ES2948559T3 - Un sistema, un dispositivo y un método para proporcionar una terapia o una cura para el cáncer y otros estados patológicos - Google Patents

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Abstract

Se proporciona un método para el tratamiento de patologías causadas por células que tienen secuencias de ADN que difieren del ADN de células humanas sanas. El método utiliza la orientación de las diferencias de secuencia y efectúa la escisión del ADN que no ocurre en el genoma sano, mediante lo cual las células que contienen el ADN objetivo se matan o inactivan. Los sistemas preferidos para efectuar dicho daño al ADN son los sistemas CRISPR en los que un CAS escinde el ADN adyacente a una secuencia reconocida por CRISPR. También se describen métodos y un sistema informático para diseñar y/o producir los ácidos nucleicos dirigidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Un sistema, un dispositivo y un método para proporcionar una terapia o una cura para el cáncer y otros estados patológicos
Campo técnico
La invención se refiere a una composición que permite la intervención terapéutica contra el cáncer, en donde la terapia implica la muerte de ciertas células específicamente definidas. La presente composición proporciona una terapia para cánceres.
Antecedentes
Millones de personas mueren de cáncer anualmente. Las terapias actuales de, por ejemplo, cirugía, quimioterapia y radioterapia son duras e inespecíficas y matan muchas células sanas, así como las células cancerosas que se pretende eliminar.
Se han intentado terapias personalizadas contra el cáncer, sin embargo, pocos de estas han demostrado ser efectivos contra "cualquier" cáncer, ya que cada cáncer se presenta de manera única para el individuo, cuando se tiene en cuenta que el cáncer tiene una etiología genética. Un cáncer en el órgano de un paciente puede comportarse, en términos generales, como un subconjunto de enfermedad completamente diferente en el mismo lugar en otro paciente.
Además, una serie de infecciones virales, así como infecciones con patógenos vivos, no tienen una terapia satisfactoria hoy en día debido a la resistencia a los medicamentos o debido a la falta de disponibilidad de antibióticos efectivos que no sean dañinos para los humanos al mismo tiempo.
Por lo tanto, existe la necesidad de un tratamiento del cáncer que se adapte al cáncer específico en relación con el individuo, y también existe la necesidad de terapias que puedan atacar específicamente las células infectadas con virus o células u organismos patógenos que son difíciles de atacar con los antibióticos existentes.
Varios estudios sugieren la edición de genes en la terapia del cáncer, por ejemplo, en el descubrimiento de objetivos de fármacos contra el cáncer mediante la detección de dominios de proteínas CRISPR-Cas9 (Shi et al, Nature Biotechnology 2015), mediante la creación de nuevos modelos animales de cáncer (Mou et al. Genome Medicine 2015), al convertir genes conocidos relacionados con el cáncer y convertirlos en variantes saludables utilizando vectores virales, mediante el uso de CRISPR-Cas9 en la ingeniería de inmunoterapia CAR-T (inmunoterapia de células T con receptor de antígeno quimérico) y mediante el uso de CRISPR-Cas9 para integrar un gen de timidina quinasa en un punto de ruptura específico del genoma de la célula cancerosa y someter las células a ganciclovir para neutralizar el cáncer (documento WO2015/103057).
En la técnica conocida, la terapia génica para el tratamiento de un cáncer se utiliza para protocolos de terapia génica in situ, en los que se utilizan vectores virales para transducir genes específicos que generan aumento de la inmunidad sistémica al cáncer, por ejemplo, en terapia génica inmunomoduladora in situ del cáncer de próstata (La et al., Clin Med Res. septiembre de 2006; 4(3): 218-227). La inmunoterapia con células CAR-T está forjada con los riesgos asociados a la inmunoterapia y aún presenta riesgos e incertidumbre para el paciente, por ejemplo, trastornos autoinmunes, efectos secundarios de la inmunomodulación y la muerte.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en la comprensión inicial del inventor de que las secuencias genómicas rápidas y fiables de última generación y, en consecuencia, la identificación de secuencias de ácidos nucleicos que son exclusivas de las células (como las células cancerosas, las células infectadas por virus y las células de organismos patógenos ) cuando se compara con células sanas en un individuo puede utilizarse para diseñar vectores de expresión que codifican moléculas efectoras y de reconocimiento para permitir la destrucción o neutralización selectiva de dichas células.
Según los hallazgos del Proyecto Genoma del Cáncer, la mayoría de las células cancerosas poseen 60 o más mutaciones. El desafío ha sido identificar cuáles de estas mutaciones son responsables de tipos particulares de cáncer, ya que las mutaciones varían interpersonalmente, pero la gran mayoría de tales mutaciones son, sin embargo, únicas para las células cancerosas y, por lo tanto, pueden distinguir estas células cuando se dirigen a ellas para una terapia específica. En cuanto a bacterias y virus, el problema de identificar secuencias únicas para la orientación es un problema menor, pero, por supuesto, es de gran relevancia garantizar que la orientación de una secuencia viral o bacteriana específica no conduzca a efectos no deseados fuera del objetivo.
Si una molécula de reconocimiento con una fiabilidad/fidelidad muy alta es capaz de distinguir una secuencia de ácido nucleico de una célula cancerosa en un individuo de cualquier secuencia de ácido nucleico de una célula normal en el mismo individuo, y si dicho reconocimiento específico puede utilizarse para desencadenar la destrucción o neutralización del "ácido nucleico del cáncer", entonces, las etapas para proporcionar un tratamiento efector contra el cáncer en un individuo se pueden dividir en las siguientes etapas simples:
1) identificación y verificación de la(s) secuencia(s) de ácido nucleico que aparece(n) en las células cancerosas pero no en las células sanas o al menos solo en una población insignificante de células sanas, dicha secuencia identificada se denomina en el presente documento "secuencia NA del cáncer ";
2) construcción de al menos un vector de expresión, que codifica una secuencia de reconocimiento que es complementaria a la secuencia NA del cáncer y también codifica al menos una molécula efectora, que es capaz de destruir o neutralizar los ácidos nucleicos que comprenden la secuencia NA del cáncer;
3) administración del vector o vectores de expresión al paciente que alberga el cáncer para efectuar la destrucción o neutralización dirigida de los ácidos nucleicos que comprenden la secuencia NA del cáncer. A su vez, esto ayudará en la destrucción o neutralización de las células cancerosas.
