CN107303291A - 含peitc的药物组合物及其在癌症治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种PEITC的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)改变突变型p53，使其恢复野生型活性，(b)抑制突变型p53所导致的肿瘤细胞增殖，(c)诱导突变型p53肿瘤细胞的凋亡，和/或(d)预防或治疗基于p53突变引起的疾病。本发明还提供了一种p53基因检测试剂的用途，包括PEITC和p53基因检测试剂的试剂盒以及体外非治疗性地抑制肿瘤细胞的方法。

Description

含PEITC的药物组合物及其在癌症治疗中的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，更具体地涉及含PEITC的药物组合物及其在癌症和其他基于p53突变引起的疾病的预防与治疗中的应用。
背景技术
本专利申请是CN200510040865.1、CN200610126892.5、CN200910052231.6、CN201310205609.8、CN201310352414.6、CN201310364101.2和CN201410346419.2以及US8039511B2、US8410170B2、EP06817815.1、CA2630262和JP5308160的后续专利。
癌症(Cancer)，是威胁人类健康的重大疾病。根据《全球癌症报告2014》，2012年全世界共新增1400万癌症病例并有820万人死亡。其中，中国新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。
虽然由于流行病学的进步，早期诊断和治疗方法的进一步改良，肿瘤的治疗和预防近些年来已取得显著的成就，然而肿瘤仍然是威胁人民生命的主要疾病之一。发掘新型高效低毒的抗癌、防癌新药，仍然是药物研究的重要课题。
佛美尼综合症(LFS)是一种由p53基因的胚系突变所引起的常染色体显性遗传疾病，该类病人患癌症的风险明显增加。因此，以突变型p53为治疗靶点，为肿瘤预防开辟了一条前途径。
然而，以突变型p53为靶点的癌症治疗和预防研究才刚刚起步。随着很多小分子药物筛选方法不断被发现和运用，目前已有以p53为靶点的新型化合物的研究报道，尤其是以突变型p53为靶点的化合物APR-246已进入临床II期试验，这给癌症治疗带来了新的希望。
但是，人工设计的小分子药物普遍采用单靶点筛选方法。由于单靶点药物仅对一个突变的基因有效，一旦被单靶点药物阻拦生长通道，肿瘤细胞会主动选择其他通路配合自身的生长。只要成功找到其他通路，单靶点药物就会失去作用，这就是这类药物在癌症治疗最令人头痛的耐药性的问题。一旦出现耐药性，即意味着癌症治疗的预后不良。突破靶向药物治疗的耐药性是全球医学界的研究焦点之一，解决耐药性，必须寻找到有效的多靶点抑制剂。
综上所述，本领域迫切需要开发不易产生耐药性的、以突变型p53为靶点的癌症治疗和预防药物。
发明内容
本发明的目的在于提供涉及含PEITC的药物组合物及其在癌症和其他由于p53突变引起的疾病的预防与治疗，尤其是以突变型p53为靶点的癌症预防和治疗中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种PEITC的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)改变(或激活)突变型p53，(b)抑制突变型p53肿瘤细胞的增殖，(c)诱导突变型p53肿瘤细胞的凋亡，和/或(d)预防或治疗基于p53突变引起的疾病。
在另一优选例中，所述的突变型p53在选自下组的位点具有突变：R175、C176、Y220、P223、C242、G245、R248、R249、R273、V274、P278、R282或其组合。
在另一优选例中，所述的突变型p53选自下组：突变型p53R175、突变型p53C176、突变型p53C242。
在另一优选例中，所述的突变型p53为突变型p53R175。
在另一优选例中，所述的突变型p53为突变型p53R175H。
在另一优选例中，所述的改变(或激活)包括诱导突变型p53重新具备类野生型p53的构象或功能。
在另一优选例中，所述的类野生型指改变(或激活)后的突变型p53的构象或功能与野生型p53的构象或功能的相似程度≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％，最佳地≥99.9％。
在另一优选例中，所述的功能包括激活磷酸化ATM/CHK2、推迟S和G2/M期、和/或诱导细胞凋亡。
在另一优选例中，所述的PEITC包括天然存在的PEITC或人工合成的PEITC。
在另一优选例中，所述天然存在的PEITC包括天然食物来源的PEITC。
在另一优选例中，所述的天然食物包括十字花科植物。
在另一优选例中，所述的十字花科植物选自下组：
青菜、萝卜、大白菜、西洋菜、西蓝花、胡萝卜、甘蓝、辣根、芥末、花椰菜、覆盆子或其组合。
在另一优选例中，所述的PEITC提取自十字花科植物。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗癌症。
在另一优选例中，所述的癌症选自下组：
乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、口腔癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、鼻咽癌、肺癌、膀胱癌、软组织肉瘤、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、成骨肉瘤或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂、栓剂、植入剂、膏剂、溶液剂和口服剂型。
在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、口服液剂和颗粒剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物中还可含有其他抗肿瘤活性成分。
在另一优选例中，所述的药物组合物中还可含有活性成分Nutlin、MG132、和/或Zn2+
在另一优选例中，所述的药物组合物为单元剂型，每个单元剂型中PEITC的含量约为日剂量的0.1至1(或0.25-1，或0.5-1)，其中所述日剂量为5-500mg，较佳地为20-200mg，更佳地为60-180mg。
在本发明的第二方面，提供了一种p53基因检测试剂的用途，用于制备诊断试剂或诊断试剂盒，所述诊断试剂或诊断试剂盒用于(a)判断PEITC治疗效果，和/或(b)判断肿瘤患者是否适合用PEITC进行治疗。
在另一优选例中，所述的试剂包括蛋白芯片、核酸芯片、或其组合。
在另一优选例中，所述的判断包括辅助判断和/或治疗前判断。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或诊断试剂盒检测选自下组的p53基因突变：
p53R175、p53C176、p53C242、p53Y220、p53P223、p53C242、p53G245、p53R248、p53R249、p53R273、p53V274、p53P278、p53R282或其组合。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或诊断试剂盒检测p53基因第175位R→H突变。
在另一优选例中，所述的诊断试剂或诊断试剂盒用于检测选自下组的样本：手术切除组织样本、石蜡切片组织样本、活检穿刺组织样本、血液样本、或其组合。
在另一优选例中，所述的p53基因突变检测试剂选自下组：p53基因、p53蛋白、p53蛋白特异性抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的p53蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测的标记物。
在另一优选例中，所述可检测的标记物选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)容器A，以及位于容器A中的PEITC或含PEITC的药物；
(b)容器B，以及位于容器B中的p53基因检测试剂；
(c)说明书。
在另一优选例中，所述的说明书注明以下内容：
(i)如果检测对象中肿瘤细胞的p53为突变型，则提示PEITC治疗效果较好，和/或所述肿瘤患者适合用PEITC进行治疗；
在另一优选例中，所述的说明书还注明以下内容：
(ii)如果检测对象中肿瘤细胞的p53为野生型，则提示PEITC治疗效果较差，和/或所述肿瘤患者不适合用PEITC进行治疗。
在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性地抑制肿瘤细胞的方法，所述方法包括步骤：
(i)提供一肿瘤细胞，检测所述肿瘤细胞p53基因的突变情况，如果所述肿瘤细胞的p53为突变型时，进行步骤(ii)；
