CN111575385A

CN111575385A - Sb290157在卵巢上皮性癌疾病中的应用

Info

Publication number: CN111575385A
Application number: CN202010566750.0A
Authority: CN
Inventors: 孙静; 李昂; 韩凌斐; 杨倩楠; 于博骏
Original assignee: Shanghai First Maternity and Infant Hospital
Current assignee: Shanghai First Maternity and Infant Hospital
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-06-19
Also published as: CN111575385B

Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，具体是SB290157在卵巢上皮性癌疾病中的应用，本发明通过实验首次发现了卵巢上皮性癌的一种诊断标志物C3及其受体C3AR，实验结果表明卵巢上皮性癌肿瘤组织中C3、C3AR表达明显增加，卵巢上皮性癌的表达量与卵巢上皮性癌组织中MDSC的浸润成正相关，且还发现了卵巢上皮性癌组织中C3、C3AR的表达量与MDSC相关的免疫抑制基因S100A8、S100A9、IL‑10、TGF‑β的表达成正相关。C3a受体拮抗剂SB290157可用于有效的治疗卵巢上皮性癌疾病，为该类患者带来了新的治疗方法，可有效减轻该类患者的痛苦，实用性强，应用前景广。

Description

SB290157在卵巢上皮性癌疾病中的应用

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，具体地说，是SB290157在卵巢上皮性癌疾病中的应用。

背景技术

卵巢上皮癌是常见的妇科恶性肿瘤，占卵巢肿瘤的50％-70％。由于EOC早期(I、II期)缺乏典型临床表观，76％的病人在发现时已有腹腔内种植，肝实质和/或胸腔、颅内转移(III、IV期)这是导致较高病死率的主要原因，早期诊断率的提高有赖于B超、血清CA一125检测等手段普查，但目前国内众多医院尚不具备这种条件。根据EOC分期、分级不同，正确选择手术及比疗方法有利于提高病人生存期。早期癌多无明显症状，当盆腔肿瘤增大并向腹腔播散时可出现腹胀、腹痛、腹部肿块，部分病例可有月经不调或不规则出血。较晚期的病人可有消瘦、低热、食欲缺乏及胃肠功能紊乱等症状。盆腔检查可触及囊实性肿块，尤其在子宫直肠陷凹内可触及结节或实性块，固定不动。部分病例可触及腹部肿块，并可有腹水及胸水存在。

SB290157是一种小分子化合物，其化学式是C₂₄H₂₉F₃N₄O₆。SB290157是一种有效的选择性C3a受体拮抗剂，IC50为200nM。目前关于SB290157的研究及应用主要在以下方面：①SB290157具有神经保护功能，可用于血栓栓塞时静脉溶栓治疗的辅助治疗、脑出血时的神经保护功能、阿尔茨海默病以及小血管疾病和血管性痴呆；②SB290157可减轻Abelcet引起的高血压，具有降低血压的应用前景；③SB290157与阿片受体激动剂联合使用可产生无耐受性的强效止痛剂；④SB290157可能是一种治疗早期年龄相关性黄斑变性的方法；⑤SB290157可抑制饮食诱导的肥胖、代谢功能障碍以及脂肪细胞和巨噬细胞信号转导；⑥SB290157具有抗炎作用，具有抑制关节炎、抑制晚期哮喘反应和气道高反应的应用前景；⑦SB290157具有治疗狼疮性肾炎的应用前景；⑧SB290157可以作为一种药物调动造血干细胞的移植等。

现有关于C3AR拮抗剂SB290157的研究很多，但缺乏SB290157在肿瘤治疗应用中的相关研究，也没有SB290157在治疗卵巢上皮性癌中的应用。

本发明通过研究SB290157在卵巢癌发生发展中的作用，为卵巢癌的药物治疗提供新策略。关于本发明SB290157在卵巢上皮性癌疾病中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种卵巢上皮性癌的新的诊断标志物及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供了补体C3、C3AR分子作为诊断标志物在制备预测、诊断或预后卵巢上皮性癌的试剂中的应用。