Dado que el alto número de mutaciones presentes en las células cancerosas en comparación con las células normales proporciona múltiples objetivos para las secuencias de reconocimiento, el efecto que se logra al destruir o neutralizar los ácidos nucleicos es equivalente a las múltiples alteraciones del ADN que ocurren al tratar las células cancerosas con radioterapia; sin embargo, cuando la radioterapia también causa la destrucción del ADN en las células normales (y por lo tanto de las células normales), el enfoque de dirigir a secuencias de ácido nucleico que son específicas para el cáncer evitará efectos fuera del objetivo.
El inventor también se dio cuenta de que se puede usar exactamente el mismo principio en el tratamiento de cualquier tipo de enfermedad en la que un patógeno, ya sea una célula infectada por un virus, una bacteria, o un parásito, es el agente causante de la enfermedad y comprende secuencias de ácido nucleico que son distintas de cualquier secuencia de ácido nucleico en el individuo infectado. Una secuencia distinta de este tipo se denomina secuencia NA patógena en el presente documento. La construcción y administración al individuo de vectores de expresión apropiados que codifiquen una secuencia de reconocimiento complementaria a la secuencia de NA del patógeno y codifiquen una molécula efectora capaz de destruir o neutralizar los ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de NA del cáncer podrán erradicar las células que comprenden los ácidos nucleicos diana.
Por lo tanto, la invención proporciona tratamientos basados en ingeniería genética personalizados que pueden tratar un cáncer, así como tratamientos de ingeniería genética que se dirigen a células infectadas por virus o agentes infecciosos patógenos.
En términos amplios, se proporciona un sistema, que no es parte de la presente invención, configurado para
- interactuar con material del paciente, o datos de dicho material, en un patrón de reacción predefinido - proporcionar un diseño o sintetizar material biológico terapéutico modificado genéticamente
- seguir un patrón de reacción predefinido basado en medios informáticos configurados para
- recibir entrada de estados biológicos de la(s) muestra(s), o datos de la(s) muestra(s), tomados tanto de material relacionado con la enfermedad como de material sano muestreado del mismo paciente, a continuación datos de genoma, transcriptoma, proteoma, expresión génica, metaboloma y epigenoma, y a
- generar datos para diseño(s) y/o secuencia(s) para material biológico y/o sintetizar material biológico según un patrón predefinido que, según los datos muestreados del paciente, está configurado para ser dañino para los estados biológicos del material relacionado con la enfermedad y no dañino para el material sano.
Un primer aspecto se refiere a un método, que no es parte de la presente invención, para el tratamiento de una enfermedad en un animal, tal como un ser humano, comprendiendo el método la inducción de la destrucción preferente de células que comprenden al menos una secuencia de ADN, que no está presente o no está presente en cantidades significativas en células sanas de dicho animal, administrando
1) una cantidad efectiva de al menos un vector de expresión, en donde cada uno de dichos al menos un vector(es) de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una de dicha(s) al menos una secuencia(s) de ADN, y que comprende(n) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que interrumpe selectivamente el ADN que comprende dicha al menos una secuencia de ADN cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o 2) una cantidad efectiva de al menos un primer vector de expresión, en donde cada uno de dichos al menos un vector(es) de expresión comprende(n) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una de dichas al menos una secuencia(s) de ADN, y una cantidad eficaz de al menos una segundo vector de expresión, que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que interrumpe selectivamente el ADN que comprende dicha al menos una secuencia de ADN cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o
3) una cantidad efectiva de al menos una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una de dicha(s) secuencia(s) de ADN y una cantidad efectiva de al menos una molécula que interrumpe selectivamente el ADN que comprende dicha al menos una secuencia de ADN cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o
4) una cantidad efectiva de al menos un vector de expresión, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una de dicha(s) secuencia(s) de ADN y una cantidad eficaz de al menos una segunda molécula que interrumpe selectivamente el ADN que comprende dicha al menos una secuencia de ADN cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o 5) una cantidad efectiva de al menos una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una de dichas al menos una secuencia(s) de ADN y una cantidad efectiva de al menos un vector de expresión, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que interrumpe selectivamente el ADN que comprende dicha al menos una secuencia de ADN cuando se une a dicha molécula de reconocimiento,
en donde la administración de dichos vectores y/o moléculas definidas en cualquiera de 1-5 da como resultado la interrupción de las moléculas de ácido nucleico que comprenden dicha al menos una secuencia de ADN hasta tal punto que dichas células mueren o se neutralizan.
Un segundo aspecto se refiere a un método, que no es parte de la presente invención, para diseñar y opcionalmente preparar un medio terapéutico para el tratamiento de una enfermedad en un animal tal como un ser humano, que comprende
a) secuenciar el ADN de una célula o grupo de células, en donde dicha célula o grupo de células es/son de tejido maligno, células infectadas por virus y células de un organismo patógeno,
b) comparar posteriormente la información de la secuencia de ADN obtenida en la etapa a con la información de la secuencia de ADN de células sanas de dicho animal o de un genoma sano completamente secuenciado de la especie de dicho animal,
c) identificar secuencias de ADN de la célula o grupo de células, donde dichas secuencias de ADN no aparecen en las células sanas de dicho animal, y
d) diseñar y opcionalmente preparar un medio terapéutico, que comprende al menos uno de los siguientes
1) un vector de expresión, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c, y que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que interrumpe selectivamente dicha al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o 2) un primer vector de expresión, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que reconoce específicamente al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c y un segundo vector de expresión, que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que interrumpe selectivamente dicha al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o
3) una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c, y un vector de expresión, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que interrumpe selectivamente dicha al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o
4) un vector de expresión, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c y una molécula que interrumpe selectivamente dicha al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o
5) una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c y una molécula que interrumpe selectivamente dicha al menos una secuencia de ADN identificada en la etapa c cuando se une a dicha molécula de reconocimiento.
