JP2020508693A

JP2020508693A - Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集用組成物およびこれを用いたゲノム編集方法

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Publication number: JP2020508693A
Application number: JP2019548478A
Authority: JP
Inventors: キム，ジン−ス; ウンキム，ジュン
Original assignee: Institute for Basic Science
Current assignee: Institute for Basic Science
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2018-03-06
Publication date: 2020-03-26
Also published as: WO2018164457A1; CN111051509A; EP3594339A4; KR20180102025A; EP3594339A1

Abstract

Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術が提供される。前記ゲノム編集技術は真核細胞、例えば、哺乳類細胞、特にヒト細胞に適用可能であることを特徴とする。【選択図】図１ａ

Description

Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術に関わるものであって、Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含むゲノム編集用組成物およびこれを用いたゲノム編集方法に関するものである。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、細菌、古細菌に現れる外部に由来した遺伝要素に対する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは外部に由来したＤＮＡまたはＲＮＡに相補的に結合できるガイドＲＮＡとヌクレアーゼ役割をＣａｓエフェクター蛋白質を用いて特定標的配列にＤＮＡまたはＲＮＡ切断を誘導する特徴を有しており、このような特性を活用して最近、高等生物のゲノムを編集する遺伝子ハサミ技術として基礎・応用科学分野で広く活用されている。

現在最も多く用いられるクリスパー遺伝子ハサミは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）で発見された２型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを基盤としたものである。Ｓ．ピオゲネスに由来したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは一般に高い効率で所望の標的位置に遺伝子編集を誘導することができるという点で有用であるが、標的配列に５’−ＮＧＧＰＡＭ配列がある場合のみに効果的に遺伝子編集を誘導することができるという点が限界として作用した。このような限界を克服するための方法の一つとして、種々の種に存在する他の型、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの新型遺伝子ハサミとしての活用可能性を確認する研究が多く行われている。

一例は、Ｃ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲシステム、これをコードする遺伝子（ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡなど）またはＲＮＡ（ｍＲＮＡなど））、または前記遺伝子を含む発現ベクターを含むゲノム編集用組成物を提供する。

他の例は、前記ゲノム編集用組成物を細胞または生物に導入させる段階を含むゲノム編集方法を提供する。

他の例は、前記ゲノム編集用組成物を使用して得られた遺伝子改変細胞を提供する。

他の例は、前記遺伝子改変細胞から得られた遺伝子改変生物を提供する。

他の例は、前記塩基編集用組成物が導入された哺乳動物胚を哺乳動物委託母卵管に移植する段階を含む遺伝子改変動物の製造方法を提供する。

Ｃ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲシステムは、最近発見されたＶＢ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。既存に最も多く活用されたＳｐＣａｓ９システムと異なり、ヌクレアーゼ役割を果たすエフェクター蛋白質がＣａｓ９でないＣ２ｃ１蛋白質であり、ＮＧＧ−３’ＰＡＭ配列でない５’−ＴＴＮＰＡＭ配列を認識し、ＤＮＡ切断を起こした時、平滑末端でない粘着末端（ｓｔｉｃｋｙｅｎｄ）を生成するという特徴を有する。

本明細書では、Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼを使用してヒトなどの真核細胞内でのゲノム編集に使用する技術を提案する。

前記Ｃ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃ２ｃ１蛋白質（例えば、ＡａｃＣ２ｃ１蛋白質）、および標的遺伝子の標的部位とハイブリダイズ可能な（相補的塩基配列を有する）ガイドＲＮＡ（例えば、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））を含むものであってもよい。

したがって、前記ゲノム編集用組成物は、（１）Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼ、これをコードする遺伝子、または前記遺伝子を含む発現ベクター、および（２）ガイドＲＮＡ、これをコードするＤＮＡ、またはこれを含む発現ベクターを含むものであってもよい。

他の例は、前記ゲノム編集用組成物を細胞または生物に導入（投与または注入）する段階を含むゲノム編集方法を提供する。前記細胞は生体から単離された細胞（例えば、真核細胞）であってもよく、前記生物はヒトを除くかヒトを含む真核生物（例えば、哺乳動物）であってもよい。

前記細胞は真核動物細胞、真核植物細胞などの真核細胞であり、前記生物は真核動物または真核植物などの真核生物であってもよい。

他の例は、前記ゲノム編集用組成物を使用して得られた遺伝子改変細胞を提供する。前記細胞は、真核細胞であってもよい。前記真核細胞は真核動物の細胞であってもよく、一具体例で、ヒトを含むかヒトを除いた哺乳動物細胞であってもよい。