进一步地，本发明提供了补体C3、C3AR分子抑制剂在制备治疗卵巢上皮性癌的试剂盒中的应用。

优选地，所述的补体C3、C3AR分子抑制剂是抑制补体C3、C3AR分子的表达量的物质。

优选地，所述的补体C3、C3AR分子抑制剂选自小分子化合物或生物大分子。

更优选地，所述的生物大分子是以补体C3、C3AR蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制补体C3、C3AR蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

再优选地，所述的补体C3、C3AR分子抑制剂是SB290157。

第二方面，补体C3、C3AR分子抑制剂在制备抑制MDSC浸润的试剂盒中的应用。

第三方面，补体C3、C3AR分子抑制剂在制备抑制S100A8、S100A9、IL-10、TGF-β基因表达的试剂盒中的应用。

第四方面，补体C3、C3AR分子抑制剂在制备促进T细胞浸润的试剂盒中的应用。

优选地，所述的抑制剂是SB290157。

本发明优点在于：

本发明通过实验发现C3AR拮抗剂SB290157能够抑制MDSC相关免疫抑制基因的表达，抑制卵巢肿瘤的生长，并且促进肿瘤微环境中T细胞的浸润，因此，C3AR拮抗剂SB290157有望成为卵巢上皮性癌药物治疗的新策略。若C3AR拮抗剂SB290157应用到临床可以为千万卵巢癌患者带去福音，改善患者的预后，减轻医疗和经济负担，具有很好的应用前景。

附图说明

附图1是表明C3、C3AR在卵巢上皮性癌组织中高表达。

附图2是表明在卵巢上皮性癌组织中C3、C3AR的表达水平与MDSC的浸润呈正相关。

附图3-12是表明卵巢癌患者C3、C3AR表达水平的升高与患者的预后差有关。

附图13是卵巢上皮性癌患者外周血及肿瘤组织中MDSC表面C3AR的表达情况。

附图14是卵巢上皮性癌与正常卵巢组织中MDSC表面C3AR表达免疫荧光染色结果。

附图15是不同的卵巢癌细胞中C3分子的表达情况。

附图16是表明卵巢癌细胞培养上清促进MDSC中C3AR的表达。

附图17-18是表明C3AR通过MDSC抑制T细胞的活化。

附图19-22是表明卵巢上皮性癌中C3AR分子的表达与MDSC相关因子的表达呈正相关。

附图23是表明干扰C3/C3AR信号抑制MDSC中S100A9、COX2、iNOS的表达。

附图24是表明SB290157抑制卵巢肿瘤的生长。

附图25-26是肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例旨在大数据分析卵巢上皮性癌肿瘤组织中C3、C3AR的表达情况与MDSC浸润及患者预后之间的关系。

1研究对象与方法

通过基于TCGA和GTEx项目的癌症大数据分析网站Gene Expression ProfilingInteractiveAnalysis，分析C3、C3AR在卵巢上皮性癌组织及正常组织中的表达情况。基于PubMed、高通量测序、TCGA、UniProt等五大数据库的肿瘤免疫分析网站TISIDB，分别对卵巢上皮性癌组织中C3、C3AR的表达量与肿瘤组织中MDSC浸润情况之间的相关性进行了分析。基于TGCA、GEO以及EGA的数据的癌症大数据预后网站Kaplan Meierplotter，分析C3、C3AR的表达量与卵巢上皮性癌患者预后的关系。

2结果

2.1卵巢上皮性癌肿瘤组织中C3、C3AR的表达情况

为了研究C3、C3AR在卵巢上皮性癌组织中的表达情况，我们首先GEPIA分析基于TCGA数据库的癌症大数据，分析发现，共有426例卵巢上皮性癌组织样本和88名正常组织样本纳入研究。与正常组织相比，肿瘤组织中C3、C3AR的表达明显增加(图1)，差异有统计学意义(|Log2FC|＞1，P＜0.01)。因此，我们推测C3、C3AR可能与卵巢上皮性癌的发生发展相关。

