CN110452955A - 一种血清ctc中微小rna的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血清CTC中微小RNA的检测方法，通过在血液中捕获肿瘤释放的micro RNA携带的遗传信息并加以检测分析，实现利用无创的液体活检方式及时检测miRNA的qRT‑PCR方法。可以避免血清复杂成分干扰，从血清CTC中检测micro RNA效果更好，稳定性强，循环肿瘤细胞与组织相比，可以实现无创检测，而与血浆中游离的大分子相比，又具有无可比拟的稳定性，因此，具有很大的优势和潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及到一种血清CTC中微小RNA的检测方法。
背景技术
2015年中国约有429.2万癌症新发病例，281.4万癌症死亡病例。其中，肺癌新发病例为73.3万例，死亡病例为61万例，均占所有癌症的首位。根据组织学亚型，肺癌可分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）。非小细胞肺癌包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，共占肺癌发病率85 %左右。我国约75 %的肺癌患者在诊断时已经属于晚期，5年生存率约为15.6 %，III、IV期的NSCLC缓解率仅为25 %-30 %，2年生存率小于15 %。因此要提高肺癌患者的长期活率，早期发现肺结节的良恶性具有重要意义。
肺结节主要是指肺实质内被充气肺组织完全包围，单发或多发直径不超过3 cm的圆形或类圆形结节影，不能排除早期肺癌的可能。美国胸科医师学院（ACCP）于2003年，2007年，2013年三次更新肺结节处理指南，Fleischner学会也分别在2005年，2013年先后发布了肺小结节处理指南和肺非实性结节处理指南，我国于2015年发布了肺部结节诊疗中国专家共识以及肺亚实性结节影像处理专家共识。基于亚洲人群和欧美人群的种族差异性，2016年还推出了适用于亚洲的肺结节临床处理专家共识。对此类肺结节的干预措施包括定期影像随访、微创活检或手术治疗等，在临床实践中，如何避免非癌性肺结节患者因不必要的侵入性活检或手术而带来的并发症风险以及因结节的发现和评估所产生的焦虑需要临床医生仔细地权衡。
在精准医学时代，血液标志物检测因具有如下的特点及优势，对于肿瘤相关的miRNA检测方法提供了新思路，1. 取样简单，可提高随访率；2. 可多次检测随访观察，可增加恶性肿瘤检出率；3. 无放射性及创伤性损害，可降低并发症的发生率；4. 可用于治疗后的复发耐药监测，提高治疗的效率。5. 降低检查成本，减轻政府和患者的经济压力，有很高的经济效益比。
目前研究的比较多的血液标志物检测包括：循环肿瘤细胞（CTC）、micro RNA含量变化以及循环肿瘤DNA（ctDNA）。其中，micro RNA是长度21-25nt的RNA分子，可以特异性识别靶mRNA并调控编码基因的表达，它们通过促进mRNA降解并抑制基因转录而影响mRNA在转录和转录后水平的表达。Micro RNA调控着至少1/3的人类编码蛋白的基因，其中近半数位于肿瘤相关的染色体区域。大量研究表明，micro RNA在细胞增殖、分化、凋亡和代谢方面发挥着重要作用，并参与了癌基因和抗癌基因的信号调控。
在多种人类恶性肿瘤中己经检测到异常表达的micro RNA，并且发现micro RNA与肿瘤的发生、发展、预测、诊断、治疗和预后有关。Micro RNA在非小细胞肺癌中扮演着多重角色，包括在肺癌发生过程中发挥促癌或抑癌基因的作用，调控肺癌细胞的增殖和分化，参与肺癌的侵袭和转移，影响肺癌对放、化疗的敏感性等。因而，micro RNA可以作为肺癌的一种标志物。MiR-205是肺鳞癌特异的标志物，Lebanony和Bishop分别对NSCLC组织中miR-205进行定量分析并据此进行病理分型，包括在甲醛溶液固定后的石蜡包埋组织和分化不良的较小的针吸活检组织中，其敏感性达96 %，特异性达90 %。MiR-25，miR-34c-5p，MiR-191，let-7e和miR-34a等5种micro RNAs也能够很好地区分鳞癌和腺癌，且其在I-IIIa期吸烟男性鳞癌患者中的低表达提示预后不良。
