CN109068658A - 用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞 - Google Patents
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Abstract
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是被积极招募到肿瘤部位以产生针对肿瘤生长和转移的免疫应答的白血细胞。本公开提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：从来自受试者的样品中分离CD8+T细胞、在白细胞介素‑10存在的条件下扩增CD8+T细胞以及将扩增的CD8+T细胞施用于受试者。所述治疗癌症的方法可与补体信号传导通路的抑制剂组合使用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年11月18日提交的美国临时申请No.62/257,143、2015年12月10日提交的美国临时申请No.62/265,508、62/265,511和62/265,513的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
政府权益声明
本发明是在美国卫生研究院授予的基金号R01AI074944-01的资助下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本公开涉及肿瘤浸润淋巴细胞和用于治疗癌症的组合物和方法。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是积极招募到肿瘤部位的白血细胞，以产生针对肿瘤生长和转移的免疫应答。多种信号通路控制TIL的活化，并且许多已经被作为癌症治疗的靶标进行研究。然而，目前专注于激活TIL的治疗方法仅对少部分患者有效，突出了对改进的癌症治疗方法的需求。
发明内容
在一个方面中，本公开提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其特征在于，所述方法包括：从来自受试者的样品中分离CD8+ T细胞、将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-10、将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-2、扩增所述CD8+ T细胞以及向所述受试者施用所述扩增的CD8+ T细胞。在一些实施例中，可在暴露于白细胞介素-10之前，将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-2。在其他实施例中，可将所述CD8+ T细胞同时暴露于白细胞介素-2和白细胞介素-10。在一些实施例中，所述公开的方法还可包括向所述受试者施用有效治疗量的补体抑制剂。
附图简要说明
图1显示了通过补体来调节在CD8+ T细胞中IL-10的表达。图1A显示了IL-10+(IL-10阳性)和IL-10-(IL-10阴性)的CD8+ T细胞中差异表达的基因的热图。图1B显示了图1A所示差异表达的基因的通路分析。图1C和图1D显示了IL-10+的CD8+(GFP+)和IL-10-的CD8+(GFP-)T细胞中补体(图1C)和补体受体(图1D)的mRNA表达。图表显示了基于基因芯片数据的每种所示基因的mRNA相对表达水平。所示的是由Trandem及其同事存储的数据的平均值±SEM(Journal of Immunology，186：3642-52)。图1E显示了在来自野生型(WT)和C3-/-小鼠的CD8+ TIL中IL-10的表达。将IL-10报告子(Tiger)小鼠与C3-/-小鼠杂交并接种B16黑素瘤细胞。自第12天至第13天通过流式细胞术分析TIL。右图显示了6只C3-/-Tiger小鼠的IL-10+CD8+ TIL的百分比。误差线表示SEM。所有图均通过Student t检验确定显著性(*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001)。
图2显示了通过补体抑制由T细胞介导的抗肿瘤免疫。图2A-C显示了在C3-/-小鼠中黑素瘤的发展。将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。从第7天开始每天监测肿瘤生长。图示为这些小鼠中的肿瘤体积、大小和重量(每组n＝9只小鼠)。图2D-F显示了C3-/-小鼠中乳腺癌的发展。将E0771乳腺癌细胞(1×106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。从第7天开始每隔一天监测肿瘤生长。图示为这些小鼠中的肿瘤体积、大小和重量(每组n＝9只小鼠)。图2G-H显示了来自C3-/-小鼠的CD8+ TIL表型。给WT和C3-/-小鼠皮下接种B16F10细胞(2×105/小鼠)。在肿瘤接种后第12天，通过流式细胞术(每组n＝5只小鼠)分析表达IFNγ和TNFα的总的CD8+ TIL。图2I显示了WT、C3-/-、TCRα-/-和C3-/-TCRα-/-小鼠(每组n＝6只小鼠)中B16F10肿瘤的发展。所示的所有实验代表至少三次独立实验。线条和误差线表示平均值±SEM。所有图均通过Student t检验确定显著性(ns，P>0.05；*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001)。
图3显示了荷瘤小鼠中的非CD8+ T细胞应答。将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。使用胶原酶和DNA酶处理引流淋巴结(dLNs)和肿瘤以产生单细胞悬液。以CD45+细胞的门控预选白细胞。图3A显示了对来自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的白细胞中的CD11b和GR1表达情况的流式细胞术分析(每组n＝4只小鼠)。图3B显示了使用CD4和FOXP3作为标记物(每组n＝4只小鼠)对来自TIL的白细胞中调节性CD4+ T细胞群进行的流式细胞术分析。图3C显示了使用NK1.1作为标记物(每组n＝4只小鼠)来对来自TIL的白细胞中的天然杀伤细胞(NK)群体进行的流式细胞术分析。所示的实验是三个独立实验的代表。线条和误差线表示平均值±SEM。所有图均通过Student t检验确定显著性(ns，P>0.05)。
图4显示了IL-10在C3-/-小鼠的抗肿瘤反应中的重要作用。图4A-C显示了在C3-/-小鼠中黑素瘤的发展。将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)、IL-10-/-、C3-/-和IL-10-/-C3-/-小鼠中。从第7天开始每天监测肿瘤生长。图示为这些小鼠中的肿瘤体积、大小和重量(每组n＝8只小鼠)。图4D-F显示了C3-/-小鼠中乳腺癌的发展。将E0771乳腺癌细胞(1×106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)、C3-/-和IL-10-/-C3-/-小鼠中。从第7天开始每隔一天监测肿瘤生长。图示为这些小鼠中的肿瘤体积、大小和重量(每组n＝8只小鼠)。所示的实验是三个独立实验的代表。线条和误差线表示平均值±SEM。在A和D中通过Student t检验以及在C和F中通过ANOVA来确定显著性(ns，P>0.05*；P≤0.05；**，P≤0.01)。
图5显示了IL-10增强了来自癌症患者的TIL的功能。图5A显示了体外扩增的来自肺癌患者的TIL的细胞数量。分离并在存在6,000U/mL rIL-2,100U/mL rIL-10或6,000U/mLrIL-2和100U/mLrIL-10的条件下培养TIL。显示了计数得到的活TIL的数量(y轴)。插入的图显示来自3名患者的两种培养物的TIL比例。图5B显示了体外扩增的TIL的杀伤活性。图5A中的经扩增的TIL经抗CD3/CD28抗体激活24小时，并以20：1的效应物：靶的比率测试其杀死自体原代肿瘤细胞的能力。通过阻抗测定以15分钟的间隔测量杀伤活性。图5C-D显示了体外扩增的CD8+ TILs中IFNγ和TNFα的表达。在完全培养基中单独使用6,000U/mL rIL-2或将其与100U/mL rIL-10组合使用，以将来自肺癌的TIL扩增20天。通过流式细胞术分析CD8+TIL中的IFNγ和TNFα表达。图5A-D中显示的结果是3至6名患者的代表数据。图5E显示了经IL-10处理的人肺肿瘤CD8+ TIL中差异表达的基因的热图。图5F-J显示了在IL-10/IL-2处理的人CD8+ TIL中所指示的不同通路的mRNA表达。图示为基于基因芯片数据的是每种指定基因与来自IL-2处理的细胞相比较的mRNA相对表达水平。图示为平均值±SEM。在图5F-J中通过ANOVA来确定显著性(*，P≤0.05；**，P≤0.01)。
图6显示了通过自分泌C3抑制IL-10的生成。图6A显示了T细胞转移至C3-/-TCR-/-小鼠和肿瘤发展的示意图。图6B显示了嵌合小鼠中黑素瘤的发展。将B16F10黑素瘤细胞接种到T细胞重建的C3-/-TCR-/-小鼠中，并每天监测肿瘤发展(每组n＝5只小鼠)。图6C显示了来自初始小鼠的dLN的CD8+ T细胞上的C3aR和C5aR表达的荧光激活细胞分选(FACS)图谱。图6D显示了来自dLN和黑素瘤的CD8+ T细胞上C3aR和C5aR表达的FACS图谱。将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)小鼠中，并在第13天分离TIL并通过流式细胞术分析。图6E显示了来自乳腺癌的CD8+ T细胞上的C3aR和C5aR表达的FACS谱。将E0771细胞(1×106/小鼠)皮下接种到WT小鼠中。通过流式细胞术在第19天分析CD8+ TIL上的C3aR和C5aR的表达。图6F显示了来自图6D-E的结果。图6G显示了来自外周血单核细胞(PBMC)和来自肝癌的TIL(n＝5)的CD8+ T细胞上的C3aR和C5aR表达的FACS图谱。图6H显示了肿瘤细胞中羧肽酶N(CPN)表达对CD8+ TIL中IL-10的生成的影响。将对照和表达CPN的B16F10细胞(4×105/小鼠)皮下接种到WT Tiger小鼠中。在第13天测定CD8+ TIL中的IL-10-报告分子eGFP的表达。右图显示了5只小鼠的IL-10+CD8+ TILs的百分比。图6I显示了C3aR和C5aR拮抗剂对CD8+ TIL中IL-10表达的影响。用对照或经C3aR和C5aR拮抗剂(每组n＝3)处理的携带B16肿瘤的WT Tiger小鼠。图6J显示了C3aR和C5aR拮抗剂对体外激活的CD8+ T细胞(n＝4)中IL-10表达的影响。图6K显示了补体信号传导阻断对乳腺癌发展的影响。将E0771乳腺癌细胞(1×106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)、C3-/-和IL-10-/-小鼠中。对WT和IL-10-/-小鼠，自肿瘤植入后第9天开始每12小时用C3aR和C5aR拮抗剂或对照溶液进行处理。每隔一天监测肿瘤体积(每组n＝8只小鼠)。对于图6B和图6K来说，结果是三个独立实验的代表。线条和误差线表示平均值±SEM。在图B中用Student t检验及图6J和图6K中的方差分析(ANOVA)来确定显著性(ns，P>0.05；*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001)。
图7显示了补体通过不依赖PD-1的通路抑制抗肿瘤免疫性。将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。图7A显示了肿瘤植入后第12天通过流式细胞术测得的CD8+TIL上的PD-1的表达水平。图7B显示了在IL-10存在的条件下由抗CD3/CD28抗体激活的CD8+ T细胞上的PD-1的表达水平。通过与3μg/mL抗CD3/CD28抗体一起温育48小时(有或没有500U/mL IL-10)来激活幼年小鼠淋巴结的T细胞，并分析PD-1表达。图7C-D显示了WT和C3-/-小鼠中发展的肿瘤细胞上的PD-L1表达。将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)或E0771乳腺癌细胞(1×106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。分别在第12天和第19天通过流式细胞术测量CD45-B16肿瘤细胞(图7C)和CD45-E0771细胞(图7D)中的PD-L1表达。图7E显示了IL-10刺激后肿瘤细胞中的PD-L1表达。用或不用500U/mLIL-10来培养B16F10细胞5天。通过流式细胞术来分析PD-L1表达。图7F显示了转导的B16F10细胞上的PD-L1表达。用对照病毒或单引导RNA(sgRNA)靶向PD-L1病毒来转导B16F10细胞，并用嘌呤霉素进行选择以产生稳定的PD-L1沉默的多克隆细胞系。图7G显示了来自PD-L1沉默的B16F10肿瘤的CD8+ TIL中的IL-10表达。将对照或PD-L1沉默的B16F10黑素瘤细胞(4×105/小鼠)皮下接种到C3-/-和C3-/-Tiger小鼠中。通过流式细胞术分析CD3+CD8+TIL中的GFP表达。右图显示了4只单独小鼠的IL-10+CD8+ TILs的百分比。图7H显示了阻断PD-1/PD-L1和补体信号传导通路对肿瘤发展的影响。将对照或PD-L1沉默的B16F10黑素瘤细胞(4×105/小鼠)皮下接种到WT和C3-/-小鼠中。植入后第7天开始每天监测肿瘤发展(分别为n＝7、7、9和8只小鼠)。对于图7I来说，将B16F10黑素瘤细胞(5×104/小鼠)皮下接种到WT小鼠中。植入后6天将小鼠随机分为4组。每组小鼠接受对照抗体、抗PD-1抗体、C3aR和C5aR拮抗剂，或抗PD-1抗体加C3aR和C5aR拮抗剂(每组n＝8只小鼠)。对于图7A-F来说，纯灰色表示同种型对照染色。对于图7A-E来说，数据代表每组6至8只小鼠的池。通过Student t检验来测定图7H和图7I中的显著性。*，P≤0.05；**，P≤0.01。
