JP2022538789A - 新規ｃｒｉｓｐｒ ｄｎａターゲティング酵素及びシステム - Google Patents

Abstract

本開示は、標的化した形で核酸を操作するための新規システム、方法、及び組成物について記載する。本開示は、ＤＮＡなどの核酸を標的化して修飾するための、天然に存在しないエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲシステム、成分、及び方法について記載する。各システムが、一体となって核酸を標的化する１つ以上のタンパク質成分と１つ以上の核酸成分とを含む。本開示は、新規シングルエフェクタークラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの天然に存在しないエンジニアリングされたシステム及び組成物を、ゲノムデータベースからの計算的同定、天然遺伝子座からエンジニアリングされたシステムへの開発、並びに実験的検証及び適用移行の方法と共に提供する。

Description

関連出願
本願は、２０１９年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８６１，５８２号、２０１９年７月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８７２，１５７号、２０１９年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８７３，６０６号、及び２０１９年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８７３，６０２号の優先権の利益を主張し、これらの各々の全内容は、本明細書によって参照により援用される。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、全体として参照により本明細書で援用される配列表を含む。２０２０年６月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２１８６－７０２１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔというファイル名で、サイズは９０１，６８９バイトである。

本開示は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）及びその成分に関連するベクターシステムを使用するものである、配列ターゲティング及び核酸編集を伴う遺伝子発現制御に用いられるシステム、方法、及び組成物に関する。

近年、ゲノムシーケンシング技術及び解析の進歩が適用されることにより、原核生物の生合成経路からヒト病理に及ぶまでの多種多様な自然領域における生物学的活性の遺伝的基礎に関して重要な洞察が得られている。遺伝子シーケンシング技術が生み出す大量の情報を完全に理解し、評価するためには、対応したゲノム及びエピゲノム操作技術の規模、有効性、及び容易さの向上が必要となる。このような新規ゲノム及びエピゲノムエンジニアリング技術は、バイオテクノロジー、農業、及びヒト治療薬を含めた数多くの領域における新規適用の開発を加速させることになる。

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、まとめてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとして知られ、現在のところ、細菌及び古細菌にファージ感染に対する免疫を付与するものと理解されている。原核生物適応免疫のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは極めて多様な一群のタンパク質エフェクター、非コードエレメント、並びに遺伝子座構成であり、その幾つかの例がエンジニアリングされ、適合されることにより、重要なバイオテクノロジーが生み出されている。

宿主防御に関与するこのシステムの成分には、ＤＮＡ又はＲＮＡを修飾する能力を有する１つ以上のエフェクタータンパク質と、これらのタンパク質活性をファージＤＮＡ又はＲＮＡ上の特異的配列に標的化することを担うＲＮＡガイドエレメントとが含まれる。ＲＮＡガイドはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）で構成され、１つ又は複数のエフェクタータンパク質による標的核酸の操作を実現するために追加的なトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とすることもある。ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡへのタンパク質結合を担うダイレクトリピートと、所望の核酸標的配列に相補的なスペーサー配列とからなる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列を修飾することにより、別のＤＮＡ又はＲＮＡ標的を標的化するよう再プログラム化し得る。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大きく２つのクラスに分けることができる：クラス１システムは、一緒になってｃｒＲＮＡの周りに複合体を形成する複数のエフェクタータンパク質で構成され、クラス２システムは、ｃｒＲＮＡと複合体化してＤＮＡ又はＲＮＡ基質を標的化する単一のエフェクタータンパク質からなる。クラス２システムのシングルサブユニットのエフェクター組成は、エンジニアリング及び適用移行に一層簡便な成分セットを提供し、従ってこれまでプログラム可能なエフェクターの重要な供給源となっている。従って、新規クラス２システムの発見、エンジニアリング、及び最適化が、ゲノムエンジニアリング及びその他に向けた広範且つ強力なプログラム可能技術につながり得る。

本願中のいかなる文献の引用又は識別情報も、かかる文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、古細菌及び細菌において外来性の遺伝エレメントから種を防御する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって例示されるクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの特徴付け及びエンジニアリングにより、ゲノム編集及びその他における多様な一連のバイオテクノロジー適用への道が開かれてきた。それにも関わらず、核酸及びポリヌクレオチド（即ち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は任意のハイブリッド、誘導体、又は修飾体）を修飾するための、その独自の特性によって新規適用を実現する現在のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを越える更なるプログラム可能なエフェクター及びシステムが依然として必要とされている。

本開示は、新規シングルエフェクタークラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの天然に存在しないエンジニアリングされたシステム及び組成物を、ゲノムデータベースからの計算的同定、天然遺伝子座からエンジニアリングされたシステムへの開発、並びに実験的検証及び適用移行の方法と共に提供する。この新規エフェクターは既存のクラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターのオルソログ及びホモログと配列が異なり、またユニークなドメイン構成も有する。これは、限定はされないが、１）新規ＤＮＡ／ＲＮＡ編集特性及び制御機構、２）送達戦略におけるより高い汎用性に比したより小さいサイズ、３）遺伝子型によって惹起される細胞死などの細胞過程、及び４）プログラム可能なＲＮＡ誘導型ＤＮＡ挿入、切出し、及び動員を含めた更なる特徴を提供する。

本明細書に記載される新規ＤＮＡターゲティングシステムがゲノム及びエピゲノム操作技法のツールボックスに加わることにより、特異的でプログラムされた摂動への幅広い適用が実現する。

本開示は、非天然環境、例えばそのシステムが当初発見された細菌以外の細菌で使用することのできる最小のシステムを作り出すために使用される新規に発見された酵素及び他の成分を含む新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する。

一態様において、本開示は、ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド、又はＲＮＡガイドをコードする核酸；及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸を含む、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３のエンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを提供し、ここで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、表２に提供されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１～１７）と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み；ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列に相補的な標的核酸配列を標的化することができる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、又は３つ）のＲｕｖＣドメインを有する。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９エフェクタータンパク質である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識能を有し、標的核酸は、核酸配列５’－ＴＴＧ－３’を含むＰＡＭを含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表３に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表３に提供されるヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列は約２２～約４０ヌクレオチド（例えば、２６～３５ヌクレオチド）を含む。

本明細書に提供されるシステムのいずれかの特定の実施形態において、標的核酸はＤＮＡである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。

本明細書に提供されるシステムのいずれかの特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる標的核酸のターゲティングにより、標的核酸に修飾（例えば、一本鎖又は二本鎖切断イベント）が生じる。一部の実施形態において、修飾により欠失イベントが生じる。一部の実施形態において、修飾により挿入イベントが生じる。一部の実施形態において、修飾により細胞毒性が生じる。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は非特異的な（即ち、「コラテラルな」）ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅ又はＤＮＡｓｅ）活性を有する。本明細書に提供されるシステムのいずれかの特定の実施形態において、本システムはドナー鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を更に含む。

一部の実施形態において、本明細書に提供されるシステムのいずれかの細胞（例えば、真核細胞（例えば哺乳類細胞）又は原核細胞（例えば細菌細胞））内にある。

本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、モジュレーターＲＮＡ、又はその両方を含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはｔｒａｃｒＲＮＡを含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはモジュレーターＲＮＡを含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。

本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、分割されたＲｕｖＣドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は標的核酸を切断する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、ベクター内にある。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む。一部の実施形態において、システムは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるシステムを細胞内の標的核酸に結合する方法を提供し、この方法は、（ａ）システムを提供すること；及び（ｂ）システムを細胞に送達することを含み、ここで、細胞は標的核酸を含み、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列は標的核酸に結合する。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む、標的核酸のターゲティング及び編集方法を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む、標的核酸の編集方法を提供する。

一態様において、本開示は、ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド、又はＲＮＡガイドをコードする核酸；及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸を含む、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２のエンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを提供し、ここで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、表８に提供されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み；ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列に相補的な標的核酸配列を標的化することができる。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、又は３つ）のＲｕｖＣドメインを含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表９に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表９に提供されるヌクレオチド配列を含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８エフェクタータンパク質である。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識能を有し、及び標的核酸は、核酸配列５’－ＣＧ－３’を含むＰＡＭを含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列は約１７ヌクレオチド～約４４ヌクレオチドを含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列は２６～３８ヌクレオチドを含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＤＮＡである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＰＡＭを含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、非特異的ヌクレアーゼ活性を有する。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる標的核酸のターゲティングにより、標的核酸に修飾が生じる。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾は、二本鎖切断イベント又は一本鎖切断イベントである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸の修飾により、挿入イベント又は欠失イベントが生じる。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、改変により細胞毒性又は細胞死が生じる。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはドナー鋳型核酸を更に含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、モジュレーターＲＮＡ、又はその両方を含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはｔｒａｃｒＲＮＡ及び／又はモジュレーターＲＮＡを更に含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムは細胞内にある。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムは、真核細胞又は原核細胞内にある。

本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、分割されたＲｕｖＣドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は標的核酸を切断する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、ベクター内にある。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む。一部の実施形態において、システムは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるシステムを細胞内の標的核酸に結合する方法を提供し、この方法は、（ａ）システムを提供すること；及び（ｂ）システムを細胞に送達することを含み、ここで、細胞は標的核酸を含み、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列は標的核酸に結合する。

一態様において、本開示は、標的核酸のターゲティング及び編集方法であって、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む、方法を提供する。一態様において、本開示は、標的核酸の編集方法であって、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む、方法を提供する。

一態様において、本開示は、標的核酸のある部位におけるペイロード核酸の挿入を標的化する方法であって、本明細書に記載されるシステムを標的核酸に接触させることを含む、方法を提供する。

一態様において、本開示は、ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド、又はＲＮＡガイドをコードする核酸；及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸を含む、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７のエンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを提供し、ここで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、表１２に提供されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み；ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列に相補的な標的核酸配列を標的化することができる。

ＣＬＵＳＴ．０８９５３７及びＣＬＵＳＴ．０８５５８９は同義的に使用できる。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、又は３つ）のＲｕｖＣドメインを含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表１３に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表１３に提供されるヌクレオチド配列を含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２エフェクタータンパク質である。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識能を有し、及び標的核酸は、核酸配列５’－ＴＴＣ－３’を含むＰＡＭを含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列は約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチドを含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列は２５～３７ヌクレオチドを含む。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＤＮＡである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸はＰＡＭを含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、非特異的ヌクレアーゼ活性を有する。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる標的核酸のターゲティングにより、標的核酸に修飾が生じる。例えば、本明細書に記載されるシステムのいずれかにおいて、標的核酸の修飾は、二本鎖切断イベントである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの他の実施形態において、標的核酸の修飾は、一本鎖切断イベント、挿入イベント、又は欠失イベントである。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、改変により細胞毒性又は細胞死が生じる。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはドナー鋳型核酸を更に含む。例えば、ドナー鋳型核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、モジュレーターＲＮＡ、又はその両方を含む。本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはｔｒａｃｒＲＮＡ及び／又はモジュレーターＲＮＡを更に含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムはｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。

本明細書に記載されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、システムは、細胞内、例えば、真核細胞又は原核細胞内にある。

本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、分割されたＲｕｖＣドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は標的核酸を切断する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸は、ベクター内にある。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む。一部の実施形態において、システムは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。

別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるシステムを細胞内の標的核酸に結合する方法を提供し、この方法は、（ａ）システムを提供すること；及び（ｂ）システムを細胞に送達することを含み、ここで、細胞は標的核酸を含み、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドに結合し、スペーサー配列は標的核酸に結合する。

一態様において、本開示は、標的核酸のターゲティング及び編集方法であって、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む、方法を提供する。一態様において、本開示は、標的核酸の編集方法であって、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む、方法を提供する。

本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、接触は、直接接触又は間接接触を含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、間接的に接触することは、ＲＮＡガイド及び／又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の産生を可能にする条件下で、本明細書に記載されるＲＮＡガイド又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする１つ以上の核酸を投与することを含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、接触は、インビボでの接触又はインビトロでの接触を含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、標的核酸をシステムと接触させることは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びガイドＲＮＡが標的核酸に到達することを可能にする条件下で、核酸を含む細胞をシステムと接触させることを含む。本明細書に提供されるシステムのいずれかの一部の実施形態において、インビボで細胞をシステムと接触させることは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びガイドＲＮＡが細胞に到達するか又は細胞内で産生されることを可能にする条件下で、細胞を含む対象にシステムを投与することを含む。

