JP2009513130A - ２つの機能的サブドメインに変異を有するｌａｇｌｉｄａｄｇホーミングエンドヌクレアーゼ変異型及びその使用 - Google Patents
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Abstract
それぞれが改変DNA標的半部位の別個の部分に結合する2つの別々のサブドメインに変異を有するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型であって、各サブドメインが結合するヌクレオチドを含むキメラDNA標的配列を切断し得るLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型。該ヘテロダイマーメガヌクレアーゼ及びその誘導生成物の、遺伝子操作、ゲノム療法及び抗ウイルス療法のための使用。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、改変されたDNA標的半部位(half-site)の別個の部分にそれぞれが結合する2つの機能的サブドメインに変異を有するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を作製する(engineering)方法に関し、該LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型は、各サブドメインが結合するヌクレオチドを含むキメラDNA標的配列を切断できる。
本発明は、また、上記の方法により得ることができるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型、該変異型をコードするベクター、該ベクターにより改変された細胞、動物又は植物、並びに該I-CreIエンドヌクレアーゼ変異型及び誘導される生成物の、遺伝子操作、ゲノム療法及び抗ウイルス療法のための使用に関する。
メガヌクレアーゼは、定義によると、生細胞の特定の遺伝子座にDNA二本鎖切断(DSB)をもたらし得る大きい(＞14 bp)切断部位を有する配列特異的エンドヌクレアーゼである(Thierry及びDujon, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5625〜5631)。メガヌクレアーゼは、培養細胞及び植物中のそれらの標的配列の近傍で相同組換えを刺激するために用いられており(Rouetら, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜106; Choulikaら, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜73; Donohoら, Mol. Cell. Biol, 1998, 18, 4070〜8; Elliottら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93〜101; Sargentら, Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 267〜77; Puchtaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 5055〜60; Chiurazziら, Plant Cell, 1996, 8, 2057〜2066)、これにより、メガヌクレアーゼにより誘導される組換えが、ゲノム操作のための効率的で確固とした方法になる。メガヌクレアーゼ誘導組換えの使用は、天然メガヌクレアーゼのレパートリーにより制限されており、現在の技術の主要な制限は、興味のある遺伝子座にメガヌクレアーゼ切断部位を予め導入する必要があることである。つまり、仕立てた基質特異性を有する人工メガヌクレアーゼの作製について、多くの研究が行われている。このようなタンパク質は、真の染色体配列を切断するために用いることができ、広い応用範囲のゲノム操作についての新しい展望を開き得る。例えば、メガヌクレアーゼは、単遺伝子性遺伝性疾患と連結する変異の修正を誘導し、現在の遺伝子治療アプローチにおいて用いられる無作為に挿入される導入遺伝子による危険性を回避するために用いることができる(Hacein-Bey-Abinaら, Science, 2003, 302, 415〜419)。
最近、Cys2-His2型ジンクフィンガータンパク質(ZFP)のジンクフィンガーDNA結合ドメインを、FokIエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させて、ヒトリンパ様細胞を含む種々の細胞種において組換えを誘導できた(Smithら, Nucleic Acids Res, 1999, 27, 674〜81; Paboら, Annu. Rev. Biochem, 2001, 70, 313〜40; Porteus及びBaltimore, Science, 2003, 300, 763; Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764)。ZFPの結合特異性は、比較的容易に操作され、多くの(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn配列に結合可能な新規な人工ZFPのレパートリーが、現在、利用可能である(Paboら, 上記; Segal及びBarbas, Curr. Opin. Biotechnol., 2001, 12, 632〜7; Isalanら, Nat.
Biotechnol., 2001, 19, 656〜60)。しかし、非常に狭い特異性を維持することがゲノム工学的応用についての主要な課題の1つであり、現在のところ、ZFPが、治療用途についての非常に厳密な要件を充足するかどうか明確でない。さらに、これらの融合タンパク質は、おそらく特異性のレベルが低いために、細胞内で非常に毒性が高いことが示されている(Porteus及びBaltimore, 上記; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175))。
Biotechnol., 2001, 19, 656〜60)。しかし、非常に狭い特異性を維持することがゲノム工学的応用についての主要な課題の1つであり、現在のところ、ZFPが、治療用途についての非常に厳密な要件を充足するかどうか明確でない。さらに、これらの融合タンパク質は、おそらく特異性のレベルが低いために、細胞内で非常に毒性が高いことが示されている(Porteus及びBaltimore, 上記; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175))。
本質的に、メガヌクレアーゼは、可動性の遺伝的要素によりコードされるエンドヌクレアーゼのファミリーであるホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)により本質的に代表され、その機能は、ホーミングと呼ばれるプロセスにおけるDNA二本鎖切断(DSB)誘導組換え事象を開始することである(Chevalier及びStoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜74; Kostrikenら, Cell; 1983, 35, 167〜74; Jacquier及びDujon, Cell, 1985, 41, 383〜94)。数百のHESが、細菌、真核生物及び古細菌で同定されている(Chevalier及びStoddard, 上記)。しかし、選択した遺伝子でHE切断部位を見出す可能性は、非常に低い。
生物学的機能並びに有効性及び特異性の点でのそれらの例外的な切断特性に鑑みて、HEは、理想的な骨格を提供して、ゲノム操作のための新規なエンドヌクレアーゼを導く。最近10年間で、4つのHEファミリーのうち最大のLAGLIDADGファミリーを特徴付けるデータが蓄積されている(Chevalier及びStoddard, 上記)。LAGLIDADGは、ファミリー内で実際に保存されている唯一の配列のことであり、タンパク質中に1又は(多くの場合) 2コピーが見出される。I-CreIのような単一モチーフのタンパク質は、ホモダイマーを形成し、パリンドローム又は偽パリンドロームDNA配列を切断するが、I-SceIのようなより大きい二重モチーフタンパク質はモノマーであり、非パリンドローム標的を切断する。7つの異なるLAGLIDADGタンパク質が結晶化されており、これらはコア構造の非常に著しい保存を示し、このことは、一次配列レベルでの類似性の欠如と対照的である(Juricaら, Mol. Cell., 1998, 2, 469〜76; Chevalierら, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312〜6 ; Chevalierら J.
Mol. Biol., 2003, 329, 253〜69; Moureら, J. Mol. Biol, 2003, 334, 685〜95; Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜70; Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300, 889〜901; Duanら, Cell, 1997, 89, 555〜64; Bolducら, Genes Dev., 2003, 17, 2875〜88; Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123〜36)。このコア構造において、2つのモノマー又は二重LAGLIDAGタンパク質の2つのドメインが寄与するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインともよばれる2つの特徴的なαββαββα折り畳みは、2回回転対称で互いに面している。DNA結合は、逆平行βシートに折り畳まれ、かつDNAらせん主溝上に鞍部を形成する各ドメインからの4つのβ鎖に依存する(図1A)。その天然の標的に結合したI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて8つの残基(Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68及びR70)が、±3、4、5、6、7、9及び10位にて7つの残基と直接の相互作用を確立していることを示す(Juricaら, 1998, 上記)。さらに、いくつかの残基は、いくつかの塩基との水が媒介する接触を確立する。例えば、S40、K28及びN30と+8位及び-8位の塩基対とである(Chevalierら, 2003, 上記)。触媒コアは、対称のモノマー／ドメインの寄与により中央にある。このコア構造に加えて、他のドメインを見出すことができる。例えば、インテインであるPI-SceIは、タンパク質スプライシングドメインと、追加のDNA結合ドメインを有する(Moureら, 2002, 上記; Grindlら, Nucleic Acids Res., 1998, 26, 1857〜62)。
Mol. Biol., 2003, 329, 253〜69; Moureら, J. Mol. Biol, 2003, 334, 685〜95; Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764〜70; Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300, 889〜901; Duanら, Cell, 1997, 89, 555〜64; Bolducら, Genes Dev., 2003, 17, 2875〜88; Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123〜36)。このコア構造において、2つのモノマー又は二重LAGLIDAGタンパク質の2つのドメインが寄与するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインともよばれる2つの特徴的なαββαββα折り畳みは、2回回転対称で互いに面している。DNA結合は、逆平行βシートに折り畳まれ、かつDNAらせん主溝上に鞍部を形成する各ドメインからの4つのβ鎖に依存する(図1A)。その天然の標的に結合したI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて8つの残基(Y33、Q38、N30、K28、Q26、Q44、R68及びR70)が、±3、4、5、6、7、9及び10位にて7つの残基と直接の相互作用を確立していることを示す(Juricaら, 1998, 上記)。さらに、いくつかの残基は、いくつかの塩基との水が媒介する接触を確立する。例えば、S40、K28及びN30と+8位及び-8位の塩基対とである(Chevalierら, 2003, 上記)。触媒コアは、対称のモノマー／ドメインの寄与により中央にある。このコア構造に加えて、他のドメインを見出すことができる。例えば、インテインであるPI-SceIは、タンパク質スプライシングドメインと、追加のDNA結合ドメインを有する(Moureら, 2002, 上記; Grindlら, Nucleic Acids Res., 1998, 26, 1857〜62)。
ホーミングエンドヌクレアーゼからの新規なエンドヌクレアーゼを導くための2つのアプローチが、研究されている。
- タンパク質変異型
突然変異誘発及びスクリーニング／選択によりDNA結合タンパク質の基質特異性を変更することは、しばしば、困難であることが示されており(Lanioら, Protein Eng., 2000, 13, 275〜281; Voziyanovら, J. Mol. Biol., 2003, 326, 65〜76; Santoroら, P.N.A.S., 2002, 99, 4185〜4190; Buchholz及びStewart, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 1047〜1052)、より具体的には、HEのDNA結合ドメインを改変することは、長い間、その実行を思いとどまらせる課題であると考えられていた(Ashworthら, Nature 2006, 441, 656〜659;
Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993〜1008 ; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006,
355, 443〜458; Doyonら, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477〜2484; Steuerら, 上記; Seligmanら, Nucleic Acids Res., 2002, 30, 3870〜3879)。
- タンパク質変異型
突然変異誘発及びスクリーニング／選択によりDNA結合タンパク質の基質特異性を変更することは、しばしば、困難であることが示されており(Lanioら, Protein Eng., 2000, 13, 275〜281; Voziyanovら, J. Mol. Biol., 2003, 326, 65〜76; Santoroら, P.N.A.S., 2002, 99, 4185〜4190; Buchholz及びStewart, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 1047〜1052)、より具体的には、HEのDNA結合ドメインを改変することは、長い間、その実行を思いとどまらせる課題であると考えられていた(Ashworthら, Nature 2006, 441, 656〜659;
Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993〜1008 ; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006,
355, 443〜458; Doyonら, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 2477〜2484; Steuerら, 上記; Seligmanら, Nucleic Acids Res., 2002, 30, 3870〜3879)。
I-CreI / DNA結晶構造の分析は、9つのアミノ酸がホーミング部位と直接接触することを示し(Chevalierら, 2003; Juricaら, 上記)、その無作為化は209の組み合わせとなり、今日のいずれのスクリーニング能力も超える数である。
よって、いくつかの実験室は、半合理的(semi-rational)アプローチ(Chicaら, Curr. Opin. Biotechnol., 2005, 16, 378〜384)に基づいて、取り扱うべき変異ライブラリーの多様性を限定している。構造のデータに従って、適切な残基の小さい組を選択する。それにもかかわらず、これは、選択された配列を切断する再設計されたエンドヌクレアーゼを創出するのにはまだ充分でない。
- Seligmanらは、I-CreIのαββαββα折り畳みの特定の個別の残基を置換する合理的アプローチを用いた(Sussmanら, J. Mol. Biol., 2004, 342, 31〜41; Seligmanら, Nucleic Acids Res., 2002, 上記; Seligmanら, Genetics, 1997, 147, 1653〜64)。実質的な切断は、わずかなI-CreI変異型(Y33C、Y33H、Y33R、Y33L、Y33S、Y33T、S32K、S32R)を用いて、±10位で改変された標的についてのみ観察された。
- 同様にして、Gimbleら(上記)は、PI-SceIの追加のDNA結合ドメインを改変した。彼らは、結合特異性が変化しているが特異性は変化していないタンパク質変異型を得たが、ほとんどの変異型は、野生型標的配列についての親和性の多くを維持していた。
- ハイブリッド又はキメラの単鎖タンパク質
新しいメガヌクレアーゼは、異なるモノマー同士のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを交換することにより得ることができた(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。異なるメガヌクレアーゼからの2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインがスペーサーにより連結されているこれらの単鎖キメラメガヌクレアーゼは、2つの半分(half)の親のDNA標的配列の融合に相当するハイブリッド標的を切断できる。
新しいメガヌクレアーゼは、異なるモノマー同士のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを交換することにより得ることができた(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。異なるメガヌクレアーゼからの2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインがスペーサーにより連結されているこれらの単鎖キメラメガヌクレアーゼは、2つの半分(half)の親のDNA標的配列の融合に相当するハイブリッド標的を切断できる。
キメラ及び単鎖人工HEの構築は、新規な(非パリンドローム)標的配列を切断する新規なメガヌクレアーゼを得るために、コンビナトリアルアプローチを用い得ることを示唆する：異なるモノマー又はコアドメインを単一タンパク質に融合させて、新規な特異性を達成し得る。これらの結果は、I-CreIダイマーの2つのDNA結合ドメインが独立して挙動することを意味する。各DNA結合ドメインはDNA標的部位の異なる半分に結合する(図1A)。新規メガヌクレアーゼの集団の作製、及び2つの異なるモノマー／コアドメインを組み立てることによりそれらを組み合わせる能力は、標的にされ得るDNAの数を著しく増加させるが、全ての可能な配列を飽和するほどではない。
より多数の配列に届くために、組み合わせ得るより小さい独立したサブドメインを同定し得ることは、非常に価値がある(図1B)。
しかし、コンビナトリアルアプローチは、モノマー間よりも、単一モノマー又はドメイン内で適用することが難しい。なぜなら、結合界面は非常に緻密であり、実質的に全ての塩基特異的相互作用の原因である2つの異なるββヘアピンは、別々のサブドメインを構成しないが、単一の折り畳みの一部分であるからである。例えば、I-CreIのDNA結合領域の内部の部分では、第1ヘアピンからの1つの残基(Q44)、及び第2ヘアピンからの2つの残基(R68及びR70; Chevalierら, 2003, 上記の図1Bを参照)がgtcトリプレットに結合する。さらに、一連の変異の累積の影響は、適当な折り畳みを結局破壊し得る。
しかし、コンビナトリアルアプローチは、モノマー間よりも、単一モノマー又はドメイン内で適用することが難しい。なぜなら、結合界面は非常に緻密であり、実質的に全ての塩基特異的相互作用の原因である2つの異なるββヘアピンは、別々のサブドメインを構成しないが、単一の折り畳みの一部分であるからである。例えば、I-CreIのDNA結合領域の内部の部分では、第1ヘアピンからの1つの残基(Q44)、及び第2ヘアピンからの2つの残基(R68及びR70; Chevalierら, 2003, 上記の図1Bを参照)がgtcトリプレットに結合する。さらに、一連の変異の累積の影響は、適当な折り畳みを結局破壊し得る。
構造レベルでの明確なモジュール性の欠失にもかかわらず、本発明者は、ホーミングエンドヌクレアーゼ半部位の別個の部分に結合し得る分離可能な機能的サブドメインを同定した(図2)。異なるモノマー又は同じモノマー内のコアドメインからの2つのサブドメインを組み立てることにより、本発明者は、パリンドロームキメラ標的(図3a)を切断し得る機能的ホーミングエンドヌクレアーゼ(ホモダイマー)変異型を作製した。さらに、4つの異なるサブドメイン(図3a)を組み立てて、非パリンドロームキメラ標的を切断し得る新しいヘテロダイマー分子を形成することにより、より大きいコンビナトリアルアプローチが可能になる。
異なるサブドメインを別々に改変して、新しい切断特異性を作製でき、1つのメガヌクレアーゼ(ホモダイマー、ヘテロダイマー、単鎖キメラ分子)内の異なるサブドメインの組み合わせは、メガヌクレアーゼにより切断され得るDNA標的の数を著しく増大させる。つまり、各サブドメインについての少数の新しい切断者(cleavers)を同定することにより、新しい特異性を有する非常に多数の新規なエンドヌクレアーゼの設計が可能になる。
このアプローチを用いて、4組の変異を、完全に作製された特異性を有するヘテロダイマーホーミングエンドヌクレアーゼに組み立て、モデル標的(COMB1)又はヒトRAG1遺伝子からの配列を切断した。ホーミングエンドヌクレアーゼが完全に再設計されて、天然に存在する配列を切断したのは、これが最初である。
さらに、より最近の研究では、作製されたタンパク質の標的は、最初の野生型基質から、部位当たり1〜6塩基異なるが、22 bpのCOMB1及びRAG1配列は、I-CreI切断部位(C1221)から、それぞれ9及び16 bp異なっている。
さらに、より最近の研究では、作製されたタンパク質の標的は、最初の野生型基質から、部位当たり1〜6塩基異なるが、22 bpのCOMB1及びRAG1配列は、I-CreI切断部位(C1221)から、それぞれ9及び16 bp異なっている。
いずれのホーミングエンドヌクレアーゼ(2つのドメインを有するモノマー又はホモダイマー)に適用できるこの新しいコンビナトリアルアプローチは、標的にされ得るDNA配列の数を著しく増大させ、多くの興味のある遺伝子からの配列を切断し得る専用メガヌクレアーゼの作製をもたらす。I-CreI誘導体の集団の作製、並びに分子内及び分子間でそれらを組み合わせる能力は、達成可能な22マーの標的の数を、少なくとも1.57×107 ((64×62)2)に増大させる。
さらに、ゲノム操作の応用について、HEの主要な利点は、治療用途に用いる場合に必須になりつつある特徴である、それらの繊細な特異性である。
よって、このアプローチは、選択された配列を切断する新規なエンドヌクレアーゼを創出する一般的な方法を提供する。可能な応用は、ウイルスゲノムの特異的な切断又は二本鎖切断により誘発される組換えによる遺伝的欠陥の修正を含み、これらはともに治療法に導く。
本発明は、少なくとも：
(a) 親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位の1つの半分の第1部分と相互作用するコアドメインの第1機能的サブドメインに変異を有する第1変異型を、
(a1) I-CreIの26位〜40位に位置するアミノ酸に相当する第1サブドメインの少なくとも1つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置換し、
(a2) 前記半部位の第1部分の少なくとも1つのヌクレオチドを異なるヌクレオチドで置換することにより前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位から誘導される第1 DNA標的配列を切断できる、工程(a1)からの第1変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築し、
(b) 前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位の第2部分と相互作用するコアドメインの第2機能的サブドメインに変異を有する第2変異型を、
(b1) I-CreIの44位〜77位に位置するアミノ酸に相当する第2サブドメインの少なくとも1つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置換し、
(b2) 前記半部位の第2部分の少なくとも1つのヌクレオチドを異なるヌクレオチドで置換することにより前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位から誘導される第2 DNA標的配列を切断できる、工程(b1)からの第2変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築し、
(c) 前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの前記第1機能的サブドメイン及び第2機能的サブドメインに変異を有する第3変異型を、
(c1) 工程(a1)及び工程(b1)からの2つの変異型の変異を、単一変異型に組み合わせ、