他の例は、前記塩基編集用組成物が導入された哺乳動物胚を哺乳動物委託母卵管に移植して遺伝子改変動物を生産する段階を含む遺伝子改変動物の製造方法を提供する。前記胚細胞を卵管に移植を受ける哺乳動物は前記胚細胞が由来する哺乳動物と同種の哺乳類（委託母）であってもよい。

他の例は、前記遺伝子改変細胞から得られた遺伝子改変生物を提供する。前記遺伝子改変動物は、前記遺伝子改変動物の製造方法によって製造されたものであってもよい。前記動物は、真核動物、例えばヒトを含むかヒトを除いた哺乳動物であってもよい。

前記Ｃ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは多様な細菌で発見され、代表的な例として、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）種に由来したＣ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（以下、‘ＡａｃＣ２ｃ１’）が挙げられる。ＡａｃＣ２ｃ１の野生型（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ、ＷＴ）は１１２９個のアミノ酸から構成されており（配列番号１参照）、例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｂｒｏｗｓｅ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／１２５３０５／で提供される核酸配列（１７７１番目から５１６０までの部位）によってコードされる蛋白質であってもよい。

本発明で使用されたものとして、“ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅＲＮＡ）”は標的遺伝子内の標的部位内の特異的な塩基配列（標的配列）にハイブリダイズ可能な標的化配列を含むＲＮＡを意味し、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）または生体（または細胞）内でＣ２ｃ１蛋白質などのようなヌクレアーゼと結合してこれを標的遺伝子（または標的部位）に導く役割を果たす。

前記ガイドＲＮＡは、共に作用するヌクレアーゼの種類および／またはその由来微生物によって適切に選択できる。

例えば、前記ガイドＲＮＡは、
標的配列とハイブリダイズ可能な部位（標的化配列）を含むＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；
Ｃ２ｃ１蛋白質などのようなヌクレアーゼと相互作用する部位を含むトランス活性化型（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）；および
前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位（例えば、標的化配列を含むｃｒＲＮＡ部位およびヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部位）が融合された形態の一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）
からなる群より選択された１種以上であってもよく、
具体的に、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌＲＮＡ）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部位を含む一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。

前記ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子（標的部位）内の標的配列と相補的な配列（標的化配列）を有する部分（これをスペーサー領域（Ｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎ）、標的ＤＮＡ認識配列（ＴａｒｇｅｔＤＮＡｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）、塩基対合領域‘ｂａｓｅｐａｉｒｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）などとも命名する）およびＣ２ｃ１蛋白質との結合のためのフォールディング構造を形成するための二重結合部位を含むことができる。前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分および標的ＤＮＡの相補的な部分を含む場合であれば、いかなる形態のガイドＲＮＡも本発明で使用できる。

例えば、Ｃ２ｃ１蛋白質は標的遺伝子編集のために二つのガイドＲＮＡ、即ち、標的遺伝子の標的部位とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を有するＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とＣ２ｃ１蛋白質と相互作用するトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ；Ｃ２ｃ１蛋白質と相互作用する）を必要とし、これらｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは互いに結合された二本鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体形態、または線状に連結された一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）形態（Ｃ２ｃ１蛋白質と結合するための適切なフォールディング構造を形成するために部分的に二本鎖を形成する）で使用できる。一例で、ＡａｃＣ２ｃ１を使用する場合、ｓｇＲＮＡは少なくとも前記ｃｒＲＮＡのハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ一部または全部とｔｒａｃｒＲＮＡのＣ２ｃ１蛋白質と相互作用する部位を少なくとも含むｔｒａｃｒＲＮＡ一部または全部が連結されたものであってもよい。

前記ガイドＲＮＡ、具体的にｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは標的遺伝子内標的配列と相補的な配列（標的化配列）を含み、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの上流部位、具体的にｓｇＲＮＡまたはｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に一つ以上、例えば、１−１０個、１−５個、または１−３個の追加のヌクレオチドを含むことができる。前記追加のヌクレオチドはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ、Ｇ）であってもよいが、これに制限されるのではない。

一例で、ＡａｃＣ２ｃ１に対するｓｇＲＮＡは、次の配列一般式１で表され得る：
（５’−［配列番号２］−［（Ｎ）ｎ］−３’；配列一般式１）

上記配列一般式１で、
太字で表示した部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ由来部分であり、
イタリック体で表示した部分は、ｃｒＲＮＡ由来部分であり、
Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、それぞれ独立してＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣの中から選択された任意のヌクレオチドであってもよく、
（Ｎ）ｎは標的部位とハイブリダイズ可能な（相補的配列を有する）標的化配列であって、Ａ、Ｕ、Ｇ、およびＣの中から選択されたｎ個の互いに同一であるか異なるヌクレオチドであり、ｎは１７−２３、１８−２２、または１９−２１の整数（例えば、２０）であってもよい。

