CN109825587B - 一种胶质瘤预后标志物cpvl及其应用 - Google Patents
一种胶质瘤预后标志物cpvl及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胶质瘤预后标志物CPVL及其应用，现提出如下方案，一种胶质瘤预后标志物CPVLmRNA，检测标志物CPVLmRNA在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂的应用，一种胶质瘤预后试剂盒，能够检测胶质瘤组织中的标志物CPVLmRNA的含量，包含有用于检测标志物CPVLmRNA的含量的PCR引物，一种胶质瘤预后标志物CPVLmRNA的应用。本发明能够有效的验证CPVL敲减能促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤能力，调节胶质瘤细胞周期，CPVL敲减诱导胶质瘤细胞凋亡，阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意，致癌基因CPVL在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，从而为胶质瘤的治疗提供一个潜在的治疗靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胶质瘤预后标志物CPVL及其应用。
背景技术
胶质瘤是临床上最常见的颅内恶性肿瘤。由于各种理化、遗传等因素的影响，胶质瘤的发病率常居于颅内肿瘤首位，占颅脑肿瘤的50％左右。胶质瘤因具有发病隐匿，生长速度快，易侵袭与转移，病死率高，平均生存期短等特点，已经成为了对人生命健康造成极大危害的疾病类型。目前采用的手术切除及放、化疗等传统疗法并未明显改善胶质瘤患者的预后效果，一直是中枢神经系统恶性肿瘤治疗中的一大难题，其根本原因在于胶质瘤的发病机制还不完全清楚。因此，阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的缺点，而提出的一种胶质瘤预后标志物CPVL及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种胶质瘤预后标志物CPVLmRNA，其序列号如表1所示。
检测标志物CPVLmRNA在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂的应用。
一种胶质瘤预后试剂盒，能够检测胶质瘤组织中的标志物CPVLmRNA的含量，包含有用于检测标志物CPVLmRNA的含量的PCR引物，其序列号如表2所示。
一种胶质瘤预后标志物CPVLmRNA的应用，包含以下步骤，其步骤如下：
S1:检测CPVLmRNA在样品中的表达，其中样品包括正常脑细胞、胶质瘤细胞、五对胶质瘤及癌旁正常脑细胞；
将样品铺于细胞6孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞长满，提取各细胞的总RNA，应用real-timePCR技术对样品的CPVL基因进行检测；同时提取各样品细胞的总蛋白，利用WesternBlot技术对不同样品中CPVL基因表达的蛋白进行检测。
S2:对胶质瘤标本进行CPVL蛋白表达的检测和分析；
收集经病理确诊的不同病理分级和恶性程度的胶质瘤组织标本各10例以及10例因脑外伤行减压术后的正常脑组织标本，根据WHO神经系统肿瘤分类病理标准，Ⅰ-Ⅱ级为低恶性度胶质瘤，Ⅲ-Ⅳ级为高恶性度胶质瘤，提取各组织标本的总RNA，应用real-timePCR技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的CPVLmRNA进行检测；然后提取组织标本的总蛋白，利用WesternBlot技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中检测CPVLmRNA在表达的蛋白进行检测；
将各样本石蜡包埋，冰冻切片，运用免疫组化技术观察CPVLmRNA在人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的分布情况；并进一步比较CPVLmRNA表达分布情况与胶质瘤病理分期分级的相关性；
结合临床生存期随访数据，以患者直接或间接因胶质瘤疾病“死亡”作为终点事件，计算3年累计生存概率；根据各样本CPVLmRNA的real-timePCR表达量数据将样本分为高表达组和低表达组，以回访时间作为x轴以累计概率作为y轴绘制生存曲线，分析CPVLmRNA表达与胶质瘤患者临床预后的相关性。
S3:对样品胶质瘤细胞进行感染
对CPVLmRNA表达高的胶质瘤细胞株U251和LN382进行慢病毒感染。
S4:将S3感染后的胶质瘤细胞进行克隆形成实验；
将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；以每孔100、200、300个细胞的梯度密度分别接种于3个细胞6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养14天后，经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去上清液，用PBS清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟；然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；观察染色和克隆大小，计数并计算克隆形成率。
S5:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞增殖实验
运用MTT法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，另外设6个只有100μl完全培养基的空白孔做基准值；实验开始时共铺5块板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；自培养第二天开始，每天用MTT法检测一块板；MTT检测方法：培养终止前4h加入20μL5mg/mL的MTT于孔中，无需换液；4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μLDMSO溶解甲瓒颗粒；振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值。