(c2) 第1変異型DNA標的半部位の第1部分と第2変異型DNA標的半部位の第2部分とを含むキメラDNA標的配列を切断できる、工程(c1)からの変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築する
工程を含む、コアドメインの2つの機能的サブドメインの変異により親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼから誘導されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を作製する方法に関する。
(a) 親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位の1つの半分の第1部分と相互作用するコアドメインの第1機能的サブドメインに変異を有する第1変異型を、
(a1) I-CreIの26位〜40位に位置するアミノ酸に相当する第1サブドメインの少なくとも1つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置換し、
(a2) 前記半部位の第1部分の少なくとも1つのヌクレオチドを異なるヌクレオチドで置換することにより前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位から誘導される第1 DNA標的配列を切断できる、工程(a1)からの第1変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築し、
(b) 前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位の第2部分と相互作用するコアドメインの第2機能的サブドメインに変異を有する第2変異型を、
(b1) I-CreIの44位〜77位に位置するアミノ酸に相当する第2サブドメインの少なくとも1つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置換し、
(b2) 前記半部位の第2部分の少なくとも1つのヌクレオチドを異なるヌクレオチドで置換することにより前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位から誘導される第2 DNA標的配列を切断できる、工程(b1)からの第2変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築し、
(c) 前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの前記第1機能的サブドメイン及び第2機能的サブドメインに変異を有する第3変異型を、
(c1) 工程(a1)及び工程(b1)からの2つの変異型の変異を、単一変異型に組み合わせ、
(c2) 第1変異型DNA標的半部位の第1部分と第2変異型DNA標的半部位の第2部分とを含むキメラDNA標的配列を切断できる、工程(c1)からの変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築する
工程を含む、コアドメインの2つの機能的サブドメインの変異により親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼから誘導されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を作製する方法に関する。
定義
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、ここで、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、1文字コードに従って表し、ここで、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- ヌクレオチドは、次のように表される。1文字コードは、ヌクレオシドの塩基を表すために用いられる。aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
- 「親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ」により、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型を意図する。該親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、モノマー、又は22〜24 bpの二本鎖DNA標的を切断できる機能的エンドヌクレアーゼに会合してなる2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを含むダイマー(ホモダイマー又はヘテロダイマー)であり得る。
- 「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型」又は「変異型」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ配列の少なくとも1つのアミノ酸の、異なるアミノ酸での置換により得られるタンパク質を意図する。
- 「機能的変異型」により、DNA標的、好ましくは野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより切断されない新しいDNA標的を切断できるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を意図する。例えば、このような変異型は、DNA標的配列に接触するか又は該DNA標的に直接若しくは間接的に相互作用する位置でアミノ酸の変動を有する。
- 「新規な特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼ変異型」により、親のホーミングエンドヌクレアーゼのものとは異なる切断される標的のパターンを有する変異型を意図する。互いに等価であり、同様に用いられる用語「新規な特異性」、「改変された特異性」、「新規な切断特異性」、「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変異型の特異性のことをいう。
- 「I-CreI」により、配列SWISSPROT P05725又はpdbアクセッションコード1g9yを有する野生型I-CreIを意図する。
- 「ドメイン」又は「コアドメイン」により、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼに特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みであり、約100アミノ酸残基の配列に相当する「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。上記のドメインは、DNA標的の1つの半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれた4つのベータ鎖(β1、β2、β3、β4)を含む。このドメインは、DNA標的の別の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを伴って、該DNA標的を切断し得る機能的エンドヌクレアーゼを形成できる。例えば、ダイマーのホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6〜94に相当する。モノマーのホーミングエンドヌクレアーゼの場合、2つのこのようなドメインが、エンドヌクレアーゼの配列中に見出される。例えば、I-DmoI (194アミノ酸)において、第1ドメイン(残基7〜99)及び第2ドメイン(残基104〜194)は、短いリンカー(残基100〜103)により分けられている。
- 「サブドメイン」により、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的半部位の別個の部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。2つの異なるサブドメインは、独立して挙動し、一方のサブドメイン内の変異は、他方のサブドメインの結合及び切断特性を変更しない。よって、2つのサブドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的半部位の別個の部分に結合する。
- 「ベータ-ヘアピン」により、ループ又はターンにより連結されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行ベータシートの2つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
- 「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼにより認識され切断される22〜24 bpの二本鎖パリンドローム、部分的パリンドローム(偽パリンドローム)又は非パリンドロームのポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、エンドヌクレアーゼにより二本鎖切断(切断)が誘導されるべき明確なDNA位置、好ましくはゲノムの位置のことを表す。DNA標的は、二本鎖ポリヌクレオチドの1つの鎖の5'から3'配列により定義される。例えば、図2に示す野生型I-CreIにより切断されるパリンドロームDNA標的配列は、配列5'- t-12c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11a+12 (配列番号1)により定義される。
- 「DNA標的半部位」、「半切断部位」又は「半部位」により、各LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合するDNA標的の一部分を意図する。
- 「キメラDNA標的」、組み合わせたDNA標的又は「ハイブリッドDNA標的」により、上記の標的の少なくとも1つの半分が、少なくとも2つの別々のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせを含むDNA標的を意図する。
- 「ベクター」により、連結された別の核酸を移動させ得る核酸分子を意図する。
- 「相同な」により、配列間の相同組換えを導くのに充分な同一性を別の配列に対して有する、より好ましくは少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%の同一性を有する配列を意図する。
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得る各配列中の位置を比較することにより決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められている場合、これらの分子はその位置で同一である。核酸又はアミノ酸配列同士の類似性又は同一性の度合は、これらの核酸配列により共有される位置での同一又はマッチするヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を算出できる。
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得る各配列中の位置を比較することにより決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められている場合、これらの分子はその位置で同一である。核酸又はアミノ酸配列同士の類似性又は同一性の度合は、これらの核酸配列により共有される位置での同一又はマッチするヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を算出できる。
- 「個体」は、哺乳類とともに他の脊椎動物(例えば鳥類、魚類及び爬虫類)を含む。用語「哺乳類」及び「哺乳動物」は、本明細書で用いる場合、その子に授乳し、生存する子を出産する(真獣類(eutharian)又は胎盤哺乳類(placental mammals))又は産卵する(後獣類(metatharian)又は無胎盤哺乳類(nonplacental mammals))単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物の種の例は、ヒト、及びその他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)及び反芻類(例えばウシ、ブタ、ウマ)を含む。
- 「遺伝性疾患」は、1又はいくつかの遺伝子の異常が部分的又は完全に、直接又は間接的に原因であるいずれの疾患のことをいう。該異常は、突然変異、挿入又は欠失であり得る。該突然変異は、点突然変異(punctual mutation)であり得る。該異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響し得る。該異常は、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造若しくは安定性に影響し得る。該遺伝性疾患は、劣性又は優性であり得る。このような遺伝性疾患は、限定されないが、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症(LDL受容体欠損)、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝臓代謝の遺伝性障害、レッシュ-ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、色素性網膜炎、毛細管拡張性運動失調、ブルーム症候群、網膜芽腫、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びテイ-サックス病であり得る。
本発明の方法によると、各置換は、DNA標的半部位と相互作用するアミノ酸残基の位置にある。LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼのDNA相互作用残基は、当該技術において公知である。変異される残基は、DNA骨格又はヌクレオチド塩基と、直接又は水分子を介して相互作用し得る。
上記の方法の有利な実施形態によると、工程a1)又はb1)においてアミノ酸は、A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、W及びYからなる群より選択されるアミノ酸で置換される。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程a1)で置換されるアミノ酸は、I-CreIの28位〜40位に位置する。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程b1)で置換されるアミノ酸は、I-CreIの44位〜70位に位置する。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程b1)で置換されるアミノ酸は、I-CreIの44位〜70位に位置する。
本発明の方法によると、DNA標的半部位の各部分は、少なくとも2連続ヌクレオチド、好ましくは3連続ヌクレオチドを含み、第1部分と第2部分とは、少なくとも1ヌクレオチド、好ましくは少なくとも2ヌクレオチドで分けられている。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、上記の半部位の第1部分及び第2部分は、それぞれ、該半部位の外側(external)及び内側(internal)の四半部(quarter)に位置する。
本発明の方法によると、親のDNA標的は、パリンドローム、非パリンドローム又は偽パ
リンドロームであり得る。
リンドロームであり得る。
本発明によると、サブドメインの位置は、I-CreI構造(pdbアクセッションコード1g9y)を参照して定義される。I-CreIでのサブドメインの位置がわかれば、当業者は、Pymolのような公知のタンパク質構造分析ソフトウェアを用いて、別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ内の対応する位置を容易に導き出すことができる。例えばI-MsoIについて、2つの機能的サブドメインは、それぞれ30位〜43位及び47位〜75位に位置する。
本発明の方法によると、工程a1)又はb1)におけるアミノ酸変異は、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型のいずれかに導入される。
親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼは、I-SceI、I-ChuI、I-CreI、I-CsmI、PI-SceI、PI-TliI、PI-MtuI、I-CeuI、I-SceII、I-Sce III、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI-AaeI、PI-BsuI、PI-DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI-MfuI、PI-MflI、PI-MgaI、PI-MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI-MshI、PI-MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI-PfuI、PI-RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、PI-TagI、PI-ThyI、PI-TkI、PI-TspI、I-MsoI及びI-AniI、好ましくはI-CreI、I-SceI、I-ChuI、I-DmoI、I-CsmI、PI-SceI、PI-PfuI、PI-TliI、PI-MtuI、I-MsoI、I-AniI及びI-CeuI、より好ましくはI-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI、I-DmoI、PI-SceI及びPI-PfuI、さらにより好ましくはI-CreIからなる群より選択され得る。
機能的変異型は、タンパク質構造に影響しない変異を含む。例えば、親のホーミングエンドヌクレアーゼは、以下からなる群より選択される1又は複数の変異を含むI-CreI変異型であり得る：
- 24位のイソロイシンのバリンへの変異(I24V)、
- 70位のアルギニンのセリンへの変異(R70S)、及び
- 75位のアスパラギン酸の非荷電アミノ酸、好ましくはアスパラギン(D75N)又はバリン(D75V)への変異。
- 24位のイソロイシンのバリンへの変異(I24V)、
- 70位のアルギニンのセリンへの変異(R70S)、及び
- 75位のアスパラギン酸の非荷電アミノ酸、好ましくはアスパラギン(D75N)又はバリン(D75V)への変異。
工程a1)又はb1)は、特に、DNA標的配列と接触するか、又は該DNA標的と直接若しくは間接的に相互作用する他の位置での、追加の変異の導入を含み得る。
この工程は、国際PCT出願WO 2004/067736に記載されるようにして変異型のライブラリーを作製することにより行い得る。
この工程は、国際PCT出願WO 2004/067736に記載されるようにして変異型のライブラリーを作製することにより行い得る。
工程c1)における変異の組み合わせは、公知のオーバーラップPCR法に従って、2つのサブドメインのそれぞれを含むオーバーラップフラグメントを増幅することにより行い得る。
工程a2)、b2)又はc2)における選択及び／又はスクリーニングは、国際PCT出願WO 2004/067736に記載されるようなインビトロ又はインビボでの切断アッセイを用いて行い得る。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、工程a2)、b2)及び／又はc2)は、上記の変異型により作製された変異DNA標的配列中の二本鎖切断が、正の選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又は負の選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化を導く条件下で、該DNA二本鎖切断の組換えにより媒介される修復によりインビボで行われる。
例えば、本発明のI-CreI変異型の切断活性は、PCT出願WO 2004/067736に記載されるようにして、レポーターベクターを用いて、酵母又は哺乳動物細胞において、直列反復組換えアッセイにより測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクターにクローニングされた、レポーター遺伝子の2つの短縮された非機能的コピー(直列反復配列
)と、キメラDNA標的配列とを、介在配列内に含む。キメラDNA標的配列は、それぞれの最初の変異型半部位の異なる部分の組み合わせから作られる。変異型の発現は、キメラDNA標的配列を切断できる機能的エンドヌクレアーゼをもたらす。この切断は、直列反復配列間の相同組換えを誘発し、機能的レポーター遺伝子をもたらし、その発現を適切なアッセイにより監視し得る。
例えば、本発明のI-CreI変異型の切断活性は、PCT出願WO 2004/067736に記載されるようにして、レポーターベクターを用いて、酵母又は哺乳動物細胞において、直列反復組換えアッセイにより測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクターにクローニングされた、レポーター遺伝子の2つの短縮された非機能的コピー(直列反復配列
)と、キメラDNA標的配列とを、介在配列内に含む。キメラDNA標的配列は、それぞれの最初の変異型半部位の異なる部分の組み合わせから作られる。変異型の発現は、キメラDNA標的配列を切断できる機能的エンドヌクレアーゼをもたらす。この切断は、直列反復配列間の相同組換えを誘発し、機能的レポーター遺伝子をもたらし、その発現を適切なアッセイにより監視し得る。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、これは、工程c2)で得られた1つの変異型を発現させて、ホモダイマーの形成を可能にするさらなる工程d1)を含む。該ホモダイマーは、それぞれが2つの最初の変異型半部位の1つに由来する2つの異なる部分を含むパリンドローム又は偽パリンドロームのキメラ標的配列を切断し得る(図3a)。
上記の方法の別の有利な実施形態によると、これは、工程c2)で得られた1つの変異型と、野生型LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型とを同時発現させて、ヘテロダイマーの形成を可能にする工程d'1)をさらに含む。好ましくは、工程c2)で得られた2つの異なる変異型を同時発現させる。上記のヘテロダイマーは、4つの異なる部分(A、B、C'、D'; 図3a)を含む非パリンドロームのキメラ標的配列を切断可能であり、該部分のそれぞれは4つの最初の変異型半部位(2つの異なるモノマーのそれぞれについての2つの最初の変異型; 図3a)の1つに由来する。
例えば、宿主細胞は、上記の変異型をコードする1又は2つの組換え発現ベクターにより改変され得る。細胞は、次いで、変異型の発現を可能にする条件下で培養され、形成されるホモダイマー／ヘテロダイマーは、細胞培養物から回収される。
本発明の方法によると、単鎖キメラエンドヌクレアーゼは、工程c2)で得られる1つの変異型と、ホーミングエンドヌクレアーゼドメイン／モノマーとの融合により構築され得る。該ドメイン／モノマーは、野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型からであり得る。
ホーミングエンドヌクレアーゼに由来する単鎖キメラ分子を構築する方法は、当該技術において公知である(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。このような方法のいずれも、本発明で定義される変異型に由来する単鎖キメラエンドヌクレアーゼを構築するために用い得る。
ホーミングエンドヌクレアーゼに由来する単鎖キメラ分子を構築する方法は、当該技術において公知である(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜62; Chevalierら, Mol. Cell., 2002, 10, 895〜905; Steuerら, Chembiochem., 2004, 5, 206〜13; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。このような方法のいずれも、本発明で定義される変異型に由来する単鎖キメラエンドヌクレアーゼを構築するために用い得る。
本発明の主題は、上記で定義される方法により得ることができるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異形でもある。
上記の変異型の第1の好ましい実施形態において、これは、少なくとも2つの置換を有するI-CreI変異型であり、該置換は、I-CreIのそれぞれ26位〜40位及び44位〜77位に位置する2つのサブドメインのそれぞれに1つずつある。
より好ましい実施形態において、I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン中の上記の置換は、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にある。
上記の変異型の第1の好ましい実施形態において、これは、少なくとも2つの置換を有するI-CreI変異型であり、該置換は、I-CreIのそれぞれ26位〜40位及び44位〜77位に位置する2つのサブドメインのそれぞれに1つずつある。
より好ましい実施形態において、I-CreIの44位〜77位に位置するサブドメイン中の上記の置換は、44位、68位、70位、75位及び／又は77位にある。
別のより好ましい実施形態において、I-CreIの26位〜40位に位置する機能的サブドメイン中の表記の置換は、I-CreIの26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位にある。
上記の変異型の別のより好ましい実施形態において、これは、I-CreIの28位〜40位に少なくとも1つの第1置換と、I-CreIの44位〜70位に1つの第2置換とを有する。
上記の変異型の別のより好ましい実施形態において、これは、I-CreIの28位〜40位に少なくとも1つの第1置換と、I-CreIの44位〜70位に1つの第2置換とを有する。
好ましくは、上記の変異型は、44位、68位及び70位に、
好ましくは、上記の変異型は、28位、30位、33位、38位及び40位にそれぞれ、
からなる群より選択されるアミノ酸を有する。
別のより好ましい実施形態において、上記の変異型は、式：
c-11n-10n-9n-8m-7y-6n-5n-4n-3k-2y-1 r+1m+2n+3n+4n+5r+6k+7n+8n+9n+10g+11 (I)
