CN107709359A

CN107709359A - Ror1‑ror2结合的调节剂

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Publication number: CN107709359A
Application number: CN201680037264.1A
Authority: CN
Inventors: T·J·基普斯; 于健
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2018-02-16
Also published as: US10913798B2; JP2018513384A; CA2983293A1; EP3286214A1; EP3286214B1; AU2016253149B2; WO2016172726A1; WO2016172726A9; US20180112002A1; AU2016253149A1; EP3286214A4; JP6704000B2; HK1250999A1; US20210371535A1; CA2983293C

Abstract

本文提供的尤其是鉴定能够抑制ROR1蛋白和ROR2蛋白之间的结合(例如偶联)的试剂的方法。通过干扰ROR1‑ROR2偶联(结合)，使用本文提供的方法所鉴定的试剂抑制非经典Wnt5a信号转导。因此，通过本文提供的方法所鉴定的试剂尤其可用于癌症诊断和治疗。

Description

ROR1-ROR2结合的调节剂

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年4月24日提交的美国临时申请第62,152,424号的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本说明书中。

参考在光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录

于2016年4月25日在文件48537-558001WO_ST25.TXT中创建的序列表，93,609字节的数据，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统，在此通过引用并入本说明书中。

背景技术

受体酪氨酸激酶样孤儿受体ROR1和ROR2是进化上保守的I型蛋白质[1-8]。对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)和小家鼠(Mus musculus)中这些蛋白质的发育表达模式的研究已经显示出明显的保守性[9]。ROR1和ROR2的表达在胚胎发育的早期阶段为最高水平，在来自所有三个胚层的组织中的大部分主要系统中出现，但是最显著的是神经嵴，而ROR1的表达似乎更限于神经间质[10,11]。然而，ROR1或ROR2的完全敲除导致涉及心脏、肺、泌尿生殖道和其他器官的普遍发育异常，这表明ROR1或ROR2中每一个可能对器官发生有广泛的贡献[12,13]。

尽管在一些成人组织中可发现低水平的ROR2，但是除了在称为原血细胞(hematogone)的前体B细胞的小亚群之外，ROR1的产后表达不明显[14]。然而，ROR1可在慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的白血病细胞上发现[15-17]，并且ROR1或ROR2由多种不同癌症的赘生性细胞表达[18,19]。ROR1或ROR2的癌细胞表达与增强的癌细胞迁移、上皮-间质转化(EMT)、增加的复发性疾病和转移的相关风险以及不利的预后相关[20,21]。最近，ROR1在卵巢癌干细胞上得到鉴定，这种细胞在体外具有增强的迁移/球状体形成能力，以及在体内增强的移入/转移的能力[22]。

ROR1和ROR2各自可用作Wnt5a的受体[15,23]，其可诱导非经典Wnt信号，潜在地导致在器官发生期间增强的肿瘤细胞生长、定向迁移、和/或组织细胞极性[18,24-26]。另一方面，ROR2也可抑制Wnt靶基因的转录，并通过隔离(sequester)经典Wnt配体来调节Wnt信号转导，从而在不同的细胞环境中起到肿瘤抑制剂的作用[27]。虽然ROR1或ROR2的活性被认为是受相关蛋白质影响的[28,29]，但是ROR1和ROR2被认为是相互独立的起作用。

本领域需要与ROR1、ROR2和/或Wnt5a相关的分子途径的有效调节剂。本领域还需要抗癌治疗剂。本文提供了对本领域中的这些需要和其他需要的解决方案。

发明概述

在一方面，本发明提供了鉴定ROR1-ROR2结合抑制剂的方法。该方法包括(i)在反应容器中将测试剂与ROR1蛋白和ROR2蛋白组合。(ii)检测ROR1蛋白与ROR2蛋白的结合相对于标准对照的减少，从而鉴定出ROR1-ROR2结合抑制剂。

在一方面，本发明提供了通过本文提供的方法包括其实施方案所鉴定的抗体。

在另一方面，本发明提供了抑制ROR1-ROR2相互作用的方法。该方法包括(i)使通过本文提供的方法包括其实施方案所鉴定的化合物与ROR1-ROR2复合物接触，其中复合物包含ROR1蛋白和ROR2蛋白。(ii)使化合物抑制ROR1蛋白和ROR2蛋白之间的相互作用，由此抑制ROR1-ROR2相互作用。

在另一方面，本发明提供了在有需要的对象中治疗癌症的方法。该方法包括向对象施用治疗有效量的通过本文提供的方法包括其实施方案所鉴定的抗体、小分子、肽或核酸。

在另一方面，本发明提供了鉴定包含ROR1和ROR2蛋白的蛋白质复合物的抑制剂的方法。该方法包括(i)在包含ROR1和ROR2的反应容器中与测试剂组合；和(ii)相对于标准对照检测包括ROR1和ROR2的蛋白质复合物的破坏，由此鉴定包含ROR1和ROR2蛋白的蛋白质复合物的抑制剂。在实施方案中，所述检测包括在存在测试剂的情况下检测蛋白质复合物中ROR1和/或ROR2的水平降低，其中相对于标准对照，复合物中ROR1和/或ROR2的水平降低表明测试剂是包含ROR1和ROR2蛋白的蛋白质复合物的抑制剂。在实施方案中，所述检测包括在存在测试剂的情况下检测蛋白质复合物中未结合的ROR1和/或未结合的ROR2的水平升高，其中相对于标准对照，未结合的ROR1和/或ROR2的水平升高表明测试剂是包含ROR1和ROR2蛋白的蛋白质复合物的抑制剂。

在实施方案中，ROR1和/或ROR2蛋白包括可检测部分。在实施方案中，所述检测包括在存在测试剂的情况下检测鸟嘌呤交换因子(GEF)的水平，其中相对于标准对照，GEF水平降低表明测试剂是具有ROR1蛋白和ROR2蛋白的复合物的抑制剂。在实施方案中，GEF是RhoA、Rac1、AHRGEF1、AHRGEF2或AHRGEF6。在实施方案中，GEF包含可检测部分。在实施方案中，所述组合在Wnt5a蛋白存在下发生。在实施方案中，反应容器是包含固体支撑的柱。

在实施方案中，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物在不存在细胞的情况下存在。在实施方案中，ROR1和ROR2存在于细胞的表面上。在实施方案中，细胞是肿瘤细胞。在实施方案中，肿瘤细胞是慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞。在实施方案中，CLL细胞是MEC1细胞。在实施方案中，所述细胞形成体外细胞培养物的一部分。在实施方案中，细胞形成生物体的一部分。在实施方案中，生物体是哺乳动物。在实施方案中，生物体是小鼠。

在实施方案中，测试剂是抗体、小分子、肽、蛋白质或核酸。在实施方案中，测试剂是抗体。在实施方案中，抗体是抗ROR1抗体。在实施方案中，抗体是抗ROR2抗体。在实施方案中，抗体结合ROR1蛋白或ROR2蛋白。在实施方案中，抗体结合KNG结构域。在实施方案中，抗体是人源化抗体。在实施方案中，抗体是嵌合抗体。在实施方案中，抗体是scFv。

附图说明

图1A-1J.Wnt5a通过Rac1和RhoA的ROR1依赖性活化增强CLL增殖和迁移。图1A：CD154诱导的CFSE标记的CLL细胞(n＝6)的增殖，具有或不具有外源Wnt5a并用Ctrl-IgG或UC-961处理，如每个直方图的左上角标出。一个代表性CLL样品的测定结果通过具有比未刺激的细胞更少荧光的细胞百分比显示，所述细胞百分比在每个直方图的左下角标出。图1B：条形图表示在每种培养条件下来自6名不同患者的CFSE荧光减弱的CLL细胞的平均比例，培养条件在图下方标出。图1C：条形图表示应答于CXCL12和/或Wnt5a与Ctrl-IgG或UC-961的迁移的CLL细胞(n＝6)的平均比例。图1D：在CLL细胞中测量活化的Rac1和RhoA，其在无血清培养基(血清饥饿)中培养，并且然后用Wnt5a以每条泳道上方标出的时间处理细胞。全细胞裂解物也通过免疫印迹分析检测总Rac1或RhoA。图1E：如每组印迹的顶部标出，Wnt5a诱导的用Ctrl-IgG或UC-961处理的CLL细胞中Rac1(上图)或RhoA(下图)的活化。图1F：在用或不用Wnt5a和/或CD154处理30分钟的血清饥饿的CLL细胞中活化的Rac1。图1G：在用或不用Wnt5a和/或CXCL12处理30分钟的血清饥饿的CLL细胞中活化的RhoA。图1H：在有或没有外源Wnt5a并用Rac1抑制剂(NSC-23766)或RhoA抑制剂(Y-27632)处理的情况下，分析CD154诱导的CLL细胞(n＝6)的增殖。一个代表性样品的CFSE-标记的CLL细胞的测定结果如图1A和图1I所示。如左上所示处理的6个患者样品的CSFE荧光减弱的CLL细胞的平均比例示于b幅。图1J：应答于CXCL12和/或Wnt5a、有或无NSC-23766或Y-27632的CLL细胞(n＝6)迁移的平均比例。数据显示为平均值±SEM；*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。对于每个免疫印迹，每条泳道下面的数字是对未处理样品标准化的活化的GTP酶比总GTP酶的条带密度的比例。

图2A-2G.ROR1与ROR2结合。图2A：健康对象的ZAP70^Neg/mu-IgVH(CLL-1-4)或ZAP70⁺/um-IgVH(CLL-5-8)CLL细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的裂解物中ROR1或ROR2的免疫印迹分析。纯化的重组细胞外ROR1或ROR2(ROR1-ex或ROR2-ex)作为特异性对照上样到单独的泳道上。图2B：通过流式细胞术检测CD5⁺CD19⁺CLL细胞上的ROR1或ROR2。图2C：健康供体的PBMC用抗ROR2-Alexa-488、抗CD19-PE和抗CD5-APC单克隆抗体染色并通过流式细胞术分析。在每个直方图的顶部标出的每个亚组的中心等值线(center contour)图中指示了门控策略(gating strategy)，描绘了与抗ROR2单克隆抗体孵育的细胞(阴影)相对于与Alexa-488缀合的Ctrl-IgG孵育的细胞(空心直方图)的荧光。每个CD19⁺细胞亚群的ΔMFI标在右上角。图2D：CLL样品(n＝80)的ROR2的ΔMFI或健康供体(n＝15)的PBMC中每个门控淋巴细胞()亚群的ROR2的ΔMFI。图2E：来自新鲜分离的CLL细胞裂解物的抗ROR1或抗ROR2免疫沉淀的免疫印迹分析，检测ROR1与ROR2的结合。图2F：来自在无血清培养基中培养的CLL细胞裂解物的抗ROR1免疫沉淀的免疫印迹分析，并且然后不用(-)或用(+)Wnt5a处理。图2G：通过ELISA在CLL患者(n＝9)或年龄匹配的健康对照对象(正常，n＝9)的血浆中评估Wnt5a水平。数据显示为平均值±SEM；*P<0.05；***P<0.001。

图3A-3D.UC-961抑制ROR1信号转导(signaling)。图3A：如每行右边缘(比例尺：2μm)所示，在新鲜分离的CLL细胞+/-Ctrl-IgG或UC-961中通过共聚焦显微镜检测的ROR1和ROR2的共定位(箭头)。图3B：在用或不用Wnt5a和Ctrl-IgG或UC-961处理后，对ROR1和ROR2染色的血清饥饿的CLL细胞的共聚焦显微镜结果，如3A所示。图3C：对于用对照siRNA(Ctrl-siRNA)或对ROR1或ROR2特异性的siRNA转染的CLL细胞(n＝6)，在有或没有Wnt5a的情况下，向CXCL12迁移的细胞的平均比例。数据显示为平均值±SEM；*P<0.05；**P<0.01。图3D：活化的RhoA或Rac1通过对CLL细胞的裂解物的Rho家族蛋白质活性拉下试验(pull-down assay)来测量，所述细胞为用Ctrl-siRNA转染的CLL细胞或用对ROR1或ROR2特异性的siRNA转染的CLL细胞并且在存在或不存在Wnt5a的情况下培养。全细胞裂解物也通过免疫印迹检测总RhoA或Rac1(最后一行)。每条泳道下面的数字是对未处理样品标准化的活化的GTP酶比总GTP酶的条带密度的比例，如图1D。

图4A-4F.UC-961抑制Wnt5a诱导的GEF募集以及RhoA和Rac1的活化。图4A：如左边缘或每一行所示(比例尺：5μm)，在没有(-)或有(+)Wnt5a的情况下培养的CLL细胞中，ARHGEF1与ROR1和ROR2的共定位(箭头)。图4B：在没有(-)或有(+)Wnt5a的情况下培养的CLL细胞中，ARHGEF2与ROR1-ROR2的共定位，如图4A。图4C：在没有(-)或有(+)Wnt5a的情况下培养的CLL细胞中，ARHGEF6与ROR1-ROR2的共定位，如图4A。图4D：使用对ARHGEF1、ARHGEF2、或ARHGEF6特异性的单克隆抗体，在用或不用Wnt5a的情况下培养的CLL细胞的裂解物的免疫沉淀中的RhoA(上两排图)或Rac1(下两排图)随时间(分钟)的体外交换，如每图的右下方所示。该线描绘了仅使用缓冲液观察到的GTP酶活化。图4E：如在每个图的底部所示，使用对ARHGEF1、ARHGEF2、或ARHGEF6特异性的单克隆抗体，在用或不用Wnt5a的情况下培养的CLL细胞的裂解物的免疫沉淀中的RhoA或Rac1的体外交换测定。该线描绘了仅使用缓冲液的GTP酶活化。图4F：在用对ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6特异性的Ctrl-siRNA或siRNA转染的CLL细胞，在不用(-)或用(+)Wnt5a处理后RhoA或Rac1的活化。全细胞裂解物也通过免疫印迹分析检测总RhoA或Rac1。每条泳道下面的数字是对未处理样品标准化的活化的GTP酶比总GTP酶的条带密度的比例。