图8显示了通过补体来调节IL-10在CD8+ TIL中的生成。图8A显示了GFP+(IL-10)和GFP-CD8+ T细胞中的IL10mRNA的相对水平。图8B显示了与补体通路相关的基因的mRNA相对水平。图8A和图8B中的数据通过分析Trandem及其同事(Journal of Immunology，186：3642-52)的微阵列数据集(GSE25846)产生。对于图8C来说，将B16F10黑素瘤细胞(2×10 5个/小鼠)皮下接种到WT IL-10报告分子(Tiger)小鼠和C3-/-Tiger小鼠中。解剖来自荷瘤小鼠的引流淋巴结(dLNs)，并通过流式细胞术分析淋巴细胞中的GFP表达。数据代表每组5-6只小鼠的池。线条和误差线表示平均值±SEM。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。成对t检验。
图9显示了荷瘤小鼠中的非CD8+ T细胞应答。将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。解剖引流淋巴结和肿瘤并用胶原酶和DNA酶处理以获得单细胞悬液。以CD45阳性细胞的门控预选白细胞。图9A显示了通过流式细胞术分析来自dLNs的白细胞中的CD11b和GR1表达。图9B显示了通过使用CD4和Foxp3作为标记的流式细胞术分析来自dLN的白细胞中的调节性CD4+T细胞群。图9C显示了来自C3-/-小鼠的CD4+TIL的表型。向WT和C3-/-小鼠皮下接种B16F10细胞(2×105/小鼠)。在肿瘤接种后第12天，通过流式细胞术(每组n＝4只小鼠)分析产生IFNγ和TNFα的CD4+TIL。图9D显示了IL-10对人CD4+T细胞中效应细胞因子的生成的影响。从健康供体的PBMC中富集CD4+T细胞，并通过体外抗CD3/CD28抗体进行活化48小时。然后将活化的CD4+T细胞与100U/mlrIL-2或100U/ml rIL-2加500U/ml rIL-10一起培养48小时。在细胞内进行IFNγ和TNFα染色之前，使用细胞活化混合物(Biolegend)将细胞激活6小时。通过流式细胞术来分析IFNγ和TNFα的表达(n＝3)。图9E显示了IL-10对鼠CD4+T细胞中效应细胞因子的生成的影响。使用阴性选择试剂盒从幼年小鼠的脾中富集小鼠CD4+T细胞，并通过抗CD3/CD28抗体在体外进行活化48小时。然后将活化的CD4+T细胞与100U/ml rIL-2或100U/ml rIL-2加500U/ml rIL-10一起培养48小时。在细胞内进行IFNγ和TNFα染色之前，使用细胞活化混合物(Biolegend)将细胞激活6小时。通过流式细胞术来分析IFNγ和TNFα的表达(n＝3)。所示的数据是三个独立实验的代表。线条和误差线表示平均值±SEM。ns，p>0.05，*p≤0.05，**p≤0.01。Student’st检验。
图10显示了IL-10培养后在CD8+ TIL上表达的T细胞耗竭标记物。分离来自肺癌患者的人TIL并在体外与IL-2或IL-2加IL-10共培养21天。通过抗CD3/CD28抗体来活化T细胞24小时。通过流式细胞术分析PD-1、LAG-3和TIM-3的表面表达。FACS图谱是三名患者的代表。
图11显示了过敏毒素通过C3aR和C5aR来调节IL-10的生成。图11A显示了对从幼年小鼠处收获并用C3aR和同种型对照抗体进行染色的腹膜巨噬细胞进行的流式细胞术分析。图11B显示了对从幼年小鼠的脾收集并用C5aR抗体进行染色的脾细胞进行的流式细胞术分析。图11C显示了新鲜分离的来自野生型(WT)、C3-/-小鼠的B16肿瘤和来自WT小鼠的CPN过表达的B16肿瘤以及来自WT小鼠的离体培养的B16肿瘤中的C3a和C5a的水平。通过ELISA来量化C3a和C5a。使用培养基作为背景(每组n＝4只小鼠)。对于图11D来说，用对照或携带CPN1的病毒来转导B16黑素瘤细胞，用G418来选择过表达CPN1的稳定细胞系。通过RT-PCR证实CPN1的过表达。用β-肌动蛋白作为内部对照。图11E显示了用对照GFP或CPN2-GFP病毒转导的CPN1-过度表达的B16黑素瘤细胞的流式细胞术分析。对于图11F-G来说，通过使用板结合的抗CD3/CD28抗体对CD8+ T细胞进行活化3天。在第3天通过流式细胞术确定补体受体C3aR和C5aR的表达(图11F)。然后将活化的CD8+ T细胞在没有抗CD3/CD28抗体的新鲜培养基中再培养3天。通过流式细胞术来测定C3aR和C5aR的表达(图11G)。结果代表三只小鼠的平均值。图11H显示了补体信号传导阻断对乳腺癌发展的影响。将E0771乳腺癌细胞(1×106/小鼠)皮下接种到野生型(WT)小鼠中。将小鼠随机分为两组，并在肿瘤接种后的第7天开始每12小时用C3aR拮抗剂或对照溶液进行处理。每隔一天监测肿瘤体积(每组n＝6只小鼠)。ns，p>0.05。
图12显示了Bach2对IL-10的转录抑制作用。图12A显示了IL-10启动子中的预测Bach2结合位点。图12B显示了对WT和C3-/-小鼠中发展的B16黑素瘤的C3aR+C5aR+CD8+TILS进行bach2定位的共聚焦成像。数据代表每组8-10只小鼠的池。右图显示了总数为156个细胞的WT细胞和总数为192个细胞的C3-/-小鼠中的核点数百分比。图12C显示了Bach2表达对CD8+ T细胞中IL-19生成的影响。通过CD3/CD28抗体对T细胞进行活化24小时，接着用对照或含有逆转录病毒转导的Bach2，然后与100u/ml IL-2共培养5-6天。通过流式细胞术来监测GFP表达。图12D显示了对照和如图12C所述的Bach2表达CD8+ T细胞中对IL-10进行的细胞内染色。在流式细胞术分析之前，用PMA和伊屋诺霉素来刺激感染的T细胞4-6小时。图12E显示了Bach2表达的CD8+ T细胞中的IL10mRNA水平。通过流式细胞术来分选图12D所示的Bach2表达的CD8+ T细胞和对照CD8+ T细胞，并通过实时RT-PCR来确定IL-10的mRNA表达。基于18s rRNA进行数据标准化。图12C-E显示了三次重复的代表。误差条表示SEM。**p≤.01。
图13显示了Bach2过表达的CD8+ T细胞中的mRNA表达。通过CD3/CD28抗体对T细胞进行活化24小时，接着用对照或含有Bach2的逆转录病毒转导，然后用100U/ml IL-2共培养5-6天。通过流式细胞术来分选BFP阳性CD8+ T细胞，并提取RNA用于实时PCR测定。
具体实施方式
本公开涉及用于治疗癌症的组合物和方法。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是被招募到肿瘤部位并涉及肿瘤细胞杀伤的单核免疫细胞。TIL包括不同类型细胞(包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞)的混合物，T细胞是其中丰度最高的细胞类型。
白细胞介素10(IL-10)被广泛认为是免疫抑制性细胞因子，因为它抑制包括CD4+T细胞、树突细胞和巨噬细胞在内的许多不同细胞类型的活化。与其对许多类型的细胞的抑制作用相反，IL-10活化CD8+TIL并增强其抗肿瘤活性。然而，CD8+ TIL在正常情况下不表达IL-10。因此，需要能够活化IL-10从而提高CD8+ TIL抗肿瘤活性的癌症治疗方法。
本公开还提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：从来自受试者的样品中分离CD8+ T细胞、在白细胞介素-10存在的条件下扩增CD8+ T细胞以及将扩增的CD8+ T细胞施用于受试者。
补体的信号传导表现出对抗肿瘤免疫的多因子抑制。补体抑制CD8+ TIL中IL-10的产生，降低它们的抗肿瘤活性。补体还招募免疫抑制性骨髓衍生的抑制性细胞(MDSC)，并防止各种肿瘤模型中自然杀伤(NK)细胞的激活。在另一个方面中，本公开说明了通过抑制补体信号传导来活化CD8+ TIL的方法。一些实施方案可包括治疗癌症的方法，所述方法包括施用在白细胞介素-10存在的条件下体外扩增的CD8+ T细胞并抑制补体信号传导。
1.定义
除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在有冲突的情况下，以本文件(包括本文的任何定义)为准。以下说明了优选的方法和材料，但是与在此描述的那些相似或等同的方法和材料也可用于实践或测试所公开的实施例。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文并入本文。本公开的材料、方法和实例仅是说明性的并不旨在是限制性的。
这里使用的术语“包括(comprise)”，“包含(include)”，“具有(having)”，“具有(has)”，“可以(can)”，“包含(contain)”等及其变体旨在是开放式的过渡短语、术语或不排除其他行为或结构的可能性的词语。除非上下文另外明确指出，单数形式“一”、“一个”和“所述”也包括复数形式。无论是否明确阐述，本公开还设想了其他“包括”、“包含”和“基本上包含”这些所展示的实施例或元素的实施例。
用于与数量连用的修饰语“大约”包含设定值并具有上下文所叙述的意思(例如，它至少包括与特定量的测量相关的误差程度)。修饰语“约”也应该被认为是公开了由两个端点的绝对值定义的范围。例如，表述“从约2到约4”也公开了“从2到4”的范围。术语“约”可以指所指数字的正负10％。例如，“约10％”可指示9％至11％的范围，“约1”可指0.9-1.1。“约”的其他含义可以根据上下文明显看出，例如四舍五入，因此，例如“约1”也可以表示从0.5到1.4。
对于本文所述的数字范围，具有相同精确度的每个中间数字也明确考虑在内。例如，对于6-9的范围，除了6和9以外，还考虑数字7和8；对于6.0-7.0的范围，数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0被明确考虑。
本文中所使用的术语“施用”(administration/administrating)是指通过任何适当的途径提供、接触和/或递送以实现期望的效果。所公开的组合物可以本领域普通技术人员熟悉的许多方式施用于受试者，包括例如局部施用或全身施用，其可通过例如口服施用、皮下注射、静脉内注射、局部施用或植入。
“亲和力成熟的抗体”在本文中用于指代在一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，其导致抗体对靶抗原的亲和力(即KD，kd或ka)与不具有改变的亲本抗体相比发生改善。示例性亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。本领域已知用于生产亲和力成熟抗体的多种方法，包括对使用生物展示制备的组合抗体文库进行筛选。例如，Marks等人，BioTechnology，10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域重配对进行亲和力成熟。Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；Schier等人，Gene,169：147-155(1995)；Yelton等人,J.Immunol.,155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.,154(7):3310-3319(1995)；以及Hawkins等人,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)描述了CDR和/或框架残基的随机诱变。美国专利No.6,914,128B1描述了在选择的诱变位置和在接触区或超突变位置处，用活性增强氨基酸残基进行选择性突变。
本文所用的“抗体”是指单克隆抗体，多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)，源自动物例如但不限于鸟(例如，鸭子或鹅)、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)或非人灵长类动物(例如猴，黑猩猩等)的抗体。“抗体”还包括重组抗体、单克隆抗体、亲和力成熟抗体、双特异性抗体(bispecific antibody)、双重特异性抗体(dual specificantibody)、抗体衍生物、嵌合抗体、单链Fv(“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体，如衍生自骆驼科家族动物的的可变重链结构域(“VHH”；也称为“VHH片段”)(VHH及其制备方法在Gottlin等人，Journal of Biomolecular Screening，14：77-85(2009)中描述)以及VNAR片段、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fvs(“sdFv”)和抗独特型(“抗-Id”)抗体、双重结构域抗体、双重可变结构域(DVD)或三重可变结构域(TVD)抗体(双重可变结构域免疫球蛋白及其制备方法在Wu，C.等人，Nature Biotechnology，25(11)：1290-1297(2007)和PCT国际申请WO 2001/058956中描述，其中每一个的内容通过引用并入本申请)和上述任何的功能活性表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。术语“抗体”还包括任何抗体片段，其在本发明中用于指代包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。该部分不需要包括完整抗体的Fc区的重链恒定结构域(即CH2、CH3或CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的示例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、Fab’-SH片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv(scFv)分子、仅含有一个轻链可变区的单链多肽、含有轻链可变区的三个CDR的单链多肽、仅含有一个重链可变区的单链多肽、含有重链可变区的三个CDR的单链多肽和VHH。