(式中、nはa、t、c又はgであり、mはa又はcであり、yはc又はtであり、kはg又はtであり、rはa又はgである(配列番号2)が、n-10n-9n-8がaaaでありかつn-5n-4n-3がgtcであるときに、n+8n+9n+10はtttではなく、かつn+3n+4n+5はgacではなく、n+8n+9n+10がtttでありかつn+3n+4n+5がgacであるときに、n-10n-9n-8はaaaではなく、かつn-5n-4n-3はgtcではない)
を有する配列を含むキメラDNA標的を切断する。
c-11n-10n-9n-8m-7y-6n-5n-4n-3k-2y-1 r+1m+2n+3n+4n+5r+6k+7n+8n+9n+10g+11 (I)
(式中、nはa、t、c又はgであり、mはa又はcであり、yはc又はtであり、kはg又はtであり、rはa又はgである(配列番号2)が、n-10n-9n-8がaaaでありかつn-5n-4n-3がgtcであるときに、n+8n+9n+10はtttではなく、かつn+3n+4n+5はgacではなく、n+8n+9n+10がtttでありかつn+3n+4n+5がgacであるときに、n-10n-9n-8はaaaではなく、かつn-5n-4n-3はgtcではない)
を有する配列を含むキメラDNA標的を切断する。
本発明によると、上記のキメラDNA標的は、パリンドローム、偽パリンドローム又は非パリンドロームであり得る。好ましくは、-11位〜-8位と+8位〜+11位のヌクレオチド配列及び／又は-5位〜-3位及び／又は+3位〜+5位のヌクレオチド配列がパリンドロームである。
より好ましくは、キメラDNA標的(ここで、n-4がtであるか又はn+4がaである)を切断するために、上記の変異型は、44位にグルタミン(Q)を有する。
より好ましくは、キメラDNA標的(ここで、n-4がaであるか又はn+4がtである)を切断するために、上記の変異型は44位にアラニン(A)又はアスパラギンを有する。A44、R68、S70又はA44、R68、S70、N75を含むI-CreI変異型は、このような変異型の例である。
より好ましくは、キメラDNA標的(ここで、n-4がaであるか又はn+4がtである)を切断するために、上記の変異型は44位にアラニン(A)又はアスパラギンを有する。A44、R68、S70又はA44、R68、S70、N75を含むI-CreI変異型は、このような変異型の例である。
より好ましくは、キメラDNA標的(ここで、n-4がcであるか又はn+4がgである)を切断するために、上記の変異型は44位にリジン(K)を有する。K44、R68、E70又はK44、R68、E70、N75を含むI-CreI変異型は、このような変異型の例である。
より好ましくは、キメラDNA標的(ここで、n-9がgであるか又はn+9がcである)を切断するために、上記の変異型は38位にアルギニン(R)又はリジン(K)を有する。それぞれ28位、30位、33位、38位及び40位に以下のアミノ酸残基を有するI-CreI変異型が、このような変異型の例である：
より好ましくは、キメラDNA標的(ここで、n-9がgであるか又はn+9がcである)を切断するために、上記の変異型は38位にアルギニン(R)又はリジン(K)を有する。それぞれ28位、30位、33位、38位及び40位に以下のアミノ酸残基を有するI-CreI変異型が、このような変異型の例である：
より好ましくは、上記のDNA標的は、-10位〜-8位に、aac、aag、aat、acc、acg、act、aga、agc、agg、agt、ata、atg、cag、cga、cgg、ctg、gac、gag、gat、gaa、gcc、gga、ggc、ggg、ggt、gta、gtg、gtt、tac、tag、tat、taa、tcc、tga、tgc、tgg、tgt又はttgからなる群より選択されるヌクレオチドトリプレット、及び／又は+8位〜+10位に-10位〜-8位の上記のヌクレオチドトリプレットの逆相補配列であるヌクレオチドトリプレットを含む。
上記の変異型の次に好ましい実施形態において、これは、I-MsoIの30〜43位及び47〜75位にそれぞれ位置する2つのサブドメインに1つずつ少なくとも2つの置換を有するI-MsoI変異型である。
さらに、他の残基は、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの全体の配列にわたって、特に、該配列のC末端の半分において変異され得る。例えば、I-CreIのC末端の半分(80〜163位)の置換は、I-CreIの80、82、85、86、87、94、96、100、103、114、115、117、125、129、131、132、147、151、153、154、155、157、159及び160位であることが好ましい。
本発明の変異型は、親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ配列のNH2末端及び／又はCOOH末端で挿入された1又は複数の残基を含み得る。例えば、メチオニン残基をNH2末端に導入し、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)をNH2末端及び／又はCOOH末端に導入する。上記のタグは、該ポリペプチドの検出及び／又は精製に有用である。
本発明の変異型は、2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメインを単一ポリペプチドに含むモノマー若しくは単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、又は2つのこのようなドメインを2つの別々のポリペプチドに含むホモダイマー若しくはヘテロダイマーのいずれかであり得る。本発明によると、一方又は両方のモノマー／ドメインは、上記で定義されるように2つのサブドメイン内で変異され得る。1つのモノマー／ドメインは、親のLAGL
IDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型であり得る。
IDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はその機能的変異型であり得る。
本発明の別の好ましい実施形態によると、上記の変異型は、両方のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメインが、上記で定義されるように、少なくとも2つの別々のサブドメイン内に変異を含み、一方のドメイン内の該変異が他方のドメイン内のものとは異なるモノマー、単鎖キメラ分子又はヘテロダイマーである。
本発明の主題は、上記で定義される変異型又はその変異ドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントである。該ポリヌクレオチドは、上記で定義されるモノマーの1つのドメイン、ホモダイマー若しくはヘテロダイマーの1つのモノマー、又はモノマー若しくは単鎖分子の2つのドメインをコードし得る。
本発明の主題は、上記で定義される変異型をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む組換えベクターでもある。該ベクターは、ホモダイマー変異型の1つのモノマー、又はモノマー変異型若しくは単鎖分子の2つのドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。あるいは、上記のベクターは、それぞれがヘテロダイマー変異型のモノマーの1つをコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含み得る。
好ましいベクターのある種類は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それらが連結する核酸の自律複製及び／又は発現が可能なものである。それらが機能的に連結する遺伝子の発現を駆動し得るベクターは、本明細書において「発現ベクター」という。
本発明によるベクターは、限定されないが、YAC (酵母人工染色体)、BAC (細菌人工)、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半合成若しくは合成のDNAで構成され得る直鎖状若しくは環状のDNA又はRNA分子を含む。一般に、組換えDNA技術において用いられる発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形であり、これは、通常、それらのベクターの形では染色体に結合しない環状二本鎖DNAループのことをいう。多数の適切なベクターが、当該技術において知られている。
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス1及び2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)及びポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。
ベクターは、選択マーカー、例えば真核細胞培養についてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；S. cerevisiaeについてTRP1；E. coliにおいてリファンピシン又はアンピシリン耐性を含み得る。
好ましくは、上記のベクターは、本発明の変異型をコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御要素の制御下に位置して、該変異型の産生又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、該ベクターは、複製起点、該コードポリヌクレオチドに機能可能に連結するプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーも含み得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。好ましくは、上記の変異型がヘテロダイマーである場合、各モノマーをコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に駆動し得る1つのベクターに含まれる。
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、これは、上記で定義されるようなキメラDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を共有する配列を含む標的化構築物(targeting construct)を含む。
より好ましくは、上記の標的化DNA構築物は：
a) 上記で定義されるようなキメラDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を共有する配列と、
b) a)で定義される配列に接する、導入されるべき配列と
を含む。
より好ましくは、上記の標的化DNA構築物は：
a) 上記で定義されるようなキメラDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を共有する配列と、
b) a)で定義される配列に接する、導入されるべき配列と
を含む。
本発明は、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターで改変された原核又は真核の宿主細胞にも関する。
本発明は、それらの細胞の全て又は一部分が上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターで改変されていることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書で用いる場合、細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞のことをいう。
本明細書で用いる場合、細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞のことをいう。
本発明において定義される変異型をコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に知られるいずれの方法により調製できる。例えば、これらは、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、cDNA鋳型から増幅される。好ましくは、該cDNAのコドンは、所望の発現系での該タンパク質の発現に好ましいように選択される。
上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学技術により得て、宿主細胞に導入できる。
本発明の変異型は、上記で定義されるポリペプチドを発現させることにより産生される。好ましくは、該ポリペプチドは、1つ又は2つの発現ベクターにより改変された宿主細胞において、ポリペプチドの発現又は同時発現に適切な条件下で発現又は同時発現され、変異型は宿主細胞培養物から回収される。
本発明の主題は、上記で定義される変異型、好ましくは発現ベクター中に含まれる1若しくは2つのポリヌクレオチド、細胞、トランスジェニック植物、非ヒトトランスジェニック動物の、非治療目的のための分子生物学、インビボ又はインビトロでの遺伝子操作、及びインビボ又はインビトロでのゲノム操作のための使用でもある。
非治療目的は、例えば(i) タンパク質産生のための細胞パッケージング系統における特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(ii) 株の改良及び代謝工学のための農作物における特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(iii) 遺伝子改変農作物におけるマーカーの除去のための標的された組換え、(iv) 遺伝子改変微生物株(例えば抗生物質製造のため
)におけるマーカーの除去のための標的された組換えを含む。
)におけるマーカーの除去のための標的された組換えを含む。
上記の使用の有利な実施形態によると、これは、キメラDNA標的配列を含む興味のある部位に二本鎖切断を誘導することにより、DNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘発するためである。
本発明によると、上記の二本鎖切断は、特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、変異遺伝子の場所に機能的遺伝子を回復させるため、興味のある内因性遺伝子を減弱化又は活性化させるため、興味のある部位に変異を導入するため、外因性遺伝子又はその一部分を導入するため、内因性遺伝子又はその一部分を不活性化又は検出するため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを対形成させずに分解させるためである。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記の変異型、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳類は、上記で定義される標的化DNA構築物と会合する(are associated with)。
本発明の主題は、上記で定義されるキメラDNA標的を含むベクターを、上記で定義される変異型と接触させて、該ベクター上に位置する興味のある部位で二本鎖核酸を切断することにより、該変異型の切断部位を取り囲む配列と相同性を示す別のベクターとの相同組換えを誘導する工程を含むことを特徴とする、遺伝子操作の方法でもある。
本発明の主題は、1) 上記で定義される変異型の少なくとも1つのキメラDNA標的配列を含むゲノム遺伝子座を、該標的を上記の変異型と接触させることにより二本鎖切断する工程と、2) 上記の切断されたゲノム遺伝子座を、標的遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれている該遺伝子座に導入される配列を含む標的化DNA構築物との相同組換えに適する条件下に保持する工程とを含むことを特徴とする、ゲノム操作の方法でもある。
本発明の主題は、以下の：1) 上記で定義される変異型の少なくとも1つのキメラDNA標的を含むゲノム遺伝子座を、該切断部位を上記の変異型と接触させることにより、二本鎖切断する工程、2) 上記の切断されたゲノム遺伝子座を、上記の切断部位を取り囲む領域と相同性を共有する染色体DNAとの相同組換えに適する条件下に保持する工程を含むことを特徴とするゲノム操作の方法でもある。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つの変異型、好ましくは発現ベクターに含まれる1又は2つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組成物でもある。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、標的にされる遺伝子座と相同性を共有する配列に挟まれている興味のある部位を修復する配列を含む標的化DNA構築物を含む。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、標的にされる遺伝子座と相同性を共有する配列に挟まれている興味のある部位を修復する配列を含む標的化DNA構築物を含む。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つの変異型、好ましくは発現ベクターに含まれる1又は2つのポリヌクレオチドの、必要とする個体における遺伝性疾患を予防、改善又は治癒するための医薬の製造のための使用でもあり、該医薬は、該個体にいずれの手段により投与される。
本発明の主題は、いずれの手段により、上記で定義される組成物を個体に投与する工程を少なくとも含む、必要とする個体における遺伝性疾患を予防、改善又は治癒する方法でもある。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つの変異型、好ましくは発現ベクターに含まれる1又は2つのポリヌクレオチドの、必要とする個体において、DNA中間体(interm
ediate)を提示する感染因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための医薬の製造のための使用でもあり、該医薬は、個体にいずれの手段により投与される。
ediate)を提示する感染因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための医薬の製造のための使用でもあり、該医薬は、個体にいずれの手段により投与される。
本発明の主題は、必要とする個体において、DNA中間体を提示する感染因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒する方法でもあり、該方法は、該個体に、上記で定義される組成物をいずれの手段により投与する工程を少なくとも含む。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つの変異型、好ましくは発現ベクターに含まれる1又は2つのポリヌクレオチドの、生物学的に誘導された生成物、又は生物学的使用を意図する生成物においてDNA中間体を提示する感染因子の増殖の阻害、不活性化又は消去のため、或いは物体の消毒のためのインビトロでの使用でもある。
本発明の主題は、生成物又は物質を、DNA中間体を提示する感染因子から除染する方法でもあり、該方法は、生物学的に誘導された生成物、生物学的使用を意図する生成物又は物体を、上記で定義される組成物と、該感染因子の増殖の阻害、不活性化又は消去に充分な時間接触させる工程を少なくとも含む。
ある具体的な実施形態において、上記の感染因子はウイルスである。例えば、該ウイルスは、アデノウイルス(Ad11、Ad21)、ヘルペスウイルス(HSV、VZV、EBV、CMV、ヘルペスウイルス6、7又は8)、ヘパドナウイルス(HBV)、パポバウイルス(HPV)、ポックスウイルス、又はレトロウイルス(HTLV、HIV)である。
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも1つのホーミングエンドヌクレアーゼ変異型の、他のメガヌクレアーゼを作製するための骨格としての使用でもある。例えば、新規な第三世代のホーミングエンドヌクレアーゼの作製の目的のために、3回目の突然変異誘発と選択／スクリーニングとを該変異型に対して行うことができる。
上記の使用の別の有利な実施形態によると、上記のホーミングエンドヌクレアーゼ変異型は、上記で定義される標的化DNA構築物と会合する。
本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼ変異型の使用及び該ホーミングエンドヌクレアーゼ変異型の使用方法は、上記で定義される、該変異型に由来する単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、該変異型又は単鎖キメラエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳類の使用も含む。
上記の特徴に加えて、本発明は、本発明によるI-CreIメガヌクレアーゼ変異型及びそれらの使用を示す実施例、並びに添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の特徴も含む。該図面において：
- 図1は、本発明の原理を示す。A: その標的に結合しているI-CreIの構造。実験データは、2つの独立したサブドメイン(四角)を、DNA結合ドメイン内で同定し得ることを示す。コアドメインの各サブドメインは、DNA標的の異なる半分に結合する。B. 半DNA標的の別個の部分にそれぞれが結合するより小さい独立サブドメイン(四角)を同定したいであろう。しかし、この仮定を支持する構造又は実験のデータはない。
- 図1は、本発明の原理を示す。A: その標的に結合しているI-CreIの構造。実験データは、2つの独立したサブドメイン(四角)を、DNA結合ドメイン内で同定し得ることを示す。コアドメインの各サブドメインは、DNA標的の異なる半分に結合する。B. 半DNA標的の別個の部分にそれぞれが結合するより小さい独立サブドメイン(四角)を同定したいであろう。しかし、この仮定を支持する構造又は実験のデータはない。
- 図2は、Chevalier及びStoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757〜74 ; Chevalierら J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜69の後の、そのDNA標的とのI-CreIの塩基特異的相互作用のマップを表す。本発明者は、-10〜-8及び8〜10、又は-5〜-3及び3〜5の領域で改変されたDNA標的に結合可能な新規なI-CreI由来エンドヌクレアーゼを同定している。これらのDNA標的を、灰色の箱で囲む。
- 図3は、再設計されたホーミングエンドヌクレアーゼの作製のためのストラテジを示す。a. 一般的なストラテジ。局所的に特異性を変更したI-CreI誘導体の大きい集団を作製する。次いで、コンビナトリアルアプローチを用いて、これらの変異体をホモタイマータンパク質に、次いでヘテロダイマーに組み立てて、完全に再設計された特異性を有するメガヌクレアーゼを得る。b. COMB1標的(配列番号53)を切断するコンビナトリアル変異体の作製：作業の流れ。2つのパリンドローム標的(COMB2 (配列番号39)及びCOMB3 (配列番号46))は、COMB1標的に由来し、ホモダイマーコンビナトリアル変異体を、これらの2つの標的を切断するように設計する。次いで、陽性のものを同時発現させてCOMB1標的を切断する。c. 標的のRAG1系列。2つのパリンドローム標的(RAG1.2 (配列番号55)及びRAG1.3 (配列番号56))は、RAG1.1 (配列番号54)に由来する。次いで、標的のCOMB系列について記載したものと同様の作業の流れを適用できる。
- 図4は、変異型のスクリーニングを示す。(a) 酵母スクリーニングアッセイの原理。LEU2遺伝子をマーカーとして有し、アッセイされるメガヌクレアーゼを発現する株(MEGA)を、TRP1遺伝子をマーカーとして有し、選択された標的を含むレポータープラスミドを有する株と交配させる。標的は、オーバーラップ短縮LacZ遺伝子(LAC及びACZ)で挟まれる。二倍体(LEU2, TRP1)において、メガヌクレアーゼによる標的部位の切断は、2つのlacZ反復間の相同組換えを誘発し、機能的ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子をもたらし、これはX-Gal染色により監視できる。(b) 実験のスキーム。I-CreI変異型のライブラリーをPCRを用いて構築し、複製可能な酵母発現ベクターにクローニングし、S. cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)に形質転換する。64個のパリンドローム標的を、LacZに基づく酵母レポーターベクターにクローニングし、得られるクローンをFYBL2-7B株(MATa, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)に形質転換する。フィルタメンブレン上のロボット支援グリッド付け(gridding)を用いて、メガヌクレアーゼ変異型を発現する個別のクローンと、レポータープラスミドを有する個別のクローンとの間の交配を行う。１次ハイスループットスクリーニングの後に、陽性クローンのORFをPCRにより増幅して配列決定する。I-CreI N75骨格タンパク質から誘導した44位、68位及び70位での410個の異なる変異型を、2100個の陽性の中から同定し、低密度で試験して完全なパターンを確立し、350個のクローンを確認した。また、294個の変異体を酵母ベクターに再クローニングし、2次スクリーニングで試験し、結果は再クローニングせずに得られたものを確認した。選択されたクローンは、次いで、切断活性について、類似のCHOに基づくアッセイ及び結局はインビトロでアッセイする。
- 図5は、一連の変異型の切断パターンを示す。変異型は、44位、68位及び70位の残基に対応する3文字で同定する。各変異体は、±3〜5位のヌクレオチドの置換及び一連のコントロール標的により、I-CreIにより切断されるC1221パリンドローム標的に由来する64個の標的に対して試験する。標的マップは、上部右パネルに示す。I-CreIタンパク質及び8つの誘導体についての酵母(左)及び哺乳動物細胞(右)での切断パターン。酵母については、最初の未処理データ(フィルタ)を示す。CHO細胞について、定量未処理データ(ONPG測定)を示し、0.25より優れた値を四角で囲み、0.5より優れた値を中程度の灰色で強調し、1より優れた値を濃い灰色で囲んだ。LacZ: 陽性コントロール。0: 標的なし。U1、U2及びU3: 3つの異なる切断されないコントロール。