これらの図は、様々なタンパク質クラスターの遺伝子座解析の結果を表す一連の概略図並びに核酸及びアミノ酸配列である。

図１は、代表的なＣＬＵＳＴ．１２１１４３遺伝子座の保存されたエフェクター（ｅ＿Ａ）及びＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを示す概略配列表現である。 図１は、代表的なＣＬＵＳＴ．１２１１４３遺伝子座の保存されたエフェクター（ｅ＿Ａ）及びＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを示す概略配列表現である。 ＣＬＵＳＴ．１２１１４３のＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートエレメントの例の複数の配列アラインメントを示す一連の配列である。図２は、出現順に、それぞれ配列番号８２５、１０１、１０１、１０１、１０１、１０１、１０１、１０６、１０６、１０６、１０６、１０２、１０３、１０３、１０４、１０４、１０４、１０７、１０７、１０７、１０７、１０７、１０７、１０８、１０８、１０８、１０８、１０８、１０８、１０８、１１０、１０９及び１０５を開示する。 ＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクタータンパク質の系統樹の概略表現である。 ＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクタータンパク質の多重配列アラインメントの概略表現であり、ＲｕｖＣドメインの保存されている触媒残基の位置を図示し、ジンクフィンガードメインの保存された触媒残基を図示する。 ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示すグラフである。枯渇を定量化するために、エンリッチメントを、各ダイレクトリピート及びスペーサーのＲ_処理／Ｒ_入力として計算した。規格化された入力リード数は、次のように計算される。Ｒ_入力＝ＤＲとスペーサーを含むリード数／総リード数ここで、リード数は、形質転換前にＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクター及び関連ｃｒＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡライブラリの次世代シーケンシングから取得される。規格化された処理リード数は、次のように計算される：Ｒ_処理＝（１＋ＤＲとスペーサーを含むリード数）／総リード数ここで、リード数は、抗生物質スクリーニング後にＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクター及び関連ｃｒＲＮＡを発現する生存細胞から抽出されたプラスミドＤＮＡの次世代シーケンシングから取得される。強力に枯渇した標的のエンリッチメントは１／１０未満である。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＴＴＴ…ＡＧＡＧ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＴＣＴ…ＡＡＡＧ－［スペーサー］－３’）を有するＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９の枯渇の程度が図に示される。 陰性対照の枯渇活性の程度を示すグラフであり、エフェクタープラスミドから欠失したＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクターをコードする配列でスクリーンが繰り返されている。 図７Ａおよび７Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。図７Ａ及び図７Ｂは、どちらも配列番号８２６を開示する。 図７Ａおよび７Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。図７Ａ及び図７Ｂは、どちらも配列番号８２６を開示する。 ＣＬＵＳＴ．１２１１４３３３０００１４８３９の枯渇した標的に隣接する配列のｗｅｂｌｏｇｏである。図８は、配列番号８２６を開示する。 図９は、代表的なＣＬＵＳＴ．１９６６８２遺伝子座の保存されたエフェクター（ｅ＿Ａ）及びＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを示す概略配列表現である。 図９は、代表的なＣＬＵＳＴ．１９６６８２遺伝子座の保存されたエフェクター（ｅ＿Ａ）及びＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを示す概略配列表現である。 ＣＬＵＳＴ．１９６６８２のＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートエレメントの例の複数の配列アラインメントを示す一連の配列である。図１０は、出現順に、それぞれ配列番号８２７、７１４、７１４、７１４、７３３、７０１、７０４、７０５、７０５、７０３、７３４、７０６、７４３、７２０、７２０、７４０、７４０、７３１、７３１、７４２、７４２、８２８、７３２、７３０、７３０及び７４１を開示する。 ＣＬＵＳＴ．１９６６８２エフェクタータンパク質の系統樹の概略表現である。 ＣＬＵＳＴ．１９６６８２エフェクタータンパク質の多重配列アラインメントの概略表現であり、ＲｕｖＣドメインの保存されている触媒残基の位置を図示し、ジンクフィンガードメインの保存された触媒残基を図示する。 図１３Ａおよび１３Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。図１３Ａ及び図１３Ｂは、どちらも配列番号８２９を開示している。 図１３Ａおよび１３Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。図１３Ａ及び図１３Ｂは、どちらも配列番号８２９を開示している。 ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８の枯渇した標的に隣接する配列のｗｅｂｌｏｇｏである。図１４は、配列番号８２９を開示する。 図１５は、代表的なＣＬＵＳＴ．０８９５３７遺伝子座の保存されたエフェクター（ｅ＿Ａ）及びＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを示す概略配列表現である。 図１５は、代表的なＣＬＵＳＴ．０８９５３７遺伝子座の保存されたエフェクター（ｅ＿Ａ）及びＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを示す概略配列表現である。 ＣＬＵＳＴ．０８９５３７のＣＲＩＳＰＲダイレクトリピートエレメントの例の複数の配列アラインメントを示す一連の配列である。図１６は、出現順に、それぞれ配列番号８３０、４０２、４２９、４０３、４１９、４３１、４３６、４３２、４４１、４０４、４５５、４４６、４４７、４１１、４１４、４１５、４４０、４３７、４３８、４３０、４１２、４２５、４４８、４５２、４０６、４０７、４２２、４４２、４４３、４２４、４０９、４１３、４２０、４１８、４２６、４４４、４１６、４４５、４３４、４０１、４１０、４４９、４５４、４１７、４２７、４２３、４５０、４２８、４３９、４３５、４５３、４２１、４０８、４０５、４３３及び４５１を開示する。 図１７は、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７エフェクタータンパク質の系統樹の概略表現である。 図１７は、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７エフェクタータンパク質の系統樹の概略表現である。 ＣＬＵＳＴ．０８９５３７エフェクタータンパク質の多重配列アラインメントの概略表現であり、ＲｕｖＣドメインの保存されている触媒残基の位置を図示し、ジンクフィンガードメインの保存された触媒残基を図示する。 ｐＡＣＹＣ１８４及びダイレクトリピート転写方向を標的とするスペーサーについてのエンジニアリングされた組成物の枯渇活性の程度を示すグラフである。枯渇を定量化するために、エンリッチメントを、各ダイレクトリピート及びスペーサーのＲ_処理／Ｒ_入力として計算した。規格化された入力リード数は、次のように計算される。Ｒ_入力＝ＤＲとスペーサーを含むリード数／総リード数ここで、リード数は、形質転換前にＣＬＵＳＴ．０８９５３７エフェクター及び関連ｃｒＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡライブラリの次世代シーケンシングから取得される。規格化された処理リード数は、次のように計算される：Ｒ_処理＝（１＋ＤＲとスペーサーを含むリード数）／総リード数ここで、リード数は、抗生物質スクリーニング後にＣＬＵＳＴ．０８９５３７エフェクター及び関連ｃｒＲＮＡを発現する生存細胞から抽出されたプラスミドＤＮＡの次世代シーケンシングから取得される。強力に枯渇した標的のエンリッチメントは１／１０未満である。「順」方向のダイレクトリピート（５’－ＧＴＧＣ…ＡＣＡＧ－［スペーサー］－３’）及び「逆」方向のダイレクトリピート（５’－ＣＴＧＴ…ＧＣＡＣ－［スペーサー］－３’）を有するＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２の枯渇の程度が図に示される。 図２０Ａおよび２０Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。図２０Ａ及び２０Ｂは、どちらも配列番号８３１を開示する。 図２０Ａおよび２０Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｅ．Ｃｌｏｎｉ上の位置による、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２の枯渇及び非枯渇標的の密度を示すグラフ表現である。トップ鎖上及びボトム鎖上の標的を別々に、アノテートされた遺伝子の向きに関して示す。図２０Ａ及び２０Ｂは、どちらも配列番号８３１を開示する。 ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２の枯渇した標的に隣接する配列のｗｅｂｌｏｇｏである。図２１は、配列番号８３１を開示する。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ防御システムの幅広い天然の多様性には、プログラム可能なバイオテクノロジーに生かすことのできる様々な活性機構及び機能要素が含まれている。天然のシステムでは、これらの機構及びパラメータが外来ＤＮＡ及びウイルスに対する効率的な防御を実現する一方で、自己と非自己の判別を提供して自己標的化を回避している。エンジニアリングされたシステムでは、同じ機構及びパラメータがまた、分子技術の多様なツールボックスを提供し、ターゲティング空間の境界を画定する。例えば、システムＣａ９及びＣａ１３ａはカノニカルなＤＮＡ及びＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有し、そのターゲティング空間は、それぞれ、標的となるＤＮＡ上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）及び標的となるＲＮＡ上のプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）によって画定される。

本明細書に記載される方法を用いて、シングルサブユニットのクラス２エフェクターシステム内に、ＲＮＡによるプログラムが可能な核酸操作の能力を拡張することのできる更なる機構及びパラメータが発見された。

一態様において、本開示は、天然に存在するゲノム配列内の特定の他の特徴との強力な共出現パターンを呈する新規タンパク質ファミリーを探索及び同定するための計算的方法及びアルゴリズムの使用に関する。特定の実施形態において、これらの計算的方法は、ＣＲＩＳＰＲアレイにごく近接して共出現するタンパク質ファミリーを同定することに関する。しかしながら、本明細書に開示される方法は、非コード及びタンパク質コードの両方の（例えば、細菌遺伝子座の非コード範囲にあるファージ配列の断片；又はＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１タンパク質）、他の特徴にごく近接した範囲内に天然に出現するタンパク質の同定において有用である。本明細書に記載される方法及び計算は１つ以上の計算装置で実施されてもよいことが理解される。

一部の実施形態において、ゲノム又はメタゲノムデータベースから一組のゲノム配列が入手される。データベースは、ショートリード、又はコンティグレベルデータ、又はアセンブルされたスキャフォールド、又は生物の完全ゲノム配列を含む。同様に、データベースは、原核生物、若しくは真核生物からのゲノム配列データを含んでもよく、又はメタゲノム環境試料からのデータを含んでもよい。データベースリポジトリの例としては、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のＲｅｆＳｅｑ、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ、ＮＣＢＩの全ゲノムショットガン（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｏｔｇｕｎ：ＷＧＳ）、及びジョイントゲノム研究所（Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＪＧＩ）の統合微生物ゲノム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ：ＩＭＧ）が挙げられる。

一部の実施形態において、指定される最小長さのゲノム配列データの選択には、最小サイズ要件が課される。特定の例示的実施形態において、最小コンティグ長さは、１００ヌクレオチド、５００ｎｔ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、４０ｋｂ、又は５０ｋｂであってもよい。

一部の実施形態において、公知の又は予測されるタンパク質は、完全な又は選択された一組のゲノム配列データから抽出される。一部の実施形態において、公知の又は予測されるタンパク質は、ソースデータベースによって提供されるコード配列（ＣＤＳ）アノテーションを抽出することから取られる。一部の実施形態において、予測タンパク質は、計算的方法を適用してヌクレオチド配列からタンパク質を同定することにより決定される。一部の実施形態では、ＧｅｎｅＭａｒｋスイートを使用してゲノム配列からタンパク質が予測される。一部の実施形態では、Ｐｒｏｄｉｇａｌを使用してゲノム配列からタンパク質が予測される。一部の実施形態では、同じ一組の配列データに対して複数のタンパク質予測アルゴリズムが用いられ、得られる一組のタンパク質から重複が排除されてもよい。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイはゲノム配列データから同定される。一部の実施形態では、ＰＩＬＥＲ－ＣＲを使用してＣＲＩＳＰＲアレイが同定される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ認識ツール（ＣＲＩＳＰＲ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ：ＣＲＴ）を使用してＣＲＩＳＰＲアレイが同定される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、最小限の回数（例えば２、３、又は４回）繰り返されるヌクレオチドモチーフを同定する発見的手法によって同定され、ここで繰り返されるモチーフの連続する出現間の間隔は、指定される長さ（例えば、５０、１００、又は１５０ヌクレオチド）を超えない。一部の実施形態では、同じ一組の配列データに対して複数のＣＲＩＳＰＲアレイ同定ツールが用いられ、得られる一組のＣＲＩＳＰＲアレイから重複が排除されてもよい。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイにごく近接しているタンパク質が同定される。一部の実施形態において、近接性はヌクレオチド距離として定義され、２０ｋｂ、１５ｋｂ、又は５ｋｂ以内であってもよい。一部の実施形態において、近接性は、タンパク質とＣＲＩＳＰＲアレイとの間にあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の数として定義され、特定の例示的距離は、１０、５、４、３、２、１、又は０個のＯＲＦであり得る。ＣＲＩＳＰＲアレイとごく近接した範囲内にあると同定されたタンパク質は、次に相同タンパク質クラスターにまとめられる。一部の実施形態では、ｂｌａｓｔｃｌｕｓｔを使用してタンパク質クラスターが形成される。特定の他の実施形態では、ｍｍｓｅｑｓ２を使用してタンパク質クラスターが形成される。

タンパク質クラスターのメンバー間にＣＲＩＳＰＲアレイとの強力な共出現パターンを確立するため、予め編成された完全な一組の公知の及び予測されるタンパク質に対してタンパク質ファミリーの各メンバーのＢＬＡＳＴ検索が実施されてもよい。一部の実施形態では、ＵＢＬＡＳＴ又はｍｍｓｅｑｓ２を使用して類似のタンパク質が検索されてもよい。一部の実施形態では、ファミリー内のタンパク質の代表的なサブセットについてのみ検索が実施されてもよい。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲアレイとごく近接した範囲内にあるタンパク質のクラスターがメトリックによって順位付けされるか又はフィルタリングされることにより共出現が決定される。１つの例示的メトリックは、特定のＥ値閾値に至るまでのＢＬＡＳＴマッチの数に対するタンパク質クラスター内の要素の数の比である。一部の実施形態では、一定のＥ値閾値が使用されてもよい。他の実施形態では、Ｅ値閾値は、タンパク質クラスターの最も離れたメンバーによって決定されてもよい。一部の実施形態において、大域的な一組のタンパク質がクラスター化され、共出現メトリックは、含まれる１つ又は複数の大域的クラスターの要素の数に対するＣＲＩＳＰＲ関連クラスターの要素の数の比である。

一部の実施形態において、手動でのレビュープロセスを用いることにより、クラスター中のタンパク質の天然に存在する遺伝子座構造に基づいてエンジニアリングされるシステムの潜在的機能性及び最小限の一組の成分が評価される。一部の実施形態において、手動でのレビューにはタンパク質クラスターの図解表現が役立ち得るとともに、これは、ペアワイズでの配列類似性、系統樹、供給源生物／環境、予測される機能性ドメイン、及び遺伝子座構造の図解描写を含む情報を含み得る。一部の実施形態において、遺伝子座構造の図解描写は、高い代表性を有する近隣タンパク質ファミリーをフィルタリングし得る。一部の実施形態において、代表性は、含んでいる１つ又は複数の大域的クラスターの１つ又は複数のサイズに対する関連する近隣タンパク質の数の比によって計算されてもよい。特定の例示的実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、天然に存在する遺伝子座のＣＲＩＳＰＲアレイ構造の描写を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、推定ＣＲＩＳＰＲアレイの長さに対する保存されたダイレクトリピートの数、又は推定ＣＲＩＳＰＲアレイの長さに対するユニークなスペーサー配列の数の描写を含み得る。一部の実施形態において、タンパク質クラスターの図解表現は、ＣＲＩＳＰＲアレイとの推定エフェクターの様々な共出現メトリックの描写を含み、新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを予測し、及びその成分を同定し得る。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドとＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の間の複合体は、標的核酸に結合したか又は標的核酸を修飾した活性化ＣＲＩＳＰＲ複合体である。

定義
用語「切断イベント」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼによって作り出される標的核酸におけるＤＮＡ切断を指す。一部の実施形態において、切断イベントは二本鎖ＤＮＡ切断である。一部の実施形態において、切断イベントは一本鎖ＤＮＡ切断である。

用語「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」は、本明細書で使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターをコードする配列、ＲＮＡガイド、並びに他の配列及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターの発現に関与する、又はその活性を導く核酸及び／又はタンパク質を指す。

用語「ＣＲＩＳＰＲアレイ」は、本明細書で使用されるとき、最初のＣＲＩＳＰＲリピートの最初のヌクレオチドから始まって最後の（末端）ＣＲＩＳＰＲリピートの最後のヌクレオチドで終わる、ＣＲＩＳＰＲリピートとスペーサーとを含む核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメントを指す。典型的には、ＣＲＩＳＰＲアレイ中の各スペーサーは２つのリピート間に位置する。用語「ＣＲＩＳＰＲリピート」、又は「ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート」、又は「ダイレクトリピート」は、本明細書で使用されるとき、複数の短い定方向に反復する配列を指し、これはＣＲＩＳＰＲアレイ内で配列変異をごく僅かしか又は全く示さない。

用語「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲエフェクターによって核酸配列を特異的にターゲティングするために使用されるガイド配列を含むＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｃｒＲＮＡは、標的認識を媒介する配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡと二重鎖を形成する配列とを含む。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ＣＲＩＳＰＲエフェクターに結合する。用語「ドナー鋳型核酸」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素が標的核酸を改変した後に１つ以上の細胞タンパク質によって標的核酸の構造を改変するために使用され得る核酸分子を指す。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は二本鎖核酸である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は一本鎖核酸である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は線状である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は環状（例えば、プラスミド）である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は外因性核酸分子である。一部の実施形態において、ドナー鋳型核酸は内因性核酸分子（例えば、染色体）である。

用語「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲエフェクター」、「エフェクター」、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」、又は「ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、本明細書で使用されるとき、酵素活性を実行するタンパク質又はＲＮＡガイドによって指定される核酸上の標的部位に結合するタンパク質を指す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、エンドヌクレアーゼ活性、ニッカーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、トランスポサーゼ活性、及び／又は切出し活性を有する。

用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、ヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲエフェクターを特定の標的核酸を標的化及び切断するように導くことができるＲＮＡ分子を指す。