本文中所使用的术语“抗癌分子”是指有效治疗受试者中的癌症的任何分子。在一些实施例中，抗癌分子包括抗体。合适的抗癌分子包括但不限于抗PD-L1(例如BMS-936559，MPDL3280A等)、抗CD40(例如，CP-870,893等)、抗TIM3、CTLA4(例如，伊匹单抗、tremelimumab等)、抗PD-1(例如，MK-3475、nivolumab等)、抗4-1BB(抗CD137)(例如，BMS663513、PF-05082566、抗-CD94(例如，IPH2201等)、抗-LAG3(例如，IMP321、LAG525、BMS-986016等)、抗-CD134(例如MED16469等)、抗-CD70(例如，ARGX-110等)、抗CD27(例如，Varlilumab等)、抗糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)(例如，TRX-518、MK-4166等)、CD278、anto-GARP(例如，ARGX-115等)、T细胞活化的免疫球蛋白抑制V型结构域(VISTA)及其组合。在一些实施例中，抗癌分子包括适体。
本文中的“适体”是指能够与其靶标特异性非共价结合的寡核酸或肽分子。适体可包括肽、DNA或RNA序列。适体可靶向PD-L1、CD40、TIM3、CTLA4、PD-1、4-1BB(CD137)、CD94、LAG3、CD134、CD70、CD27、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、CD278、GARP、T细胞活化的免疫球蛋白抑制V型结构域(VISTA)及其组合。适体与其靶标的结合可能导致靶标活性的改变。适体与其靶标的结合可能抑制靶标活性。适体与其靶标的结合可能提高靶标活性。
本文所用的“结合蛋白”是指与结合配偶体(例如多肽、抗原、化合物或其他分子或任何种类的基质)结合并与其形成复合物的单体或多聚体蛋白质。结合蛋白与结合配偶体特异性结合。结合蛋白包括抗体及其抗原结合片段和本领域已知的以及下文所述的其他各种形式和衍生物，以及包括一个或多个抗原结合结构域的其他分子，所述抗原结合结构域结合抗原分子或结合在抗原分子上的特定位点(表位)。因此，结合蛋白包括但不限于抗体、四聚体免疫球蛋白、IgG分子、IgG1分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体以及任何保留了与抗原结合能力的此类抗体的片段。
“双特异性抗体(bispecific antibody)”在本文中用于指代一种全长抗体，其通过四源杂交瘤技术(参见Milstein等人，Nature，305(5934):537-540(1983))、通过将两种不同单克隆抗体化学缀合(参见Staerz等人，Nature,314(6012):628-631(1985))、或通过凸起进洞(knob-into-hole)方法或在Fc区引入突变的类似的方法(参见Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(14):6444-6448(1993))产生，得到多种不同的免疫球蛋白种类，其中只有一种是功能性的双特异性抗体。双特异性抗体在其两个结合臂之一(一对HC/LC)上结合一个抗原(或表位)，并在其第二臂(另一对HC/LC)上结合不同的抗原(或表位)。通过该定义，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，并对于其结合的每种抗原是单价的。
在本文中可互换使用的“癌症”或“肿瘤”是指体内异常细胞的不受控制的和不受调节的生长。癌症可能侵入身体的临近部位，也可能通过淋巴系统或血流扩散到身体较远的部位。本文可互换使用的“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指以不受控制的生长异常分裂和繁殖的细胞。癌细胞可脱落并前往身体的其他部位并建立另一个位点，称为转移。癌细胞或癌症细胞也称为恶性细胞。癌细胞或癌症细胞系可源自癌症。例如，癌细胞系可以是A549细胞系(“A549”)，其是人肺腺癌上皮细胞系。
癌症可能包括肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、脑瘤、乳腺癌、类癌瘤、胃肠道癌、不明原发性癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肝外胆管癌、尤文氏肿瘤家族(PNET)、颅外生殖细胞肿瘤、眼内黑素瘤眼癌、胆囊癌、胃癌(胃)、外生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈部癌、下咽癌、胰岛细胞癌、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、急性淋巴细胞白血病、白血病、急性髓细胞、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、唇癌和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病淋巴瘤、非霍奇金病淋巴瘤、恶性间皮瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、原发灶隐匿转移性颈部鳞状癌、多发性骨髓瘤和其他浆细胞瘤、真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病、鼻咽癌、成胚细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、外分泌癌、胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻旁窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、浆细胞瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、移行细胞肾盂和输尿管癌、涎腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、睾丸癌、恶性胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、不寻常的儿童癌症、阴道癌、外阴癌和肾胚细胞瘤。
本文所使用的“补体抑制剂”是指能够抑制补体信号传导的部分。合适的补体抑制剂包括但不限于C5a抑制剂、C5aR抑制剂、C3抑制剂、C3aR抑制剂、D因子抑制剂、B因子抑制剂、C4抑制剂、C1q抑制剂或其任何组合。
本文使用的抗体的“衍生物”可指当与真正的或亲本抗体相比时，具有对其氨基酸序列进行一处或多处修饰并表现出修饰的结构域结构的抗体。该衍生物可能仍然能够采用天然抗体中存在的典型结构域配置，以及采用能够以特异性与靶(抗原)结合的氨基酸序列。抗体衍生物的典型示例是与其他多肽、重排的抗体结构域或抗体片段偶联的抗体。该衍生物还可包括至少一种其他化合物，例如，蛋白质结构域，所述蛋白质结构域通过共价键或非共价键连接。可根据本领域已知的方法使用重组核酸技术来实现连接。在含有抗体的融合蛋白中存在的另外的结构域可通过柔性接头连接，有利地是肽接头，其中，所述肽接头包括多个亲水的肽键结合的氨基酸，其长度足以跨越另一蛋白结构域的C末端与抗体的N末端之间的距离，或反之亦然。抗体可以与效应分子连接，该效应分子具有适于生物活性或与固体支持物、生物活性物质(例如细胞因子或生长激素)、化学试剂、肽、蛋白质或药物选择性结合的构象。
“双重特异性抗体(dual specific antibody)”在本文中用于指代其两个结合臂中的每一个(一对HC/LC)均可结合两种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开WO 02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有两个相同的抗原结合臂(具有相同的特异性和相同的CDR序列)，并且对于其结合的每种抗原而言都是二价的。
本文可互换使用的“双重可变结构域”或“DVD”是指结合蛋白上的两个或更多个抗原结合位点，所述结合蛋白可以是二价(两个抗原结合位点)、四价(四个抗原结合位点)或多价结合蛋白。DVD可以是单特异性的，即能够结合一种抗原(或一种特异性表位)或多特异性的，即能够结合两种或更多种抗原(即，相同靶抗原分子的两个或更多个表位或不同靶抗原的两个或更多个表位)。优选的DVD结合蛋白包括两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽并被称为“DVD免疫球蛋白”或“DVD-Ig”。因此这样的DVD-Ig结合蛋白是四聚体并且使人联想到IgG分子，但提供比IgG分子更多的抗原结合位点。因此，四聚体DVD-Ig分子的每一半使人联想到IgG分子的一半，并包括重链DVD多肽和轻链DVD多肽，但不同于IgG分子中提供单个抗原结合结构域的一对重链和轻链，DVD-Ig的一对重链和轻链提供两个或更多个抗原结合位点。
DVD-Ig结合蛋白的每个抗原结合位点可来源于供体(“亲本”)单克隆抗体，并因此包括具有针对每个抗原结合位点总共有6个参与抗原结合的CDR的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。因此，结合两种不同表位(即，两种不同抗原分子的两种不同表位或相同抗原分子的两种不同表位)的DVD-Ig结合蛋白包括源自第一种亲本单克隆抗体的抗原结合位点和第二种亲本单克隆抗体的抗原结合位点。
在一个实施例中，DVD-Ig结合蛋白不仅结合与其亲本单克隆抗体结合的靶分子相同的靶分子，而且还具有其一个或多个亲本单克隆抗体的一种或多种期望性质。优选地，这种附加性质是一个或多个亲本单克隆抗体的抗体参数。来自一个或多个亲本单克隆抗体的可对DVD-Ig结合蛋白产生贡献的抗体参数包括但不限于抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物学功能、表位识别、蛋白质稳定性、蛋白质溶解度、生产效率、免疫原性、药代动力学、生物利用度、组织交叉反应性和直向同源抗原结合。
在本文中可互换使用的术语“有效剂量”，“有效量”或“治疗有效量”是指在所需时间内有效达到所需治疗结果的的量。本领域技术人员可确定有效量，且该有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在个体中引起期望的应答的能力等因素而变化。本文使用的该术语还可指在动物、哺乳动物或人体中有效引起期望的体内作用(例如，降低和/或抑制雌激素受体的功能)时的量。治疗有效量可在一次或多次施用、应用或剂量中给予(例如，该试剂可在疾病进展的任何阶段、症状之前或之后作为预防性治疗或以治疗方式给予等)，并不旨在限于特定的制剂、组合或施用途径。在公开的范围内，所公开的融合蛋白可在受试者治疗过程的不同时间施用。所用的施用时间和剂量取决于多种因素，比如，治疗的目标(例如，治疗与预防)、受试者的病情等，并可由本领域技术人员很容易地确定。
“表位”或“感兴趣的表位”是指任何分子上被其特异性结合配偶体识别并可结合特异性结合配偶体上的互补位点的位点。上述分子和特异性结合配偶体是特异性结合对的一部分。例如，表位可位于多肽、蛋白质、半抗原、糖抗原(例如，但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖)或多糖上。其特异性结合配偶体可以是，但不限于，抗体。
本文中所使用的“F(ab’)2片段”是指通过胃蛋白酶消化完整IgG抗体以除去大部分Fc区而同时使一些铰链区保持完整而产生的抗体。F(ab’)2片段具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab)部分，因此它们是二价的，分子量约为110kDa。二价抗体片段(F(ab’)2片段)小于完整IgG分子，并使得其能够更好地穿透组织，从而在免疫组织化学中促进更好的抗原识别。F(ab’)2片段的使用还避免了与活细胞上的Fc受体或蛋白质A/G的非特异性结合。F(ab’)2片段可结合并沉淀抗原。
本文所使用的术语“离体、体外(ex-vivo)”是指在机体外应用于获自机体的细胞、组织或其他样品的条件。例如，CD8+ T细胞的体外处理可包括在受试者体外的人造环境中将从获自受试者的样品中分离的CD8+ T细胞暴露于的IL-2和/或IL-10。体外处理之后，细胞、组织或其他样品可施用于受试者或施用于一个或多个其他受试者。
本文所使用的“框架”(FR)或“框架序列”可表示可变区减去CDR的剩余序列。由于可通过不同的系统来确定CDR序列的确切定义(例如，参见上文)，因此框架序列的含义会受到相应不同的解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)也在每条链上将轻链和重链上的框架分成四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，以及CDR3位于FR3和FR4之间。在没有特别指定特定的亚区为FR1、FR2、FR3或FR4时，框架区如其他人所指代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的FR的组合。本文所述的一个FR(FR)代表四个亚区中的一个，且多个FR(FRs)代表构成框架区的四个亚区中的两个或更多个。
