CN110538173A - 异硫氰酸酯类化合物在制备食管癌靶向药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异硫氰酸酯类化合物在制备食管癌靶向药中的应用,旨在解决p53基因突变的食管鳞癌患者丢失wtp53抑癌功能的技术问题。本发明将异硫氰酸酯类化合物应用于制备p53突变型食管癌药物中,并阐明了其再活化mutp53的分子机制,为mutp53食管癌患者的靶向治疗奠定基础,能够在一定程度上改善患者的生存率及生存质量,进而减轻个人、家庭及社会的压力,同时也减轻家庭及社会的经济负担。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域,具体涉及异硫氰酸酯类化合物(Isothiocyanates,ITCs)在制备治疗食管癌的靶向药中的应用。
背景技术
食管癌是严重威胁人类生命健康的消化系统肿瘤,我国每年有16~20万人死于食管癌,占全世界食管癌患者的50%左右。从病理组织学角度可以分为食管鳞癌和食管腺癌,在高发病率的中国,大约90%以上的食管癌患者属于食管鳞癌,5年总体生存率为15%~34%。
近年来,我国在食管癌的诊断、外科手术、放射治疗和化学治疗等方面取得了令人瞩目的成绩。但是,外科手术仅凭经验判断,缺乏对正常细胞和肿瘤细胞的选择性,不仅伤害正常器官,而且破坏自身的免疫系统;放射治疗通过放射线抑制肿瘤生长,对增殖旺盛的正常组织也具有杀伤性,且重要脏器有一定的局限性;化学治疗毒副作用大,机体丧失对肿瘤的自我保护屏障。此外,化疗加剧了肿瘤细胞基因组的不稳定性,还会造成肿瘤细胞对化学药物的耐药性。传统治疗对肿瘤细胞和正常细胞“无差别”方式的杀伤,导致食管癌的治疗效果欠佳。因此,精准医疗在食管癌临床治疗上成为重要的发展方向。
随着现代医学技术的快速发展,自90年代分子靶向治疗开始应用于恶性肿瘤。分子靶向治疗是指使用小分子化合物、单克隆抗体、多肽等物质特异性干预调节肿瘤细胞生物学行为的信号通路,从而抑制肿瘤发展。靶向药物能够特异性的识别过度表达的肿瘤细胞,并抑制其过度增殖、浸润和远端转移,治疗恶性肿瘤疗效明显。目前,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂、表皮生长因子受体单克隆抗体、血管内皮生长因子受体单克隆抗体、环氧化酶-2抑制剂等靶向药物已经应用于食管癌的分子靶向治疗。
然而,食管癌的发生发展是一个复杂的过程,存在多重的致癌机理,因而尚存在很多潜在的靶点可以被阻断或抑制,新一代靶点的开发和低成本靶向药物的研制是食管癌治疗的重要研究方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何为食管癌的治疗提供一种新型的靶向药物,以低成本的实现食管癌的精确治疗。
本发明的技术研究思路为:
抑癌基因p53是一种与人类肿瘤发生最为密切的转录因子,在受到外界信号如DNA损伤、致癌物质和缺氧等刺激时,野生型p53(wild-type p53,wtp53)发挥细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡、介导细胞衰老、维护基因组稳定和错配DNA碱基修复等功能;但p53发生突变后,突变型(mutant p53,mutp53)功能获得后可增强肿瘤的发生、侵袭及转移;食管鳞癌患者存在大约50%的p53 基因突变,且吸烟、饮酒患者突变率更高。
因此,以p53 基因作为潜在的靶点,寻找将突变p53功能恢复的靶向药进行精准治疗具有重大意义。本发明研究发现异硫氰酸酯类化合物能够应用于制备治疗或预防食管癌的靶向药,以解决p53 基因突变的食管鳞癌患者丢失wtp53抑癌功能的技术问题,为mutp53食管癌患者的靶向治疗奠定基础。
为解决上述技术问题,采用的具体技术方案如下:
根据异硫氰酸酯类化合物能够通过“WT-like”结构改变再激活p53依赖的转录活性,将异硫氰酸酯类化合物应用于治疗食管癌的靶向药的制备当中。
所述异硫氰酸酯类化合物优选苄基异硫氰酸酯(Benzyl isothiocyanate,BITC)和/或苯乙基异硫氰酸酯(Phenethyl Isothiocyanate,PEITC)。
所述异硫氰酸酯类化合物尤其适用的食管癌种类为p53突变型。
进一步的,所述p53突变型为p53蛋白第248位的R突变为Q。
与现有技术相比,本发明的主要有益技术效果在于:
1. 本发明研究阐明了其日常生活中可食用且来源广泛的十字花科蔬菜中提取的ITCs活化mutp53的分子机制(通过“WT-like”结构改变再激活p53依赖的转录活性),为ITCs靶向预防及治疗p53突变型食管癌奠定了坚实的基础。
2. 本发明研究发现了对于mutp53的食管鳞癌细胞系,ITCs可以阻滞其细胞周期于G2/M期并诱导mutp53结构发生变化,可再活化mutp53的功能,但对具有wtp53的食管鳞癌细胞效果不佳,ITCs在mutp53的食管鳞癌预防、发生、发展中具有极其重要的作用和临床价值。