2.2卵巢上皮性癌肿瘤组织中C3、C3AR的表达与MDSC浸润的相关性

为了研究C3、C3AR分子表达量与卵巢上皮性癌组织中MDSC的浸润之间的关系，我们分析了肿瘤免疫分析网站TISIDB中的癌症大数据。我们发现，共有307例卵巢上皮性癌样本纳入研究。通过Spearman相关性分析，我们可以发现卵巢上皮性癌组织中C3、C3AR的表达量与卵巢上皮性癌组织中MDSC的浸润成正相关(图2)，差异有统计学意义(P＜

2.2e-16)。MDSC是免疫抑制细胞，因此，我们猜想在卵巢上皮性癌可能通过C3/C3AR调控MDSC发挥免疫抑制功能发生免疫逃逸。

2.3卵巢上皮性癌组织中C3、C3AR的表达量与卵巢上皮性癌患者预后相关

随后，我们想进一步研究C3、C3AR分子与卵巢上皮性癌患者预后之间的关系。通过Kaplan Meier-plotter[Ovarian cancer]中卵巢上皮性癌的数据分析，我们可以发现共有1435名卵巢上皮性癌患者纳入研究。其中，C3分子低表达组共有624名患者、C3分子高表达组共有811名患者；C3AR分子低表达组1038名患者、C3AR分子高表达组397名患者。与C3分子低表达组相比，C3分子高表达组患者的无进展生存期(progression-free survival，PFS)明显缩短(图3-4)。在卵巢上皮性癌不同分期与分级中，皆可发现C3分子高表达组患者的PFS减少。C3AR分子高表达组患者的PFS亦是明显小于C3AR分子低表达组患者，且在卵巢上皮性癌的不同的分期与分级中具有相似的结果(图5-12)。

实施例2

本实施例旨在检测健康志愿者、卵巢上皮性癌患者术前外周血及肿瘤局部MDSC表面C3AR分子的表达情况。

1研究对象及分组

研究对象包括来自上海市第一妇婴保健院经临床病理切片检查确诊的卵巢上皮性癌患者和来医院参加体检的健康育龄女性对照。

2方法

2.1外周血及肿瘤组织中MDSC表面C3AR分子的表达情况的测定

2.1.1样品的采集及预处理

外周血的采集与处理：研究对象在知情同意的情况下，采集静脉血5ml于抗凝管中，用等体积的PBS稀释。在干净的离心管中加入等体积的分离液。将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。室温，水平转子500～1000g，离心20～30min。离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mlPBS洗涤白膜层细胞。250g离心10min.弃上清，5ml的PBS重悬细胞，250g离心10min。重复上一步骤，弃上清，细胞重悬备用。

肿瘤组织采集与处理：取出保存在RPMI1640培养液中的肿瘤组织，放在6cm培养皿中，加入少许RPMI1640培养液，剪开肿瘤表面被膜，用剪刀彻底剪碎组织，越碎越好。1500rpm离心5min，去上清，加入配制好的胶原酶Ⅰ和Ⅳ(0.1％终浓度(1ul-1ml))消化组织，37度水浴1-2h，每10-15min摇晃一次，组织变软，1500rpm离心5min。加入10％血清配制的RPMI1640培养液中和，1500rpm离心5min，用10％血清配制的RPMI1640培养液洗一遍。将组织取出，置于12孔板中研磨，通过70um滤网过滤，1500rpm离心5min，再用PBS洗一遍，计数。300g离心10min，弃上清，用缓冲液重悬，加入Anti-SSEA-1(CD15)MicroBeads，充分混匀后，4℃孵育15min，加入缓冲液清洗。300g离心10min，弃上清，加入缓冲液重悬。将无菌管置于磁铁上，将细胞悬液加入无菌管中，待细胞悬液从无菌管中流出后，向无菌管中加入适当的缓冲液冲洗3次。将无菌管从磁铁上取下，向无菌管中加入缓冲液，向无菌管加压冲洗出被CD15磁珠标记的细胞，备用。