- 図6は、統計データを表す。(a) 切断された標的: I-CreI変異型により切断された標的は、灰色に着色する。各標的を切断するタンパク質の数を下に示し、灰色の着色程度が酵母においてこれらの切断者を用いて得られる平均シグナル強度に比例する。(b) 7クラスタのうち3つの分析。各変異体クラスタについて(クラスタ1、3及び7)、各標的についての累積強度を計算し、バープロット(左欄)は、標準化された強度が減少する順に示す。各クラスタについて、各位置(44、68及び70)での各型のアミノ酸の数を、右欄のコード化ヒス
トグラムとして示す。アミノ酸着色コードの凡例は、図の下にある。(c) 酵母における変異体及び標的のデータの階層的クラスタリング。変異体及び標的は、ともに、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., American statist. Assoc., 1963, 58, 236〜244)を用いる階層的クラスタリングを用いてクラスタにした。クラスタリングは、R packageからのhclustを用いて行った。変異型及び標的のデンドログラムは、クラスタの位置を最適化するために並べなおし、変異体デンドログラムは、推定されるクラスタと8の高さで切断した。QRR変異体及びGTC標的は、矢印で示す。灰色のレベルは、シグナル強度を反映する。
トグラムとして示す。アミノ酸着色コードの凡例は、図の下にある。(c) 酵母における変異体及び標的のデータの階層的クラスタリング。変異体及び標的は、ともに、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., American statist. Assoc., 1963, 58, 236〜244)を用いる階層的クラスタリングを用いてクラスタにした。クラスタリングは、R packageからのhclustを用いて行った。変異型及び標的のデンドログラムは、クラスタの位置を最適化するために並べなおし、変異体デンドログラムは、推定されるクラスタと8の高さで切断した。QRR変異体及びGTC標的は、矢印で示す。灰色のレベルは、シグナル強度を反映する。
- 図7は、ハイブリッド又はキメラ部位の例を示す。gtt (配列番号3)及びcct (配列番号4)は、I-CreI部位に由来する2つのパリンドローム部位である。gtt/cctハイブリッド部位(配列番号5)は、上の鎖の-5、-4、-3にgtt配列を、下の鎖の5、4、3にcct配列を示す。
- 図8は、ヘテロダイマー変異型の切断活性を示す。酵母を、KTG変異型及びQAN変異系で同時形質転換した。標的の編成は、上部のパネルに示す。単独のgtt、cct又はgcc半部位を有する標的は、太字で示す。ホモ-及び／又はへテロダイマーで切断されると予測される2つのこのような半部位を有する標的は、太字及び灰色で強調する。0: 標的なし。結果は、下の3つのパネルに示す。予期せぬ弱いシグナルは、それぞれKTG及びQANにより切断されるgtc/cct及びgtt/gtcについてのみ観察される。
- 図9は、ヘテロダイマー変異型の切断活性の定量的分析を表す。(a) 酵母における選択された変異型の同時形質転換。明確にするために、関連するハイブリッド標的についての結果のみを示す。aac/acc標的は、関連しない標的の例として常に示す。KTGxAGR対について、パリンドロームtac及びtct標的は、示していないが、それぞれAGR及びKTGにより切断される。RRN変異体によるcat標的の切断は非常に低く、酵母では定量できなかった。(b) CHO細胞における一過性同時トランスフェクション。(a)及び(b)について、黒色のバー: 第1変異体単独についてのシグナル; 灰色のバー: 第2変異体単独についてのシグナル; ストライプのバー: 同時発現又は同時トランスフェクションにより得られるシグナル。
- 図10は、I-CreI N75骨格タンパク質、並びにUlib4及びUlib5ライブラリーの構築に用いた縮重プライマーの配列を表す。A. 骨格(配列番号6)は、D75Nコドン置換及び3'末端に追加の3コドン(AAD)を含むI-CreI ORFである。B. プライマー(配列番号7、8、9)。
- 図11は、各標的を切断するパターンと変異体の数の例を示す。A. プロファイリングの例。それぞれの新規なエンドヌクレアーゼを、図2に示す配列とは±8、±9及び±10位で異なる図11Bのように整列させた一連の64個のパリンドローム標的に対して、酵母でプロファイリングする。各標的配列は、-10,-9,-8トリプレット(10NNN)にちなんで命名する。例えば、GGGは、tcgggacgtcgtacgacgtcccga標的(配列番号17; 図14B)に相当する。メガヌクレアーゼは、64個の標的に対して4回試験する。I-CreI (D75)、I-CreI N75又は10個の誘導変異型により切断される標的を、黒色又は灰色のスポットにより可視化する。B. 各標的を切断する変異体の数、及び切断の平均強度。各配列は、-10,-9,-8トリプレット(10NNN)にちなんで命名する。各標的を切断するタンパク質の数を下に示し、灰色の着色のレベルは、酵母においてこれらの切断者(cutter)を用いて得られた平均シグナル強度に比例する。
- 図12は、28、30、33、38及び／又は40位でのI-CreI変異型の切断パターンを表す。スクリーニングの後に得られ、28位、30位、33位、38位、40位、70位及び75位の残基により規定される141個のI-CreI変異型のそれぞれについて、I-CreIにより切断されるC1221パリンドローム標的から±8〜10位のヌクレオチドの置換により導かれる64個の標的を用いて酵母において切断を監視した。標的は、-10位、-9位及び-8位のヌクレオチドに相当する3文
字で表記する。例えば、GGGは、tcgggacgtcgtacgacgtcccga標的(配列番号17)に相当する。値(箱で囲む)は、フィルタのスキャンの後に適切なソフトウェアにより評価した切断強度に対応し、(0)は切断がないことを示す。
字で表記する。例えば、GGGは、tcgggacgtcgtacgacgtcccga標的(配列番号17)に相当する。値(箱で囲む)は、フィルタのスキャンの後に適切なソフトウェアにより評価した切断強度に対応し、(0)は切断がないことを示す。
- 図13は、その標的に結合しているI-CreIホモダイマー上のタンパク質及びDNA標的における変異の局在化を表す。2組の変異(残基44、68及び70; 残基30、33及び38)を、左のモノマー上に黒色で示す。2組の変異は、空間的に明確に区別される。しかし、明確なサブドメインについての構造的証拠はない。DNA標的部位の同族領域(領域-5〜-3; 領域-10〜-8)を、1つの半部位上に灰色で示す。
- 図14: I-CreI誘導体の標的の定義(A及びB)、及びプロファイリング(C及びD)。全ての標的は、I-CreI野生型により切断され、A及びBの上部に示されるパリンドローム標的であるC1221から導かれる。A. 64個の標的の第1の系列は、±5〜±3位(灰色の箱)の突然変異誘発により導かれる。いくつかの例を以下に示す。I-CreI残基44、68及び70との相互作用を示す。B. 64個の標的の第2の系列は、±10〜±8位(灰色の箱)の突然変異誘発により導かれる。いくつかの例を以下に示す。±8、±9及び±10位は、残基44、68及び70とは接触しない。C. 図13Dのような標的の編成。左のパネルについて、表の3文字は、±3、±4及び±5位の塩基を示す(例えば、GGGは、tcaaaacggggtaccccgttttga (配列番号10)を意味する)。右のパネルについて、3文字は、±8、±9及び±10位の塩基を示す(例えば、GGGは、tcgggacgtcgtacgacgtcccga (配列番号17)を意味する)。D. プロファイリング。I-CreI N75 (QRR)を含む、C1221標的を切断する10個のI-CreI変異型を、64個の標的の2組を用いてプロファイリングする(左側に±5〜±3、右側に±10〜±8)。標的は、図13Cのように整列させる。C1221標的(四角で囲む)は、両方の組に見出される。変異体は、44、68及び70位に見出される残基に対応する3文字で同定され(例:QRRは、Q44、R68、R70)、これらの全ては追加のD75N変異を有する。
- 図15は、その標的に結合しているI-CreIホモダイマー上のタンパク質及びDNA標的における変異の局在化を表す。2組の変異(残基44、68及び70; 残基28、30、33、38及び40)は、左のモノマー上に黒色で示す。2組の変異は、空間的に明確に区別される。しかし、明確なサブドメインについての構造的証拠はない。DNA標的部位の同族領域(領域-5〜-3; 領域-10〜-8)を、1つの半部位上に灰色で示す。
- 図16は、キメラ標的COMB2 (tctggacgacgtacgtcgtcctga: 配列番号39)を切断する44、68、70位及び28、30、33、38、40位の変異の組み合わせを示す。上のパネル: それに続くパネル上の変異体の特徴のマップ。文字で示すように、コンビナトリアル変異体は、28、30、33、38、40、44、68及び70位の残基にちなんで8文字コードで命名し、親のコントロールは、28、30、33、38及び40位又は44、68及び70位の残基にちなんで5文字又は3文字コードで命名する。変異体は、酵母においてCOMB2と、2つの親の標的である10TGC及び5GACとに対してスクリーニングする。
- 図17は、キメラtcaacaccctgtacagggtgttga標的(配列番号49)を切断する44、68、70位及び28、30、33、38、40位の変異の組み合わせを示す。A. 44、68及び70位、28、30、33、38及び40位のいずれかで変異したタンパク質を、キメラ標的に対してアッセイする。44、68及び70で変異したタンパク質は、44、68及び70位のアミノ酸残基を示す3文字コードで表す(例: AAKはA44、A68、K70を意味する)。28、30、33、38及び40で変異したタンパク質を、28、30、33、38及び40位のアミノ酸残基を示す5文字コードで表す(例: KNRQQはK28、N30、R33、Q38、Q40を意味する)。B. キメラタンパク質を、キメラDNA標的に対してアッセイする。タンパク質は、パネルの左に示す28、30、33、38、40での変異、並びにパネルに3文字コードで示す44、68及び70での変異により定義される。キメラDNA標的を切断するキメラタンパク質を丸で囲む。
- 図18は、キメラtcaacactttgtacaaagtgttga標的(配列番号52)を切断する44、68、70位及び28、30、33、38、40位での変異の組み合わせを示す。A. 44、68及び70、28、30、33、38及び40のいずれかで変異されたタンパク質を、キメラ標的に対してアッセイする。44、68及び70で変異されたタンパク質は、44、68及び70位のアミノ酸残基を示す3文字コードで表す(例: AARはA44、A68、R70を意味する)。28、30、33、38及び40で変異されたタンパク質は、28、30、33、38及び40位のアミノ酸残基を示す5文字コードで表す(例: KNRQEは、K28、N30、R33、Q38、E40を意味する)。B. キメラタンパク質を、キメラDNA標的に対してアッセイする。タンパク質は、パネルの左に示す28、30、33、38、40での変異、及びパネルに3文字コードで示す44、68及び70での変異により定義される。
- 図19は、コンビナトリアル変異体の生化学的及び生物物理学的特徴づけを示す。a. インビトロ切断についての未処理データの例。異なる濃度のタンパク質をアッセイした。レーン1〜15: nMでのタンパク質濃度は、250、189.4、126.3、84.2、63.2、42.1、21.1、15.8、10.5、7.4、4.2、2.1、1.0、0.5及び0である。b. コンビナトリアル変異体によるCOMB2の切断。c. コンビナトリアル変異体によるCOMB3の切断。d. CDにより測定された、同じタンパク質の熱変性。太いラインは、65℃の中間点変性温度を有するI-CreI N75に対応する。他のタンパク質: KNHQS/KEG (中間点変性温度: 65.3℃)、KNHQS/KAS (64.9℃)、KEG (63.1℃)、KNHQS (62.2℃)、NNSRQ (61.2℃)、KAS (61.2℃)、KAS (61.2℃)、ARR (57.3℃)、ASR (57.1℃)、NNSRK/ARR (55.8℃)、NNSRK/ASR (55.8℃)。タンパク質の命名については図16を参照されたい。
- 図20は、再設計されたヘテロダイマーによる非パリンドローム標的の切断を示す。a. ヘテロダイマーによるCOMB1の切断(下部の右のパネル)。親のホモダイマーによるCOMB2及びCOMB3パリンドローム標的の切断は、上部の左のパネルに示す。コンビナトリアル変異体について、命名は、図16及び本文と同じである。b. RAG1.1標的のヘテロダイマーによる切断。本文に記載するように、コンビナトリアル変異体は、28、30、33、38、40、44、68、70、75及び77位に対応する、8ではなく10残基にちなんで命名する。
実施例1：新しい機能的エンドヌクレアーゼのスクリーニング：ヌクレオチド±3〜±5 (5NNN)に対する新しい特異性を有するI-CreI変異型の工学的な作製
メガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、及び特異性が変更された変異型をスクリーニングするために用いる哺乳類又は酵母細胞における切断誘導組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004/067736、及びEpinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962に記載される。これらのアッセイは、機能的LacZレポーター遺伝子をもたらし、これは標準的な方法により監視できる(図4a)。
メガヌクレアーゼ変異型を作製する方法、及び特異性が変更された変異型をスクリーニングするために用いる哺乳類又は酵母細胞における切断誘導組換えに基づくアッセイは、国際PCT出願WO 2004/067736、及びEpinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962に記載される。これらのアッセイは、機能的LacZレポーター遺伝子をもたらし、これは標準的な方法により監視できる(図4a)。
A) 材料及び方法
a) 変異体ライブラリーの構築
I-CreI骨格タンパク質のオープンリーディングフレームを、以前に記載されたようにして合成した(Epinatら, N.A.R., 2003, 31, 2952〜2962)。I-CreI骨格タンパク質は、野生型I-CreI、I-CreI D75N (I-CreI N75)、I-CreI R70S、D75N (I-CreI S70 N75)、I-CreI I24V, R70S, D75N (I-CreI V24 S70 N75)、及びI-CreI I24V, R70S (I-CreI V24 S70)を含む。コンビナトリアルライブラリーは、1つのDNA標的半部位の±3〜5位の塩基との相互作用に参加する可能性がある残基の異なる組み合わせを置換することにより(Q44、R68、R70、D75及びI77)、I-CreI骨格タンパク質から誘導した。メガヌクレアーゼライブラリーの多様性は、選択された位置のそれぞれでユニーク縮重コドンを有する縮重プライマーを用いるPCRにより作製した。例えば、変異D75Nは、コドン75をaacで置換することにより導入した。次いで、I-CreI N75 cDNA鋳型に対するPCRを、SigmaからのコドンVVK (18コドン、アミノ酸ADEGHKNPQRST)を、44、68及び70位に有するプライマーを用いて行った。最終のP
CR産物を、特異的制限酵素で消化し、pCLS0542内の同じ制限酵素で消化したI-CreI ORFにクローニングしなおした。LEU2遺伝子をマーカーとして有するこの2ミクロンに基づく複製ベクターにおいて、I-CreI変異型は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある(Epinatら, 上記)。E. coliでのエレクトロポレーションの後に、DNAレベルで12倍の理論的多様性を示す7×104クローンを得た(183 = 5832)。
a) 変異体ライブラリーの構築
I-CreI骨格タンパク質のオープンリーディングフレームを、以前に記載されたようにして合成した(Epinatら, N.A.R., 2003, 31, 2952〜2962)。I-CreI骨格タンパク質は、野生型I-CreI、I-CreI D75N (I-CreI N75)、I-CreI R70S、D75N (I-CreI S70 N75)、I-CreI I24V, R70S, D75N (I-CreI V24 S70 N75)、及びI-CreI I24V, R70S (I-CreI V24 S70)を含む。コンビナトリアルライブラリーは、1つのDNA標的半部位の±3〜5位の塩基との相互作用に参加する可能性がある残基の異なる組み合わせを置換することにより(Q44、R68、R70、D75及びI77)、I-CreI骨格タンパク質から誘導した。メガヌクレアーゼライブラリーの多様性は、選択された位置のそれぞれでユニーク縮重コドンを有する縮重プライマーを用いるPCRにより作製した。例えば、変異D75Nは、コドン75をaacで置換することにより導入した。次いで、I-CreI N75 cDNA鋳型に対するPCRを、SigmaからのコドンVVK (18コドン、アミノ酸ADEGHKNPQRST)を、44、68及び70位に有するプライマーを用いて行った。最終のP
CR産物を、特異的制限酵素で消化し、pCLS0542内の同じ制限酵素で消化したI-CreI ORFにクローニングしなおした。LEU2遺伝子をマーカーとして有するこの2ミクロンに基づく複製ベクターにおいて、I-CreI変異型は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある(Epinatら, 上記)。E. coliでのエレクトロポレーションの後に、DNAレベルで12倍の理論的多様性を示す7×104クローンを得た(183 = 5832)。
b) 標的クローンの構築
C1221の24 bpのパリンドローム(tcaaaacgtcgtacgacgttttga, 配列番号1)は、ほぼパリンドロームの天然I-CreI標的(tcaaaacgtcgtgagacagtttgg, 配列番号24) の半部位の反復である。C1221は、酵母及び哺乳動物細胞の両方におけるインビトロ及びエクスビボでI-CreI天然標的と同様に効率的に切断される。64個のパリンドローム標的は、次のようにしてC1221から誘導した。オリゴヌクレオチドの64対(ggcatacaagtttcaaaacnnngtacnnngttttgacaatcgtctgtca (配列番号25)及び逆相補配列) を、Sigmaに注文し、アニールし、pGEM-T Easy (PROMEGA)に同じ方向でクローニングした。次いで、400 bpのPvuIIフラグメントを切り出し、ともに以前に記載されたpCLS0042ともよばれる酵母ベクターpFL39-ADH-LACURAZ、及び哺乳動物ベクターpcDNA3.1-LACURAZ-ΔURAにクローニングして(Epinatら, 上記)、64個の酵母レポーターベクター(標的プラスミド)を得た。
C1221の24 bpのパリンドローム(tcaaaacgtcgtacgacgttttga, 配列番号1)は、ほぼパリンドロームの天然I-CreI標的(tcaaaacgtcgtgagacagtttgg, 配列番号24) の半部位の反復である。C1221は、酵母及び哺乳動物細胞の両方におけるインビトロ及びエクスビボでI-CreI天然標的と同様に効率的に切断される。64個のパリンドローム標的は、次のようにしてC1221から誘導した。オリゴヌクレオチドの64対(ggcatacaagtttcaaaacnnngtacnnngttttgacaatcgtctgtca (配列番号25)及び逆相補配列) を、Sigmaに注文し、アニールし、pGEM-T Easy (PROMEGA)に同じ方向でクローニングした。次いで、400 bpのPvuIIフラグメントを切り出し、ともに以前に記載されたpCLS0042ともよばれる酵母ベクターpFL39-ADH-LACURAZ、及び哺乳動物ベクターpcDNA3.1-LACURAZ-ΔURAにクローニングして(Epinatら, 上記)、64個の酵母レポーターベクター(標的プラスミド)を得た。
あるいは、単鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて、酵母及び哺乳動物レポーターベクターにクローニングした。
c) 酵母株
メガヌクレアーゼ発現変異型のライブラリーを、leu2変異一倍体酵母株FYC2-6A: alpha, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200に形質転換した。(Gietz及びWoods, Methods Enzymol.,
2002, 350, 87〜96)に基づく従来の化学／熱ショックプロトコールを形質転換に用いたが、これは、通常、DNAのμg当たり106個の独立した形質転換体を与える。個別の形質転換体(Leu+)クローンを、96ウェルのマイクロプレートに別々に採取した。13824個のコロニーをコロニー採取器(QpixII, GENETIX)で採取し、144枚のマイクロタイタープレートで成長させた。
メガヌクレアーゼ発現変異型のライブラリーを、leu2変異一倍体酵母株FYC2-6A: alpha, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200に形質転換した。(Gietz及びWoods, Methods Enzymol.,
2002, 350, 87〜96)に基づく従来の化学／熱ショックプロトコールを形質転換に用いたが、これは、通常、DNAのμg当たり106個の独立した形質転換体を与える。個別の形質転換体(Leu+)クローンを、96ウェルのマイクロプレートに別々に採取した。13824個のコロニーをコロニー採取器(QpixII, GENETIX)で採取し、144枚のマイクロタイタープレートで成長させた。
64個の標的プラスミドを、同じプロトコルを用いて、一倍体酵母株FYBL2-7B: a, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202に形質転換し、64個の試験株を得た。
d) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
メガヌクレアーゼ発現クローンは、64個の標的株のそれぞれと交配させ、図4に示すスクリーニングアッセイを用いることにより二倍体をベータ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。I-CreI変異型クローン、及び酵母レポーター株をグリセロール(20%)中に仕込み、新しいマイクロプレートで複製させた。交配は、コロニーグリッダー(QpixII, GENETIX)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に高グリッド密度(high gridding density)で(約20スポット/cm2)スポットした。第2のグリッド付けプロセスは、同じフィルタ上に、各変異体についての64又は75個の異なるレポーター含有酵母株からなる第2の層をスポットして行った。メンブレンを固形寒天YEPD富化培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして交配させた。次いで、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース(2 %)を炭素源として含む(及び同時発現実験についてG418を含む)合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートし、発現ベクター及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0、0.1 % SDS、6 %ジメチルホルムアミド(DMF)、7 mM β-メルカプトエタノール、1%アガロース中に0.02 % X-Galを含む固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性を監視した。2日間のインキュベーションの後に
、陽性のクローンをスキャンにより同定した。クローンのβ-ガラクトシダーゼ活性を、適切なソフトウェアを用いて定量した。
メガヌクレアーゼ発現クローンは、64個の標的株のそれぞれと交配させ、図4に示すスクリーニングアッセイを用いることにより二倍体をベータ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。I-CreI変異型クローン、及び酵母レポーター株をグリセロール(20%)中に仕込み、新しいマイクロプレートで複製させた。交配は、コロニーグリッダー(QpixII, GENETIX)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に高グリッド密度(high gridding density)で(約20スポット/cm2)スポットした。第2のグリッド付けプロセスは、同じフィルタ上に、各変異体についての64又は75個の異なるレポーター含有酵母株からなる第2の層をスポットして行った。メンブレンを固形寒天YEPD富化培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして交配させた。次いで、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース(2 %)を炭素源として含む(及び同時発現実験についてG418を含む)合成培地に移し、37℃にて5日間インキュベートし、発現ベクター及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。5日後に、フィルタを、0.5 Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0、0.1 % SDS、6 %ジメチルホルムアミド(DMF)、7 mM β-メルカプトエタノール、1%アガロース中に0.02 % X-Galを含む固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性を監視した。2日間のインキュベーションの後に