图5A-5I.ROR1的功能结构域图谱。图5A：ROR1的结构和ROR1的截短形式的示意图。ROR1与ROR2的相互作用通过使用来自MEC1(对照)、MEC1-ROR1(ROR1)、或用截短形式的ROR1转染的MEC1细胞的裂解物进行抗-ROR1免疫沉淀的免疫印迹分析来验证。图5B：在MEC1-ROR1细胞中ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6与ROR1和ROR2的共定位(例如箭头)(比例尺：2μm)。图5C：在MEC1(对照)、MEC1-ROR1(ROR1)和表达截短形式的ROR1的MEC1细胞中测量活化的Rac1或RhoA。全细胞裂解物也通过免疫印迹检测总Rac1或RhoA。每条泳道下面的数字是对MEC1样品标准化的活化的GTP酶比总GTP酶的条带密度的比例。图5D：在MEC1或MEC1-ROR1细胞中通过UC-961和抗Wnt5a单克隆抗体抑制Rac1-活化或RhoA-活化。每条泳道下面的数字是对MEC1标准化的条带密度的比例，如图5C。图5E：根据图下面标出的天数，在三个相同的孔中MEC1(圆圈)、MEC1-ROR1(正方形)或表达每种截短形式的ROR1的MEC1细胞(如图例中所示)的平均数目。图5F：在标出的天数，在三个相同的孔中用Ctrl-IgG(正方形)、UC-961(三角形)或抗Wnt5a(倒三角形)培养的MEC1-ROR1细胞的平均数目。图5G：如底部所示，条形图显示用(+)或不用(-)CCL21的情况下用每种截短形式的ROR1(如图例所示)转染的MEC1、MEC1-ROR1或MEC1细胞迁移的平均比例。图5H：条形图描绘了在Ctrl-IgG、UC-961或抗Wnt5a存在下，用(+)或不用(-)CCL21的MEC1-ROR1细胞迁移的平均比例。图5E-5H中的数据显示为平均值±SEM；*P<0.05；**P<0.01。图5I：卡通图模拟通过诱导形成ROR1-ROR2异二聚体使Wnt5a增强增殖和迁移的分子机制，其募集活化Rac1和RhoA的GEF。

图6A-6E.UC-961抑制MEC1-ROR1的移入。图6A：在接受静脉输注1×10⁶MEC1或MEC1-ROR1细胞3周后，Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠的代表性脾脏。显示年龄匹配的、未移入的Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠(Nor)的脾脏用于比较。图6B：如右边所示，从股骨或胫骨骨髓或从3周前移入MEC1或MEC1-ROR1细胞的小鼠的脾中收集MEC1或MEC1-ROR1细胞。在等值线图中显示了用4A5-Alexa-647(纵坐标)和抗-CD19-PE(横坐标)染色的细胞的荧光。每个等值线图右上角的百分比表示荧光在虚线所示阈值以上的细胞比例。图6C：在接受静脉输注1×10⁶MEC1-ROR1细胞3周后，用Ctrl-IgG或UC-961处理的Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠的代表性脾脏。显示了年龄匹配的未移入的Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠(Nor)的脾脏用于比较。图6D：如右边所示，从股骨或胫骨骨髓或从3周前移入MEC1-ROR1的小鼠的脾中收集MEC1-ROR1细胞，然后用Ctrl-IgG或UC-961处理。细胞用4A5-Alexa-647和抗-CD19-PE染色以鉴定MEC1-ROR1细胞，如图6B。每个等值线图右上角的百分比表示荧光在虚线所示阈值以上的细胞比例。图6E：条形表示用MEC1细胞(空心条)或MEC1-ROR1细胞(黑色条)移入3周前收获自小鼠的骨髓(左)或脾(右)的CD19⁺人白血病细胞的平均数。如在每个直方图的底部所示，用Ctrl-IgG或UC-961处理一些动物组。数据显示为每组动物的平均值±SEM(n＝5)；**P<0.01；***P<0.001。

图7.通过不含CD154的Wnt5a诱导的CLL增殖的CFSE测定。CFSE-标记的CLL细胞(n＝6)与不具有(左图)或具有(右图)外源Wnt5a的HeLa细胞共培养6天的荧光。一个代表性CLL样品的测定结果在每幅的左下角显示了分裂细胞的百分比。

图8A-8E.ROR2在CLL细胞中的表达。图8A：质谱显示ROR2的独特肽，其通过2D-nanoLC-MS/MS从CLL细胞制备然后用抗-ROR1单克隆抗体相对于Ctrl-IgG进行免疫沉淀的蛋白质裂解物中被鉴定。图8B：从3个CLL患者样品中的每个提取总RNA。通过RT-PCR扩增ROR2cDNA并通过DNA测序验证。使用总RNA作为PCR模板以确保没有基因组DNA污染。序列说明：ACGTGCACATGAGGTCCATT(SEQ ID NO:1)；CACCGGGTGTGGGATTTACA(SEQ ID NO:2)；TGCCCCGCACACATTGTTGGTCCTATTTGTAAATCCCA(SEQ ID NO:3)；CPAHIVGPICKSH(SEQ ID NO:4)。图8C：如底部所示，CLL样品(n＝80)的ROR1的ΔMFI或健康供体(n＝15)的PBMC中每个门控淋巴细胞亚群的ROR1的ΔMFI。图8D：纯化ROR1-ex和ROR2-ex蛋白，并通过SDS-PAGE和考马斯染色分析。图8E：用pcDNA3.1(载体，左图)或pcDNA3.1编码的ROR2(ROR2，右图)转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并且然后用Alexa-488标记的同种型对照单克隆抗体(空白直方图)或抗ROR2-Alexa-488单克隆抗体染色用于流式细胞术分析。

图9.通过共聚焦显微镜进行共定位分析的阴性对照。CLL细胞用抗-CD5-Alexa-647和抗-CD19-Alexa-488、抗ROR1-Alexa-647和抗-CD19-Alexa-488、或抗CD5-Alexa-647和抗-ROR2-Alexa-488染色，用于通过共聚焦显微镜进行评估(比例尺：2μm)。CD5和CD19、ROR1和CD19、或CD5和ROR2之间不存在共定位。

图10A-10B.在CLL中沉默ROR1和ROR2。图10A：如各泳道顶部所示，用非特异性对照siRNA(Ctrl-siRNA)、或对ROR1(ROR1-siRNA)或ROR2(ROR2-siRNA)有特异性的siRNA转染CLL细胞。48小时后通过免疫印迹分析检查细胞中的ROR1或ROR2。每条泳道下面的数字是对Ctrl-siRNA处理的样品标准化的ROR1或ROR2比β-肌动蛋白的条带密度的比例。图10B：用Ctrl-siRNA(黑色直方图)或ROR1-siRNA或ROR2-siRNA(灰色直方图)转染的CLL细胞进行流式细胞术，然后用抗-CD5-Alexa-647(左图)或抗-ROR2-Alexa-488(右图)染色。空白直方图代表用Alexa-488标记的同种型Ctrl-IgG(同种型)染色的对照或转染的CLL细胞的荧光。

图11A-11B.ROR1与ARHGEF1、ARHGEF2和ARHGEF6的相互作用。图11A：质谱图显示ARHGEF1、ARHGEF2和ARHGEF6的独特肽，其通过2D-nanoLC-MS/MS从CLL细胞制备然后用抗-ROR1单克隆抗体相对于Ctrl-IgG进行免疫沉淀的蛋白质裂解物中被鉴定。序列说明：KQLLFPAEEDNGAGPPRD(SEQ ID NO:5)；KAAAQGPEGDIQEQELQSEELGLRA(SEQ ID NO:6)；WQIWELLSTDNPDALPE(SEQ ID NO:7)。图11B：如每条泳道上面所示，使用新鲜分离的CLL细胞的裂解物对ROR1、ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6特异性的单克隆抗体所产生的免疫沉淀的免疫印迹分析。如每个亚组左边所示，用对ROR1、ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6特异性的抗体探测免疫印迹。

图12A-12D.UC-961抑制ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6与ROR1或ROR2的共定位。图12A：在血清饥饿的CLL细胞+/-Wnt5a(如左边所示)和Ctrl-IgG或UC-961中，通过共聚焦显微镜检测的ROR1与ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6的共定位(例如箭头)(比例尺：5μm)。图12B：使用对ARHGEF1(左子图)或ARHGEF6(右子图)特异性的单克隆抗体，来自用或不用Wnt5a培养的CLL细胞的裂解物的免疫沉淀的Rac1(左图)或RhoA(右图)随时间(分钟)的体外交换，如每图的右下方所示。该线描绘了仅使用缓冲液的GTP酶活化。图12C：如在每条泳道上部所示，使用非特异性Ctrl-siRNA或对ARHGEF1(ARHGEF1-siRNA)、ARHGEF2(ARHGEF2-siRNA)、或ARHGEF6(ARHGEF6-siRNA)特异性的siRNA瞬时转染CLL细胞。48小时后通过免疫印迹分析检查细胞ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6的表达。每条泳道下面的数字是对Ctrl-siRNA样品标准化的每个GEF比βE肌动蛋白的条带密度的比例。图12D：如在泳道顶部所指示的，用Ctrl-siRNA、ARHGEF1-siRNA、或ARHGEF6-siRNA转染的CLL细胞然后后进行用(+)或不用(-)Wnt5a处理的Rac1或RhoA活化。全细胞裂解物也通过免疫印迹分析检测总Rac1或RhoA。每条泳道下面的数字是对未处理的Ctrl-siRNA转染的样品标准化的活化的GTP酶比总GTP酶的条带密度的比例。

图13A-13B.在亲本MEC1细胞和用各种ROR1构建体的每个构建体转染的MEC1细胞中ROR1、ROR2和Wnt5a的表达。图13A：MEC1细胞或用编码ROR1或编码截短形式的ROR1的载体转染的MEC1细胞的荧光，用荧光染料标记的同种型对照单克隆抗体(空心直方图)或4A5-Alexa-647(顶行)或抗ROR2-Alexa-488(底行)(阴影直方图)。图13B：Wnt5a的表达通过对来自原代CLL细胞或MEC1细胞的裂解物的免疫印迹分析进行测定。使用重组Wnt5a(100ng)作为阳性对照，β-肌动蛋白作为细胞裂解物的上样对照。

图14A-14C.MEC1细胞的共聚焦显微图，用于表达ROR1或各种截短形式的ROR1。图14A：如图的每行右侧所示(比例尺：2μm)，转染有各种ROR1构建体的MEC1细胞中的ROR1和ROR2的共定位(例如箭头)。图14B：如图的每行右侧所示(比例尺：2μm)，ROR1和ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6在转染有各种ROR1构建体的MEC1细胞中的共定位(例如箭头)。图14C：如图的每行右侧所示(比例尺：2μm)，ROR2和ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6在转染有各种ROR1构建体的MEC1细胞中的共定位(例如箭头)。

发明详述

I.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。一般而言，本文所用的命名法和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、以及核酸化学和杂交的实验过程是本领域中众所周知且常用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。技术和过程通常是根据本领域常规方法和各种普遍的参考文献(通常参见Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，其通过引用并入本文)，在整个说明书中提供。

“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其多聚体，以及其互补物。术语“多核苷酸”是指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”通常是指多核苷酸的单个单元，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其经修饰版本(version)。本文考虑的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA(包括siRNA)、以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂交分子。本文所用的核酸也指具有与天然存在的核酸相同的基本化学结构的核酸。这种类似物具有经修饰的糖和/或经修饰的环取代基，但保持与天然存在的核酸相同的基本化学结构。核酸模拟物(nucleic acid mimetic)是指具有与核酸的一般化学结构不同的结构的化学化合物，但是所述化学化合物以与天然存在的核酸类似的方式起作用。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。

如本文所用的“合成mRNA”是指通过非天然手段(如标准寡核苷酸合成技术或克隆技术)衍生的任何mRNA。这种mRNA还可包括天然存在的核苷酸的非蛋白原(non-proteinogenic)衍生物。另外，本文中的“合成mRNA”还包括使用任何表达载体(包括但不限于原核细胞、真核细胞系和病毒方法)通过重组技术表达或外源表达的mRNA。“合成mRNA”包括已经纯化的或获得自表达载体或系统的此类mRNA。

词语“互补”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T与序列T-C-A互补。互补性可以是部分的，其中根据碱基配对只有一些核酸匹配，或可以是完全的，其中根据碱基配对所有核酸均匹配。

当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作地连接”的。例如，如果表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌性前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并符合读框。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的多聚物，其中多聚物可缀合至不由氨基酸组成的部分。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸多聚物，以及天然的氨基酸多聚物和非天然的氨基酸多聚物。这些术语适用于大环的肽、已经用非肽功能性修饰的肽、肽模拟物、聚酰胺和大内酰胺(macrolactam)。“融合蛋白”是指编码重组表达为单个部分的两个或更多个不同的蛋白质序列的嵌合蛋白质。