(ii)在PEITC存在的条件下，培养所述肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的PEITC的浓度为1-100μM，较佳地为4-50μM，更佳地为5-20μM。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有活性成分(a)PEITC，活性成分(b)Nutlin，和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物还可含有Zn2+、或MG132。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于(a)改变(或激活)突变型p53，(b)抑制突变型p53肿瘤细胞的增殖，(c)诱导突变型p53肿瘤细胞的凋亡，和/或(d)预防或治疗基于p53突变引起的疾病。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示PEITC抑制p53突变型细胞DU145的细胞增殖和诱导细胞凋亡。
图1A显示了WST-1法测定细胞增殖率的结果。其中包括经DMSO(对照)或PEITC处理3天的DU145细胞。
图1B显示了PEITC对细胞凋亡的影响。其中包括经DMSO(对照)或PEITC处理3天DU145细胞。检测组蛋白相关DNA片段指示细胞凋亡。
图2显示PEITC抑制突变型p53R175依赖的细胞增殖和诱导细胞凋亡。
图2a分别用DMSO(对照)或PEITC处理拥有p53热点基因突变和野生型p53的人肿瘤细胞株3天。
图2b显示了WST-1法测定细胞增殖率的结果。其中包括DMSO或PEITC处理3天的转染siRNA的SK-BR-3细胞和A549细胞。
图2c显示了PEITC对细胞凋亡的影响。其中包括用DMSO或4μM PEITC处理3天的未转染的或转染siRNA的SK-BR-3细胞和A549细胞。使用BD lsrfortessa仪器经Annexin-V染色检测凋亡。
图2d显示了WST-1法测定细胞增殖率的结果。其中包括用DMSO或PEITC处理3天的转染pcDNA3、pcDNA3-p53R175、pcDNA3-p53R273或pcDNA3-wtp53的H1299细胞。
图2e显示了PEITC对细胞凋亡的影响。其中包括用DMSO或8μM PEITC处理3天的转染pcDNA3、pcDNA3-p53R175、pcDNA3-p53R273或pcDNA3-wtp53的H1299细胞。使用BD lsrfortessa仪器经Annexin-V染色检测凋亡。
图3显示了PEITC诱导突变型p53R175蛋白转变成“类野生型”的构象变化。
图3a显示了应用PAb240抗体(突变型)和PAb1620抗体(野生型)经ELISA方法确定PEITC对重组纯化的GST-p53R175H的构象的影响。
图3b和图3c显示了免疫荧光试验的检测结果。其中包括用DMSO或4μM PEITC处理6小时的SK-BR-3细胞。细胞的免疫荧光使用PAb240和PAb1620抗体进行。A549细胞株作为对照，表明p53基因野生型的构象不会被PEITC改变。H1299细胞系作为抗p53抗体对照。所有检测的阈值限定为20μM。***表示PAB240和PAB1620相比，p≤0.0001。
图3d显示了使用PAb240抗体对SK-BR-3细胞裂解物中的突变型p53蛋白进行免疫沉淀，并用p53抗体(fl393)进行检测的结果。
图4显示PEITC能使突变型p53R175蛋白复活其野生型的转录激活作用。
图4a显示PEITC诱导突变型p53蛋白与染色质结合。其中，以PEITC处理SK-BR-3细胞4小时，染色质结合和核可溶性组分用免疫印迹分析。组蛋白H3和拓扑异构酶IIB分别作为染色质和核可溶性组分的标记物。
图4b显示了提取RNA并利用TaqMan基因表达检测试剂盒检测基因表达水平的结果。其中，以DMSO或4μM PEITC处理SK-BR-3、H1299和A549细胞4小时，qRT-PCR扩增p53调节基因。
图4c显示了提取RNA并利用TaqMan基因表达检测试剂盒检测基因表达水平的结果。其中，以DMSO或4μM PEITC处理p53 siRNA转染或NS siRNA转染的SK-BR-3细胞4小时，qRT-PCR扩增p53调节基因。
图4d显示了荧光素酶检测的结果。其中，用质粒16451转染SK-BR-3、HOP92、AU565、H1299和MEF[(10)3/175和(10)3/273]细胞后，PEITC(4或6μM)处理24小时，再分别进行荧光素酶检测。
图4e显示了Western blotting测定蛋白水平的结果。其中，在4μM PEITC或20μM依托泊苷处理SK-BR-3细胞4小时后，用Western blot分析p21表达水平。4μM PEITC处理A549细胞4小时作为对照。用p53 DO-1和GAPDH抗体采用Westernblotting测定蛋白水平。
图5显示了基因表达水平的检测结果。其中，PEITC诱导DU145细胞中典型p53靶基因p21的表达。DU145细胞经DMSO(对照)或PEITC处理4小时。提取RNA，应用TaqMan基因表达试剂盒检测基因的表达水平。
图6显示ITCs恢复p53的转录激活功能。
图6A显示了免疫印迹分析p53、p21表达水平的结果。其中，SCC114细胞用不同浓度的DMSO(对照)或ITCs处理24小时。提取40mg细胞总蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上测定，用P21抗体检测。剥离印迹，再次用p53(DO-1)抗体和抗GAPDH抗体检测。
图6B显示了染色质免疫沉淀反应(CHIP)的结果。其中，经过PEITC处理24小时的SCC-114细胞的裂解液与抗p53抗体(DO-1)进行免疫沉淀反应，然后对p53识别元素p21、PUMA和MDM2进行PCR。
图7显示PEITC处理SK-BR-3和A549细胞后，蛋白酶体降解p53蛋白。
图7a显示了用不同浓度的异硫氰酸苯乙酯和抑制剂(10μM Nutlin-3或20μMMG132)处理SK-BR-3细胞4小时后的p53蛋白降解情况。
图7b显示了SK-BR-3细胞经PEITC(4μM或8μM)，20μM MG132，或两者共处理4小时后的p53蛋白降解情况。
图7c显示了SK-BR-3细胞经PEITC(4μM或8μM)，10μM MG132，或两者共处理4小时后的p53蛋白降解情况。
图7d显示了用不同浓度的异硫氰酸苯乙酯和抑制剂(10μM Nutlin-3或20μMMG132)处理A549细胞24小时后的p53蛋白降解情况。收集细胞，制备细胞裂解物。裂解物经SDS-PAGE电泳后，用p53 DO-1抗体检测。
图7e显示了不同浓度的PEITC或DMSO处理SK-BR-3细胞4小时后的p53蛋白降解情况。收集细胞制备可溶性组分和不溶性组分。30μg可溶性或不溶性裂解物经SDS-PAGE电泳后，用p53 DO-1抗体检测。
图8显示PEITC处理SK-BR-3细胞后，p53R175蛋白被细胞自噬。
图8a显示了以PEITC(4μM或8μM)、CHQ(50μM)、或两者共处理SK-BR-3细胞4小时后的细胞自噬情况。裂解物经SDS-PAGE电泳后，用p53 DO-1抗体检测。
图8b显示了用ATG5 siRNA或NS siRNA转染SK-BR-3细胞后的细胞自噬情况。30μg裂解物经SDS-PAGE电泳后，用抗ATG5抗体检测。剥离印迹后，用抗GAPDH抗体重新结合。
图8c显示了用DMSO或PEITC处理转染ATG5 siRNA或NS siRNA的SK-BR-3细胞4小时后的细胞自噬情况。用p53DO-1和GAPDH抗体采用Western blotting测定蛋白水平。
图8d显示了WST-1法测定细胞增殖率的结果。其中，用DMSO或PEITC处理转染ATG5 siRNA或NS siRNA的SK-BR-3细胞3天
图8e显示了PEITC对细胞凋亡的影响。其中，以DMSO或PEITC处理转染ATG5siRNA或NS siRNA的SK-BR-3细胞3天。检测组蛋白相关的DNA片段指示细胞凋亡。
图9显示了锌和氧化还原剂对PEITC诱导p53R175蛋白复活作用的影响。
图9a显示了锌对PEITC活性的影响。其中，以PEITC、锌或两者共处理SK-BR-3细胞。WST-1法测定细胞增殖率。PEITC活性以生长抑制率的IC50值来表示。
图9b显示了应用PAb240抗体(突变型)和PAb1620抗体(野生型)经ELISA方法确定锌或锌和PEITC共处理对重组纯化的GST-p53R175H的构象的影响。
图9c显示了PEITC对SK-BR-3细胞降低谷胱甘肽的影响。其中，SK-BR-3细胞经PEITC(4μM或8μM)或DMSO处理4小时。利用GSH/GSSG GLO谷胱甘肽试剂盒检测还原剂GSH和氧化剂GSSG的比值。
图9d显示了NAC对PEITC活性的影响。其中，以不同浓度的PEITC或PEITC结合3μM NAC处理SK-BR-3细3天。WST-1法测定细胞增殖率。
图9e显示了WST-1法测定细胞增殖率的结果。其中，PEITC单独或联合2mMATZ或500单位的PEG过氧化氢酶共处理SK-BR-3细胞3天。
图9f显示了各成分对细胞凋亡的影响。其中，DMSO、ATZ、NAC或PEITC单独处理，或PEITC与ATZ或NAC共处理未转染的或siRNA转染的SK-BR-3细胞3天。使用BD lsrfortessa仪器经Annexin-V染色检测凋亡。
图10显示PEITC诱导H2AX灶，激活ATM和Chk2，阻滞G2/M期和S期，诱导细胞凋亡。其中，PEITC或DMSO处理SK-BR-3细胞和A549细胞3天，抗γ–H2AX抗体染色。
图10a显示了细胞抗γ–H2AX抗体染色(绿色)和DAPI(蓝色)的合并图像。其中，所有检测的阈值限定为20μM。
图10b显示了γ-H2AX灶细胞百分比(≤10或＞10，如图所示)。
图10c显示了PEITC或DMSO处理4小时的SK-BR-3细胞和A549细胞的免疫印迹分析结果。其中，免疫印迹使用抗pATM S1981和抗pCHK2 Thr68抗体进行。印迹剥离后，抗ATM和抗CHK2抗体重新结合。
