CN107422123B - 一种用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒 - Google Patents

一种用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒，含有检测HOXA10的特异性抗体、检测HOXA11的特异性抗体、检测HOXC6的特异性抗体或者检测HOXC8表达量的特异性抗体中的任意一种或两种以上的组合。本发明通过对TCGA数据库中口腔鳞状细胞癌及口腔正常组织的mRNA的测序结果进行统计分析，共纳入32例口腔正常组织和341例口腔鳞状细胞癌组织的数据，发现HOX家族中部分基因的表达在口腔鳞癌和正常组织中差距显著，适合应用于口腔鳞状细胞癌的诊断。随后采用免疫组化的方法在口腔鳞癌组织病理切片中检测出HOX家族基因的表达，确定了这些基因在口腔鳞状细胞癌中的阳性表达以及在诊断中的应用价值。

Description

一种用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种诊断试剂，具体来说是一种用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒。
技术背景：
口腔鳞状细胞癌是全球最常见的十大癌症之一，是最常见的口腔肿瘤，占比约达90％以上，每年约有500000新增病例，且近年来仍呈上升趋势。口腔鳞状细胞癌不仅危及患者的生命，还影响其美观和外形，以及患者的咀嚼、语音、吞咽等生存质量。尽管目前有包括手术治疗、放化疗、生物治疗、基因靶向治疗等在内的综合序列治疗法，但是口腔鳞状细胞癌的长期治疗效果仍不理想。据文献报道，约有2/3的口腔鳞状细胞癌患者被诊断时已处于癌症晚期，而在过去的30年中，晚期口腔鳞状细胞癌的5年生存率只有40％～50％。此外，晚期患者经历手术、放疗和化疗等综合治疗后，面部外形严重破坏，生存质量明显降低。但是，对于早期的OSCC患者5年生存率高达85.4％，早期患者治疗后生存质量也显著提高。因此，口腔鳞状细胞癌的早期诊断对提高患者生存预后至关重要。特异性和敏感度高的标记物能对口腔鳞状细胞癌患者的早期诊断，治疗和预后判断提供很大的帮助。
目前口腔鳞状细胞癌病理诊断主要依靠伊红-苏木素(HE)染色及组织形态学进行诊断，但当肿瘤组织发生坏死或者组织受到挤压导致结构不清时，仅根据HE染色及形态学观察难以做出正确诊断。此时，采用免疫组化方法检测口腔鳞状细胞癌与正常组织的差异表达基因，对明确诊断口腔鳞癌具有重要意义。
至今可供临床应用的TM有近200种，可分为细胞表面肿瘤标记物、肿瘤的血清标记物以及癌基因标记物。例如：在胚胎期表达，健康成人不表达，随着肿瘤发生又重新表达的胚胎抗原如甲胎蛋白(AFP)及癌胚抗原(CEA)；与肿瘤相关的糖蛋白如癌抗原50(CA50)、癌抗原125(CA125)、鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)、表皮生长因子受体(EGFR)等；还有像血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、增殖细胞核抗原(PCNA)等与肿瘤细胞增殖分化有关。但是，具有临床的特异性强、敏感度高的肿瘤标记物目前还较缺乏。
发明内容：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒，所述的这种用途要解决现有技术中主要依靠伊红-苏木素(HE)染色及组织形态学进行诊断口腔鳞状细胞癌的效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有检测HOXA10的特异性抗体、检测HOXA11的特异性抗体、检测HOXC6的特异性抗体或者检测HOXC8的特异性抗体中的任意一种或两种以上的组合。
进一步的，所述的试剂盒中还含有二甲苯、乙醇、质量百分比浓度为3％的双氧水、抗原修复液、山羊血清封闭液、磷酸盐缓冲液和中性树胶。
本发明还提供了检测HOXA10的特异性抗体在制备用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂中的用途。
本发明还提供了检测HOXA11的特异性抗体在制备用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂中的用途。
本发明还提供了检测HOXC6的特异性抗体在制备用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂中的用途。
本发明还提供了检测HOXC8的特异性抗体在制备用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂中的用途。
对于基因表达量的测定，可以使用本领域公知的标准方法。一般基因表达量经典的方法是将mRNA量或者蛋白质量作为标准来测定。本发明中也可以同样的将HOXA10、HOXA11、HOXC6、HOXC8基因的mRNA量或者蛋白质量作为标准进行相应的基因表达量的测定。
本发明的检测过程中，采用的样本为口腔鳞状细胞癌组织、血液、血浆、体液、细胞或者唾液中的一种或者多种。
本发明通过对TCGA数据库中口腔鳞状细胞癌及口腔正常组织的mRNA的测序结果进行统计分析，共纳入32例口腔正常组织和341例口腔鳞状细胞癌组织的数据，首先采用生物信息学方法在全基因组中确定了口腔鳞癌比口腔组织中差异表达的显著基因。随后采用ROC曲线(receiver operating characteristic curve)的方法对这些特意表达的基因及目前常用于的诊断基因进行分析研究，发现HOX家族中部分基因的表达在口腔鳞癌和正常组织中差距显著，适合应用于口腔鳞状细胞癌的诊断。相较于目前常用的诊断基因可能具有更大的优势。