术语“肽基”和“肽基部分”是指单价肽。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指在自然界中找不到的氨基酸类似物、合成的氨基酸和氨基酸模拟物。

氨基酸在本文中可通过其公知的三字母符号或由IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可用它们通常接受的单字母代码来表示。

“保守性修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守性修饰的变体是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在指定密码子指定为丙氨酸的每个位置上，密码子可以改变成任何相应的密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，这是保守修饰的变体的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG外)可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异隐含在关于表达产物的每个描述的序列中，而不是关于实际探针序列中。

关于氨基酸序列，技术人员将认识到，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各个取代、缺失或添加，是“保守性修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体还包括并且不排除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因。

以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见例如Creighton、Proteins(1984))。在实施方案中、可存在至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或至少40个保守取代。在实施方案中，可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个保守取代。

通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定“序列相同性的百分比”，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗口中多核苷酸或多肽序列的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位，gap)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数来计算百分比，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目并将结果乘以100得到序列相同性的百分比。

在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情况下，术语“相同”或百分比“相同性”是指相同的两个或更多个序列或子序列或具有特定百分比相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列(即，60％相同性，在特定区域(例如本发明的整个多肽序列或本发明的多肽的各个结构域)任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同性)，当在比较窗口中进行比较和比对以达到最大对应时，或使用以下序列比较算法或通过人工比对和目视检查之一测量的指定区域。然后这样的序列被认为是“基本相同的”。这个定义也指测试序列的互补物。任选地，相同性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸的区域上。

对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或者可指定替代参数。之后基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列相同性百分比。

如本文所用，“比较窗口”包括指具有选自以下连续位置数目的任一区段：例如全长序列或20至600、约50至约200、或约100至约150个氨基酸或核苷酸，其中在两个序列最佳比对之后，可将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是周知的。用于比较的序列的最佳比对可通过以下实施：例如Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的检索相似性的方法，通过这些算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的计算机化实施，或通过人工比对和目视检查(参见例如Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(1995supplement))。

适合于确定序列相同性百分比和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其在Altschul等(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中分别描述。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中的长度为W的短字(word)来识别高评分序列对(HSP)，所述字(word)在数据库序列中与相同长度的字对齐时匹配或满足一些正值阈值评分T。T被称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些最初的相邻字命中作为启动检索的种子(seed)，以找到包含它们的更长的HSP。只要累积比对得分可以增加，字命中就沿每个序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。当在以下情况下，字命中向各个方向的延伸将停止：累计比对分数从其达到的最大值下降X量；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累计评分降为零或低于零；或者达到序列的任一端点。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3和期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。

BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性的度量是最小总和概率(P(N))，其提供了偶然发生两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，那么认为核酸与参考序列相似。

两个核酸序列或多肽基本上相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应，如下所述。多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅由于保守取代不同。两个核酸序列基本相同的另一个指示是两个分子或其互补物在严格条件下彼此杂交，如下所述。另外两个核酸序列基本相同的指示是可使用相同的引物来扩增该序列。

氨基酸或核苷酸碱基“位置”由数字表示，该数字基于其相对于N端(或5'端)的位置依次确定参考序列中的每个氨基酸(或核苷酸碱基)。由于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截短、融合等，通常通过简单地从N端计数确定的测试序列中的氨基酸残基数不一定是与参考序列中对应位置的数目相同。例如，在变体相对于比对参考序列具有缺失的情况下，变体中不存在对应于参考序列中缺失位点位置的氨基酸。在比对的参考序列中存在插入的情况下，该插入将不对应于参考序列中的编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考序列或比对序列中可有氨基酸串，其可不对应于相应序列中的任何氨基酸。

当在给定氨基酸或多核苷酸序列的编号的情况下使用时，术语“参考编号”或“对应于”是指当给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列比较时，特定参考序列的残基的编号。在实施方案中，与参考序列的比较是给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列之间的序列比对。

当关于例如细胞、核酸或蛋白质使用时，术语“重组”指示细胞、核酸或蛋白质已通过引入异源核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或者细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或者表达从天然形式的细胞中发现的那些基因被修饰的基因(例如编码天然或非天然转运蛋白的突变，如本文所述的转运蛋白基序列)。例如，重组蛋白质可以是由已经通过引入异源核酸(例如编码重组蛋白质)而被修饰的细胞或生物体表达的蛋白质。

本文所用的关于DNA核酸序列(例如基因)的“表达”一词是指该序列的转录和/或翻译产物。DNA分子在细胞中的表达水平可基于存在于细胞内的相应mRNA的量或由细胞产生的DNA编码的蛋白质的量来确定(Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,18.1-18.88)。

术语“基因”是指涉及产生蛋白质的DNA区段；它包括编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。前导序列、尾随序列以及内含子包括在转录和翻译基因期间必需的调控元件。此外，“蛋白质基因产物”是从特定基因表达的蛋白质。

术语“分离的”是指与其正常结合的组分(其它蛋白质、核酸、细胞等)部分或完全分离的核酸、多核苷酸、多肽、蛋白质或其它组分。在实施方案中，分离的多肽或蛋白质是重组多肽或蛋白质。

“细胞培养物”是位于生物体外的细胞的体外群。细胞培养物可从细胞库或动物分离的原代细胞或衍生自这些来源之一的并且被永生化以进行长期体外培养的继代细胞中建立。

本文使用的“细胞”是指进行足以保存或复制其基因组DNA的代谢或其他功能的细胞。细胞可通过本领域公知的方法鉴定，所述方法包括例如完整膜的存在、特定染料的染色、产生后代的能力、或者在配子的情况下能够与第二配子产生一个有活力(viable)的后代。细胞可包括原核和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和衍生自植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如斜纹夜蛾属，spodoptera)和人类细胞。

术语“转染”或“转导”可互换使用，并定义为将核酸分子和/或蛋白质引入细胞的过程。可使用非病毒的方法或基于病毒的方法将核酸引入细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的序列。典型地，包含蛋白质表达必需元件(例如启动子、转录起始位点等)的核酸载体。非病毒转染方法包括不使用病毒DNA或病毒颗粒作为递送系统将核酸分子引入细胞的任何合适的方法。示例性的非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声致穿孔(sonoporation)、通过热休克转染、磁化和电穿孔。对于基于病毒的方法，任何有用的病毒载体均可用于本文所述的方法中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。在一些方面，按照本领域公知的标准方法使用逆转录病毒载体将核酸分子引入细胞。术语“转染”或“转导”也指将蛋白质从外部环境引入细胞。通常，蛋白质的转导或转染依赖于将能够穿过细胞膜的肽或蛋白质连接到感兴趣的蛋白质。参见例如Ford等(2001)Gene Therapy 8：1-4和Prochiantz(2007)Nat.Methods 4：119-20。

术语“质粒”是指编码基因和/或编码基因表达所必需的调节元件的核酸分子。来自质粒的基因的表达可以以顺式或反式发生。如果基因以顺式表达，则基因和调控元件由相同的质粒编码。反式表达是指基因和调控元件由不同质粒编码的情况。

术语“附加型”是指细胞中质粒的染色体外状态。附加型质粒是不属于染色体DNA的一部分并且独立于染色体DNA复制的核酸分子。

术语“外源的”是指源自给定细胞或生物体之外的分子或物质(例如，核酸或蛋白质)。相反地，术语“内源的”是指天然存在或起源于给定的细胞或生物体的分子或物质。

“载体”是能够将另一核酸转运到细胞中的核酸。当载体存在于合适的环境中时，载体能够指导由载体携带的一个或多个基因编码的一种或多种蛋白质的表达。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指形成复合物的两个分子(例如，包含ROR1和ROR2蛋白的蛋白质复合物，或包含ROR1和/或ROR2蛋白的蛋白质复合物与抗体结合)在生理条件下相对稳定。

用于测定配体(例如抗体)是否与蛋白质(抗原)结合和/或配体对蛋白质的亲和力的方法是本领域已知的。例如，可使用多种技术来检测和/或定量配体与蛋白质的结合，所述技术例如但不限于蛋白质印迹、斑点印迹、表面等离子体共振方法(例如BIAcore系统；Pharmacia Biosensor AB，Uppsala,Sweden和Piscataway，NJ)，生物膜层干涉(BLI)技术(例如Octet系统，Pall ForteBio Menlo Park,CA)，等温滴定量热法(ITC)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

可用于分析配体的免疫特异性结合和交叉反应性的免疫测定法包括但不限于使用如下技术的竞争性和非竞争性测定系统，例如蛋白质印迹、RIA、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、免疫扩散测定法、凝集测定法、互补物结合测定法、免疫放射测定法和荧光免疫测定法。

“标记”或“可检测部分”是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段可检测的组合物。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子密度试剂、酶(例如在ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质(例如抗体)或可被检测的其他实体，例如通过将放射性标记并入肽中或将荧光团共价连接到与靶肽特异性反应的抗体上。可使用本领域已知的用于将抗体缀合至标记的任何合适的方法，例如使用Hermanson，Bioconjugate Techniques 1996，Academic Press，Inc.，San Diego中所述的方法。

“标记的蛋白质或多肽”是通过接头或化学键共价地，或者通过离子键、范德华力、静电或氢键非共价地结合到标记上，从而可通过检测与标记的蛋白质或多肽结合的标记的存在来检测标记的蛋白质或多肽的存在。或者，使用高亲和力相互作用的方法可获得相同的结果，其中一对结合配偶体之一结合另一结合配偶体，例如生物素、链霉抗生物素蛋白。

“对照”样品或值是指用作参考的样品，通常是已知的参考，用于与测试样品进行比较。例如，可以从测试条件(例如在测试化合物的存在下)获取测试样品，并且与来自已知条件的样品(例如在不存在测试化合物(阴性对照)或者在存在已知化合物(阳性对照)的情况下)进行比较。对照也可表示从大量测试或结果中收集的平均值。本领域的技术人员将认识到，对照可被设计用于评估任何数量的参数。例如，可基于药理学数据(例如半衰期)或治疗措施(例如副作用比较)设计对照以比较治疗益处。本领域技术人员将理解在给定情况下哪些标准对照是最合适的，并且能够基于与标准对照值的比较来分析数据。标准对照对于确定数据的显著性(例如统计学显著性)也是有价值的。例如，如果给定参数的值在标准对照中变化很大，则测试样本的变化不会被认为是显著的。

术语“抑制剂”、“阻遏物”或“拮抗剂”或“负调节物”可互换地指能够可检测地降低给定基因或蛋白质的表达或活性的物质。与拮抗剂不存在时的对照相比，拮抗剂可降低表达或活性10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，或者与拮抗剂不存在时的对照相比，拮抗剂可降低表达或活性的量，所述量的范围在由前述百分比中的任意两个所限定的范围内。在某些情况下，表达或活性以1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍低于不存在拮抗剂时的表达或活性，或者表达或活性在由上述任何两个值定义的范围内低于不存在拮抗剂时的表达或活性。

如本文所定义，关于蛋白质-抑制剂(例如，如本文提供的测试剂)相互作用的术语“抑制”是指相对于不存在抑制剂(例如，测试剂)的情况下的蛋白质活性或功能，对蛋白质活性或功能产生负面影响(例如，降低)(例如，降低ROR1与ROR2的结合或反之，例如在包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物中)。在实施方案中，抑制是指减少疾病或疾病症状。因此，抑制至少在某种程度上包括，部分地或完全地阻断刺激，降低、预防或延迟活化，或失活、脱敏或下调信号转导或酶活性或蛋白质的量。类似地，“抑制剂”是抑制ROR1或ROR2活性的化合物或蛋白质，例如通过结合部分地或完全地阻断、降低、预防、延迟、失活、脱敏或下调酶活性(例如ROR1或ROR2催化活性)。

如本文所用的术语“小分子”是指分子量为500道尔顿或更小但大于1道尔顿的化合物。尽管小分子可能是生物来源的，但小分子通常是非生理的。

抗体是大的复合的分子(分子量约为150,000或约1320个氨基酸)，具有复杂的内部结构。天然抗体分子含有两对相同的多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每条轻链和重链又依次由两个区域组成：参与结合靶抗原的可变(“V”)区和与免疫系统的其他组分相互作用的恒定(“C”)区。轻链和重链可变区在三维空间中聚集在一起以形成结合抗原的可变区(例如细胞表面上的受体)。在每个轻链或重链可变区内，存在称为互补决定区(“CDR”)的3个短区段(平均长度为10个氨基酸)。抗体可变区中的六个CDR(3个来自轻链，3个来自重链)在三维空间中一起折叠以形成停靠靶抗原的实际抗体结合位点。CDR的位置和长度已经由Kabat,E.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Departmentof Health and Human Services，1983,1987精确定义。CDR中不包含的可变区部分被称为框架(“FR”)，其形成CDR的环境。

如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”是指主要负责抗原结合的区域。轻链可变区中有三个CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)，重链可变区中有三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)。在实施方案中，形成六个CDR的残基是轻链可变区中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)，以及重链可变区中的31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)。Kabat等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD，在此通过引用并入本文。在实施方案中，形成六个CDR的残基是轻链可变区中的残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)，以及重链可变区中的26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)。Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917，在此通过引用并入本文。除非另有说明，如本文所用，CDR残基的编号根据Kabat。