图10d和图10e分别显示了SK-BR-3(d)或A549(e)细胞经PEITC，10μMNutlin-3或共处理24h后，采用流式细胞仪分析的结果。
图10f显示了使用BD lsrfortessa仪器经Annexin-V染色检测凋亡的结果，其中包括以4μM PEITC，10μM Nutlin-3或共处理24小时的SK-BR-3细胞和A549细胞。
图11显示ITCs恢复p53突变蛋白的细胞周期阻滞功能。
图11A和图11B显示了用流式细胞术分析经BITC(5μm或10μM)或DMSO(对照)处理的SCC003细胞。
图11C和图11D显示了用流式细胞术分析经PEITC(5μm或10μM)或DMSO(对照)处理的SCC003细胞。
图11E和图11F显示了用流式细胞术分析经BITC(5μm或10μM)或DMSO(对照)处理的SCC114细胞。
图11G和图11H显示了用流式细胞术分析经PEITC(5μm或10μM)或DMSO(对照)处理的SCC114细胞。
图12显示ITCs诱导突变型p53依赖型细胞周期阻滞。
图12A显示了DMSO对照组(未转染)，非特异性siRNA(N)组和mtp53siRNA(P)组SCC114细胞培养24小时、48小时和72小时后的免疫印迹分析结果。其中，转染后mtp53siRNA转染组的细胞p53蛋白表达减少，而对照组没有。
图12B显示了WST-1试验测定siRNA转染细胞增殖率的结果。其中，用PEITC/BITC处理后，突变型p53细胞能够增殖。
图12C、图12D、图12E显示了流式细胞术分析结果。其中，用BITC(5μM或10μM)或DMSO(对照)处理DMSO对照组(未转染)、非特异性siRNA(N)组和mtp53siRNA(P)组转染的SCC114细胞，然后用流式细胞术分析。
图12F、图12G、图12H显示了显示了流式细胞术分析结果。其中，用PEITC(5μM或10μM)或DMSO(对照)处理DMSO对照组(未转染)、非特异性(scrambled)siRNA(N)组和mtp53siRNA(P)组转染的SCC114细胞，然后用流式细胞技术分析。
图13显示PEITC在体内诱导突变型p53R175蛋白复活和抑制裸鼠移植瘤的生长。
图13a显示了小鼠乳腺脂肪垫(上图)和H&E染色(下图)的典型图像。所有检测的阈值限定为20μM。
图13b显示了肿瘤体积测量结果。用游标卡尺测量肿瘤，计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：L x W2x 0.523(**，p≤0.009，*，p≤0.03)(n＝7)。
图13c显示了每周动物体重的变化情况。
图13d显示了根据对照组和PEITC组每个组织切片的肿瘤细胞的平均数量对动物进行分配的情况(***，p≤0.00026)(n＝7)。
图13e显示了移植瘤组织中代表性图像Ki67(**，p≤0.007)和p53(*，p≤0.033)染色(上图)和阳性细胞计数(下图)(n＝7)。**表示Ki67p≤0.007，*表示p53p≤0.033。结果以均值显示。所有检测的阈值限定为200μM。
图13f显示了免疫印迹分析PEITC组和对照组裸鼠移植瘤中p53的表达水平的结果。印迹为每组12个肿瘤组织裂解物的代表性图片。
图13g显示了PEITC组和对照组动物的p53调节基因qRT-PCR结果(n＝4)。
图13h显示了SK-BR-3肿移植瘤中p21和Bax的免疫印迹。
图14显示PEITC抑制DU145细胞裸鼠移植瘤的生长。
图14A显示了小鼠侧面的代表性图像。
图14B显示了肿瘤体积测量结果。用游标卡尺测量肿瘤，计算肿瘤体积。公式L×W2×0.523(**，P≤0.003；***，P≤0001)(n＝7)。
图14C显示了每周动物体重(克)的变化情况。
各附图中，WT表示野生型，WB表示免疫印迹，WCL表示全细胞裂解物，AIN-93M表示AIN-93M标准饲料。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现，PEITC能够使突变型p53恢复其野生型活性(激活拟野生型p53活性)，抑制p53突变引起的肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。实验表明，PEITC能够诱导突变型p53转型，尤其是突变型p53R175、p53P223L、p53V274F、p53R248重新具备类野生型p53的构象或功能，进而恢复激活野生型p53靶点，如磷酸化ATM/CHK2，阻滞S和G2/M期，诱导细胞凋亡。在此基础上完成本发明。
本发明人研究发现：
1、PEITC可以恢复热点突变点R175、C176、Y220、P223、C242、G245、R248、R249、R273、V274、P278、R282错义突变的突变型p53的野生型构象和转录激活功能，诱导表达上述热点突变型p53细胞的凋亡。
2、PEITC能够抑制突变型p53R175表达型的乳腺癌细胞SK-BR-3、AU565、突变型p53R248表达型的口腔癌细胞SCC114和突变型p53P223L或p53V274F表达型的前列腺癌细胞DU145的增殖。
3、体内动物实验证明PEITC能够抑制乳腺癌细胞SK-BR-3和前列腺癌细胞DU145异体移植肿瘤的生长。
4、在表达突变型p53R175的乳腺癌细胞SK-BR-3、AU565，表达突变型p53P223L或p53V274F的前列腺癌细胞DU145和表达突变型p53R248的口腔癌细胞SCC114中，
PEITC可以通过将突变型构象转变成类野生型构象，复活转录激活功能，激活野生型p53靶点，如磷酸化ATM/CHK2，阻滞S和G2/M期，诱导细胞凋亡。
4、PEITC可以增加乳腺癌细胞SK-BR-3、AU565突变型p53R175蛋白对蛋白酶体和自噬降解的敏感性。
5、锌离子能增强PEITC诱导乳腺癌细胞SK-BR-3、AU565突变型p53R175的复活作用。
6、氧化还原变化对重新激活p53R175和抑制增长很重要，而对恢复p53R175构象不重要。
术语
如本文所用，术语“类野生型p53(wt-like p53)的构象和/或功能”是指基本具备野生型p53的构象和/或功能，改变(激活)后的突变型p53的构象和/或功能与野生型p53的构象和/或功能的相似程度≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％，最佳地≥99.9％。较佳地，类野生型p53的构象和/或功能为人野生型p53的构象和/或功能。
如本文所用，术语“改变突变型p53”是指改变(重新激活)突变型p53恢复其野生型活性和/或构型(激活拟野生型p53活性)，抑制p53突变引起的肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。
p53基因
如本文所用，术语“p53”、“p53基因”可互换使用，是指肿瘤抑制基因p53，p53基因的突变是人类癌症中十分普遍的现象。大多数的p53基因突变是错义突变，进一步可细分为接触突变(直接破坏p53与DNA的结合)和构象突变(破坏p53的构象)。这两种突变均造成正常的野生型p53的失活。研究表明，某些特定的小分子可以通过改变(激活)突变型p53来达到肿瘤抑制功能，用于癌症的治疗。
p53基因定位于人类染色体17p13.1，由其编码的包括393个氨基酸组成的53kD的核内磷酸化蛋白，被称为p53蛋白。野生型p53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟，并具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用。突变型p53蛋白稳定性增加，半衰期延长，可被免疫组化方法检测出来。
通常状况下,野生型(wtp53)在细胞内的活性水平是被严格控制的,蛋白半衰期很短。HDM2/MDM2作为最主要的p53负调控分子,通过转录抑制和行使E3功能降解p53。同时,hdm2/mdm2又是p53的靶基因。p53-HDM2/MDM2所形成的这一负反馈机制使wtp53活性在细胞内维持在较低水平。p53作为体内信号通路的重要网络节点分子,现已知道超过150多种基因受其调控,形成一个精细复杂的p53调控网络,在维护基因组稳定性中发挥了重要作用。
p53作为最重要的抑癌基因之一,与癌症的发生发展联系紧密,大约50％的人类癌症中存在着p53突变。在所有p53突变形式中,占主导地位的还是因点突变引起的错义突变,其比例约占总体的80％。而在这些p53错义突变中,发生在DBD区的点突变比例高达97％。实际上,p53的DBD区每一个氨基酸都可发生点突变而形成相应的突变体,但是以下12个位点的突变在癌症中高频率出现,与癌症进程紧密关联,被称为热点突变,它们分别是:R175、C176、Y220、P223、C242、G245、R248、R249、R273、V274、P278、R282。
PEITC
如本文所用，PEITC(Phenethyl isothiocyanate)，即苯乙基异硫氰酸酯，西洋菜和其他十字花科蔬菜中富含PEITC。动物实验表明，PEITC对癌症具有化学预防作用，流行病学研究也支持此类化合物预防人类癌症的效果。事实上，PEITC用于健康人群肺癌预防的I期临床研究已经完成，II期临床正在进行中。PEITC诱导的氧化应激有助于细胞凋亡，然而，这一作用的确切机制和分子靶点还不是很清楚。
已有的研究表明，PEITC和顺铂联用时，通过p53途径诱导肿瘤细胞凋亡。但是上述研究并没有明确诱导凋亡的分子机理，尚不清楚通过p53 DBD区哪几种热点突变起作用。