3. 本发明为具有潜在癌症风险的人群提供新的、便捷、低成本的防治方法,为食管癌患者(尤其是mutp53患者)提供有效的治疗策略。
4. 本发明将低成本来源的异硫氰酸酯类化合物应用于制备p53突变型食管癌药物中,能够在一定程度上改善患者的生存率及生存质量,进而减轻个人、家庭及社会的压力,同时也减轻家庭及社会的经济负担。
附图说明
图1为CCK-8检测BITC和PEITC对KYSE150细胞增殖的影响曲线图。
图2为CCK-8检测BITC和PEITC对EC109细胞增殖的影响曲线图。
图3为ITCs处理各细胞系后p53蛋白、p21蛋白表达变化图。
图4为BITC试验组的对照DMSO对KYSE150细胞凋亡检测图。
图5为5μM的BITC对KYSE150细胞凋亡检测图。
图6为10μM的BITC对KYSE150细胞凋亡检测图。
图7为15μM的BITC对KYSE150细胞凋亡检测图。
图8为20μM的BITC对KYSE150细胞凋亡检测图。
图9为不同浓度的BITC对KYSE150细胞凋亡统计图。
图10为PEITC试验组的对照DMSO对KYSE150细胞凋亡检测图。
图11为5μM的PEITC对KYSE150细胞凋亡检测图。
图12为10μM的PEITC对KYSE150细胞凋亡检测图。
图13为15μM的PEITC对KYSE150细胞凋亡检测图。
图14为20μM的PEITC对KYSE150细胞凋亡检测图。
图15为不同浓度的PEITC对KYSE150细胞凋亡统计图。
图16为BITC对KYSE150细胞周期的检测图;图中,从左至右依次为DMSO、5 μM的BITC、10 μM的BITC。
图17为PEITC对KYSE150细胞周期的检测图;图中,从左至右依次为DMSO、5 μM的PEITC、10 μM的PEITC。
图18为不同浓度的BITC对KYSE150细胞p21 mRNA表达的统计图。
图19为不同浓度的PEITC对KYSE150细胞p21 mRNA表达的统计图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式,但以下实施例只是用来详细阐述本发明,并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明,均为常规仪器设备;所涉及的试剂或化合物如无特别说明,均为市售常规试剂或化合物;所涉及的试验方法或细胞培养方法,如无特别说明,均为常规方法。
实施例1:对食管鳞癌细胞系敏感的ITCs化合物的筛选研究
(1)试验材料
细胞系食管鳞癌细胞KYSE150(p53R248Q)、食管鳞癌细胞EC109(p53+/+)来源于郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室。
(2)试验方法
a. 在96孔板中接种各细胞系的细胞悬液100μL/孔(每孔细胞数5000个),将培养板在37℃,5% CO2的条件下培养至细胞贴壁;
b. 以二甲基亚砜(DMSO)为对照,待细胞贴壁后分别加入10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM、100μM的苄基异硫氰酸酯(BITC)或苯乙基异硫氰酸酯(PEITC),将培养板放置在培养箱中培养24 h、48 h;
c. 向每孔加入10μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,以免影响OD值的读数);将培养板在培养箱内孵育1~4h;
d. 用酶标仪测定450nm处的吸光度,并计算细胞存活率、细胞系的半数抑制浓度(IC50值)。
(3)试验结果
BITC和PEITC对各细胞系的IC50值如表1所示。
表1 ITCs对各细胞系的半数抑制浓度(μM)
。
由表1可知,BITC和PEITC对p53突变型细胞系KYSE150(p53R248Q)的IC50值与p53野生型细胞系EC109(p53+/+)相比较低,并随着培养时间的延长,IC50值进一步降低。
CCK-8检测BITC和PEITC对KYSE150(p53R248Q)细胞增殖的影响如图1所示:与DMSO对照组相比,随着BITC和PEITC化合物浓度的增加,KYSE150(p53R248Q)细胞的增值率明显降低。
CCK-8检测BITC和PEITC对EC109(p53+/+)细胞增殖的影响如图2所示:与DMSO对照组相比,随着BITC和PEITC化合物浓度的增加,EC109(p53+/+)细胞的增值率降低,但降低趋势较图1不明显。
实施例2: BITC和PEITC对食管鳞癌细胞系p53蛋白、p21蛋白表达的影响验证
(1)试验分组