2.1.2流式细胞术检测MDSC表面C3AR分子的表达情况

经上述步骤提取的细胞中加入25ul配制好的CD15、C3AR抗体(1：200稀释，用flowcyte cell staining buffer配制)，4℃避光染色15min,加入200ul PBS,充分洗涤，1500rpm离心5min,去上清，用200ul PBS重悬，上机检测。

2.1.3统计与分析

FlowJo 7.6流式分析软件，数据表示为平均值±误差(SEM)，数据统计通过GraphPad软件实现，数据显著性差通过Student's t检验统计分析，P<0.05认为具有统计学差异。

3结果

3.1外周血中MDSC表面C3AR分子的表达情况

共收集卵巢上皮性癌患者外周血3份，健康志愿者外周血6份。通过流式细胞术分析可以发现，与健康志愿者相比，卵巢上皮性癌患者的外周血中，MDSC表面C3AR的表达明显升高(图13)。

3.2卵巢上皮性癌组织中MDSC表面C3AR分子的表达情况

共收集正常卵巢组织4例，卵巢上皮性癌肿瘤组织9例，通过流式细胞术分析可以发现，肿瘤组织中MDSC表面C3AR亦呈增高趋势(图13)。

实施例3

本实施例旨在检测正常卵巢组织及卵巢上皮性癌组织石蜡切片中MDSC表面C3AR分子的表达情况。

1研究对象

研究对象为既往在上海市第一妇婴保健院确诊为卵巢上皮性癌并进行手术的患者的肿瘤组织石蜡切片以及因其他疾病在上海市第一妇婴保健院行双附件切除的患者的正常卵巢组织石蜡切片。

2方法

2.1石蜡切片中MDSC表面C3AR分子的表达情况测定

2.1.1样品的采集及预处理

研究对象在知情同意下，取其术后经上海市第一妇婴保健院标本库制作好的组织石蜡切片，常温保存。

2.1.2免疫荧光染色检测MDSC表面C3AR分子的表达情况

依次将石蜡切片小心放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min,无水乙醇Ⅱ5min-95％乙醇Ⅰ5min-95％乙醇Ⅱ5min-75％乙醇Ⅰ5min-75％乙醇Ⅱ5min-PBSⅠ5min-PBSⅡ5min(以上操作均在实验通风柜中进行)。随后，将切片捞入煮沸的修复液(1L修复液：1.8mM citrate柠檬酸+8.2mM sodium citrate柠檬酸钠，单蒸水定容至1L)中，煮15min，之后取出烧杯，自然冷却约40min。取出玻片，用PBS洗3次，5min/次，用含3％H₂O₂的甲醇中，避光10min后，用PBS洗3次，5min/次，用封闭液(包括10％驴血清+0.2％Triton)常温通透封闭1h后，加一抗孵育液(由10％驴血清加CD15抗体、C3AR抗体配成)，4℃冰箱孵育过夜。第二天，将切片用PBS清洗三次后，再加二抗孵育液(10％驴血清封闭加荧光二抗、1:5000Hoechst.33342(10mg/ml))，常温孵育1h，孵育完成，PBS清洗3次。用无尘纸擦干残留的PBS，晾干后滴加封片剂进行封片。封片剂完全凝固后可在激光共聚焦显微镜(Nikon)下进行拍摄获取数据。

2.1.3统计与分析

ImageJ图像分析软件统计阳性细胞数，数据表示为平均值±误差(SEM)，数据统计通过GraphPad软件实现，数据显著性差通过Student's t检验统计分析，P<0.05认为具有统计学差异。

3结果

本研究中共收集卵巢上皮性癌组织石蜡切片30例，正常卵巢组织石蜡切片10例，通过免疫荧光染色，检测既有MDSC表面标记物CD15表达，又有C3AR表达的阳性细胞。通过分析，可以发现，与正常卵巢组织相比，卵巢上皮性癌组织中MDSC细胞的浸润增多，C3AR表达明显增加(图14)。