运用Celigo细胞计数法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，置于37℃、5％CO2培养箱培养；从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；通过调整analysissettings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
S6:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞周期实验
运用PI-FACS法检测细胞周期，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板。待细胞贴壁后饥饿处理14h后加入完全培养基培养，待细胞进入对数生长期；胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS重悬，再次离心弃上清，共2次；加入预冷70％乙醇，固定3小时；离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500μlPBS含50μg/mL溴化乙锭(PI)，100μg/mLRNaseA，0.2％TritonX-100，4℃避光孵育30分钟；以标准程序用流式细胞仪检测。
S7:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞凋亡实验
运用AnnexinV-APC单染法检测细胞凋亡，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板；待细胞生长状态良好，胰酶消化，离心；在室温下用PBS洗涤(1500rpm/min,离心5min)；用500μlbindingbuffer重悬细胞，加入10μlAnnexin-Vmediumbuffer及1μlAnnexinV荧光抗体，常温避光孵育15min后离心；用PBS洗涤后，500μlbindingbuffer重悬细胞，在1h内用流式细胞术检测并进行数据分析。
S8:将S3感染后的胶质瘤细胞进行回复实验
在U251和LN382细胞中沉默CPVL基因，利用S3、S4、S5、S6和S7的步骤进行试验，并记录检测后的细胞增殖数据。
本发明的有益效果：
该发明能够有效的验证CPVL敲减能促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤能力，调节胶质瘤细胞周期，CPVL敲减诱导胶质瘤细胞凋亡，阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意，致癌基因CPVL在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，从而为胶质瘤的治疗提供一个潜在的治疗靶点。
附图说明
图1为CPVLmRNA在胶质瘤细胞和正常脑细胞的表达示意图；
图2为采用real-timePCR技术检测脑胶质瘤细胞株U251、LN382和U87MG中CPVLmRNA的相对表达示意图；
图3为采用WesternBlot技术检测CPVL在正常脑细胞HEB和胶质瘤细胞系U251、LN382和U87MG中表达的示意图；
图4为采用WesternBlot技术检测CPVL在胶质瘤组织T和邻近非癌组织ANT中的蛋白表达的示意图；
图5为采用real-timePCR技术检测脑胶质瘤低临床分期和高临床分期标本中CPVLmRNA的相对表达的示意图；
图6为采用WesternBlot技术分析CPVL在低临床期和高临床期脑胶质瘤中的表达的示意图；
图7采用免疫组化分析CPVL蛋白在胶质瘤组织T和邻近非癌组织ANT中的表达的示意图；
图8为采用免疫组化分析CPVL在正常脑组织和不同临床分期的胶质瘤组织中CPVL表达的示意图；
图9为Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验生存的示意图；
图10为采用real-timePCR技术检测在U251和LN382细胞中敲除CPVL后CPVLmRNA的相对表达的示意图；
图11为采用WesternBlot技术检测在U251和LN382细胞中敲除CPVL后CPVL蛋白表达的示意图；
图12为U251和LN382细胞中敲除CPVL后在进行克隆实验的克隆数量记录的示意图；
图13为U251和LN382细胞中敲除CPVL后在进行克隆实验的对照的示意图；
图14为采用流式细胞仪检测U251和LN382细胞中敲除CPVL后细胞的凋亡细胞百分率的示意图；
图15为采用流式细胞术检测U251和LN382细胞中敲除CPVL后细胞的G1、G2/M期细胞百分比的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-15，一种胶质瘤预后标志物CPVLmRNA，其序列号如表1所示。
表1：
检测标志物CPVLmRNA在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂的应用。
一种胶质瘤预后试剂盒，能够检测胶质瘤组织中的标志物CPVLmRNA的含量，包含有用于检测标志物CPVLmRNA的含量的PCR引物，其序列号如表2所示。表1：
一种胶质瘤预后标志物CPVLmRNA的应用，包含以下步骤，其步骤如下：
S1:检测CPVLmRNA在样品中的表达，其中样品包括正常脑细胞、胶质瘤细胞、五对胶质瘤及癌旁正常脑细胞；
将样品铺于细胞6孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞长满，提取各细胞的总RNA，应用real-timePCR技术对样品的CPVL基因进行检测；同时提取各样品细胞的总蛋白，利用WesternBlot技术对不同样品中CPVL基因表达的蛋白进行检测。
S2:对胶质瘤标本进行CPVL蛋白表达的检测和分析；
收集经病理确诊的不同病理分级和恶性程度的胶质瘤组织标本各10例以及10例因脑外伤行减压术后的正常脑组织标本，根据WHO神经系统肿瘤分类病理标准，Ⅰ-Ⅱ级为低恶性度胶质瘤，Ⅲ-Ⅳ级为高恶性度胶质瘤，提取各组织标本的总RNA，应用real-timePCR技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的CPVLmRNA进行检测；然后提取组织标本的总蛋白，利用WesternBlot技术对人脑胶质瘤组织和正常脑组织中检测CPVLmRNA在表达的蛋白进行检测；
将各样本石蜡包埋，冰冻切片，运用免疫组化技术观察CPVLmRNA在人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的分布情况；并进一步比较CPVLmRNA表达分布情况与胶质瘤病理分期分级的相关性；