受血清复杂成分干扰，单纯从血清中检测micro RNA效果不佳，稳定性差，个体差异显著，而从血清循环肿瘤细胞中检测micro RNA可能是解决这一棘手问题的新思路。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，简称CTC）是指脱离肿瘤并进入血液循环的癌细胞，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，这种远端转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团（CirculatingTumorMicroemboli，简称CTM）。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变（Epithelial Mesenchymal Transition，简称EMT），故CTC存在不同类型，包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型，CTM和间质细胞表型CTC具有更强的转移潜能。
在临床诊断中，循环肿瘤细胞与组织相比，可以实现无创检测，而与血浆中游离的大分子相比，又具有无可比拟的稳定性，因此，具有很大的优势和潜力。循环肿瘤细胞中micro RNA可作为肿瘤的标志物，GENYO的研究人员开发出一种称为MishCTC的方法，获得了25例转移性癌症患者的外周血样本，选择了miR-21这一可靶定多个肿瘤的抑制基因，在癌细胞中表达而不在造血细胞中表达，是检测CTC的理想标志物。将原位杂交方法以及基于CK表达的免疫磁性选择和免疫细胞化学相结合，利用锁核酸（LNA）探针来检测miRNA。验证了miR-21是检测EMT表型的CTC的一个很好的标志物。此外，在结直肠癌的研究中，也发现miR-1826是一种新的非编码RNA基因，相较于健康的志愿者，结直肠癌患者外周血样本中miR-1826显著升高。这些研究为抑制肿瘤的转移提供了新的思路，在血液中捕获肿瘤释放的microRNA携带的遗传信息的蛛丝马迹并加以检测分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清CTC中微小RNA的检测方法，通过在血液中捕获肿瘤释放的microRNA携带的遗传信息并加以检测分析，实现利用无创的液体活检方式及时检测miRNA的qRT-PCR方法。
本发明采用的技术方案如下：一种血清CTC中微小RNA的检测方法，包括如下步骤：
（1）：取来自非小细胞肺癌患者的外周血7.5 m L置于抗凝管中并混匀全血标本；
（2）：去除血浆蛋白及血浆(清)核酸：将全血标本分为两等分加入缓冲液，离心去上清，轻摇离心管混匀沉淀细胞；
（3）：去除红细胞：混匀后，于两管中分别加入裂解液，将离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清，轻摇离心管混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
（4）：分层离心：于两支新的离心管中加入分层液，将步骤（3）中的液体叠加到分层液顶层，然后用缓冲液清洗离心管管壁，将清洗液同时转移至缓冲液顶层离心；
（5）：去除白细胞：步骤（4）中离心后可见3层溶液，轻柔吸取最上2层溶液于两支新的离心管内，分别加缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清，加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
（6）：洗涤磁微粒：吸取适量磁微粒混悬液至EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
（7）：抗体孵育：将步骤（6）中磁微粒缓慢加入到处理好的血样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动；
（8）：清除游离磁微粒：将两支离心管内的液体转移至两支新的离心管中，靠于磁力架上，随后将液体再次分别转移至两支新的离心管中，架于离心管上端，离心弃上清，然后分别涂至两张载玻片上；
（9）：将步骤（8）中的载玻片自然晾干，用浓度为4%的多聚甲醛固定细胞表面抗原，浓度为1%的胎牛血清封闭细胞表面非特异性位点；
（10）：将每份血样富集后获得的2张载玻片随机分为2组分别加一抗工作液，避光孵育后，充分洗涤；
（11）：加二抗工作液，避光孵育后，充分洗涤，加DAPI工作液染色后，轻微洗涤；
（12）：滴甘油，盖上盖玻片，由同一检验员显微镜下读片；
（13）：采用实时荧光定量PCR检测CTC中微小RNA的表达量。
优选的，所述步骤（8）中采用EGFR免疫脂质体磁球对外周血中的循环肿瘤细胞进行捕获。
优选的，采用EGFR免疫脂质体磁球对外周血中捕获的循环肿瘤细胞进一步用于微小RNA检测。
优选的，所述步骤（13）中采用实时荧光定量PCR检测CTC中微小RNA的表达量的过程中，采用TRNzol法进行基于循环肿瘤细胞的总RNA的提取。
优选的，所述步骤（13）中采用实时荧光定量PCR检测CTC中微小RNA的表达量的过程中，采用逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