Un tercer aspecto se refiere a un ordenador o sistema informático, que no es parte de la presente invención, para diseñar y opcionalmente preparar un medio terapéutico como se describe en el presente documento, que comprende i) una primera memoria de ordenador o segmento de memoria que comprende datos de secuencia de ADN de células sanas de un animal o de un genoma sano completamente secuenciado de la especie de dicho animal,
ii) una segunda memoria de ordenador o segmento de memoria que comprende datos de secuencia de ADN de células relacionadas con patologías,
iii) código ejecutable adaptado para comparar datos de secuencias de ADN de la segunda memoria del ordenador con el conjunto completo de datos de secuencias de ADN en la primera memoria e identificar secuencias de ADN de la segunda memoria de la computadora que no aparecen en los datos de secuencias de ADN en la primera memoria de la computadora,
iv) una tercera memoria de ordenador o segmento de memoria que está adaptada para comprender datos de secuencias de ADN, o punteros a datos de secuencias de ADN, identificados por el ordenador definido en iii, y v) código ejecutable adaptado para diseñar vectores de expresión basados en 1) datos de secuencia de ADN almacenados o señalados en la tercera memoria de computadora o segmento de memoria, y 2) datos de secuencia para ácidos nucleicos que codifican moléculas efectoras, y opcionalmente
vi) un sintetizador de ácidos nucleicos adaptado para sintetizar secuencias de ADN diseñadas por el código ejecutable en v.
Leyendas de la figura
La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra el algoritmo de búsqueda y diseño descrito en detalle en el Ejemplo 1.
Divulgación detallada
Moléculas de reconocimiento y moléculas efectoras
En gran parte de la discusión y divulgación de la presente invención, la atención se centra en la identificación de ácidos nucleicos distintivos derivados de células cancerosas/malignas. Sin embargo, como se entenderá, la presente invención se basa principalmente en el hallazgo de que las tecnologías actuales de edición del genoma, como el sistema CRISPR-Cas-9, brindan la posibilidad de seleccionar y editar específicamente cualquier secuencia de ácido nucleico de elección. Véase, por ejemplo, el documento WO 2015/089465, que se refiere al tratamiento de la infección por VHB mediante la edición del genoma de las células infectadas por VHB y Hsin-Kai Liao et al, Nature Communications 6, Artículo n.° 6413, que se refiere a una defensa editada genéticamente contra la infección por VIH.
Como se describe en el ejemplo, es posible buscar en el genoma de las células malignas secuencias que puedan ser el objetivo de una molécula de reconocimiento y garantizar que no se dirijan células sanas (normales). De hecho, se prefiere que el método del primer aspecto resulte en la destrucción y neutralización de células malignas en un paciente con cáncer, y también se prefiere que la molécula de reconocimiento utilizada en el método no reconozca el ADN autólogo del animal en células sanas (normales).
Los sistemas CRISPR tienen una facilidad insuperable para dirigir las proteínas asociadas a CRISPR (Cas) (como Cas9 y cualquiera de las otras moléculas efectoras discutidas en el contexto de CRISPR en el presente documento) a múltiples objetivos genéticos al proporcionar secuencias de ARN guía complementarias a los sitios objetivo. Los sitios de destino para los sistemas CRISPR/Cas9 se pueden encontrar cerca de la mayoría de los loci genómicos; el único requisito es que la secuencia objetivo, que coincide con la cadena guía de ARN, va seguida de una secuencia de motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Para Streptococcus pyogenes (Sp) Cas9, esta es cualquier nucleótido seguido de un par de guaninas (NGG). Sin embargo, Francisella novicida Cas9 se ha diseñado para reconocer PAM YG (cualquier pirimidina seguida de guanina), y Cpf1 de Francisella novicida reconoce PAM TTN o YTN.
Por lo tanto, se prefiere que la molécula de reconocimiento sea un ácido nucleico, que reconozca dicha al menos una secuencia de a Dn , a la que se apunta, mediante apareamiento de bases. Normalmente, la molécula de reconocimiento es un ARNcr y la molécula que interrumpe selectivamente dicha al menos una secuencia de ADN al unirse a dicha molécula de reconocimiento es una proteína asociada a CRISPR (Cas), es decir, una nucleasa. Esta Cas puede ser cualquier Cas adecuada, pero puede ser, por ejemplo, cas9, eSpCas9, SpCas9-HF y Cpfl.
La selección de los sitios objetivo y la elección del sistema CRISPR para la terapia pueden optimizarse aún más al priorizar los objetivos a través de un marcador de actividad predictiva del sitio objetivo del sistema CRISPR y del sitio o sitios fuera del objetivo, tal como, por ejemplo, el SgRNA Scorer 1.0 puesto a disposición por la Universidad de Harvard.
Si bien se prefiere de acuerdo con la presente invención que las células que son el objetivo de una secuencia de reconocimiento se dañen letalmente debido a la ruptura de múltiples moléculas de ADN, la terapia será eficaz incluso en el caso de que las células diana sean simplemente "neutralizadas".
Al utilizar sistemas CRISPR para el reconocimiento específico de secuencias de ADN divergentes en células malignas, la fidelidad del reconocimiento puede incrementarse empleando secuencias de reconocimiento que incluyen modificación en la columna vertebral de la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, la estabilidad del dúplex entre una secuencia de reconocimiento y su ADN diana puede mejorarse usando secuencias de reconocimiento que incluyen nucleótidos modificados. Un ejemplo son los ácidos nucleicos bloqueados (LNA); los oligonucleótidos modificados con LNA (una modificación de ribosa) pueden formar dúplex estables entre secuencias nucleicas complementarias relativamente cortas y de esta manera se puede asegurar que se minimiza el riesgo de efectos fuera del objetivo. Otras posibilidades son el uso de variantes del esqueleto de fosfato, tal como modificaciones de enlaces internucleotídicos de fosfodiéster y fosforotioato, variantes de ribosa, tal como LNA, 2'OMe, ARN 2'-fluoro (2'F) y 2'MOE; y variantes de estructuras principales sin ribosa tales como PMO y PNA.