可使用本领域已知的技术将其用作重链和轻链“接受体”框架序列(或简称为“接受体”序列)以对非人抗体进行人源化的人重链和轻链FR序列在本领域中是已知的。在一个实施例中，人类重链和轻链接受体序列选自公开可获得的数据库如V-碱基(超文本传输协议：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或国际信息系统(超文本传输协议：//imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)中列出的框架序列。
如本文所使用的术语“功能性抗原结合位点”可指结合蛋白(例如，抗体)上能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力可能不如亲本结合蛋白(例如，抗原结合位点源自的亲本抗体)，但结合抗原的能力必须可使用已知用于评估蛋白质(例如，抗体)与抗原结合的多种方法中的任何一种来测量。而且，多价蛋白质(例如，多价抗体)的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不需要在数量上相同。
本文中可互换使用的“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是指包括最初衍生自两种或多种分离蛋白的多肽序列的蛋白。
本文使用“人源化抗体”来描述包括来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列，但其中至少一部分VH和/或VL序列已被改变为更“像人类”，即更类似于人类种系可变序列的抗体。“人源化抗体”是免疫特异性结合感兴趣的抗原的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，且其包括基本上具有人抗体氨基酸序列的框架(FR)区和具有基本上非人抗体氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文所用的术语“基本上”在述及CDR时是指与非人抗体CDR的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的CDR。人源化抗体包括基本上全部的至少一个、通常为两个可变结构域(Fab，Fab’，F(ab’)2，FabC，Fv)，其中，全部或基本上全部的CDR区与非人免疫球蛋白(即供体抗体)的CDR区相对应，并且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。在一个实施例中，人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施例中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。该抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施例中，人源化抗体仅包括人源化轻链。在一些实施例中，人源化抗体仅包括人源化重链。在特定实施例中，人源化抗体仅包括轻链和/或人源化重链的人源化可变结构域。
人源化抗体可选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA、IgY和IgE，以及任何同种型的，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可包括来自多于一种类别或同种型的序列，并可使用本领域众所周知的技术来选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
人源化抗体的框架区和CDR不需要与亲本序列精确对应，例如，可通过取代、插入和/或缺失至少一个氨基酸残基来诱变供体抗体CDR或共有框架，使得该位点的CDR或框架残基既不对应于供体抗体或也不对应于共有框架。然而，在优选实施例中，这些突变将不会扩展。通常，至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，并且最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用的术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用的术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker，FromGenes toClones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，1987))。“共有免疫球蛋白序列”因此可包括“共有框架区”和/或“共有CDR”。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置被家族中在该位置最频繁出现的氨基酸所占据。如果两个氨基酸出现频率相同，则可在共有序列中包括其中任一。
在本文中，在述及两个或更多个多肽或多核苷酸序列时“相同的”或“同一性”可意指所述序列具有的在具体区域内相同的残基的具体百分比。可通过最佳比对两个序列、比较具体区域上的两个序列、确定两个序列中出现相同残基的位置数以获得匹配位置的数目、将匹配位置的数量除以具体区域中位置的总数以及将结果乘以100得到序列同一性的百分比来计算百分比。在两个序列长度不同或者比对产生一个或多个交错末端并且比较的具体区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基被包括在算式的分母中而不是分子中。
如本文所用的“肺癌”是指起源于肺的癌症。例如，肺癌可以是肺的癌症，如小细胞肺癌(cancer)(也称为小细胞肺癌(carcinoma)和燕麦细胞癌)、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、腺瘤、类癌瘤和未分化的癌。
本文可互换使用的“非小细胞肺癌”或“NSCLC”是指除小细胞肺癌以外的任何类型的上皮性肺癌。NSCLC的三种主要亚型是腺癌，包括细支气管肺泡癌、鳞状细胞肺癌和大细胞肺癌。NSCLC对化疗相对不敏感。
本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质(即除了可能以极少的量存在的天然突变之外，该群所包括的单个抗体均是相同的)的抗体群获得的抗体。单克隆抗体是针对单一抗原高度特异性的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中，一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物学特性即可。
本文使用“多价结合蛋白”指包括两个或多个抗原结合位点(本文也称为“抗原结合结构域”)的结合蛋白。多价结合蛋白优选地经工程化以具有三个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指可结合两个或多个相关或不相关的靶的结合蛋白，包括能够结合相同靶分子的两个或多个不同表位的结合蛋白。
“重组抗体”是指通过一个或多个步骤制备的抗体，包括通过重组技术将编码一种或多种单克隆抗体中的全部或部分到合适的表达载体的核酸序列克隆，随后在合适的宿主细胞中表达抗体。该术语包括但不限于重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、由抗体片段形成的多特异性或多价结构、双功能抗体、异源偶联抗体、和本文(i)中所述的其他抗体。(双重可变结构域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu，C等人，Nature Biotechnology，25：1290-1297(2007)中)。本文使用的术语“双功能抗体”是指包括具有对一个抗原位点的特异性的第一臂和具有对不同抗原位点的特异性的第二臂的抗体，即双功能抗体具有双重特异性。
本文中所使用的“样品”、“测试样品”、“样本”、“来自受试者的样品”和“患者样品”可互换使用并可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊髓液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品。可以直接使用从患者处获得的样品的形式，或者可对样品进行预处理(例如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰组分的失活、添加试剂等)从而以本文中所讨论的方式或本领域已知的其他方式改变样品的特性。
可利用任何细胞类型、组织或体液来获得样品。这些细胞类型、组织和液体可包括组织(例如，活检和尸检样品)切片、为了组织学目的而取得的冷冻切片、血液(如全血)、血浆、血清、痰、粪便、眼泪、粘液、唾液、支气管肺泡(BAL)灌洗液、毛发、皮肤、红细胞、血小板、间质液、眼晶体液、脑脊液、汗液、鼻液、滑液、月经、羊水、精液等。细胞类型和组织还可包括淋巴液、腹水、妇科液体、尿液、腹膜液、脑脊液、通过阴道润洗收集的液体或通过阴道冲洗收集的液体。可通过从动物移除细胞样品来提供组织或细胞类型，但也可通过使用先前分离的细胞(例如，在另一个时间和/或用于另一个目的而由另一个人分离的)来完成。还可使用保藏组织，例如那些具有治疗或结果历史的保藏组织。蛋白质或核苷酸的分离和/或纯化可能不是必需的。
本文所使用的“特异性结合”或“特异性结合”可指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，其中所述相互作用取决于化学物质上的特定结构(例如，抗原性决定簇或表位)；例如，抗体通常识别并结合特定蛋白质结构而不是泛泛地识别并结合任意蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的、未标记的“A”)的存在将减少结合至抗体的标记的“A”的量。
本文所用的“受试者”和“患者”可互换地指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如猴，如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩等)和人)。在一些实施例中，受试者可以是人类或非人类。受试者或患者可以正接受其他形式的治疗。
“治疗”(treat、treating、treatment)在本文中各自可互换使用，以描述逆转、减轻或抑制上述术语所应用于的疾病的进展或此种疾病的一种或多种症状。取决于受试者的病况，该术语还指预防疾病，并包括预防疾病的发作或预防与疾病相关的症状。治疗可通过急性或慢性方式进行。该术语还指在患病之前降低与这种疾病相关的疾病或症状的严重程度。这种在患病之前对疾病的严重程度的预防或降低是指将抗体或药物组合物施用于在给药时不患有此等疾病的受试者。“预防”还指防止疾病或与这种疾病相关的一种或多种症状的复发。“疗法(treatment)”和“治疗性”是指治疗的行为，“治疗”如上定义。
本文使用“变体”来描述通过氨基酸的插入、缺失或保守置换而在氨基酸序列上不同但保留至少一种生物学活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性示例包括被特定抗体结合或促进免疫应答的能力。本文还使用变体来描述与参考蛋白质具有基本上相同的氨基酸序列并保留至少一种生物学活性的蛋白质。“变体”也可用于描述经过不同的加工(例如，通过蛋白水解、磷酸化或其他翻译后修饰)但仍保留其抗原反应性的多肽或其片段。
除非在此另外定义，否则与本文公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的任何命名法和技术都是本领域中公知和常用的。术语的含义和范围应该清楚；然而如果存在任何潜在的歧义，则本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。
2.补体抑制
补体受体在T淋巴细胞上表达，补体系统是先天性和继发性免疫的主要成分。因此，长期以来认为补体在肿瘤免疫监视中发挥积极作用。然而，补体信号传导还抑制人类抗肿瘤免疫性。患者血浆或肿瘤中的补体水平与肺癌、结肠直肠癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌、消化道癌、脑肿瘤和慢性淋巴细胞白血病的肿瘤大小和不良结果呈正相关。补体C3通过补体受体C3aR和C5aR来抑制CD8+ TIL中IL-10的产生。补体缺陷小鼠以T细胞和IL-10依赖性的方式对肿瘤发展具有抗性。来自补体缺陷小鼠的CD8+ TIL表达IL-10并表现出增强的效应子功能。缺乏补体成分(C3，C4或C5aR)或用补体抑制剂治疗的小鼠表现出肿瘤抗性或抑制转移。补体还可通过招募MDSC或通过抑制NK细胞活化来抑制抗肿瘤免疫性。
本公开的另一个方面提供一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗量的补体抑制剂。在一些方面中，补体信号传导的抑制可用来增强另一种癌症疗法的效果。例如，人类抗PD-1抗体可用来治疗黑色素瘤和肺癌。然而，仅约10-30％的患者对抗PD-1治疗有反应。补体信号传导介导的免疫抑制不影响肿瘤上的T细胞或PD-L1上的PD1，表明补体信号传导和PD-1信号传导是两条独立的通路。通过拮抗剂对C3aR和C5aR以及抗PD-1的补体信号传导的联合阻断可增强抗PD-1治疗的功效。