本发明人非常意外地发现，PEITC可以在体外和体内改变(重新激活)突变型p53，揭示了天然食物来源化合物的一种新的作用机理。在含有突变型p53的细胞中，PEITC对p53突变序列中较为常见的“热点”突变，如：p53R175、p53R248、p53P223和p53V274抑制活性较强，其中对最常见的“热点”突变之一p53R175的抑制活性最强。机理研究显示，PEITC通过恢复p53类野生型构象和转录激活功能诱导突变型p53R175的细胞凋亡。具体而言，在用PEITC处理的细胞内，改变的突变型p53R175通过激活野生型p53靶点，即磷酸化ATM/CHK2，推迟S和G2/M期，诱导细胞凋亡。机理的进一步研究表明，PEITC的这种生长抑制作用，在一定程度上受锌离子浓度和细胞氧化还原状态的影响。此外，PEITC通过蛋白酶体和自噬使p53R175突变体对降解敏感，其敏感程度与浓度相关。PEITC诱导p53R175的改变，提升其对降解途径的敏感性，很可能有助于其抗癌活性。以异体移植的小鼠模型抑制肿瘤生长的研究进一步证实，天然食物来源的化合物PEITC也能够在体内复活突变型p53R175的野生型功能，诱导细胞凋亡。这些前所未有的发现证明了突变型p53可以被天然食物来源化合物改变，对癌症预防和治疗有重大的意义。
本发明的主要优点包括：
(a)PEITC是目前发现的唯一针对突变型P53作为靶点的纯天然食物来源治疗肿瘤的化合物；
(b)由于PEITC是食物来源化合物，因此其安全性非常高。并且，PEITC不仅可以作为治疗肿瘤的药物，而且可以作为预防肿瘤的保健品使用；
(c)即使长期服用，PEITC也不易产生耐药性，并且对于其他抗肿瘤药物已经产生耐药性的肿瘤患者，使用PEITC治疗，仍然能够获得良好的效果；
(d)PEITC既可以单独使用，也可以与其它抗肿瘤药物配合使用；
(e)PEITC对于其它由于P53突变引起的疾病也能起到很好的治疗效果；
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用材料和方法
细胞系
HOP92，OVCAR3和SW620购自NCI DTP,DCDT Tumor Repository,Fredrick,Maryland。H1299、HT29、A549、MDA-MB-231、AU565、SK-BR-3、DU145、SCC003、SCC016、SCC114、SCC122、和MCF7来自Tissue Culture Source Resource,Georgetown University,Washington,DC。所有细胞系都是支原体阴性的，以含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基培养。从ATCC购买的正常的结肠细胞CCD841，用含10％FBS的Eagle’s基础培养基培养。3T3 Balb/c纤维母细胞(p53+/+)，则在含10％FBS的Dulbecco改良的Eagle’s培养基中培养。(10)3(p53-/-)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和(10)3衍生的p53突变的MEFs[(10)3/175和(10)3/273]在含10％FBS和400μg/mL G418的Dulbecco改良的Eagle’s培养基中培养。MEF(10)3及其衍生的人p53残基R175和R273突变细胞系，由DarrenR.Carpizo博士赠送。
细胞增殖试验
如前所述，PEITC对肿瘤细胞增殖的作用通过WST-1试验(Roche)测定。简单的说，取适量PEITC，用DMSO稀释，以使10μl的药物储备液在最终体积为1ml的SK-BR-3细胞(40000细胞/ml)中含有所需的药物浓度并且DMSO浓度为1％。将含PEITC的SK-BR-3细胞培养物加入96孔微量培养板中，每孔为4000个细胞。以1％DMSO作为对照，同时以不含细胞的培养液作为空白对照。培养板在37℃下培养3天，随后添加WST-1试剂孵育2小时。随后以微孔板酶标仪(Bio-Rad)测定OD450。以PEITC处理过的细胞OD450数值及DMSO对照细胞的OD450数值的比值来计算细胞增殖百分比。以类似的试验方法，测定PEITC对以下细胞增殖的影响：p53siRNA或NS siRNA转染的H1299，HOP92，AU565，OVCAR3，SW620，HT29，A549，MCF7，CCD841，SK-BR-3、DU145、SCC003、SCC016、SCC114、SCC122细胞。
细胞转染
p53 siRNA购自SMARTpool(Thermo Scientific/Dharmacon,Lafayette,CO,USA)。siRNA按制造商(Invitrogen)的说明书采用Lipofectamine 2000转染。简单地说，转染前，细胞于10cm培养皿中培养24小时，细胞汇合度为50-60％。取siRNA(0.430nmol)和43μL Lipofectamine 2000，与1mL的Opti-MEM(Invitrogen)混合。将混合物加入到细胞培养基后，培养6小时。24小时后，进行第二次类似的转染。于初次转染的72小时后，收获细胞，制备裂解物或用指定浓度的PEITC或DMSO处理，再用如前所述的WST-1试剂(Roche)测定肿瘤细胞的增殖。对于SK-BR-3细胞中ATG5的敲低实验，ATG5 siRNA(Santa CruzBiotechnology)转染采用如前所述的方法，但单次转染为6小时。24小时后，收获转染细胞以制备裂解物或用PEITC处理转染细胞4小时后制备裂解物。
按制造商(Invitrogen)的说明书，用Lipofectamine 2000转染pcDNA3、pcDNA3-wtp53、pcDNA3-p53R175和pcDNA3-p53R273质粒。简单地说，转染前，细胞于10cm培养皿中培养24小时，细胞汇合度为50-60％。将质粒(14μg)和43μLLipofectamine 2000，与1mL的Opti-MEM(Invitrogen)混合。添加混合物到细胞培养基中，培养6小时。24小时后，转染细胞用PEITC处理，进行如前所述的WST-1试验或Annexin V染色。转染细胞保存在含10％FBS和400μg/mL G418的RPMI 1640培养基中。
ELISA
以含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，于37℃下培养pGeX4T1-mutp53R175H质粒转化后的大肠杆菌细胞(BL21DE3)，直至600nm处OD值为0.4。在同一温度下，添加0.5mM异丙基-1-硫代-β-半乳糖皮蒽(IPTG)，持续摇瓶3小时，以诱导重组蛋白表达。细菌沉淀后，加入裂解缓冲液(250mM Tris-HCl，pH7.5，1mMEDTA，150mM NaCl，1％的Triton X-100，0.5％的Nonidet P-40，0.1％的Tween 20，0.2％SDS，1M DTT和蛋白酶抑制剂)使细胞裂解，并反复冻融三次，然后超声破碎(三个循环，每次一分钟)。超声破碎后，于4℃下18500×g离心30分钟，溶液变澄清。将上清液转移一支新管内，保存。以十二烷基肌氨酸钠缓冲液(裂解缓冲液+2％十二烷基肌氨酸钠)重悬沉淀，再用探针超声破碎(三个循环，每次一分钟)。将上述两步得到的上清液部分，以1x PBS按1:1的比例稀释后，用谷胱甘肽-琼脂糖小球(σ，G4510)，4℃下匀速旋转，孵育2小时。用PBS清洗几次后，以洗脱缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM GSH(σ，G4251)，300mM NaCl，1mM二硫苏糖醇(DTT)和蛋白酶抑制剂)洗脱蛋白质。另取25ng重组GST-突变体p53R175H，以pH 7.5的100mM Tris-Cl、300mM NaCl缓冲液稀释。用DMSO或4μM PEITC处理，在冰上孵育1小时。得到的蛋白样本加入ELISA板，4℃下孵育2小时。1x PBST清洗(含有0.05％Tween-20)，用5％的脱脂牛奶4℃封闭2小时。清洗后，添加以1x PBST按1:1000的比例稀释的小鼠一抗(PAB240或PAB1620)，继续于4℃下孵育过夜。1x PBST清洗，于4℃下添加辣根过氧化酶标记的抗鼠的二抗反应1小时。1x PBST清洗，加入底物(SuperSignal ELISAPico Chemi luminescent Substrate,Thermo Scientific)，再于450nM测定化学发光强度。纯化的GST和纯化的野生型p53(Thermo Scientific)作为对照。为了确定ZnCl2的影响，另取25ng重组GST-突变体p53R175H，以pH 7.5的100mMTris-Cl、300mM NaCl缓冲液稀释，用2.5μM ZnCl2或4μM PEITC单独处理或共处理后，冰上孵育1小时。然后按上述进行ELISA试验。
Annexin V染色
按制造商(Biolegend)的说明书进行Annexin V染色。简言之，以PEITC或作为对照的DMSO处理待检测细胞，3天后收集细胞，以1x PBS洗一次，用0.5mLAnnexin V结合缓冲液重悬。离心收集细胞，将5μL结合Annexin V的荧光染料添加到残留的缓冲液中，在避光条件下室温孵化15分钟，随后加入0.5mLAnnexin V结合缓冲液和5μL 0.1μg/mL的PI染色液。再以BD LSRFORTESSA流式仪(BD Biosciences)分析细胞。为了明确Nutlin-3处理对细胞诱导凋亡的影响，用指定浓度的PEITC、Nutlin-3单独处理、或两者共处理、或DMSO处理待检测细胞24或72小时。如前所述，处理好的细胞用Annexin V染色。为了确定还原剂NAC或PEG-过氧化氢酶对PEITC诱导细胞凋亡的效果，单独用PEITC、还原剂或氧化剂、或用PEITC结合还原剂或氧化剂，处理待检测细胞。如前所述，处理好的细胞用Annexin V染色。用DMSO或指定浓度的PEITC处理ATG5 siRNA或NS siRNA转染的细胞72小时。为了检测细胞凋亡，用细胞死亡检测ELISA结合光度酶分析法(Roche)，定量测定处于细胞凋亡期的胞浆组蛋白相关DNA片段。