Dichos enfoques requerirán que la secuencia de reconocimiento se proporcione mediante administración directa porque los ácidos nucleicos modificados no son productos de expresión.
En realizaciones preferidas de la invención, el o los diseños y/o la o las secuencias de sistemas CRISPR incluyen, aunque no de forma limitativa, sistema(s) CRISPR-Cas9, sistema(s) CRISPR-eSpCas9 y sistema(s) SpCas9-HF y sistema(s) CRISPR-Cpf1, como alternativa, recombinación homóloga, ARN de interferencia (ARNi), nucleasas de dedo de cinc (ZFN), activador de la transcripción como nucleasas efectoras (TALEN) y otras formas futuras de hacer preciso, cambios específicos en el genoma. Esto significa que la molécula efectora (nucleasa), por ejemplo, puede seleccionarse entre Cas9, eSpCas9, SpCas9-HF y Cpf1. Dado que varios de estos ejercen efectos fuera del objetivo mínimos, el perfil de seguridad de la presente invención se basa predominantemente en la identificación correcta de secuencias de ADN únicas que no se encuentran en las células normales.
Una característica atractiva de la presente invención es que puede probarse in vitro antes de someter al paciente al tratamiento aumentando así aún más la seguridad. Cuando se ha diseñado una selección de secuencias de reconocimiento, pueden administrarse a células cancerosas aisladas del paciente ya células normales aisladas del paciente, solo en el caso de que el efecto de alteración del ADN se limite sustancialmente a las células cancerosas debe invocarse la terapia en el paciente. Este enfoque es particularmente relevante en aquellas realizaciones descritas en el presente documento donde el ADN de las células cancerosas se compara con un genoma sano estándar; como medida de seguridad, este enfoque garantiza que las células normales de los pacientes no incluirán por casualidad uno o más de los objetivos de ADN que se cree que son específicos para el cáncer.
Así, en una realización de la invención implica que antes de la administración in vivo de la terapia personalizada sintetizada, se prueba la terapia, optimizada y validada in vitro sobre células sanas y células enfermas. El resultado esperado se mide mediante un mapeo de roturas de doble cadena de ADN con resolución de nucleótidos, como por ejemplo el marcaje directo de roturas in situ, enriquecimiento en estreptavidina y secuenciación de próxima generación (BLESS). De manera alternativa, se puede determinar la supervivencia celular simple in vitro.
Existen algoritmos de búsqueda bioinformática en la técnica conocida que, cuando se les suministra un gen o un genoma completo, pueden encontrar todos los segmentos posibles de 20 bases ubicados cerca de un PAM, los clasifica en función de su singularidad en el genoma y otros parámetros y genera una lista de ARN guía que lo lleve allí, tal como, por ejemplo, CHOPCHOP de la Universidad de Harvard o CRISPRscan de la Universidad de Yale. En el presente contexto, por lo tanto, la discusión sobre el ADN derivado de células malignas en un paciente puede aplicarse igualmente al ADN derivado de cualquier patógeno o célula involucrada en una patología, siempre que dicho ADN no sea idéntico al ADN que se encuentra en las células sanas del individuo a tratar. Esencialmente, solo es necesario cambiar la elección de la molécula de reconocimiento (por ejemplo, su secuencia de ácido nucleico) cuando se desea apuntar a un ADN particular de un cáncer u otra célula relacionada con la patología; además, la elección de los medios para asegurar la entrada de la molécula de reconocimiento en la célula diana normalmente tendrá que optimizarse para la célula diana particular. Para concluir sobre esto, toda la divulgación en la presente solicitud que se relaciona con el diseño de la molécula de reconocimiento en el contexto del cáncer puede emplearse de manera análoga para otras patologías.
En una realización de la invención, los diseños y/o secuencias proporcionados se utilizan en la síntesis de los sistemas CRISPR, como alternativa, recombinación homóloga, ARN de interferencia (ARNi), nucleasas de dedo de cinc (ZFN), activador de la transcripción como nucleasas efectoras (TALEN) y otras formas futuras de hacer preciso, cambios específicos en el genoma. El sistema preferido actualmente es un sistema CRISPR-Cas9, que hoy se ha convertido en un sistema versátil para la edición de genes de genomas eucariotas (incluidos los humanos).
Si utiliza un sistema CRISPR-Cas9, el único otro requisito previo es que la secuencia que se va a escindir de acuerdo con la invención esté seguida corriente abajo o corriente arriba por una secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM) (tal como 5-NGG-3').
Como resultará evidente a partir de las reivindicaciones, el tratamiento de la invención puede tomar muchas formas prácticas y simplemente tiene que asegurar que la célula diana al mismo tiempo 1) alberga una molécula de reconocimiento (como al menos un CRISPR que tiene una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia de NA de cáncer o una secuencia NA del patógeno) y una molécula efectora (como Cas9). Ambas moléculas pueden estar codificadas por un mismo vector de expresión, pueden estar codificadas por vectores de expresión separados, o solo una está codificada por un vector de expresión mientras que la otra molécula se administra directamente, o ambas pueden administrarse directamente.
Los vectores de expresión preferidos son adenovirus, virus adenoasociados, o lentivirus, pero puede utilizarse cualquier formato de vector que pueda proporcionar la presencia celular de las moléculas efectoras y de reconocimiento. Por lo tanto, los métodos generalmente aplicados en terapia génica para efectuar la transfección en células diana son prácticos según la presente invención. Por ejemplo, si usa más tiempo, ácidos nucleicos opcionalmente modificados que no se introducen en un vector viral sino como plásmidos, de acuerdo con la invención, es atractivo formularlos de modo que sean captados por las células diana; las formulaciones de liposomas constituyen una posibilidad, pero los ácidos nucleicos también se pueden modificar directamente, por ejemplo, uniéndose a lípidos como el colesterol.
Como se entenderá, los sistemas CRISPR-Cas9 preferidos normalmente se usan como herramientas de edición de genes en lugar de simplemente introducir rupturas en el ADN objetivo. Sin embargo, tanto la edición de genes como los enfoques de ruptura de genes son útiles cuando se destruyen células de acuerdo con la presente invención.
