JP2022502481A - 遺伝的に変異された細胞の死滅誘導組成物及び該組成物を用いた遺伝的に変異された細胞の死滅誘導方法 - Google Patents
遺伝的に変異された細胞の死滅誘導組成物及び該組成物を用いた遺伝的に変異された細胞の死滅誘導方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のWGSを比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的な変異配列を選別する段階;
前記選別された変異配列を認識する切断因子を製造する段階;
前記切断因子とヌクレアーゼを含む組成物を調製する段階;及び
ヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物を、ゲノム配列の変異を含む細胞に印加する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法を提供する。
ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のWGSを比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的なindelを選別する段階;
前記選別されたindelを認識する切断因子を製造する段階;
前記切断因子とヌクレアーゼを含む組成物を調製する段階;及び
ヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物を、ゲノム配列の変異を含む細胞に印加する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法を提供する。
数個のDSBが細胞死滅を誘導でき、全ての癌細胞は固有のIn/Del配列を有するということから、HCT116、U2OS、及びREP1細胞において固有のIn/Del配列をWGS(whole genome sequencing)によって確認した。その後、次の表1〜表3のように、癌細胞が持つ固有のDNA挿入(insertion)配列中に6〜8bpdml挿入サイズで染色体上に均一に広がっている部位を30個選定して細胞株別crRNAを作製し、CRISPR RNP複合体で細胞に形質感染させた後、crRNA特異性及び細胞生存度を確認した。
実施例1で作製されたcrRNAを用いてCRISPRシステムが作動するか否かを調べるために、in vitro切断アッセイ(cleavage assay)を行った。まず、PCRによって挿入配列(insertion sequence)の前後部分のDNAを500bpサイズに増幅して精製後に、作製されたcrRNAを用いてCRIPSRシステムによるDNAの切断がなされるか確認した。
大腸癌HCT116細胞と骨肉腫U2OS細胞に30個の特異的RNP(ribonucleotide protein)複合体を形質感染してDNA DSBを誘導した後、細胞の生長率をコロニー形成アッセイ(colony forming assay)によって確認した。
WGS(whole genome sequencing)を用いて、saCas9に対する新規なU2OS細胞株特異的crRNAを設計してAAVにパッケージングした。U2OS細胞株特異的crRNAの具体的配列は、次の通りである。
患者由来膠芽細胞腫からINDELによる細胞死滅効果を確認した。細胞を低酸素チャンバーで培養した以外は、実施例4と同じ方法で実験した。膠芽細胞腫に使用可能な配列は16個だけであった。16個の膠芽細胞腫特異的配列による選択的細胞死滅を確認するということは、16個のDNA DSBのみを生成させることができることを意味する。
ATMキナーゼ抑制剤を含有又は非含有するAAV粒子を実施例5の膠芽細胞腫細胞に形質導入し、実施例4及び実施例5と同じ方法で実験した。24時間の形質導入後、細胞を室温で10分間1%メチレンブルーで染色した。細胞をPBSで3回10分間洗浄し、室温で乾燥させた。細胞を500ulの10%酢酸溶液で脱色し、ODを測定した。結果を図11に示した。
癌特異的INDEL誘導細胞死滅(CINDELA)効果を確認するために、患者由来の肺癌組織をマウス異種移植に使用した。患者由来の肺癌組織をマウスに挿入し、28個の肺癌組織特異的crRNAを含むAAV粒子をマウスに連続して注射した。
Claims (47)
- ヌクレアーゼ、及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導用組成物。
- ヌクレアーゼ、及び癌特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を含む、癌治療用組成物。
- 前記ヌクレアーゼは、制限酵素(restriction enzyme)、ZNFN(zinc finger nuclease)、TALEN(transcriptional activator−like effector nuclease)又はCasタンパク質であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記Casタンパク質は、Cas3、Cas9、Cpf1、Cas6、C2c12又はC2c2であることを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
- 前記Casタンパク質は、コリネバクター(Corynebacter)、ステレラ(Sutterella)、レジオネラ(Legionella)、トレポネーマ(Treponema)、フィリファクター(Filifactor)、ユーバクテリウム(Eubacterium)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、バクテロイデス(Bacteroides)、フラビイボラ(Flaviivola)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、アゾスピリラム(Azospirillum)、グルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)、ナイセリア(Neisseria)、ロゼブリア(Roseburia)、パービバキュラム(Parvibaculum)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ニトラティフラクター(Nitratifractor)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)及びカンピロバクター(Campylobacter)からなる群から選ばれるCasタンパク質のオルソログ(ortholog)を含む微生物属に由来し、これらから分離されたもの又は組み換えられたものを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
- 前記切断因子は、配列番号1〜163からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記ゲノム配列の変異を含む細胞は、癌細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 正常細胞固有の挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号61〜90の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記癌は大腸癌であり、大腸癌特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号1〜30の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 前記癌は骨肉腫であり、骨肉腫特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号31〜60の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 前記癌は膠芽細胞腫であり、膠芽細胞腫特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号121〜136からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 前記癌は肺癌であり、肺癌特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号137〜163からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 前記組成物は、ゲノム配列の変異を含む細胞固有の挿入及び/又は欠失を含む核酸配列部位に二重鎖切断(Double−stranded break,DSB)を誘導して細胞を死滅させることを特徴とする、請求項1又は2に記載の組成物。
- ベクターを用いて切断因子を導入することを特徴とする、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記ベクターは、AAVであることを特徴とする、請求項14に記載の組成物。
- ヌクレアーゼ、及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を、ゲノム配列の変異を含む細胞に処理する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法。
- ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のWGS(whole genome sequenceing)を行う段階;
ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のWGSを比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的な変異配列を選別する段階;
前記選別された変異配列を認識する切断因子を製造する段階;
前記切断因子とヌクレアーゼを含む組成物を調製する段階;及び
ヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物をゲノム配列の変異を含む細胞に適用する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法。 - ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のWGS(whole genome sequenceing)を行う段階;
ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のWGSを比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的なindelを選別する段階;
前記選別されたindelを認識する切断因子を製造する段階;
前記切断因子とヌクレアーゼを含む組成物を調製する段階;及び
ヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物を、ゲノム配列の変異を含む細胞に適用する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法。 - 前記ヌクレアーゼは、制限酵素(restriction enzyme)、ZNFN(zinc finger nuclease)、TALEN(transcriptional activator−like effector nuclease)又はCasタンパク質であることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 前記Casタンパク質は、Cas3、Cas9、Cpf1、Cas6、又はC2c2であることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 前記Casタンパク質は、コリネバクター(Corynebacter)、ステレラ(Sutterella)、レジオネラ(Legionella)、トレポネーマ(Treponema)、フィリファクター(Filifactor)、ユーバクテリウム(Eubacterium)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、バクテロイデス(Bacteroides)、フラビイボラ(Flaviivola)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、アゾスピリラム(Azospirillum)、グルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)、ナイセリア(Neisseria)、ロゼブリア(Roseburia)、パービバキュラム(Parvibaculum)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ニトラティフラクター(Nitratifractor)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)及びカンピロバクター(Campylobacter)からなる群から選ばれるCasタンパク質のオルソログ(ortholog)を含む微生物属に由来し、これらから分離されたもの又は組み換えられたものを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 前記切断因子は、配列番号1〜163の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 前記ゲノム配列の変異を含む細胞は、癌細胞であることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 正常細胞固有の挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号61〜90の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- 前記癌は大腸癌であり、大腸癌特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号1〜30の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 前記癌は骨肉腫であり、骨肉腫特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号31〜60の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 前記癌は膠芽細胞腫であり、膠芽細胞腫特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号121〜136からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 前記癌は肺癌であり、肺癌特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号137〜163からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- ゲノム配列の変異を含む細胞固有の挿入及び/又は欠失を含む核酸配列部位に同時多発的二重鎖切断(Double−stranded break,DSB)を誘導して細胞を死滅させることを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- Caffeine、Wortmannin、CP−466722、KU−55933、KU−60019、KU−559403からなる群から選ばれる一つ以上のATM(Ataxia telangiectasia mutated)阻害剤、Schisandrin B、NU6027、NVP−BEZ235、VE−821、VE−822(VX−970)、AZ20、AZD6738からなる群から選ばれる一つ以上のATR(Ataxia telangiectasia and Rad−3mutated)阻害剤、又はDNA−PKcs(DNA−dependent protein kinase catalytic subunit)のDNA二重螺旋修復阻害剤をさらに処理することを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- ヌクレアーゼ及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を個体に投与する段階を含む、癌の治療方法。
- ヌクレアーゼ及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子の発現カセットを含むベクターをゲノム配列の変異を含む細胞に処理することを含む、癌の治療方法。
- 前記ベクターは、AAV(Adeno−associated virus)であることを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- ヌクレアーゼ、及び患者の癌細胞固有の挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を含む、患者オーダーメイド型の癌治療用組成物。
- 前記ヌクレアーゼは、制限酵素(restriction enzyme)、ZNFN(zinc finger nuclease)、TALEN(transcriptional activator−like effector nuclease)又はCasタンパク質であることを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- 前記Casタンパク質は、Cas3、Cas9、Cpf1、Cas6、C2c12又はC2c2であることを特徴とする、請求項35に記載の組成物。
- 前記Casタンパク質は、コリネバクター(Corynebacter)、ステレラ(Sutterella)、レジオネラ(Legionella)、トレポネーマ(Treponema)、フィリファクター(Filifactor)、ユーバクテリウム(Eubacterium)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、バクテロイデス(Bacteroides)、フラビイボラ(Flaviivola)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、アゾスピリラム(Azospirillum)、グルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)、ナイセリア(Neisseria)、ロゼブリア(Roseburia)、パービバキュラム(Parvibaculum)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ニトラティフラクター(Nitratifractor)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)及びカンピロバクター(Campylobacter)からなる群から選ばれるCasタンパク質のオルソログ(ortholog)を含む微生物属に由来し、これらから分離されたもの又は組み換えられたものを特徴とする、請求項36に記載の組成物。
- 前記切断因子は、配列番号1〜163からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- 正常細胞固有の挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号61〜90の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- 前記癌は大腸癌であり、大腸癌特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号1〜30の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- 前記癌は骨肉腫であり、骨肉腫特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号31〜60の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- 前記癌は膠芽細胞腫であり、膠芽細胞腫特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号121〜136からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- 前記癌は肺癌であり、肺癌特異的挿入(insertion)及び/又は欠失(deletion)を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号137〜163からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドRNAであることを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- 前記組成物は、ゲノム配列の変異を含む細胞固有の挿入及び/又は欠失を含む核酸配列部位に二重鎖切断(Double−stranded break,DSB)を誘導して細胞を死滅させることを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- ベクターを用いて切断因子を導入することを特徴とする、請求項34に記載の組成物。
- 前記ベクターは、AAVであることを特徴とする、請求項45に記載の組成物。
- 患者の癌細胞から癌細胞特異的なindelを選別し、これを認識する切断因子を製造して、ヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物を患者に伝達することを含む、患者オーダーメイド型の癌治療方法。
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