免疫荧光染色
在四孔的载玻片(Lab-Tek)中，用PEITC(4或6μM)或作为对照的1％DMSO，处理待检测细胞6小时。细胞用1x PBS清洗两次，然后用甲醛(3.7％)在室温(RT)下固定15分钟。固定的细胞用0.5％的Triton X-100(σ)室温下处理5分钟。细胞以含0.5％Tween-20的1x PBS清洗四次，用10％的山羊血清(σ)4℃下封闭过夜。用0.1％的Tween-20清洗细胞四次后，用能区分突变型或野生型p53的小鼠源一抗PAB240(1:300,Calbiochem)或PAB1620(1:300,Calbiochem)，4℃下孵育过夜。以0.1％的Tween-20清洗四次后,细胞用Alexa Fluor 488-标记的山羊抗小鼠IgG(1:400,Invitrogen)，于室温下孵育2小时。以0.1％的Tween-20清洗细胞四次，用含DAPI的Prolong Gold Anti-Fade试剂(Invitrogen)染核。盖上盖玻片,细胞在避光室温下处理24小时。用Ze iss LSM 510 NLO带Plan-Apochromat 63×1.4-孔径油镜，Axiovert 200M倒置激光扫描显微镜进行免疫荧光分析。图像用Photomultiplier Tubes(PMT)检测器采集，Image J软件分析。荧光染色强度用Metamorph软件定量。
为了测定肿瘤细胞中PEITC对γ-H2AX灶形成的影响，p53siRNA或NS siRNA转染的待检测细胞，以4μM PEITC或作为对照的1％DMSO在37℃下处理3天。如前所述，以小鼠抗-γ-H2AX单克隆抗体(1:300,Upstate)作一抗，细胞用甲醛固定处理，以免疫染色检测γ-H2AX灶。
免疫共沉淀
待检测细胞以指定浓度的PEITC或作为对照的1％DMSO处理6小时。为了制备细胞裂解物，将收获的细胞以1x PBS清洗一次，用含有蛋白酶抑制剂(RocheMolecular Biochemicals)的裂解缓冲液(20mM Tris-Cl(pH 8.0)，137mM氯化钠，10％甘油，1％NP-40，2mM EDTA)将细胞沉淀重新混悬，冰上孵育30分钟。以离心机于18500×g、4℃下将细胞悬液离心10分钟，收集上清液。上清液用裂解缓冲液稀释，向200μg裂解物中加入适量proteinG Agarose(Roche)于4℃轻轻地摇晃1小时。预纯化后的裂解物，于4℃下加入小鼠源PAB240抗体(2μg，Calbiochem)轻轻摇晃2小时。然后将proteinG Agarose-加入悬浮液，4℃下孵育2小时。沉淀用添加有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液清洗四次，免疫沉淀物通过在Laemmli缓冲液中沸腾进行洗脱，然后进行4-12％的SDS-PAGE电泳。免疫沉淀的p53蛋白以FL393(Santa Cruz Biotechnology)作为一抗，进行免疫印迹检测。二抗采用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(1:2000，GE healthcare)。根据制造商的说明书(Amersham)，使用ECL Prime Western Blot检测试剂盒检测蛋白印迹。作为对照，清除印迹后，再以抗p53(DO-1)抗体(1:1000，Santa CruzBiotechnology)或抗GAPDH抗体(1:2000，Novus Biologicals)重新检测。用GeneTools软件测定经PEITC处理后的样本中，相对于DMSO对照样品，其p53条带的密度。
裂解液的制备及Western blot分析
采用不同的裂解液以制备可溶性、不溶性和全细胞裂解组分。以1x PBS清洗两次，收集细胞，用来制备裂解物(可溶的)。将RIPA缓冲液(10mM磷酸钠(pH 7.2)，300mMNaCl，0.1％SDS，1％Nonidet P-40，1％脱氧胆酸盐，2mM EDTA)加入细胞中，于冰浴中放置30分钟。然后将细胞悬液于18500×g在4℃下离心10分钟，收集上清液，除非另有提及。沉淀物即为不溶性组分。将不溶性组分溶解在含有2％SDS的裂解缓冲液中(65mM Tris-HCl(pH 8.0),150mM NaCl,2％SDS,50mM DTT)。如上所述，将所收获细胞沉淀以2％的SDS裂解缓冲液溶解以制备全细胞裂解组分。将该组分于18500×g4℃下离心10分钟收集其中组分。然后取30-50μg的裂解物进行4–12％SDS/PAGE电泳。将蛋白质转移到PVDF膜上，根据制造商(Amersham)的说明书ECL Prime Western blot进行蛋白印迹检测。其中p21、Bax、ATM、pATM S1981、CHK2、pCHK2Thr68和p53(DO-1)的抗体分别购自于Santa Cruz Biotechnology，GAPDH抗体购自Novus Biologicals。ATG5(1:1000，细胞信号传导)的抗体由Dr.Shivendra Singh赠送。
染色质分离
将待检测细胞分别用指定浓度PEITC或作为对照的DMSO处理4小时。细胞用胰蛋白酶消化后于500×g离心5分钟收集。细胞沉淀以冰预冷的PBS洗涤一次，并转移至1.5mL微量离心管中于500×g离心2分钟。细胞沉淀于-80℃储存，然后按照生产商的说明书(Subcellular protein fractionation kit,ThermoScientific)分离染色质中核可溶性部分和染色质结合蛋白部分。取10微克来自PEITC或DMSO处理后的细胞样品可溶性核提取物与染色质结合核提取物蛋白进行4-12％SDS-PAGE电泳，并将蛋白转移到PVDF膜。用p53(DO-1)抗体(1:1000，Santa Cruz Biotechnology)进行蛋白免疫印迹测定p53含量。以组蛋白H3和TopoII B作为染色质和可溶性核组分的内标。组蛋白H3多克隆抗体购于(ThermoScientific)和，鼠抗topoii B单克隆抗体购于(Santa Cruz Biotechnology)。
RNA提取和定量RT-PCR
待检测细胞用QiagenRNA提取试剂盒提取细胞RNA，采用高容量的RNA-cDNA转换试剂盒合成cDNA(Applied Biosystems，Invitrogen)，采用TaqManRT-PCR(qRT-PCR)(Applied Biosystems，Invitrogen公司)定量方法测定基因表达水平。并以GAPDH归一化，结果以平均值及三个重复测定的标准偏差来表示。异体移植瘤组织的RNA亦以QIAGEN试剂盒提取，然后进行qRT-PCR，经GAPDH归一化处理测定基因表达水平。计算PEITC处理组与对照组的每个肿瘤基因表达水平的变化倍数，并以平均值及标准偏差表示。
谷胱甘肽水平测定
使用GSH/GSSG-GLO谷胱甘肽检测试剂盒(Promega)，测定还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的水平。简而言之，用PEITC或作为对照的DMSO处理待检测细胞4小时，根据制造商(Promega)的说明书处理细胞，测定谷胱甘肽。
转导基因荧光素酶活性的检测
将Bert Vogelstein(Addgene plasmid#16451)赠送的编码有能与p53 WT蛋白特定位点结合的p21启动子序列的WWP-Luc(p21/WAF1启动子)质粒，转染到待检测细胞中，以4或6μM PEITC分别处理24小时。按照制造商(Luciferaseassay,Promega)说明书，检测细胞裂解物转导基因荧光素酶活性。
细胞周期分析
待检测细胞分别以PEITC、Nutlin-3或两者合用处理24或72小时，以DMSO作为对照。收集细胞以流式细胞仪进行细胞周期检测分析。简之，细胞以不含钙、镁离子的PBS清洗，胰蛋白酶消化5分钟，收集细胞并于190xg、4℃离心3分钟。所收集细胞以PBS洗涤一次，重新悬浮于1毫升70％乙醇中，–20℃储存过夜。然后，在420×g，离心10分钟后收集沉淀的细胞颗粒，以1毫升冰预冷的PBS清洗一次，重悬于1毫升新鲜制备的PI染色液(PBS含0.1％Triton X-100、0.05μg/mL碘化丙啶，0.1mg/mL的RNase(Sigma))中。细胞悬液先在暗处、室温放置30分钟，然后于4℃放置30分钟。以Becton Dickinson FACS检测样品，并以Mod Fit程序(Verity Software House)进行数据分析。
PEITC处理后的ATM和CHK2检测