一例で、ガイドＲＮＡは前記配列一般式１中の１−１５個、５−１５、１０−１５個、または１２−１５個のヌクレオチドが欠失したものであってもよく、この時、欠失するヌクレオチドは配列一般式１に下線で表示したヌクレオチド（ＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡ）から選択された１−１５個、５−１５、１０−１５個、または１２−１５個（例えば、１２個または１５個）のヌクレオチドであってもよい。

一例で、前記ＡａｃＣ２ｃ１に対するｓｇＲＮＡは、次の配列一般式２で表され得るが、これに制限されるのではない：
（５’−［配列番号３］−［（Ｎ）ｎ］−３’；配列一般式２）

上記配列一般式２で、ｎは２０であってもよい。

前記ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端（即ち、ｃｒＲＮＡのターゲッティング配列部位の５’末端）に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含むことができる。

前記ガイドＲＮＡの標的配列は、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒＡｄｊａｃｅｎｔＭｏｔｉｆ）配列（５’−ＴＴＮ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである））の３’に隣接して位置する約１７個〜約２３個、約１８個〜約２２個、または約１９個〜約２１個、例えば２０個の連続する核酸配列であってもよい。

前記ガイドＲＮＡの標的配列とハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（標的鎖；即ち、ＰＡＭ配列（５’−ＴＴＮ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）が位置するＤＮＡ鎖）またはこの相補的な鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであってもよい。一例で、ガイドＲＮＡの標的化配列は、ＰＡＭ配列が位置する標的鎖と相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的配列を有しハイブリダイズ可能なものであってもよい。

本明細書で、標的部位の核酸配列（標的配列）は、標的遺伝子の該当遺伝子部位の二つのＤＮＡ鎖のうちのＰＡＭ配列が位置する鎖の核酸配列で表される。この時、実際にガイドＲＮＡが結合するＤＮＡ鎖はＰＡＭ配列が位置する鎖の相補的鎖であり得るので、前記ガイドＲＮＡに含まれている標的化配列は、ＲＮＡ特性上ＴをＵに変更するのを除いて、標的配列と同一な核酸配列を有することができる。したがって、本明細書で、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的配列は、ＴとＵが相互変更されることを除いて同一な核酸配列で表される。

前記Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは
生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）でＣ２ｃ１エンドヌクレアーゼ蛋白質およびガイドＲＮＡが複合体を形成した（生体外で予め組み立てられた）リボ核酸蛋白質形態で使用されるか（この場合、複合体形態で生体内または細胞内に注入され、複合体形態で細胞膜および／または核膜を通過するようになる）、
Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼ蛋白質またはこれをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡの混合物形態で使用されるか、
Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼ蛋白質コード遺伝子（ＤＮＡ）およびガイドＲＮＡコードＤＮＡをそれぞれ含むか、共に含むプラスミド形態で使用できる。

前記Ｃ２ｃ１蛋白質は、細胞浸透ペプチドおよび／または蛋白質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ）と連結され得る。前記蛋白質伝達ドメインはポリ−アルギニンまたはＨＩＶ由来のＴＡＴ蛋白質であってもよいが、これに制限されない。細胞浸透ペプチドまたは蛋白質伝達ドメインは上述の例以外にも多様な種類が当業界に公知されているので、当業者は前記例に制限されず多様な例を適用することができる。

また、前記Ｃ２ｃ１蛋白質またはこれをコードする遺伝子は、核移行シグナル（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ、ＮＬＳ）配列を追加的に含むことができる。したがって、前記Ｃ２ｃ１蛋白質をコードする遺伝子を含む発現カセットは、前記Ｃ２ｃ１蛋白質を発現させるためのプロモーター配列などの調節配列、またはここに加えて、ＮＬＳ配列を含むことができる。前記ＮＬＳ配列は当業界によく知られており、例えばＰＫＫＫＲＫＶのアミノ酸配列を有するものであってもよいが、これに制限されるのではない。特に、前記Ｃ２ｃ１蛋白質またはこれを含むリボ核酸蛋白質が真核細胞および／または真核生物に適用される場合に、前記ＮＬＳ配列が必要なことがある。

前記Ｃ２ｃ１蛋白質またはこれをコードする核酸分子は、単離および／または精製のためのタグまたは前記タグをコードする核酸配列と連結され得る。一例として、前記タグは、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグなどのような小さいペプチドタグ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）タグ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグなどからなる群より適切に選択できるが、これに制限されない。

前記ゲノム編集は、ゲノム内の標的遺伝子内の一つ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入、および／またはもとの塩基と異なる塩基を有するヌクレオチドへの置換、および／またはこれによる標的遺伝子の不活性化（機能異常、喪失など）などを意味するものであり得る。