因此，术语“抗体”根据其在本领域中通常已知的含义使用。抗体以例如完整的免疫球蛋白或通过用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区二硫键下方消化抗体以产生F(ab)'2(Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键与V_H-C_H1连接的轻链)。在温和的条件下F(ab)'2可被还原以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分铰链区的Fab(参见FundamentalImmunology(Paul ed.,3d ed.1993))。虽然根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是技术人员将会理解此类片段可通过化学或通过重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用，术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那些(参见例如McCafferty等，Nature348：552-554(1990))。如本文所用，术语“抗体片段”是指抗体的部分。抗体片段的实例包括但不限于线性抗体、单链抗体分子、Fv、Fab和F(ab').sub.2片段以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在实施方案中，抗体片段保留了重链和/或轻链可变区的至少一部分。

为了制备单克隆或多克隆抗体，可使用本领域已知的任何技术(参见例如Kohler&Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985)77-96页)。“单克隆”抗体(mAb)是指衍生自单个克隆的抗体。用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号)可适用于产生本文公开的多肽的抗体。此外，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合选定抗原的抗体和异源Fab片段。

人源化抗体是基因工程化的抗体，其中至少一个CDR(或其功能性片段)来自小鼠抗体(“供体抗体”，其也可以是大鼠、仓鼠或其他非人物种)被移植到人抗体(“受体抗体”)。在实施方案中，多于一个小鼠CDR被移植(例如全部6个小鼠CDR被移植)。受体抗体的序列可以是例如成熟的人抗体序列(或其片段)、人抗体序列的共有序列(或其片段)或种系区序列(或其片段)。因此，人源化抗体可以是具有来自供体抗体和可变区框架(FR)的一个或多个CDR的抗体。另外，为了保持高结合亲和力，人受体序列中的氨基酸可被来自供体序列的相应氨基酸取代，例如：(1)氨基酸在CDR中；(2)氨基酸位于人框架区(例如氨基酸紧邻CDR之一)。参见美国专利第5,530,101和5,585,089号，其通过引用并入本文，其提供了用于构建人源化抗体的详细说明。尽管人源化抗体通常包含来自小鼠抗体的全部6个CDR(例如，如Kabat所定义的，但通常还包括由Chothia定义的高变环H1)，但是也可用更少的小鼠CDR和/或小于完整的小鼠CDR序列(例如CDR的功能片段)来制备人源化抗体(例如，Pascalis等，J.Immunol.169：3076,2002；Vajdos等，Journal of Molecular Biology,320：415-428,2002；Iwahashi等，Mol.Immunol.36：1079-1091,1999；Tamura等，Journal of Immunology，164：1432-1441,2000)。

通常，如本文所提供的人源化抗体可包括(i)包含至少一个来自小鼠抗体的CDR(经常是三个CDR)(在本文中也称为小鼠CDR)和人可变区框架的的轻链；和(ii)包含至少一个来自小鼠抗体的CDR(经常是三个CDR)和人可变区框架(FR)的重链。轻链和重链可变区框架(FR)可分别是成熟的人抗体可变区框架序列(或其片段)、种系可变区框架序列(与J区序列组合)(或其片段)或人抗体可变区框架序列的共有序列(或其片段)。

嵌合抗体是其中小鼠(或其它啮齿动物)抗体的可变区与人抗体的恒定区组合的抗体；他们通过基因工程化的方法的构建是众所周知的。这种抗体保留小鼠抗体的结合特异性，同时约三分之二是人的。存在于小鼠、嵌合和人源化抗体中的非人序列的比例表明嵌合抗体的免疫原性介于小鼠和人源化抗体之间。可具有相对于小鼠抗体降低的免疫原性的其他类型的基因工程化的抗体包括使用噬菌体展示方法制备的人抗体(Dower等，WO91/17271；McCafferty等，WO92/001047；Winter，WO92/20791；以及Winter，FEBS Lett.23：92,1998，其每一个通过引用并入本文)或使用转基因动物(Lonberg等，WO93/12227；Kucherlapati WO91/10741，其各自通过引用并入本文)。

设计人源化抗体的其他方法也可用于获得与上述美国专利第5,530,101和5,585,089号中的方法相同的结果，例如“超人源化(superhumanization)”(参见Tan等J.Immunol.169：1119,2002和美国专利第6,881,557号)或Studnicak等，Protein Eng.7:805,1994的方法。此外，产生基因工程化的、免疫原性降低的单克隆抗体的其他方法包括“改形(reshaping)”、“超嵌合(hyperchimerization)”和镶饰(veneering)/重塑(resurfacing)，如Vaswami等，Annals of Allergy，Asthma and Immunology 81：105，1998；Roguska等，Protein Eng.9∶895，1996；和美国专利第6,072,035和5,639,641号；Methods Mol Biol.2009；525∶405-23，Deimmunization of monoclonalantibodies.Jones TD1，Crompton LJ，Carr FJ，Baker MP中描述的。

单克隆抗体的表位是单克隆抗体结合抗原的区域。如果两种抗体之一竞争性抑制(阻断)另一种与抗原的结合，则两种抗体结合相同或重叠的表位。也就是说，如在竞争性结合测定中测量的，超过一个抗体1x、5x、10x、20x或100x或在任何两个上述值限定的范围内的一个抗体的量抑制另一个抗体的结合至少30％，但优选50％、75％、90％或甚至99％或任何两个上述值所限定的范围内(参见，例如，Junghans等，Cancer Res.50：1495,1990)。或者，如果基本上抗原中降低或消除一种抗体结合的所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果一些降低或消除一种抗体结合的氨基酸突变降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。

如本文所指的“ROR1蛋白”包括也称为神经营养酪氨酸激酶相关受体1(NTRKR1)的酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1)的任何重组或天然形式，或保持ROR1的激酶活性(例如与ROR1相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内或由任何两个上述值所限定的范围内)的其变体或其同系物。在一些方面，与天然存在的ROR1蛋白相比，所述变体或同系物的整个序列或该序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分或在由任何两个上述长度所限定的范围内)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性或在由任何两个上述值所限定的相同性范围内。在实施方案中，ROR1蛋白与由UniProt参考号Q01973(SEQ ID NO：8)或与其具有实质相同性的变体或同源物所鉴定的蛋白质基本上相同。在一些实施方案中，ROR1蛋白与由UniProt参考号Q9Z139(SEQ ID NO：9)或与其具有实质相同性的变体或同系物鉴定的蛋白质基本上相同。

本文所指的“ROR2蛋白”包括也称为神经营养酪氨酸激酶相关受体2(NTRKR2)的酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR2)的任何重组或天然形式，或保持ROR2的激酶活性(例如与ROR2相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内或由任何两个上述值所限定的范围内)的其其变体或其同系物。在一些方面，与天然存在的ROR2蛋白相比，所述变体或同系物的整个序列或该序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分或在由任何两个上述长度所限定的范围内)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性或在由任何两个上述值所限定的相同性范围内。在实施方案中，ROR2蛋白与由UniProt参考号Q01974(SEQ ID NO：10)或与其具有实质相同性的变体或同源物所鉴定的蛋白质基本上相同。在一些实施方案中，ROR2蛋白与由UniProt参考号Q9Z138(SEQ ID NO：9)或与其具有实质相同性的变体或同系物鉴定的蛋白质基本上相同。

术语“siRNA”、“小干扰RNA”等在惯例和常规意义上指通常长度为20-25个碱基对的RNA分子，其在RNA干扰途径内通过用互补核苷酸序列干扰表达特定基因起作用。不希望受任何理论束缚，siRNA被认为在转录后帮助降解mRNA，因此除去不然将被表达的转录物。术语“siRNA对ROR1或ROR2是特异性的”是指siRNA在表达系统(例如细胞)中在接触后减少或阻止ROR1或ROR2的表达。

“Wnt5a蛋白”在本文中是指包括任何重组或天然存在形式的无翼型(winglesstype)MMTV整合位点家族、成员5a(Wnt5a)或其变体或其同系物，其保持Wnt5a的活性(例如与Wnt5a相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内或由任何两个上述值所限定的范围的活性内)。在一些方面，与天然存在的Wnt5a蛋白相比，所述变体或同系物的整个序列或该序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分或在由任何两个上述长度所限定的范围内)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性或在由任何两个上述值所限定的相同性范围内。在实施方案中，Wnt5a蛋白与由UniProt参考号P41221(SEQ ID NO：12)或与其具有实质相同性的变体或同源物所鉴定的蛋白质基本上相同。在一些实施方案中，Wnt5a蛋白与由UniProt参考号P22725(SEQ ID NO：13)或与其具有实质相同性的变体或同系物鉴定的蛋白质基本上相同。

“RhoA蛋白”或“RhoA”在本文中是指包括任何重组或天然存在形式的Ras同源基因家族成员A(RhoA)或其变体或其同系物，其保持RhoA的GTP酶(鸟苷三磷酸酶)活性(例如与RhoA相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内或由任何两个上述值所限定的范围的活性内)。在一些方面，与天然存在的RhoA蛋白相比，所述变体或同系物的整个序列或该序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分或在由任何两个上述长度所限定的范围内)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性或在由任何两个上述值所限定的相同性范围内。在实施方案中，RhoA蛋白与由UniProt参考号P61586(SEQ ID NO：14)或与其具有实质相同性的变体或同源物所鉴定的蛋白质基本上相同。在一些实施方案中，RhoA蛋白与由UniProt参考号Q9QUI0(SEQ IDNO：15)或与其具有实质相同性的变体或同系物鉴定的蛋白质基本上相同。

“Rac1蛋白”或“Rac1”在本文中是指包括任何重组或天然存在形式的Ras相关C3肉毒毒素底物1(Rac1)或其变体或其同系物，其保持Rac1的GTP酶(鸟苷三磷酸酶)活性(例如与Rac1相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内或由任何两个上述值所限定的范围的活性内)。在一些方面，与天然存在的Rac1蛋白相比，所述变体或同系物的整个序列或该序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分或在由任何两个上述长度所限定的范围内)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性或在由任何两个上述值所限定的相同性范围内。在实施方案中，Rac1蛋白与由UniProt参考号P63000(SEQ ID NO：16)或与其具有实质相同性的变体或同源物所鉴定的蛋白质基本上相同。在一些实施方案中，Rac1蛋白与由UniProt参考号P63001(SEQID NO：17)或与其具有实质相同性的变体或同系物鉴定的蛋白质基本上相同。

“ARHGEF1蛋白”或“ARHGEF1”在本文中是指包括任何重组或天然存在形式的Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子1(ARHGEF1)或其变体或其同系物，其保持ARHGEF1的活性(例如与ARHGEF1相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内或由任何两个上述值所限定的范围的活性内)。在一些方面，与天然存在的ARHGEF1蛋白相比，所述变体或同系物的整个序列或该序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分或在由任何两个上述长度所限定的范围内)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性或在由任何两个上述值所限定的相同性范围内。在实施方案中，ARHGEF1蛋白与由UniProt参考号Q92888(SEQ ID NO：18)或与其具有实质相同性的变体或同源物所鉴定的蛋白质基本上相同。在一些实施方案中，ARHGEF1蛋白与由UniProt参考号Q61210(SEQ ID NO：19)或与其具有实质相同性的变体或同系物鉴定的蛋白质基本上相同。

“ARHGEF2蛋白”或“ARHGEF2”在本文中是指包括任何重组或天然存在形式的Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子2(ARHGEF2)或其变体或其同系物，其保持ARHGEF2的活性(例如与ARHGEF2相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内或由任何两个上述值所限定的范围的活性内)。在一些方面，与天然存在的ARHGEF2蛋白相比，所述变体或同系物的整个序列或该序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分或在由任何两个上述长度所限定的范围内)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性或在由任何两个上述值所限定的相同性范围内。在实施方案中，ARHGEF2蛋白与由UniProt参考号Q92974(SEQ ID NO：20)或与其具有实质相同性的变体或同源物所鉴定的蛋白质基本上相同。在一些实施方案中，ARHGEF2蛋白与由UniProt参考号Q60875(SEQ ID NO：21)或与其具有实质相同性的变体或同系物鉴定的蛋白质基本上相同。

“ARHGEF6蛋白”或“ARHGEF6”在本文中是指包括任何重组或天然存在形式的Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子6(ARHGEF6)或其变体或其同系物，其保持ARHGEF6的活性(例如与ARHGEF6相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性内或由任何两个上述值所限定的范围的活性内)。在一些方面，与天然存在的ARHGEF6蛋白相比，所述变体或同系物的整个序列或该序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分或在由任何两个上述长度所限定的范围内)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列相同性或在由任何两个上述值所限定的相同性范围内。在实施方案中，ARHGEF6蛋白与由UniProt参考号Q15052(SEQ ID NO：22)或与其具有实质相同性的变体或同源物所鉴定的蛋白质基本上相同。在一些实施方案中，ARHGEF6蛋白与由UniProt参考号Q8K4I3(SEQ ID NO：23)或与其具有实质相同性的变体或同系物鉴定的蛋白质基本上相同。

术语“UC-961”、“Cirmtuzumab”等在惯例和常规意义上指能够与ROR1结合的单克隆抗体药剂，例如在CLL细胞表面上表达。UC-961与ROR1的结合可能阻碍细胞生长和存活。

术语“荧光共振能量转移”、“FRET”等在惯例和常规意义上指在两种光敏物质(例如可检测部分如发色团或荧光团)之间的能量转移机理。这种分子之间的能量转移可通过非辐射偶极子-偶极子耦合来介导，其效率与距离的六次方成反比。因此，如本领域已知的，FRET可对供体和受体光敏物质之间的距离极为敏感。