在一些实施例中，所述补体抑制剂可包括C5a抑制剂、C5aR抑制剂、C3抑制剂、C3aR抑制剂、D因子抑制剂、B因子抑制剂、C4抑制剂、C1q抑制剂中的一种或多种或其任何组合。合适的补体抑制剂可包括，但不限于SB-290157(作为C3aR的选择性拮抗剂开发的非肽小化合物)、PMX205(环六肽氢化肉桂酸酯-(L-鸟氨酸-脯氨酸-D-环己丙氨酸-色氨酸-精氨酸)是明确定义的C5aR拮抗剂)、因子D抑制剂(例如，BCX1470等)、sCR1-sLex/TP-20、Mirococept、TNX-234、TNX-558、TA106、Neutrazumab、抗备解素、HuMax-CD38、ARC1905、JPE-1375、JSM-7717、C1INH、Rhucin/rhC11NH、sCR1/TP10、CAB-2/MLN-依库珠单抗、培克珠单抗、Ofatumumab、Compstatin/POT-4、PMX-53、rhMBL等及其组合。
3.白细胞介素10(IL-10)
IL-10是一种在免疫调节和炎症中具有多种多向作用的细胞因子。IL-10具有免疫抑制作用，包括抑制促炎细胞因子如TNFα、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-12和IFNγ，抑制抗原呈递和抑制CD4+ T细胞活化。IL-10在各种肿瘤模型中促进肿瘤生长和进展。尽管其对许多类型的细胞具有抑制作用，但IL-10可以用来活化和扩增CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)并促进它们的抗肿瘤活性。
在一些实施例中，白细胞介素10可包含白细胞介素10蛋白或其变体。白细胞介素10蛋白的变体可包括通过插入、缺失或取代氨基酸而氨基酸序列不同但保留IL-10的至少一种生物学活性的肽或多肽。可根据不同目的制备IL-10变体，所述目的包括增加血清半衰期、减少针对IL-10的免疫应答、促进纯化或制备、减少IL-10向其单体亚单位的转化、改善治疗功效以及在治疗使用期间减轻副作用的严重性或发生。氨基酸序列变体可以是天然不存在的变体，但其他氨基酸序列变体可以是翻译后变体，例如，糖基化变体。只要其保留适当水平的IL-10活性，任何IL-10变体都可使用。本领域的技术人员应了解，IL-10的形式可改变。例如，一种形式可包括野生型人IL-10。另外，也可选择可能对IL-10R n CD8+ T细胞具有所需亲和力的IL-10的其它修饰形式。IL-10可来源于哺乳动物，例如人类或老鼠。人IL-10(hIL-10)优选用于治疗需要IL-10疗法的人。
可使用本领域已知的标准技术以多种方式获得IL-10，例如，从能够分泌蛋白质的活化细胞(例如T细胞)的培养基中分离和纯化、使用化学合成或重组技术来获得(参见，例如，Merrifield,Science 233:341–47(1986)；Atherton et al.,Solid Phase PeptideSynthesis,A Practical Approach,1989,I.R.L.Press,Oxford；美国专利No.5,231,012教导了用于生产具有IL-10活性的蛋白质的方法，包括使用重组和其他合成技术)。重组人IL-10也是可商购的，例如来自PeproTech，Inc.，Rocky Hill，N.J.。
4.IL-10在继发性细胞治疗的TIL扩增中的应用
本公开的另一个特征提供IL-10在继发性细胞治疗的TIL扩增中的应用。描述了将免疫细胞转移至患者体内的继发性细胞疗法(ACT)已经显示出在多种类型的癌症中具有持久的临床疗效。然而，仅有小部分癌症患者获益于ACT。在当前临床ACT方案下转移的细胞的功效通常受到植入效率低、持久性差和对肿瘤细胞攻击能力弱的限制。
尽管使用了TCR和CAR-T基因工程化的T细胞的ACT已经证明在晚期癌症患者中具有诱导治愈性的应答的一些能力，但是存在许多重大问题，包括植入效率低、持久性差和CTL活性差，这些限制了现有的ACT技术。用细胞因子预处理T细胞可用于将基因工程化的和抗肿瘤特异性的T细胞编程为用于ACT的抗肿瘤T细胞，但尚未完全建立具有在体内持久影响的可靠和有效的处理方法。例如，用IL-12加IL-2处理基因工程化的T细胞导致其效力增加，但ACT产物的数量减少以及IL-15加IL-2导致来自人乳腺癌的CD8+ TILs的短寿命。因此，需要能够在体内产生足够数量的有效抗肿瘤细胞并在转移后长期存在于体内的最佳处理条件。
IL-10是处理用于ACT的基因工程化T细胞的优秀候选者。IL-10加IL-2显著增强人CD8+ TILs的数量和效力。鉴于C3aR/C5aR1拮抗剂诱导CD8+ T细胞中的IL-10产生以及巨噬细胞中的内源性IL-12产生，在一些实施例中补体抑制剂也可用于辅助处理CD8+ T细胞。
在一些方面中，本公开提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其特征在于，所述方法包括：从来自受试者的样品中分离CD8+ T细胞、将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-10、将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-2、扩增所述CD8+ T细胞以及向所述受试者施用所述扩增的CD8+ T细胞。可利用任何细胞类型、组织或体液来获得样品。这样的细胞类型、组织和液体可包括组织(例如活检和尸检样品)切片、为了组织学目的而取得的冷冻切片、血液(例如全血)、血浆或血清。在一些实施例中，所述样品可包括组织样品。在一些实施例中，所述样品可包括肿瘤样品。在一些实施例中，所述样品可以是血液样品。
在一些实施例中，可在暴露于白细胞介素-10之前，将所述CD8+T细胞暴露于白细胞介素-2。在其他实施例中，可将所述CD8+ T细胞同时暴露于白细胞介素-2和白细胞介素-10。在某些实施例中，可将CD8+ T细胞暴露于白介素-2、白细胞介素-10或白细胞介素-2和白细胞介素-10约1小时至约4周、约1小时至约3周、约6小时至约两周或约12小时至两周左右。在一些实施例中，可将CD8+ T细胞暴露于白介素-2、白细胞介素-10或白细胞介素-2和白细胞介素-10约1小时、约6小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约3天、约5天、约1周、约10天、约2周、约3周或约4周。
正如本领域普通技术人员显而易见的，细胞可被扩增至并以任何合适的数量使用。例如，在一些实施例中，在向受试者施用之前，CD8+T细胞可扩增到至少1×106个细胞的密度。在一些实施例中，在向受试者施用之前，CD8+ T细胞可扩增到至少2×107个细胞的密度。
正如本领域技术人员显而易见的，细胞可通过任何合适的浓度暴露于白细胞介素-2和白细胞介素-10。例如，在一些实施例中，CD8+ T细胞可暴露于约10-10,000U/mL IL-2。在一些实施例中，CD8+ T细胞可暴露于约10-6,000U/mL IL-2。在一些实施例中，CD8+ T细胞可暴露于约10、约100、约120、约500、约1,000、约2,000、约3,000、约4,000、约5,000、约6,000、约7,000、约8,000、约9,000或约10,000U/mLIL-2。在一些实施例中，IL-2的浓度可随时间推移增加或减少。作为非限制性示例，在第一周期间，CD8+ T细胞可暴露于约10-120U/mL IL-2，然后在第二周期间将IL-2浓度增加至6,000IU/mL。在一些实施例中，CD8+ T细胞可暴露于约1-10,000U/mL IL-10。在一些实施例中，细胞可暴露于约10-1,000U/mL IL-10。在一些实施例中，细胞可暴露于约10、约50、约100、约500、约1,000、约2,000、约3,000、约4,000、约5,000、约6,000、约7,000、约8,000、约9,000或约10,000U/mL IL-10。在一些实施例中，IL-10的浓度可随时间推移增加或减少。
在一些实施例中，除了白细胞介素-2和白细胞介素-10之外，细胞可在体外暴露于补体抑制剂。正如本领域技术人员显而易见的，细胞可通过任何合适的浓度暴露于补体抑制剂。细胞可与IL-2、IL-10或IL-2和IL-10同时暴露于补体抑制剂，或者在一些实施例中，细胞可在暴露于IL-2、IL-10或IL-2和IL-10之前或之后暴露于补体抑制剂。
本公开的方法还可与其他已知癌症治疗方法结合使用。在一些实施例中，所述方法还可包括向所述受试者施用抗癌剂。在一些实施例中，抗癌剂可包括顺铂、奥沙利铂、激酶抑制剂、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、lambrolizumab和nivolumab中的至少一种。
在一些实施例中，本公开的方法还包括向所述受试者施用补体抑制剂。在一些实施例中，补体抑制剂和扩增的CD8+ T细胞可共同施用。在其他实施例中，可在施用所述扩增的CD8+ T细胞之前施用补体抑制剂。在其他实施例中，所述扩增的CD8+ T细胞可在施用补体抑制剂之前施用。
应了解，前面的详细描述和伴随的例子仅仅是说明性的，并且不被认为是对本公开或所要求保护的主题的范围的限制，其仅由所附权利要求及其等同物限定。
对于所公开的实施例的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。包括但不限于与化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法有关的那些变化和修改，其可在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行。
5.示例实施例
实施例1
方法
小鼠和鼠类细胞系：C57BL/6J(野生型)小鼠(库存号000664)、C3-/-小鼠(N7，库存号003641)、TCRα-/-小鼠(N13，库存号002116)、IL10-/-小鼠(N13，库存号：002251)和IL10GFP报告分子(Tiger)小鼠(N10，库存号：008379)，购自The Jackson Laboratory。C3-/-小鼠进一步与C57BL/6J回交5代(N12)。N表示回交世代的数量。六到八周大的小鼠用于所有实验。所有的小鼠品系都是C57BL/6遗传背景。小鼠被安置在杜克大学医学中心的特定无病原体设施中，并根据杜克大学机构动物管理及使用委员会批准的方案使用。B16-F10鼠黑素瘤细胞系于2011年从ATCC购买。E0771是一种小鼠乳腺癌，由Scott A.Gerber博士(罗彻斯特大学)于2013年赠送。
肿瘤模型：在100μLPBS中将总共5×104至4×105的B16F10或1×106的E0771肿瘤细胞皮下注射接种到6至8周龄的小鼠中。每天或每隔一天监测肿瘤发展。当肿瘤体积达到2,000mm3时将小鼠处死。
小鼠离体和体外实验：将肿瘤切成小块(<3mm)，并在37℃下在5mL解离溶液[补充有胶原酶I型(200U/mL)和DNA酶I(100μg/mL)的RPMI培养基]中温育30分钟。孵育期间每10分钟通过吹打和涡旋来混合样品。胶原酶(C0130)和DNA酶I(ND25)购自Sigma-Aldrich。使用CD45来区分肿瘤浸润白细胞与其他细胞，并使用靶向表面标记物的不同抗体进行流式细胞术分析。为了进行细胞内细胞因子染色，将细胞在完全RPMI培养基中与佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、伊屋诺霉素和布雷菲德菌素A(Cell Activation Cocktail；BioLegend)共培养4至6小时。
微阵列数据分析：使用6,000U/mL rIL2和/或100U/mL rIL10将来自人肺肿瘤的TIL体外扩增20天。通过在3μg/mL抗-CD3/CD28抗体中温育6小时来活化经扩增的TIL。通过使用试剂盒(StemcellTechnologies)进行阴性选择来富集CD8+ TIL。根据说明书使用TRIzol试剂(Life Technologies)来提取RNA。通过杜克大学微阵列设施使用人类U133A2.0阵列来进行微阵列分析。使用具有标准背景校正的PartekGenomics Suite(PartekIncorporated)分析来自CEL文件的原始强度，以针对每个探针组以log2量表产生RMA(稳健多阵列平均强度)。以在两个或更多个阵列中检测到“存在”筛选探针组，且四分位间强度范围>0.5。然后使用高级ANOVA分析筛选后的RMA强度的差异表达，并使用Benjamini-Hochberg方法产生具有/不具有FDR调整的P值的差异表达基因。
RT-PCR：根据制造商的方案用Direct-Zol(Zymo Research)来分离RNA。用SuperScript III逆转录酶(Life Technologies)来合成互补DNA。使用基于SYBR绿色的检测(Applied Biosystems)进行定量实时PCR。对于肿瘤细胞中的mRNA表达，使用β-肌动蛋白mRNA来对样品进行标准化。
补体受体拮抗剂和PD-1抗体治疗：C3a受体拮抗剂SB 290157购自EMD Millipore，C5a受体拮抗剂PMX205购自Selleck Chemicals LLC。对于E0771乳腺肿瘤，在肿瘤植入后第9天用10mg/kg的SB290157和1mg/kg的PMX205(均在5％DMSO/5％乙醇/90％PBS中)对小鼠进行两次腹膜内处理。对照小鼠用5％DMSO/5％乙醇/90％PBS来处理。对于B16黑素瘤，小鼠每周两次以200μg/小鼠腹膜注射抗PD-1抗体(克隆：RMP1-14；Bio X细胞)，或使用如E0771模型中所述的SB 290157和PMX205或抗PD-1抗体与SB 290157和PMX205的组合。