Ｃ２ｃ１の場合、ＰＡＭ配列近所でＤＮＡの二本鎖を切断し、この時、二本鎖の切断位置が相異なって末端長さが相異なる粘着末端（ｓｔｉｃｋｙｅｎｄ）を形成する。ＡｃｓＣ２ｃ１の場合、ＰＡＭ配列が位置する鎖ではＰＡＭ配列から３’方向に５−２５ｎｔ（ヌクレオチド）、５−２０ｎｔ、１０−２５ｎｔ、１０−２０ｎｔまたは１５−２０ｎｔ離れた位置（その位置のヌクレオチドの５’または３’末端；例えば、ＰＡＭ配列から３’方向に１７番目ヌクレオチドと１８番目ヌクレオチドの間）を切断し、他の鎖（ＰＡＭ配列が位置する鎖と相補的な鎖）ではＰＡＭ配列と相補的な配列から５’方向に１５−３０ｎｔ（ヌクレオチド）、１５−２５ｎｔ、２０−３０ｎｔ、または２０−２５ｎｔ離れた位置（その位置のヌクレオチドの５’または３’末端；例えば、ＰＡＭ配列と相補的配列から５’方向に２４番目ヌクレオチドと２５番目ヌクレオチドの間）を切断して、粘着末端を形成することができる。前記切断位置は、標的配列位置によって変わってもよい。

前記細胞は、原核細胞または真核細胞（真核動物細胞または真核植物細胞）であってもよく、特に、ヒト細胞などを含む哺乳動物細胞などの真核動物細胞であってもよい。前記細胞は、生体内存在するか、生体から単離された細胞であってもよい。

前記細胞に導入させる段階は、Ｃ２ｃ１コード遺伝子およびガイドＲＮＡコード遺伝子をそれぞれまたは共に含む発現ベクターを通常的方法（電気穿孔、リポフェクションなど）で細胞に導入させて発現させるか、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で予め組み立てられたＣ２ｃ１−ガイドＲＮＡ複合体、またはＣ２ｃ１蛋白質またはこれをコードするｍＲＮＡとガイドＲＮＡ混合物を電気穿孔、リポフェクション、微細注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などの方法で発現ベクターを通じることなく直接細胞内に導入させることによって行うことができる。前記細胞に導入させる段階は、生体から単離された細胞に対して生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で行われることであってもよい。

本明細書に使用されたものとして、
‘標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ）’は、塩基編集（または塩基変異）の対象になる遺伝子を意味し、
‘標的部位または標的領域’は、標的遺伝子内の標的特異的ヌクレアーゼによる塩基編集が起こる部位を意味するものであって、一例で前記標的特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼ（ＲＮＡガイド操作型ヌクレアーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ）；ＲＧＥＮ）を含むものである場合、標的遺伝子内のＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼが認識する配列（ＰＡＭ配列）の５’末端および／または３’末端に隣接して位置し、最大長さが約５０ｂｐまたは約４０ｂｐである遺伝子部位（二本鎖または二本鎖のうちのいずれか一つの一本鎖）を意味する。

一例で、前記標的特異的ヌクレアーゼがＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼを含む場合、前記ＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼと共に、標的化配列を含むガイドＲＮＡを含むことができる。前記‘標的化配列（ｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）’は、標的部位内の連続する約１５〜約３０個、約１５〜約３５個、約１７〜約２３個、または約１８個〜約２２個、例えば、約２０個のヌクレオチド（ｎｔ）を含む部位の塩基配列と相補的な塩基配列を含む（ハイブリダイズ可能な）ガイドＲＮＡの部位であってもよい。前記標的化配列と相補的な塩基配列を含む標的部位の塩基配列を‘標的配列（ｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅ）’と称することができ、前記標的配列はＲＮＡ−ガイドヌクレアーゼが認識するＰＡＭ配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１７ｎｔ〜約２３ｎｔ、または約１８ｎｔ〜約２２ｎｔ、例えば、約２０ｎｔの長さの塩基配列を意味するものであり得る。

本明細書は、ＶＢ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃ２ｃ１システムがヒトゲノム編集（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ）に活用できるのをはじめて提案する。アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）種に由来したＣ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲシステムが代表的に使用され、当該細菌が高温に最適化された好熱菌であるにもかかわらず、３７℃条件でヒトＨＰＲＴ１遺伝子の特定標的配列に高い効率で作動することが確認された。好熱菌でないヒトゲノム編集（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ）に適した温度条件で生存する中温菌由来Ｃ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲシステムを用いれば、より高い効率でゲノム編集可能な新型遺伝子ハサミを確保することができ、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いたゲノム編集プラットフォームを拡張することに寄与できると期待される。