用語「ＲＮＡガイド」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に記載されるタンパク質の標的核酸へのターゲティングを促進する任意のＲＮＡ分子を指す。例示的な「ＲＮＡガイド」としては、限定はされないが、ｃｒＲＮＡ、並びにｔｒａｃｒＲＮＡ及び／又はモジュレーターＲＮＡのいずれかと融合したｃｒＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ｃｒＲＮＡ及びモジュレーターＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びモジュレーターＲＮＡを含む。

用語「モジュレーターＲＮＡ」は、本明細書に記載されるとき、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターを含む核タンパク質複合体の活性を調節する（例えば、増加又は減少させる）任意のＲＮＡ分子を指す。一部の実施形態において、モジュレーターＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターを含む核タンパク質複合体のヌクレアーゼ活性を調節する。

本明細書で使用されるとき、「標的核酸」という用語は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムによって修飾される特定の核酸配列を指す。一部の実施形態において、標的核酸は遺伝子を含む。一部の実施形態において、標的核酸は非コード領域（例えば、プロモーター）を含む。一部の実施形態において、標的核酸は一本鎖である。一部の実施形態において、標的核酸は二本鎖である。

用語「トランス活性化ｃｒＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲエフェクターが特定の標的核酸に結合するために必要な構造を形成する配列を含むＲＮＡを指す。

「転写活性部位」は、本明細書で使用されるとき、転写が開始され活発に起こるプロモーター領域を含む核酸配列中の部位を指す。

ＣＲＩＳＰＲ酵素に関して本明細書で使用される「コラテラルＲＮＡｓｅ活性」という用語は、酵素が特異的に標的化された核酸を修飾した後のＣＲＩＳＰＲ酵素の非特異的ＲＮＡｓｅ活性を指す。

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書に記載されるものと同様の又は等価な方法及び材料を使用し得るが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は全て、全体として参照により援用される。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から、及び特許請求の範囲から明らかであろう。

プール型スクリーニング
エンジニアリングされた新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性を効率的に検証し、同時に種々の活性機構及び機能パラメータを偏りのない方法及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において新規プール型スクリーニング手法で評価する。第一に、新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの保存タンパク質及び非コードエレメントの計算的同定から、ＤＮＡ合成及び分子クローニングを用いて個別の成分を単一の人工発現ベクター（一実施形態ではｐＥＴ－２８ａ＋骨格をベースとする）にアセンブルする。第２の実施形態では、エフェクター及び非コードエレメントを単一のｍＲＮＡ転写物に転写し、異なるリボソーム結合部位を用いて個々のエフェクターを翻訳する。

第二に、天然のｃｒＲＮＡ及びターゲティングスペーサーを、第２のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を標的化する非天然スペーサーを含むプロセシングされていないｃｒＲＮＡのライブラリに置き換える。このｃｒＲＮＡライブラリをタンパク質エフェクター及び非コードエレメントを含むベクター骨格（例えばｐＥＴ－２８ａ＋）にクローニングし、その後、続いてこのライブラリをｐＡＣＹＣ１８４プラスミド標的と共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。結果的に、得られる各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、ただ１つのターゲティングスペーサーを含む。代替的実施形態では、非天然スペーサーを含むプロセシングされていないｃｒＲＮＡのライブラリが、Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２：２００６．０００８；及びＧｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５（１９）：５６７３－８４（これらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される）に記載されるものなどの資料から引用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子を更に標的化する。この実施形態において、必須遺伝子機能を破壊する新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの正の標的化された活性は、細胞死又は成長停止を生じさせる。一部の実施形態において、必須遺伝子ターゲティングスペーサーをｐＡＣＹＣ１８４標的と組み合わせて、アッセイに別の次元を加えることができる。

第三に、抗生物質選択下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を成長させる。一実施形態において、三重抗生物質選択：エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターシステムを含むｐＥＴ－２８ａ＋ベクターの形質転換の成功を確認するためのカナマイシン、並びにｐＡＣＹＣ１８４標的ベクターの同時形質転換の成功を確認するためのクロラムフェニコール及びテトラサイクリンが用いられる。ｐＡＣＹＣ１８４は通常、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンに対する耐性を付与するため、抗生物質選択下では、このプラスミドを標的化する新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの正の活性により、エフェクター、非コードエレメント、及びｃｒＲＮＡライブラリの特異的活性エレメントを活性に発現する細胞が排除されることになる。早い時点と比較した後の時点における生存細胞集団を調べると、典型的には不活性ｃｒＲＮＡと比較してシグナルの枯渇が生じる。一部の実施形態において、二重抗生物質選択が用いられる。例えば、クロラムフェニコール又はテトラサイクリンのいずれかを抜き取って選択圧を除去すると、ターゲティング基質、配列特異性、及び効力に関する新規情報を得ることができる。一部の実施形態では、カナマイシンのみを使用して、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターシステムを含むｐＥＴ－２８ａ＋ベクターの形質転換の成功が確認される。この実施形態は、成長の変化を観察するためにカナマイシン以外の更なる選択が必要ないため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子を標的化するスペーサーを含むライブラリに好適である。この実施形態では、クロラムフェニコール及びテトラサイクリン依存性が取り除かれ、ライブラリ中のそれらの標的（存在する場合）が、ターゲティング基質、配列特異性、及び効力に関するネガティブ又はポジティブの更なる情報源を提供する。

ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性に影響を及ぼし得る多様な一組の特徴及び配列を含むため、プール型スクリーンからの活性ｃｒＲＮＡをｐＡＣＹＣ１８４にマッピングすることにより、種々の活性機構及び機能パラメータを示唆するものであり得る活性パターンが仮説にとらわれず幅広く提供される。このようにして、異種原核生物種における新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの再構成に必要な特徴をより包括的に試験し、研究することができる。

本明細書に記載されるインビボプール型スクリーンの重要な利点としては、以下が挙げられる：
（１）汎用性－プラスミド設計により、複数のエフェクター及び／又は非コードエレメントを発現させることが可能になる；ライブラリクローニング戦略により、計算的に予測されたｃｒＲＮＡの両方の転写方向の発現が実現する；
（２）活性機構及び機能パラメータの包括的試験により、ＤＮＡ又はＲＮＡ切断を含めた多様な干渉機構を評価し；転写、プラスミドＤＮＡ複製などの特徴の共出現；及びｃｒＲＮＡライブラリについてのフランキング配列を調べて、４Ｎの複雑さ等価のＰＡＭを確実に決定することができる；
（３）感度－ｐＡＣＹＣ１８４は低コピープラスミドであり、僅かな干渉率であっても、プラスミドによってコードされる抗生物質耐性を除去することができるため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ活性について高感度を実現する；及び
（４）効率－ＲＮＡシーケンシングについてより高い速度及びスループットを実現する最適化された分子生物学ステップは、タンパク質発現試料をスクリーンにおける生存細胞から直接採取することができる。

このインビボプール型スクリーンを用いてその作動可能なエレメント、機構及びパラメータ、並びにその天然細胞環境の外部でエンジニアリングされたシステムにおいて活性であり再プログラム化されるその能力を評価することにより、本明細書に記載される新規ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓファミリーを評価した。

ＲｕｖＣドメインを有するクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクター
一態様において、本開示は、本明細書においてＣＬＵＳＴ．１２１１４３と称されるクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供する。このクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣドメインを有する単離されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を含む。

一態様において、本開示は、本明細書においてＣＬＵＳＴ．１９６６８２と称されるクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供する。このクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣドメインを有する単離されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を含む。

一態様において、本開示は、本明細書においてＣＬＵＳＴ．０８９５３７と称されるクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを提供する。このクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣドメインを有する単離されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を含む。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドは、他の成分を含み得る二元複合体を形成する。二元複合体は、ＲＮＡガイド中のスペーサー配列に相補的な核酸基質（即ち、配列特異的基質又は標的核酸）への結合時に活性化される。一部の実施形態において、配列特異的基質は二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態において、配列特異的基質は一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態において、配列特異的基質は一本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態において、配列特異的基質は二本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態において、配列特異性は、ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）中のスペーサー配列と標的基質の完全な一致を必要とする。他の実施形態において、配列特異性は、ＲＮＡガイド（例えば、ｃｒＲＮＡ）中のスペーサー配列と標的基質の部分的な（連続的又は非連続的な）一致を必要とする。

一部の実施形態において、二元複合体は標的基質への結合時に活性化した状態になる。一部の実施形態において、活性化した複合体は、「複数回の代謝回転」活性を呈し、従って標的基質への作用時（例えば、それの切断時）、活性化した複合体は活性化した状態のままである。一部の実施形態において、活性化した二元複合体は「単回の代謝回転」活性を呈し、従って標的基質への作用時、二元複合体は不活性状態に戻る。一部の実施形態において、活性化した二元複合体は非特異的な（即ち、「コラテラル」）切断活性を呈し、従って複合体は非標的核酸を切断する。一部の実施形態において、非標的核酸は、ＤＮＡ（例えば、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ）である。一部の実施形態において、非標的核酸は、ＲＮＡ（例えば、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ）である。

ＣＲＩＳＰＲ酵素修飾
非活性化／不活性化ＣＲＩＳＰＲ酵素
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合、減少したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較したとき少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％のヌクレアーゼ不活性化となるようにＣＲＩＳＰＲ酵素を修飾することができる。ヌクレアーゼ活性は、当技術分野で周知の幾つかの方法、例えば、タンパク質のヌクレアーゼドメインへの突然変異の導入によって減少させることができる。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ活性の触媒残基が同定され、それらのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基（例えば、グリシン又はアラニン）に置換することによりヌクレアーゼ活性を減少させてもよい。

不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の機能的ドメインを含むか、又はそれと関連づけられ得る（例えば、融合タンパク質、リンカーペプチド、「ＧＳ」リンカーなどを介して）。こうした機能性ドメインは様々な活性、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、及びスイッチ活性（例えば、光誘導性）を有することができる。一部の実施形態において、機能性ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、ＶＰ６４、ＶＰ１６、Ｆｏｋ１、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１、及びビオチン－ＡＰＥＸである。

不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素上に１つ以上の機能性ドメインを位置させることは、その機能性ドメインが帰属する機能的効果による影響を標的に及ぼすのに正しい空間上の向きとなることを可能にする。例えば、機能性ドメインが転写活性化因子（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、又はｐ６５）である場合、その転写活性化因子は、それが標的の転写に影響を及ぼすことが可能になる空間上の向きに置かれる。同様に、転写リプレッサーが標的の転写に影響を及ぼすように位置し、及びヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）が標的を切断又は部分的に切断するように位置する。一部の実施形態において、機能性ドメインはＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端に位置する。一部の実施形態において、機能性ドメインはＣＲＩＳＰＲ酵素のＣ末端に位置する。一部の実施形態において、不活性化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｎ末端に第１の機能性ドメイン及びＣ末端に第２の機能性ドメインを含むように修飾される。

スプリット酵素
本開示はまた、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素のスプリットバージョンも提供する。スプリットバージョンのＣＲＩＳＰＲ酵素は送達に有利であり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は酵素の２つの部分に分割され、それらが一緒になって実質的に機能性のＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。

分割は、１つ又は複数の触媒ドメインが影響を受けないような方法で行われ得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素はヌクレアーゼとして機能してもよく、又は本質的に（例えば、その触媒ドメインにある１つ又は複数の突然変異に起因して）触媒活性がごく僅かしかない又は全くないＲＮＡ結合タンパク質である不活性化された酵素であってもよい。

一部の実施形態では、ヌクレアーゼローブ及びα－ヘリックスローブが別個のポリペプチドとして発現する。これらのローブはそれ自体には相互作用を及ぼさないが、ガイドＲＮＡがそれらを複合体へと動員し、その複合体が完全長ＣＲＩＳＰＲ酵素の活性を再現し、部位特異的ＤＮＡ切断を触媒する。修飾されたガイドＲＮＡを使用すると、二量化が妨げられることによりスプリット酵素活性が無効になり、誘導性の二量化システムの開発が可能となる。スプリット酵素については、例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１２．１０（２０１５）：２９８４－２９８９（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

一部の実施形態において、スプリット酵素は、例えばラパマイシン感受性二量化ドメインを利用することにより、二量化パートナーに融合されてもよい。これにより、ＣＲＩＳＰＲ酵素活性を時間的に制御するための化学誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素の作成が可能になる。このようにして２つの断片に分割されていることによりＣＲＩＳＰＲ酵素を化学誘導性にすることができ、ＣＲＩＳＰＲ酵素の制御された再アセンブルにはラパマイシン感受性二量化ドメインを使用することができる。

分割点は、典型的にはインシリコで設計され、コンストラクトにクローニングされる。この過程でスプリット酵素に突然変異が導入されてもよく、非機能性ドメインが除去されてもよい。一部の実施形態において、スプリットＣＲＩＳＰＲ酵素の２つの部分又は断片（即ち、Ｎ末端及びＣ末端断片）は、例えば野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素の配列の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％を含む完全なＣＲＩＳＰＲ酵素を形成することができる。

自己活性化型又は不活性化型酵素
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、自己活性化型又は自己不活性化型であるように設計されてもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は自己不活性化型である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするコンストラクトに標的配列を導入することができる。従ってＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を切断するとともに、それによって酵素をコードするコンストラクトがその発現を自己不活性化し得る。自己不活性化ＣＲＩＳＰＲシステムの構築方法については、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｅ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｖ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（２０１６）：Ｓ５０（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

一部の他の実施形態では、弱いプロモーター（例えば、７ＳＫプロモーター）の制御下で発現する更なるガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を標的化して、その発現を（例えば、核酸の転写及び／又は翻訳を妨げることにより）妨げ及び／又は阻止することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素と、ガイドＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を標的化するガイドＲＮＡとを発現するベクターを細胞にトランスフェクトすると、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸の効率的な破壊につながり、ＣＲＩＳＰＲ酵素レベルを低下させることができ、従ってゲノム編集活性を制限することができる。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素のゲノム編集活性は、哺乳類細胞における内因性ＲＮＡシグネチャ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を通じて調節することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡの５’－ＵＴＲにｍｉＲＮＡ相補配列を用いることにより、ＣＲＩＳＰＲ酵素スイッチを作ることができる。このスイッチは、標的細胞中のｍｉＲＮＡに選択的且つ効率的に応答する。従って、このスイッチは、異種細胞集団内で内因性ｍｉＲＮＡ活性を感知することによりゲノム編集を差次的に制御し得る。従って、このスイッチシステムは、細胞内ｍｉＲＮＡ情報に基づく細胞型選択的なゲノム編集及び細胞エンジニアリングのフレームワークを提供し得る（Ｈｉｒｏｓａｗａ，Ｍｏｅ ｅｔ ａｌ．“Ｃｅｌｌ－ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｗｉｔｃｈ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１７ Ｊｕｌ ２７；４５（１３）：ｅ１１８）。

誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、誘導性、例えば、光誘導性又は化学誘導性であってもよい。この機構により、ＣＲＩＳＰＲ酵素中の機能性ドメインを活性化させることが可能になる。光誘導能は、当該技術分野において公知の様々な方法により、例えば、スプリットＣＲＩＳＰＲ酵素においてＣＲＹ２ＰＨＲ／ＣＩＢＮ対が用いられる融合複合体を設計することにより実現し得る（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．“Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，５００．７４６３（２０１３）：４７２を参照のこと）。化学誘導能は、例えば、スプリットＣＲＩＳＰＲ酵素においてＦＫＢＰ／ＦＲＢ（ＦＫ５０６結合タンパク質／ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン）対が用いられる融合複合体を設計することにより実現し得る。ラパマイシンは融合複合体の形成に必要であり、従ってＣＲＩＳＰＲ酵素を活性化する（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｖｏｌｚ，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，“Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３．２（２０１５）：１３９－１４２を参照のこと）。

更に、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現は、誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御下での転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現システム）、ホルモン誘導性遺伝子発現システム（例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現システム）、及びアラビノース誘導性遺伝子発現システムによって調節することができる。ＲＮＡとして送達される場合、ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質の発現は、小分子様テトラサイクリンを感知することのできるリボスイッチによって調節されてもよい（例えば、Ｇｏｌｄｆｌｅｓｓ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．“Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４０．９（２０１２）：ｅ６４－ｅ６４を参照のこと）。

誘導性ＣＲＩＳＰＲ酵素及び誘導性ＣＲＩＳＰＲシステムの様々な実施形態が、例えば、米国特許第８８７１４４５号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２０８２４３号明細書、及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。

機能性突然変異
本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ酵素に様々な突然変異又は修飾を導入して特異性及び／又はロバスト性を改善することができる。一部の実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するアミノ酸残基が同定される。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、例えば、ＰＡＭを認識するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、異なるＰＡＭを認識するように更に修飾されてもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、例えば、５’－ＮＧＧ－３’、５’－ＹＧ－３’、５’－ＴＴＴＮ－３’、又は５’－ＹＴＮ－３’ＰＡＭを認識することができ、ここで、「Ｙ」はピリミジンであり、「Ｎ」は任意の核酸塩基である。

一部の実施形態において、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列に取り付けられている。一部の実施形態において、少なくとも１つの核外輸送シグナル（ＮＥＳ）が、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列に取り付けられている。一部の実施形態において、Ｃ末端及び／又はＮ末端ＮＬＳ又はＮＥＳは、真核細胞、例えばヒト細胞における最適な発現及び核ターゲティングのために取り付けられる。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、１つ以上の機能活性が改変される。例えば、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、そのヘリカーゼ活性が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、そのヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性又はエキソヌクレアーゼ活性）が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、ガイドＲＮＡと機能的に関連するその能力が改変される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、標的核酸と機能的に関連するその能力が改変される。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は標的核酸分子の切断能を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は標的核酸分子の両方の鎖を切断する。しかしながら、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のアミノ酸残基を突然変異させることにより、その切断活性が改変される。例えば、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、この酵素が標的核酸の切断能を有しないものとなる１つ以上の突然変異を含んでもよい。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、この酵素が標的核酸の一本鎖の切断能（即ち、ニッカーゼ活性）を有するものとなる１つ以上の突然変異を含んでもよい。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な標的核酸の鎖を切断する能力を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的核酸の鎖を切断する能力を有する。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の所望の機能活性（例えば、ヌクレアーゼ活性及び機能的にガイドＲＮＡと相互作用する能力）を保持しつつ酵素のサイズを縮小させるため、１つ以上のアミノ酸残基に欠失を含むようにエンジニアリングされてもよい。このトランケート型ＣＲＩＳＰＲ酵素は有利には、負荷に制限のある送達システムとの組み合わせで用いられてもよい。

一態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の核酸配列を提供する。別の態様において、本開示はまた、本明細書に記載されるアミノ酸配列と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のアミノ酸配列も提供する。

一部の実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載される配列と同じである一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド、例えば、連続又は非連続ヌクレオチド）を少なくとも有する。一部の実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載される配列と異なる一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド、例えば、連続又は非連続ヌクレオチド）を少なくとも有する。

一部の実施形態において、アミノ酸配列は、本明細書に記載される配列と同じである一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基、例えば、連続又は非連続アミノ酸残基）を少なくとも有する。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、本明細書に記載される配列と異なる一部分（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基、例えば、連続又は非連続アミノ酸残基）を少なくとも有する。

２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、それらの配列が最適な比較を目的としてアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントとなるように第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入されてもよく、及び比較を目的として非相同配列が無視されてもよい）。一般に、比較を目的としてアラインメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％でなければならず、及び一部の実施形態では、参照配列の長さの少なくとも９０％、９５％、又は１００％である。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列におけるある位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されているとき、次にはそれらの分子は当該の位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。本開示の目的上、配列の比較及び２つの配列間におけるパーセント同一性の決定は、ギャップペナルティーを１２、ギャップ伸長ペナルティーを４、及ｓびフレームシフトギャップペナルティーを５としたＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列を用いて達成することができる。

ガイドＲＮＡ修飾
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドは、ウラシル（Ｕ）を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドは、チミン（Ｔ）を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドのダイレクトリピート配列は、ウラシル（Ｕ）を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡガイドのダイレクトリピート配列は、チミン（Ｔ）を含む。一部の実施形態において、表３、９、又は１３のいずれかによるダイレクトリピート配列は、表３、９、又は１３のいずれかの対応する配列においてチミンとして示される１つ以上の場所に、ウラシルを含む配列を含む。

一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイにおいて繰り返される配列の１つのコピーのみを含む。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られる１つ以上のスペーサー配列に隣接する（例えば、フランキング）完全長配列である。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られる１つ以上のスペーサー配列に隣接する（例えば、フランキング）完全長配列の一部（例えば、プロセシングされた部分）である。

スペーサー長さ
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。ガイドＲＮＡのスペーサー長さは約１５～５０ヌクレオチドの範囲であってもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、少なくとも２２ヌクレオチド、少なくとも２３ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも２６ヌクレオチド、又は少なくとも２７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサー長さは、１５～１７ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１６～２２ヌクレオチド、１７～２０ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチド）、２３～２５ヌクレオチド（例えば、２３、２４、又は２５ヌクレオチド）、２４～２７ヌクレオチド、２７～３０ヌクレオチド、３０～３３ヌクレオチド（例えば、３０、３１、３２、又は３３ヌクレオチド）、３３～３６ヌクレオチド（例えば、３３、３４、３５、又は３６ヌクレオチド）、３６～４０ヌクレオチド（例えば、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド）、４０～４５ヌクレオチド（例えば、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５ヌクレオチド）、３０又は３５～４０ヌクレオチド、４１～４５ヌクレオチド、４５～５０ヌクレオチド、又はそれ以上である。一部の実施形態において、スペーサー長さは、２２～４０ヌクレオチド、又は２６～３５ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは少なくとも１６ヌクレオチドであり、又は１６～２０ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド）である。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは１９ヌクレオチドである。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。ガイドＲＮＡのスペーサー長さは約１５～５０ヌクレオチドの範囲であってもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサー長さは、１５～１７ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１６～２２ヌクレオチド、１７～２０ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチド）、２３～２５ヌクレオチド（例えば、２３、２４、又は２５ヌクレオチド）、２４～２７ヌクレオチド、２７～３０ヌクレオチド、３０～４５ヌクレオチド（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、又は４５ヌクレオチド）、３０又は３５～４０ヌクレオチド、４１～４５ヌクレオチド、４５～５０ヌクレオチド、又はそれ以上である。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは少なくとも１６ヌクレオチドであり、又は１６～２０ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド）である。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長さは１９ヌクレオチドである。

一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイにおいて繰り返される配列の１つのコピーのみを含む。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られる１つ以上のスペーサー配列に隣接する（例えば、フランキング）完全長配列である。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られる１つ以上のスペーサー配列に隣接する（例えば、フランキング）完全長配列の一部（例えば、プロセシングされた部分）である。

ガイドＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的への結合の成功は許容するが、同時にヌクレアーゼ活性の成功は許容しない（即ち、ヌクレアーゼ活性のない／インデルを生じさせない）ような方法で修飾されてもよい。こうした修飾ガイド配列は、「デッドガイド」又は「デッドガイド配列」と称される。こうしたデッドガイド又はデッドガイド配列はヌクレアーゼ活性の点で触媒的に不活性又はコンホメーション的に不活性であってもよい。デッドガイド配列は、典型的には、活性なＲＮＡ切断を生じるそれぞれのガイド配列よりも短い。一部の実施形態において、デッドガイドは、ヌクレアーゼ活性を有するそれぞれのガイドＲＮＡと比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％短い。ガイドＲＮＡのデッドガイド配列は、１３～１５ヌクレオチド長（例えば、１３、１４、又は１５ヌクレオチド長）、１５～１９ヌクレオチド長、又は１７～１８ヌクレオチド長（例えば、１７ヌクレオチド長）であってもよい。

従って、一態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりの機能性ＣＲＩＳＰＲ酵素と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲシステムを提供し、ここでｇＲＮＡはデッドガイド配列を含み、従ってｇＲＮＡは、検出可能な切断活性なしにＣＲＩＳＰＲシステムが細胞の目的のゲノム遺伝子座に向けられるような標的配列へのハイブリダイズ能を有する。

デッドガイドの詳細な説明は、例えば、国際公開第２０１６０９４８７２号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載される。

誘導性ガイド
ガイドＲＮＡは、誘導性システムの成分として作成することができる。このシステムの誘導可能な性質により、遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となる。一部の実施形態において、誘導性システムの刺激としては、例えば、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー、及び／又は熱エネルギーが挙げられる。

一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの転写は、誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御下での転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現システム）、ホルモン誘導性遺伝子発現システム（例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現システム）、及びアラビノース誘導性遺伝子発現システムによって調節することができる。誘導性システムの他の例としては、例えば、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、光誘導性システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）、又は光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。これらの誘導性システムは、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第８７９５９６５号明細書（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

化学修飾
ガイドＲＮＡのリン酸骨格、糖、及び／又は塩基に化学修飾を適用することができる。ホスホロチオエートなどの骨格修飾はリン酸骨格上の電荷を修飾し、オリゴヌクレオチドの送達及びヌクレアーゼ耐性に役立つ（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，“Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ，ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２４（２０１４），ｐｐ．３７４－３８７を参照のこと）；２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｆ、及びロックド核酸（ＬＮＡ）などの糖修飾は、塩基対合及びヌクレアーゼ耐性の両方を亢進させる（例えば、Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．“Ｆｕｌｌｙ ２‘－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４８．４（２００５）：９０１－９０４を参照のこと）。化学修飾塩基、とりわけ２－チオウリジン又はＮ６－メチルアデノシンなどは、より強い塩基対合又はより弱い塩基対合のいずれも可能にすることができる（例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ－ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２ Ａｕｇ ２０；３：１５４を参照のこと）。加えて、ＲＮＡは、蛍光色素、ポリエチレングリコール、又はタンパク質を含めた種々の機能性部分との５’末端及び３’末端の両方のコンジュゲーションに適している。

化学的に合成されるガイドＲＮＡ分子には、幅広い種類の修飾を適用することができる。例えば、オリゴヌクレオチドを２’－ＯＭｅで修飾してヌクレアーゼ耐性を改善すると、ワトソン・クリック塩基対合の結合エネルギーを変化させることができる。更には、２’－ＯＭｅ修飾は、オリゴヌクレオチドがトランスフェクション試薬、タンパク質又は細胞中の任意の他の分子とどのように相互作用するかに影響を及ぼし得る。これらの修飾の効果は経験的試験によって決定することができる。

一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは１つ以上のホスホロチオエート修飾を含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、塩基対合を亢進させること及び／又はヌクレアーゼ耐性を増加させることを目的として１つ以上のロックド核酸を含む。

これらの化学修飾の概要については、例えば、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｓｅｐ １０；２３３：７４－８３；国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット；及び米国特許第８７９５９６５ Ｂ２号明細書（この各々が全体として参照により援用される）を参照することができる。

配列修飾
本明細書に記載されるガイドＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの配列及び長さは最適化することができる。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの最適化された長さは、プロセシングされた形態のｔｒａｃｒＲＮＡ及び／若しくはｃｒＲＮＡを同定することによるか、又はｃｒＲＮＡのＲＮＡガイドについての経験的な長さ研究によって決定されてもよい。

ガイドＲＮＡはまた、１つ以上のアプタマー配列も含むことができる。アプタマーは、特異的な標的分子に結合することのできるオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは、遺伝子エフェクター、遺伝子アクチベーター、又は遺伝子リプレッサーに特異的であってもよい。一部の実施形態において、アプタマーはタンパク質に特異的であり、次にはそのタンパク質が特異的遺伝子エフェクター、遺伝子アクチベーター、又は遺伝子リプレッサーに特異的であって、それを動員し／それに結合するものであってもよい。エフェクター、アクチベーター、又はリプレッサーは融合タンパク質の形態で存在することができる。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、同じアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列を有する。一部の実施形態において、２つ以上のアプタマー配列は異なるアダプタータンパク質に特異的である。アダプタータンパク質としては、例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１を挙げることができる。従って、一部の実施形態において、アプタマーは、本明細書に記載されるとおりのアダプタータンパク質のうちのいずれか１つに特異的に結合する結合タンパク質から選択される。一部の実施形態において、アプタマー配列はＭＳ２ループである。アプタマーの詳細な説明については、例えば、Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｃａｓ９ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０１６ Ｎｏｖ １６；４４（２０）：９５５５－９５６４；及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（これらは全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。

ガイド：標的配列一致要件
古典的ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又は１００％であってもよい。一部の実施形態において、相補性の程度は１００％である。ガイドＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長、又はそれ以上であってもよい。

オフターゲット相互作用を減少させるため、例えば、相補性が低い標的配列と相互作用するガイドを減少させるため、ＣＲＩＳＰＲシステムに突然変異を導入して、ＣＲＩＳＰＲシステムが標的配列と、８０％、８５％、９０％、又は９５％より高い相補性を有するオフターゲット配列との間を区別できるようにしてもよい。一部の実施形態において、相補性の程度は、８０％～９５％、例えば、約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％である（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と、１、２、又は３個のミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットとの間を区別する）。従って、一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、又は９９．９％より高い。一部の実施形態において、相補性の程度は１００％である。

当該分野では、機能性となるのに十分な相補性があるならば、完全な相補性は要件とならないことが公知である。スペーサー／標的に沿ったミスマッチの位置を含め、スペーサー配列と標的配列との間へのミスマッチ、例えば１個以上のミスマッチ、例えば１又は２個のミスマッチの導入により、切断効率の調節を生かすことができる。典型的には、ミスマッチ、例えば二重ミスマッチが中心寄りに位置するほど（即ち、３’末端又は５’末端にあるのでない）；切断効率がより大きい影響を受ける。従って、スペーサー配列に沿ったミスマッチ位置の選択により、切断効率を調節することができる。例えば、標的の１００％未満の切断が（例えば、細胞集団中で）所望される場合、スペーサー配列にスペーサーと標的配列との間の１又は２個のミスマッチを導入してもよい。