、陽性のクローンをスキャンにより同定した。クローンのβ-ガラクトシダーゼ活性を、適切なソフトウェアを用いて定量した。
少なくとも1つの標的に対して活性を示すクローンを単離した(1次スクリーニング)。スポットする密度を、次いで、4スポット/cm2まで減らし、各陽性クローンを、4重で64個のレポーター株に対して試験して、完全なプロファイルを作製した(2次スクリーニング)。
e) 配列
酵母での1次及び／又は2次スクリーニングの間に同定された陽性のクローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、PROLIGOからのプライマー：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc (配列番号26)及びggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc (配列番号27)を用いて、酵母コロニーに対するPCRにより増幅した。簡単に、酵母コロニーを採取し、100μlのLGlu液体培地中に再懸濁し、一晩培養した。遠心分離の後に、酵母ペレットを10μlの滅菌水に再懸濁し、1.5μlの各特異的プライマー(100 pmol/μl)を含む50μlの最終容量でPCR反応を行うのに用いた。PCR条件は、94℃にて10分間の変性を1サイクル、94℃にて30秒の変性、55℃にて1分のアニーリング、72℃にて1.5分の伸長を35サイクル、及び最終伸長の5分であった。得られたPCR生成物を、次いで、配列決定した。
酵母での1次及び／又は2次スクリーニングの間に同定された陽性のクローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、PROLIGOからのプライマー：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgaaggagatagaaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc (配列番号26)及びggggaccactttgtacaagaaagctgggtttagtcggccgccggggaggatttcttcttctcgc (配列番号27)を用いて、酵母コロニーに対するPCRにより増幅した。簡単に、酵母コロニーを採取し、100μlのLGlu液体培地中に再懸濁し、一晩培養した。遠心分離の後に、酵母ペレットを10μlの滅菌水に再懸濁し、1.5μlの各特異的プライマー(100 pmol/μl)を含む50μlの最終容量でPCR反応を行うのに用いた。PCR条件は、94℃にて10分間の変性を1サイクル、94℃にて30秒の変性、55℃にて1分のアニーリング、72℃にて1.5分の伸長を35サイクル、及び最終伸長の5分であった。得られたPCR生成物を、次いで、配列決定した。
f) 1次ヒットの再クローニング
1次スクリーニングの間に同定された陽性クローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、Gatewayプロトコル(Invitrogen)を用いて再クローニングした。ORFは、酵母コロニー上でPCRにより、e)に記載するようにして増幅した。次いで、PCR産物を: (i) ガラクトース誘導性プロモーター、選択マーカーとしてのLEU2又はKanR、及び2ミクロン複製起点を有する酵母ゲートウェイ発現ベクター、及び(ii) NOVAGENからのpET 24d(+)ベクターにクローニングした。得られたコロニーは、配列決定(MILLEGEN)により確認した。
1次スクリーニングの間に同定された陽性クローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、Gatewayプロトコル(Invitrogen)を用いて再クローニングした。ORFは、酵母コロニー上でPCRにより、e)に記載するようにして増幅した。次いで、PCR産物を: (i) ガラクトース誘導性プロモーター、選択マーカーとしてのLEU2又はKanR、及び2ミクロン複製起点を有する酵母ゲートウェイ発現ベクター、及び(ii) NOVAGENからのpET 24d(+)ベクターにクローニングした。得られたコロニーは、配列決定(MILLEGEN)により確認した。
B) 結果
I-CreIは、22 bpの偽パリンドローム標的を切断するダイマーホーミングエンドヌクレアーゼである。その天然の標的に結合したI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて、8残基が7塩基と直接的な相互作用を確立していることを示している(Juricaら, 1998, 上記)。残基Q44、R68、R70は、3〜5位の連続塩基対と接触する(及び-3〜-5、図2)。網羅的なタンパク質ライブラリーに対する標的ライブラリーのアプローチは、DNA結合界面のこの部分を局所的に改変するために行われた。
I-CreIは、22 bpの偽パリンドローム標的を切断するダイマーホーミングエンドヌクレアーゼである。その天然の標的に結合したI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて、8残基が7塩基と直接的な相互作用を確立していることを示している(Juricaら, 1998, 上記)。残基Q44、R68、R70は、3〜5位の連続塩基対と接触する(及び-3〜-5、図2)。網羅的なタンパク質ライブラリーに対する標的ライブラリーのアプローチは、DNA結合界面のこの部分を局所的に改変するために行われた。
第1ライブラリーにおいて、I-CreI骨格をD75からNに変異させて、I-CreI構造において埋め込まれたD75の水素受容体電荷を満足するライブラリー内の塩基性残基R68及びR70の置換により引き起こされる、ありそうなエネルギーのゆがみを低減させた。D75N変異は、タンパク質構造に影響しなかったが、過剰発現実験におけるI-CreIの毒性を低減させた。次いで、44、68及び70位を無作為化した。
第2ライブラリーにおいて、I-CreI骨格を、R70からS及びI24からVに変異させた(I-CreI
V24, S70)。これらの変異は、タンパク質構造に影響しなかった。次いで、44、68、75及び77位を無作為化した。
V24, S70)。これらの変異は、タンパク質構造に影響しなかった。次いで、44、68、75及び77位を無作為化した。
図13Aに記載するように、I-CreIにより切断されるパリンドローム標的(Chevalierら, 2003, 上記)の±3、±4及び±5位の置換により得られる64個のパリンドローム標的を作製した。
ロボット支援交配プロトコルを用いて、我々のライブラリーから多数のメガヌクレアーゼをスクリーニングした。一般的なスクリーニングのストラテジは、図4bに記載する。
ロボット支援交配プロトコルを用いて、我々のライブラリーから多数のメガヌクレアーゼをスクリーニングした。一般的なスクリーニングのストラテジは、図4bに記載する。
44、68及び70位に多様性を有するI-CreI N75変異体のライブラリーからの結果を、以下に詳述する。13,824個のメガヌクレアーゼ発現クローン(理論的多様性約2.3倍)を、高密度(20スポット/cm2)にてナイロンフィルタ上にスポットし、64個の標的株のそれぞれに対して個別に試験した(884,608スポット)。少なくとも1つの標的に対する活性を示す2100個のクローンを単離し(図4b)、メガヌクレアーゼをコードするORFをPCRにより増幅して配列決定した。410個の異なる配列を同定し、類似の数の対応するクローンを、さらなる分析のために選択した。スポット密度は、4スポット/cm2に減らし、各クローンを4重で64個のレポーター株に対して試験して、完全なプロファイルを作製した(図5のように)。350個の陽性を確認できた。次に、1より多いクローンを含有する株の可能性を回避するために、変異ORFをPCRにより増幅し、酵母ベクターに再クローニングした。得られたプラスミドは、個別に酵母に形質転換しなおした。294個のこのようなクローンを得て、低密度で試験した(4スポット/cm2)。1次スクリーニングでの違いは、弱いシグナルについてほとんど観察され、28個の弱い切断者が今回陰性となったようである。1つの陽性クローンのみが、1次プロファイリングで観察されたものとは異なるパターンを示した。
350個の確認されたクローンは、非常に多様なパターンを示した。これらの新しいプロファイルのいくつかは、野生型骨格といくらかの類似性を共有していたが、多くの他のものは完全に異なっていた。種々の実施例を、図5に示す。ホーミングエンドヌクレアーゼは、通常、それらの標的配列における縮重をいくらか適応させることができ、最初の発見の1つは、元のI-CreIタンパク質自体が酵母において7つの異なる標的を切断することであった。多くの変異型もこの規則に従い、切断される配列の数は1〜21の範囲で、平均で5.0の切断される配列(標準偏差 = 3.6)であった。興味深いことに、50変異体において(14%)、特異性は、それらが1つの標的のみを切断するように変化していた。37個(11%)が2つの標的を切断し、61個(17%)が3つの標的を切断し、58個(17%)が4つの標的を切断した。5以上の標的について、パーセンテージは10%未満であった。全体として、38個の標的が変異体により切断された(図6a)。切断が、±3位にAを有する標的ではほとんど観察されず、±5、±4、±3位にTGN (tgn)及びCGN (cgn)を有する標的では全く観察されなかったことは、注目に値する。
実施例2：44、68及び／又は70位での変異型の階層的クラスタリングは、7つのI-CreI変異型ファミリーを規定する。
A) 材料及び方法
クラスタリングは、R packageからのhclust及び低密度の1次スクリーニングからの定量データを用いて行った。変異体及び標的はともに、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., American Statist. Assoc., 1963, 58, 236〜244)を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタにした。変異体及び標的のデンドログラムを並べ替えて、クラスタの位置を最適にし、変異体のデンドログラムを8の高さで切ってクラスタを定義した。
A) 材料及び方法
クラスタリングは、R packageからのhclust及び低密度の1次スクリーニングからの定量データを用いて行った。変異体及び標的はともに、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., American Statist. Assoc., 1963, 58, 236〜244)を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタにした。変異体及び標的のデンドログラムを並べ替えて、クラスタの位置を最適にし、変異体のデンドログラムを8の高さで切ってクラスタを定義した。
B) 結果
次いで、階層的クラスタリングを用いて、変異型の多数の多様な切断パターンの中でファミリーが同定できるかを決定した。1次及び2次スクリーニングは一致する結果を示したので、酵母の低密度スクリーニングの第1回目からの定量データを分析に用いて、より大きいサンプルサイズを可能にした。変異型及び標的はともに、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., 上記)を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタにし、7つのクラスタを定義した(図6c)。詳細な分析はそれらの3つについて示し(図6b)、結果を表Iにまとめる。
次いで、階層的クラスタリングを用いて、変異型の多数の多様な切断パターンの中でファミリーが同定できるかを決定した。1次及び2次スクリーニングは一致する結果を示したので、酵母の低密度スクリーニングの第1回目からの定量データを分析に用いて、より大きいサンプルサイズを可能にした。変異型及び標的はともに、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., 上記)を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタにし、7つのクラスタを定義した(図6c)。詳細な分析はそれらの3つについて示し(図6b)、結果を表Iにまとめる。
各クラスタについて、好ましい標的の組は、シグナルの頻度及び強度に基づいて同定できた(図6b)。各クラスタについての3つの好ましい標的は、それらの切断頻度とともに表Iに示す。これらの頻度の合計は、クラスタの特異性の測定である。例えば、クラスタ1について、3つの好ましい標的(gtt/c/g)は、観察された切断の78.1%を占め、gtt単独について46.2%であり、非常に狭い特異性を明らかにした。実際に、このクラスタはQANと同様に、ほとんどgttを切断するいくつかのタンパク質を含む(図5)。対照的に、クラスタ2における3つの好ましい標的は、観察された全てのシグナルの36.6%のみである。このクラスタで観察された比較的広い多様なパターンに従って、QRRは5つの標的を切断するが(図5)、
他のクラスタメンバーの活性は、これらの5つの標的に限定されない。
他のクラスタメンバーの活性は、これらの5つの標的に限定されない。
各クラスタで見出された残基の分析により、44位に強い偏りが示された。Qはクラスタ1及び2において圧倒的であるが、A及びNはクラスタ3及び4でより頻度が高く、Kはクラスタ6及び7で頻度が高い。一方、これらの偏りは、±4位のDNAについて強い塩基選択と関連し、クラスタ1及び2においてt:a、クラスタ3、4及び5においてa:t、並びにクラスタ6及び7においてc:gの塩基対が大多数である(表Iを参照)。その標的に結合したI-CreIの構造は、残基Q44が-4位で下の鎖と(そして+4位の上の鎖と、図2を参照)相互作用することを示す。これらの結果は、この相互作用が、我々の変異体においてほぼ保存されることを示唆し、Q44がアデニンと、A44 (又はより低い頻度でN44)がチミンと、及びK44がグアニンと接触を確立するであろう「コード」を明らかにする。このような相関関係は、68及び70位については観察されなかった。
実施例3：変異型は、新しいDNA標的配列を切断するために機能的ヘテロダイマーに組み立てられ得る
A) 材料及び方法
75個のハイブリッド標的配列を、次のようにしてクローニングした。各変異パリンドロームの2つの異なる半部位を含むオリゴヌクレオチドを設計した(PROLIGO)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて酵母及び哺乳動物レポーターベクターにクローニングした。酵母レポーターベクターでS. cerevisiae FYBL2-7B株(MATα, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
A) 材料及び方法
75個のハイブリッド標的配列を、次のようにしてクローニングした。各変異パリンドロームの2つの異なる半部位を含むオリゴヌクレオチドを設計した(PROLIGO)。一本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いて酵母及び哺乳動物レポーターベクターにクローニングした。酵母レポーターベクターでS. cerevisiae FYBL2-7B株(MATα, ura3Δ851, trp1Δ63, leu2Δ1, lys2Δ202)を形質転換した。
B) 結果
変異型は、パリンドローム部位を切断できるホモダイマーである。切断可能な標的のリストを、ハイブリッド切断部位(図7に記載されるような)を切断するであろうヘテロダイマーを創出することにより拡張できるかを試験するために、独特なプロファイルのI-CreI変異型のサブセットを選択し、LEU2又はKAN遺伝子をマーカーとして有する2つの異なる酵母ベクターにクローニングした。44、68及び／又は70位に変異を有し、75位にNを有する変異体の組み合わせを、次いで、パリンドローム及び非パリンドロームのキメラDNA標的の組とともに酵母で同時発現させた。例は図8に示す。K44、T68、G70、N75 (KTG)変異体、及びQ44、A68、N70、N75 (QAN)変異体の同時発現は、いずれかの変異型単独では切断されなかった2つのキメラ標的gtt/gcc及びgtt/cctの切断をもたらした。パリンドロームのgtt、cct及びgcc標的(並びにKTG及びQANの他の標的)も切断され、ホモダイマー種の形成に起因すると考えられるが、関連しない標的は切断されなかった。さらに、gtt、cct又はgcc半部位は、切断を可能にするのに充分ではなかった。なぜなら、このような標的は、完全に抵抗性であったからである(図8のggg/gcc、gat/gcc、gcc/tac、及びその他の多くを参照)。予期しない切断は、KTG及びQANホモダイマーを用いてそれぞれgtc/cct及びgtt/gtcでのみ観察されたが、シグナルは非常に弱いままであった。つまり、効率的な切断は、2つの変異モノマーの協力的な結合を必要とする。これらの結果は、ヘテロダイマー種についての特異性の良好なレベルを証明する。
変異型は、パリンドローム部位を切断できるホモダイマーである。切断可能な標的のリストを、ハイブリッド切断部位(図7に記載されるような)を切断するであろうヘテロダイマーを創出することにより拡張できるかを試験するために、独特なプロファイルのI-CreI変異型のサブセットを選択し、LEU2又はKAN遺伝子をマーカーとして有する2つの異なる酵母ベクターにクローニングした。44、68及び／又は70位に変異を有し、75位にNを有する変異体の組み合わせを、次いで、パリンドローム及び非パリンドロームのキメラDNA標的の組とともに酵母で同時発現させた。例は図8に示す。K44、T68、G70、N75 (KTG)変異体、及びQ44、A68、N70、N75 (QAN)変異体の同時発現は、いずれかの変異型単独では切断されなかった2つのキメラ標的gtt/gcc及びgtt/cctの切断をもたらした。パリンドロームのgtt、cct及びgcc標的(並びにKTG及びQANの他の標的)も切断され、ホモダイマー種の形成に起因すると考えられるが、関連しない標的は切断されなかった。さらに、gtt、cct又はgcc半部位は、切断を可能にするのに充分ではなかった。なぜなら、このような標的は、完全に抵抗性であったからである(図8のggg/gcc、gat/gcc、gcc/tac、及びその他の多くを参照)。予期しない切断は、KTG及びQANホモダイマーを用いてそれぞれgtc/cct及びgtt/gtcでのみ観察されたが、シグナルは非常に弱いままであった。つまり、効率的な切断は、2つの変異モノマーの協力的な結合を必要とする。これらの結果は、ヘテロダイマー種についての特異性の良好なレベルを証明する。
全体として、14個の異なるタンパク質の合計で112の組み合わせを酵母において試験し、組み合わせの37.5% (42/112)がそれらの予測されるキメラ標的に対して陽性のシグナルを示した。定量データを、6つの例について図9aに示し、同じ6つの組み合わせについて、関連する標的のサブセットを用いて一過性同時トランスフェクション実験におけるCHO細胞での結果が確認された(図9b)。一般的な規則として、機能的ヘテロダイマーは、2つの発現されたタンパク質のうちの一方がホモダイマーとして強いシグナルを与えるときに常に得られた。例えば、2つの低活性変異体であるDRN及びRRNは、KTG又はQRRのような強い切断者を有する機能的ヘテロダイマーを与えるが(図9a及び9b)、同じ弱い変異体の同時発
現により、キメラ標的の切断は検出できなかった。
現により、キメラ標的の切断は検出できなかった。
実施例4：ヌクレオチド±8〜±10に対する新しい特異性を有する機能的エンドヌクレアーゼ(10NNN)
変異型は、実施例1に記載する実験手順に従って作製する。
変異型は、実施例1に記載する実験手順に従って作製する。
A) 材料及び方法
a) 変異体ライブラリーの構築
I-CreI wt (I-CreI D75)、I-CreI D75N (I-CreI N75)及びI-CreI S70 N75のオープンリーディングフレームを、以前に記載されるようにして合成した(Epinatら, N.A.R., 2003,
31, 2952〜2962)。コンビナトリアルライブラリーは、1つのDNA標的半部位の±8〜10位の塩基との相互作用に含まれる可能性がある残基の異なる組み合わせを置換することにより、I-CreI N75、I-CreI D75又はI-CreI S70 N75骨格から誘導した(Q26, K28, N30, S32,
Y33, Q38及びS40)。メガヌクレアーゼライブラリーの多様性は、選択された位置のそれぞれでユニーク縮重コドンを有する縮重プライマーを用いるPCRにより作製した。
a) 変異体ライブラリーの構築
I-CreI wt (I-CreI D75)、I-CreI D75N (I-CreI N75)及びI-CreI S70 N75のオープンリーディングフレームを、以前に記載されるようにして合成した(Epinatら, N.A.R., 2003,
31, 2952〜2962)。コンビナトリアルライブラリーは、1つのDNA標的半部位の±8〜10位の塩基との相互作用に含まれる可能性がある残基の異なる組み合わせを置換することにより、I-CreI N75、I-CreI D75又はI-CreI S70 N75骨格から誘導した(Q26, K28, N30, S32,
Y33, Q38及びS40)。メガヌクレアーゼライブラリーの多様性は、選択された位置のそれぞれでユニーク縮重コドンを有する縮重プライマーを用いるPCRにより作製した。
変異D75Nは、コドン75をaacで置換することにより導入した。次いで、N30位、Y33位及びQ38位(Ulib4ライブラリー)又はK28位、N30位及びQ38位(Ulib5ライブラリー)での3つのコドンを、12の異なるアミノ酸A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,Tをコードする縮重コドンVVK (18コドン)により置換した。その結果、これらのタンパク質ライブラリーの最大(理論的)多様性は、123、すなわち1728であった。しかし、核酸の点では、多様性は183、すなわち5832であった。
BIOMETHODESに注文したLib4において、I-CreI N75骨格の70位のアルギニンを、まず、セリンで置換した(R70S)。次いで、28位、33位、38位及び40位を無作為化した。通常のアミノ酸(K28、Y33、Q38及びS40)を、10アミノ酸(A,D,E,K,N,Q,R,S,T,Y)の1つで置換した。得られるライブラリーは、タンパク質の点で10000の理論的複雑さを有する。
さらに、2つの位置のみの無作為化に起因する225 (152)の複雑さの小さいライブラリーを、I-CreI N75又はI-CreI D75骨格において、NVK縮重コドン(24コドン、アミノ酸ACDEGHKNPQRSTWY)を用いて構築した。
所望の変異の組み合わせを有するフラグメントを、10、12又は15の異なるアミノ酸をコードする縮重プライマーの対と、DNA鋳型としてI-CreI N75 (図10A)、I-CreI D75又はI-CreI S70 N75のオープンリーディングフレーム(ORF)とを用いてPCRにより得た。例えば、図10Bは、それぞれUlib4及びUlib5ライブラリーを作製するために用いたプライマーの2対(Ulib456for及びUlib4rev; Ulib456for及びUlib5rev)を示す。対応するPCR産物を、LEU2栄養要求性マーカー遺伝子を有する酵母複製発現ベクターpCLS0542 (Epinatら, 上記)中のI-CreI N75又はI-CreI D75 ORFにクローニングしなおした。この2ミクロンに基づく複製ベクターにおいて、I-CreI変異型はガラクトース誘導性プロモーターの制御下にある。
b) 標的クローンの構築
C1221に由来する64個のパリンドローム標的を、64対のオリゴヌクレオチド(ggcatacaagtttcnnnacgtcgtacgacgtnnngacaatcgtctgtca (配列番号28)及び逆相補配列)を用いることにより、実施例1に記載するようにして構築した。
C1221に由来する64個のパリンドローム標的を、64対のオリゴヌクレオチド(ggcatacaagtttcnnnacgtcgtacgacgtnnngacaatcgtctgtca (配列番号28)及び逆相補配列)を用いることにより、実施例1に記載するようにして構築した。
c) 配列
酵母での1次及び／又は2次スクリーニングの間に同定された陽性のクローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、プライマー：PCR-Gal10-F (gcaactttagtgctgacacatacagg, 配列番号29)及びPCR-Gal10-R (acaaccttgattgcagacttgacc, 配列番号30)を用いて酵母
コロニー上でPCRにより増幅させた。
酵母での1次及び／又は2次スクリーニングの間に同定された陽性のクローンのオープンリーディングフレーム(ORF)を、プライマー：PCR-Gal10-F (gcaactttagtgctgacacatacagg, 配列番号29)及びPCR-Gal10-R (acaaccttgattgcagacttgacc, 配列番号30)を用いて酵母
コロニー上でPCRにより増幅させた。
d) 構造分析
タンパク質構造の全ての分析は、Pymolを用いて行った。I-CreIからの構造は、pdbエントリー1g9yに相当する。本文の残基の番号付けは、常にこれらの構造について記載するが、残基の番号が第1ドメインについて設定されたとおりであるホモダイマーの第2 I-CreIタンパク質ドメインでの残基は例外である。
タンパク質構造の全ての分析は、Pymolを用いて行った。I-CreIからの構造は、pdbエントリー1g9yに相当する。本文の残基の番号付けは、常にこれらの構造について記載するが、残基の番号が第1ドメインについて設定されたとおりであるホモダイマーの第2 I-CreIタンパク質ドメインでの残基は例外である。
B) 結果
I-CreIは、22 bpの偽パリンドローム標的を切断するダイマーホーミングエンドヌクレアーゼである。その天然の標的に結合したI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて、8残基が7塩基と直接的な相互作用を確立していることを示している(Juricaら, 1998, 上記)。これらの構造的データによると、±8〜10位のヌクレオチドの塩基は、I-CreIアミノ酸N30、Y33、Q38との直接の接触、及びI-CreIアミノ酸K28及びS40と間接的な接触を確立する(図2)。つまり、30位、33位及び38位の変異を有する新規なタンパク質は、I-CreIにより切断されるパリンドローム標的(10NNN標的)の±8位、±9位及び±10位での置換に起因する64個の標的の新規な切断プロファイルを示し得る。さらに、変異は、DNA塩基との直接接触に参加する残基の数及び位置を変化させるだろう。より具体的には、30、33、38以外であるが、折り畳まれたタンパク質のかなり近傍にある位置は、同じ塩基対との相互作用に参加し得る。