Por "neutralización" se entiende que una célula se inactiva debido al daño de su ADN, al menos en la medida en que no pueda proliferar (en los cánceres esto significará que el crecimiento del cáncer se interrumpe) y/o que no pueda replicar su genoma. Otras posibilidades son que las células se vuelvan más inmunogénicas debido a la aparición de productos de expresión inmunogénicos y, por lo tanto, se vuelvan inactivas/destruyan como consecuencia de una reacción inmune. También es posible que el daño en el ADN induzca al menos una reversión parcial a un fenotipo benigno, lo que significa que las células pierden su capacidad para hacer metástasis o su capacidad para invadir el tejido. Por último, las células también pueden volverse generalmente más sensibles a otras terapias contra el cáncer con las que se pueden combinar los principios de la presente invención. Sin embargo, se prefiere que las células diana mueran como consecuencia de la alteración del ADN inducida.
En una de las realizaciones más simples, el método de terapia que no forma parte de la invención utiliza una o más moléculas de reconocimiento (como CRISPR) que han sido diseñadas para apuntar a tantos cromosomas importantes en la célula objetivo como sea posible. La introducción de un número suficiente de rupturas en el ADN cromosómico tendrá como efecto que la célula posteriormente no sea viable; como se ha detallado anteriormente, el efecto sobre las células objetivo es equivalente al efecto de la radioterapia.
Además, pueden introducirse mutaciones de cambio de marco de forma específica del sitio, por ejemplo utilizando un sistema CRISPR-Cas9 o similar diseñado correctamente. Un cambio de marco es una mutación genética causada por indeles (inserciones o eliminaciones) de una cantidad de nucleótidos en una secuencia de ADN que no es divisible por tres. Debido a la naturaleza triplete de la expresión génica por codones, la inserción o deleción puede cambiar el marco de lectura (la agrupación de los codones), dando como resultado un producto de expresión de proteína completamente diferente en comparación con el del gen no mutado. Cuanto antes en la secuencia se produzca la eliminación o la inserción, más alterada estará la proteína.
Si se produce un cambio de marco indel en una o más proteínas vitales de la célula diana y se inhiben los mecanismos de reparación, como es el caso del cáncer, el cambio de marco es incompatible con la vida continua de la célula. Una mutación de cambio de marco no es lo mismo que un polimorfismo de un solo nucleótido en el que se reemplaza un nucleótido, en lugar de insertarlo o eliminarlo.
Este enfoque es otra forma en la que un organismo podría ser alterado.
Si se orientan varios sitios al mismo tiempo, por ejemplo, para cortar una parte más grande del genoma del organismo, como es el caso cuando se hace ingeniería de ADN recombinante, podría inducirse un impacto mayor a través de los daños antes mencionados.
Otra forma en que se puede matar una célula es mediante la introducción de una o varias mutaciones que introducen codones de parada ("UAA", "UGA" o "UAG") en la secuencia. El polipéptido que se crea podría ser anormalmente corto o anormalmente largo, y lo más probable es que no sea funcional.
En realizaciones interesantes se utilizan sistemas Crispr-Cas9 o sistemas similares, que insertan un gen de muerte o un mecanismo de muerte en las células diana, para matar efectivamente el cáncer más rápido.
Un enfoque más simple se basa en la introducción de una o varias alteraciones del genoma de las células diana, para interferir generalmente con el metabolismo de la célula.
En otra realización de la invención, los sistemas Crispr-Cas9 o similares utilizados eliminan uno o varios pares de bases del genoma de la célula diana, para perturbar el metabolismo de la célula.
En otra realización que no forma parte de la invención, los sistemas Crispr-Cas9 o similares modifican o insertan uno o varios genes en el genoma de la célula diana, para poder detectar visual o electromagnéticamente las células cancerosas desde la perspectiva de un procedimiento quirúrgico, por ejemplo, a través de un colorante fluorescente. En otra realización, el o los sistemas Crispr-Cas9 están configurados para producir un polimorfismo de un solo nucleótido en el que se reemplaza un nucleótido, en lugar de insertarlo o eliminarlo.
En otra realización, varios sitios están orientados al mismo tiempo, por ejemplo, para cortar una parte más grande del genoma del organismo, como es el caso cuando se hace ingeniería de ADN recombinante que es perjudicial, podría inducirse un impacto mayor a través de los daños antes mencionados.
En otra realización que no forma parte de la invención, el(los) sistema(s) crispr-Cas9 está(n) configurado(s) para introducir una o varias mutaciones que introducen codones de terminación ("UAA", "UGA" o "UAG") en la secuencia de las células cancerosas.
Como se desprende de las reivindicaciones, el método de terapia que no forma parte de la invención encuentra un amplio uso siempre que el material genético que no está presente en las propias células sanas del individuo tratado esté realmente presente en las células relacionadas con la patología. Además de los cánceres, infecciones bacterianas "difíciles" y de otro tipo, como por ejemplo tuberculosis o la orientación específica de bacterias u otros organismos patógenos que han desarrollado resistencia a los medicamentos o que son notoriamente difíciles de controlar/erradicar.
Ciertas infecciones no tienen una cura efectiva actual: paludismo y una serie de otras enfermedades parasitarias (la esquistosomiasis y las infecciones por Echinococcus multilocularis son ejemplos), y también una serie de enfermedades víricas.
Con respecto a las enfermedades virales, será posible apuntar solo a esas células en un individuo, que comprenden ADN derivado del virus (en aquellos casos en los que el virus utiliza la maquinaria bioquímica de una célula infectada para producir proteínas virales a partir del ADN). Dado que la defensa inmunológica normal contra tales infecciones virales es la inducción de la muerte de las células infectadas, el enfoque actualmente divulgado es simplemente uno que logra el mismo resultado final de una manera diferente. Los objetivos interesantes serían la infección por VIH, así como VHB y VHC.