ＡａｃＣ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲシステム発現ベクター構成およびこれを用いた蛋白質発現を確認した結果を示すものであって、１ａは、ＡａｃＣ２ｃ１蛋白質発現ベクターとＡａｃ−ｓｇＲＮＡクローニングベクターを示す。ＡａｃＣ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲシステム発現ベクター構成およびこれを用いた蛋白質発現を確認した結果を示すものであって、１ｂは、ＡａｃＣ２ｃ１蛋白質発現確認した結果（左側１^ｓｔ抗体、ＨＡタグ。右側１^ｓｔ抗体、ＧＡＰＤＨ）を示す。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＨＰＲＴ１遺伝子編集結果を示すものであって、２ａ（Ｈｅｌａ細胞）および２ｂ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ＡａｃＣ２ｃ１を用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＨＰＲＴ１標的遺伝子編集結果（Ｉｎｄｅｌ（％））を示すグラフである（生物学的複製（反復）（Ｎ＝３））。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＨＰＲＴ１遺伝子編集結果を示すものであって、２ａ（Ｈｅｌａ細胞）および２ｂ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ＡａｃＣ２ｃ１を用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＨＰＲＴ１標的遺伝子編集結果（Ｉｎｄｅｌ（％））を示すグラフである（生物学的複製（反復）（Ｎ＝３））。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＨＰＲＴ１遺伝子編集結果を示すものであって、２ｃは、ＨＰＲＴ１−ＴＳ２とＨＰＲＴ１−ＴＳ５に対する１^ｓｔＮＧＳ結果分析結果を示す（青い字、ＰＡＭ配列。大文字表記、ＡａｃＣ２ｃ１標的配列。小文字表記、ＡａｃＣ２ｃ１標的周辺配列。ＷＴ、野生型）。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＨＰＲＴ１遺伝子編集結果を示すものであって、２ｄは、クリスタルバイオレット染色を用いたコロニー形成アッセイ結果を示す（Ｈｅｌａ細胞にＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後、播種、６−チオグアニン（６−ＴＧ）選択を行って２週後、ＨＰＲＴ１遺伝子に変異が導入されて遺伝子機能がＫＯされた細胞由来コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）をクリスタルバイオレット染色を通じて確認した）。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＣＲ５遺伝子とＤＮＭＴ１遺伝子の編集結果を示すものであって、３ａ（Ｈｅｌａ細胞）および３ｂ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ＡａｃＣ２ｃ１を用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＣＲ５標的遺伝子編集結果（Ｉｎｄｅｌ（％））を示すグラフである（生物学的複製（反復）（Ｎ＝１））。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＣＲ５遺伝子とＤＮＭＴ１遺伝子の編集結果を示すものであって、３ａ（Ｈｅｌａ細胞）および３ｂ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ＡａｃＣ２ｃ１を用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＣＲ５標的遺伝子編集結果（Ｉｎｄｅｌ（％））を示すグラフである（生物学的複製（反復）（Ｎ＝１））。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＣＲ５遺伝子とＤＮＭＴ１遺伝子の編集結果を示すものであって、３ｃ（Ｈｅｌａ細胞）および３ｄ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ＡａｃＣ２ｃ１を用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＤＮＭＴ１標的遺伝子編集結果（Ｉｎｄｅｌ（％））を示すグラフである（生物学的複製（反復）（Ｎ＝１））。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＣＲ５遺伝子とＤＮＭＴ１遺伝子の編集結果を示すものであって、３ｃ（Ｈｅｌａ細胞）および３ｄ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ＡａｃＣ２ｃ１を用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＤＮＭＴ１標的遺伝子編集結果（Ｉｎｄｅｌ（％））を示すグラフである（生物学的複製（反復）（Ｎ＝１））。ＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターを用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＣＲ５遺伝子とＤＮＭＴ１遺伝子の編集結果を示すものであって、３ｅは、ＣＣＲ５−ＴＳ３とＤＮＭＴ１−ＴＳ４に対する１^ｓｔＮＧＳ結果分析結果を示す（青い字、ＰＡＭ配列。大文字表記、ＡａｃＣ２ｃ１標的配列。小文字表記、ＡａｃＣ２ｃ１標的周辺配列。ＷＴ、野生型）。

以下では実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明しようとするが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのではない。以下に記載された実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できるのは当業者において自明である。