实时阻抗分析：应用实时细胞分析(RTCA)S16(ACEABiosciences)使用实时阻抗分析进行人TIL体外杀伤测定。将原代自体癌细胞(1.5×104个细胞/孔)接种在E-plate 16中并培养2天。将TIL体外扩增21天并用抗CD3/CD28抗体刺激24小时。将效应细胞以20:1的比例(效应细胞：癌细胞)加入到每个孔中与肿瘤细胞一起培养。将癌细胞和效应细胞在37℃的CO2培养箱中共培养，并通过RTCA S16进行实时监测。
继发性细胞转移：使用EasySepmouse CD4+T细胞和EasySep小鼠CD8+ T富集试剂盒(Stemcell Technologies)来负向富集CD4+和CD8+ T细胞。通过静脉注射将一百万个混合的CD4+和CD8+ T细胞(2：1)转移到6-8周龄的性别匹配的受体小鼠中。在T细胞转移14天后，将受体小鼠皮下植入B16F10黑素瘤，每天监测肿瘤生长。
使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑产生PD-L1缺陷型稳定细胞系：B16细胞在完全DMEM培养基中培养。细胞每2至3天以1：6至1：8的比例传代。pLentiCRISPR V1质粒是FengZhang的赠品(Addgene质粒#49535。当前版本是pLentiCRISPR V2，质粒#52961)。通过在线程序(http://crispr.mit.edu/)将小鼠PD-L1的Cas9向导序列(NCBI登录号：GQ904196)设计为5’AGCCTGCTGTCACTTGCTAC3’。两个寡核苷酸由IDT合成为5’CACCGAGCCTGCTGTCACTTGCTAC3’和5’AAACGTAGCAAGTGACAGCAGGCTC3’(黑体表示BsmBI限制性位点)。根据来自Zhang实验室的方案，将pLentiCRISPR V1用BsmBI消化，并将退火的寡核苷酸克隆到pLentiCRISPR V1中。为了制备慢病毒，用包装质粒pVSVg(AddGene#8454)和psPAX2(AddGene#12260)将pLentiCRISPR(与克隆的sgRNA)共转染到HEK293(F)T细胞中。为了PD-L1沉默，根据方案将CRISPR对照或靶向PD-L1病毒的CRISPR sgRNA转导入B16F10细胞。在转导48小时后，在含有1μg/mL嘌呤霉素(Invivogen)的完全培养基中选择转导的B16F10细胞。培养基每48小时更换一次。通过流式细胞术来测定PD-L1的表达。关于向导RNA设计和构建克隆的更多详细信息，可查看http://crispr.genomeengineering.org。
引物列表：
小鼠CPN1(NM_030703)
正链：5′GGTGGACCTGAACCGCAACTTC 3′
负链：5′CGTTGGTGATGCCGTCTGGAA 3′
小鼠β-Actin(NM_007393)
正链：5′ACCTTCTACAATGAGCTGCG 3′
负链：5′CTGGATGGCTACGTACATGG 3′
C3a和C5a ELISA
补体C3a和C5a小鼠ELISA试剂盒(目录号ABIN415413和ABIN415613)购自Antibodies-Online。从每只小鼠处仔细解剖肿瘤以保持完整。将肿瘤在冷PBS中漂洗以彻底除去血液并在均质化之前称重。然后将肿瘤切碎成小块并在PBS中匀浆。将匀浆离心以获得无细胞上清液。通过ELISA测定上清液中和来自B16细胞培养物的培养基中存在的C3a和C5a的量。
C3aR和C5aR拮抗剂体外阻断：使用阴性选择试剂盒(StemcellTechnologies；目录号19853)富集来自淋巴结的小鼠CD8+ T细胞，并通过板结合的抗CD3(2μg/mL)和抗CD28(1μg/mL)抗体进行活化72小时。然后在完全培养基(对照)、10μmol/L SB290157(C3aR拮抗剂，C3aRA)、10μmol/L PMX205(C5aR拮抗剂，C5aRA)或10μmol/L SB290157和10μmol/L PMX205中培养CD8+ T细胞6天。通过细胞内染色来确定IL10的表达。
人样品：新鲜分离的人肝癌和肺癌活检,以及外周血由北京肿瘤医院和研究所的肝胰胆外科和胸外科提供。该研究按照赫尔辛基宣言进行，并经北京肿瘤医院和研究所伦理委员会批准。患者签署了知情同意书。
统计分析：数据以平均值±SEM表示。当进行多重比较时，通过双尾Student t检验或单向ANOVA分析结果。统计学显着性定义为P≤0.05。
用于流式细胞术和细胞分选的抗体：抗人CD3(HIT3A)、CD4(A161A1)、CD8(HIT8A)、IFNγ(4S.B3)、TNFα(MAb11)、C3aR(hC3aRZ8)、C5aR(S5/1)抗体和抗小鼠CD3(17A2)、CD4(GK1.5)、CD8(53-6.7)、CD11b(M1/70)、CD11c(N418)、CD19(6D5)、CD25(3C7)、CD45.2(104)，TCRβ(H57-597)、TCRγδ(UC7-13D5)、F4/80(BM8)、IFNγ(XMG1.2)，TNFα(MP6-XT22)、IL-10(JES5-16E3)、GR1(RB6-8C5)、Ly6C(HK1.4)、Ly6G(1A8)、IA/IE(M5/114.15.2)、NK1.1(PK136)、FOXP3(MF-14)、PD-1(29F.1A12)、PD-L1(10F.9G2)购自Biolegend，相关的同种型对照抗体也来自Biolegend。一级抗小鼠C3aR抗体(D20)和山羊IgG同种型对照购自SantaCruz Biotechnology；Alexa Fluor 488驴抗山羊二抗购自Life technologies。在表面染色之前用小鼠Fc受体单克隆抗体(2.4G2；BD PharMingen)封闭Fc受体。将CD45用于白细胞门控，并且在某些实验中在细胞表面染色之前使用LIVE/DEAD Fixable Dead Cell StainKit(Life Technologies)来检测死细胞。对于细胞因子细胞内染色，根据制造商的说明使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD PharMingen)将细胞固定并透化，然后用IFNγ、TNFα或IL-10单克隆抗体进行染色。使用同种型对照抗体来区分背景染色。将FOXP3Fix/Perm BufferSet(Biolegend)用于FOPX3细胞内染色。
人类TIL培养：用锋利的手术刀将肿瘤切成小块(每边大约2mm)。将片段浸入含有1.5mg/ml II型胶原酶(Gibco，目录号17101-015)和10μg/ml I型脱氧核糖核酸酶(Sigma，目录号DN25)的5ml无血清RPMI 1640中并在37℃时温育2-3小时，同时进行轻轻搅拌。使单细胞浆液通过无菌70μm筛网以除去未消化的组织块。消化的单细胞悬浮液在PBS中洗涤两次，活细胞在两步Ficoll梯度上纯化，重新悬浮细胞以进行铺板。在24孔板的多个孔中接种1×106个在2mL的含有6000U/mL IL-2和/或100U/ml IL-10的培养基中的活细胞。将板置于加有5％CO2的37℃潮湿培养箱中。一旦淋巴细胞生长可见，在不迟于培养开始后1周，将所有孔中的一半培养基替换。当任何孔变得接近融合时，将内容物剧烈混合，分成两个子孔，并用培养基加6000U/mL IL-2和/或100U/ml IL-10填充至每孔2mL。随后，每周更换一半培养基至少两次，或将培养物分开以保持细胞密度为0.8至1.6×106个细胞/mL。来自24孔板各孔的消化物的TIL作为独立的TIL培养物进行处理，并与任何其他原始孔的后代分开保存。
稳定细胞系的生成：B16细胞在完全DMEM培养基中培养。细胞每2-3天传代，比例为1：6至1：8。为了过表达CPN1，将CPN1 CDS克隆到修饰的pLenti6.3载体(Lifetechnologies)中，并根据制造商的方案对病毒进行包装。转导后48小时，在含有800μg/mlG418(Invivogen)的完全培养基中选择转导的B16细胞。为了过表达CPN2，将CPN2CDS克隆到pLenti7.3中，并根据制造商的方案包装病毒。分选GFP阳性的经转导的B16F10细胞以产生稳定的细胞系。
实施例2
通过补体来调节IL-10在CD8+ T细胞中的表达
为了研究效应子CD8+ T细胞中IL-10生成的分子调节，基于Trandem及其同事收集的数据(Journal of Immunology，186：3642-52)分析了IL-10+CD8+ T细胞的基因表达谱。图1A显示了IL-10+CD8+ T和IL-10-CD8+ T细胞中差异表达的基因的热图。GFP+CD8+ T细胞中的IL10mRNA水平高于GFP-CD8+ T细胞中的IL10mRNA水平，表明了在该数据集中GFP的表达忠实地反映了IL-10的表达(图8A)。通路分析显示了参与补体途径的基因在IL-10+和IL-10-CD8+ T细胞之间差异表达的基因中高度富集(图1B)。几种补体成分及其受体的mRNA表达水平在IL-10+CD8+ T细胞中得到上调(图1C和D)。这些数据表明补体信号传导通路可能参与调节CD8+ T细胞中IL-10的表达。
为了测试补体信号传导是否可在肿瘤发育过程中调节效应子CD8+ T细胞中的IL-10产生，将IL10报道分子小鼠(称为Tiger小鼠)(其中在IL10基因的终止密码子和聚腺苷酸化信号之间插入IRES-GFP盒(如Kamanaka等人，Immunity，25(6)：941-52(2006)所述))与C3缺陷小鼠杂交(如Wessels等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(25):11490-94(1995)所述)，并用B16黑素瘤接种野生型和C3-/-IL10报告分子小鼠。测量了CD8+ TIL中IL-10的生成。如图1E所示，在C3-/-小鼠中大约10％的CD8+ TIL表达高水平的IL-10，而野生型小鼠中未检测到产生IL-10的CD8+ TIL(图1E)。野生型Tiger或C3C3-/-Tiger小鼠的引流淋巴结(dLN)中的CD8+ T细胞不产生IL-10(图8C)。这些数据证明补体信号传导抑制CD8+ TIL中的IL-10产生，并且将其去除足以促进IL-10在肿瘤微环境中产生但不在外周产生。
实施例3
通过补体来抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫性
C3缺陷小鼠黑色素瘤的发展：在100μL PBS中将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到6-8周大的野生型(WT)和C3敲除(C3-/-)小鼠中。从第7天开始每天监测肿瘤生长。C3缺陷型小鼠的B16黑素瘤生长速度显著低于野生型小鼠(图2A–C)。具体来讲，与WT对照相比，C3缺陷小鼠表现出显著更小的肿瘤体积(图2A)、肿瘤大小(图2B)和肿瘤重量(图2C)。
C3缺陷小鼠乳腺癌的发展：在100μL PBS中将E0771乳腺癌细胞(1×106/小鼠)皮下接种到6-8周大的野生型(WT)和C3敲除(C3-/-)小鼠中。从第7天开始每隔一天监测肿瘤生长。C3缺陷型小鼠的E0771乳腺癌细胞发展速度显著低于野生型小鼠(图2D–F)。具体来讲，与WT对照相比，C3缺陷小鼠表现出显著更小的肿瘤体积(图2F)、肿瘤大小(图2G)和肿瘤重量(图2H)。
来自C3-/-小鼠的CD8+ TIL的表型：给WT和C3-/-小鼠皮下接种B16F10细胞(2×105/小鼠)。在肿瘤接种后第12天，通过流式细胞术分析总的产生IFNγ和TNFα的CD8+ TIL。CD8+ T细胞是来自C3-/-小鼠的TIL中的主要细胞群，与野生型小鼠相比，其数量增加约4倍(图2G)。这些CD8+ TIL表现出多能性，正如其中同时增加的IFNγ和TNFα表达所证实(图2H)。为了进一步确定C3-/-小鼠中增强的抗肿瘤应答是否是T细胞介导的，将C3-/-小鼠与T细胞受体α链敲除小鼠(TCRα-/-)(其缺乏功能性成熟的T细胞)杂交，并研究了C3-/-TCRα-/-小鼠的生长情况。TCRα-/-小鼠的抗肿瘤免疫力受损(图2I)。从C3-/-小鼠中去除成熟的T细胞导致它们的肿瘤抗性完全丧失(图2I)。这些结果表明C3-/-小鼠增强的抗肿瘤免疫性是由增强的CD8+CTL介导的杀伤作用所介导的。
实施例4
荷瘤小鼠中的非CD8+ T细胞应答
MDSC的招募：补体可通过招募骨髓来源的抑制细胞(MDSC)到肿瘤部位或通过阻止NK活化来抑制抗肿瘤免疫。为了研究补体信号在MDSC的招募和NK活化中的作用，将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。使用胶原酶和DNA酶处理引流淋巴结(dLNs)和肿瘤以产生单细胞悬液。使用CD45+细胞的门控预筛白细胞并对MDSC进行定量。观察到两种类型小鼠的dLN中骨髓细胞数量相当(图9A)。图3A显示了对来自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的白细胞中的CD11b和GR1表达的流式细胞术分析(每组n＝4只小鼠)。在野生型或C3-/-小鼠中生长的肿瘤中的肿瘤浸润白细胞中的CD11b+GR1+细胞(其包含CD11bhiGR1hi嗜中性粒细胞和CD11b+GR1dim MDSC)的百分比相当。大多数这些细胞是CD11bhiGR1hi嗜中性粒细胞。这些数据表明MDSC介导的免疫抑制可能不是C3-/-小鼠中B16黑素瘤的主要细胞机制。
T细胞(Treg)扩增：DLN和TIL中的扩增的调节性T细胞(Treg)与肿瘤免疫抑制相关。为了研究补体信号在Treg扩增中的作用，将B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)皮下接种到野生型(WT)和C3-/-小鼠中。使用胶原酶和DNA酶处理引流淋巴结(dLNs)和肿瘤以产生单细胞悬液。使用CD45+细胞的门控预筛白细胞。图3B显示了使用CD4和FOXP3作为标记物(每组n＝4只小鼠)来对来自TIL的白细胞中调节性CD4+T细胞群的流式细胞术分析。在来自野生型和C3-/-小鼠的dLN或TIL中，Tregs的百分比没有发现差异(图3B和图(图9B)。