a. 在10cm细胞培养皿中接种各细胞系的细胞,按1×105/ml细胞浓度铺板,将培养皿在37℃,5% CO2的条件下培养至细胞贴壁;
b. 以二甲基亚砜(DMSO)为对照组,待细胞贴壁后分别加入10μM、50μM的BITC或PEITC为试验组,将培养皿放置在培养箱中培养24 h。
(2)试验方法
(I)总蛋白提取、蛋白浓度测定
a. 从细胞培养箱中分别取出实验组及对照组细胞,制成细胞悬液,将计数板放入自动细胞计数仪中记数;记数后将培养瓶的细胞悬液抽取到离心管中,1000rpm,离心5min,将上清弃去;
b. 沉淀后的细胞加入1mL PBS后吹散、混匀,转移至1.5mL EP管中加入1mL PBS洗涤2遍弃去上清,务必将PBS吸取干净;
c. 取出细胞裂解液(RIPA)、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂待融化后颠倒混匀数次,混匀后置于冰上,按1×106细胞需要加100uL的细胞裂解液+1uL蛋白酶抑制剂+1µL磷酸酶抑制剂的比例,加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂到细胞团中(在冰上完成);
d. 充分混匀后,置于4℃条件下的冰上,静置30min,每隔10min将混悬液用手指轻弹数次;静置后放入低温离心机,4℃、12000rpm、离心15min;
e. 离心后,上清液即为蛋白质,将上清液50uL移入EP管中进行蛋白浓度测定,剩余上清液全部移入另一个EP管中放入-80℃冰箱中备用。
f. 采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,按照说明书进行操作;测完蛋白浓度后,计算含有30μg蛋白的溶液体积即为上样量。
(II) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
a. 按照SDS-聚丙烯酰胺凝胶试剂盒说明书制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶;将胶放入电泳槽中,加入电泳液,内侧电泳液要没过玻璃板,外侧电泳液至少没过小玻璃板;
b. 用微量加样器吸取30μg样品,不要吸入气泡,将枪头倾斜插入加样孔缓慢加入,避免样品溢出,然后在样品两侧加入5μL Maker;
c. 将电压调至80V恒压,电泳时间大约30min,待溴酚蓝进入分离胶后,将电压调整至120V恒压,电泳约60min直至溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳。
(III) 转膜
a. 将玻璃板从电泳槽中取出,小心撬开玻璃板,依据猜测与燃蛋白Marker指示的分子量位置,用切胶刀切取含有目的蛋白的凝胶,置于预冷的转膜缓冲液中,同时切取1张与胶同样大小的PVDF膜及6张滤纸,将PVDF膜置于甲醇中10~20s激活;
b. 按照如下顺序制作“三明治”结构,从转膜夹负极(黑色面板)开始:黑色面板:海绵:滤纸:胶:PVDF膜:滤纸:海绵。逐层赶走气泡,将转膜夹夹紧,放入预先加入预冷的Blottingbuffer转膜夜的转印槽内,300mA冰上转膜约60min。
(IV) 封闭、抗体孵育及显影
a. 配制适量含5%的脱脂奶粉的TBST封闭液,然后加入封闭盒中;
b. 将转膜结束后的PVDF膜取出,做好标记,按照目的蛋白分子量将膜切开转入一抗孵育盒,将切开的PVDF膜走好标记;根据一抗说明书要求用封闭液稀释一抗,加入相应装有PVDF膜的孵育盒内,放入4℃冰箱内过夜;
c. 第二天将孵育盒从冰箱中取出,将一抗稀释液吸出移入离心管中回收(回收后放入-20℃冻存),加入适量TBST摇床上洗膜3次,每次10min;用TBST稀释相应种属二抗,加入孵育盒,放在摇床室温缓慢孵育1h;吸出二抗,用TBST洗膜3次,每次10min;
d. 在暗房中将发光液均匀涂在PVDF膜上,放入机器中显影。
(3)试验结果
如图3所示:KYSE150(p53R248Q)细胞加入不同浓度BITC或PEITC后wtp53蛋白表达水平升高(P<0.05),mutp53蛋白表达水平下降(P<0.05),p21蛋白表达水平升高(P<0.05),而EC109(p53+/+)细胞加入不同浓度BITC或PEITC后wtp53蛋白、mutp53蛋白和p21蛋白均无明显变化(P>0.05)。
实施例3: BITC和PEITC对KYSE150(p53R248Q)细胞凋亡的影响研究
(1)试验分组
a. 在10cm细胞培养皿中接种KYSE150(p53R248Q)细胞,按1×105/ml细胞浓度铺板,将培养皿在37℃,5%CO2的条件下培养至细胞贴壁;
b. 以二甲基亚砜(DMSO)为对照组,待细胞贴壁后分别加入5μM、10μM、15μM、20μM的BITC或PEITC为试验组,将培养皿放置在培养箱中培养12 h。
(2)试验方法