実施例１：ベクター製作
ｐＲＳＦＤｕｅｔ１−Ｈｉｓ６−Ｓｕｍｏ−ＡａｃＣ２Ｃ１−ＣＮプラスミド（Ｐｆ．ＤｉｎｓｈａｗＰａｔｅｌｇｒｏｕｐから提供を受けたｐＲＳＦ−Ｄｕｅｔ−１−Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＡａｃＣ２ｃ１プラスミドのＡａｃＣ２ｃ１Ｃ−ｔｅｒｍにＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）−ＨＡタグ配列追加）を鋳型としてＡａｃＣ２ｃ１のコード配列をＰＣＲで増幅し（ＣＭＶ−ＡａｃＣ２ｃ１−ＣＮ−１Ｆ−Ｈｉｎｄ３：ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧ（配列番号５）、ＣＭＶ−ＡａｃＣ２ｃ１−ＣＮ−１Ｒ−ＢａｍＨ１：ＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＧＴＡＧＴＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号６）、ｐｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ進行）、ｐｃＤＮＡ３．１骨格ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ７９０−２０）にＧｉｂｓｏｎクローニングを行った。

ヒト（Ｈｕｍａｎ）細胞発現とゲノム編集に最適化させるために、実施例１で準備された、ＣＭＶプロモーター、ＡａｃＣ２ｃ１コード配列、および核移行シグナル（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ；ＰＫＫＫＲＫＶ）を含む発現用カセットを製作した。ＡａｃＣ２ｃ１遺伝子はヒト細胞発現（ｈｕｍａｎｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に適したＣＭＶプロモーター下に転写誘導させ、ＳＶ４０核移行シグナル（ＰＫＫＫＲＫＶ）とＨＡタグはＡａｃＣ２ｃ１コード配列Ｃ末端側に位置させてＡａｃＣ２ｃ１ベクターを製作した（ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａｃＣ２ｃ１−ＮＬＳ−ＨＡ；図１ａ）。

標的配列に相補的に結合するｓｇＲＮＡは、ヒトＵ６プロモーター下に転写されるように製作した。Ａａｃ−ｓｇＲＮＡの場合、５’配列は共通的であり、ｓｇＲＮＡの３’側の２０個の塩基配列を標的配列（表２参照）に合わせて交替して特定標的位置に作動するｓｇＲＮＡを製作することができる（配列一般式２参照）。Ａａｃ−ｓｇＲＮＡクローニングベクターは、Ｕ６−Ｓｐ−ｓｇＲＮＡクローニングベクターを基盤として製作を行った（図１ａ参照）。

実施例２：細胞実験
Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ）とＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）両方とも２４ウエルプレート規模で実験を行った。トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行う前日に細胞を播種し、翌日７０〜８０％コンフルエント条件でトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を行った。前記実施例１で準備されたＡａｃＣ２ｃ１ベクター５００ｎｇとＡａｃ−ｓｇＲＮＡベクター５００ｎｇをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞内に伝達した。トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後、７２時間後にＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡサンプルを抽出し、下記の追加的な分析を行った。

実施例３：標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
ディープシーケンシングライブラリ（Ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｌｉｂｒａｒｙ）は、ＰＣＲ方法を通じて製作した。ＴｒｕＳｅｑＨＴＤｕａｌＩｎｄｅｘプライマーを用いて各サンプルのＩＤを付与し、ＭｉｎｉＳｅｑ３００サイクルキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて分析を行った。ディープシーケンシングに使用されたプライマー配列を下記の表１に整理した：

実施例４：６ＴＧ選択
２４ウエルプレート規模でＡａｃＣ２ｃ１ベクターとｓｇＲＮＡベクターをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後、継代培養を通じて十分な細胞数を確保した。トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後、一週間後に、１．５＊１０^６細胞を前日１００ｐｉディッシュに播種し、翌日から６ｕＭ６ＴＧ（６−チオグアニン）条件で選択を始めた。２週後、ＨＰＲＴ１遺伝子に変異が導入されて遺伝子機能がＫＯ（ノックアウト）された細胞由来コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）をクリスタルバイオレット染色を通じて確認した。

実施例５：ＡａｃＣ２ｃ１発現確認
ゲノム編集に先立ってＡａｃＣ２ｃ１蛋白質がヒト（ｈｕｍａｎ）細胞で発現されるかどうかを確認するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐｃＤＮＡ３．１−ＡａｃＣ２ｃ１−ＮＬＳ−ＨＡプラスミドをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し（実施例４参照）、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）２４時間後に細胞の全細胞溶解物（ＷＣＬ）を取って、ＡａｃＣ２ｃ１蛋白質のみ特異的に観察するために、ＡａｃＣ２ｃ１蛋白質Ｃ−末端に位置するＨＡタグを特異的に認識する１^ｓｔ抗体を使用して、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）方法でＡａｃＣ２ｃ１蛋白質発現有無を確認した。