实施例4

本实施例旨在检测卵巢癌细胞系SKOV3、ID8细胞C3分子的表达情况。

1研究对象

SKOV3、ID8细胞株。

2方法

2.1SKOV3、ID8细胞C3分子的表达情况的测定

2.1.1样品的采集与预处理

SKOV3细胞培养：细胞在含有10％FBS和1％抗生素P/S的RPMI1640培养基中培养，每天换液，控制细胞密度。细胞传代时去上清，PBS冲洗，加入0.05％胰酶，在37℃细胞培养箱中消化2分钟，显微镜下观察细胞悬浮后，加入2倍胰酶体积的含10％FBS培养基终止消化，转移至15ml离心管，1000rpm离心3分钟，弃上清，重悬后分盘。

ID8细胞培养：细胞在含有10％FBS和1％抗生素P/S的DMEM培养基中培养，每天换液，控制细胞密度。细胞传代时去上清，PBS冲洗，加入0.05％胰酶，在37℃细胞培养箱中消化2分钟，显微镜下观察细胞悬浮后，加入2倍胰酶体积的含10％FBS培养基终止消化，转移至15ml离心管，1000rpm离心3分钟，弃上清，重悬后分盘。

293T、3T3细胞培养：细胞在含有10％FBS和1％抗生素P/S的DMEM培养基中培养，每天换液，控制细胞密度。细胞传代时去上清，PBS冲洗，加入0.05％胰酶，在37℃细胞培养箱中消化2分钟，显微镜下观察细胞悬浮后，加入2倍胰酶体积的含10％FBS培养基终止消化，转移至15ml离心管，1000rpm离心3分钟，弃上清，重悬后分盘。

2.1.2实时荧光定量PCR检测C3的表达情况

消化获得细胞悬液后(>1×10⁶)，1000rpm离心3min，弃上清，加1ml PBS重悬去除血清后，1000rpm离心3min，去上清，加入1ml Trizol，反复吹打使细胞裂解并转移入RNAse-free 1.5ml EP管，室温裂解5min后，加入200μl氯仿进行萃取，剧烈振荡15-30s，室温静置5min，待完全分层后12000rpm，4℃离心10min，小心吸取上层水相(中间为DNA层，下层为蛋白层)于新的1.5ml EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃沉淀过夜，沉淀结束后12000rpm，4℃离心30min，RNA形成白色沉淀在管底聚集，小心去除上清，加1ml 75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm 4℃离心5min，去上清，12000rpm 4℃离心3min去除管壁液体，用移液器小心吸净液体，在超净台打开管盖晾干(约2min)，待RNA沉淀变透明加入适量RNAse-freeddH2O，反复吹打溶解RNA，检测RNA浓度及质量(OD260/280在2.0左右说明RNA质量较高)，保存于-80℃。

2.1.3mRNA反转录

按照如下体系进行mRNA反转录(10μl)：

表1

总RNA	500ng
		5xPrimeScriptBuffer	2μl
PrimeScriptRTEnzymeMix	0.5μl
		OligodTPrimer(50μM)	0.5μl
Random6mers(100μM)	0.5μl

RNAse-free ddH₂O补至10μl，混匀后瞬时离心，按照如下程序进行反转。

表2

37℃	15min
		85℃	5s
10℃	hold

将反转录得到的cDNA加ddH₂O稀释20倍，待用，-20℃储存。

按照如下体系进行定量PCR(10μl)：

表3

2×bioradMix	5μl
		稀释后的cDNA模板	2μl
qPCR引物(F/R，10mmol)	0.1μl
		ddH<sub>2</sub>O	2.9μl

为避免实验中的误差需加三个复孔，可配好总管后进行分装，mRNA实时定量PCR以看家基因GAPDH为内参。PCR程序设置如下：

2.1.4统计与分析

MxPro实时荧光定量PCR数据分析软件，数据表示为平均值±误差(SEM)，数据统计通过GraphPad软件实现，数据显著性差通过Student's t检验统计分析，P<0.05认为具有统计学差异。