虽然野生型和C3-/-小鼠之间CD4+TIL的百分比相当，但来自C3-/-小鼠的更多CD4+ TIL表达效应细胞因子(图9C)。为了测试IL-10对CD4+T细胞功能的直接影响，从健康供体的PBMC中富集CD4+T细胞，并通过体外抗CD3/CD28抗体活化48小时。然后将活化的CD4+T细胞与100U/ml rIL-2或100U/ml rIL-2加500U/ml rIL-10一起培养48小时。在细胞内进行IFNγ和TNFα染色之前，使用细胞活化混合物(Biolegend)将细胞激活6小时。IL-10在体外不明显改变人或小鼠CD4+T细胞的效应状态(图9D-E)。这些结果表明，CD4+TILs中增强的效应子表型可能是由于来自C3-/-小鼠的肿瘤的间接作用。此外，与野生型小鼠相比，来自C3-/-小鼠的TIL中总的或活化的NK细胞的百分比没有变化(图3C)。另外，观察到野生型和C3-/-小鼠之间的肿瘤浸润白细胞中的NK细胞、Th17细胞、巨噬细胞或树突细胞的细胞群没有差异。
实施例5
IL-10在C3-/-小鼠抗肿瘤反应中的作用
为了确定IL-10是否对于C3-/-小鼠中增强的抗肿瘤免疫力是必需的，将C3-/-小鼠与IL-10-/-小鼠杂交以产生双突变小鼠。小鼠皮下接种B16F10黑素瘤细胞(2×105/小鼠)或E0771乳腺癌细胞(1×106/小鼠)，并检查肿瘤发展。C3-/-小鼠中IL-10的缺失完全消除了它们对B16黑素瘤(图4A-C)以及E0771乳腺癌(图4D-F)的增强的肿瘤抗性。然而，野生型背景中的IL-10缺失与野生型小鼠相比没有导致改变的抗肿瘤免疫性(图4A-C)，这表明当补体信号传导是完整的时IL-10可能不参与这些肿瘤模型中的抗肿瘤免疫，因为补体信号传导阻止了CD8+TILs中IL-10的产生。
实施例6
通过IL-10增强人TIL功能
为了确定重组人IL-10是否可以增强患有癌症的患者的TIL的功能，从人肺肿瘤分离TIL并在IL-2或IL-2和IL-10的存在下进行培养。用锋利的手术刀将肿瘤切成小块(每边大约2mm)。将小块浸入含有1.5mg/ml II型胶原酶(Gibco，目录号17101-015)和10μg/ml I型脱氧核糖核酸酶(Sigma，目录号DN25)的5ml无血清RPMI 1640中并在37℃时温育2-3小时，同时进行轻轻搅拌。使单细胞浆液通过无菌70μm筛网以除去未消化的组织块。消化的单细胞悬浮液在PBS中洗涤两次，活细胞在两步Ficoll梯度上纯化，细胞重新悬浮以进行铺板。在24孔板的多个孔中接种1×106个在2mL含有6000U/mL IL-2和/或100U/mlIL-10的培养基中的活细胞。将板置于5％CO2的37℃潮湿培养箱中。一旦淋巴细胞生长可见，在不迟于培养开始后1周，将所有孔中的一半培养基替换。当任何孔变得接近融合时，将内容物剧烈混合，分成两个子孔，并用培养基加6000U/mL IL-2和/或100U/ml IL-10填充至每孔2mL。随后，每周更换一半培养基至少两次，或将培养物分开以保持细胞密度为0.8至1.6×106个细胞/mL。来自24孔板各孔的消化物的TIL作为独立的TIL培养物进行处理，并与任何其他原始孔的后代分开保存。
如图5A所示，在IL-2的存在下进行培养2周后，TIL开始扩增并进入对数生长期。当加入IL-2时，IL-10强烈增强TIL的增殖能力，而单独使用IL-10不能使TILs进入细胞周期(图5A)。为了直接测试扩增的TILs的肿瘤杀伤，将体外扩增的TIL与自体原发性肿瘤进行共培养。与IL-2扩增的TIL相比，通过IL-2加IL-10扩增的TIL诱导了原发性肿瘤细胞的快速和更有效的杀伤(图5B)。此外，用IL-2加IL-10进行体外扩增的CD8+ TIL具有显著增强的IFNγ和TNFα表达(图5C和D)。然而，T细胞耗竭标志物如程序性死亡1(PD-1)、LAG3和TIM3的表达没有被IL-10改变(图10)。总之，这些结果表明IL-10可作为T细胞生长因子来用于体外扩增人类TILs。
为了进一步了解IL-10如何促进人CD8+ TIL功能，在存在或不存在IL-10的经IL-2扩增的人肺肿瘤的CD8+ TIL中进行mRNA表达谱分析。与IL-2培养的CD8+ TILs相比，IL-10/IL-2培养的CD8+ TIL显示出不同的基因表达模式(图5E)。IL-10上调基因与几个信号传导通路相关，包括T细胞受体(TCR)信号传导(图5F)、Notch信号传导(图5G)、细胞周期(图5H)和杀伤活性(图5I)。IL-10对趋化因子基因表达的影响取决于具体的趋化因子(图5J)。这些数据表明使用IL-10的刺激在人类TIL中诱导有效的效应子功能并引发不同的信号传导通路。这些数据还表明IL-10在人和小鼠CD8+ T细胞中起相似作用。
实施例7
通过自分泌C3抑制IL-10产生
为了确定由CD8+ T细胞表达的内源性C3是否抑制它们的IL-10产生，将来自野生型或C3-/-初免小鼠的CD4+和CD8+ T细胞移植到C3-/-TCRα-/-受体中，并将小鼠接种B16黑素瘤(图6A)。接受C3-/-CD8+ T细胞的小鼠中的肿瘤比接受野生型CD8+ T细胞的小鼠中的肿瘤发展得更慢(图6B)，这表明由CD8+ T细胞表达的补体C3通过自分泌机制抑制其抗肿瘤活性。另外，C3aR和C5aR转录物在产生IL-10的效应子CD8+ T细胞中上调(图1D)。
检查CD8+ TILs上C3aR和C5aR的表面表达。使用表达高水平C3aR和C5aR的腹膜巨噬细胞和脾中性粒细胞(图11A-B)作为对照。来自初始小鼠或携带肿瘤的小鼠的dLN的CD8+T细胞不表达C3aR或C5aR(图6C和D，左边两个图)。然而，约20％来自黑素瘤的CD8+TIL表达C3aR和C5aR(图6D，右边两个图)。来自E0771乳腺癌模型的类似百分比的CD8+ TIL也表达C3aR和C5aR(图6E-F)。此外，从人肝脏肿瘤分离的CD8+ TILs表达高水平的C3aR和C5aR(图6G)。
过敏毒素或补体肽是由于补体系统活化而产生的片段。在野生型小鼠新鲜分离的B16肿瘤中检测到过敏毒素C3a和C5a(图11C)。为了测试局部产生的C3a和C5a在调节CD8+TIL中的IL-10表达中的作用，羧肽酶N(CPN)1和2的亚基在B16黑素瘤细胞中过表达(图11D-E)。CPN的局部过表达使来自野生型小鼠的肿瘤中的过敏毒素失活(C3a和C5a)(图11C)并使CD8+ TIL中的IL-10的生成恢复到与来自C3-/-宿主的肿瘤的CD8+ TIL相似的程度(图1E和6H)。另外，使用拮抗剂阻断C3aR和C5aR也恢复了体内IL-10的生成(图6I)，这表明局部产生的C3a和C5a抑制CD8+ TIL中的IL-10的生成。
为了确定过敏毒素是否通过CD8+ T细胞上的C3aR和C5aR来抑制IL-10的表达，在体外纯化并活化CD8+ T细胞，并测定其中C3aR和C5aR的表达。仅在长期体外培养后才在活化的CD8+ T细胞上检测到C3aR和C5aR(图11F-G)。C3aR或C5aR单独使用拮抗剂进行的体外阻断稍微增加了活化的CD8+ T细胞中的IL-10表达，而两种受体的联合阻断进一步增强这些细胞中的IL-10表达(图6J)。总之，体内和体外结果证明C3aR和C5aR在CD8+ T细胞产生IL-10中具有重叠的抑制功能。
使用补体受体拮抗剂进一步研究是否阻断过敏毒素与其受体的结合可以抑制已建立的肿瘤的发展。SB 290157是一种非肽类小分子化合物，作为C3aR的选择性拮抗剂而开发。PMX205，环状六肽氢化肉桂酸酯-(L-鸟氨酸-脯氨酸-D-环己基丙氨酸-色氨酸-精氨酸)是明确定义的C5aR拮抗剂。SB 290157和PMX205对C3aR和C5aR的药理学阻断抑制了野生型小鼠中的肿瘤生长，并且其效力是IL-10依赖性的(图6K；图11H)。这些数据表明C3aR和C5aR在补体介导的对IL-10的生成和抗肿瘤免疫性的抑制中起重要作用。结果表明，在CD8+ TIL上表达的C3aR和C5aR可作为新的免疫检查点受体，其可被靶向用于癌症的进一步免疫治疗。
实施例8
补体通过不依赖PD-1的通路抑制抗肿瘤免疫性
用针对CD8+ TIL上表达的PD-1的单克隆抗体来阻断免疫检查点，导致被选择的患者中的客观抗肿瘤反应。来自C3-/-小鼠的CD8+ TILs表达了与野生型小鼠具有可比水平的PD-1(图7A)。IL-10在体外不能调节活化的CD8+ T细胞上的PD-1表达(图7B)。与野生型小鼠相比，来自C3-/-小鼠的肿瘤细胞表达了相似水平的PD-L1(图7C和D)。另外，在含有IL-10的培养基中培养时，肿瘤细胞上的PD-L1表达没有改变(图7E)。这些结果表明IL-10不明显调节CD8+ T和肿瘤细胞中的PD-1/PD-L1表达。
使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑来产生PD-L1缺陷型B16黑素瘤细胞系(图7F)。来自PD-L1缺陷型B16肿瘤的CD8+ TIL中的IL-10表达类似于来自未经修饰的B16肿瘤的CD8+ TIL中的IL-10表达(图1E和图7G)，这表明PD-1信号传导不调节体内CD8+ T细胞中的IL-10的生成。基于这些发现，测试了补体信号传导和PD-L1/PD-1信号传导通路联合阻断的效果。C3-/-小鼠中的PD-L1–缺陷型肿瘤比野生型肿瘤发展得更慢(图7H)。为了进一步研究PD-1和补体受体的联合阻断对已建立的肿瘤的治疗效果，将B16黑素瘤细胞植入一群野生型B6小鼠中。在肿瘤发展6天后将荷瘤小鼠随机分为4组，并用对照抗体、抗PD-1阻断抗体、C3aR和C5aR拮抗剂或抗PD-1阻断抗体与C3aR和C5aR拮抗剂的组合来处理。单独的抗PD-1阻断抗体在B16黑素瘤模型中不显示抗肿瘤作用(图7I)。然而，用抗PD-1阻断抗体加C3aR和C5aR拮抗剂的组合治疗进一步增强由C3aR和C5aR阻断介导的抗肿瘤作用(图7I)。
实施例9
通过Bach2转录抑制IL-10
为了理解补体信号如何抑制CD8+ TIL中的IL-10表达，搜索公开的微阵列数据以鉴定具有与IL-10+-CD8+ T细胞中的那些相似或相反的表达模式的候选基因。Bach2-/-T细胞的基因表达模式与IL-10+CD8+ T细胞相似。从转录调控元件数据库检索IL-10启动子序列，并使用transfac位置加权矩阵运用公布的算法来预测Bach2结合位点。Bach2结合位点在图12A中示出。
在CD4+T细胞中Bach2既充当转录的活化剂又充当阻遏物以保持其天然状态。进行共聚焦成像分析以确定Bach2的细胞内位置。解剖肿瘤并通过Ficoll溶液(GElifesciences)来富集淋巴细胞。用抗小鼠Cd3、CD8和C5aR进行表面染色后，通过流式细胞术分选补体阳性的CD8+ T细胞，接着使用真核转录因子缓冲液组(Biolegend)进行Bach2和DAPI的细胞内染色。在细胞离心涂片(Thermo Scientific)后，将切片安装在Fluoromount-G(Southern Biotechnology)中。使用Zeiss 710倒置共焦显微镜(Zeiss)拍摄切片并使用imageJ软件进行评估。如图12B所示，Bach2主要定位于来自野生型小鼠的C3aR+C5aR+CD8+TILS核中的斑点，而Bach2主要定位于C3-/-小鼠的细胞质中。
为了确定Bach2表达对IL-10产生的影响，在来自IL-10eGFP报告分子小鼠的活化的原代CD8+ T细胞中过表达Bach2。如图12C所示，表达Bach2的CD8+ T细胞中的IL-10产生得到显著降低。图12D显示了在对照和如图12C所述的表达Bach2的CD8+ T细胞中针对IL-10进行的细胞内染色。通过流式细胞术来分选图12D所示的表达Bach2的和对照CD8+ T细胞，并通过实时RT-PCR来确定IL-10mRNA表达。根据制造商的方案用Direct-Zol(ZymoResearch)来分离RNA。用SuperScript III逆转录酶(Life Technologies)来合成互补DNA。使用基于SYBR绿色的测定(Applied Biosystems)进行定量实时PCR。对于mRNA表达，使用18s RNA来对整个样品进行标准化。使用的引物是小鼠18s rRNA(NOR_003278)正向：5’TCGATGGTAGTCGCCGTGCCTA 3’，反向：5’GCCTGCTGCCTTCCTTGGATGT 3’；小鼠IL-10(NM_010548)正向：5’AGCCGGGAAGACAATAACTG 3’，反向：5’GCCTGCTGCCTTCCTTGGATGT 3’；小鼠CPN1(NM030703)正向：5’GGTGGACCTGAACCGCAACTTC 3’，反向：5’CGTTGGTGATGCCGTCTGGAA3’；反向；5’CGTTGGTGATGCCGTCTGGAA 3’；小鼠β-Actin(NM_007397)正向：5’ACCTTCTACAATGAGCTGCG 3’，反向：5’CTGGATGGCTACGTACATGG 3’。
图12E和图13显示了Bach2表达的CD8+ T细胞中降低的IL10mRNA水平。总之，这些数据表明补体信号传导促进Bach2的核定位，其抑制CD8+ TIL中的IL10转录。
实施例10
hIL-10抗人PD-1融合蛋白
合成抗PD-1单克隆抗体的V区编码区。重链和轻链的V区分别克隆到AbVec免疫球蛋白G1和AbVec-k中。接下来，将人IL-10编码区插入重链的C端作为具有SGGGGSGGGGSGGGGSGGGG接头的融合蛋白。将具有人IL-10的整个重链和轻链分别克隆到pEE6.4和pEE12.4(Lonza)。接下来，两种载体都被NotI和BamHI限制性内切酶消化。将完整的人巨细胞病毒主要-立即早期重链/猿猴病毒40转录单位形式消化的pEE6.4质粒连接到来自含有轻链表达盒的消化的pEE12.4质粒的大NotI-BamHI片段中。将含有重链和轻链两者的质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞中，并建立稳定克隆以用于产生IL-10/抗PD-1融合物。