本发明的优点在于：可以避免血清复杂成分干扰，从血清CTC中检测micro RNA效果更好，稳定性强，循环肿瘤细胞与组织相比，可以实现无创检测，而与血浆中游离的大分子相比，又具有无可比拟的稳定性，因此，具有很大的优势和潜力。
附图说明
图1为本发明实施例中EGFR免疫脂质磁球的制备流程示意图。
图2为本发明实施例中EGFR免疫脂质磁球分选鉴定CTC的流程示意图。
图3为本发明实施例中循环肿瘤细胞微小RNA检测流程图。
图4为本发明实施例中荧光定量PCR检测循环肿瘤细胞微小RNA的循环曲线图。
图5为本发明实施例中荧光定量PCR检测循环肿瘤细胞微小RNA的结果曲线图。
具体实施方式
下面对本发明对一种血清CTC中微小RNA的检测方法作进一步详细描述。
实施例1
本实施例中首先需要进行确定取样人群：
一、确定样本量
1）前期入组100例肺结节患者，评价检测体系及指标，对后续样本量进行测算；
2）根据前期研究结果，由统计学家初步计算CTC中micro RNA诊断非小细胞肺癌的灵敏度及特异度，进一步计算所需要的总的样本量，预计入组约500例患者。
二、入选标准
1）年满18周岁，男女不限；
2）影像学检查发现的单发肺部结节（直径5mm-2cm）拟1-3月内行手术治疗的（需要后续的病理确诊结果）；
3）愿意进行临床研究前签署书面知情同意书并遵守研究方案；
三、排除标准
1）器官移植手术史；
2）孕期或哺乳期；
3）多发肺部结节患者；
4）其他肿瘤正在接受靶向药物、免疫抑制剂、免疫调节剂、生物治疗患者；
5）血液系统疾病；
6）6月内有输血史；
7）急性、重症疾病需紧急治疗；
8）不愿意进行临床研究前签署书面知情同意书并遵守研究方案。
四、剔除标准
1）无法行手术治疗患者；
2）未按照样本收集保存运输要求进行操作，质量差的样本；
3）患者中途退出临床研究。
本实施例根据以上标准确定取样人群后进行血清CTC中微小RNA的检测，具体方法如下：
（1）：取来自非小细胞肺癌患者的外周血7.5 m L置于抗凝管中并混匀全血标本；
（2）：去除血浆蛋白及血浆(清)核酸：将全血标本分为两等分加入缓冲液，离心去上清，轻摇离心管混匀沉淀细胞；
（3）：去除红细胞：混匀后，于两管中分别加入裂解液，将离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清，轻摇离心管混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
（4）：分层离心：于两支新的离心管中加入分层液，将步骤（3）中的液体叠加到分层液顶层，然后用缓冲液清洗离心管管壁，将清洗液同时转移至缓冲液顶层离心；
（5）：去除白细胞：步骤（4）中离心后可见3层溶液，轻柔吸取最上2层溶液于两支新的离心管内，分别加缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清，加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
（6）：洗涤磁微粒：吸取适量磁微粒混悬液至EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
（7）：抗体孵育：将步骤（6）中磁微粒缓慢加入到处理好的血样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动；
（8）：清除游离磁微粒：将两支离心管内的液体转移至两支新的离心管中，靠于磁力架上，随后将液体再次分别转移至两支新的离心管中，架于离心管上端，离心弃上清，然后分别涂至两张载玻片上；
（9）：将步骤（8）中的载玻片自然晾干，用浓度为4%的多聚甲醛固定细胞表面抗原，浓度为1%的胎牛血清封闭细胞表面非特异性位点；
（10）：将每份血样富集后获得的2张载玻片随机分为2组分别加一抗工作液，避光孵育后，充分洗涤；
（11）：加二抗工作液，避光孵育后，充分洗涤，加DAPI工作液染色后，轻微洗涤；
（12）：滴甘油，盖上盖玻片，由同一检验员显微镜下读片；
（13）：采用实时荧光定量PCR检测CTC中微小RNA的表达量。
其中，步骤（8）过程中原理为采用EGFR免疫脂质体磁球对外周血中的循环肿瘤细胞进行捕获；
具体EGFR免疫脂质体磁球的制备如下：
免疫脂质体磁球纳米系统由5种功能元素组成：（i）氧化铁（Fe 3 O 4）纳米颗粒，（ii）Cholesterol，（iii）GHDC，（iv）DOPC，（v）CD63。FA用作生物配体，以特异性捕获在其膜上过表达FA受体（FR）的癌细胞亚群。超顺磁性Fe3O4纳米颗粒允许EGFR捕获细胞后的磁性分离，并且分离的CTC可以用免疫荧光进行鉴定。不仅GHDC可以与蛋白抗体反应，HQCMC也可通过其所含的活性基团增加磁性微球与抗体的接枝量，并起到乳化分散及表面活性剂的功能。
利用EGFR免疫脂质体磁球分离非小细胞肺癌外周血中的CTC用于进一步的微小RNA检测。