结合临床生存期随访数据，以患者直接或间接因胶质瘤疾病“死亡”作为终点事件，计算3年累计生存概率；根据各样本CPVLmRNA的real-timePCR表达量数据将样本分为高表达组和低表达组，以回访时间作为x轴以累计概率作为y轴绘制生存曲线，分析CPVLmRNA表达与胶质瘤患者临床预后的相关性。
S3:对样品胶质瘤细胞进行感染
对CPVLmRNA表达高的胶质瘤细胞株U251和LN382进行慢病毒感染。
S4:将S3感染后的胶质瘤细胞进行克隆形成实验；
将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数；以每孔100、200、300个细胞的梯度密度分别接种于3个细胞6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀；置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养14天后，经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去上清液，用PBS清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟；然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色15分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；观察染色和克隆大小，计数并计算克隆形成率。
S5:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞增殖实验
运用MTT法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，另外设6个只有100μl完全培养基的空白孔做基准值；实验开始时共铺5块板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；自培养第二天开始，每天用MTT法检测一块板；MTT检测方法：培养终止前4h加入20μL5mg/mL的MTT于孔中，无需换液；4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μLDMSO溶解甲瓒颗粒；振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值。
运用Celigo细胞计数法检测细胞增殖，预计检测5天；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；对照慢病毒组和CPVL慢病毒组以2000cells/well分别接种6个孔于96孔板，每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致，置于37℃、5％CO2培养箱培养；从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；通过调整analysissettings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
S6:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞周期实验
运用PI-FACS法检测细胞周期，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板。待细胞贴壁后饥饿处理14h后加入完全培养基培养，待细胞进入对数生长期；胰酶消化，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS重悬，再次离心弃上清，共2次；加入预冷70％乙醇，固定3小时；离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500μlPBS含50μg/mL溴化乙锭(PI)，100μg/mLRNaseA，0.2％TritonX-100，4℃避光孵育30分钟；以标准程序用流式细胞仪检测。
S7:将S3感染后的胶质瘤细胞进行细胞凋亡实验
运用AnnexinV-APC单染法检测细胞凋亡，两实验组细胞各接种3个孔于细胞6孔板；待细胞生长状态良好，胰酶消化，离心；在室温下用PBS洗涤(1500rpm/min,离心5min)；用500μlbindingbuffer重悬细胞，加入10μlAnnexin-Vmediumbuffer及1μlAnnexinV荧光抗体，常温避光孵育15min后离心；用PBS洗涤后，500μlbindingbuffer重悬细胞，在1h内用流式细胞术检测并进行数据分析。
S8:将S3感染后的胶质瘤细胞进行回复实验
在U251和LN382细胞中沉默CPVL基因，利用S3、S4、S5、S6和S7的步骤进行试验，并记录检测后的细胞增殖数据。
本发明中：采用real-timePCR技术和利用WesternBlot技术检测CPVL在正常脑细胞、胶质瘤细胞、五对胶质瘤及癌旁正常脑组织中的表达，应用免疫组化技术对179例石蜡包埋的胶质瘤标本进行CPVL蛋白表达分析，然后采用MTT法、克隆形成实验及裸鼠成瘤实验探讨CPVL对胶质瘤细胞增殖和致瘤能力的影响，同时运用流式细胞术分析CPVL对胶质瘤细胞凋亡和细胞周期的影响，最终利用回复实验来验证CPVL对胶质瘤细胞凋亡和细胞周期的影响的结果。
实验表明与正常脑细胞和组织相比，胶质瘤细胞及组织中CPVL表达显著上调，免疫组织化学分析显示CPVL的表达与临床晚期和较差的存活率显著相关，CPVL敲减能促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤能力，调节胶质瘤细胞周期，CPVL敲减诱导胶质瘤细胞凋亡，该发明能够有效的验证CPVL敲减能促进胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤细胞增殖和致瘤能力，调节胶质瘤细胞周期，CPVL敲减诱导胶质瘤细胞凋亡，阐明胶质瘤的发病机制具有重要的理论和实践意，致癌基因CPVL在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，从而为胶质瘤的治疗提供一个潜在的治疗靶点。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.胶质瘤预后标志物CPVLmRNA在制备胶质瘤预后制剂的应用，所述胶质瘤预后标志物CPVLmRNA的核酸序列如表1所示。
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