ＣＲＩＳＰＲシステムの使用方法
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムには、非常に多数の細胞型における標的ポリヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、転位、不活性化、又は活性化）を含め、多種多様な有用性がある。このＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ検出（例えば、特異的高感度酵素レポーターアンロッキング（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｕｎｌｏｃｋｉｎｇ：ＳＨＥＲＬＯＣＫ））、核酸の追跡及び標識、エンリッチメントアッセイ（バックグラウンドからの所望の配列の抽出）、循環腫瘍ＤＮＡの検出、次世代ライブラリの調製、薬物スクリーニング、疾患診断及び予後判定、及び様々な遺伝的障害の治療において、幅広い範囲にわたる適用を有する。

別の態様において、本開示は、標的核酸のある部位におけるペイロード核酸の挿入又は切出しを標的化する方法を提供し、ここでこの方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む。

別の態様において、本開示は、ＤＮＡ標的核酸の認識時に一本鎖ＤＮＡを非特異的に分解する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを標的核酸に接触させることを含む。

別の態様において、本開示は、試料中における標的核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の検出方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるいずれかのシステム及び標識されたレポーター核酸を試料に接触させることであって、ｃｒＲＮＡが標的核酸にハイブリダイズすると、標識されたレポーター核酸の切断が起こること、並びに標識されたレポーター核酸の切断によって生成される検出可能シグナルを測定することを含み、それにより試料中における標的核酸の存在を検出する。

更に別の態様において、本開示は、それを必要としている対象における病態又は疾患の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを対象に投与することを含み、ここでスペーサー配列は、病態又は疾患に関連する標的核酸の２２～４０ヌクレオチドと相補的であり；ここでＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドと会合して複合体を形成し；ここで複合体は、スペーサー配列のヌクレオチドと相補的な標的核酸配列に結合し；及びここで複合体が標的核酸配列に結合したことに応じて、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が標的核酸を切断し、それにより対象の病態又は疾患を治療する。

一態様において、本開示は、それを必要としている対象における病態又は疾患の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを対象に投与することを含み、ここでスペーサー配列は、病態又は疾患に関連する標的核酸の１７～４４ヌクレオチドと相補的であり；ここでＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドと会合して複合体を形成し；ここで複合体は、スペーサー配列のヌクレオチドと相補的な標的核酸配列に結合し；及びここで複合体が標的核酸配列に結合したことに応じて、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が標的核酸を切断し、それにより対象の病態又は疾患を治療する。

一態様において、本開示は、それを必要としている対象における病態又は疾患の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるシステムのいずれかを対象に投与することを含み、ここでスペーサー配列は、病態又は疾患に関連する標的核酸の２０～４０ヌクレオチドと相補的であり；ここでＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質はＲＮＡガイドと会合して複合体を形成し；ここで複合体は、スペーサー配列のヌクレオチドと相補的な標的核酸配列に結合し；及びここで複合体が標的核酸配列に結合したことに応じて、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が標的核酸を切断し、それにより対象の病態又は疾患を治療する。

別の態様において、本開示は、本明細書に開示されるシステムのいずれかを薬剤として使用するための方法を提供する（例えば、病態又は疾患の治療又は予防における使用のための）。

一部の実施形態において、病態又は疾患は、感染性疾患又は癌（例えば、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は膀胱癌）である。

更に別の態様において、本開示は、標的核酸を編集する方法（例えば、インビトロ又はエクスビボの方法）、例えば、標的核酸のターゲティング及び編集方法；ＤＮＡ標的核酸の認識に応じた一本鎖ＤＮＡの非特異的分解方法；二本鎖標的ＤＮＡのスペーサー相補鎖の認識に応じた前記二本鎖標的ＤＮＡの非スペーサー相補鎖のターゲティング及びニッキング方法；二本鎖標的ＤＮＡのターゲティング及び切断方法；試料中の標的核酸の検出方法；二本鎖核酸の特異的編集方法；二本鎖核酸の塩基編集方法；細胞における遺伝子型特異的又は転写状態特異的細胞死又は休眠の誘導方法；二本鎖標的ＤＮＡにおけるインデルの作成方法；二本鎖標的ＤＮＡへの配列の挿入方法、又は二本鎖標的ＤＮＡにおける配列の欠失又は逆位形成方法において、本明細書に開示されるシステムのいずれかを使用するための方法を提供する。

ＤＮＡ／ＲＮＡ検出
一態様において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ／ＲＮＡ検出において使用することができる。シングルエフェクターＲＮＡ誘導型ＤＮアーゼをＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）で再プログラム化することにより、特異的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）センシング用のプラットフォームがもたらされ得る。そのＤＮＡ標的の認識時、活性化したＶ型単一エフェクターＤＮＡガイドＤＮａｓｅは、近隣非標的ｓｓＤＮＡの「コラテラル」切断に関与する。このｃｒＲＮＡによってプログラム化されるコラテラル切断活性により、ＣＲＩＳＰＲシステムが特異的ＤＮＡの存在を標識ｓｓＤＮＡの非特異的分解によって検出することが可能となる。

ＤＮＡ検出適用においては、コラテラルｓｓＤＮＡ活性をレポーターと組み合わせることができ、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ標的化ＣＲＩＳＰＲトランスレポーター（ＤＮＡ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｔｒａｎｓ ｒｅｐｏｒｔｅｒ：ＤＥＴＥＣＴＲ）法と呼ばれる方法などであり、これは、アトモル濃度のＤＮＡ検出感度を実現する（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６０（６３８７）：４３６－４３９，２０１８を参照のこと）（これは全体として参照により本明細書に援用される）。本明細書に記載される酵素を使用する一つの適用は、インビトロ環境における非特異的ｓｓＤＮＡの分解である。フルオロフォア及び消光剤に連結した「レポーター」ｓｓＤＮＡ分子もまた、未知のＤＮＡ試料（一本鎖又は二本鎖のいずれか）と共にこのインビトロシステムに加えることができる。未知のＤＮＡ片中に標的配列を認識すると、このエフェクター複合体がレポーターｓｓＤＮＡを切断し、蛍光リードアウトが生じる。

他の実施形態において、ＳＨＥＲＬＯＣＫ法（特異的高感度酵素レポーターアンロッキング（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＵｎＬＯＣＫｉｎｇ））もまた、核酸増幅及びレポーターｓｓＤＮＡのコラテラル切断に基づいたアトモル濃度（又は単一分子）感度のインビトロ核酸検出プラットフォームを提供し、標的のリアルタイム検出を可能にする。ＳＨＥＲＬＯＣＫにおけるＣＲＩＳＰＲの使用方法については、例えば、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５６（６３３６）：４３８－４４２（２０１７）（これは全体として参照により本明細書に援用される）に詳細に記載される。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、マルチプレックス化したエラーロバストな蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＭＥＲＦＩＳＨ）において使用することができる。こうした方法については、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｅｄ，ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５ Ａｐｒ ２４；３４８（６２３３）：ａａａ６０９０（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

核酸の追跡及び標識
細胞過程は、タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡの間での分子相互作用網に依存する。タンパク質－ＤＮＡ及びタンパク質－ＲＮＡ相互作用の正確な検出は、かかる過程を理解する鍵である。インビトロ近接性標識技法は、レポーター基、例えば光活性化可能な基と組み合わせたアフィニティータグを用いることにより、インビトロで目的のタンパク質又はＲＮＡの近くにあるポリペプチド及びＲＮＡを標識する。紫外線照射後、光活性化可能な基がタグ付加分子にごく近接したタンパク質及び他の分子と反応し、それによってそれらを標識する。標識された相互作用分子は、続いて回収し、同定することができる。このＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質を使用して、例えば、プローブを選択のＲＮＡ配列に標的化することができる。こうした適用はまた、動物モデルにおいても疾患又は培養が困難な細胞型のインビボイメージングに適用することができる。核酸の追跡及び標識方法については、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書；国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット；及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。

ハイスループットスクリーニング
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリの調製に使用することができる。例えば、費用対効果の高いＮＧＳライブラリを作成するため、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して標的遺伝子のコード配列を破壊することができ、同時に次世代シーケンシングによって（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭシステムで）、ＣＲＩＳＰＲ酵素がトランスフェクトされたクローンをスクリーニングすることができる。ＮＧＳライブラリの調製方法に関する詳細な説明については、例えば、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１５．１（２０１４）：１００２（これは全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。

エンジニアリングされた微生物
微生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、及び微細藻類）は、合成生物学に広く用いられている。合成生物学の発展には、様々な臨床応用を含め、幅広い有用性がある。例えば、プログラム可能なＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、例えば癌関連ＲＮＡを標的転写物として用いる標的化した細胞死のため、毒性ドメインのタンパク質を分割することができる。更に、例えばキナーゼ又は酵素などの適切なエフェクターとの融合複合体により、合成生物系においてタンパク質間相互作用が関わる経路に影響を及ぼすことができる。

一部の実施形態において、ファージ配列を標的化するガイドＲＮＡ配列を微生物に導入することができる。従って、本開示はまた、微生物（例えば産生菌株）にファージ感染に対するワクチンを接種する方法も提供する。

一部の実施形態において、本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して微生物をエンジニアリングすることにより、例えば、収率を改善し又は発酵効率を改善することができる。例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して酵母などの微生物をエンジニアリングすることにより、発酵性糖からバイオ燃料若しくはバイオポリマーを生成し、又は発酵性糖源としての農業廃棄物に由来する植物由来のリグノセルロースを分解することができる。より詳細には、本明細書に記載される方法を使用して、バイオ燃料生産に必要な内因性遺伝子の発現を修飾し、及び／又はバイオ燃料合成を妨げ得る内因性遺伝子を修飾することができる。これらの微生物エンジニアリング方法については、例えば、Ｖｅｒｗａａｌ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ｅｎａｂｌｅｓ ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”Ｙｅａｓｔ，２０１７ Ｓｅｐ ８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｙｅａ．３２７８；及びＨｌａｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｆｒｏｍ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，２０１５ Ｎｏｖ １；３３：１１９４－２０３（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

植物における適用
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、植物において幅広い種類の有用性がある。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して植物のゲノムをエンジニアリングすることができる（例えば、生産を向上させる、所望の翻訳後修飾を有する生産品にする、又は工業製品を生産するための遺伝子を導入する）。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、植物に所望の形質を（例えば、ゲノムに対する遺伝性修飾を伴い又は伴わず）導入し、又は植物細胞若しくは全植物における内因性遺伝子の発現を調節することができる。

一部の実施形態において、本ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、特異的タンパク質、例えば、アレルゲンタンパク質（例えば、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、サヤマメ、及びヤエナリ中のアレルゲンタンパク質）をコードする遺伝子を同定、編集、及び／又はサイレンシングすることができる。タンパク質をコードする遺伝子を同定、編集、及び／又はサイレンシングする方法に関する詳細な説明については、例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｎｄ ｌｅｇｕｍｅ ａｌｌｅｒｇｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１（３）：２２２－８（２０１１）、及び国際公開第２０１６２０５７６４ Ａ１号パンフレット（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

遺伝子ドライブ
遺伝子ドライブは、特定の遺伝子又は遺伝子群の遺伝形質に有利な偏りが出る現象である。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ドライブを構築することができる。例えば、遺伝子の特定のアレルを標的化して破壊することにより、細胞に第２のアレルをコピーさせて配列を固定するようにＣＲＩＳＰＲシステムを設計することができる。このコピーのため、第１のアレルが第２のアレルに変換されることになり、子孫に第２のアレルが遺伝する可能性が高くなる。どのように本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ドライブを構築するかに関する詳細な方法については、例えば、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｖｅｃｔｏｒ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１６ Ｊａｎ；３４（１）：７８－８３（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

プール型スクリーニング
本明細書に記載されるとおり、プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、細胞増殖、薬剤耐性、及びウイルス感染などの生物学的機構に関与する遺伝子を同定するための強力なツールである。細胞がバルクで本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コードベクターのライブラリによって形質導入され、選択的チャレンジの適用前及び適用後にｇＲＮＡの分布が測定される。プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーンは、細胞生存及び増殖に影響を及ぼす機構に対して良好に機能し、個々の遺伝子の活性の測定にまで（例えば、エンジニアリングされたレポーター細胞株を使用することにより）拡張することができる。一度に１つの遺伝子のみが標的化されるアレイ化されたＣＲＩＳＰＲスクリーンでは、ＲＮＡ－ｓｅｑをリードアウトとして使用することが可能になる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムは単一細胞ＣＲＩＳＰＲスクリーンに使用することができる。プール型ＣＲＩＳＰＲスクリーニングに関する詳細な説明については、例えば、Ｄａｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅａｄ－ｏｕｔ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２０１７ Ｍａｒ；１４（３）：２９７－３０１（これは全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。

飽和突然変異誘発（「バッシング（ｂａｓｈｉｎｇ）」）
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムはインサイチュー飽和突然変異誘発に使用することができる。一部の実施形態では、プール型ガイドＲＮＡライブラリを使用して、特定の遺伝子又は調節エレメントに関するインサイチュー飽和突然変異誘発を実施することができる。かかる方法では、決定的な最小の特徴及びそれらの遺伝子又は調節エレメント（例えば、エンハンサー）の個別的な脆弱性を明らかにすることができる。これらの方法については、例えば、Ｃａｎｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＢＣＬ１１Ａ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，２０１５ Ｎｏｖ １２；５２７（７５７７）：１９２－７（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

治療上の適用
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、様々な治療上の適用を有し得る。一部の実施形態において、新規ＣＲＩＳＰＲシステムは、様々な疾患及び障害、例えば、遺伝性障害（例えば、単一遺伝子疾患）、ヌクレアーゼ活性によって治療することができる疾患（例えば、Ｐｃｓｋ９ターゲティング、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ＢＣＬ１１ａターゲティング）を治療するために使用することができる。

一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、対象、例えば、ヒト患者などの哺乳類の治療に用いられる。哺乳類対象はまた、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、雌ウシ、ヤギ、又はヒツジなど、家畜化された哺乳類であってもよい。

本明細書に記載される治療法の一部において、病態又は疾患は、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、α１－アンチトリプシン欠乏症、ポンペ病、筋強直性ジストロフィー、ハンチントン病、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ失調症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、遺伝性慢性腎疾患、高脂血症、高コレステロール血症、レーベル先天黒内障、鎌状赤血球症、及びβサラセミアからなる群から選択される。

本明細書に記載される方法（及びかかる方法における使用のための組成物）の一部の実施形態において、病態又は疾患は癌又は感染性疾患である。

一部の実施形態において、病態又は疾患は癌であり、ここで癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及び膀胱癌からなる群から選択される。

別の態様において、本開示は、ＲＮＡ配列特異的干渉；ＲＮＡ配列特異的遺伝子調節；ＲＮＡ、ＲＮＡ産物、ｌｎｃＲＮＡ、非コードＲＮＡ、核ＲＮＡ、又はｍＲＮＡのスクリーニング；突然変異誘発；ＲＮＡスプライシングの阻害；蛍光インサイチュハイブリダイゼーション；育種；細胞休眠の誘導；細胞周期停止の誘導；細胞成長及び／又は細胞増殖の減少；細胞アネルギーの誘導；細胞アポトーシスの誘導；細胞壊死の誘導；細胞死の誘導；又はプログラムされた細胞死の誘導からなる群から選択される方法における本明細書に記載されるシステムの使用を提供する。