CTC检测作为一种简单的血液检测，可随时捕捉并评估循环肿瘤细胞以确定患者的预后，外周血样本易获得、创伤性小、可反复采集，是临床上常规检测较为理想的样本来源，CTC的分离富集是本检测开展的首要条件。目前，CTC的分离主要有超速离心，磁珠免疫捕获，沉淀或过滤等方法。此处采用抗原抗体结合的阳性捕获法，通过免疫磁珠进行CTC的分离富集。采用抗EGFR结合免疫磁珠捕获EGFR阳性的CTC。
CTC的显微镜观察
CD45抗原是白细胞特有抗原，用带荧光的抗CD45的抗体来标记白细胞；Cytokeratin8/Cytokeratin18/Cytokeratin 19都是CTC细胞特有的表面抗原，用带荧光的抗Cytokeratin的抗体来标记CTC；DAPI是DNA染料，用来对细胞核进行染色；用针对目标EGFR蛋白的抗体，来看CTC细胞中EGFR抗原是否表达以及表达量。在荧光显微镜下可以进行观察拍照并统计数量。
其中，步骤（13）中采用实时荧光定量PCR检测CTC中微小RNA的表达量时，采用TRNzol法进行基于循环肿瘤细胞的总RNA的提取，具体操作下：
a、加入1ml TRNzol，充分震荡混匀，将匀浆样品在15-30℃放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
b、4℃下12,000 rpm(~13,400×g) 离心10 min，取上清；
c、每使用1 ml TRNzol加入0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min；d、4℃下12,000 rpm(~13,400×g)离心10-15 min，样品会分成三层：黄色的有机相，中
间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600 μl）转移到新的离心管中；
e、在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 min；
f、4℃下12,000 rpm(~13,400×g)离心10 min，去上清，离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；
g、加入1 ml 75%乙醇 (RNase-Free ddH2O配置) 洗涤沉淀，每使用1 ml TRNzol至少用1 ml75%乙醇对沉淀进行洗涤；
h、4℃下5,000 rpm(~2,300×g)离心3 min，倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸到沉淀；
i、室温放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3 min左右即可），根据实验需要，加入30-100 μlRNase-FreeddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
其中，将提取出的微小RNA采用逆转录试剂盒进行RNA逆转录，具体操作如下：
a. 将模板RNA在冰上解冻；引物、10×RT mix（其中包含RNasin和DTT）、Super puredNTP混合液、RNase-FreeddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体；
b. 按照下表的逆转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5min，简短离心，并置于冰上，RNA模板于第d步加入；
c. 要做多个逆转录反应时，可以将配制好的混合液后分装在单个反应管中，置于冰上；
d. 将模板RNA（50ng-2μg）加入到混合液中，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5sec，简短离心以收集管壁残留的液体；
e. 37℃孵育60 min；
f. 将逆转录的产物进行后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
具体定量检测如下：
测试1：采用实时荧光定量PCR方法进行循环肿瘤细胞中micro RNA表达量的定量检测，具体操作如下：
a. 在PCR仪上进行如下反应：37℃反应60min，95℃反应5min；
b. 获得CDNA产物后使用micro RNA荧光定量PCR试剂进行micro RNA定量检测；
c. 进行Real-TimePCR反应，采用如下流程：95℃反应15min，95℃反应10秒，60℃反应30秒进行35次循环；
d. 进行扩增结果的分析及数据处理。
测试2：
循环肿瘤细胞中miR-30a-3p表达量的检测