Cuando se trata de otras infecciones, la identificación del ADN objetivo es más o menos trivial debido a las grandes diferencias entre las secuencias de ADN humano y las secuencias que se encuentran en bacterias, hongos y parásitos. En esos casos, la tarea principal es seleccionar un medio optimizado para efectuar la introducción de las moléculas efectoras y de reconocimiento en las células diana, en el caso de las bacterias, el fago se puede utilizar como vector, mientras que otros medios, por ejemplo, un micovirus o un virus nematodo, pueden ser útiles para introducir vectores de expresión en hongos y parásitos.
Una realización separada del primer aspecto de la invención integra el (los) principio (s) activo (s) en un depósito preventivo o terapéutico, es decir, "una vacuna", en forma de una inyección, parche, gránulo o implante que dispone una dosis continua del principio o principios activos en un tejido, compartimiento de líquido o vaso sanguíneo del animal tratado, ya sea de forma preventiva antes de que se haya adquirido una enfermedad o después del diagnóstico. Esta realización implica el uso de tecnología de última generación para depositar un fármaco y garantizar una liberación sostenida.
Método y medios para identificar y preparar medios terapéuticos
En realizaciones preferidas, el método del segundo aspecto, así como los medios informáticos que no forman parte de la invención, tanto los genomas cancerosos como los patógenos se comparan con los genomas sanos para encontrar áreas en las secuencias que difieren de tal manera que las diferencias puedan dirigir la diseño de la parte de ARN de un Crispr-Cas9, de forma que ataca selectivamente a las células cancerosas o patológicas y no a las células sanas. Este diseño de la secuencia de dicho ARN se puede lograr agregando una o múltiples muestras de una o múltiples células sanas y de una o múltiples células cancerosas, para garantizar que el genoma sea altamente representativo del genoma sano y para garantizar que la(s) diferencia(s) sea(n) altamente representativa(s) del genoma del cáncer. Potencialmente también que la(s) diferencia(s) están presentes en múltiples generaciones del cáncer, para aparecer en la mayoría de las células cancerosas. Esto se debe a la posibilidad de que ocurran mutaciones rápidas.
Por lo tanto, el método del segundo aspecto y los medios informáticos están configurados para utilizar los diseños y/o secuencias proporcionados en la síntesis de los sistemas CRISPR-Cas9 (como los que se detallan en el presente documento), como alternativa, recombinación homóloga, ARN de interferencia (ARNi), nucleasas de dedo de zinc (ZFN) y nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) para hacer cambios precisos específicos en el genoma.
En general, en el método donde se identifican secuencias útiles para el objetivo, es importante tener acceso a toda la información de la secuencia de las células normales del individuo que se va a tratar. Sin embargo, se puede prescindir de esto; en su lugar, se puede utilizar un genoma ya secuenciado (sano), aunque esto es un poco menos seguro debido al riesgo de que el individuo a tratar pueda comprender secuencias en común con las secuencias de la enfermedad, mientras que este no es el caso para el genoma ya secuenciado. Sin embargo, como se indica en el presente documento, es posible realizar una evaluación de seguridad inicial in vitro sometiendo células malignas y células sanas del individuo a tratar a la combinación del reconocimiento y la molécula que interrumpe la secuencia de ADN diana cuando se une a la molécula de reconocimiento.
Cuando comienza la secuenciación del ADN celular relacionado con la enfermedad, puede requerir más o menos tiempo antes de que se secuencie todo el genoma, pero durante el proceso pueden identificarse continuamente secuencias diana útiles, quizás incluso en un momento muy temprano. Cada vez que se identifica una secuencia, se añade a una lista de posibles secuencias diana que pueden clasificarse y reclasificarse con referencia a secuencias ya incluidas y secuencias que se incluyen continuamente: los criterios utilizados para clasificar las secuencias incluyen una evaluación de la presencia de PAM, presencia de la secuencia en cromosomas vitales, etc., véase a continuación.
También puede ser conveniente comparar las secuencias de ADN del cáncer con uno o más genomas normales completamente secuenciados y buscar diferencias frente a genes altamente conservados en los genomas secuenciados previamente.
Además, ya se conoce una lista de aproximadamente 200 mutaciones genéticas "comunes" que están relacionadas y son específicas de varios tipos de cáncer. Si tal mutación se identifica como parte del proceso de identificación, tales secuencias, por regla general, se clasificarán en un nivel superior para la preparación posterior de los medios terapéuticos cuando el objetivo sea un cáncer, en primer lugar porque ya se sabe que estas secuencias son específicas del cáncer y la inclusión de una secuencia de reconocimiento que se dirige a tal secuencia específica de cáncer será una elección segura.
En una realización de la invención, la salida del sistema se integra en un adenovirus (es decir, un virus adenoasociado) o lentivirus como vector de tratamiento.
En una realización de la invención, los medios informáticos están configurados para buscar y detectar secuencias en el genoma del cáncer que difieren del genoma sano con 1-20 nucleótidos en la misma ubicación entre los genomas, y configurados para encontrar dichos sitios que se siguen corriente abajo o corriente arriba, por la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) (5-NGG-3'). El sistema está configurado para, en caso de encontrar múltiples de dichos sitios, clasificar los hallazgos en función de los que tienen la mayor cantidad de diferencias y, alternativamente, en función de una base de datos de conocimiento de la importancia de los genes en cuestión. El sistema está configurado para al menos uno de los siguientes: 1) Clasificar los hallazgos más altos con la mayor diferencia entre los sanos y los cancerosos/relacionados con patógenos 2) Clasifique los hallazgos más altos cuyo uso se sabe que tiene el mayor impacto según la base de datos de conocimiento predefinida. 3) Ser capaz de presentar la ubicación de estos hallazgos. 4) Generar un diseño y/o sintetizar un tratamiento basado en estos hallazgos reflejando el hallazgo en una secuencia de ARN, que cuando se sintetiza es la receta de una unidad que se puede incluir en un sistema Crispr-Cas9, que se dirigirá específicamente a las células cancerosas y no a las células sanas. 5) Producir varias salidas, tales como varios sistemas Crispr-Cas9, que atacan varios puntos diferentes dentro del material canceroso objetivo, por ejemplo, múltiples puntos del genoma del cáncer, con la intención de alterar una mayor parte del material canceroso. En el caso de atacar varios puntos a la vez en una célula cancerosa, la intención es cortar una parte más grande del genoma para causar más daño.