与单独的抗PD-1以及抗PD-1加游离IL-10共同施用相比，可使用E0771和4T1乳腺癌模型在体内检查抗PD-1-IL-10融合蛋白的功能。可分析这些治疗对TIL细胞群和肿瘤生长的影响。
实施例11
IL-10/PD-1融合蛋白
因为IL-10和抗PD-1都靶向CD8+ TIL并且具有非常不同的作用模式，所以预期到，包含与靶向部分(包括抗PD-1抗体)连接的IL-10部分的作为融合蛋白的白细胞介素-10靶向分子将有效地以高效力靶向CD8+ TIL并同时最小化其对广泛的其他细胞群的抑制作用。表达高水平PD-1(PD-1high细胞)的CD8+ TIL高度富集抗肿瘤活性。因此，制备抗PD-1-IL-10融合物以将IL-10递送至PD-1highCD8+ TIL并测试其抗肿瘤活性。
使用的多肽序列衍生自Medarex Inc.的完全人源抗人PD-1mAb(也如美国专利8,008,449B2中所述的，其通过引用整体并入本文)，其也阻断小鼠PD-1。抗人PD-1的重链和轻链的V区被分别克隆到AbVec免疫球蛋白G1和AbVec-k中。将小鼠IL-10编码区插入重链的C末端以作为包含接头的融合蛋白。与IL-10和轻链融合的整个重链分别克隆到pEE6.4和pEE12.4(Lonza)，然后将这两个质粒重新连接。含有重链和轻链的质粒被转染到CHO细胞中以产生抗PD-1-IL-10融合蛋白。
将在体外进行评估抗PD-1-IL-10的功能以确保其功能正常。使用E0771和4T1乳腺癌模型在体内评估抗PD-1-IL-10的功效，并将其与单独的抗PD-1以及抗PD-1加游离IL-10共同施用的功效相比。分析这些治疗对TIL细胞群的影响。由于其他细胞类型如B细胞、髓样树突状细胞和单核细胞也表达PD-1，所以抗PD-1-IL-10融合蛋白的总体抗肿瘤作用可能来源于其对所有这些细胞类型的影响。因此，在体内测试抗PD-1-IL-10融合蛋白的总体效果。其他靶向白细胞介素-10分子，如抗TIM3-IL-10融合蛋白或抗LAG3-IL-10融合蛋白，也可如所述进行测试。
实施例12
用IL-10进行离体处理
用抗-CD3/CD28活化来自TCR转基因小鼠的脾脏和淋巴结的外周pmel-1 CD8+ T细胞，用IL-2或IL-2加IL-10进行离体扩增，并转移到经环磷酰胺处理的淋巴细胞减少性的C57BL/6小鼠，其具有或不具有B16黑素瘤肿瘤(CD45.2)。在没有肿瘤的野生型B6小鼠中，检查淋巴细胞去除的宿主中转移的经IL-10调节的pmel-1 CD8+ T细胞的稳态，包括数量、位置、持续性、功能表型(IFNγ，TNFα，穿孔素和端粒酶B表达)以及它们在过继转移后2-24周形成不同记忆细胞群(TCM，TEM)的能力。
在携带B16黑素瘤的野生型B6小鼠中，检查转移的IL-10处理的pmel-1 CD8+ T细胞的稳态和抗肿瘤效力。另外，IL-10处理的pmel-1CD8+ TILs的分子和功能表型将在肿瘤中表征。为了进一步模拟临床背景，pmel-1TCRα和β基因将在活化后逆转录转导到来自非转基因野生型C57BL/6小鼠的CD8+ T细胞中，并以与上述相同的方式进行测试。
实施例13
离体处理
评估C3aR/C5aR1拮抗剂离体处理对抗肿瘤小鼠CD8+ T细胞在体内的功能的影响。用C3aR/C5aR1拮抗剂处理CD8+ T细胞导致IL-10的生成，但是将测试的是：C3aR/C5aR1拮抗剂是否主要通过诱导IL-10促进抗肿瘤免疫，因为其抗肿瘤效力需要IL-10。用C3aR/C5aR1拮抗剂对抗肿瘤CD8+ T细胞进行离体处理，并进行测试。用IL-2或IL-2加C3aR/C5aR1拮抗剂扩增来自任一转基因小鼠或逆转录病毒转导的外周pmel-1 CD8+ T细胞，并如实施例11中所述进行测试。这些实验将确定用IL-10或C3aR/C5aR1拮抗剂离体调节外周抗原特异性T细胞是否导致有效的抗肿瘤效力和当转移到淋巴去除的宿主中时是否具有持久的肿瘤特异性CD8+记忆T细胞，以及这两种调节技术是否具有类似的体内作用。由于C3aR/C5aR1信号传导抑制了巨噬细胞中的IL-12的生成，因此用C3aR/C5aR1拮抗剂调节T细胞可能导致IL-10和IL-12的生成以及有效的CTL。
接下来，测试IL-10体内调节对抗肿瘤小鼠CD8+ T细胞功能的影响。通过逆转录病毒转导来组成性表达IL-2或IL-12而进行体内调节抗肿瘤CD8+ T细胞的方法尚未在临床上应用。聚乙二醇化的IL-10在癌症患者中具有可控的不良作用情况，表明在体内在CD8+ T细胞中表达IL-10是可行的。进行用抗CD3/CD28来活化pmel-1 CD8+ T细胞的实验，并使用基于MSCV的IL-10-GFP-表达的逆转录病毒载体来转导活化的CD8+ T细胞。在病毒转导的T细胞中分析IL-10表达水平。表达pmel-1 CD8+ T细胞的GFP+IL-10将以3-5x106/小鼠进行分选并过继转移至淋巴去除的具有和不具有B16黑素瘤肿瘤(CD45.2)的野生型B6小鼠中。将按照实施例11来分析转移的表达IL-10的pmel-1 CD8+T细胞的稳态和抗肿瘤能力。
评估用IL-10和C3aR/C5aR1拮抗剂进行离体和体内处理对人TCR工程化的T细胞的影响。为了便于转化成临床应用，测试IL-10和C3aR/C5aR1拮抗剂对体内人TIL 1383I TCR工程化T细胞的稳态的影响。TIL 1383I TCR(如Roszkowski等人，Cancer Res.65(4)：1570-6(2005)所述)识别HLA-A2限制性酪氨酸酶368-376，其是黑素瘤肿瘤中高度表达的抗原。使用体内模型直接比较IL-10、C3aR/C5aR1拮抗剂和IL-12之间的处理效果。用抗CD3(OKT3)来刺激人PBMC并用IL-2进行培养3天，并用抗肿瘤TIL 1383ITCRα和β链基因进行转染。在细胞处于快速扩增方案(REP)阶段的第8天，将IL-10、C3aR/C5aR1拮抗剂或IL-12连续加入培养物3周。在体外培养结束时，测定TIL 1383I TCR CD8+ T细胞的数量和功能状态。此外，这些扩增的TIL 1383I TCR-基因工程化的人T细胞被转移到免疫缺陷的NOD-scid/IL-2Rγnull(NSG小鼠，Jackson Lab，005557)中。在转移后1-5周确定TCR基因工程化的人T细胞的数量、位置、持久性和功能状态。
实施例14
人TIL扩增
测试C3aR/C5aR1拮抗剂对人TIL扩增的影响。分离来自NSCLC和TNBC患者的TIL，并在存在IL-2或IL-2加上C3aR/C5aR1拮抗剂的条件下进行培养。在体外测定数量、抗肿瘤CTL活性和效应分子产量。另外，测试IL-10和C3aR/C5aR1拮抗剂处理对人TIL的体内稳态的影响。分离来自NSCLC和TNBC的人类TIL，并在存在IL-2或IL-2加上C3aR/C5aR1拮抗剂的条件下进行培养，然后注射到NSG小鼠中。在转移后1-5周确定人类TIL的数量、持续性、位置和功能状态。这些实验将确定IL-10和C3aR/C5aR1拮抗剂是否促进大量有效的抗肿瘤人TIL的产生以治疗肺癌和乳腺癌。
上述实验将解决如何更好地利用IL-10和C3aR/C5aR拮抗剂在基于免疫检查点封锁和ACT的免疫疗法中的应用。预计单独或联合使用IL-10将增强目前的免疫疗法。鉴于补体信号传导(抑制CD8+ TIL中的IL-10产生和NK细胞活化，促进MDSC招募到TME)在抑制宿主抗肿瘤免疫中的多种作用，基于补体信号传导抑制剂的癌症免疫疗法可能为临床应用开辟新的途径。
6.条款(Clauses)
出于完整性的原因，本公开的各个方面在以下编号的各条中列出：
第1条：一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其特征在于，所述方法包括：从来自受试者的样品中分离CD8+ T细胞、将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-10、将所述CD8+T细胞暴露于白细胞介素-2、扩增所述CD8+ T细胞以及向所述受试者施用所述扩增的CD8+T细胞。
第2条：根据第1条所述的方法，其特征在于，在暴露于白细胞介素-10之前，将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-2。
第3条：根据第1条所述的方法，其特征在于，将所述CD8+ T细胞同时暴露于白细胞介素-2和白细胞介素-10。
第4条：根据第1条所述的方法，其特征在于，将所述CD8+ T细胞暴露于白细胞介素-2和白细胞介素-10约1小时至约24小时。
第5条：根据第1条所述的方法，其特征在于，在向所述受试者施用之前，将所述CD8+ T细胞扩增到至少106个所述CD8+ T细胞。
第6条：根据第1条所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述受试者施用有效治疗量的补体抑制剂。
第7条：根据第1条所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在向所述受试者施用所述CD8+ T细胞之前，将所述分离的CD8+ T细胞暴露于所述补体抑制剂。
第8条：根据第6或7条中任一条所述的方法，其特征在于，所述补体抑制剂包括C5a抑制剂、C5aR抑制剂、C3抑制剂、C3aR抑制剂、D因子抑制剂、B因子抑制剂、C4抑制剂、C1q抑制剂中的一种或多种或其任何组合。
第9条：根据第1-8条中任一条所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给所述受试者施用顺铂、奥沙利铂、激酶抑制剂、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、兰洛单抗和纳武单抗中的至少一种。
第10条：根据第1-9条中任一条所述的方法，其特征在于，所述癌症选自：头部癌症、颈癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、实体瘤(包括晚期实体瘤)、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、弥漫性大细胞淋巴瘤、晚期CD70+癌症、CD20+非霍奇金淋巴瘤和血液恶性肿瘤。
第11条：根据第1条所述的方法，其特征在于，所述样品是血液样品。
第12条：根据第1条所述的方法，其特征在于，所述样品是组织样品。
第13条：根据第1条所述的方法，其特征在于，所述样品是肿瘤样品。
Claims (13)
1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其特征在于，所述方法包括：从来自受试者的样品中分离CD8+T细胞、将所述CD8+T细胞暴露于白细胞介素-10、将所述CD8+T细胞暴露于白细胞介素-2、扩增所述CD8+T细胞以及向所述受试者施用所述扩增的CD8+T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在暴露于白细胞介素-10之前，将所述CD8+T细胞暴露于白细胞介素-2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述CD8+T细胞同时暴露于白细胞介素-2和白细胞介素-10。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述CD8+T细胞暴露于白细胞介素-2和白细胞介素-10约1小时至约24小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在向所述受试者施用之前，将所述CD8+T细胞扩增到至少106个所述CD8+T细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述受试者施用有效治疗量的补体抑制剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在向所述受试者施用所述CD8+T细胞之前，将所述分离的CD8+T细胞暴露于补体抑制剂。
8.根据权利要求6或7中任一项所述的方法，其特征在于，所述补体抑制剂包括C5a抑制剂、C5aR抑制剂、C3抑制剂、C3aR抑制剂、D因子抑制剂、B因子抑制剂、C4抑制剂、C1q抑制剂中的一种或多种或其任何组合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给所述受试者施用顺铂、奥沙利铂、激酶抑制剂、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、兰洛单抗和纳武单抗中的至少一种。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症选自：头部癌症、颈癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、实体瘤(包括晚期实体瘤)、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、弥漫性大细胞淋巴瘤、晚期CD70+癌症、CD20+非霍奇金淋巴瘤和血液恶性肿瘤。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是血液样品。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是组织样品。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是肿瘤样品。
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