFR_E2群において80%の細胞死を観察した。Cas9-RecJ構築物を使用することで、対照と比較して、細胞死効率を5倍増大させた。
この実施例では、CRISPR-Cas9構築物を投与するための様々な送達方法を示す。
CNVおよびMT2を標的とするにより、HT-29(結腸癌細胞株)における特異的な死滅を分析すること。HT-29細胞を、エレクトロポレーションにより、500ngのCas9タンパク質、および個々のCNVの標的gRNAを発現するDNAで導入した。培養したHT-29細胞を、1XPBSで洗浄し、その後、トリプシン-EDTAで処理し、底部から取り除いた。必要な数の細胞を取り除き、1XPBSで1回洗浄した。細胞を、20μL/各条件で、Lonza SF緩衝液で再懸濁し、それを各DNAと混合した。細胞とDNAの混合物をLonza エレクトロポレータ内に置いて、電気ショックを受けさせた。ヒトゲノムに整列しないNT1(非標的)、および電気ショックのみの条件を、対照条件として加えた。電気ショックによるDNA導入後、各条件ごとに、細胞を96ウェルに挿入することを4回繰り返した。DNA導入の24時間後に、50μLのCellTiter Glo試薬を96ウェルに加えた。プレートをFLUOstar omega readerに置いて、2分間振盪させた。室温で10分間反応させた後に、発光を測定した。この方法は細胞中のATPの量に基づき、代謝を受ける生細胞の量は吸光度によって決定される。結果として、3つの対照条件と比較して、TRAPPC9およびヒトゲノム中の100を超える部位を標的とするMT2条件において、30%の細胞死が誘導された。加えて、図29に示されるように、3つのCNV標的であるCDK8、LINC00536、およびTRPS1は、20~45%の細胞死を誘導した。
Cas12a発現ベクターを、高いCNV突然変異配列(EGFR_E2)あるいは非CNV WT配列(CCR5)を標的とするcrRNAと共に使用した。HCC827ゲノムにおける>18の切断あるいは1つの二重切断のいずれかをそれぞれ誘導するように、crRNAを設計した。肺腺癌細胞株であるHCC827を、Cas12a/crRNA発現ベクターの送達のために電気穿孔した。HCC827はそのEGFR遺伝子中にE2突然変異を有しており、特定のゲノム内に突然変異配列の18を超えるコピーがある。使用したCas12a 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YQMTYVPDNIKNVGRQCGIIFYVPAAYTSKIDPTTGFINAFKRDVVSTNDAKENFLMKFDSIQYDIEKGLFKFSFDYKNFATHKLTLAKTKWDVYTNGTRIQNMKVEGHWLSMEVELTTKMKELLDDSHIPYEEGQNILDDLREMKDITTIVNGILEIFWLTVQLRNSRIDNPDYDRIISPVLNKNGEFFDSDEYNSYIDAQKAPLPIDADANGAFCIALKGMYTANQIKENWVEGEKLPADCLKIEHASWLAFMQGERGであった。EGFR_WT crRNA配列は、Ggagatgttgcttctcttaattccであり、CCR5 crRNA配列は、Tgcacagggtggaacaagatggatであり、EGFR_E2 crRNA配列は、Ggagatgtcttgatagcgacgggaであった。AsCpf1ハンドルは、Taatttctactcttgtagatであった。
Claims (14)
- 癌細胞中で細胞死を選択的に誘導する際に使用される薬剤の製造における、エンドヌクレアーゼ活性を有するCas9ドメインを含む第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を有するRecJドメインを含む第2のドメインとを含むキメラポリペプチド、および細胞中の標的核酸と相補的な配列を含むガイド核酸の使用であって、
前記誘導は、
a)配列特異的なエンドヌクレアーゼ活性を含む前記第1のドメインと、エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第2のドメインとを含む前記キメラポリペプチド、および細胞中の標的核酸と相補的な配列を含む前記ガイド核酸を、被験体に投与すること、および、
b)標的核酸を切断することであって、それによって、細胞死を誘導する、こと、を含む、使用。 - 前記標的核酸は疾患に関連付けられる、請求項1に記載の使用。
- 前記標的核酸は被験体の癌細胞中にある、請求項1に記載の使用。
- 前記標的核酸は被験体の正常細胞にはない、請求項1に記載の使用。
- 前記標的核酸は癌に関連する配列を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記標的核酸はRNAを含む、請求項1に記載の使用。
- 前記標的核酸はDNAを含む、請求項1に記載の使用。
- 前記標的核酸は染色体異常を含む領域内にある、請求項1に記載の使用。
- 前記染色体異常は、転座、欠失、重複、逆位、挿入、環、コピー数多型、インデル、および同腕染色体からなる群から選択される、請求項8に記載の使用。
- 前記切断することは、細胞中の1つ以上の切断部位での切断を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記癌は、肺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、または子宮頚癌を含む、請求項5に記載の使用。
- 前記標的核酸は、癌に関連する配列に特異的な一塩基多型を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記標的核酸は、BRCA-1、BRAF、BCR-ABL、HER2、KIF5A、IRX1、ADAMTS16、GNPDA2、KCNE2、SLC15A5、SMIM11、DACH2、HERC2P2、CD68SHBG、ERBB2、KRT16、LINC00536、TRPS1、CDK8、TRAPPC9、HERC2P2、SIRPB1、MRC1、ATP11A、POTEB、HERC2P2、PRDM9、CDKN2B、HPV、LINE2 (MT2)、CCR5、またはHPRT1からなる群から選択された遺伝子の一部を含む、請求項1に記載の使用。
- キメラポリペプチドは3’OHオーバーハングを生成する、請求項1に記載の使用。
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