I-CreIは、22 bpの偽パリンドローム標的を切断するダイマーホーミングエンドヌクレアーゼである。その天然の標的に結合したI-CreI構造の分析は、各モノマーにおいて、8残基が7塩基と直接的な相互作用を確立していることを示している(Juricaら, 1998, 上記)。これらの構造的データによると、±8〜10位のヌクレオチドの塩基は、I-CreIアミノ酸N30、Y33、Q38との直接の接触、及びI-CreIアミノ酸K28及びS40と間接的な接触を確立する(図2)。つまり、30位、33位及び38位の変異を有する新規なタンパク質は、I-CreIにより切断されるパリンドローム標的(10NNN標的)の±8位、±9位及び±10位での置換に起因する64個の標的の新規な切断プロファイルを示し得る。さらに、変異は、DNA塩基との直接接触に参加する残基の数及び位置を変化させるだろう。より具体的には、30、33、38以外であるが、折り畳まれたタンパク質のかなり近傍にある位置は、同じ塩基対との相互作用に参加し得る。
網羅的なタンパク質ライブラリーに対する標的ライブラリーのアプローチは、DNA結合界面のこの部分を局所的に改変するために行われた。5アミノ酸の位置の無作為化は、205
= 3.2×106の理論的多様性を導く。しかし、より低い多様性のライブラリーは、一度に2、3又は4残基を無作為化することにより作製され、225 (152)、1728 (123)又は10,000 (104)の多様性をもたらす。このストラテジは、以前に記載され(Epinatら, 2003, 上記、及び国際PCT出願WO 2004/067736)、かつその原理が図4に記載される酵母に基づくアッセイを用いる64個のパリンドローム10NNN DNA標的に対するこれらのライブラリーのそれぞれを、広範囲にわたってスクリーニングすることを可能にする。
= 3.2×106の理論的多様性を導く。しかし、より低い多様性のライブラリーは、一度に2、3又は4残基を無作為化することにより作製され、225 (152)、1728 (123)又は10,000 (104)の多様性をもたらす。このストラテジは、以前に記載され(Epinatら, 2003, 上記、及び国際PCT出願WO 2004/067736)、かつその原理が図4に記載される酵母に基づくアッセイを用いる64個のパリンドローム10NNN DNA標的に対するこれらのライブラリーのそれぞれを、広範囲にわたってスクリーニングすることを可能にする。
まず、I-CreI骨格を、D75からNに変異させた。D75N変異は、タンパク質構造に影響を与えなかったが、過剰発現実験におけるI-CreIの毒性を減少させた。
次に、Ulib4ライブラリーを構築した。残基30、33及び38を無作為化し、通常のアミノ酸(N30、Y33及びQ38)を、12アミノ酸(A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T)のうちの1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で1728の複雑さを有する(核酸の点で5832)。
次に、Ulib4ライブラリーを構築した。残基30、33及び38を無作為化し、通常のアミノ酸(N30、Y33及びQ38)を、12アミノ酸(A,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T)のうちの1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で1728の複雑さを有する(核酸の点で5832)。
次いで、2つのその他のライブラリー：Ulib5及びLib4を構築した。Ulib5において、残基28、30及び38を無作為化し、通常のアミノ酸(K28、N30及びQ38)を、12アミノ酸(ADEGHKNPQRST)のうちの1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で1728の複雑さを有する(核酸の点で5832)。Lib4において、70位のアルギニンを、まず、セリンに置き換えた。次いで、28位、33位、38位及び40位を無作為化し、通常のアミノ酸(K28、Y33、Q38及びS40)を、10アミノ酸(A,D,E,K,N,Q,R,S,T,Y)のうちの1つで置き換えた。得られたライブラリーは、タンパク質の点で10000の複雑さを有する。
1次スクリーニング実験において、Ulib4からの20000クローン、Ulib5からの10000クローン、及びLib4からの20000クローンを、64個の試験株のそれぞれと交配させ、二倍体を、ベータ-ガラクトシダーゼ活性について試験した。64個の標的の少なくとも1つとの切断活性を示す全てのクローンを、4重で、64個の標的に対する2回目のスクリーニングで試験し、各切断プロファイルを、図11に示すようにして確立した。次いで、メガヌクレアーゼ
ORFを、PCRにより各株から増幅させ、配列決定した。
ORFを、PCRにより各株から増幅させ、配列決定した。
2次スクリーニング及びコード領域全体にわたる陽性の配列決定の後に、少なくとも1つの標的に対する切断活性を示す、合計で1484のユニーク変異体を単離した。異なるパターンが観察できた。図12は、141個の変異型の集団により切断される37個の新規な標的を示し、これらはI-CreIにより切断されない34個の標的と、I-CreIにより切断される3個の標的(aag、aat及びaac)を含む。I-CreI N75及びI-CreI D75を含むプロファイルの12個の例を、図11Aに示す。これらの新しいプロファイルのいくつかは、野生型骨格といくらかの類似性を共有したが、多くの他のものは全く異なっていた。ホーミングエンドヌクレアーゼは、通常、それらの標的配列における縮重をいくらか適応させることができ、I-CreI及びI-CreI N75タンパク質は、それぞれ一連の16及び3つの標的を切断する。切断縮重は、新規なエンドヌクレアーゼの多くについて見出され、変異体当たり9.9個の切断される標的が平均である(標準偏差：11)。しかし、同定された1484個の変異体のうち、219個(15%)は、1つのDNA標的のみを切断することが見出され、179個(12%)が2つを切断し、169個(11%)及び120個(8%)がそれぞれ3及び4つの標的を切断可能であった。つまり、それらの好ましい標的に関わらず、I-CreI誘導体の著しい数が、I-CreI N75変異体(切断された3つの10NNN標的配列)、又はI-CreI (切断された16個の10NNN標的配列)のものよりも、高くなければ同様の特異性レベルを示す。また、10NNN配列に対する変更された特異性について単離された変異体の大多数が、図2に記載される元のC1221標的配列をもはや切断しない(それぞれ61%及び59%)。
全体的に、変異体のこの大きい集団は、±10、±9及び±8位で異なる64個の可能なDNA配列の全てを標的にすることを可能にした(図11B)。しかし、各標的を切断する変異体の数における大きい多様性が存在し(図11B)、これらの数は3〜936の範囲で、平均228.5である(標準偏差：201.5)。切断は、しばしば、±8にグアニン、又は±9にアデニンを有する標的について観察されたが、±10又は±8のシトシンは、切断者の数が低いことに関連した。さらに、全ての標的が同じ効率で切断されたわけではなかった。変異体に応じて(例えば図11Bにおける野生型10AAA標的についての切断効率を比較されたい)、同じ標的についてシグナルの著しい多様性が観察できたので、平均切断効率を、以前に報告されたようにして各標的について測定した(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。これらの平均効率は、図11Bで灰色のレベルで表す。結果の分析は、この平均効率と切断者の数との間の明確な相関関係を示し、最も頻繁に切断される標的は、最も効率的に切断される(例えば図11Bの10TCN、10CTN及び10CCN標的を、10GAN、10AAN及び10TANと比較されたい)。
つまり、新規な基質特異性を有する変異体を含む数百の新規な変異型を得た。これらの変異型は、高いレベルの活性を維持でき、新規なタンパク質の特異性は、その標的について野生型タンパク質のものよりもさらに狭くし得る。
実施例5：28、30、33、38及び40位でのI-CreI変異型とそれらの標的の間の相互作用の統計的分析
A) 材料及び方法
以前に記載されたようにして(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)、階層的クラスタリングを用いて、特定のタンパク質残基と標的塩基との間の可能性のある相関関係を確立した。クラスタリングは、2次スクリーニングからの定量的データに対して、R packageからのhclustを用いて行った。変異型は、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., American Statist. Assoc., 1963, 58, 236〜244)を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタにした。変異体のデンドログラムは、17の高さで切ってクラスタを規定した。分析のために、クラスタ内での標的の切断の累積強度(cumulated intensity)は、この標的を用いるクラスタの全ての変異体の切断強度の合計として算出し
、全ての標的を用いるクラスタの全ての変異体の切断強度の合計に対して標準化した。
A) 材料及び方法
以前に記載されたようにして(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)、階層的クラスタリングを用いて、特定のタンパク質残基と標的塩基との間の可能性のある相関関係を確立した。クラスタリングは、2次スクリーニングからの定量的データに対して、R packageからのhclustを用いて行った。変異型は、ユークリッド距離及びウォード法(Ward, J.H., American Statist. Assoc., 1963, 58, 236〜244)を用いる標準的な階層的クラスタリングを用いてクラスタにした。変異体のデンドログラムは、17の高さで切ってクラスタを規定した。分析のために、クラスタ内での標的の切断の累積強度(cumulated intensity)は、この標的を用いるクラスタの全ての変異体の切断強度の合計として算出し
、全ての標的を用いるクラスタの全ての変異体の切断強度の合計に対して標準化した。
B) 結果
10個の異なる変異体クラスタを同定した(表II)。
10個の異なる変異体クラスタを同定した(表II)。
各クラスタで見出された残基の分析は、全ての無作為化された位置について強い偏りを示した。この研究において用いた全てのライブラリーにおいて残基は変異されず、I-CreI骨格で見出された残基は、大きな比率を占めると予測された。実際に、K28、N30及びS40は、10クラスタの全てで最も頻度が高い残基であり、DNA／タンパク質相互作用についての結論は、実際には推断できない。しかし、Y33は、クラスタ7、8及び10においてのみ最も代表的な残基であったが、その他の7つのクラスタでは、H、R、G、T、C、P又はSのようなその他の残基の強い発生が観察された。野生型Q38残基は、1つ以外の全てのクラスタにおいて大きな比率を占めたが、R及びKがクラスタ4では最も頻度が高かった。
一方、残基33及び38の性質と、標的の±10位及び±9位での基質の識別との間に強い相関関係が観察された。
Y33の普及は、アデニンの高い頻度に関連し(クラスタ7及び10においてそれぞれ74.9%及び64.3%)、この相関関係は、より低い程度ではあるが、クラスタ4、5及び8でも観察された。H33又はR33は、グアニンと関連し(クラスタ1、4及び5においてそれぞれ63.0%、56.3%及び58.5%)、T33及びC33又はS33はチミンと関連した(クラスタ3及び9においてそれぞれ45.6%及び56.3%)。G33は、±10での塩基の代表が最も平均的なクラスタであるクラスタ2において、比較的頻度が高かった。これらの結果は、Seligmanら(Nucleic Acids Res., 2002, 30, 3870〜3879)の観察と矛盾せず、彼らは、Y33R又はY33Hの変異がI-CreIの特異性をグアニンの方にシフトさせ、Y33C、Y33T、Y33S (及びY33Lも)は、±10位のチミンの方にシフトさせたことを以前に示している。
さらに、R38及びK38は、クラスタ4におけるグアニンの例外的に高い頻度に関連したが、他のクラスタの全てでは、野生型Q38残基、及び標的の±9におけるアデニンが大きい比率を占めた。
その標的に結合しているI-CreIの構造(Chevalierら, 2003, 上記; Juricaら, 1998, 上記)は、Y33及びQ38が-10及び-9の2つのアデニンに接触することを示し(図2)、結果は、これらの相互作用が多くの変異体でおそらく維持されていることを示唆する。同様の結果は、残基44及び±4位について以前に記載されている(Arnouldら, 上記)。しかし、33/±10、38/±9及び44/±4の対について得られた結果の比較は、所定の塩基が、位置に応じて、異なるアミノ酸残基と関連し得ることを示す。最も見出される残基は、グアニンについて33位のR及びH、38位のR又はK、並びに44位のK、アデニンについて33位のY並びに38位及び44位のQ、チミンについて33位のS、C又はT、並びに44位のAである。3つの場合について、シトシンについて明確なパターンは観察されない。つまり、普遍的な「コード」は存在しないが、各塩基に接触するための一連の解決策(solutions)があり、最良の解決策は、より一般的な関係に依存し、ジンクフィンガータンパク質について観察されたことと非常に類似する(Paboら, 上記)。
実施例6：2つのI-CreI機能的サブドメインは、DNA結合の点において独立して挙動し得る。
この実施例では、I-CreI標的を異なるサブドメインが結合し、独立して挙動する2つの部分に分けることができることを示す。I-CreI DNA標的において、±5、±4及び±3位には、残基44、68及び70が結合する(図2)。実施例1に記載するようにして得られる44、68、70及び75位で変異されたI-CreI変異型は、I-CreI野生型により切断されるパリンドローム標的C1221 (Chevalierら, 2003)に対して検出可能な活性を示すことが示されたが、種々の効率で他の標的を切断した。結合部位の外側の部分では、±9及び±8位には、残基30、33及び38が接触する(図2)。図13に示すように、2つの組の残基は、タンパク質の別個の部分にある。塩基±8には直接の相互作用はない。±5〜±3位及び±10〜±8位に2つの異な
る独立した機能的サブドメインが結合すれば、一方のサブドメインの工学的改変は、他方のドメインの結合特性に影響を与えないはずである。
この実施例では、I-CreI標的を異なるサブドメインが結合し、独立して挙動する2つの部分に分けることができることを示す。I-CreI DNA標的において、±5、±4及び±3位には、残基44、68及び70が結合する(図2)。実施例1に記載するようにして得られる44、68、70及び75位で変異されたI-CreI変異型は、I-CreI野生型により切断されるパリンドローム標的C1221 (Chevalierら, 2003)に対して検出可能な活性を示すことが示されたが、種々の効率で他の標的を切断した。結合部位の外側の部分では、±9及び±8位には、残基30、33及び38が接触する(図2)。図13に示すように、2つの組の残基は、タンパク質の別個の部分にある。塩基±8には直接の相互作用はない。±5〜±3位及び±10〜±8位に2つの異な
る独立した機能的サブドメインが結合すれば、一方のサブドメインの工学的改変は、他方のドメインの結合特性に影響を与えないはずである。
±5〜±3位及び±9〜±8位に2つの異なる独立した機能的サブドメインが結合するのかを決定するために、±5〜±3の領域での特異性が変化しているが、C1221にまだ結合する変異体を、±10〜±8領域におけるそれらの切断特性についてアッセイした。
A) 材料及び方法
a) 構造分析
タンパク質構造の全ての分析は、Pymolを用いて行った。I-CreIからの構造は、pdbエントリー1g9yに相当する。本文の残基の番号付けは、常にこれらの構造について記載するが、残基の番号が第1ドメインについて設定されたとおりであるホモダイマーの第2 I-CreIタンパク質ドメインでの残基は例外である。
a) 構造分析
タンパク質構造の全ての分析は、Pymolを用いて行った。I-CreIからの構造は、pdbエントリー1g9yに相当する。本文の残基の番号付けは、常にこれらの構造について記載するが、残基の番号が第1ドメインについて設定されたとおりであるホモダイマーの第2 I-CreIタンパク質ドメインでの残基は例外である。
b) I-CreI変異体発現酵母株
変異体を、44、68、70及び75位を変異させ、C1221由来標的を切断できるクローンをスクリーニングすることにより、実施例1に記載されるようにして作製した。プラスミドを発現する変異体で、S. cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を形質転換する。
変異体を、44、68、70及び75位を変異させ、C1221由来標的を切断できるクローンをスクリーニングすることにより、実施例1に記載されるようにして作製した。プラスミドを発現する変異体で、S. cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を形質転換する。
c) 標的クローンの構築
±5〜±3DNAの変異によりC1221から誘導された64個のパリンドローム標的を、64対のオリゴヌクレオチド(ggcatacaagtttcaaaacnnngtacnnngttttgacaatcgtctgtca (配列番号31)及び逆相補配列)を用いることにより、実施例1に記載されるようにして構築した。
±5〜±3DNAの変異によりC1221から誘導された64個のパリンドローム標的を、64対のオリゴヌクレオチド(ggcatacaagtttcaaaacnnngtacnnngttttgacaatcgtctgtca (配列番号31)及び逆相補配列)を用いることにより、実施例1に記載されるようにして構築した。
d) メガヌクレアーゼ発現クローンの交配、及び酵母でのスクリーニング
交配は、低グリッド密度(約4スポット/cm2)を用いて実施例1に記載されるようにして行った。
交配は、低グリッド密度(約4スポット/cm2)を用いて実施例1に記載されるようにして行った。
B) 結果
C1221に由来する全ての可能なパリンドローム標的に対応する64個の標的を、図14Bに示すようにして、±10〜±8の塩基の突然変異誘発により構築した。I-CreI N75切断プロファイルを確立し、これはaaa及びaat標的で強いシグナルを示し、aag標的でより弱いシグナルを示した。
C1221に由来する全ての可能なパリンドローム標的に対応する64個の標的を、図14Bに示すようにして、±10〜±8の塩基の突然変異誘発により構築した。I-CreI N75切断プロファイルを確立し、これはaaa及びaat標的で強いシグナルを示し、aag標的でより弱いシグナルを示した。
図14Cに示すように、±5〜±3で明らかに異なる切断プロファイルを有するタンパク質、例えばQAR、QNR、TRR、NRR、ERR及びDRRは、±10〜±8において類似のプロファイルを有する。±10〜±8でのaaa配列はC1221標的に対応し、C1221を切断する全ての我々の変異型により切断されることが必要である。aatも同様にほとんどの変異体で切断されるが(90%)、aagはしばしば観察されず、これはおそらく、シグナルが、わずかな切断者において検出レベル未満に低下するからであろう。他の標的は全く切断されない。これらの結果は、±5〜±3及び±10〜±8領域には、2つの異なる大きく独立した結合単位が結合することを示す。
実施例7：組み合わされた標的COMB2について記載されたように、2組の変異を分子内で組み合わせて、新規で予測可能な標的特異性を得ることができる
A) 組み合わされた標的を切断可能で、位置10NNN及び5NNNで同時に変更されたコンビナトリアル変異体を作製するための一般的なストラテジ
ここでの目的は、新規なDNA標的を切断するために、I-CreI DNA結合界面で、分離可能な機能的サブドメインを組み合わせることが可能であるかを決定することである。
A) 組み合わされた標的を切断可能で、位置10NNN及び5NNNで同時に変更されたコンビナトリアル変異体を作製するための一般的なストラテジ
ここでの目的は、新規なDNA標的を切断するために、I-CreI DNA結合界面で、分離可能な機能的サブドメインを組み合わせることが可能であるかを決定することである。
C1221標的配列の2つの異なる領域(10NNN (-10〜-8位及び+8〜+10位: ±8〜10又は±10〜8; 実施例4)と、5NNN (-5〜-3位及び+3〜+5: ±3〜5又は±5〜3; 実施例1)に対する切断特異性を変更する、I-CreIコード配列中の変異の別個の群の同定は、これらの変異体の2つの群を組み合わせて、10NNN及び5NNN位(図3a)で同時に変更された標的配列を切断可能なコンビナトリアル変異体を作製する可能性を高める。
一方で28、30、33、38及び40位、並びに他方で44、68及び70位は、同じDNA結合折り畳み上に存在し、これらが独立して挙動するはずであるという構造的な証拠はない。しかし、これらの2組の変異は、DNA標的の異なる領域の周囲に位置するこの折り畳み(図13及び15)の2つの空間的に別個の領域に明らかに存在する。さらに、一連の変異の累積の影響は、折り畳みを結局は破壊し得る。これらが2つの独立した機能的サブユニットの一部分であるかを確認するために、これらの2組の変異体からの変異を組み合わせ、得られる変異型が組み合わせた標的配列を切断する能力をアッセイした(図3b)。
よって、4つの切断された5NNN及び10NNN標的のパッチワークであるモデル非パリンドローム標的配列を設計した。この標的COMB1は、±3、±4、±5、±8、±9及び±10位にてC1221コンセンサス配列とは異なる (図3b)。さらに、パリンドロームの形の左(COMB2)及び右(COMB3)の半分を表す2つの誘導標的配列を設計した(図3b)。パリンドローム標的を標的にし得る適切なI-CreIコンビナトリアル変異体を作製するために、各パリンドローム配列の10NNN及び5NNN部分を効率よく切断する変異体を選択した(表III (本実施例)及び表IV (実施例8))、並びに酵母でのインビボクローニングにより同じコード配列中にそれらの特徴的な変異を組み込んだ(図3b)。
本文及び図面を通して、COMB配列についてのコンビナトリアル変異体は、28、30、33、38、40、44、68及び70位の残基にちなんで8文字コードで命名する(例えば、NNSRK/AARは、I-CreI 28N30N33S38R40K44A68A70R75Nのことである)。親のコントロールは、28、30、33、38及び40位の残基(NNSRKはI-CreI 28N30N33S38R40K70S75Nのことである)、又は44、68及び70位の残基(AARはI-CreI 44AQ68A70R75Nのことである)にちなんで、5文字又は3文字コードで命名する。
これらの実施例に記載される全ての標的配列は、22又は24 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の11又は12ヌクレオチドのみで記載し、その後にそのことを示すためだけの接尾辞_Pが続く(例えば、I-CreIにより切断される標的5' tcaaaacgtcgtacgacgttttga 3' (配列番号1)は、tcaaaacgtcgt_Pとよばれる)。
基本的に、I-CreIモノマーでの4つの一連の変異を、それぞれ実施例1及び4に記載するようにして得た。I-CreI構造において、埋め込まれたD75の水素受容体電荷を満足するライブラリー内の塩基性残基R68及びR70の置換に起因するであろうエネルギーのひずみを低減させるために、第1段階において、D75N変異をI-CreI骨格に導入した。
本実施例において、COMB2の10NNN部分(tctggacgtcgt_P標的(配列番号37))を切断できる変異型を、28、30、33又は28、33、38及び40位の突然変異誘発により得て(表III)、COMB2の5NNN部分(tcaaaacgacgt_P (配列番号38))を切断できる変異体を、44、68及び70位切断の突然変異誘発により得た(表III)。
実施例8において、COMB3の10NNN部分(tcgatacgtcgt_P (配列番号44))を切断できる変異体を、28、30、33位又は28、33、38及び40位の突然変異誘発により得て(表IV)、COMB3の5NNN部分(tcaaaaccctgt_P (配列番号45))を切断できる変異体を、44、68及び70位切断の突然変異誘発により得た(表IV)。
次いで、それぞれの組み合わせた標的について(COMB2又はCOMB3)、10NNN標的を切断する変異体からの28、30、33、38及び40位の変異を、5NNN標的を切断する変異体からの44、68及び70位の変異と組み合わせ、得られたコンビナトリアル変異体が適切な標的配列COMB2 (tctggacgacgt_P (配列番号39); 本実施例)又はCOMB3 (tcaaaaccctgt_P (配列番号45);
実施例8)を切断する能力についてアッセイした。
実施例8)を切断する能力についてアッセイした。
B) 材料及び方法:
a) コンビナトリアル変異体の構築
異なるライブラリーに由来する変異を含有するI-CreIコード配列(アミノ酸28,30,33,38,40及び44,68,70又は44,68,70,75,77)を作製するために、I-CreIコード配列の5'末端(aa 1〜43位)又は3'末端(39〜167位)を増幅する別々のオーバーラップPCR反応を行った(図10)。5'及び3'末端の両方について、PCR増幅を、ベクター(pCLS0542)に特異的なプライマー(Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号40)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'(配列番号41))と、アミノ酸39〜43についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(assF 5'-ctaxxxttgaccttt-3' (配列番号42)又はassR 5'-aaaggtcaaxxxtag-3'