前記得られた結果を図１ｂに示した（左側１^ｓｔ抗体、ＨＡタグ。右側１^ｓｔ抗体、ＧＡＰＤＨ）。図１ｂに示されているように、ＨＡタグを特異的に認識する１^ｓｔ抗体を使用した時、偽（ｍｏｃｋ）対照群に比べてｐ３−Ａａｃ−Ｃ２ｃ１−ＣＮプラスミドをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した実験群で１３３ｋＤａ位置に蛋白質が観察されるのを確認することができる。

実施例６：ＡａｃＣ２ｃ１を用いたゲノム編集
実施例５でＡａｃＣ２ｃ１蛋白がヒト（ｈｕｍａｎ）細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）で発現されることを確認したので、次いでＡａｃＣ２ｃ１を用いたヒト（ｈｕｍａｎ）ゲノム編集が可能であるか試験した。標的遺伝子としてヒトＨＰＲＴ１遺伝子を選定した。ＨＰＲＴ１遺伝子の場合、遺伝子ハサミを導入して完全ＫＯを誘導した場合にＫＯされたクローンを６−チオグアニン（６−ＴＧ）選択とクリスタルバイオレット染色を通じて表現型基盤でも確認できるという点で優先的に実験を行った。

ヒト（ｈｕｍａｎ）ＨＰＲＴ１遺伝子、およびＣＣＲ５とＤＮＭＴ１遺伝子のエキソン配列に対してＡａｃＣ２ｃ１標的配列を選択し（表２）、各標的配列に対応するＡａｃ−ｓｇＲＮＡベクターを製作した（実施例１参照）。

Ｈｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してＡａｃＣ２ｃ１とＡａｃ−ｓｇＲＮＡ発現ベクターを伝達し、３回の反復実験を行った。ベクター伝達７２時間後に、ゲノムＤＮＡ分離した後、標的配列での遺伝子編集効率（導入されたｉｎｄｅｌ頻度（％））を標的化ディープシーケンシング方式で分析し、導入されたｉｎｄｅｌが統計的に有意味な値であるか確認するためにＡａｃＣ２ｃ１とＡａｃ−ｓｇＲＮＡ発現ベクターを処理しない偽（ｍｏｃｋ）対照群に対しても標的化ディープシーケンシングを共に行って比較分析した。

前記分析結果を図２ａ（Ｈｅｌａ細胞）および２ｂ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）に示した。図２ａおよび２ｂに示されているように、ＨＰＲＴ１−ＴＳ２とＨＰＲＴ１−ＴＳ５に対して、Ｈｅｌａ細胞の場合は平均的に６．７％と５．８％ｉｎｄｅｌが導入され、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の場合は平均的に２．８％と１７％の高いｉｎｄｅｌが標的配列に導入されたのを確認することができる。

また、Ｉｎｄｅｌが標的配列に主にどのように導入されるか確認するために、標的化ディープシーケンシング生データを分析してその結果を図２ｃに示した。図２ｃに示されているように、標的配列３’側に欠失が主に現れる変異パターンであるのを確認することができる（図２ｃ）。

前述の遺伝解析の分析から得られた結果をより明確に立証するために、ＡａｃＣ２ｃ１とＡａｃ−ｓｇＲＮＡ発現ベクターを伝達したＨｅｌａ細胞に６−ＴＧ選択とクリスタルバイオレット染色を行って表現型基盤でＨＰＲＴ１遺伝子機能が損傷された細胞を確認した。より具体的に、Ｈｅｌａ細胞にＡａｃＣ２ｃ１とｓｇＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後、播種し、６−チオグアニン６−ＴＧ）選択を行って、２週後にＨＰＲＴ１遺伝子に変異が導入されて遺伝子機能がＫＯされた細胞由来コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）をクリスタルバイオレット染色を通じて確認した。前記結果を図２ｄに示した。図２ｄに示されているように、遺伝子編集効率が高かったＨＰＲＴ１−ＴＳ２とＨＰＲＴ１−ＴＳ５に該当するＡａｃ−ｓｇＲＮＡとＡａｃＣ２ｃ１プラスミドを伝達した細胞でＨＰＲＴ１遺伝子が完全にノックアウトされた場合が多く発生して、６−ＴＧ選択でも多くのコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成し、クリスタルバイオレット染色時に強く染色されるのを確認することができる。