a. 收集分别经BITC、PEITC化合物作用12h后的细胞,使用不含EDTA胰酶消化收集;用PBS洗涤细胞2次(2000rmp离心5min),收集1~5×105细胞;
b. 加入500μL的Bingding Buffer悬浮细胞;加入5μL Annexin V-FITC混匀后,加入5μL Propidium Iodide,混匀;
c. 室温、避光、反应5~15min;在1h内使用流式细胞仪进行检测。
(3)试验结果
BITC对KYSE150(p53R248Q)细胞凋亡的影响如图4~9所示。PEITC对KYSE150(p53R248Q)细胞凋亡的影响如图10~15所示。
可知:BITC和PEITC可引起KYSE150(p53R248Q)细胞凋亡,且其作用具有浓度依赖性。
实施例4: BITC和PEITC对KYSE150(p53R248Q)细胞周期的影响验证研究
(1)试验分组
a. 在10cm细胞培养皿中接种KYSE150(p53R248Q)细胞,按1×105/ml细胞浓度铺板,将培养皿在37℃,5%CO2的条件下培养至细胞贴壁;
b. 以二甲基亚砜(DMSO)为对照组,待细胞贴壁后分别加入5μM、10μM的BITC或PEITC为试验组,将培养皿放置在培养箱中培养12h。
(2)试验方法
a. 收集分别经BITC、PEITC化合物作用12h后的细胞,使用EDTA胰酶消化收集;根据样本数量,计算所需要的染色工作液体积,每样本500μL工作液孵育;临用前将Rnase A:PI工作液按1:9体积配制染色工作液;
b. 用PBS洗涤细胞一次(2000rmp离心5min),收集并调整细胞浓度为1×106/mL细胞;制备的单细胞悬液离心后,去上清,在细胞中加入体积分数为70%冷乙醇500μL固定(2小时至过夜),4℃保存,染色前用PBS洗去固定液;
c. 加入提前配制好的500μL PI/RNase A染色工作液,室温避光30~60min;
d. 流式细胞仪检测上机检测,记录激发波长488nm处红色荧光。
(3)试验结果
如图16和17所示,BITC和PEITC可以导致KYSE150(p53R248Q)细胞周期阻滞在G2/M期,且其作用具有浓度依赖性。
如图16所示, 经DMSO处理的KYSE150(p53R248Q)细胞对照组(左)的细胞周期分布为:G0/G1期37.69%,S期57.89%,G2/M期4.39%;经5μM(中)BITC处理的KYSE150(p53R248Q)细胞的细胞周期分布为:G0/G1期30.99%,S期35.65%,G2/M期33.37%;经10μM(右)BITC处理的KYSE150(p53R248Q)细胞的细胞周期分布为:G0/G1期9.95%,S期36.49%,G2/M期53.58%。
如图17所示,经DMSO处理的KYSE150(p53R248Q)细胞对照组(左)的细胞周期分布为:G0/G1期29.56%,S期67.01%,G2/M期3.44%;经5μM(中)PEITC处理的KYSE150(p53R248Q)细胞的细胞周期分布为:G0/G1期30.20%,S期46.07%,G2/M期23.72%;经10μM(右)BITC处理的KYSE150(p53R248Q)细胞的细胞周期分布为:G0/G1期13.62%,S期40.48%,G2/M期45.91%。
由此可见,BITC和PEITC可以导致KYSE150(p53R248Q)细胞周期阻滞在G2/M期,且其作用具有浓度依赖性。
实施例5: BITC和PEITC对KYSE150(p53R248Q)细胞p53下游靶基因p21表达的影响研究
(1)试验分组
a. 在10cm细胞培养皿中接种KYSE150(p53R248Q)细胞,按1x105/ml细胞浓度铺板,将培养皿在37℃,5%CO2的条件下培养至细胞贴壁;
b. 以二甲基亚砜(DMSO)为对照组,待细胞贴壁后分别加5μM、10μM、20μM、30μM的BITC或PEITC为试验组,将培养皿放置在培养箱中培养24h。
(2)试验方法
a. Trizol法提取KYSE150(p53R248Q)细胞的RNA;
b. RNA反转录为cDNA:Total RNA量按照1μg的量,V=1000/C(RNA浓度)
a)去除基因组DNA反应:于冰上配制反应混合液,如表2所示,反应条件42℃ 2min或室温30min。
表2 反应体系
试剂 | 使用量 |
5xgDNA Eraser Buffer | 2.0μl |
gDNA Eraser | 1.0μl |
Total RNA | V |
RNase Free dH<sub>2</sub>O | up to 10μl |
b)反转录反应,反应体系如表3所示。
表3 反应体系
试剂 | 使用量 |
步骤1的反应液 | 10.0μl |
PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0μl |