En una realización de la invención, la entrada genética está configurada para utilizar una técnica de biopsia líquida para extraer el material genético del cáncer de una muestra de sangre del paciente.
En otra realización de la invención, el medio informático toma esta base de datos de diferencias entre los genomas e identifica las diferencias que incluyen un sitio PAM, están adyacentes o en las proximidades de un sitio PAM, por ejemplo, diferencias entre dos genomas que están de 1-20 nucleótidos de distancia de un sitio PAM. Esencialmente, incluso algunos desajustes entre una secuencia de ADN normal y una que se encuentra en un cáncer pueden utilizarse como diana. En realizaciones particularmente interesantes donde se identifica un desajuste más largo, se pueden diseñar múltiples secuencias de reconocimiento parcialmente superpuestas para permitir una multitud de posibles rupturas en el ADN de una célula cancerosa.
En una realización, la máquina puede recibir una o más muestras de células sanas y una o más muestras de células enfermas para asegurar la identificación de un sitio que tiene una alta probabilidad de representar un segmento de ADN enfermo que es representativo de diferentes generaciones de células enfermas.
Para mejorar los tratamientos contra el cáncer existentes y habilitar un vector seguro con alta especificidad solo para el cáncer, se proporciona un sistema que no es parte de la invención que puede agregar varias muestras de datos con respecto al material canceroso y no canceroso, para aumentar el nivel de seguridad y la especificidad con respecto a la probabilidad de lo que representan los datos para los tipos de materiales respectivos.
Debido a la configuración y los medios informáticos, el sistema permite un tratamiento del cáncer altamente específico, que tienen en cuenta las especificaciones de las células sanas del paciente y la configuración de las células cancerosas del paciente.
En una realización de la invención, el medio informático está configurado para leer documentos digitales que contienen al menos datos genómicos y generar documentos digitales que contienen al menos datos genómicos.
Debido a los medios informáticos del sistema y la capacidad de recibir e interpretar datos del paciente, el dispositivo puede permitir un tratamiento del cáncer que tenga en cuenta el genoma de las especificaciones reales del cáncer del individuo, en el diseño del tratamiento dirigido por ingeniería genética.
En otra realización, el sistema informático que no forma parte de la invención está configurado de manera que genere por sí mismo la información que define el vector de tratamiento y su diseño en función del genoma del paciente individual; esto simplemente requiere que la computadora esté preprogramada con la información de secuencia para uno o más vectores de expresión en los que se pueden insertar las secuencias que codifican moléculas de reconocimiento y moléculas efectoras. Opcionalmente, el sistema informático se puede vincular o entregar entrada de síntesis a un sintetizador de ácido nucleico, que puede producir los vectores de expresión útiles en la invención.
El dispositivo facilita un procedimiento seguro en el que una computadora interactúa no solo con los datos del paciente, pero también una base de datos de conocimiento sobre estrategias óptimas para dañar las células cancerosas.
En una realización, la base de datos incluye la siguiente información e información sobre sitios genéticos que se sabe que son universales en humanos y sus productos genéticos.
Como se desprende de las reivindicaciones, el sistema informático descrito actualmente y el método relacionado son útiles en métodos para proporcionar una terapia o una cura para el cáncer, comprendiendo dicho(s) método(s) interactuar con material del paciente, o datos de dicho material, en un patrón de reacción predefinido:
- proporcionar un diseño o sintetizar material biológico terapéutico modificado genéticamente
- seguir un patrón de reacción predefinido basado en medios informáticos configurados para
- recibir entrada de estados biológicos de la(s) muestra(s), o datos de la(s) muestra(s), tomado de material no canceroso y material canceroso muestreado del mismo paciente, a continuación genoma, transcriptoma, proteoma, expresión génica, metaboloma y epigenoma.
- Generar datos para diseño(s) y/o secuencia(s) para material biológico y/o sintetizar material biológico según un patrón predefinido que, según los datos muestreados del paciente, está configurado para ser dañino para los estados biológicos del material canceroso y no dañino para el material no canceroso.
Estos métodos pueden utilizar además uno o más de los aspectos del sistema mencionado anteriormente, como también se desprenderá de los párrafos anteriores.
Habiendo así descrito con detalle una realización preferida de la presente invención, debe apreciarse y será evidente para los expertos en la técnica que muchos cambios no ejemplificados en los detalles Descripción de la invención podría hacerse sin alterar los conceptos y principios de la invención allí incorporados. También se debe apreciar que son posibles numerosas realizaciones que incorporan solo una parte de la realización preferida que no alteran, con respecto a esas partes, los conceptos y principios de la invención allí incorporados. Por lo tanto, las presentes realizaciones deben considerarse en todos sus aspectos como ilustrativas y no restrictivas, el alcance de la invención está indicado por las reivindicaciones adjuntas, y todas las realizaciones alternativas y los cambios a las realizaciones mostradas en el presente documento que entran dentro del significado y el rango de equivalencia de las reivindicaciones adjuntas, por lo tanto, deben ser abarcados allí.
Descripción detallada de realizaciones de la invención
En lo sucesivo, las realizaciones de la invención se describirán con más detalles con referencia al dibujo en el que: La figura 1 ilustra un esquema paso a paso del cálculo.
EJEMPLO 1
Un experimento de prueba de concepto de bioinformática
La figura 1 ilustra con detalle un esquema paso a paso del cálculo proporcionado a continuación.
Los parámetros de entrada para el sistema informático son secuencias de ADN de un grupo de células, donde dichas células representan tejido sano, y secuencias de ADN de un grupo de células, donde dichas células representan tejido maligno en este experimento. El siguiente algoritmo podría suministrarse con parámetros de entrada de células infectadas por virus y células de un organismo patógeno.