术语“ROR1的KNG结构域”等在惯例和常规意义上指ROR1的细胞外环状结构区(KNG)结构域。术语“ROR2的KNG结构域”等在惯例和常规意义上指ROR2的KNG结构域。如本领域已知的，环状结构区结构域是自发的蛋白质结构域，其折叠成由二硫键稳定的特征性大环。在实施方案中，KNG结构域对应于SEQ ID NO：8的氨基酸残基310-392。在实施方案中，KNG结构域对应于SEQ ID NO：10的氨基酸残基314-395。

如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌和肉瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化疗耐药性、赫赛汀(herceptin)耐药性、HER2阳性、多柔比星(doxorubicin)耐药性、他莫昔芬(tamoxifen)耐药性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌瘤、肉瘤)、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、或多发性骨髓瘤。额外的实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或成神经管细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、癌症、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、皮癌前病变(premalignant skinlesions)、睾丸癌、淋巴癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺赘生物、甲状腺髓样癌(medullarythyroid cancer)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma)、黑素瘤、结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌、乳头派杰病(Paget’s Disease of the Nipple)、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。

术语“白血病”广泛地指血液形成器官的进行性恶性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中的白细胞及其前体的变形的增殖和发育。白血病一般根据以下进行临床分类：(1)疾病的持续时间和特征--急性或慢性；(2)涉及的细胞类型；骨髓的(骨髓性的)、淋巴的(淋巴系性的)或单核细胞的；和(3)血液白血病性的或非白血病性的(亚白血性血病的，subleukemic)中异常细胞的数目增加或不增加。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血病性白血病、a leukocythemicleukemia、嗜碱性粒细胞白血病、干细胞性白血病、牛白血病、慢性粒细胞白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗斯白血病、多毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、成淋巴球性白血病、淋巴样白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、小成髓细胞性白血病(micromyeloblastic leukemia)、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞白血病、髓样粒细胞白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病、浆细胞白血病(plasma cellleukemia)、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病(plasmacytic leukemia)、早幼粒细胞白血病、Rieder细胞白血病、Schilling氏白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病或未分化细胞性白血病。

术语“肉瘤”通常是指由类似胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，并且通常由嵌入纤维状(fibrillar)或均质物质中的紧密堆积的细胞组成。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy's肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤(chloroma sarcoma)、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、Wilms’肿瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、Ewing’s肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素性出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、Jensen’s肉瘤、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶肉瘤、骨旁肉瘤、网状细胞肉瘤、劳氏肉瘤、浆液性囊肿肉瘤、滑膜肉瘤或毛细血管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。

术语“黑素瘤”被认为是指由皮肤和其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的黑素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑素瘤、无色素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、Cloudman’s黑素瘤、S91黑素瘤、Harding-Passey黑素瘤、幼年黑素瘤、雀斑样痣恶性黑素瘤(lentigo maligna melanoma)、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、subungal melanoma或浅表扩散性黑素瘤(superficial spreading melanoma)。

术语“癌”是指由上皮细胞组成的恶性新生长，其倾向于渗透周围组织并引起转移。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括例如甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡状癌(acinous carcinoma)、腺样癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底样细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管肺癌(bronchogeniccarcinoma)、脑样癌(cerebriform carcinoma)、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺性癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌(carcinoma en cuirasse)、皮肤癌、柱状癌(cylindricalcarcinoma)、柱状细胞癌、导管癌(duct carcinoma)、导管癌(ductal carcinoma)、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外生癌、溃疡性癌、纤维癌、gelatinifornicarcinoma、胶状癌、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌(hematoid carcinoma)、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、透明细胞癌、肾上腺样癌、幼稚性胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗门特氏(Krompecher's)癌、Kulchitzky-细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌、小叶癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓质癌(medullary carcinoma)、黑素癌、软癌(carcinomamolle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、黏膜癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、胶样癌、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌(pultaceous carcinoma)、肾的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、schneiderian癌、硬癌、阴囊癌(carcinomascroti)、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、海绵样癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌(transitional cell carcinoma)、结节性癌(carcinoma tuberosum)、小管癌、结节性肝癌(tuberous carcinoma)、疣状癌或绒毛状癌。

如本文所用，术语“转移”、“转移性”和“转移性癌症”可互换使用，并且是指增殖性疾病或病症(例如癌症)从一个器官或另一个非相邻器官或身体部分的扩散。癌症发生在原发部位，例如乳房，该部位被称为原发性肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发肿瘤或原发部位中的一些癌细胞获得穿透和渗透局部区域中周围正常组织的能力和/或穿透淋巴系统或血管系统的壁的能力，通过系统循环至身体中的其他部位和组织。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二临床可检测的肿瘤被称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移的肿瘤及其细胞与原始肿瘤相似。因此，如果肺癌转移到乳房，乳房部位的继发性肿瘤由异常肺细胞组成，而不是异常的乳房细胞。乳房中的继发性肿瘤是指转移性肺癌。因此，术语转移性癌症是指对象患有或已经有原发性肿瘤并具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。术语非转移性癌症或具有非转移性癌症的对象是指对象具有原发性肿瘤但不具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指对象患有原发性肺肿瘤或有原发性肺肿瘤病史，并且在第二位置或多个位置处(例如在乳房中)具有一个或多个继发性肿瘤的疾病。

在与疾病相关的物质或物质活性或功能(例如糖尿病、癌症(例如前列腺癌、肾癌、转移性癌症、黑素瘤、去势耐受性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤))的情况下，术语“相关”或“与……相关”是指疾病(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如默克尔细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头颈部癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、成神经细胞瘤)是(全部或部分地)由物质或物质活性或功能引起的，或者该疾病的症状是(全部或部分地)由物质或物质活性或功能引起的。

II.方法

检测了原代CLL细胞中的ROR1相关的蛋白质。出乎意料地发现，ROR1与ROR2结合以对Wnt5a应答来募集活化Rho GTP酶的鸟嘌呤交换因子(GEF)。

Wnt5a可分别活化慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞中的GTP酶RhoA和Rac1以分别增强白血病细胞迁移和增殖。已经发现相对于健康供体和新鲜分离的白血病细胞的水平，Wnt5a在CLL患者的血浆中以高水平存在。

因此，在一个方面，提供了测定患有癌症或有发生癌症风险的对象中Wnt5a蛋白的表达水平的方法。该方法包括(i)从对象获得生物样品；(ii)测定生物样品中Wnt5a蛋白的表达水平。在实施方案中，所述测定包括：(a)使Wnt5a蛋白与生物样品中的Wnt5a蛋白结合剂接触，从而形成Wnt5a蛋白-结合剂复合物；以及(b)检测所述Wnt5a蛋白-结合剂复合物。如本文所提供的“Wnt5a蛋白结合剂”是指能够结合Wnt5a蛋白的物质。Wnt5a蛋白结合剂可以是核酸或蛋白质。在实施方案中，Wnt5a蛋白结合剂是适体。在实施方案中，Wnt5a蛋白结合剂是肽。在实施方案中，Wnt5a蛋白结合剂是小分子。在实施方案中，Wnt5a蛋白结合剂是抗体。在实施方案中，Wnt5a蛋白结合剂包含可检测部分。在实施方案中，该方法包括进一步选择已经患有癌症或有发展癌症风险的对象。在实施方案中，生物样品是对象的血液衍生的生物样品。在实施方案中，血液衍生的生物样品是全血、血清或血浆。在实施方案中，癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

不受任何特定作用机制的束缚，已经发现在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的ROR1相关蛋白(包括ROR2)可在CLL和CD5B细胞上发现的证据。Wnt5a诱导ROR1-ROR2偶联(结合)，其募集ARHGEF1、ARHGEF2和ARHGEF6，并活化RhoA和Rac1，增强CLL细胞迁移和增殖。使用CLL细胞系MEC1(缺乏ROR1但表达ROR2和Wnt5a)发现，与亲代细胞相比，表达ROR1的MEC1具有募集鸟嘌呤交换因子的ROR1-ROR2复合物、增加的细胞因子引导的迁移，以及增强的免疫缺陷小鼠中的移植。ROR1-ROR2偶联(结合)需要胞外环状结构区结构域，并且Wnt5a诱导的ROR1-ROR2募集鸟嘌呤交换因子需要富含半胱氨酸结构域或胞内富含脯氨酸结构域。此外，已经发现ROR1与ROR2的偶联(结合)引起其在Wnt5a阻断的非经典Wnt信号转导的显著的生物学活性，已经发现其增强了癌细胞在体内的增殖、存活和转移。

没有已知得可用于测试可干扰ROR1与ROR2的偶联(结合)的试剂的测定，因为这以前并未被认为是非经典Wnt信号转导所需的。本文提供了这样的测定。

为此目前已经确定，抗体(例如我们的抗-ROR1单克隆抗体、UC-961)可抑制ROR1与ROR2偶联的能力，从而阻断Wnt5a可能对癌细胞具有的诱导RhoA和Rac1活化的作用。

这些发现允许本发明提供以下内容：

1)分析监测Wnt5a将ROR1与ROR2偶联的能力。

2)ROR1或ROR2的抗体可抑制ROR1与ROR2偶联的能力，从而阻断Wnt5a诱导的信号转导。

3)筛选可抑制ROR1与ROR2偶联能力的多肽或小分子。

4)对旨在阻断ROR1与ROR2的偶联(结合)的分子的相对有效性进行表征和排序，所述ROR1与ROR2的偶联(结合)是Wnt5a诱导的非经典Wnt信号转导所需的。

可使用荧光共聚焦显微镜或荧光共振能量转移(FRET)测定或通过其他方式(例如基于细胞的检测)来进行ROR1-ROR2偶联(结合)抑制剂的筛选，以监测ROR1与ROR2的共定位。筛选可以是自动化的，以使其可用于筛选干扰ROR1和ROR2的偶联(结合)的抗体或其他试剂(小分子、肽、药物等)。预期干扰这种偶联(结合)的试剂将干扰由Wnt5a诱导的非经典Wnt信号转导。

本文特别提供了尤其是鉴定能够抑制ROR1和ROR2之间的结合(例如，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持)的试剂的方法。所鉴定的药物可通过与ROR1相互作用而抑制ROR1-ROR2结合和/或包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持，由此阻止ROR1与ROR2的结合。或者，所鉴定的药物可通过与ROR2相互作用来抑制结合，由此阻止ROR1与ROR2的结合。通过它们抑制ROR1与ROR2的结合和/或抑制包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的能力，通过本文提供的方法所鉴定的药剂可被用作癌症诊断剂或癌症治疗剂。

对于本文提供的涉及“ROR1和ROR2之间的结合”的方面和实施方案，应该理解，该短语包括包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持。因此，一方面提供了鉴定ROR1-ROR2结合的抑制剂和/或包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的抑制剂的方法。该方法包括(i)在反应容器中将测试剂与ROR1蛋白和ROR2蛋白组合。(ii)检测相对于标准对照ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的减少和/或包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的减少，从而鉴定ROR1-ROR2结合和/或包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的抑制剂。

在一个方面，提供了鉴定ROR1-ROR2结合抑制剂的方法。该方法包括(i)在反应容器中将测试剂与ROR1蛋白和ROR2蛋白组合。(ii)检测ROR1蛋白与ROR2蛋白的结合相对于标准对照减少，从而鉴定出ROR1-ROR2结合抑制剂。如本文所提供的术语“结合”是指ROR1蛋白和ROR2蛋白之间的联合。该联合可以是直接的(例如通过共价键)或间接的(例如通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤键)、范德华相互作用(例如偶极子-偶极子、偶极子-诱导偶极子、伦敦色散)、环堆积(π效应)、疏水相互作用等))。因此，术语“结合”包括包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持。如本文所提供的ROR1与ROR2的结合和/或包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持也可称为“杂寡聚作用(heterooligomerization)”或“偶联”。在实施方案中，在ROR1与ROR2的结合和/或包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持之前，Wnt5a与ROR1或ROR2结合。在实施方案中，ROR1与ROR2的结合和/或包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持增加鸟嘌呤交换因子(GEF)或GTP酶的水平。ROR1蛋白和ROR2蛋白之间的相互作用和/或包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持可通过测试剂与KNG结构域的结合来抑制。在实施方案中，KNG结构域形成ROR1蛋白的一部分。在实施方案中，KNG结构域形成ROR2蛋白的一部分。

对于本文提供的方法包括其实施方案，ROR1蛋白和ROR2蛋白可由细胞表达。在实施方案中，反应容器包含细胞。在实施方案中，ROR1蛋白和ROR2蛋白在细胞表面上表达。细胞可形成体外细胞培养物的一部分。在实施方案中，体外细胞培养物包含Wnt5蛋白。因此，在实施方案中，组合步骤在Wnt5a蛋白存在下发生。在实施方案中，细胞表达内源性Wnt5a蛋白。在实施方案中，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持在Wnt5a蛋白存在下发生。在实施方案中，细胞表达外源Wnt5a蛋白。因此，在实施方案中，细胞用编码Wnt5a蛋白的载体转染。

在实施方案中，反应容器包含细胞培养物。如本文所提供的“细胞培养物”是指包含合适的细胞营养物并且能够在体外维持细胞的环境。在合适的容器(例如细胞培养皿)中，环境可以是液体环境、固体环境和/或半固体环境(例如琼脂，凝胶等)。可使用细胞培养基。本文使用的“细胞培养基”根据其在本领域中通常接受的含义使用。细胞培养基(在本领域中也称为“培养基”)包括液体(例如生长因子、矿物质、维生素等)或设计用于支持细胞生长(例如分裂、分化、维持等)的凝胶。在实施方案中，本文提供的组合物包含实施方案，还包含生理上可接受的溶液。如本文所提供的“生理上可接受的溶液”是指可包含本文提供的组合物而不失去其生物学特性的任何可接受的水溶液(例如缓冲液)。在实施方案中，生理上可接受的溶液是细胞培养基。因此，在实施方案中，细胞形成体外细胞培养物的一部分。