待检测细胞以DMSO、ATZ、NAC、PEG-过氧化氢酶或单一的PEITC或以ATZ或NAC或PEG-过氧化氢酶与PEITC联合处理4小时。然后于1600×g、4℃、离心10分钟后收集细胞，PBS洗涤一次，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液重悬(10mM磷酸钠(pH 7.2)300mM NaCl,0.1％SDS,1％Nonidet P-40,1％脱氧胆酸盐，和2mM EDTA)，冰上放置30min，于18500×g、4℃离心10分钟，收集上清液。取200μg的裂解物进行4-12％SDS/PAGE电泳。电泳后，蛋白转移到PVDF膜上，以anti-pATM Ser1981抗体(1:500)(Santa Cruz Biotechnology)或anti-pCHK2Thr68抗体(1:500)(Santa Cruz Biotechnology)进行蛋白印迹检测。二抗为过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(1:1000，GE Healthcare)。用ECLPrime Western Blot Detection Kit，按照制造商(Amersham)的说明书，显示印迹。作为对照，剥离印迹后，用anti-ATM抗体(1:500，Santa CruzBiotechnology)或Chk2抗体(Santa Cruz Biotechnology)重新检测。
小鼠移植瘤模型
二十只雌性无胸腺nu/nu BALB/C小鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl,4-6周龄)购自Charles River实验室(Wilmington，MA)。所有体内研究和肿瘤收集符合实验动物保护及使用委员会(IACUC)的程序和指导原则。将小鼠称重后置于聚碳酸酯笼中(五只/笼，每笼动物平均体重和方差相同)一周。小鼠随意取食水，饲料为AIN-93M。隔离一周后，将小鼠随机分配到AIN-93M饲料对照组或含有PEITC的AIN-93M饲料组(5μmol PEITC/g饲料，10只/组)。这2种饲料均由ResearchDiets(New Brunswick,NJ)提供。所采用的动物数是根据以前试验结果决定的，该试验已证明所采用的SK-BR-3细胞移植瘤小鼠模型的动物数所获结果具有统计学意义。饲料中所含的PEITC浓度也基于之前的小鼠生物试验结果。如前所述，采用乙酸乙酯萃取饲料中的PEITC后，加入1,2-苯二硫酚与ITC环合反应测定，实测的浓度为4.97±0.16μmol/g。采用单因素方差分析，计算样品之间PEITC的差异，表明无统计学意义(α＝0.05)。
小鼠饲料隔天添加一次。在人乳腺癌异体移植瘤小鼠模型中，对照组与PEITC组小鼠饲喂一周后，将处于指数生长期的2x106的肿瘤细胞(悬浮于50μLMatrigel中)，注射到小鼠左、右乳腺脂肪垫位置(“癌症化学预防”设置)。实验过程中无小鼠死亡。每周用游标卡尺从外部测定肿瘤大小，评估肿瘤的形成和生长，持续进行10个生物测定周期。按照公式L x W2x 0.523计算肿瘤体积。
在前列腺癌体外移植瘤小鼠模型中，由于肿瘤位置的特殊性，并且小鼠的肿瘤体积小，不容易从外部测量。还是由于体积小，一些小鼠的肿瘤在数周体积的测量值仍然参差不齐。为此，最终的肿瘤体积计算，只采纳符合生长模式、无异常波动的动物肿瘤数据(n＝7)。采用GraphPad软件没有分析到异常数据。其余操作与人乳腺癌异体移植瘤模型一致。
所有的动物处死后，采集肿瘤，按下文描述的方法用苏木精和伊红(H&E)染色。试验过程中，每周称量动物体重一次。按前述以1,2-本二硫酚与ITCS环合反应，测定尸检时收集的动物血液中的ITC浓度。治疗组及对照组动物的血液中PEITC浓度分别为1.13±0.15μm(n＝3)和0.37±0.03μm(n＝2)。由于各组动物饲喂不同的饲料，试验无法按盲法进行；但是试验中，采用盲法完成肿瘤样本采集和组织病理学分析。病理学家按盲法检测H&E染色组织切片中的肿瘤发生率。
移植瘤的组织病理学分析、免疫组织化学、Western blot和qRT-PCR分析
以H&E染色组织切片病理学检查来确定其是否为肿瘤。按照乔治城大学Histopathology and Tissue Shared Resources标准进行免疫组织化学检查。简之，将组织切成5μm的薄片，以二甲苯脱蜡和梯度醇脱水，再将组织切片放入98℃含0.05％Tween的10nM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中浸泡20分钟，进行热诱导抗原修复(HIER)。免疫组化染色采用Dako的辣根过氧化物酶标记的聚合物(k4001，k4003)，根据制造商指南进行。简之，将切片以3％过氧化氢和10％正常山羊血清处理各10分钟，然后加入一抗p53(DO-7)(1:800，Dako)，在室温(RT)放置1小时，或加入Ki-67(1:15，NovusBiologicals)抗体,于4℃放置过夜。然后将切片暴露于适当的HRP标记的聚合物30分钟和DAB显色液中(Dako)5分钟。切片再以苏木精复染(Fisher,Harris Modified Hematoxylin)、在1％氢氧化铵中变蓝，脱水，以Acrymount固定。以未经一抗孵育的切片作为阴性对照。切片在奥林巴斯BX61显微镜下以放大200倍进行镜检。整个肿瘤组织切片中有代表性的图像使用DP70相机照相并以DP70软件处理。图像采用Image J软件分析。此外，由于肿瘤体积小，每个肿瘤分析采用四张切片来确定细胞数。将每种抗体染色的切片，取不同区域拍摄二十张图片，计算细胞总数。每个肿瘤的数据以不同抗体染色的细胞总数的平均值表示。
因为得到的肿瘤组织尤其是来自补充有PEITC小鼠的肿瘤组织数量有限，把肿瘤随机地分组，进行western blotting和qRT-PCR分析。对于Western blot，各组的SK-BR-3移植瘤(n＝12)裂解液按瘤组织和裂解缓冲液(Pierce)20w/v的比例制成匀浆。如前述方法，取25μg的裂解物进行4–12％SDS/PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，以p53(DO-1)抗体进行蛋白免疫印迹试验。
统计分析
采用双尾t检验法检验肿瘤体积和生物端点的统计差异。P值≤0.05被认为具有统计学意义。所有统计分析均为双侧检验。
实施例1
PEITC对突变型p53细胞增殖的抑制作用
1.PEITC通过作用于前列腺癌细胞DU145突变型p53抑制其增殖
通过WST-1试验研究了PEITC对前列腺癌细胞DU145增殖的影响。为此，用不同浓度的PEITC处理DU145细胞72小时。之后通过检测各组细胞的OD450数值，计算对应的IC50。结果显示PEITC减少了DU145细胞系的增殖(IC50s＝～8μM)(图1A)。
2.PEITC通过作用于乳腺癌细胞SK-BR-3、AU565突变型p53R175抑制其增殖
WST-1试验研究表明，PEITC能降低各种表达突变型p53细胞的增殖。其中，PEITC对表达p53R175突变型的人乳腺癌细胞SK-BR-3、AU565和人非小细胞肺癌HOP92的抑制作用最强。这些肿瘤细胞对PEITC的IC50相比其它热点突变细胞下降了约2.5-5倍(图2a)。而用PEITC处理表达野生型p53的细胞，没有观察到明显的增殖抑制。
3.PEITC通过作用于口腔癌细胞SCC114突变型p53R248抑制其增殖
同样，在口腔癌细胞系SCC003，SCC016，SCC114和SCC122中进行的WST-1试验结果显示，在表达R248突变型p53的SCC114细胞中，经过PEITC处理后，观察到了最大的抑制率，而在表达野生型p53的SCC003细胞中却没有发现这种现象。
上述结果表明，PEITC以突变型p53为靶点抑制肿瘤细胞系的增殖。
实施例2
PEITC以突变型p53依赖性方式抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡
1.PEITC以p53R175或p53R248依赖性方式抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的增殖并诱导细胞凋亡
为了确定PEITC抑制肿瘤细胞增殖的作用是否是通过使p53R175转型改变野生型p53活性所介导的，转染p53siRNA后的WST-1试验显示：p53R175表达减少的SK-BR-3细胞(图2b)显著降低了PEITC抑制增殖的敏感性，而用NS siRNA转染的细胞则保持高敏感性。然而同样的试验在A549细胞中却没有观察到显著的增殖差异(图2b)。上述结果表明PEITC诱导的增殖抑制，依赖于突变型p53蛋白。
为了确定PEITC是否通过改变突变型p53蛋白而诱导肿瘤细胞凋亡，通过流式细胞技术进一步检测了表达不同突变型p53蛋白的肿瘤细胞系，试验结果显示与MDA-MB-231(p53R280)或A549细胞(图2c)相比，以4μM PEITC处理的SK-BR-3细胞，发生凋亡的细胞百分比与对照相比增加了约3倍(图2c)。值得注意的是，用PEITC或DMSO处理p53R175表达减少的SK-BR-3的细胞，其凋亡率没有显著的差异(图2c)，这证明PEITC依赖于突变型p53诱导细胞凋亡。
2.PEITC以p53P223或p53V274依赖性方式抑制前列腺癌细胞系DU145的增殖并诱导细胞凋亡
在前列腺癌细胞系DU145中，细胞死亡酶联免疫吸附试验结合光度酶测定试验结果显示：与经DMSO处理的对照细胞组相比，用8μM PEITC处理的DU145细胞其凋亡率增加了约2倍(图1B)
本实施例中的结果说明，PEITC通过介导突变型p53的改变抑制了肿瘤细胞的增殖，并诱发了肿瘤细胞的凋亡。
实施例3
PEITC恢复突变型p53的“类野生型”构象和转录激活功能
1.PEITC作用于乳腺癌细胞SK-BR-3突变型p53R175H，恢复其“类野生型”构象和转录激活功能