采用实时荧光定量PCR检测CTC中miR-30a-3p的表达量，将提取好的miR-30a-3p参照micro RNA反转录试剂盒的组分配制反转录反应液（详见试剂盒）。之后在PCR仪上进行如下反应获得cDNA产物：37℃反应60min，95℃反应5min。使用micro RNA荧光定量PCR试剂进行miR-30a-3p定量检测，采用如下流程：95℃反应15min，95℃反应10秒，60℃反应30秒进行35次循环。最后进行miR-30a-3p扩增结果的分析及数据处理。
测试3
循环肿瘤细胞中miR-15b-5p表达量的检测
采用实时荧光定量PCR检测CTC中miR-15b-5p的表达量，将提取好的miR-15b-5p参照micro RNA反转录试剂盒的组分配制反转录反应液（详见试剂盒）。之后在PCR仪上进行如下反应获得cDNA产物：37℃反应60min，95℃反应5min。使用micro RNA荧光定量PCR试剂进行miR-15b-5p定量检测，采用如下流程：95℃反应15min，95℃反应10秒，60℃反应30秒进行35次循环。最后进行miR-15b-5p扩增结果的分析及数据处理。
测试4
循环肿瘤细胞中miR-151a-5p表达量的检测
采用实时荧光定量PCR检测CTC中miR-151a-5p的表达量，将提取好的miR-151a-5p参照micro RNA反转录试剂盒的组分配制反转录反应液（详见试剂盒）。之后在PCR仪上进行如下反应获得cDNA产物：37℃反应60min，95℃反应5min。使用micro RNA荧光定量PCR试剂进行miR-151a-5p定量检测，采用如下流程：95℃反应15min，95℃反应10秒，60℃反应30秒进行35次循环，最后进行miR-151a-5p扩增结果的分析及数据处理。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种血清CTC中微小RNA的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）：取来自非小细胞肺癌患者的外周血7.5 m L置于抗凝管中并混匀全血标本；
（2）：去除血浆蛋白及血浆(清)核酸：将全血标本分为两等分加入缓冲液，离心去上清，轻摇离心管混匀沉淀细胞；
（3）：去除红细胞：混匀后，于两管中分别加入裂解液，将离心管置于垂直混匀仪混匀，离心弃上清，轻摇离心管混匀沉淀细胞后补加缓冲液；
（4）：分层离心：于两支新的离心管中加入分层液，将步骤（3）中的液体叠加到分层液顶层，然后用缓冲液清洗离心管管壁，将清洗液同时转移至缓冲液顶层离心；
（5）：去除白细胞：步骤（4）中离心后可见3层溶液，轻柔吸取最上2层溶液于两支新的离心管内，分别加缓冲液，颠倒混匀后离心弃上清，加入缓冲液，混匀沉淀细胞；
（6）：洗涤磁微粒：吸取适量磁微粒混悬液至EP管中，静置后吸弃溶液，加入缓冲液混匀，静置后弃上清，重复3次后用缓冲液重悬磁微粒至原体积；
（7）：抗体孵育：将步骤（6）中磁微粒缓慢加入到处理好的血样本中，调节摇床摇速，并将离心管倾斜固定于摇床上，室温摇动；
（8）：清除游离磁微粒：将两支离心管内的液体转移至两支新的离心管中，靠于磁力架上，随后将液体再次分别转移至两支新的离心管中，架于离心管上端，离心弃上清，然后分别涂至两张载玻片上；
（9）：将步骤（8）中的载玻片自然晾干，用浓度为4%的多聚甲醛固定细胞表面抗原，浓度为1%的胎牛血清封闭细胞表面非特异性位点；
（10）：将每份血样富集后获得的2张载玻片随机分为2组分别加一抗工作液，避光孵育后，充分洗涤；
（11）：加二抗工作液，避光孵育后，充分洗涤，加DAPI工作液染色后，轻微洗涤；
（12）：滴甘油，盖上盖玻片，由同一检验员显微镜下读片；
（13）：采用实时荧光定量PCR检测CTC中微小RNA的表达量。
2.根据权利要求1所述的一种血清CTC中微小RNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（8）中采用EGFR免疫脂质体磁球对外周血中的循环肿瘤细胞进行捕获。
3.根据权利要求2所述的一种血清CTC中微小RNA的检测方法，其特征在于：采用EGFR免疫脂质体磁球对外周血中捕获的循环肿瘤细胞进一步用于微小RNA检测。
4.根据权利要求1所述的一种血清CTC中微小RNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（13）中采用实时荧光定量PCR检测CTC中微小RNA的表达量的过程中，采用TRNzol法进行基于循环肿瘤细胞的总RNA的提取。
5.根据权利要求1所述的一种血清CTC中微小RNA的检测方法，其特征在于：所述步骤（13）中采用实时荧光定量PCR检测CTC中微小RNA的表达量的过程中，采用逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
Priority Applications (1)
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