3结果

通过实时荧光定量PCR，可发现无论是在人卵巢癌细胞系SKOV3还是小鼠卵巢癌细胞系ID8中C3分子均呈现高表达水平。(图15)。

实施例5

本实施例旨在检测不同卵巢癌细胞系对MDSC表面C3AR表达情况的影响。

1研究对象

来自上海市第一妇婴保健院分娩的产妇(健康志愿者)、SKOV3、ID8细胞株、C57小鼠(6-8周，雌性，上海斯莱克)。

2方法

2.1MDSC表达C3AR情况的测定

2.1.1样品的采集与预处理

SKOV3、ID8细胞培养如前所述。待细胞密度长到90％左右，收取细胞培养上清，备用。

脐带血的采集及预处理：知情同意后，取在上海市第一妇婴保健院进行分娩的产妇的脐带血20ml于抗凝管中，用等体积的PBS稀释。在干净的离心管中加入等体积的分离液，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。室温，水平转子500～1000g，离心20～30min。离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mlPBS洗涤白膜层细胞。250g离心10min.弃上清，5ml的PBS重悬细胞，250g离心10min。重复上一步骤，弃上清，细胞重悬备用。

小鼠骨髓细胞的采集与预处理：断颈处死小鼠，75％酒精擦拭全身，剪开皮毛(注意保持腹膜完整)，剪断大腿，剔除组织、肌肉、暴露骨头，放入装有DMEM培养基的12孔板中内。2ml的注射器吸取培养基沿骨头一端的骨髓腔冲洗骨髓细胞(注意切勿重复冲洗)。收集含有骨髓细胞的培养液，通过40um滤网过滤，1500rpm离心5min,加入红细胞裂解液5ml(1:9配制)，1500rpm离心5min，加入DMEM培养基5ml，1500rpm离心5min，弃上清，细胞重悬备用。

2.1.2流式细胞术检测MDSC中C3AR的表达情况

将上述所得细胞平均分成2份，铺入U型底的96孔板进行培养，一份给予配制好的含有10％FBS和1％抗生素P/S的RPMI1640或DMEM培养基(Ctrl组)，另一份以1:1的比例加入RPMI1640或DMEM培养基和SKOV3或ID8细胞培养上清(S-T组)，将细胞置于37℃恒温细胞培养箱，培养48h。其中，人脐带血来源的单个核细胞用RPMI1640或SKOV3细胞培养上清培养，小鼠骨髓细胞用DMEM或ID8细胞培养上清培养。

48h后，收集细胞于离心管中，1500rpm离心5min，PBS清洗1次，1500rpm离心5min，备用。

脐带血所得的单个核细胞按照之前所述的细胞表面染色的方法用CD15、C3AR抗体进行染色后，上机检测。

收集到的小鼠骨髓细胞，加入25ul配制好的CD11b、Gr-1、C3AR抗体(1：200稀释，用flowcyte cell stainingbuffer配制)，4℃避光染色15min,加入200ul PBS,充分洗涤，1500rpm离心5min,去上清，加入25ul配制好的Alexa Fluor 647(1:1000稀释，用flowcytecell staining buffer配制)，4℃避光染色15min,加入200ul PBS,充分洗涤，1500rpm离心5min,去上清，用200ul PBS重悬，上机检测。

2.1.3统计与分析

3结果

人脐带血来源的单个核细胞经SKOV3细胞培养上清刺激后，MDSC中C3AR的表达增加。(图16)

小鼠骨髓细胞来源的MDSC经ID8卵巢癌细胞培养上清刺激后，MDSC表面C3AR的表达亦上调(图16)。

实施例6

本实施例旨在检测卵巢癌细胞培养上清对MDSC功能的影响。

1研究对象

C57小鼠(6-8周，雌性，上海斯莱克)、ID8细胞系。

2方法

2.1MDSC功能的测定

2.1.1样品的采集与预处理

ID8细胞培养方法如上所述，收集肿瘤培养上清备用。

MDSC细胞分选：按照如前所述的方法，提取小鼠骨髓细胞，并用配制好的CD11b、Gr-1抗体进行细胞表面染色。待染色结束后，上机分选双阳性MDSC，并收集细胞。将收集的MDSC平均分为两份，一份用配制好的DMEM培养，一份以1:1的比例加入DMEM培养基和ID8细胞培养上清，将细胞置于37℃恒温细胞培养箱中，培养48h。