在实施方案中，细胞是癌细胞。在实施方案中，癌细胞是慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞。在实施方案中，CLL细胞是慢性B细胞白血病细胞。在实施例中，CLL细胞是MEC1细胞。在常规意义上，如本文所提供的MEC1细胞是指保藏在莱布尼茨研究所(LeibnizInstitute)DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心并具有登记号ACC 497的细胞。在实施方案中，MEC1细胞表达ROR1蛋白和ROR2蛋白。在进一步的实施方案中，ROR1蛋白是外源蛋白，而ROR2蛋白是内源蛋白。换句话说，MEC1细胞可内源性表达ROR2蛋白，并通过转染表达ROR1蛋白的载体形成表达ROR1蛋白和ROR2蛋白的MEC1细胞。

在实施方案中，ROR1蛋白和ROR2蛋白是分离的蛋白，并且所述方法在无细胞环境中进行。在实施方案中，组合包括将分离的ROR1蛋白与固体支持物结合(允许结合)，由此形成结合的ROR1蛋白并使结合的ROR1蛋白与分离的ROR2蛋白和测试剂接触。因此，在实施方案中，反应容器是包含固体支持物的柱。如本文包括其实施方案所提供的“固体支持物”是指可被修饰以包含适合于连接或结合分离的ROR1蛋白或分离的ROR2蛋白或其片段的分散的各个位点的任何材料，并且适合于本文提供的方法包括其实施方案。固体支持物的实例包括但不限于玻璃和改性或功能化玻璃(例如羧甲基葡聚糖功能化玻璃)、塑料(包括丙烯类、聚苯乙烯和苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、Teflon.TM.等)、多糖(例如琼脂糖凝胶、琼脂糖)、尼龙或硝酸纤维素、复合材料、陶瓷和塑料树脂，硅或硅基材料包括硅和改性硅(例如图案化硅)、碳、金属、石英(例如图案化石英)、无机玻璃、塑料、光纤束以及各种其他多聚物。通常，底物允许光学检测并且不会明显地发出荧光。

在实施方案中，检测包括检测在测试剂存在下与ROR2蛋白结合的ROR1蛋白的水平，其中与ROR2蛋白结合的ROR1蛋白水平与标准对照相比降低表明测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。标准对照可以是不存在测试剂时ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的水平。在实施方案中，标准对照是在不能抑制ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的试剂存在下，ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的水平。在实施方案中，标准对照是在不能结合ROR1蛋白或ROR2蛋白的试剂存在下，ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的水平。在实施方案中，标准对照是在不能结合ROR1蛋白的KNG结构域的试剂存在下，ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的水平。在实施方案中，标准对照是在ROR1抗体存在下，ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的水平。在进一步的实施方案中，所述ROR1抗体是4A5抗体。

在实施方案中，检测包括在存在测试剂的情况下检测包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持水平，其中所述复合物中ROR1蛋白或ROR2蛋白的水平相对于标准对照的下降表明测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。标准对照可以是在不存在测试剂的情况下，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的水平。在实施方案中，标准对照是在先前显示不抑制ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的试剂存在下，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持。在实施方案中，标准对照是在先前显示不结合ROR1蛋白或ROR2蛋白的试剂存在下，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的水平。在实施方案中，标准对照是在先前显示不结合ROR1蛋白的KNG结构域的试剂存在下包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的水平。在实施方案中，标准对照是在ROR1抗体存在下包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的水平。在进一步的实施方案中，所述ROR1抗体是4A5抗体。

在实施方案中，检测包括在存在测试剂的情况下检测未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平，其中相对于标准对照，未结合的ROR1蛋白水平升高或未结合的ROR2蛋白水平升高表明测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。如本文所提供的术语“未结合的ROR1蛋白”是指不形成复合物的一部分或不结合ROR2蛋白的ROR1蛋白。如本文所提供的术语“未结合的ROR2蛋白”是指不形成复合物的一部分或不结合ROR1蛋白的ROR2蛋白。在实施方案中，标准对照是在不存在测试剂的情况下，未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平。在实施方案中，标准对照是在不能抑制ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的试剂存在下，未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平。在实施方案中，标准对照是在不能结合ROR1蛋白或ROR2蛋白的试剂存在下，未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平。在实施方案中，标准对照是在不能与ROR1蛋白的KNG结构域结合的试剂存在下，ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的水平。在实施方案中，标准对照是在ROR1抗体存在下ROR1蛋白与ROR2蛋白结合的水平。在进一步的实施方案中，所述ROR1抗体是4A5抗体。

在实施方案中，检测包括在存在测试剂的情况下检测包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物中未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平，其中相对于标准对照未结合的ROR1蛋白水平升高或未结合的ROR2蛋白水平升高表明测试剂是包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的抑制剂。在实施方案中，标准对照是在不存在测试剂的情况下，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物中未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平。在实施方案中，标准对照是在先前显示不抑制包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的试剂存在下，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物中的未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平。在实施方案中，标准对照是在先前显示不结合ROR1蛋白的KNG结构域的试剂存在下，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的水平。在实施方案中，标准对照是在ROR1抗体存在下，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持的结合水平。在进一步的实施方案中，所述ROR1抗体是4A5抗体。

在一些实施方案中，检测包括在测试剂存在下检测鸟嘌呤交换因子(GEF)蛋白活性或鸟苷三磷酸酶(GTP酶)蛋白活性的水平，其中相对于标准对照GEF蛋白活性水平降低或GTP酶蛋白活性降低表明测试剂是ROR1-ROR2结合(例如，包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持)的抑制剂。在实施方案中，标准对照是在不存在测试剂的情况下GEF蛋白活性或GTP酶蛋白活性的水平。在实施方案中，GEF蛋白是ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6。在实施方案中，GEF蛋白是ARHGEF1。在实施方案中，GEF蛋白是ARHGEF2。在实施方案中，GEF蛋白是ARHGEF6。在实施方案中，GTP酶蛋白是RhoA或Rac1。在实施方案中，GTP酶蛋白是RhoA。在实施方案中，GTP酶蛋白是Rac1。

在实施方案中，ROR1蛋白和ROR2蛋白包含可检测部分。在实施方案中，GEF蛋白或GTP酶蛋白包含可检测部分。可检测部分如本文所定义。在实施方案中，可检测部分是生物发光分子。在实施方案中，可检测部分是光活性分子。在实施方案中，可检测部分是荧光团。在实施方案中，可检测部分是包含荧光团的抗体。在实施方案中，可检测部分与ROR1蛋白形成融合蛋白。在实施方案中，可检测部分与ROR2蛋白形成融合蛋白。可使用多种可检测部分，根据所需的灵敏度、易于与抗体缀合、稳定性要求、以及可获得的仪器和处置条款选择标记。合适的可检测部分包括但不限于放射性核素、荧光染料(例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon Green^TM、罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimineisothiocynate,TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标志物(例如绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、由肿瘤相关蛋白酶活化的自淬灭荧光化合物、酶(例如萤光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、地高辛等。在实施方案中，可检测部分适合于荧光共振能量转移(FRET)测定或荧光共定位测定。因此，在实施方案中，反应容器形成荧光检测装置的一部分。

如本文所提供的检测步骤可包括本领域通常已知和描述的免疫测定技术和方案。见Price and Newman,"Principles and Practice of Immunoassay,"2nd Edition,Grove's Dictionaries,1997；以及Gosling,"Immunoassays:A Practical Approach,"Oxford University Press,2000。可使用各种免疫测定技术，包括竞争性和非竞争性免疫测定(参见例如Self et al.,Curr.Opin.Biotechnol.,7:60-65(1996))。术语免疫测定包括但不限于酶免疫测定(EIA)，例如酶倍增免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、IgM抗体捕获ELISA(MAC ELISA)和微粒酶免疫测定(MEIA)；毛细管电泳免疫测定(CEIA)；放射免疫测定(RIA)；免疫放射测定(IRMA)；荧光偏振免疫测定(FPIA)；和化学发光测定(CL)。如果需要，这种免疫测定可以是自动的。还可将免疫测定与激光诱导的荧光结合使用(参见例如Schmalzing et al.,Electrophoresis,18:2184-93(1997)；Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.,699:463-80(1997))。脂质体免疫测定，如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器也适用于本发明(参见例如Rongen et al.,J.Immunol.Methods,204:105-133(1997))。另外，其中蛋白质/抗体复合物的形成导致光散射增加(作为标志物浓度的函数转换成峰值速率信号)的比浊法测定适合用于本发明的方法中。比浊法测定可从Beckman Coulter(Brea，CA；Kit#449430)商购获得，并且可使用Behring浊度计分析仪(Fink et al.,J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,27:261-276(1989))进行。

可直接或间接检测抗体或结合试剂与ROR1蛋白或ROR2蛋白的特异性免疫结合。直接标记包括附着于抗体的荧光或发光标记、金属、染料、放射性核素等。可使用用碘-125(¹²⁵I)标记的抗体。使用特异于蛋白质标志物的化学发光抗体的化学发光测定适用于蛋白质水平的敏感的非放射性检测。用荧光色素标记的抗体也是合适的。荧光色素的实例包括但不限于DAPI、荧光素、Hoechst 33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺(lissamine)。间接标记包括本领域熟知的各种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、尿素酶等。例如，可使用辣根过氧化物酶检测系统与显色底物四甲基联苯胺(TMB)，其在过氧化氢存在下在450nm处可检测到可溶性产物的产生。例如，碱性磷酸酶检测系统可与显色底物对硝基苯磷酸酯一起使用，其产生在405nm处容易检测到的可溶性产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测系统可与显色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)一起使用，其产生在410nm处可检测的可溶性产物。尿素酶检测系统可与底物例如脲-溴甲酚紫(Sigma Immunochemicals；St.Louis，MO)一起使用。

可分析来自直接或间接标记的信号，例如使用分光光度计检测来自显色底物的颜色；辐射计数器检测辐射，例如用于检测¹²⁵I的γ计数器；或荧光计在某波长的光的存在下检测荧光。为了检测酶联抗体，可使用分光光度计(如EMAX微板读数器)(MolecularDevices；Menlo Park，CA)根据制造商的说明书进行定量分析。如果需要，本发明的测定可以是自动化的或者是自动执行的，并且可同时检测来自多个样品的信号。

在实施方案中，检测步骤包括通过共聚焦显微镜检测ROR1-ROR2结合。通过照相机或其他记录装置(例如，光电二极管和数据存储装置)观察(并且任选地记录)的光学图像任选地在本文的任何实施方案中进一步处理，例如通过数字化图像并在电脑上存储和分析图像。数字化、存储和分析数字化视频或数字化光学图像可用各种市售外置设备和软件。

一种常规系统将来自样本场的光送至本领域常用的冷却的电荷耦合器件(CCD)相机中。CCD相机包括图像元素阵列(像素)。来自样本的光在CCD上成像。对与样本的区域对应的特定像素进行采样以获得每个位置的光强度读数。并行处理多个像素以提高速度。本发明的设备和方法容易用于观察任何样品，例如通过荧光或暗场显微技术。

本文提供的测试剂可以是能够抑制ROR1蛋白与ROR2蛋白结合(例如包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持)的任何化合物。在实施方案中，测试剂是抗体、小分子、肽、蛋白质或核酸。在实施方案中，测试剂是抗体。抗体可以是抗ROR1抗体。在实施方案中，抗体是抗ROR2抗体。因此，在实施方案中，抗体结合ROR1蛋白或ROR2蛋白。在实施方案中，抗体结合KNG结构域。在实施方案中，抗体是人源化抗体。在实施方案中，抗体是嵌合抗体。在实施方案中，抗体是scFv。在实施方案中，测试剂是小分子。在实施方案中，测试剂是肽。在实施方案中，测试剂是蛋白质。在实施方案中，测试剂是核酸。

在一个方面，提供了通过本文提供的方法包括其实施方案鉴定的抗体。在实施方案中，抗体是抗ROR1抗体。在实施方案中，抗体结合ROR1蛋白的KNG结构域。在实施方案中，抗体是cirmtuzumab。

在另一方面，提供了抑制ROR1-ROR2相互作用(例如包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持)的方法。该方法包括(i)使通过本文提供的方法包括其实施方案鉴定的化合物与ROR1-ROR2复合物接触，其中复合物包含ROR1蛋白和ROR2蛋白。(ii)允许化合物抑制ROR1蛋白和ROR2蛋白之间的相互作用，由此抑制ROR1-ROR2相互作用(例如包含ROR1和ROR2的蛋白质复合物的形成或维持)。

本文鉴定的试剂尤其可用于治疗癌症。因此，另一方面，提供了在对其有需要的对象中治疗癌症的方法。该方法包括向对象施用治疗有效量的通过本文提供的方法包括其实施方案鉴定的抗体、小分子、肽或核酸。

“患者”或“对其有需要的对象”是指患有或倾向于可通过施用本文提供的组合物或药物组合物治疗的疾病或病症的活的生物体。非限制性实例包括人、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、奶牛、鹿和其他非哺乳动物。在实施例中，患者是人。

术语“疾病”或“病症”是指能够用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的患者或对象的状态或健康状态。在实施方案中，疾病是癌症(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如默克尔细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头和颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、成神经细胞瘤)。