この方法は、病態又は疾患が感染性であることを含んでもよく、ここで感染性病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）、及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ２）からなる群から選択される。

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、標的核酸を編集して、標的核酸を修飾することができる（例えば、１つ以上のアミノ酸残基を挿入、欠失、又は変異させることによって）。例えば、一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、望ましい核酸配列を含む外因性ドナー鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）を含む。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムで誘導される切断イベントの分解時に、細胞の分子機構は、切断イベントを修復及び／又は分解する際に、外因性ドナー鋳型核酸を利用するであろう。或いは、細胞の分子機構は、切断イベントを修復及び／又は分解する際に、内因性鋳型を利用することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、挿入、欠失、及び／又は点突然変異を生じる標的核酸を改変するために使用され得る。一部の実施形態において、挿入は、傷のない挿入である（すなわち、標的核酸への意図された核酸配列の挿入は、切断イベントの分解時に追加の意図されない核酸配列を生じない）。ドナー鋳型核酸は、二本鎖又は一本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であってもよい。外因性ドナー鋳型核酸の設計方法については、例えば、国際公開第２０１６０９４８７４ Ａ１号パンフレット（この内容全体が参照により本明細書に明示的に援用される）に記載されている。

一態様において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ、毒性ＲＮＡ、及び／又は変異ＲＮＡ（例えば、スプライシング欠陥又はトランケーション）の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するために使用することができる。例えば、有毒なＲＮＡの発現は、核封入体の形成及び脳、心臓、又は骨格筋の遅発性変性変化に関連し得る。一部の実施形態において、障害は筋強直性ジストロフィーである。筋緊張性ジストロフィーにおいて、有毒なＲＮＡの主な病原性効果は、結合タンパク質を隔離し、選択的スプライシングの調節を損なうことである（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ，” Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００９ Ａｐｒ １５；１８（８）：１４７１－８１を参照）。筋強直性ジストロフィー（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ ｍｙｏｔｏｎｉｃａ（ＤＭ））は、極めて広範囲の臨床的特徴を生じるため、遺伝学者にとって特に興味深いものである。現在ＤＭ１型（ＤＭ１）と呼ばれている古典的な形態のＤＭは、細胞質ゾルプロテインキナーゼをコードする遺伝子であるＤＭＰＫの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＴＧリピートの拡大によって引き起こされる。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、過剰発現されたＲＮＡ又は毒性ＲＮＡ、例えば、ＤＭＰＫ遺伝子、又はＤＭ１骨格筋、心臓、又は脳において誤調節された選択的スプライシングのいずれかを標的とすることができる。

本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、プラダー・ウィリ症候群、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、先天性角化異常症などの様々な疾患を引き起こすＲＮＡ依存性機能に影響を与えるトランス作用性変異を標的とすることもできる。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを使用して治療できる疾患のリストは、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，” Ｃｅｌｌ，１３６．４（２００９）：７７７－７９３及び国際公開第２０１６２０５７６４ Ａ１号パンフレットに要約される（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）。当業者であれば、これらの疾患を治療するために新規ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法を理解するであろう。

本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）／神経原線維変化（ＮＦＴ）優勢老人性認知症（アルツハイマー病（ＡＤ）で見られるものと同様のＮＦＴを伴うが、プラークを伴わない）、ボクシング認知症（慢性外傷性脳症）、及び進行性核上性麻痺などの原発性及び続発性タウオパチーを含む、様々なタウオパチーの治療にも使用できる。タウオパチー及びこれらの疾患を治療する方法の有用なリストは、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。

本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、スプライシングの欠陥及び疾患を引き起こし得るシス作用性スプライシングコードを破壊する変異を標的化するためにも使用できる。これらの疾患としては、例えば、ＳＭＮ１遺伝子の欠失に起因する運動ニューロン変性疾患（例えば、脊髄性筋萎縮症）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、前頭側頭型認知症、及び第１７染色体に関連するパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、及び嚢胞性線維症が挙げられる。

本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、特にＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性のために更に使用することができる。エフェクタータンパク質は、ウイルスＲＮＡ配列を標的化するために選択された適切なガイドＲＮＡを使用してウイルスＲＮＡを標的化することができる。

更に、インビトロＲＮＡセンシングアッセイを使用して特定のＲＮＡ基質を検出することができる。ＲＮＡターゲティングエフェクタータンパク質は、生細胞でのＲＮＡベースのセンシングに使用できる。適用例は、例えば、疾患特異的ＲＮＡのセンシングによる診断である。

本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムの治療用途の詳細な説明は、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書、欧州特許第３００９５１１号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に見出すことができる。

ＣＲＩＳＰＲシステムの送達
本開示及び当技術分野の知識を通じて、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム、又はその成分、その核酸分子、又はその成分をコードする若しくは提供する核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミド、ウイルス送達ベクターなどの様々な送達システムによって送達することができる。新規ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／又はいずれかのＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）は、適切なベクター、例えば、プラスミド、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、及び他のウイルスベクターなどのウイルスベクター、又はそれらの組み合わせを使用して送達することができる。タンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡは、１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。

一部の実施形態において、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターは、例えば、筋肉内注射、静脈内投与、経皮投与、鼻腔内投与、経口投与、又は粘膜投与によって目的の組織に送達される。かかる送達は、単回用量又は複数回用量のいずれによるものであってもよい。当業者は、本明細書において実際に送達される投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、組織、治療対象の全般的な状態、求められる形質転換／修飾の程度、投与経路、投与様式、求められる形質転換／修飾の種類など、種々の要因に応じて大きく異なり得ることを理解する。

特定の実施形態において、送達は、アデノウイルスによるものであり、これは少なくとも１×１０^５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスを含有する単回用量におけるものであることができる。一部の実施形態において、好ましくは用量は少なくとも約１×１０^６粒子、少なくとも約１×１０^７粒子、少なくとも約１×１０^８粒子、及び少なくとも約１×１０^９粒子のアデノウイルスである。送達方法及び用量については、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４Ａ１号パンフレット及び米国特許第８，４５４，９７２Ｂ２号明細書（これらは両方ともに全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

一部の実施形態において、送達はプラスミドによるものである。投薬量は、応答を引き出すのに十分な数のプラスミドであり得る。ある場合には、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの好適な分量は、約０．１～約２ｍｇであってもよい。プラスミドは概して、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、核酸ターゲティングＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流にある且つそれに作動可能に連結された転写ターミネーターを含むことになる。プラスミドはまた、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ成分もコードすることができるが、代わりに、これらのうちの１つ以上が異なるベクターにコードされてもよい。投与頻度は、医学又は獣医学の実践者（例えば、医師、獣医師）、又は当業者の範囲内にある。

別の実施形態において、送達はリポソーム又はリポフェクチン製剤などによるものであり、当業者に公知の方法によって調製することができる。かかる方法については、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第５，５９３，９７２号明細書；同第５，５８９，４６６号明細書；及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。

一部の実施形態において、送達はナノ粒子又はエキソソームによるものである。例えば、エキソソームはＲＮＡ送達に特に有用であることが示されている。

この新規ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の成分を細胞に導入する更なる手段は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の使用によるものである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドがＣＲＩＳＰＲ酵素に連結される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／又はガイドＲＮＡが１つ以上のＣＰＰとカップリングされ、それらを細胞内部へと有効に輸送する（例えば、植物プロトプラスト）。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／又は１つ又は複数のガイドＲＮＡが、細胞送達のため１つ以上のＣＰＰにカップリングされている１つ以上の環状又は非環状ＤＮＡ分子によってコードされる。

ＣＰＰは、生体分子を受容体非依存的に細胞膜を越えて輸送する能力を有するタンパク質又はキメラ配列のいずれかに由来する３５アミノ酸未満の短鎖ペプチドである。ＣＰＰは、カチオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチな抗微生物配列を有するペプチド、及びキメラ又は双節型ペプチドであってもよい。ＣＰＰの例としては、例えば、Ｔａｔ（これはＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要な核転写活性化因子タンパク質である）、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列、ポリアルギニンペプチドＡｒｇ配列、グアニンリッチ分子輸送体、及びスイートアローペプチドが挙げられる。ＣＰＰ及びその使用方法については、例えば、Ｈａｅｌｌｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１５；１３２４：３９－５８；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｂｙ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２０１４ Ｊｕｎ；２４（６）：１０２０－７；及び国際公開第２０１６２０５７６４ Ａ１号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。

本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムのための様々な送達方法はまた、例えば、米国特許第８７９５９６５号明細書、欧州特許第３００９５１１号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）にも記載されている。

以下の例に本発明を更に記載するが、これらの例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：ＣＬＵＳＴ．１２１１４３ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分の同定（図１～図４）
このタンパク質ファミリーは、淡水環境から採取された無培養のメタゲノム配列に見られるＣＲＩＳＰＲシステムに関連する大型のシングルエフェクターを表す（図３）。ＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクターには、下記表１及び表２に詳説するタンパク質の例が含まれる。これらのシステムのダイレクトリピート配列の例を表３に示す。

このエフェクター複合体を含む天然に存在する遺伝子座の例が図１に示され、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３遺伝子座の場合、エフェクタータンパク質がＣＲＩＳＰＲアレイと共出現することを示す。

エフェクタータンパク質又はＣＲＩＳＰＲアレイと共出現する双方向の１５ｋｂウィンドウ内で、他の大きなタンパク質ファミリーは同定されなかった。

ＣＬＵＳＴ．１２１１４３のダイレクトリピート配列は、３’末端の近位にある５’－ＴＧＣＡＡＡＡＧ－３’又は５’－ＴＴＴＣＡＡＡＧ－４ ’の保存されたモチーフを呈する（図２）。

図３は、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクターの系統樹の概略表現であり、ファミリーが配列多様性を呈することを示す。

図４は、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクタータンパク質の多重配列アラインメントの概略表現であり、ＲｕｖＣドメインの保存されている触媒残基の位置を明らかにし、マゼンタ、ブルー、及びレッドの色で図示される。
・任意選択で、本明細書に記載されるＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ＣＲＩＳＰＲシステムは、表４に詳述されるＤＲ相同性を有するトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び表５に詳述されるＤＲ相同性遺伝子座に含まれる完全なｔｒａｃｒＲＮＡを含む。任意選択で、システムは、表６に掲載される非コード配列のサブセットであるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
・任意選択で、本明細書に記載されるＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ＣＲＩＳＰＲシステムは、表６に掲載される非コード配列（又はその断片）によってコードされるＲＮＡモジュレーターを含む。

実施例２－トランス活性化ＲＮＡエレメントの同定
エフェクタータンパク質及びｃｒＲＮＡに加えて、本明細書に記載されるいくつかのＣＲＩＳＰＲシステムはまた、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれるロバストな酵素活性を活性化する更なるスモールＲＮＡを含み得る。このようなｔｒａｃｒＲＮＡには、典型的には、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズする相補的な領域が含まれる。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、エフェクターと複合体を形成し、プログラム可能な酵素活性の活性化を生じる。

ＴｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲアレイに隣接するゲノム配列で、ｃｒＲＮＡのダイレクトリピート部分に相同な短い配列モチーフを検索するにより同定できる。検索方法は、完全なダイレクトリピート（ＤＲ）又はＤＲ部分配列の正確な又は縮重した配列一致を含む。例えば、長さｎヌクレオチドのＤＲは、オーバーラップする６～１０ｎｔのｋｍｅｒのセットに分解できる。これらのｋｍｅｒは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接する配列にアラインメントでき、１つ以上のｋｍｅｒアラインメントを有する相同領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡとしての実験的検証のためのＤＲ相同領域として同定できる。或いは、ＲＮＡコフォールドの自由エネルギーは、ＣＲＩＳＰＲシステムのエレメントに隣接するゲノム配列からの完全なＤＲ又はＤＲ部分配列及び短いｋｍｅｒ配列について計算することができる。低い最小自由エネルギー構造を有する隣接配列エレメントは、ｔｒａｃｒＲＮＡとしての実験的検証のためのＤＲ相同性領域として同定できる。

ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントは、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子又はＣＲＩＳＰＲアレイにごく近接した範囲内で頻繁に発生する。ＤＲ相同性領域を検索してｔｒａｃｒＲＮＡエレメントを同定することの代替として、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する非コード配列を、ｔｒａｃｒＲＮＡの直接実験的検証のためのクローニング又は遺伝子合成によって単離することができる。

ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントの実験的検証は、ＣＲＩＳＰＲシステムの宿主生物のスモールＲＮＡ配列、又は非天然種で異種発現された合成配列を使用して実施できる。元のゲノム遺伝子座からのスモールＲＮＡ配列をアラインメントすることで、完全なｔｒａｃｒＲＮＡエレメントに典型的なＤＲ相同領域及びステロタイプ（ｓｔｅｒｏｔｙｐｅｄ）プロセシングを含む発現ＲＮＡ産物を同定できる。

ＲＮＡシーケンシングによって同定される完全なｔｒａｃｒＲＮＡ候補は、ｔｒａｃｒＲＮＡ候補を伴い又は伴わずｃｒＲＮＡ及びエフェクターを発現し、エフェクター酵素活性の活性化をモニタリングすることにより、インビトロ又はインビボで検証できる。

エンジニアリングされた構築物において、ｔｒａｃｒＲＮＡの発現は、哺乳動物細胞での発現のためのＵ６、Ｕ１、及びＨ１プロモーター又は細菌での発現のためのＪ２３１１９プロモーターを含むがこれらに限定されないプロモーターによってドライブされる。

一部の例では、ｔｒａｃｒＲＮＡをｃｒＲＮＡと融合させ、単一のガイドＲＮＡとして発現させることができる。

実施例３－酵素活性の新規ＲＮＡモジュレーターの同定
エフェクタータンパク質及びｃｒＲＮＡに加えて、本明細書に記載されるいくつかのＣＲＩＳＰＲシステムはまた、本明細書においてＲＮＡモジュレーターと呼ばれる、エフェクター活性を活性化又は調節するための更なるスモールＲＮＡを含み得る。

ＲＮＡモジュレーターは、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子又はＣＲＩＳＰＲアレイにごく近接した範囲内で発生すると予想される。ＲＮＡモジュレーターを同定及び検証するために、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する非コード配列を、直接実験的検証のためのクローニング又は遺伝子合成によって単離することができる。

ＲＮＡモジュレーターの実験的検証は、ＣＲＩＳＰＲシステムの宿主生物のスモールＲＮＡ配列、又は非天然種で異種発現された合成配列を使用して実施できる。スモールＲＮＡ配列を元のゲノム遺伝子座にアラインメントすることで、ＤＲ相同領域及びステロタイプ（ｓｔｅｒｏｔｙｐｅｄ）プロセシングを含む発現ＲＮＡ産物を同定できる。

ＲＮＡシーケンシングによって同定されるＲＮＡモジュレーター候補は、ＲＮＡモジュレーター候補を伴い又は伴わずｃｒＲＮＡ及びエフェクターを発現し、エフェクター酵素活性の変化をモニタリングすることにより、インビトロ又はインビボで検証できる。

エンジニアリングされた構築物において、ＲＮＡモジュレーターは、哺乳動物細胞での発現のためのＵ６、Ｕ１、及びＨ１プロモーター又は細菌での発現のためのＪ２３１１９プロモーターを含むプロモーターによってドライブされる。

一部の例では、ＲＮＡモジュレーターをｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はその両方と人工的に融合させ、単一のＲＮＡエレメントとして発現させることができる。

実施例４－エンジニアリングされたＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの機能検証（図５～図８）
本発明者らは、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分を特定した後、３３０００１４８３９と称されるメタゲノムソースから機能検証用に１つの遺伝子座を選択した。

ＤＮＡ合成及びエフェクターライブラリクローニング
本発明者らは、例示的なＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性を試験するために、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターを含むシステムを設計及び合成した。簡潔に言えば、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９エフェクターをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化核酸配列（表２に提供されるアミノ酸配列）を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に由来するカスタム発現システムにクローニングした。ベクターは、ｌａｃプロモーター及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リボソーム結合配列の制御下にあるＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９エフェクタータンパク質をコードする核酸を含んでいた。ベクターはまた、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９エフェクターのオープンリーディングフレームに続くＪ２３１１９プロモーターによってドライブされるＣＲＩＳＰＲアレイライブラリのアクセプター部位も含んでいた。

本発明者らは、「リピート－スペーサー－リピート」配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＯＬＳ）プールを計算的に設計した。ここで、「リピート」は、エフェクターに関連するＣＲＩＳＰＲアレイに見られるコンセンサスダイレクトリピート配列に相当し、「スペーサー」は、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子をタイリング（ｔｉｌｉｎｇ）する配列に相当する。スペーサー長さは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られるスペーサー長さの最頻値によって決定した。リピート－スペーサー－リピート配列には、前述のＣＲＩＳＰＲアレイライブラリアクセプター部位、及びより大規模なプールからの特異的リピート－スペーサー－リピートライブラリの特定の増幅を実現するユニークなＰＣＲプライミング部位への断片の双方向クローニングを実現する、制限部位が付加された。

次に、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ法を使用して、リピート－スペーサー－リピートライブラリをプラスミドにクローニングした。簡潔に言えば、本発明者らは初めに、ユニークなＰＣＲプライマーを使用してＯＬＳプール（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）から各リピート－スペーサー－リピートを増幅し、ＢｓａＩを使用してプラスミド骨格を事前に線形化して、潜在的バックグラウンドを低減した両方のＤＮＡ断片は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に添加する前に、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製し、製造者の指示に従ってインキュベートした。本発明者らは、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応物を更に精製及び濃縮して、細菌スクリーニングの後続のステップで最大の形質転換効率を実現した。

異なるリピート－スペーサー－リピートエレメントとＣａｓタンパク質とを含むプラスミドライブラリを、Ｌｕｃｉｇｅｎが推奨するプロトコルに従ってＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（登録商標）（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用してＥ．ＣｌｏｎｉエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に電気穿孔した。ライブラリを、精製ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドで共形質転換するか、又はｐＡＣＹＣ１８４を含むＥ．Ｃｌｏｎｉエレクトロコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に直接形質転換し、ＢｉｏＡｓｓａｙ（登録商標）ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のクロラムフェニコール（Ｆｉｓｈｅｒ）、テトラサイクリン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、カナマイシン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を含む寒天培地に播種し、３７℃で１０～１２時間インキュベートした。近似コロニー数を推定して細菌プレート上に十分なライブラリ提示を確保した後、細菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出し、「出力ライブラリ」を作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングケミストリーに適合性のあるバーコード及び部位を含むカスタムプライマーを使用してＰＣＲを実行することにより、本発明者らは、形質変換前の「入力ライブラリ」及び回収後の「出力ライブラリ」の両方からバーコード付きの次世代シーケンシングライブラリを生成し、これをプールし、Ｎｅｘｔｓｅｑ５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードして、エフェクターを評価した。一貫性を確保するために、各スクリーンに対して少なくとも２つの独立したバイオロジカルレプリケートが実施された。

細菌スクリーンシーケンシング解析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用してスクリーン入力及び出力ライブラリの次世代シーケンシングデータをデマルチプレックス化した。各試料について得られたｆａｓｔｑファイル中のリードが、スクリーニングプラスミドライブラリ用のＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを含んだ。ＣＲＩＳＰＲアレイのダイレクトリピート配列を用いてアレイの向きを決定し、スペーサー配列をソース（ｐＡＣＹＣ１８４又はＥ．Ｃｌｏｎｉ）又は陰性対照配列（ＧＦＰ）にマッピングすることにより対応する標的を決定した。各試料について、所与のプラスミドライブラリ中の各ユニークなアレイエレメントのリード総数（ｒ_ａ）をカウントし、以下のとおり規格化した：（ｒ_ａ＋１）／全てのライブラリアレイエレメントの総リード数。所与のアレイエレメントに関する規格化出力リード数を規格化入力リード数で除すことにより、枯渇スコアを計算した。

酵素活性及び細菌細胞死を生じさせる特異的パラメータを同定するため、本発明者らは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて入力及び出力プラスミドライブラリのＰＣＲ産物中における個々のＣＲＩＳＰＲアレイ（即ち、リピート－スペーサー－リピート）の表現を定量化し、比較した。本発明者らは、アレイの枯渇率を、規格化された出力リード数を規格化された入力リード数で割ったものとして定義した。枯渇率が０．１未満（１０倍を超える枯渇）の場合、アレイは「強力に枯渇した」と見なした。バイオロジカルレプリケートにわたるアレイ枯渇率を計算する際には、本発明者らは全実験にわたる所与のＣＲＩＳＰＲアレイについての最大枯渇率の値をとった（即ち、強力に枯渇したアレイは、全てのバイオロジカルレプリケートで強力に枯渇していなければならない）。本発明者らは、各スペーサー標的について、アレイ枯渇率及び以下の特徴：標的鎖、転写物ターゲティング、ＯＲＩターゲティング、標的配列モチーフ、フランキング配列モチーフ、及び標的二次構造を含む行列を作成した。本発明者らは、この行列中の異なる特徴がＣＬＵＳＴ．１２１１４３システムについての標的枯渇を説明する程度を調べ、それにより単一のスクリーン内で機能パラメータの広範な調査を得た。

図５は、所与の標的について、スクリーン出力対スクリーン入力におけるシーケンシングリードの規格化された比率をプロットすることによる、エンジニアリングされた組成物の干渉活性の程度を示す。結果は各ＤＲ転写方向につきプロットされる。各組成物の機能的スクリーニングにおいて、活性ＲＮＡガイドと複合体を形成した活性エフェクターは、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンに対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）耐性を付与するｐＡＣＹＣ１８４の能力に干渉し、細胞死及びプール内のスペーサーエレメントの枯渇をもたらす。初期ＤＮＡライブラリ（画面入力）と生存形質転換大腸菌（画面出力）のディープシーケンスの結果を比較すると、活性でプログラム可能なＣＲＩＳＰＲシステムを可能にする特定の標的配列及びＤＲ転写方向が示唆される。スクリーンはまた、エフェクター複合体がＤＲの１つの方向でのみ活性であることも示す。

図６は、陰性対照の干渉活性の欠如を示し、ここで、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３エフェクタータンパク質のコード領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へのエレクトロポレーションの前にｐＥＴ－２８ａ（＋）由来のプラスミドから欠失している。

図７Ａ～図７Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９エフェクターについての強力に枯渇した標的の位置を示す。注目すべきことに、強力に枯渇した標的の位置は、潜在的標的空間全体にわたって分散しているように見える。

図８は、枯渇した標的に隣接する配列のｗｅｂｌｏｇｏを示し、ＴＴＧの突出した５’ＰＡＭを示す。

実施例５－ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分の同定（図９～図１２）
このタンパク質ファミリーは、Ｆｅｒｖｉｄｉｂａｃｔｅｒｉａ、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）、ハロハスタ（Ｈａｌｏｈａｓｔａ）、ハロルブルム（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ）、ナトロノッカス（Ｎａｔｒｏｎｏｃｃｕｓ）種、及び淡水、温泉、塩湖、堆積物、土壌、廃水環境から採取された無培養のメタゲノム配列に見られるＣＲＩＳＰＲシステムに関連する大型のシングルエフェクターを表す（表７）。ＣＬＵＳＴ．１９６６８２エフェクターは、以下の表７及び表８に詳述されるタンパク質の例を含む。これらのシステムのダイレクトリピート配列の例を表９に示す。
・このエフェクター複合体を含む天然に存在する遺伝子座の例が図９に示され、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２遺伝子座の場合、エフェクタータンパク質がＣＲＩＳＰＲアレイと共出現することを示す。エフェクタータンパク質又はＣＲＩＳＰＲアレイと共出現する双方向の１５ｋｂウィンドウ内で、他の大きなタンパク質ファミリーは同定されなかった。
・ＣＬＵＳＴ．１９６６８２のダイレクトリピート配列は、５’末端の近位にある５’－ＧＹＹＹＧＮＫＲＫＮＮＡＣ－３’（配列番号８３２）、又は中心部にある５’－ＹＣＣＲＣＧＣＧＣＧＣＧＮＧＧＧ－３’（配列番号８３３）を含む複数の保存されたモチーフを呈し、式中、ＹはＣ又はＴ又はＵを指し、ＫはＧ又はＴ又はＵを指し、ＲはＡ又はＧを指し、Ｎは任意の核酸塩基を指す（図１０）。
・図１１は、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２エフェクター例の系統樹の概略表現であり、ファミリーが配列多様性を呈することを示す。
・図１２は、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２エフェクタータンパク質の多重配列アラインメントの概略表現であり、ＲｕｖＣドメインの保存されている触媒残基の位置を明らかにし、マゼンタ、ブルー、及びレッドの色で図示される。
・任意選択で、システムは、表１０に掲載される非コード配列のサブセットであるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。

実施例６－エンジニアリングされたＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの機能検証（図１３Ａ、１３Ｂ、及び１４）
ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分を特定した後、３３０００２５６３８と称されるメタゲノムソースから機能検証用に１つの遺伝子座を選択した。

ＤＮＡ合成及びエフェクターライブラリクローニング
本発明者らは、例示的なＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性を試験するために、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターを含むシステムを設計及び合成した。簡潔に言えば、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８エフェクターをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化核酸配列（表８に配列番号６０１として提供されるアミノ酸配列）を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に由来するカスタム発現システムにクローニングした。ベクターは、ｌａｃプロモーター及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リボソーム結合配列の制御下にあるＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８エフェクタータンパク質をコードする核酸を含んでいた。ベクターはまた、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８エフェクターのオープンリーディングフレームに続くＪ２３１１９プロモーターによってドライブされるＣＲＩＳＰＲアレイライブラリのアクセプター部位も含んでいた。

本発明者らは、「リピート－スペーサー－リピート」配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＯＬＳ）プールを計算的に設計した。ここで、「リピート」は、エフェクターに関連するＣＲＩＳＰＲアレイに見られるコンセンサスダイレクトリピート配列に相当し、「スペーサー」は、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子をタイリング（ｔｉｌｉｎｇ）する配列に相当する。スペーサー長さは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られるスペーサー長さの最頻値によって決定した。リピート－スペーサー－リピート配列には、前述のＣＲＩＳＰＲアレイライブラリアクセプター部位、及びより大規模なプールからの特異的リピート－スペーサー－リピートライブラリの特定の増幅を実現するユニークなＰＣＲプライミング部位への断片の双方向クローニングを実現する、制限部位が付加された。

次に、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ法を使用して、リピート－スペーサー－リピートライブラリをプラスミドにクローニングした。簡潔に言えば、本発明者らは初めに、ユニークなＰＣＲプライマーを使用してＯＬＳプール（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）から各リピート－スペーサー－リピートを増幅し、ＢｓａＩを使用してプラスミド骨格を事前に線形化して、潜在的バックグラウンドを低減した両方のＤＮＡ断片は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に添加する前に、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製し、製造者の指示に従ってインキュベートした。本発明者らは、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応物を更に精製及び濃縮して、細菌スクリーニングの後続のステップで最大の形質転換効率を実現した。

異なるリピート－スペーサー－リピートエレメントとＣａｓタンパク質とを含むプラスミドライブラリを、Ｌｕｃｉｇｅｎが推奨するプロトコルに従ってＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（登録商標）（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用してＥ．ＣｌｏｎｉエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に電気穿孔した。ライブラリを、精製ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドで共形質転換するか、又はｐＡＣＹＣ１８４を含むＥ．Ｃｌｏｎｉエレクトロコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に直接形質転換し、ＢｉｏＡｓｓａｙ（登録商標）ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のクロラムフェニコール（Ｆｉｓｈｅｒ）、テトラサイクリン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、カナマイシン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を含む寒天培地に播種し、３７℃で１０～１２時間インキュベートした。近似コロニー数を推定して細菌プレート上に十分なライブラリ提示を確保した後、細菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出し、「出力ライブラリ」を作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングケミストリーに適合性のあるバーコード及び部位を含むカスタムプライマーを使用してＰＣＲを実行することにより、本発明者らは、形質変換前の「入力ライブラリ」及び回収後の「出力ライブラリ」の両方からバーコード付きの次世代シーケンシングライブラリを生成し、これをプールし、Ｎｅｘｔｓｅｑ５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードして、エフェクターを評価した。一貫性を確保するために、各スクリーンに対して少なくとも２つの独立したバイオロジカルレプリケートが実施された。

細菌スクリーンシーケンシング解析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用してスクリーン入力及び出力ライブラリの次世代シーケンシングデータをデマルチプレックス化した。各試料について得られたｆａｓｔｑファイル中のリードが、スクリーニングプラスミドライブラリ用のＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを含んだ。ＣＲＩＳＰＲアレイのダイレクトリピート配列を用いてアレイの向きを決定し、スペーサー配列をソース（ｐＡＣＹＣ１８４又はＥ．Ｃｌｏｎｉ）又は陰性対照配列（ＧＦＰ）にマッピングすることにより対応する標的を決定した。各試料について、所与のプラスミドライブラリ中の各ユニークなアレイエレメントのリード総数（ｒ_ａ）をカウントし、以下のとおり規格化した：（ｒ_ａ＋１）／全てのライブラリアレイエレメントの総リード数。所与のアレイエレメントに関する規格化出力リード数を規格化入力リード数で除すことにより、枯渇スコアを計算した。

酵素活性及び細菌細胞死を生じさせる特異的パラメータを同定するため、本発明者らは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて入力及び出力プラスミドライブラリのＰＣＲ産物中における個々のＣＲＩＳＰＲアレイ（即ち、リピート－スペーサー－リピート）の表現を定量化し、比較した。本発明者らは、アレイ枯渇率を、規格化出力リード数を規格化入力リード数で除したものとして定義した。アレイは、枯渇率が０．１未満（１０倍を超える枯渇倍数）の場合に「強力に枯渇した」と見なした。バイオロジカルレプリケートにわたるアレイ枯渇率を計算する際には、本発明者らは全実験にわたる所与のＣＲＩＳＰＲアレイについての最大枯渇率をとった（即ち、強力に枯渇したアレイは、全てのバイオロジカルレプリケートで強力に枯渇していなければならない）。本発明者らは、各スペーサー標的について、アレイ枯渇率及び以下の特徴：標的鎖、転写物ターゲティング、ＯＲＩターゲティング、標的配列モチーフ、フランキング配列モチーフ、及び標的二次構造を含む行列を作成した。本発明者らは、この行列中の異なる特徴がＣＬＵＳＴ．１９６６８２システムについての標的枯渇を説明する程度を調べ、それにより単一のスクリーン内で機能パラメータの広範な調査を得た。