(配列番号43)) (ここで、xxxは残基40をコードする)を用いて行う。得られるPCR産物は、互いに15 bpの相同性を有し、2ミクロンに基づく複製ベクターであり、LEU2遺伝子をマーカーとして有するpCLS0542及びカナマイシン耐性遺伝子を含有するpCLS1107と約100〜200 bpの相同性を有する。つまり、インビボ相同組換えにより両方の群の変異を含有する無傷のコード配列を作成するために、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれを約25ngと、NcoI及びEagIでの消化により直線化したpCLS0542ベクターDNA 25ng又はDraIII及びNgoMIVでの消化により直線化したpCLS1107ベクターDNA 25ngのいずれかとを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率のLiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。コンビナトリアル変異体は、個別に作製した。PCR反応物を等モル量でプールし、直線化したプラスミドとともに酵母に形質転換した。形質転換体を、ロイシン欠損合成培地(pCLS0542)又はG418含有富化培地(pCLS1107)のいずれかで選択した。
a) コンビナトリアル変異体の構築
異なるライブラリーに由来する変異を含有するI-CreIコード配列(アミノ酸28,30,33,38,40及び44,68,70又は44,68,70,75,77)を作製するために、I-CreIコード配列の5'末端(aa 1〜43位)又は3'末端(39〜167位)を増幅する別々のオーバーラップPCR反応を行った(図10)。5'及び3'末端の両方について、PCR増幅を、ベクター(pCLS0542)に特異的なプライマー(Gal10F 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (配列番号40)又はGal10R 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'(配列番号41))と、アミノ酸39〜43についてのI-CreIコード配列に特異的なプライマー(assF 5'-ctaxxxttgaccttt-3' (配列番号42)又はassR 5'-aaaggtcaaxxxtag-3'
(配列番号43)) (ここで、xxxは残基40をコードする)を用いて行う。得られるPCR産物は、互いに15 bpの相同性を有し、2ミクロンに基づく複製ベクターであり、LEU2遺伝子をマーカーとして有するpCLS0542及びカナマイシン耐性遺伝子を含有するpCLS1107と約100〜200 bpの相同性を有する。つまり、インビボ相同組換えにより両方の群の変異を含有する無傷のコード配列を作成するために、2つのオーバーラップPCRフラグメントのそれぞれを約25ngと、NcoI及びEagIでの消化により直線化したpCLS0542ベクターDNA 25ng又はDraIII及びNgoMIVでの消化により直線化したpCLS1107ベクターDNA 25ngのいずれかとを用いて、酵母Saccharomyces cerevisiae FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率のLiAc形質転換プロトコル(Gietz及びWoods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。コンビナトリアル変異体は、個別に作製した。PCR反応物を等モル量でプールし、直線化したプラスミドとともに酵母に形質転換した。形質転換体を、ロイシン欠損合成培地(pCLS0542)又はG418含有富化培地(pCLS1107)のいずれかで選択した。
b) 標的クローンの構築
標的を、実施例1に記載されるようにしてクローニングした。
標的を、実施例1に記載されるようにしてクローニングした。
c) ホーミングエンドヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
ホーミングエンドヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニングは、高グリッド密度(約20スポット/cm2)を用いて実施例1に記載されるようにして行った。
ホーミングエンドヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニングは、高グリッド密度(約20スポット/cm2)を用いて実施例1に記載されるようにして行った。
C) 結果
tctggacgtcgt_P (配列番号37)及びtcaaaacgacgt_P (配列番号38)を切断するI-CreI変異体を、実施例1及び4に記載されるようにして同定した。30、33、38、40及び70位で変異し、配列tctggacgtcgt_P (配列番号37; 表III)を切断できる3つの変異型を、44、68及び70位で変異し、配列tcaaaacgacgt_P (配列番号38; 表III)を切断できる31の異なる変異体と組み合わせた。両方の組のタンパク質を、70位で変異させる。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインの仮説は、この位置が±10〜±8DNAの特異性に対してほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせたタンパク質では、第1の組のタンパク質からの残基30、33、38及び40のみが用いられ、残基70は第2の組のタンパク質から選択された。
tctggacgtcgt_P (配列番号37)及びtcaaaacgacgt_P (配列番号38)を切断するI-CreI変異体を、実施例1及び4に記載されるようにして同定した。30、33、38、40及び70位で変異し、配列tctggacgtcgt_P (配列番号37; 表III)を切断できる3つの変異型を、44、68及び70位で変異し、配列tcaaaacgacgt_P (配列番号38; 表III)を切断できる31の異なる変異体と組み合わせた。両方の組のタンパク質を、70位で変異させる。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインの仮説は、この位置が±10〜±8DNAの特異性に対してほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせたタンパク質では、第1の組のタンパク質からの残基30、33、38及び40のみが用いられ、残基70は第2の組のタンパク質から選択された。
得られる93個の変異体を、組み合わせた標的配列COMB2 (tctggacgacgt_P: 配列番号39)との、LacZアッセイを含む酵母での切断についてアッセイした。32個の組み合わせた変異
体が、標的を切断可能であった(表III及び図16)。親の変異体のそれぞれは、組み合わせた配列を切断できなかったので(図16)、組み合わせた標的配列の切断は、コンビナトリアル変異体に特異的である。さらに、親の変異体は5NNN及び10NNN標的配列の効率的な切断を示したが、1つ以外の全てのコンビナトリアル変異体は、これらの配列(図16)又は元のC1221配列に対して著しい活性を示さなかった。唯一の例外は、NNSRR/ARSであり、これは5GAC標的をわずかに切断することが見出された(図16)。
体が、標的を切断可能であった(表III及び図16)。親の変異体のそれぞれは、組み合わせた配列を切断できなかったので(図16)、組み合わせた標的配列の切断は、コンビナトリアル変異体に特異的である。さらに、親の変異体は5NNN及び10NNN標的配列の効率的な切断を示したが、1つ以外の全てのコンビナトリアル変異体は、これらの配列(図16)又は元のC1221配列に対して著しい活性を示さなかった。唯一の例外は、NNSRR/ARSであり、これは5GAC標的をわずかに切断することが見出された(図16)。
これらの結果は、28、30、33、38、40位と44、68、70位での変異の組み合わせは、試験された組み合わせの約30%について予測される特異性を有する機能的エンドヌクレアーゼを生じ得ることを示す。この研究は、2つの分離可能なDNA結合サブドメインの一部分として、一方で残基28〜40、他方で残基44〜70を同定する(図15)。
実施例8：組み合わせた標的COMB3を用いて記載されるように、2組の変異を分子内で組み合わせて、新規で予測可能な標的特異性を得ることができる
A) 材料及び方法:
実験手順は、実施例7に記載されるとおりである。
A) 材料及び方法:
実験手順は、実施例7に記載されるとおりである。
B) 結果
28、33、38、40及び70位で変異し、かつ配列tcgatacgtcgt_P (配列番号44, 表IV)を切断できる7つの変異型を、44、68及び70位で変異し、かつ配列tcaaaaccctgt_P (配列番号4
5, 表IV)を切断できる30の異なる変異型と組み合わせた。70位の変異は、タンパク質の両方の組で見出される。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインの仮説は、この位置が、±10〜±8での特異性にほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせたタンパク質において、タンパク質の第1の組からの残基30、33、38及び40のみを用い、残基70は、第2の組のタンパク質から選択した。
28、33、38、40及び70位で変異し、かつ配列tcgatacgtcgt_P (配列番号44, 表IV)を切断できる7つの変異型を、44、68及び70位で変異し、かつ配列tcaaaaccctgt_P (配列番号4
5, 表IV)を切断できる30の異なる変異型と組み合わせた。70位の変異は、タンパク質の両方の組で見出される。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインの仮説は、この位置が、±10〜±8での特異性にほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせたタンパク質において、タンパク質の第1の組からの残基30、33、38及び40のみを用い、残基70は、第2の組のタンパク質から選択した。
得られた210個の変異体を、組み合わせた標的配列COMB3 (tcgataccctgt_P (配列番号46))との、LacZアッセイを含有する酵母での切断についてアッセイした。77個の組み合わせた変異体が、標的を切断可能であった(表IV)。親の変異体のそれぞれは、組み合わせた配列を切断できなかったので、組み合わせた標的配列の切断は、コンビナトリアル変異体に特異的である。さらに、親の変異体は5NNN及び10NNN標的配列の効率的な切断を示したが、全てのコンビナトリアル変異体は、これらの配列又は元のC1221配列に対して著しい活性を示さなかった。
これらの結果は、28、30、33、38、40位と44、68、70位での変異の組み合わせは、試験された組み合わせの約30%について予測される特異性を有する機能的エンドヌクレアーゼを生じ得ることを示す。この研究は、2つの分離可能なDNA結合サブドメインの一部分として、一方で残基28〜40、他方で残基44〜70を同定する(図15)。
実施例9：組み合わせた標的配列番号49を用いて記載されるように、2組の変異を分子内で組み合わせて、新規で予測可能な標的特異性を得ることができる
ここでの目的は、新規なDNA標的を切断するために、I-CreI DNA結合界面での分離可能な機能的サブドメインを同定及び組み合わせることが可能であるかを決定することである。本実施例に記載される全ての標的配列は、24 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の12ヌクレオチドのみで記載し、その後にそのことを示すためだけの接尾辞_Pが続く(例えば、I-CreIタンパク質により切断される標的5' tcaaaacgtcgtacgacgttttga 3' (配列番号1)は、tcaaaacgtcgt_Pとよばれる)。
ここでの目的は、新規なDNA標的を切断するために、I-CreI DNA結合界面での分離可能な機能的サブドメインを同定及び組み合わせることが可能であるかを決定することである。本実施例に記載される全ての標的配列は、24 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の12ヌクレオチドのみで記載し、その後にそのことを示すためだけの接尾辞_Pが続く(例えば、I-CreIタンパク質により切断される標的5' tcaaaacgtcgtacgacgttttga 3' (配列番号1)は、tcaaaacgtcgt_Pとよばれる)。
I-CreIモノマーでの2つの一連の変異を、実施例1及び4に記載するようにして得た。I-CreI構造における埋め込まれたD75の水素受容体電荷を満足するライブラリー内の塩基性残基R68及びR70の置換に起因する、可能性のあるエネルギーのひずみを低減させるために、
第1段階において、D75N変異をI-CreI骨格に導入した。次いで、tcaacacgtcgt_P (配列番号47)標的を切断できる変異体を、28、30、33位又は28、33、38及び40位の突然変異誘発により得て(表V)、tcaaaaccctgt_P (配列番号48)を切断できる変異体を、44、68及び70位切断の突然変異誘発により得た(表V)。
第1段階において、D75N変異をI-CreI骨格に導入した。次いで、tcaacacgtcgt_P (配列番号47)標的を切断できる変異体を、28、30、33位又は28、33、38及び40位の突然変異誘発により得て(表V)、tcaaaaccctgt_P (配列番号48)を切断できる変異体を、44、68及び70位切断の突然変異誘発により得た(表V)。
一方で28、30、33、38及び40位、他方で44、68及び70位は、同じDNA結合折り畳み上にあり、これらが独立して挙動するはずであるという構造的証拠はない。しかし、2組の変異は、DNA標的の異なる領域の周囲に位置するこの折り畳みの2つの空間的に別個の領域上に明らかに存在する(図15)。これらが2つの独立した機能的サブユニットの一部分であるかを確認するために、我々は、これらの2つの一連の変異からの変異を組み合わせ、これらがtcaacaccctgt_P (配列番号49)キメラ標的を切断可能であるかを確認した。
A) 材料及び方法:
実験手順は、実施例7に記載されるとおりである。
実験手順は、実施例7に記載されるとおりである。
B) 結果
28、33、38、40及び70位で変異し、かつ配列tcaacacgtcgt_P (配列番号47, 表V) を切断できる5つの変異型を、44、68及び70位で変異し、かつ配列tcaaaaccctgt_P (配列番号48, 表V)を切断できる34個の異なる変異型と組み合わせた。70位の変異は、タンパク質の両方の組で見出される。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインの仮説は、この位置が、±10〜±8での特異性にほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせたタンパク質において、タンパク質の第1の組からの残基30、33、38及び40のみを用い、残基70をタンパク質の第2の組から選択した。得られた170個の変異体を、組み合わせた標的配列tcaacaccctgt_P (配列番号49)との、LacZアッセイを含有する酵母での切断についてアッセイした。37個の組み合わせた変異体が、標的を切断可能であった(図17B)が、個別の変異体の1つのみ(I-CreI K44, R68, D70, N75)が、組み合わせた配列を切断可能であった(図17A)。この研究は、2つの分離可能なDNA結合サブドメインとして、一方で残基28〜40、他方で残基44〜70を同定する(図15)。
28、33、38、40及び70位で変異し、かつ配列tcaacacgtcgt_P (配列番号47, 表V) を切断できる5つの変異型を、44、68及び70位で変異し、かつ配列tcaaaaccctgt_P (配列番号48, 表V)を切断できる34個の異なる変異型と組み合わせた。70位の変異は、タンパク質の両方の組で見出される。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインの仮説は、この位置が、±10〜±8での特異性にほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせたタンパク質において、タンパク質の第1の組からの残基30、33、38及び40のみを用い、残基70をタンパク質の第2の組から選択した。得られた170個の変異体を、組み合わせた標的配列tcaacaccctgt_P (配列番号49)との、LacZアッセイを含有する酵母での切断についてアッセイした。37個の組み合わせた変異体が、標的を切断可能であった(図17B)が、個別の変異体の1つのみ(I-CreI K44, R68, D70, N75)が、組み合わせた配列を切断可能であった(図17A)。この研究は、2つの分離可能なDNA結合サブドメインとして、一方で残基28〜40、他方で残基44〜70を同定する(図15)。
実施例10：組み合わせた標的配列番号52を用いて記載されるように、2組の変異を分子内で組み合わせて、新規で予測可能な標的特異性を得ることができる
ここでの目的は、新規なDNA標的を切断するために、I-CreI DNA結合界面での分離可能な機能的サブドメインを同定及び組み合わせることが可能であるかを決定することである。本実施例に記載される全ての標的配列は、24 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の12ヌクレオチドのみで記載し、その後にそのことを示すためだけの接尾辞_Pが続く(例えば、I-CreIにより切断される標的5' tcaaaacgtcgtacgacgttttga 3' (配列番号1)は、tcaaaacgtcgt_Pとよばれる)。
ここでの目的は、新規なDNA標的を切断するために、I-CreI DNA結合界面での分離可能な機能的サブドメインを同定及び組み合わせることが可能であるかを決定することである。本実施例に記載される全ての標的配列は、24 bpのパリンドローム配列である。よって、これらを、最初の12ヌクレオチドのみで記載し、その後にそのことを示すためだけの接尾辞_Pが続く(例えば、I-CreIにより切断される標的5' tcaaaacgtcgtacgacgttttga 3' (配列番号1)は、tcaaaacgtcgt_Pとよばれる)。
I-CreIモノマーでの2つの一連の変異を、実施例1及び4に記載するようにして得た。I-CreI構造における埋め込まれたD75の水素受容体電荷を満足するライブラリー内の塩基性残基R68及びR70の置換に起因する、可能性のあるエネルギーのひずみを低減させるために、第1工程において、D75N変異をI-CreI骨格に導入した。次いで、tcaacacgtcgt_P標的(配列番号50)を切断できる変異体を、28、30、33位又は28、33、38及び40位の突然変異誘発により得て(表VI)、tcaaaactttgt_P (配列番号51)を切断できる変異体を、44、68及び70位切断の突然変異誘発により得た(表VI)。
一方で28、30、33、38及び40位、他方で44、68及び70位は、同じDNA結合折り畳み上にあり、これらが独立して挙動するはずであるという構造的証拠はない。しかし、2組の変異は、DNA標的の異なる領域の周囲に位置するこの折り畳みの2つの空間的に別個の領域上に明らかに存在する(図15)。これらが2つの独立した機能的サブユニットの一部分であるかを確認するために、我々は、これらの2つの一連の変異からの変異を組み合わせ、これらがtcaacactttgt_Pキメラ標的(配列番号52)を切断可能であるかを確認した。
A) 材料及び方法:
実験手順は、実施例7に記載されるとおりである。
実験手順は、実施例7に記載されるとおりである。
B) 結果
28、30、33、40及び70位で変異し、かつ配列tcaacacgtcgt_P (配列番号50)を切断できる5つの変異型を、44、68及び70位で変異し、かつ配列tcaaaactttgt_P (配列番号51)を切断できる29個の異なる変異型と組み合わせた。70位の変異は、タンパク質の両方の組で見出される。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインの仮説は、この位置が、±10〜±8での特異性にほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせたタンパク質において、タンパク質の第1の組からの残基30、33、38及び40のみを用い、残基70をタンパク質の第2の組から選択した。得られた145個の変異体を、組み合わせた標的配列tcaacactttgt_P (配列番号52)との、LacZアッセイを含有する酵母での切断についてアッセイした。23個の活性な組み合わせた変異体が同定された。しかし、これらの全てについて、1つの親の変異体も標的を切断した。にもかかわらず、このことは、変異の2つの組の間の大きい自由度を証明する。標的を切断できる組み合わせた変異体は、個別の変異体と同様に組み合わせた配列を切断可能であった(図18A及びB)。
28、30、33、40及び70位で変異し、かつ配列tcaacacgtcgt_P (配列番号50)を切断できる5つの変異型を、44、68及び70位で変異し、かつ配列tcaaaactttgt_P (配列番号51)を切断できる29個の異なる変異型と組み合わせた。70位の変異は、タンパク質の両方の組で見出される。しかし、2つの分離可能な機能的サブドメインの仮説は、この位置が、±10〜±8での特異性にほとんど影響しないことを意味する。よって、組み合わせたタンパク質において、タンパク質の第1の組からの残基30、33、38及び40のみを用い、残基70をタンパク質の第2の組から選択した。得られた145個の変異体を、組み合わせた標的配列tcaacactttgt_P (配列番号52)との、LacZアッセイを含有する酵母での切断についてアッセイした。23個の活性な組み合わせた変異体が同定された。しかし、これらの全てについて、1つの親の変異体も標的を切断した。にもかかわらず、このことは、変異の2つの組の間の大きい自由度を証明する。標的を切断できる組み合わせた変異体は、個別の変異体と同様に組み合わせた配列を切断可能であった(図18A及びB)。
実施例11：ホモダイマーコンビナトリアル変異体の生化学的及び生物物理学的分析
A) 材料及び方法
新規なI-CreI変異型を、以前に記載されたようにして(Arnouldら, 上記)、発現させ、精製し、インビトロ切断について分析した。円偏光二色性分光分析(CD)測定を、0.2 cm経路長の石英キュベットを用いてJasco J-810分光偏光計で行った。平衡変性(Equilibrium unfolding)を、1℃/分での漸増温度で誘導した(プログラムされたペルティエ熱電気)。サンプルを、25 mMリン酸カリウムバッファー、pH 7.5に対して、20μMのタンパク質濃度での透析により調製した。
A) 材料及び方法
新規なI-CreI変異型を、以前に記載されたようにして(Arnouldら, 上記)、発現させ、精製し、インビトロ切断について分析した。円偏光二色性分光分析(CD)測定を、0.2 cm経路長の石英キュベットを用いてJasco J-810分光偏光計で行った。平衡変性(Equilibrium unfolding)を、1℃/分での漸増温度で誘導した(プログラムされたペルティエ熱電気)。サンプルを、25 mMリン酸カリウムバッファー、pH 7.5に対して、20μMのタンパク質濃度での透析により調製した。
B) 結果
COMB2又はCOMB3を切断する4つのコンビナトリアル変異体、及びそれらの対応する親の変異体を、それらの相対的切断効率を比較するために、インビトロで分析した。図19a〜cで観察できるように、組み合わせたパリンドローム標的配列(COMB2又はCOMB3)の切断は、2つの親の変異体がこれらの配列を切断できなかったので、コンビナトリアル変異体に特異的である。さらに、親の変異体は5NNN及び10NNN標的配列の効率的な切断を示したが、4つのコンビナトリアル変異体のうち1つのみ(NNSRK/ARR)が、これらの標的のうちの1つに対してわずかな活性を示し、その他は完全に不活性であった。つまり、酵母アッセイからの結果は、インビトロで確認された。重要なことには、変異体間の活性レベルの違いは、酵母で観察される多様性と矛盾せず、この一致は、COMB3を切断する4つのさらなる変異体のインビトロ研究によってさらに確認された。つまり、酵母で観察されるシグナルの多様性は、発現レベルの違いによるのではなく、結合及び／又は切断の特性における違いを真に反映している。
COMB2又はCOMB3を切断する4つのコンビナトリアル変異体、及びそれらの対応する親の変異体を、それらの相対的切断効率を比較するために、インビトロで分析した。図19a〜cで観察できるように、組み合わせたパリンドローム標的配列(COMB2又はCOMB3)の切断は、2つの親の変異体がこれらの配列を切断できなかったので、コンビナトリアル変異体に特異的である。さらに、親の変異体は5NNN及び10NNN標的配列の効率的な切断を示したが、4つのコンビナトリアル変異体のうち1つのみ(NNSRK/ARR)が、これらの標的のうちの1つに対してわずかな活性を示し、その他は完全に不活性であった。つまり、酵母アッセイからの結果は、インビトロで確認された。重要なことには、変異体間の活性レベルの違いは、酵母で観察される多様性と矛盾せず、この一致は、COMB3を切断する4つのさらなる変異体のインビトロ研究によってさらに確認された。つまり、酵母で観察されるシグナルの多様性は、発現レベルの違いによるのではなく、結合及び／又は切断の特性における違いを真に反映している。
最後に、コンビナトリアル変異体のこの群の構造及び安定性の分析を、遠紫外CD (図19d)、1H-NMR及び分析用超遠心を用いて行った。全ての変異体はダイマーであり、これらの二次構造及び三次構造、並びに熱変性曲線(図19d)は、元のI-CreI N75タンパク質のものと同様であり、このことは、工学的な改変が、これらのタンパク質の構造、折り畳み又は安定性を大きくは変更しなかったことを示す。つまり、変異された2つの組の残基、一方でK28、N30、Y33、Q38及びS40、他方でQ44、R68及びR70は、2つの比較的独立したDNA結合サブドメインを規定する。
実施例12：コンビナトリアル変異体の同時発現は、キメラ標的部位の切断をもたらす
A) 材料及び方法:
実験手順は、実施例3に記載されるとおりである。