由于PEITC依赖于突变型p53诱导细胞凋亡，有理由推断可能是通过恢复p53的野生型功能来实现的。为此，用具有特定构象的抗p53抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定PEITC对p53R175构象的影响。结果表明，用PEITC孵育谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-p53R175H重组体，PAB1620(野生型特有的)部分增加了约2.8倍，而PAB240(突变型特有的)部分减少了约2.6倍(图3a)。用PEITC处理的SK-BR-3细胞的免疫荧光试验显示，PAB1620抗体的荧光强度增加了约2倍，而PAB240抗体的荧光强度出现了下降(图3b和图3c)。重要的是,用PEITC处理的SK-BR-3细胞(图3d)的p53R175的免疫沉淀反应显示PAB240的免疫反应性降低了95％以上。这些结果证明，PEITC诱导了p53R175的“类野生型”构象。
能否恢复p53R175与DNA结合的能力，对p53突变型肿瘤的抑制至关重要。为此，进一步研究PEITC是否能使核染色质富集p53R175。图4a是用PEITC处理的SK-BR-3细胞的核染色质结合部分，结果显示了p53R175剂量依赖性增加。与此一致的是，4μM的PEITC增加了SK-BR-3细胞中p53靶基因的表达，特别是p21、MDM2、PUMA、NOXA、BCL2、BAX(图4b)。而用PEITC处理A549、H1299或p53R175表达减少的SK-BR-3细胞，没有观察到明显变化。这表明PEITC诱导p53靶点是p53R175依赖性的(图4b和图4c)。
2.PEITC作用于前列腺癌细胞DU145突变型p53P223L或p53V274F，恢复其“类野生型”构象和转录激活功能
在前列腺癌研究中，由于PEITC能够诱导表达突变型p53蛋白的DU145细胞凋亡，我们推断它也是通过恢复p53的类野生型功能的途径。因此，我们研究了它对典型的p53靶基因p21表达的影响。结果显示，用PEITC(8μM)处理的DU145细胞确实增强了p21的表达(图5)。这一结果表明，PEITC能够恢复p53突变体“类野生型”构象和转录激活功能。
3.PEITC作用于口腔癌细胞SCC114突变型p53R248，恢复其“类野生型”构象和转录激活功能
同样，在口腔癌SCC114细胞中，用PEITC处理后，随着药物浓度的增加，突变型P53蛋白表达水平逐渐下降，而P21蛋白表达水平逐渐上升(图6A)。染色质免疫共沉淀实验进一步证实了经PEITC处理过的SCC114细胞能够恢复突变型P53蛋白结合到基因p21、PUMA和MDM2启动子特定位点的能力。(图6B)。
为了提供更多PEITC能恢复p53转录激活功能的证据，本发明进行了荧光素酶报告基因检测试验。结果表明，用4μM PEITC处理过的细胞，荧光素酶活性增加了约2-2.5倍(图4d)。这证明PEITC(4μM)能够诱导SK-BR-3细胞中p21基因的表达，而DNA损伤剂——依托泊苷无法做到(图4e)。这表明，这种诱导是突变型p53依赖性的。
本实施例中的所有结果均显示，PEITC能够恢复突变型p53蛋白的“类野生型”构象并获得转录激活功能。
实施例4
PEITC使乳腺癌SK-BR-3细胞表达的p53R175蛋白通过蛋白酶体和自噬降解
实施例1-3表明，PEITC(≥10μM)选择性降解突变型p53蛋白，而不是野生型p53蛋白。由于PEITC能够恢复p53R175到“类野生型”状态，而野生型p53受MDM2调控，因此恢复后的p53R175的稳定性下降可能是由于MDM2依赖的蛋白酶体的降解导致了泛素化蛋白在不溶解部分的积累。为了验证这一点，分别用PEITC、蛋白酶体抑制剂MG132或特定的MDM2抑制剂Nutlin-3单独或联合处理SK-BR-3细胞。结果显示MG132或Nutlin-3均无法防止p53R175的降低(图7a)。与单独用PEITC或MG132处理的细胞相比较，用4或8μM PEITC和20μM MG132联合处理的SK-BR-3细胞，全细胞裂解物(WCL)溶解部分和不溶解部分的p53显著积累(图7b)。同样，用4或8μM PEITC和20μM Nutlin联合处理的SK-BR-3全细胞裂解物(WCL)中的p53显著增加(图7c)，而A549中没有观察到p53积累的差别(图7d)。单独用8μM PEITC处理的SK-BR-3细胞中的p53存在于全细胞裂解物中(图7b)。为了观察到p53R175的聚集，用不同浓度(1-16μM)的PEITC处理SK-BR-3细胞。较高浓度(≥8μM)时，观察到p53R175的积累(图7e)。上述结果表明，改变的p53R175稳定性的降低是由于蛋白酶体的降解。
由于蛋白质也可能通过自噬过程清除，因此，本发明进一步研究了PEITC对SK-BR-3细胞自噬的影响。结果表明，和单独用PEITC处理的细胞相比，用8μMPEITC和50μM自噬抑制剂氯喹(CHQ)联合处理SK-BR-3细胞，明显增加了WCL中p53的含量。但4μM PEITC和50μM CHQ联合处理与单独用PEITC处理的细胞没有观察到显著差异，表明较高浓度的PEITC能够诱导自噬的发生(图8a)。由于自噬的形成需要自噬蛋白5(ATG5)的参与，因此，我们通过向SK-BR-3细胞中转染ATG5 siRNA或NS siRNA，以检测细胞对PEITC的敏感性。结果发现，和用NS siRNA转染的细胞相比，ATG5表达减少的SK-BR-3细胞，用8μM或16μM浓度PEITC处理时表现出较高水平的p53R175(图8b)，而2μM到4μM浓度PEITC处理则没有明显变化(图8c)。这说明ATG5表达减少的SK-BR-3细胞具有抵抗PEITC的抗恶性肿瘤细胞增殖的作用，而NS SiRNA转染细胞仍然保持高度敏感(图8d和图8e)，这表明在这些细胞中自噬消极地控制细胞生长。
本实施例中的试验结果证明PEITC通过两种不同的途径降解细胞中的突变型p53R175蛋白，分别为：MDM2依赖型蛋白酶体降解途径和通过自噬过程降解p53R175蛋白。
实施例5
锌离子增强PEITC诱导乳腺癌SK-BR-3细胞p53R175的复活能力
p53野生型蛋白质的适当折叠构象需要锌离子。p53R175是无法与锌直接结合的。通过用氯化锌(ZnCl2)和最佳浓度范围(10-20μM)的PEITC联合处理表达突变型p53R175的SK-BR-3细胞，发现氯化锌将PEITC抑制肿瘤细胞增殖的作用增强了约3.3倍(图9a)，但单独用ZnCl2没有发现这样的效果。同样，用PEITC(4μM)和ZnCl2(2.5μM)孵化GST-p53R175H导致PAB1620部分的增加非常显著，而PAB240没有明显变化(图9b)。这些结果证明锌离子有助于帮助PEITC重建p53R175的“类野生型”构象。
实施例6
氧化还原变化对改变p53R175和抑制肿瘤细胞增殖很重要，而对恢复p53R175构象不重要
研究表明，PEITC通过使癌细胞中的谷胱甘肽抗氧化系统失活，诱导产生活性氧。而氧化还原变化影响野生型p53蛋白的构象。谷胱甘肽表达水平检测结果表明：和DMSO对照组相比，用PEITC(4或8μM)处理过的SK-BR-3细胞中谷胱甘肽水平出现了下降(图9c)。用PEITC和还原剂(3mM N-乙酰基半胱氨酸(NAC)或500单位PEG-过氧化氢酶)联合处理SK-BR-3细胞后，减弱了PEITC抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用，而过氧化氢酶特异性抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑(ATZ)则增强了PEITC抑制肿瘤细胞增殖和凋亡的作用(图9d,图9e和图9f)。单独用PEITC处理或PEITC结合ATZ或NAC处理p53R175表达减少的SK-BR-3细胞，在细胞凋亡上没有显著的差异(图9f)。这些结果表明氧化还原变化对改变p53R175和抑制肿瘤细胞增殖很重要，而对恢复p53R175构象不重要。
本实施例中的结果证明锌离子和氧化还原变化对PEITC诱导的p53R175复活具有重要的影响。
实施例7
PEITC对细胞周期和ATM/CHK2激活的影响
1.PEITC复活乳腺癌细胞SK-BR-3突变型p53R175的反式激活功能,从而激活细胞凋亡的DNA损伤应答
通过使SK-BR-3细胞产生氧化应激压力，以评估PEITC对DNA损伤修复的影响。结果发现，和DMSO对照组相比，用4μM PEITC处理的SK-BR-3细胞中的γ–H2AX焦点增加了约1.8倍，这代表了DNA双链断裂(DSB’s)的积累，而同样的试验在A549细胞中没有检测到差异(图10a和图10b)。这表明DSB’s的积累是与p53R175相关的。
为了进一步研究将突变型p53R175改变为“类野生型”p53后，是否丧失其抑制ATM/检验点激酶2(CHK2)途径的能力。图10是经4μM PEITC处理后的SK-BR-3细胞与DMSO对照组细胞中pATM-S1981和pCHK2/Thr68的比较,结果表明缺乏p53R175H的ATM/CHK2抑制导致DNA损伤应答的重新激活。用PEITC处理没有pATM-S1981和pCHK2-Thr68的A549细胞结果与γ–H2AX焦点数据一致(图10a和图10b)。这表明PEITC恢复DNA损伤修复取决于细胞的氧化还原状态。