Los datos de secuenciación podrían ser secuenciación del genoma completo, parcial y/o profunda de ADN o ARN. Primero, las secuencias PAM de las células sanas o específicas, se identifican mediante la búsqueda de texto KMP (Knuth-Morris-Pratt). La secuencia PAM en este experimento representó el uso prospectivo de Crispr-Cas9 y, por lo tanto, fue 5'-NGG-3'. Las secuencia PAM, incluyendo los nucleótidos de ADN siguientes o anteriores con una longitud de la molécula de reconocimiento complementaria deseada, por ejemplo, ARN Crispr, se almacenan en forma de lista para su posterior comparación. Se ejecutó una prueba utilizando un algoritmo personalizado hecho con el proyecto de código abierto BioPython y una muestra del cromosoma 2 de un genoma sano y canceroso del mismo individuo que se encuentra en la base de datos del proyecto de genomas AWS 1000 (ref| NW_004929308.1).
Después de ello, las secuencias de muestra del cromosoma 2 se insertaron en su propia estructura de datos de conjunto (o bolsa) respectiva. El Conjunto permite valores duplicados, de modo que no se ignoren más secuencias que ocurren y puedan participar en un análisis de coincidencia parcial. Se utiliza una estructura de datos Set para su tiempo de ejecución constante 0(1), esencial para secuencias de ADN más grandes.
Como tercera etapa, los dos conjuntos respectivos se calculan en un tercer conjunto de resultados con una operación de resta (o diferencia). La operación diferencia, da como resultado un conjunto de moléculas de reconocimiento complementarias, exclusivo de la célula cancerosa a la que se dirige, y que no existe en la célula sana. En el experimento realizado de 230 millones de nucleótidos, incluyendo duplicados superpuestos, se identificaron 8 millones de objetivos potenciales con el PAM ocurriendo en posiciones variables dentro de la secuencia objetivo.
Luego se puede realizar un análisis adicional en el conjunto resultante de secuencias, exclusivo de la célula cancerosa, o célula sana, si se desea, tales como la clasificación de su singularidad, clasificación de secuencias objetivo que se correlacionan con objetivos dentro de secuencias que se sabe que se corresponden con partes del exorna, clasificación de los objetivos en función de su marcador de actividad predictivo, tal como a través del SgRNA Scorer 1.0; la clasificación de los objetivos se optimizó aún más en función de su usabilidad, por ejemplo diseñando LNA, clasificación basada en su viabilidad para expresarse en un vector específico, por ejemplo, un virus adenoasociado u otro formato de vector que pueda proporcionar la presencia celular de las moléculas efectoras y de reconocimiento.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en un método para el tratamiento del cáncer en un animal, así como en un ser humano, comprendiendo el método la inducción de la destrucción preferente de células malignas, que comprenden al menos una secuencia de ADN, que no está presente o que no está presente en cantidades significativas en células sanas de dicho animal, en donde dicha composición comprende:
1) una cantidad efectiva de al menos un vector de expresión, en donde cada uno de dicho al menos un vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico, que codifica una molécula de reconocimiento que reconoce específicamente al menos una de dicha al menos una secuencia de ADN, y que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico, que codifica una molécula que interrumpe selectivamente el ADN, que comprende dicha al menos una secuencia de ADN, cuando está unida a dicha molécula de reconocimiento, o
2) una cantidad efectiva de al menos un primer vector de expresión, en donde cada uno de dicho al menos un primer vector de expresión comprende una primera secuencia de ácido nucleico, que codifica una molécula de reconocimiento, que reconoce específicamente al menos una de dicha al menos una secuencia de ADN, y una cantidad eficaz de al menos un segundo vector de expresión, que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico, que codifica una molécula que interrumpe selectivamente el ADN, que comprende dicha al menos una secuencia de ADN, cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o
3) una cantidad efectiva de al menos una molécula de reconocimiento, que reconoce específicamente al menos una de dicha al menos una secuencia de ADN, y una cantidad efectiva de al menos una molécula que interrumpe selectivamente el ADN, que comprende dicha al menos una secuencia de ADN, cuando se une a dicha al menos una molécula de reconocimiento, o
4) una cantidad efectiva de al menos un vector de expresión, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de reconocimiento, que reconoce específicamente al menos una de dicha al menos una secuencia de ADN y una cantidad efectiva de al menos una segunda molécula, que interrumpe selectivamente el ADN, que comprende dicha al menos una secuencia de ADN, cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, o
5) una cantidad efectiva de al menos una molécula de reconocimiento, que reconoce específicamente al menos una de dicha al menos una secuencia de ADN, y una cantidad efectiva de al menos un vector de expresión, que comprende una secuencia de ácido nucleico, que codifica una molécula que interrumpe selectivamente el a Dn , que comprende dicha al menos una secuencia de ADN, cuando se une a dicha al menos una molécula de reconocimiento,
en donde la administración de dicho(s) vector(es) y/o molécula(s) definido(s) en cualquiera de 1-5 da como resultado la interrupción de las moléculas de ácido nucleico, que comprenden dicha al menos una secuencia de ADN hasta tal punto que dichas células malignas mueren, y
en donde el animal no está expuesto a ninguna molécula de reconocimiento que reconozca el ADN autólogo del animal en células sanas,
en donde dichas células malignas se dañan letalmente debido a la introducción de rupturas de múltiples moléculas de ADN y/o es alterado su metabolismo debido a la eliminación de múltiples pares de bases del genoma de dichas células cancerosas,
en donde la molécula de reconocimiento es un ácido nucleico, que reconoce dicha al menos una secuencia de ADN mediante emparejamiento de bases, y
en donde la rotura de moléculas de ácido nucleico comprende introducir un número suficiente de rupturas en el ADN cromosómico de las células cancerosas para asegurar que las células cancerosas no sean viables.
2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la molécula de reconocimiento es un crARN y en donde dicha molécula que interrumpe selectivamente dicha al menos una secuencia de ADN, cuando se une a dicha molécula de reconocimiento, es una proteína asociada a CRISPR (Cas).
3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el Cas es uno de los siguientes: Cas9, eSpCas9, SpCas9-HF y Cpf1.
4. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho(s) vector(es) o molécula(s) se integra(n) en un depósito preventivo o terapéutico.
5. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el animal es un ser humano.
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