図１３Ａ～図１３Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８エフェクターについての強力に枯渇した標的の位置を示す。注目すべきことに、強力に枯渇した標的の位置は、Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子の潜在的標的空間全体にわたって分散しているように見える。

図１４は、枯渇した標的に隣接する配列のｗｅｂｌｏｇｏを示し、ＣＧの突出した５’ＰＡＭを示す。

実施例７－ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分の同定（図１５～図１８）
このタンパク質ファミリーは、ピキスパエラ目（Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓ）及びプランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）生物、及び淡水、永久凍土、堆積物、土壌、嫌気性、及び温泉環境から採取された無培養のメタゲノム配列に見られるＣＲＩＳＰＲシステムに関連する大型のシングルエフェクターを表す（表１１）。ＣＬＵＳＴ．０８９５３７エフェクターは、以下の表１１及び表１２に詳述されるタンパク質の例を含む。これらのシステムのダイレクトリピート配列の例を表１３に示す。
・このエフェクター複合体を含む天然に存在する遺伝子座の例が図１５に示され、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７遺伝子座の場合、エフェクタータンパク質がＣＲＩＳＰＲアレイと共出現することを示す。エフェクタータンパク質又はＣＲＩＳＰＲアレイと共出現する双方向の１５ｋｂウィンドウ内で、他の大きなタンパク質ファミリーは同定されなかった。
・ＣＬＵＳＴ．０８９５３７のダイレクトリピート配列は、３’末端の近位にある５’－ＲＢＢＮＲＢＫＧＡＣＡＳ－３’（配列番号８３４）を含む複数の保存されたモチーフを呈し（図１６）、式中、ＲはＡ又はＧを刺し、ＢはＣ又はＧ又はＴ又はＵを指し、ＫはＧ又はＴ又はＵを指し、ＳはＣ又はＧを指し、Ｎは任意の核酸塩基を指す。
・図１７は、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７エフェクターの系統樹の概略表現であり、ファミリーが配列多様性を呈することを示す。
・図１８は、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７エフェクタータンパク質の多重配列アラインメントの概略表現であり、ＲｕｖＣドメインの保存されている触媒残基の位置を明らかにし、マゼンタ、ブルー、及びレッドの色で図示される。
・任意選択で、システムは、表１４に掲載される非コード配列のサブセットであるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。

実施例８－エンジニアリングされたＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの機能検証（図１９～図２１）
ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの最小成分を特定した後、ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２と称されるメタゲノムソースから機能検証用に１つの遺伝子座を選択した。

ＤＮＡ合成及びエフェクターライブラリクローニング
本発明者らは、例示的なＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性を試験するために、ｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターを含むシステムを設計及び合成した。簡潔に言えば、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２エフェクターをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化核酸配列（表１２に提供されるアミノ酸配列）を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に由来するカスタム発現システムにクローニングした。ベクターは、ｌａｃプロモーター及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リボソーム結合配列の制御下にあるＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２エフェクタータンパク質をコードする核酸を含んでいた。ベクターはまた、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２エフェクターのオープンリーディングフレームに続くＪ２３１１９プロモーターによってドライブされるＣＲＩＳＰＲアレイライブラリのアクセプター部位も含んでいた。

本発明者らは、「リピート－スペーサー－リピート」配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリ合成（ＯＬＳ）プールを計算的に設計した。ここで、「リピート」は、エフェクターに関連するＣＲＩＳＰＲアレイに見られるコンセンサスダイレクトリピート配列に相当し、「スペーサー」は、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）必須遺伝子をタイリング（ｔｉｌｉｎｇ）する配列に相当する。スペーサー長さは、内因性ＣＲＩＳＰＲアレイに見られるスペーサー長さの最頻値によって決定した。リピート－スペーサー－リピート配列には、前述のＣＲＩＳＰＲアレイライブラリアクセプター部位、及びより大規模なプールからの特異的リピート－スペーサー－リピートライブラリの特定の増幅を実現するユニークなＰＣＲプライミング部位への断片の双方向クローニングを実現する、制限部位が付加された。

次に、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ法を使用して、リピート－スペーサー－リピートライブラリをプラスミドにクローニングした。簡潔に言えば、本発明者らは初めに、ユニークなＰＣＲプライマーを使用してＯＬＳプール（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）から各リピート－スペーサー－リピートを増幅し、ＢｓａＩを使用してプラスミド骨格を事前に線形化して、潜在的バックグラウンドを低減した両方のＤＮＡ断片は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に添加する前に、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製し、製造者の指示に従ってインキュベートした。本発明者らは、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応物を更に精製及び濃縮して、細菌スクリーニングの後続のステップで最大の形質転換効率を実現した。

異なるリピート－スペーサー－リピートエレメントとＣａｓタンパク質とを含むプラスミドライブラリを、Ｌｕｃｉｇｅｎが推奨するプロトコルに従ってＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（登録商標）（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用してＥ．ＣｌｏｎｉエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に電気穿孔した。ライブラリを、精製ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドで共形質転換するか、又はｐＡＣＹＣ１８４を含むＥ．Ｃｌｏｎｉエレクトロコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に直接形質転換し、ＢｉｏＡｓｓａｙ（登録商標）ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のクロラムフェニコール（Ｆｉｓｈｅｒ）、テトラサイクリン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、カナマイシン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を含む寒天培地に播種し、３７℃で１０～１２時間インキュベートした。近似コロニー数を推定して細菌プレート上に十分なライブラリ提示を確保した後、細菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出し、「出力ライブラリ」を作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングケミストリーに適合性のあるバーコード及び部位を含むカスタムプライマーを使用してＰＣＲを実行することにより、本発明者らは、形質変換前の「入力ライブラリ」及び回収後の「出力ライブラリ」の両方からバーコード付きの次世代シーケンシングライブラリを生成し、これをプールし、Ｎｅｘｔｓｅｑ５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードして、エフェクターを評価した。一貫性を確保するために、各スクリーンに対して少なくとも２つの独立したバイオロジカルレプリケートが実施された。

細菌スクリーンシーケンシング解析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｂｃｌ２ｆａｓｔｑを使用してスクリーン入力及び出力ライブラリの次世代シーケンシングデータをデマルチプレックス化した。各試料について得られたｆａｓｔｑファイル中のリードが、スクリーニングプラスミドライブラリ用のＣＲＩＳＰＲアレイエレメントを含んだ。ＣＲＩＳＰＲアレイのダイレクトリピート配列を用いてアレイの向きを決定し、スペーサー配列をソース（ｐＡＣＹＣ１８４又はＥ．Ｃｌｏｎｉ）又は陰性対照配列（ＧＦＰ）にマッピングすることにより対応する標的を決定した。各試料について、所与のプラスミドライブラリ中の各ユニークなアレイエレメントのリード総数（ｒ_ａ）をカウントし、以下のとおり規格化した：（ｒ_ａ＋１）／全てのライブラリアレイエレメントの総リード数。所与のアレイエレメントに関する規格化出力リード数を規格化入力リード数で除すことにより、枯渇スコアを計算した。

酵素活性及び細菌細胞死を生じさせる特異的パラメータを同定するため、本発明者らは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて入力及び出力プラスミドライブラリのＰＣＲ産物中における個々のＣＲＩＳＰＲアレイ（即ち、リピート－スペーサー－リピート）の表現を定量化し、比較した。本発明者らは、アレイの枯渇率を、規格化された出力リード数を規格化された入力リード数で割ったものとして定義した。枯渇率が０．１未満（１０倍を超える枯渇）の場合、アレイは「強力に枯渇した」と見なした。バイオロジカルレプリケートにわたるアレイ枯渇率を計算する際には、本発明者らは全実験にわたる所与のＣＲＩＳＰＲアレイについての最大枯渇率の値をとった（即ち、強力に枯渇したアレイは、全てのバイオロジカルレプリケートで強力に枯渇していなければならない）。本発明者らは、各スペーサー標的について、アレイ枯渇率及び以下の特徴：標的鎖、転写物ターゲティング、ＯＲＩターゲティング、標的配列モチーフ、フランキング配列モチーフ、及び標的二次構造を含む行列を作成した。本発明者らは、この行列中の異なる特徴がＣＬＵＳＴ．０８９５３７システムについての標的枯渇を説明する程度を調べ、それにより単一のスクリーン内で機能パラメータの広範な調査を得た。

図１９は、所与の標的について、スクリーン出力対スクリーン入力におけるシーケンシングリードの規格化された比率をプロットすることによる、エンジニアリングされた組成物の干渉活性の程度を示す。結果は各ＤＲ転写方向につきプロットされる。各組成物の機能的スクリーニングにおいて、活性ＲＮＡガイドと複合体を形成した活性エフェクターは、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンに対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）耐性を付与するｐＡＣＹＣ１８４の能力に干渉し、細胞死及びプール内のスペーサーエレメントの枯渇をもたらす。初期ＤＮＡライブラリ（画面入力）と生存形質転換大腸菌（画面出力）のディープシーケンスの結果を比較すると、活性でプログラム可能なＣＲＩＳＰＲシステムを可能にする特定の標的配列及びＤＲ転写方向が示唆される。スクリーンはまた、エフェクター複合体がＤＲの１つの方向でのみ活性であることも示す。

図２０Ａ～図２０Ｂは、ｐＡＣＹＣ１８４及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅ．Ｃｌｏｎｉ必須遺伝子を標的化するＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２エフェクターについての強力に枯渇した標的の位置を示す。

図２１は、枯渇した標的に隣接する配列のｗｅｂｌｏｇｏを示し、ＴＴＣの５’ＰＡＭを示す。

他の実施形態
本発明はその詳細な説明を伴い説明されているが、前述の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変形例が、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (49)

1. ＣＬＵＳＴ．１２１１４３、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２、又はＣＬＵＳＴ．０８９５３７のエンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムであって、
   ダイレクトリピート配列と標的核酸へのハイブリダイゼーション能を有するスペーサー配列とを含むＲＮＡガイド；及び
   ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又は前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸
   を含み、
   前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、表２、表８、又は表１２に提供されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含み；
   前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、前記ＲＮＡガイドに結合し、前記スペーサー配列に相補的な前記標的核酸配列を標的化することができる、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
2. 前記システムが、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、表２に提供されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、ＣＬＵＳＴ．１２１１４３ ３３０００１４８３９エフェクタータンパク質である、請求項２に記載のシステム。
4. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識能を有し、前記標的核酸は、核酸配列５’－ＴＴＧ－３’を含むＰＡＭを含む、請求項２又は３に記載のシステム。
5. 前記ダイレクトリピート配列が、表３に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載のシステム。
6. 前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列が、約２２ヌクレオチド～約４０ヌクレオチドを含む、請求項２～５のいずれか一項に記載のシステム。
7. 前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列が、約２６ヌクレオチド～約３５ヌクレオチドを含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のシステム。
8. 前記システムが、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、表８に提供されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
9. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、ＣＬＵＳＴ．１９６６８２ ３３０００２５６３８エフェクタータンパク質である、請求項８に記載のシステム。
10. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識能を有し、前記標的核酸は、核酸配列５’－ＣＧ－３’を含むＰＡＭを含む、請求項８又は９に記載のシステム。
11. 前記ダイレクトリピート配列が、表９に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載のシステム。
12. 前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列が、約１７ヌクレオチド～約４４ヌクレオチドを含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載のシステム。
13. 前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列が、２６～３８ヌクレオチドを含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載のシステム。
14. 前記システムが、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、表１２に提供されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。
15. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、ＣＬＵＳＴ．０８９５３７ ＣＡＡＡＣＸ０１００００６５２エフェクタータンパク質である、請求項１４に記載のシステム。
16. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識能を有し、前記標的核酸は、核酸配列５’－ＴＴＣ－３’を含むＰＡＭを含む、請求項１４又は１５に記載のシステム。
17. 前記ダイレクトリピート配列が、表１３に提供されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のシステム。
18. 前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列が、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチドを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のシステム。
19. 前記ＲＮＡガイドの前記スペーサー配列が、２５～３７ヌクレオチドを含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のシステム。
20. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、又は３つ）のＲｕｖＣドメインを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のシステム。
21. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、分割されたＲｕｖＣドメインを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のシステム。
22. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のシステム。
23. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、前記標的核酸を切断する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のシステム。
24. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
25. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする前記核酸が、細胞での発現にコドン最適化される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
26. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～２５のいずれか一項に記載のシステム。
27. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする前記核酸が、ベクター内にある、請求項１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
28. 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又は単純ヘルペスベクターを含む、請求項２７に記載のシステム。
29. 前記標的核酸がＤＮＡである、請求項１～２８のいずれか一項に記載のシステム。
30. 前記標的核酸が、ＰＡＭを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のシステム。
31. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、非特異的ヌクレアーゼ活性を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載のシステム。
32. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びＲＮＡガイドによる前記標的核酸のターゲティングにより、前記標的核酸に修飾が生じる、請求項１～３１のいずれか一項に記載のシステム。
33. 前記標的核酸の前記修飾が、二本鎖切断イベントである、請求項３２に記載のシステム。
34. 前記標的核酸の前記修飾が、一本鎖切断イベントである、請求項３２に記載のシステム。
35. 前記標的核酸の前記修飾により、挿入イベントが生じる、請求項３２に記載のシステム。
36. 前記標的核酸の前記修飾により、欠失イベントが生じる、請求項３２に記載のシステム。
37. 前記修飾により細胞毒性又は細胞死が生じる、請求項３２～３６のいずれか一項に記載のシステム。
38. ドナー鋳型核酸を更に含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のシステム。
39. 前記ドナー鋳型核酸がＤＮＡである、請求項３８に記載のシステム。
40. 前記ドナー鋳型核酸がＲＮＡである、請求項３８に記載のシステム。
41. 前記ＲＮＡガイドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ、モジュレーターＲＮＡ、又はその両方を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載のシステム。
42. 前記システムがｔｒａｃｒＲＮＡを更に含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載のシステム。
43. 前記システムがモジュレーターＲＮＡを更に含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載のシステム。
44. 前記システムが、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する、請求項１～４３のいずれか一項に記載のシステム。
45. 細胞内にある、請求項１～４３のいずれか一項に記載のシステム。
46. 前記細胞が真核細胞である、請求項４５に記載のシステム。
47. 前記細胞が原核細胞である、請求項４５に記載のシステム。
48. 請求項１～４７のいずれか一項に記載のシステムを、細胞内の標的核酸に結合させる方法であって、
    （ａ）前記システムを提供すること；及び
    （ｂ）前記システムを前記細胞に送達すること
    を含み、前記細胞が前記標的核酸を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が前記ＲＮＡガイドに結合し、前記スペーサー配列が前記標的核酸に結合する、方法。
49. 標的核酸の編集方法であって、請求項１～４７のいずれか一項に記載のシステムを前記標的核酸に接触させることを含む、方法。

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