随后采用免疫组化的方法检测了口腔鳞状细胞癌和正常组织各40例中HOX家族的表达，确定了这些基因在口腔鳞状细胞癌中的阳性表达以及在诊断中的应用价值。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明基于TCGA大数据库挑选出差异基因，并且来自同一家族，经过验证和分析，发现来自同一HOX家族的基因可以用于口腔鳞状细胞癌的病理诊断，并且在特异性和灵敏度上有一定的优势。
附图说明
图1显示了排名前30位基因ROC曲线图。
图2显示了HOX家族基因ROC曲线图(A为12种HOX基因的ROC曲线，B为四种HOX基因的ROC曲线)。
图3显示了HOX家族基因热图。
图4显示了HOXA10、HOXA11、HOXC6、HOXC8基因免疫组化图。
图5显示了HOXA10、HOXA11、HOXC6、HOXC8基因RSEM值(A为HOXA10、C为HOXA11、D为HOXC6、B为HOXC8)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明。
实施例1口腔鳞状细胞癌和口腔正常组织全基因组表达数据分析
首先从TCGA数据库中获得口腔鳞癌及口腔正常组织的mRNA测序数据，共包含32例口腔正常组织和341例口腔鳞癌组织样本的数据。计算每种基因的表达量，以RSEM值表示。
基于以下标准初步筛选出可应用于口腔鳞癌诊断的基因:
根据口腔鳞癌与口腔正常组织的P<0.01并且Mean(T)/Mean(N)倍数>9。此处，一共筛选出242个口腔鳞癌表达较高的基因。根据ROC曲线下面积排名前30位的基因。附表1及图1。表1.口腔鳞癌及正常组织中特异性基因的表达情况及ROC分析
在前30位的基因中，我们发现其中属于HOX家族的有12个，目前此家族在口腔鳞癌中的研究较少，而作为诊断口腔鳞癌与正常组织的应用目前尚未见报道。HOX家族12种基因ROC曲线下面积值都在0.8以上，说明HOX家族中的这12种基因在口腔鳞癌诊断中的敏感性和特异性较高。附表2及图2。
表2.口腔鳞癌及正常组织中HOX基因的表达情况及ROC分析
我们选取了差异较高的HOXA10、HOXA11、HOXC6及HOXC8基因进行验证，通过热图(如图3所示)分析，四种基因在癌组织里表达比正常组织高，随后选用免疫组化病理切片进行验证，选用的抗体均来自美国bioworld抗体。
实施例2应用口腔鳞癌与正常组织的病理切片检测HOX家族HOXA10、HOXA11、HOXC6及HOXC8的表达。
实验步骤如下：
1.石蜡切片(口腔鳞癌与正常组织)60℃烤片2～3小时
2.二甲苯脱蜡二次，梯度酒精水化，流水冲洗2min。
3.使用柠檬酸钠抗原修复液，微波煮沸15min,自然冷却至室温。
4.滴加3％的过氧化氢溶液，去除内源性的过氧化物酶，室温孵育10min,PBS冲洗3遍，每次5min。
5.每张切片滴加1:75浓度的一抗，4℃孵育过夜。次日PBS冲洗3次，每次5min。
6.滴加MaxVisionTM试剂盒内鼠/兔通用二抗，室温孵育1h，PBS冲洗3次，每次5min。
7.每张切片滴加新鲜配置的DAB染色液，显微镜下观察。
8.流水冲洗掉DAB，苏木素复染，流水下冲洗返蓝。梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。
免疫组化结果评分：
1.细胞阳性着色程度：0(无阳性)1(弱阳性)2(中等阳性)3(强阳性)
2.阳性细胞数量：0(无着色)，1(1～10％细胞着色)，2(11～50％细胞着色)，3(51～80％细胞着色)，4(大于80％细胞着色)。
计算公式：总评分＝染色强度×染色细胞百分比。
免疫组化结果：－(总评分0～1)+(总评分2～4)，++(总评分2～5)，+++(总评分6～9)。
如图4所示，免疫组化结果显示HOXA10、HOXA11、HOXC6及HOXC8基因在癌组织表达阳性，其中:A、B、C为正常组织，D、E、F为癌组织，A、D为100*，B、E为200*，C、F为400*。
实施例3
如图5所示，为HOXA10(A)、HOXA11(C)、HOXC6(D)及HOXC8(B)基因在口腔正常组织与口腔鳞癌组织中的表达值分布频率，选取TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)获得的口腔鳞癌的level3的表达数据，从中挑选出口腔鳞癌341例，正常组织32例，基因表达值的单位为RNA-Seq by expectationmaximization(RSEM)。
实施例4
根据灵敏度和特异性的公式：
敏感度＝真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)*100％。正确判断阳性的率。
特异度＝真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数))*100％。正确判断非阳性的率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.检测HOXA11的特异性抗体在制备用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂中的用途。
2.检测HOXA11的特异性抗体在制备用于诊断口腔鳞状细胞癌的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒中还含有二甲苯、乙醇、质量百分比浓度为3％的双氧水、抗原修复液、山羊血清封闭液、磷酸盐缓冲液和中性树胶。
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