小鼠脾脏T细胞分选：断颈处死小鼠，取小鼠脾脏组织，放入装有DMEM培养基的12孔板中内。研磨脾脏组织，通过40um滤网过滤，1500rpm离心5min,加入红细胞裂解液5ml(1:9配制)，1500rpm离心5min,加入DMEM培养基5ml,1500rpm离心5min,弃上清，用缓冲液重悬细胞。加入加热的FBS，再加入抗体MIX，充分混匀后，4℃孵育20min，加入缓冲液清洗。充分混匀后350g 4℃离心8min，弃上清，加入缓冲液重悬，加入beads。室温孵育15min，加入缓冲液。将无菌管置于磁铁上，将细胞悬液加入无菌管中，收集从无菌管中流出的T细胞,备用。

MDSC细胞与T细胞共培养：将上述所得T细胞分为3组，分别加入单纯的培养基(Ctrl组)，用DMEM培养的MDSC(DMEM组)以及用肿瘤上清培养的MDSC(S-T组)，Ctrl组只加入单纯的IL-2，余2组中加入IL-2,CD3,CD28刺激，刺激72h。

2.1.2流式细胞术检测T细胞的功能表达情况

T细胞胞内染色：加入brefeldingA，4-6h,1500rpm离心5min，PBS洗涤一下，1500rpm离心5min，加入25ul配制好的CD45、CD4、CD8抗体(1：200稀释，用flowcyte cellstaining buffer配制)，4℃避光染色15min,加入200ul PBS,充分洗涤，1500rpm离心5min,去上清，用200ul PBS重悬，1500rpm离心5min。加入IC Fix/Perm Buffer固定，混匀后室温孵育20min。用Perm Wash Buffer洗涤一次，1500rpm离心5min。加入Perm Wash Buffer，混匀，4℃孵育30min，1500rpm离心5min。加入含有IFNgama的抗体，4℃避光孵育30min。PermWash Buffer洗涤一次，1500rpm离心5min，弃上清，用200ul PBS重悬。

上机检测。

2.1.3统计与分析

3结果

与DMEM组相比，经ID8细胞培养上清刺激的MDSC与T细胞共培养后，可抑制CD8+T细胞活化因子IFNgama的分泌(图17-18)。表明卵巢上皮性癌通过MDSC抑制T细胞的活性发生免疫逃逸。

实施例7

本实施例旨在癌症大数据分析卵巢癌患者肿瘤组织中C3AR的表达与MDSC相关基因之间的关系。

1研究方法

通过基于TCGA和ICGC等大型的肿瘤研究项目的癌症大数据分析网站cBioPortal网站，分析卵巢癌组织中C3AR的表达与MDSC相关基因之间的共表达情况。

2结果

cBioPortal分析中共有307例卵巢癌样本纳入研究。通过Spearman相关性分析及Pearson相关性分析，我们可以发现卵巢癌组织中C3、C3AR的表达量与MDSC相关的免疫抑制基因S100A8、S100A9、IL-10、TGF-β的表达成正相关，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图19-22)。

实施例8

本实施例旨在研究干扰C3/C3AR信号对MDSC功能的影响。

1研究对象

C57小鼠(6-8周，雌性，上海斯莱克)。

2方法

2.1MDSC相关基因的测定

2.1.1样品的采集与预处理

ID8细胞培养细胞按如前所述的方法培养。

小鼠MDSC的获取及处理：分选按如前所述的方法取得小鼠骨髓细胞，染色，分选。将MDSC分为2组，一组加入ID8培养上清(Ctrl)，一组加入ID8培养上清和SB290157(SB290157组)，刺激48h。

2.1.2实时定量PCR检测MDSC相关基因的表达情况

收集刺激48h后的MDSC细胞，按照如前所述的方法抽屉RNA，反转成cDNA后，实时荧光定量PCR仪检测。

2.1.33统计与分析

MxPro实时荧光定量PCR数据分析软件,数据表示为平均值±误差(SEM)，数据统计通过GraphPad软件实现，数据显著性差通过Student's t检验统计分析，P<0.05认为具有统计学差异。