术语“治疗”是指治疗或改善损伤、疾病、病理或病症(包括任何客观或主观参数)的任何成功的指征，如减轻；缓解；减少症状或使患者更耐受的损伤、病理或病症；减慢恶化或衰退的速度；使恶化的最后一刻不那么虚弱；改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可基于客观或主观的参数；包括体检结果、神经精神病学的检查和/或精神病学的评估。术语“治疗”及其组合包括预防损伤、病理、病症或疾病。在实施方案中，“治疗”是指治疗癌症。

“有效量”是足以使化合物相对于不存在所述化合物时达到所述目的的量(例如达到其所施用的效果、治疗疾病、降低酶活性、增加酶活性、减少信号转导途径、或减少疾病或病症的一种或多种症状)。“治疗有效量”的实例是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的单个或多个症状的量，其也可被称为“治疗有效量”。“减少”单个或多个症状(以及和这个短语语法等同的短语)意味着减轻症状的严重程度或频率或消除症状。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。

“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指帮助施用活性试剂至对象并被对象吸收的物质，并且可包含在本发明的组合物中，而不会对患者产生显著的不利毒理学作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、普通生理盐水溶液、乳酸林格氏液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂(binder)、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(例如林格氏液)、酒精、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和颜料等。这样的制剂可被灭菌，并且如果需要的话，与辅助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等混合而不与本发明的化合物发生不利的反应。本领域技术人员将认识到其他药物赋形剂也可用于本发明。

术语“制剂”旨在包括活性化合物与作为载体的包封材料的剂型(formulation)，所述载体提供具有或不具有其它载体的活性组分的胶囊，所述活性组分被载体包围并因此与载体结合。同样，包含扁囊剂和锭剂。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适于口服施用的固体剂型。

如本文所用，术语“施用”是指口服施用，作为栓剂、局部接触、静脉内、肠胃外、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或者给对象植入缓释装置，例如微渗透泵。通过任何途径施用，包括肠胃外和透粘膜(例如，口腔、舌下、腭、齿龈、鼻、阴道、直肠或透皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、透皮贴剂等

“共同施用”是指本文所述的组合物在施用一种或多种额外的疗法的同时、刚刚之前或刚刚之后施用。本发明的化合物可对患者单独施用或者共同施用。共同施用是指包括单独地或组合地(多于一种化合物或试剂)同时施用或顺序施用化合物。因此，当需要时，制剂也可与其它活性物质组合(例如减少代谢降解)。

本文公开的组合物可通过透皮、通过局部途径递送，配制成涂药棒、溶液、混悬剂、乳剂、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、凝胶剂、涂剂(paint)、粉剂和气雾剂。口服制剂包括适于患者摄取的片剂、丸剂、粉剂、糖衣丸、胶囊、液体、锭剂、扁囊剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂(slurries)、混悬剂等。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。液体形式制剂包括溶液、混悬剂和乳剂，例如水或水/丙二醇溶液。本发明的组合物可额外地包含提供持续释放和/或缓和(comfort)的组分。这样的组分包括高分子量、阴离子伪黏膜(mucomimetic)聚合物、胶凝多糖和精细分散的药物载体基质。这些组分在美国专利第4,911,920、5,403,841、5,212,162、和4,861,760号中详细讨论。出于所有目的，这些专利的全部内容通过引用整体并入本文。本文公开的组合物还可作为微球递送用于在体内缓慢释放。例如，微球可通过在皮下缓慢释放的含有药物的微球经皮内注射施用(参见Rao,J.Biomater Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995)；作为可生物降解和可注射的凝胶制剂(参见例如Gao Pharm.Res.12:857-863,1995)；或作为用于口服施用的微球(参见例如Eyles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997)。在另一个实施方案中，本发明组合物的制剂可通过使用与细胞膜融合或被内吞的脂质体来递送，即通过使用连接于脂质体的受体配体，其与细胞的表面膜蛋白受体结合导致内吞作用。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面携带对靶细胞特异性的受体配体或者优先针对特定器官的情况下，可将本发明组合物在体内集中递送到靶细胞中。(参见，例如Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989)。组合物也可作为纳米颗粒递送。

药物组合物可包括组合物，其中以治疗有效量包含活性成分(例如本文所述的化合物，包括实施方案或实施例)，即包含有效实现其预期目的的量。对特定应用的实际有效量将特别取决于所治疗的病症。当在治疗疾病的方法中施用时，此类组合物将含有能获得所需结果的有效量的活性成分，例如调节靶分子的活性，和/或减少、消除或减缓疾病症状的进展。

对哺乳动物施用的剂量和频率(单剂量或多剂量)可根据多种因素而变化，例如哺乳动物是否患有另一种疾病、及其施用途径；受体的体型、年龄、性别、健康状况、体重、体重指数和饮食情况；被治疗疾病症状的性质和程度、同时治疗的种类、所治疗疾病的并发症或其他与健康有关的问题。其他治疗方案或试剂可与申请人发明的方法和化合物联合使用。已确定的剂量的调整和操作(例如频率和持续时间)完全在本领域技术人员的能力范围内。

对于本文所述的任何化合物，治疗有效量首先可从细胞培养测定中确定。目标浓度将是使用本文所述或本领域已知的方法测量的能够实现本文所述方法的那些活性化合物浓度。

如本领域所熟知的，用于人的治疗有效量也可从动物模型中确定。例如，可配制人用剂量以达到已经发现在动物中有效的浓度。如上所述，可通过监测化合物有效性和向上或向下调整剂量来调节人的剂量。基于上述方法和其他方法以达到在人中最大功效的剂量调整完全在普通技术人员的能力范围内。

剂量可根据患者的需要和所使用的化合物而变化。在本发明的情况中，对患者施用的剂量应该足以随时间对患者产生有益的治疗反应。剂量的大小还取决于任何不良副作用的存在、性质和程度。对于特定情况的适当剂量的确定在从业者的技能范围内。一般而言，治疗以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始。此后，剂量以小增量增加，直到达到情况下的最佳效果。可单独调整剂量和间隔以提供对正在治疗的特定临床适应症有效的所施用化合物的水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相称的治疗方案。

III.实施例

以下实施例说明了本发明的某些具体实施方案，并不意味着限制本发明的范围。

本文的实施方案通过以下实施例和详细的方案进一步说明。然而，这些实施例仅仅是为了说明实施方案，而不应被解释为限制本发明的范围。本申请通篇引用的所有参考文献和公开的专利和专利申请的内容通过引用并入本文。

我们令人惊奇地在此显示CLL细胞表达与ROR1偶联的ROR2，明显应答于Wnt5a，我们发现Wnt5a在CLL患者的血浆中以相对高的水平存在。当在缺乏Wnt5a的培养基中培养时，ROR1-ROR2复合物解离，但可通过用Wnt5a处理来重新形成，其中Wnt5a诱导GEF募集和RhoA和Rac1的活化。RhoA的活化与增强的趋化因子诱导的迁移相关，而Rac1的活化与应答于膜结合的CD154和IL-4/10的增强的白血病细胞增殖相关。抑制ROR1或ROR2的表达削弱了Wnt5a增强趋化性的能力，正如用UC-961处理一样。用MEC1细胞(一种表达Wnt5a和ROR2但不表达ROR1的CLL细胞系)也观察到了依赖将ROR2与ROR1偶联以获得最佳非经典Wnt信号转导。转染MEC1以表达ROR1允许ROR1与ROR2偶联，这与募集GEF、RhoA和Rac1的更大活化、增强的细胞趋化因子引导的迁移、以及相对于亲本MEC1细胞的增强的生长相关；这种变化可通过用UC-961处理或Wnt5a的中和抗体来抑制。总的来说，我们的研究表明，ROR1或ROR2都不足以允许Wnt5a诱导的RhoA或Rac1活化，这反击了广泛认为的每一个都可独立作为Wnt5a的受体来诱导非经典Wnt信号转导的观点²⁷,31-33。

我们发现KNG结构域是ROR1与ROR2偶联所必需的。KNG结构域含有结构域内二硫桥，其限定了通常参与蛋白质-蛋白质相互作用的多肽环³⁴。如此，ROR1的KNG结构域可能与ROR2相互作用以形成异二聚复合物(例如图5I)应答Wnt5a。尽管ΔKNG-ROR1与ROR2偶联的失败也可由于ROR1胞外结构域的截短引起的空间约束，ΔCRD-ROR1(缺少较大的细胞外CRD)可与ROR2偶联。因为CRD是Wnt推定的结合位点35,³⁶，Wnt5a与ROR2的结合可足以允许ROR2与ROR1偶联。或者，CRD除非与Wnt5a结合，CRD通常可具有抑制这种偶联的残基。在任何情况下，ΔCRD-ROR1或任何其他截短形式的ROR1都不允许在转染的MEC1细胞中募集GEF至ROR1-ROR2或增强RhoA和Rac1活化。因为除了ΔKNG-ROR1之外，ROR1的每个截短形式都允许ROR1与ROR2复合，所以ROR1与ROR2的偶联似乎不足以用于Wnt5a诱导的非经典信号转导。此外，ROR1的胞内结构域似乎是必需的，其包括富含脯氨酸的结构域(PRD)，ROR1的胞内结构域含有几个推定的SH3结合位点，其可允许GEF和/或脚手架蛋白停靠到ROR1-ROR2复合物。ΔPRD-ROR1不允许对ROR1-ROR2复合物的GEF的募集，这意味着ROR2的PRD结构域不足以募集这些因子，或者诱导应答于Wnt5a的RhoA或Rac1的增强活化。

这些观察定义了一个模型，可解释ROR2或Wnt5a在发育或肿瘤形成中的一些明显不同的属性。尽管ROR2的发育组织表达在很大程度上重叠，但与ROR1的发育组织表达并不完全一致，ROR2呈现出更广泛的分布。可想象只有在发育过程中应答于Wnt5a的共同表达ROR1和ROR2的细胞具有增强的非经典Wnt信号转导；因此ROR1的丧失可作为发育转换，使细胞逃避Wnt5a对Rho GTP酶活化的影响。这也可解释ROR2或Wnt5a可如何抑制发育中的经典Wnt信号转导和/或作为肿瘤抑制因子。像MEC1一样，细胞可需要共表达ROR1和ROR2以触发最佳的Wnt5a诱导的RhoA和Rac1的活化。在没有ROR1的情况下，Wnt5a反而可诱导ROR2结合其他卷曲蛋白(Fzd)受体^37-39，其另外与LRP5/6偶联以应答经典Wnt因子如Wnt3a ²⁷,32,38,³⁹。可想象，ROR2/Fzd复合物可与LPR/Fzd复合物的形成竞争，从而抑制其他Wnt因子诱导经典Wnt信号的能力27,32,38,³⁹。此外，ROR2或Wnt5a作为肿瘤/生长抑制剂相对于肿瘤/生长促进剂的能力可部分取决于ROR1、LPR5/6和Fzd受体的相对表达，ROR1、LPR5/6和Fzd受体可应答于Wnt5a与ROR2偶联。

与ROR1相比，ROR2在产后组织中的表达更为广泛，ROR1似乎局限于被称为原血细胞¹⁴的前体B细胞的稀有亚群。在本研究中，我们在正常CD5B细胞上发现ROR2，所述CD5B细胞是假定的CLL40的正常负体。可认为，通过这些细胞获得ROR1可以是白血病发生中的一个重要步骤，使得赘生性B细胞应答于Wnt5a以活化RhoA和Rac1，我们发现Wnt5a在CLL患者的血浆中水平相对较高。我们发现用抗ROR1单克隆抗体UC-961处理CLL细胞可破坏ROR1与ROR2的偶联并干扰应答于Wnt5a的Rho GTP酶活化，从而消除Wnt5a增强趋化因子诱导的迁移或CD154诱导的增殖的能力。同样，UC-961消除了MEC1-ROR1细胞在体外对亲本MEC1细胞增殖或趋化因子诱导的迁移或免疫缺陷小鼠在体内移植的优势。

实施例1：Wnt5a增强CLL增殖和迁移。

在存在外源性白细胞介素(IL)-4和IL-10的情况下，用表达CD154(HeLa_CD154)的细胞培养时，可诱导CLL细胞增殖(图1a，b)。外源性Wnt5a的加入显著增加了分裂细胞的比例和由羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的细胞的荧光推断的细胞分裂数；Wnt5a诱导增强的增殖可被抗ROR1单克隆抗体(UC-961)抑制至与没有Wnt5a的培养物中观察到的水平相当的水平(图1a，b)。即使在IL-4/10和/或Wnt5a存在的情况下，与HeLa细胞共培养的CLL细胞也不被诱导以增殖(图7)。

我们证实外源性Wnt5a也可增强CLL细胞向趋化因子的迁移，例如，CXCL12(图1c)[41]。UC-961可抑制Wnt5a增强迁移的能力。然而，没有CXCL12的外源性Wnt5a不诱导CLL细胞迁移，并且UC-961在没有Wnt5a的情况下不抑制CLL细胞向CXCL12的迁移(图1c)。