A) 材料及び方法:
実験手順は、実施例3に記載されるとおりである。
B) 結果
コンビナトリアル変異体が、ヘテロダイマーと同様に効率よく機能し得るかを決定するために、パリンドローム部位COMB2及びCOMB3を切断できる変異体のサブセットを、酵母において同時発現させ、元の標的の2つの半部位の融合に対応するキメラ部位COMB1をそれらが切断する能力についてアッセイした(図20a)。図20aで観察できるように、同時発現は、全ての試験したヘテロダイマーのうち、キメラ配列COMB1の切断をもたらした。この活性は、ヘテロダイマーに特異的であるようである。なぜなら、単独で発現させた変異体のそれぞれ1つずつは、キメラ標的配列を用いて検出可能な活性を示さなかったからである(図20a)。一般的に、COMB2及び／又はCOMB3について強い活性を示す2つの変異体の同時発現は、弱い活性を示す2つの変異体の同時発現よりも、キメラ部位についてより高いレベルの活性をもたらす(例えば、図20aにおいてKNHQS/KEG x NNSRK/ARRとQNRQR/KEG x NNSRK/ASRを比較されたい)。
コンビナトリアル変異体が、ヘテロダイマーと同様に効率よく機能し得るかを決定するために、パリンドローム部位COMB2及びCOMB3を切断できる変異体のサブセットを、酵母において同時発現させ、元の標的の2つの半部位の融合に対応するキメラ部位COMB1をそれらが切断する能力についてアッセイした(図20a)。図20aで観察できるように、同時発現は、全ての試験したヘテロダイマーのうち、キメラ配列COMB1の切断をもたらした。この活性は、ヘテロダイマーに特異的であるようである。なぜなら、単独で発現させた変異体のそれぞれ1つずつは、キメラ標的配列を用いて検出可能な活性を示さなかったからである(図20a)。一般的に、COMB2及び／又はCOMB3について強い活性を示す2つの変異体の同時発現は、弱い活性を示す2つの変異体の同時発現よりも、キメラ部位についてより高いレベルの活性をもたらす(例えば、図20aにおいてKNHQS/KEG x NNSRK/ARRとQNRQR/KEG x NNSRK/ASRを比較されたい)。
COMB1標的の切断は、KNHQS/KAS及びNNSRK/ARR精製タンパク質をCOMB1標的とともに我々の条件下でインキュベートしたときにインビトロでも検出されたが、単一タンパク質のインキュベーションは、いずれの検出可能な切断活性も生じなかった。しかし、切断効率は非常に低く、これはインビトロでのヘテロダイマー形成が遅いことに起因するのであろう
。実際に、Silvaらは、I-DmoIからの作製された誘導体が、活性ヘテロダイマーを形成するために、E. coliで同時発現されなければならないことを示すことができ(Nucleic Acids Res., 2004, 32, 3156〜3168)、I-CreIホモダイマーがサブユニットを容易に交換できるのか明確でない。実際に、低いレベルの切断が、別の経路、例えば溶液中の2つのホモダイマーによるその後のニック形成に起因し得ることを除外できず、我々は、現在、この問題について研究している。
。実際に、Silvaらは、I-DmoIからの作製された誘導体が、活性ヘテロダイマーを形成するために、E. coliで同時発現されなければならないことを示すことができ(Nucleic Acids Res., 2004, 32, 3156〜3168)、I-CreIホモダイマーがサブユニットを容易に交換できるのか明確でない。実際に、低いレベルの切断が、別の経路、例えば溶液中の2つのホモダイマーによるその後のニック形成に起因し得ることを除外できず、我々は、現在、この問題について研究している。
全体として、これらの結果は、コンビナトリアルアプローチが、位置10NNN及び5NNNで変更されたキメラ標的部位を効率的に切断し得る人工HEを作製できることを示す。I-CreI誘導体の集団の作製は、今日の64個の10NNN標的の全てと、64個の5NNN標的(我々の未発表データ)のうちの62個の切断を可能にする。これらを分子内、及び分子間で組み立てる能力は、達成し得る22マーの数を、少なくとも1.57×107 ((64×62)2)に増大させる。
実施例13：再設計されたホーミングエンドヌクレアーゼは、RAG1遺伝子中の天然標的配列を切断する
A) 材料及び方法
実験手順は、個別に作製したCOMB標的(実施例7)についてのコンビナトリアル変異体に対して、RAG標的についてのコンビナトリアル変異体をライブラリーとして作製した以外は、実施例3及び7に記載するとおりである。
A) 材料及び方法
実験手順は、個別に作製したCOMB標的(実施例7)についてのコンビナトリアル変異体に対して、RAG標的についてのコンビナトリアル変異体をライブラリーとして作製した以外は、実施例3及び7に記載するとおりである。
B) 結果
天然標的部位についてのHEを設計するためのコンビナトリアルアプローチの効率の分析のために、ヒトRAG1遺伝子を、10NNN及び5NNNのライブラリーに存在する変異体と両立できる可能性のある部位について分析した。RAG1は、免疫グロブリン及びTリンパ球レセプターの成熟に必須工程であるV(D)J組換えの開始の原因であるRAG2と複合体を形成することが示されている(Oettingerら, Science, 1990, 248, 1517〜1523; Schatzら, Cell, 1989, 59, 1035〜1048)。RAG1における変異を有する患者は、T及びBリンパ球の不在により、重症複合免疫不全(SCID)を示す。SCIDは、家族提供者からの同種造血幹細胞移植により治療でき、最近、ある種類のSCIDが、遺伝子治療試験の対象となっている(Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。
天然標的部位についてのHEを設計するためのコンビナトリアルアプローチの効率の分析のために、ヒトRAG1遺伝子を、10NNN及び5NNNのライブラリーに存在する変異体と両立できる可能性のある部位について分析した。RAG1は、免疫グロブリン及びTリンパ球レセプターの成熟に必須工程であるV(D)J組換えの開始の原因であるRAG2と複合体を形成することが示されている(Oettingerら, Science, 1990, 248, 1517〜1523; Schatzら, Cell, 1989, 59, 1035〜1048)。RAG1における変異を有する患者は、T及びBリンパ球の不在により、重症複合免疫不全(SCID)を示す。SCIDは、家族提供者からの同種造血幹細胞移植により治療でき、最近、ある種類のSCIDが、遺伝子治療試験の対象となっている(Fischerら, Immunol. Rev., 2005, 203, 98〜109)。
RAG1のゲノム遺伝子座の分析により、RAG1のコードエキソンの11bp上流に位置する、可能性のある標的部位が明らかになり、これはRAG1.1とよばれた(図3c)。COMB配列とは対照的に、RAG1.1部位はC1221部位とは位置10NNN及び5NNNにおいて異なるだけでなく、11N (11cの代わりに11t)及び7NN (7acの代わりに7ct)でも異なる。I-CreI D75Nは、これらの変更に耐性であるが、コンビナトリアル変異体もこれらの位置での変更に耐性であろうことが推測された。5NNN領域について、44、68、70位で変異した以前に報告されたライブラリー(Arnouldら, 上記)、並びに44、68、75及び77位で変異され、70位にセリン残基を有する別のライブラリーからの変異体を用いた。追加の残基が変異されているので、コンビナトリアル変異体は、8の代わりに10残基にちなんで命名し、最後の2文字は75及び77位の残基に対応する(例えば、KNTAK/NYSYNは、I-CreI 28K30N33T38A40K44N68Y70S75Y77Nのことである)。
個別に作製したCOMB標的について用いた変異体とは対照的に、RAG標的について用いた変異体は、ライブラリーで作製した。RAG1.2標的配列について、推定複雑度1300変異体のライブラリーを作製した。2256クローンのスクリーニングは、64個の陽性(2.8%)を生み出し、これを配列決定の後に、49個のユニークエンドヌクレアーゼに対応することがわかった。RAG1.3について、2280個のクローンをスクリーニングし、88個の陽性(3.8%)を同定し、これらは59個のユニークエンドヌクレアーゼに相当した。両方の場合において、コンビナトリアル変異体は、5NNN標的配列も10NNN標的配列も元のC1221も切断できなかった。個
別に作製して試験したCOMB変異型とは対照的に、RAG変異体は、ライブラリーとして作製した。にもかかわらず、これらのライブラリーにおいて明確な偏りは検出されず、これらの頻度は、機能的な陽性の実際の頻度の代表であるはずである。COMB標的を用いるスクリーニングと比較したこのようなより低い成功率は、75及び77位での追加の変異によるか、又はこれらの標的の±6、±7及び±11位での追加の変更による。
別に作製して試験したCOMB変異型とは対照的に、RAG変異体は、ライブラリーとして作製した。にもかかわらず、これらのライブラリーにおいて明確な偏りは検出されず、これらの頻度は、機能的な陽性の実際の頻度の代表であるはずである。COMB標的を用いるスクリーニングと比較したこのようなより低い成功率は、75及び77位での追加の変異によるか、又はこれらの標的の±6、±7及び±11位での追加の変更による。
COMB1について、パリンドローム標的を切断できる変異体のパネルを、次いで、酵母で同時発現させて、RAG1.1標的切断を試験した。図20bは、同時発現が天然標的の切断をもたらしたことを示す。RAG1.1標的切断は、同時発現によるヘテロダイマーによる。なぜなら、これらの変異体は、単独で発現させたときにRAG1.1を切断可能でなかったからである(図20b)。このことは、ホーミングエンドヌクレアーゼが完全に再設計されて、天然に存在する配列を切断することを最初に示す。これらのコンビナトリアル変異体の作製は、これがLAGLIDADGタンパク質のDNA結合界面の全体的な改変に向かう重要な工程であるので、大きい可能性を開く。
Claims (45)
- 少なくとも：
(a) 親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位の1つの半分の第1部分と相互作用するコアドメインの第1機能的サブドメインに変異を有する第1変異型を、
(a1) I-CreIの26位〜40位に位置するアミノ酸に相当する第1サブドメインの少なくとも1つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置換し、
(a2) 前記半部位の第1部分の少なくとも1つのヌクレオチドを異なるヌクレオチドで置換することにより前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位から誘導される第1 DNA標的配列を切断できる、工程(a1)からの第1変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築し、
(b) 前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位の第2部分と相互作用するコアドメインの第2機能的サブドメインに変異を有する第2変異型を、
(b1) I-CreIの44位〜77位に位置するアミノ酸に相当する第2サブドメインの少なくとも1つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置換し、
(b2) 前記半部位の第2部分の少なくとも1つのヌクレオチドを異なるヌクレオチドで置換することにより前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ半部位から誘導される第2 DNA標的配列を切断できる、工程(b1)からの第2変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築し、
(c) 前記親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの前記第1機能的サブドメイン及び第2機能的サブドメインに変異を有する第3変異型を、
(c1) 工程(a1)及び工程(b1)からの2つの変異型の変異を、単一変異型に組み合わせ、
(c2) 第1変異型DNA標的半部位の第1部分と第2変異型DNA標的半部位の第2部分とを含むキメラDNA標的配列を切断できる、工程(c1)からの変異型を選択及び／又はスクリーニングする
ことにより構築する
工程を含む、コアドメインの2つの機能的サブドメインの変異により親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼから誘導されるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型を作製する方法。 - 親のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼが、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI、I-DmoI、PI-SceI及びPI-PfuIからなる群より選択される請求項1に記載の方法。
- 工程a1)又はb1)においてアミノ酸が、A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、L、V、W及びYからなる群より選択されるアミノ酸で置換される請求項1又は2に記載の方法。
- 工程a2)、b2)及び／又はc2)が、前記変異型により生じる変異DNA標的配列中の二本鎖切断が正の選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の活性化、又は負の選択マーカー若しくはレポーター遺伝子の不活性化を導く条件下で、前記DNA二本鎖切断の組換え媒介修復によりインビボで行われる請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程c2)で得られた1つの変異型を発現させてホモダイマーの形成を可能にする工程d1)をさらに含む請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 工程c2)で得られた2つの異なる変異型を同時発現させてヘテロダイマーの形成を可能にする工程d'1)をさらに含む請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法により得ることができるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ変異型。
- 少なくとも1つの第1置換を44位、68位、70位、75位及び／又は77位に、かつ少なくとも1つの第2置換を26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位に有するI-CreI変異型である請求項7に記載の変異型。
- 44位、68位及び70位に、
- 28位、30位、33位、38位及び40位にそれぞれ、
- 75位のアスパラギン酸の、非荷電アミノ酸での変異をさらに含む請求項8〜10のいずれか1項に記載の変異型。
- 非荷電アミノ酸が、アスパラギン又はバリンである請求項11に記載の変異型。
- 式：
c-11n-10n-9n-8m-7y-6n-5n-4n-3k-2y-1 r+1m+2n+3n+4n+5r+6k+7n+8n+9n+10g+11 (I)
(式中、nはa、t、c又はgであり、mはa又はcであり、yはc又はtであり、kはg又はtであり、rはa又はgであるが(配列番号2)、但し、n-10n-9n-8がaaaでありかつn-5n-4n-3がgtcであるときに、n+8n+9n+10はtttではなく、かつn+3n+4n+5はgacではなく、n+8n+9n+10がtttでありかつn+3n+4n+5がgacであるときに、n-10n-9n-8はaaaではなく、かつn-5n-4n-3はgtcではない)
を有する配列を含むキメラDNA標的を切断する請求項8〜12のいずれか1項に記載の変異型。 - キメラDNA標的(ここで、n-4はtであるか、又はn+4はaである)を切断するための、44位にグルタミン(Q)を有する請求項13に記載の変異型。
- キメラDNA標的(ここで、n-4はaであるか、又はn+4はtである)を切断するための、44位にアラニン(A)又はアスパラギンを有する請求項13に記載の変異型。
- キメラDNA標的(ここで、n-4はcであるか、又はn+4はgである)を切断するための、44位にリジン(K)を有する請求項13に記載の変異型。
- キメラDNA標的(ここで、n-9はgであるか、又はn+9はcである)を切断するための、38位にアルギニン(R)又はリジン(K)を有する請求項13に記載の変異型。
- キメラDNA標的が、-10位〜-8位にaac、aag、aat、acc、acg、act、aga、agc、agg、agt、ata、atg、cag、cga、cgg、ctg、gac、gag、gat、gaa、gcc、gga、ggc、ggg、ggt、gta、gtg、gtt、tac、tag、tat、taa、tcc、tga、tgc、tgg、tgt又はttgから選択されるヌクレオチドトリプレット、及び／又は+8位〜+10位に-10位〜-8位の上記ヌクレオチドトリプレットの逆相補配列であるヌクレオチドトリプレットを含む請求項13〜17のいずれか1項に記載の変異型。
- I-MsoIの30〜43位及び47〜75位にそれぞれ位置する2つのサブドメインのそれぞれに1つずつ少なくとも2つの置換を有するI-MsoI変異型である請求項7に記載の変異型。
- ホモダイマーである請求項7〜19のいずれか1項に記載の変異型。
- 2つの異なる変異型を含むヘテロダイマーである請求項7〜19のいずれか1項に記載の変異型。
- 請求項7〜19のいずれか1項で定義される変異型からのモノマーと、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ若しくはその機能的変異型からのモノマー又はドメインとの融合体を含む単鎖キメラエンドヌクレアーゼ。
- 請求項7〜21のいずれか1項に記載の変異型又は請求項21に記載の変異型から誘導される単鎖キメラエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
- 請求項7〜21のいずれか1項に記載の変異型のコアドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
- 請求項23又は24に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含む組換えベクター。
- 請求項20で定義されるホモダイマーのモノマー、又は請求項21若しくは22で定義されるモノマー若しくは単鎖エンドヌクレアーゼの2つのドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含む請求項25に記載の組換えベクター。
- 2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含み、そのそれぞれが請求項21で定義されるヘテロダイマーのモノマーの1つをコードする請求項26に記載の組換えベクター。
- 請求項1及び12〜17のいずれか1項で定義されるキメラDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を共有する配列を含む標的化構築物を含む請求項25〜27のいずれか1項に記載の組換えベクター。
- 標的化構築物が、a) 請求項1及び13〜18のいずれか1項で定義されるキメラDNA標的配列を取り囲む領域と相同性を共有する配列と、b) a)の配列に接する、導入される配列とを含む請求項26に記載の組換えベクター。
- 請求項23〜27のいずれか1項で定義される1若しくは2つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項25〜29のいずれか1項に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項23〜27のいずれか1項で定義される1又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを
含む非ヒトトランスジェニック動物。 - 請求項23〜27のいずれか1項で定義される1又は2つのポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
- 少なくとも、請求項7〜21のいずれか1項に記載の変異型、請求項22に記載の単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、請求項23〜27のいずれか1項で定義される1又は2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜29のいずれか1項に記載のベクター、請求項30に記載の宿主細胞、請求項32に記載のトランスジェニック植物、請求項31に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類の、分子生物学、インビボ若しくはインビトロの遺伝子操作、及びインビボ若しくはインビトロのゲノム操作のための使用。
- 変異型により切断されるキメラDNA標的配列を含む興味のある部位に二本鎖核酸切断を誘発することにより、DNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘導するための請求項33に記載の使用。
- 二本鎖核酸切断が、特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、変異遺伝子の場所に機能的遺伝子を回復させるため、興味のある内因性遺伝子を減弱化又は活性化させるため、興味のある部位に変異を導入するため、外因性遺伝子又はその一部分を導入するため、内因性遺伝子又はその一部分を不活性化又は検出するため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを修復されないまま放置して分解させるためである請求項33又は34に記載の使用。
- 前記変異型、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳類が、請求項28又は29で定義される標的化DNA構築物を伴っている請求項33〜35のいずれか1項に記載の使用。
- 請求項1及び13〜18のいずれか1項で定義されるキメラDNA標的を含むベクターを、請求項7〜21のいずれか1項に記載の変異型又は請求項22に記載の単鎖キメラエンドヌクレアーゼと接触させることにより、該ベクター上に位置する興味のある部位で二本鎖核酸を切断し、それにより、前記ヘテロダイマーメガヌクレアーゼの切断部位を取り囲む配列との相同性を示す別のベクターとの相同組換えを誘導する工程を含む遺伝子操作の方法。
- 1) 請求項1及び13〜18のいずれか1項で定義されるキメラDNA標的を、請求項7〜21のいずれか1項に記載の変異型又は請求項22に記載の単鎖キメラエンドヌクレアーゼと接触させることにより、該DNA標的を含むゲノム遺伝子座を二本鎖切断し、2) 前記切断されたゲノム遺伝子座を、該標的遺伝子座と相同性を共有する配列に挟まれている、該遺伝子座に導入される配列を含む標的化DNA構築物との相同組換えに適する条件下で維持する工程を含む、ゲノム操作の方法。
- 1) 請求項1及び13〜18のいずれか1項で定義されるキメラDNA標的を、請求項7〜21のいずれか1項に記載の変異型又は請求項22に記載の単鎖キメラエンドヌクレアーゼと接触させることにより、少なくとも1つの該標的を含むゲノム遺伝子座を二本鎖切断し、2) 前記切断されたゲノム遺伝子座を、該標的遺伝子座を取り囲む領域と相同性を共有する染色体DNAとの相同組換えに適する条件下に維持する工程を含む、ゲノム操作の方法。
- 請求項7〜21のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項22に記載の1つの単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、請求項23〜27のいずれか1項で定義される1若しくは2つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項25〜29のいずれか1項に記載のベクターを含む組成物。
- 標的遺伝子座と相同性を共有する配列に挟まれている興味のある部位を修復する配列を含む標的化DNA構築物をさらに含む請求項40に記載の組成物。
- 請求項7〜21のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項22に記載の1つの単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、請求項23〜27のいずれか1項で定義される1若しくは2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜29のいずれか1項に記載のベクターの、個体にいずれの手段により投与される、必要とする個体における遺伝性疾患を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
- 請求項7〜21のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項22に記載の1つの単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、請求項23〜27のいずれか1項で定義される1若しくは2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜29のいずれか1項に記載のベクターの、個体にいずれの手段により投与される、必要とする個体において、DNA中間体を提示する感染因子を原因とする疾患を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
- 請求項7〜21のいずれか1項に記載の少なくとも1つの変異型、請求項22に記載の1つの単鎖キメラエンドヌクレアーゼ、請求項23〜27のいずれか1項で定義される1若しくは2つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項25〜29のいずれか1項に記載のベクターの、生物学的に誘導された生成物、又は生物学的使用を意図する生成物におけるDNA中間体を提示する感染因子の増殖の阻害、不活性化又は消去のため、或いは物体の消毒のための、インビトロでの使用。
- 感染因子がウイルスである請求項43又は44に記載の使用。
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