RT Primer Mix | 1.0μl |
5x PrimeScript Buffer 2(for Real Time) | 4.0μl |
RNase Free dH<sub>2</sub>O | 4.0μl |
Total | 20.0μl |
反应条件为:37℃15min;85℃ 5sec;4℃∞。
c)Real Time PCR,反应体系如表4所示。
表4 反应体系
试剂 | 使用量 | 终浓度 |
FastStart Green(2x) | 10μl | 1x |
PCR F Primer(10μM) | 0.8μl | 0.4μM |
PCR R Primer(10μM) | 0.8μl | 0.4μM |
cDNA | 2μl | -- |
H<sub>2</sub>O | 6.4μl | -- |
PCR的引物序列如下:
PCR F Primer:TGTCCGTCAGAACCCATGC;
PCR R Primer:AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC。
两步法PCR扩增标准程序的反应条件为:
Stage 1:预变性;Repeat:1,50℃ 2min;95℃10min;
Stage 2:PCR反应;Repeat:40,95℃30sec;60℃ 30sec;72℃ 30sec;
Stage 3:Dissociation。
d)分析实验数据,绘图。
(3)试验结果
如图18所示,与DMSO对照组相比,KYSE150(p53R248Q)细胞加入不同浓度BITC后,靶基因p21表达升高(P<0.05),且在一定药物浓度范围内表现出药物浓度依赖性。
如图19所示,与DMSO对照组相比,KYSE150(p53R248Q)细胞加入不同浓度PEITC后,靶基因p21表达升高(P<0.05),且表现出药物浓度依赖性。
即,与DMSO对照组相比,BITC和PEITC可以导致KYSE150(p53R248Q)细胞p53下游靶基因p21表达上调,差异具有统计学意义。可知,BITC和PEITC可通过“WT-like”结构改变再激活p53依赖的转录活性。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明;但是,所属技术领域的技术人员能够理解,在不脱离本发明宗旨的前提下,还可以对上述实施例中的各个具体成分、参数或工艺步骤进行同等或类似变更,形成多个具体的实施例,均为本发明的常见变化范围,在此不再一一详述。
Claims (6)
1.异硫氰酸酯类化合物在制备食管癌靶向药中的应用。
2.根据权利要求1所述的异硫氰酸酯类化合物在制备食管癌靶向药中的应用,其特征在于,所述异硫氰酸酯类化合物为苄基异硫氰酸酯和/或苯乙基异硫氰酸酯。
3.根据权利要求1所述的异硫氰酸酯类化合物在制备食管癌靶向药中的应用,其特征在于,所述食管癌的种类为p53突变型。
4.根据权利要求3所述的异硫氰酸酯类化合物在制备食管癌靶向药中的应用,其特征在于,所述p53突变型为p53蛋白第248位的R突变为Q。
5.一种食管癌靶向药,含异硫氰酸酯类化合物。
6.根据权利要求5所述的食管癌靶向药,其特征在于,所述异硫氰酸酯类化合物为苄基异硫氰酸酯和/或苯乙基异硫氰酸酯。
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JERALD T.WILKINSON等: "Effect of alkyl chain length on inhibition of N-nitrosomethylbenzylamine-induced esophageal tumorigenesis and DNA methylation by isothiocyanates", 《CARCINOGENESIS》 * |
XIANTAO WANG等: "Selective depletion of mutant p53 by cancer chemopreventive isothiocyanates and their structure-activity relationships", 《J MED CHEM.》 * |
周骊等: "番木瓜种子中异硫氰酸苄酯(BITC)的抑癌试验", 《热带生物学报》 * |
毛伟敏等主编: "《食管癌临床多学科综合诊断与鉴别诊断》", 31 January 2015, 军事医学科学出版社 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN115737621A (zh) * | 2022-11-25 | 2023-03-07 | 陕西科技大学 | 异硫氰酸苄酯靶向结合蛋白及其应用 |
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