3结果

共检测了6种MDSC的相关基因：S100A8、S100A9、Arg-1、iNOS、CCL2、COX2。其中，C3AR抑制剂SB290157处理的MDSC组，可观测到S100A9、COX2、iNOS的表达降低(图23)。

实施例9

本实施例旨在检测干扰C3/C3AR信号对肿瘤的影响。

1研究对象

C57小鼠(6-8周，雌性，上海斯莱克)。

2方法

2.1肿瘤相关指标的测定

2.1.1样品的采集及预处理

ID8细胞培养方法如前所述。

卵巢癌皮下注射模型的建立：注射前准备ID8细胞，取适龄小鼠，剔除小鼠背部毛发，充分暴露注射部位，提起注射部位皮肤使其形成空隙，将注射器沿皮肤推进5-10mm，针头可左右摆动，轻轻回抽无回流，注入细胞，500万细胞/只，形成皮丘，每天观察皮丘吸收情况，待完全吸收后隔两天观察肿瘤生长情况。

C57小鼠接种肿瘤6W后，将小鼠分为两组，实验组给予C3AR抑制剂处理1W，对照组给予相应的空白介质处理1W。

2.1.2肿瘤相关指标的测定

接种肿瘤细胞8W后，断颈处死荷瘤小鼠，剥离荷瘤小鼠的肿瘤并测定肿瘤的重量。

肿瘤组织石蜡切片的制备：新鲜组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I-5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冰箱冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。

免疫荧光染色：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。组织切片置于盛满柠檬酸(PH6.0)抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火10min停火5min转中低火5min，停火2min转中低火5min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定)。切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)。在圈内滴加封闭液孵育30min。轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。封片剂完全凝固后可在激光共聚焦显微镜(Nikon)下进行拍摄获取数据。

2.1.3统计与分析

ImageJ图像分析软件统计阳性细胞数。数据表示为平均值±误差(SEM)，数据统计通过GraphPad软件实现，数据显著性差通过Student's t检验统计分析，P<0.05认为具有统计学差异。

3结果

3.1小鼠肿瘤组织的重量

通过电子天平对取自不同组小鼠的肿瘤组织分别进行称重后发现，与对照组相比，C3AR抑制剂SB290157处理组小鼠的肿瘤重量明显缩小，差异具有统计学意义(图24)。

3.2小鼠肿瘤组织中T细胞浸润情况

通过免疫荧光染色，可发现C3AR抑制剂SB290157处理后，小鼠肿瘤组织中浸润的CD4+、CD8+T细胞增多(图25-26)。

4结论

本发明首次发现C3AR拮抗剂SB290157能够抑制MDSC相关免疫抑制基因的表达，抑制卵巢肿瘤的生长，并且促进肿瘤微环境中T细胞的浸润，因此，C3AR拮抗剂SB290157有望成为卵巢上皮性癌药物治疗的新策略。C3AR拮抗剂SB290157可应用到临床可以为千万卵巢癌患者带去福音，改善患者的预后，减轻医疗和经济负担。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.补体C3、C3AR分子作为诊断标志物在制备预测、诊断或预后卵巢上皮性癌的试剂中的应用。

2.补体C3、C3AR分子抑制剂在制备治疗卵巢上皮性癌的试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的补体C3、C3AR分子抑制剂是抑制补体C3、C3AR分子的表达量的物质。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的补体C3、C3AR分子抑制剂选自小分子化合物或生物大分子。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的生物大分子是以补体C3、C3AR蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制补体C3、C3AR蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的补体C3、C3AR分子抑制剂是SB290157。

7.补体C3、C3AR分子抑制剂在制备抑制MDSC浸润的试剂盒中的应用。

8.补体C3、C3AR分子抑制剂在制备抑制S100A8、S100A9、IL-10、TGF-β基因表达的试剂盒中的应用。

9.补体C3、C3AR分子抑制剂在制备促进T细胞浸润的试剂盒中的应用。

10.根据权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂是SB290157。