ＨＰＲＴ１遺伝子でない他の標的遺伝子に対してもＡａｃＣ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼが遺伝子編集を起こすことができるか確認するためにＣＣＲ５遺伝子とＤＮＭＴ１遺伝子を追加的に選定して実験を行った。各標的遺伝子に対して８個のＡａｃＣ２ｃ１標的配列を選択し（表２）、各標的配列に対応するＡａｃ−ｓｇＲＮＡベクターをＡａｃＣ２ｃ１発現プラスミドと共にＨｅｌａ細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞に伝達し、７２時間後にゲノムＤＮＡを抽出して標的配列位置にｉｎｄｅｌが導入されたかを確認してｉｎｄｅｌ頻度を測定した。

前記得られたｉｎｄｅｌ頻度を図３ａ（Ｈｅｌａ細胞でのＣＣＲ５標的部位のｉｎｄｅｌ頻度）、３ｂ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＣＣＲ５標的部位のｉｎｄｅｌ頻度）、３ｃ（Ｈｅｌａ細胞でのＤＮＭＴ１標的部位のｉｎｄｅｌ頻度）、３ｄ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＤＮＭＴ１標的部位のｉｎｄｅｌ頻度）に示した。図３ａ〜３ｄに示したように、ＣＣＲ５−ＴＳ３標的部位に対して、Ｈｅｌａ細胞の場合６．９％、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の場合１．４％のｉｎｄｅｌが導入されたのを確認することができ、ＤＮＭＴ１−ＴＳ４標的部位に対して、Ｈｅｌａ細胞の場合２．１％、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の場合３．１％のｉｎｄｅｌが導入されたのを確認することができた。

また、ＣＣＲ５−ＴＳ３とＤＮＭＴ１−ＴＳ４に対する１^ｓｔＮＧＳ（標的化ディープシーケンシング）分析してその結果を図３ｅに示した。図３ｅに示されているように、ＣＣＲ５−ＴＳ３とＤＮＭＴ１−ＴＳ４両方ともｉｎｄｅｌが標的配列内に導入されたのを再び確認することができる。

遺伝子解析の結果、表現型解析の結果を基盤とした時、野生型ＡａｃＣ２ｃ１−ＣＲＩＳＰＲシステムがヒトゲノム編集（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ）に用いられ得るのを確認することができ、特定標的配列位置については高い効率で作動するのを確認することができる。

Claims

Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼ、これをコードする遺伝子、または前記遺伝子を含む発現ベクター、および
ガイドＲＮＡ、これをコードするＤＮＡ、またはこれを含む発現ベクター
を含む、ゲノム編集用組成物。
前記Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）に由来するＣ２ｃ１エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載のゲノム編集用組成物。
前記ガイドＲＮＡは、下記の配列一般式１で表されるか、配列一般式１から１〜１５個のヌクレオチドが欠失した変異体である、請求項２に記載のゲノム編集用組成物：
５’−ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＸ_１Ｘ_２Ｘ_３［（Ｎ）ｎ］−３’（配列一般式１）
上記式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、それぞれ独立してＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣの中から選択されるヌクレオチドであり、
（Ｎ）ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、およびＣの中から選択されるｎ個の互いに同一であるか異なるヌクレオチドであり、ｎは１７〜２３の整数である。
前記ヌクレオチド欠失は、配列一般式１内のＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡ配列から選択される１〜１５個のヌクレオチドが欠失することである、請求項３に記載のゲノム編集用組成物。
前記ガイドＲＮＡは、次の配列一般式２で表されるものである、請求項３に記載のゲノム編集用組成物：
５’−ＧＵＣＵＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＵＵＵＵＵＣＡＡＣＧＧＧＵＧＵＧＣＣＡＡＵＧＧＣＣＡＣＵＵＵＣＣＡＧＧＵＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＵＵＧＡＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＵＣＵＧＡＧＡＡＧＵＧＧＣＡＣ［（Ｎ）ｎ］−３’（配列一般式２）
上記式中、
（Ｎ）ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ、およびＣの中から選択されるｎ個の互いに同一であるか異なるヌクレオチドであり、ｎは１７〜２３の整数である。
前記ｎは２０である、請求項５に記載のゲノム編集用組成物。
前記Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼは、核移行シグナル配列を追加的に含むものである、請求項１に記載のゲノム編集用組成物。
真核細胞または真核生物に使用するためのものである、請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載のゲノム編集用組成物。
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載のゲノム編集用組成物を単離された細胞またはヒトを除いた生物に導入する段階を含む、ゲノム編集方法。
前記細胞は真核細胞であり、前記生物はヒトを除いた真核生物である、請求項９に記載のゲノム編集方法。
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載のゲノム編集用組成物が導入された、単離された遺伝子改変細胞。
請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載のゲノム編集用組成物が導入された、ヒトを除いた遺伝子改変生物。