改变的突变型p53R175对细胞周期进程影响的试验发现用4μM PEITC处理SK-BR-3细胞24小时，G2/M和S期显著延迟(图10d)；这表明PEITC抑制细胞增殖，不仅延迟G2/M期，也延迟S期。用4μM PEITC处理A549细胞24小时，G1期延期。这表明细胞周期进程的延迟是与p53R175相关的。另外，与单独应用PEITC或Nutlin-3相比较，10μM Nutlin-3和4μM PEITC共同处理的SK-BR-3细胞24和72小时，结果表明，S期的数量显著增加(图10d)、细胞凋亡数量显著增加(图10f),说明了Nutlin-3的协同效应。而Nutlin-3单独或联合PEITC处理A549细胞24小时，显著推迟G1期；72小时，推迟G1和G2/M期(图10e)。证明观察到的Nutlin-3效果是野生型p53特有的。
总之,上述研究结果表明,PEITC在恢复突变型p53R175的反式激活功能的同时，复活细胞凋亡的DNA损伤应答。
2.PEITC通过作用于口腔癌细胞SCC114的突变型p53R248诱导G1期细胞周期阻滞
在口腔癌细胞中，表达突变型P53的SCC114细胞，经过不同浓度的PEITC处理后，能够恢复细胞从G1期进入S期的过程(P<0.05)(图11E,11F,11G,11H)。但是,对于表达野生型P53的SCC003细胞，实验组和对照组的差异没有统计学意义(P>0.05)(图11A,11B,11C,11D)。实验结果表明：PEITC诱导G1期细胞周期阻滞依赖于p53R248突变蛋白。另外，发明人通过向SCC114细胞转染siRNA进一步分析细胞周期，以确定是否是突变型p53在恢复G1期周期阻滞中发挥作用。流式细胞术和免疫印迹分析表明，当通过siRNA使突变型P53基因沉默时，就不再出现细胞周期阻滞现象(图12)。
本实施例试验结果证明PEITC通过作用于突变型p53蛋白诱导肿瘤细胞产生G1期阻滞；同时，PEITC通过作用于ATM/CHK2激酶恢复细胞的DNA损伤修复。
实施例8
PEITC通过改变不同热点的突变型p53蛋白，抑制异体移植肿瘤的生长
1.PEITC抑制人乳腺癌SK-BR-3异体移植肿瘤的生长
人乳腺癌动物模型试验结果显示，与对照饮食组相比，PEITC饮食组(5μmol/g AIN-93M)小鼠肿瘤生长受到明显的抑制(p<0.05)(图13a和图13b)。六周后对照组肿瘤体积的减小，可以解释为非侵犯表型的SK-BR-3细胞。两组间体重没有差异(图13c)。这些结果说明PEITC在SK-BR-3异体移植肿瘤模型上显示了抗肿瘤活性。
进一步的组织学检查表明，PEITC组肿瘤细胞显著减少(图13a和图13d)。同时，肿瘤Ki67和p53突变的染色细胞也显著减少(图13e)。为了评估PEITC是否复活体内突变型p53R175H,对肿瘤组织中的p53蛋白表达水平进行了检测。结果表明，尽管存在可能源自于试验用小鼠模型固有的特性，PEITC组p53R175H的水平存在差异，但和对照组相比较，PEITC组突变型p53蛋白水平显著降低(图13f)。另外，PEITC组p53调控基因p21和Bax的mRNA的蛋白质表达都有所增加(图13g和图13h)。这些结果提供了PEITC抑制SK-BR-3异体移植肿瘤生长、复活体内突变型p53的证据。
2.PEITC抑制人前列腺癌DU145异体移植肿瘤的生长
前列腺癌动物模型实验结果显示：与对照组动物相比，喂饲PEITC的动物组中观察到了有统计学意义的肿瘤生长抑制(p<0.05)(图14A和14B)。在生物测定期，两组动物的体重未观察到显著差异(图14C)。这些结果证明，PEITC在DU145移植瘤模型内有抗肿瘤活性。
本实施例结果说明PEITC能够改变p53R175H，抑制体内异体移植瘤的生长。
讨论
通过转活途径改变突变型p53，为肿瘤靶向治疗提供了一种前景光明的方向。突变型p53的改变已经在不同肿瘤的小鼠模型上分别得到验证。根据文献，已有人工设计的小分子恢复突变型p53反向转录的报道。然而,尚未见天然食物来源化合物改变突变型p53的研究报告。本发明的研究表明，PEITC选择性降解突变型p53蛋白而不影响野生型。具体而言，PEITC通过改变突变型p53R175，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，导致选择性清除这类细胞。这是天然食物来源化合物诱导细胞凋亡的新机理。研究PEITC对细胞中最终导致细胞死亡的系列不同基因之间的相互影响是非常有趣的。尽管p53通过转活多个相关、不相关的因子调节抗凋亡调节因子BCL2家族，PEITC除了影响BCL2外,还通过诱导多个启动凋亡的靶点表达,包括BH3-only类成员，恢复p53R175转录激活功能。重要的是,BCL2不能抑制PEITC诱导的细胞凋亡。
本发明的研究结果显示,改变的p53R175可以通过适当的折叠与锌结合，而ZnCl2显著增加了野生型p53特有的PAB1620，提示ZnCl2增强了PEITC的抗细胞增殖活性。
PEITC可能通过增加突变型p53细胞活性氧，加剧PEITC诱导的氧化应激。尽管诱导活性氧对恢复p53R175H构象没有影响,但提高氧化应激有助于恢复p53R175活性、诱导细胞凋亡。ATZ增强了PEITC抗增殖能力,而PEG-catalase或NAC起抑制作用，分别从正反两个方面为上述结论提供佐证。
本发明的体内研究，证实了天然食物来源的PEITC可以通过改变试验小鼠突变型p53蛋白，诱导肿瘤细胞凋亡。分析结果表明，喂食PEITC小鼠的血液样本中ITC浓度为1.13±0.15μM，这与人体药代动力学的研究结果-——食用约50克生西洋菜(大约相当于40毫克PEITC)志愿者的血浆中PEITC峰值浓度约1μM一致。
本发明的研究,按“化学预防设置”方式，证实PEITC对肿瘤的抑制作用。具体而言，在注射突变型p53细胞和肿瘤形成前，就给试验动物喂饲含PEITC的饲料。与此同时，注射的突变型p53细胞分为“启动阶段”或“已癌化”两种。研究结果表明，喂饲含PEITC饲料的小鼠，体内突变型p53得到降解、增殖抑制、肿瘤体积显著缩小。此外，p53靶基因mRNA的升高提供了喂饲含PEITC饲料小鼠p53R175H复活的证据。
医药界已经进行了很多研究，力图以改变突变型p53为靶点，从化学品库寻找可能作为肿瘤治疗药物的小分子化合物。然而,以天然食物来源化合物，预防为靶向的研究甚少。
通过靶向p53R175，本发明阐明了PEITC预防和治疗癌症的新机理。p53基因的突变可能发生在癌症的不同阶段,如在乳腺癌(DCIS,Ductal carcinoma insitu)和肝癌的早期，胰腺癌、肝细胞性肝癌、前列腺癌等的晚期,。就乳腺癌而言，DCIS阶段是发展为浸润性乳腺癌的前期。PEITC对这一阶段p53突变基因的作用,完全可用于乳腺癌的预防和早期干预。恢复p53R175“类野生型”构象和功能的发现，结合天然食物来源化合物特有的安全性，开辟了靶向性癌症预防和治疗的新途径。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种PEITC的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(a)改变(或激活)突变型p53，(b)抑制突变型p53肿瘤细胞的增殖，(c)诱导突变型p53肿瘤细胞的凋亡，和/或(d)预防或治疗基于p53突变引起的疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的突变型p53在选自下组的位点具有突变：R175、C176、Y220、P223、C242、G245、R248、R249、R273、V274、P278、R282或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的突变型p53为突变型p53R175。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PEITC提取自十字花科植物。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的十字花科植物选自下组：
青菜、萝卜、大白菜、西洋菜、西蓝花、胡萝卜、甘蓝、辣根、芥末、花椰菜、覆盆子或其组合。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物为药物组合物，较佳地，所述的药物组合物用于预防和/或治疗癌症。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的癌症选自下组：
乳腺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、口腔癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、鼻咽癌、肺癌、膀胱癌、软组织肉瘤、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、成骨肉瘤或其组合。
8.一种p53基因检测试剂的用途，其特征在于，用于制备诊断试剂或诊断试剂盒，所述诊断试剂或诊断试剂盒用于(a)判断PEITC治疗效果，和/或(b)判断肿瘤患者是否适合用PEITC进行治疗。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)容器A，以及位于容器A中的PEITC或含PEITC的药物；
(b)容器B，以及位于容器B中的p53基因检测试剂；
(c)说明书。
10.一种体外非治疗性地抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i)提供一肿瘤细胞，检测所述肿瘤细胞p53基因的突变情况，如果所述肿瘤细胞的p53为突变型时，进行步骤(ii)；
(ii)在PEITC存在的条件下，培养所述肿瘤细胞。
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