Rho家族蛋白在调节增殖和/或迁移方面起重要作用[42]，并且已经报道Wnt5a在其他细胞类型中活化Rac1和RhoA[38,43]。我们观察到Wnt5a可在30分钟内诱导Rac1和RhoA的活化(图1d)。加入UC-961可抑制Wnt5a诱导的Rac1和RhoA的活化(图1e)。CLL细胞与HeLa_CD154但非HeLa细胞的共培养也诱导了Rac1的活化(图1f)。此外，CXCL12在CLL细胞中活化RhoA(图1g)[44]。在每种情况下，外源性Wnt5a分别增强了由CD154或CXCL12活化的Rac1或RhoA的水平(图1f，g)。Rac1GTP酶抑制剂NSC-23766(而不是Y167R32，p160ROCK的选择性抑制剂)在有或没有外源性Wnt5a的情况下可抑制HeLa_CD154诱导的增殖。另一方面，在有或没有外源性Wnt5a的情况下，Y-27632(而不是NSC-23766)可抑制向CXCL12的趋化性，这支持了Rac1或RhoA的活化分别促进CLL细胞增殖或迁移的观点(图1h-j)。

实施例2：CLL和CD5B细胞上ROR2的检测

我们对CLL细胞裂解物的抗ROR1免疫沉淀(ip)进行基于质谱的蛋白质组学分析。令人惊讶的是，除了ROR1之外，我们还检测到了ROR2(图8A)。检测ROR2是意料之外的，因为有研究组报道CLL细胞特异性缺乏ROR2的表达[17]。然而，我们在分离的CLL细胞中检测到ROR2mRNA(图8B)，并且通过免疫印迹分析检测了所有样品中的ROR1和ROR2(图2a)。两种蛋白的表面表达也通过流式细胞术在CD5⁺CD19⁺CLL细胞上检测到(图2B、2D和8C)。

我们发现健康成年人的CD19⁺血液B细胞也表达ROR2，包括共表达CD5的B细胞(图2c)。我们从用抗ROR2染色的细胞的平均荧光强度(MFI)中减去用荧光色素标记的同种型对照单克隆抗体染色的细胞的MFI，以确定ΔMFI。健康对象CD5⁺CD19⁺B细胞的平均ROR2ΔMFI为5.1±0.3(n＝15)，高于CD5^NegCD19⁺B细胞的平均ROR2ΔMFI(为4.5±0.1)，但仍显著低于CLL细胞的平均ROR2ΔMFI(21.8±1.8，n＝80)(图2d)。我们没有在健康供体的CD19^Neg血液淋巴细胞上检测到ROR2(图2c、d)或在健康供体的单个核细胞上检测到ROR1(图8C)。

抗ROR1或抗ROR2免疫沉淀的免疫印迹分析证实在新鲜分离的CLL细胞中ROR1与ROR2偶联(图2e)；然而，除非用外源性Wnt5a处理，否则ROR1与ROR2的偶联在Wnt5a缺陷培养基中培养的CLL细胞中较不明显(图2f)。这表明在体内ROR1已经与CLL细胞上的ROR2偶联，可能是对内源性Wnt5a的应答。与此观点一致，我们检测到相对于年龄匹配的对照组，CLL患者血浆中高水平的Wnt5a(图2g)。

实施例3：UC-961抑制ROR1与ROR2的偶联

我们使用对ROR1表位特异性的并区别于UC-961识别的ROR1表位的非交叉阻断单克隆抗体(4A5)进行荧光共聚焦显微镜检查。这展示在新鲜分离的CLL细胞中ROR1与ROR2共定位(图3a)，但不与CD5或CD19共定位(图9)。然而，除非用外源性Wnt5a处理，否则难以在培养的CLL细胞中检测到ROR1与ROR2的共定位(图3b)。新鲜分离的或Wnt5a处理的CLL细胞与UC-961的孵育明显地破坏了ROR1-ROR2偶联，否则新鲜分离的或Wnt5a处理的CLL细胞与非特异性IgG(Ctrl-IgG)的孵育中可容易地观察到ROR1-ROR2偶联(3a，b)。

用对ROR1或ROR2特异性的siRNA(而不是对照siRNA)转染CLL细胞，通过免疫印迹分析或流式细胞术(图10A-10B)它们分别降低仅ROR1或ROR2的表达。使ROR1或ROR2沉默抑制Wnt5a增强CLL细胞向CXCL12迁移的能力(图3c)或诱导RhoA或Rac1的活化(图3d)，表明最佳的Wnt5a诱导的信号转导依赖于ROR1和ROR2的共表达。

实施例4：ROR1-ROR2复合体募集GEF

GEF可活化RhoA和Rac1[45]。质谱分析在抗ROR1免疫沉淀中检测到ARHGEF1、ARHGEF2和ARHGEF6(图11A)。通过对抗ROR1免疫沉淀的免疫印迹分析证实了这种联合，我们发现在抗ROR1免疫沉淀中含有这些GEF的每种(图11B)。此外，使用对ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6特异性的单克隆抗体从新鲜分离的CLL细胞裂解物产生的免疫沉淀中，通过免疫印迹分析各自含有可检测的ROR1(图11B)。荧光共聚焦显微镜显示，用外源性Wnt5a处理的培养的CLL细胞中，ROR1和ROR2与ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6共定位(图4a-c)。然而，用UC-961处理抑制了Wnt5a诱导这些GEF中的任何一个募集至ROR1或ROR2的能力(图12A)。

我们发现用Wnt5a处理增加了用对ARHGEF1或ARHGEF2特异性的单克隆抗体产生的免疫沉淀的RhoA的体外交换活性，但不增加用对ARHGEF6特异性的单克隆抗体产生的免疫沉淀的RhoA的体外交换活性。此外，用Wnt5a处理增加了用对ARHGEF2或ARHGEF6特异性的单克隆抗体产生的免疫沉淀的Rac1的体外交换活性，但不增加用对ARHGEF1特异性的单克隆抗体产生的免疫沉淀的Rac1的体外交换活性(图4D和12B)。用UC-961处理抑制Wnt5a分别通过抗-ARHGEF1或抗-ARHGEF2产生的免疫沉淀诱导活化RhoA或通过抗-ARHGEF2或抗-ARHGEF6的免疫沉淀诱导活化Racl的能力(图4e)。

Wnt5a在用对ARHGEF1或ARHGEF2特异性的siRNA转染的CLL细胞中活化RhoA的效果差于在用对照siRNA转染的CLL细胞中的效果(图4F和12C)。另一方面，Wnt5a在用对ARHGEF2或ARHGEF6特异性的siRNA转染的CLL细胞中活化Rac1的效果较差(图4F和12C)。然而，ARHGEF1或ARHGEF6分别沉默的CLL细胞不具有受损的Wnt5a诱导的Rac1或RhoA的活化(图12D)，表明ARHGEF1和ARHGEF2或ARHGEF2和ARHGEF6分别是最佳的Wnt5a诱导的RhoA或Rac1的活化所需的。

实施例5：ROR1的功能域图谱

MEC1细胞衍生自CLL，并已被用作这种白血病的细胞模型[30]。然而，我们发现MEC1细胞缺乏ROR1，但确实表达ROR2(图13A)。用编码全长ROR1的载体或各种截短形式的ROR1(缺乏独特结构域)的载体稳定转染MEC1，使得我们能够产生表达高水平表面ROR1的MEC1，其可通过使用4A5单克隆抗体的流式细胞术检测(图13A)。ROR1或ROR1的各种截短形式中的任一的表达不改变表面ROR2的表达水平(图13A)。

因为MEC1细胞表达高水平的Wnt5a(图13B)[41]，所以我们评估了用来表达ROR1的MEC1细胞中的组成性ROR1-ROR2偶联。除了用缺少细胞外KNG结构域的MEC1-ΔKNG转染的MEC1外，我们在每种转染子中检测到ROR2与ROR1的偶联(图5A和图14A)。荧光共聚焦显微镜显示在MECH1-ROR1细胞中，ROR1和ROR2与ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6共定位(图5b)。然而，我们没有在表达任一截短形式的ROR1的MEC1细胞中观察到共定位或具有任一GEF的ROR1-ROR2(图14B-14C)。MEC1-ROR1细胞的活化Rac1和RhoA的水平也高于MEC1(图5c)；这种增强的活化可通过用UC-961或Wnt5a的中和抗体处理来抑制(图5d)。然而，用各种截短形式的ROR1中的任一转染的MEC1细胞不具有比亲本MEC1细胞更高水平的活化的Rac1或RhoA。

我们比较MEC1与用各种ROR1构建体转染的MEC1细胞的生长。MEC1-ROR1细胞比亲本MEC1细胞或用任一截短形式的ROR1转染的MEC1细胞生长得更快(图5e)。用Wnt5a的中和抗体或UC-961处理可抑制MEC1-ROR1细胞的生长(图5f)。此外，MEC1-ROR1在应答于CCL21时的迁移显著优于MEC1细胞或表达任何截短形式的ROR1的MEC1(图5g)。用Wnt5a的中和抗体或UC-961的处理可抑制MEC1-ROR1细胞应答于CCL21的迁移(图5h)。总的来说，这些数据支持Wnt5a-诱导ROR1与ROR2共定位的模型，其一起募集负责Wnt5a诱导的RhoA和Rac1活化的GEF(图5i)。

实施例6：UC-961单抗抑制体内CLL的进展

先前的研究表明，MEC1细胞可移植入免疫缺陷小鼠[46]。在静脉内输注相同数量的MEC1或MEC1-ROR1细胞三周后，移植MEC1-ROR1细胞的Rag2^-/-γ_c ^-/-小鼠与输注MEC1的同窝小鼠相比，具有显著更大的脾脏肿大和CD19⁺人白血病的骨髓侵犯(图6a、b)。然而，用UC-961处理显著抑制了MEC1-ROR1的移植(图6c-e)。此外，用UC-961处理的小鼠收获的MEC1-ROR1细胞已经失去或减弱了它们的ROR1的表达(图6d)。

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IV.实施方案

这里考虑的实施方案包括以下内容

实施方案P1.一种鉴定破坏ROR1和ROR2偶联的试剂的方法，包括：a.使共表达ROR1和ROR2的CLL细胞与Wnt5a接触；b.使所述CLL细胞与所述试剂或对照接触；以及c.确定ROR1和ROR2偶联的存在或不存在，其中与对照细胞相比，在试剂接触的细胞中不存在ROR1和ROR2偶联，这表明ROR1和ROR2偶联的破坏，由此鉴定破坏ROR1和ROR2偶联的试剂。

实施方案P2.实施方案P1的方法，其中所述试剂是抗体、肽、小分子或siRNA。

实施方案P3.实施方案P1或P2的方法，其中所述试剂是抗体。

实施方案P4.实施方案P1-P3任一项的方法，其中所述抗体是UC-961。

实施方案P5.实施方案P1-P4任一项的方法，其中所述试剂是siRNA。

实施方案P6.实施方案P5的方法，其中所述siRNA特异性针对ROR1或ROR2。

实施方案P7.实施方案P1-P6任一项的方法，其中通过测量ROR1和ROR2的共定位或通过抑制Wnt5a活性来测定ROR1和ROR2偶联的存在或不存在。

实施方案P8.实施方案P7的方法，其中使用荧光测定法来测定所述ROR1和ROR2的共定位或通过抑制Wnt5a活性。

实施方案P9.实施方案P8的方法，其中荧光测定法选自由以下组成的组：荧光共聚焦显微镜、荧光共振能量转移(FRET)、ELISA、FACS、质谱和基于细胞的测定。

实施方案P10.实施方案P7的方法，其中与对照细胞相比，所述试剂接触的细胞中RhoA和RAC1活性的降低或缺乏表明Wnt5a活性的抑制。

实施方案P11.实施方案P7的方法，其中与对照细胞相比，所述试剂接触的细胞中ARHGEF1、ARHGEF2和/或ARHGEF6表达的减少或缺乏表明Wnt5a活性的抑制。

实施方案P12.实施方案P1-P11中任一项的方法，其中所述CLL细胞是MEC1细胞。

实施方案P13.一种分离的抗体，其抑制ROR1和ROR2偶联。

实施方案P14.实施方案P13的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。

实施方案P15.实施方案P13的抗体，其中所述抗体抑制Wnt5a活性。

实施方案P16.实施方案P15的抗体，其中通过抑制RhoA和/或Rac1活性来表明Wnt5a活性的抑制。

实施方案P17.实施方案P15的抗体，其中通过ARHGEF1、ARHGEF2和/或ARHGEF6募集的减少或缺乏来表明Wnt5a活性的抑制。

实施方案P18.实施方案P13的抗体，其中所述抗体阻断ROR1的KNG结构域与ROR2的偶联。

实施方案P19.治疗CLL的方法包括向对此有需要的对象施用破坏ROR1和ROR2偶联的试剂。

本文考虑的进一步实施方案包括以下内容

实施方案1.鉴定ROR1-ROR2结合的抑制剂的方法，所述方法包括：(i)在反应容器中将测试剂与ROR1蛋白和ROR2蛋白组合；和(ii)检测所述ROR1蛋白与所述ROR2蛋白的结合相对于标准对照的降低，由此鉴定ROR1-ROR2结合的抑制剂。

实施方案2.实施方案1的方法，其中所述检测包括在所述测试剂存在的情况下，检测与所述ROR2蛋白结合的所述ROR1蛋白的水平，其中所述与所述ROR2蛋白结合的ROR1蛋白的水平相对于标准对照的降低表明所述测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。

实施方案3.实施方案1的方法，其中所述检测包括在所述测试剂存在的情况下，检测未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平，其中未结合的ROR1蛋白水平相对于标准对照的升高或未结合的ROR2蛋白水平相对于标准对照的升高表明所述测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。

实施方案4.实施方案1-3中任一项的方法，其中所述ROR1蛋白和所述ROR2蛋白包括可检测部分。

实施方案5.实施方案1的方法，其中所述检测包括在所述测试剂存在的情况下，检测鸟嘌呤交换因子(GEF)或鸟苷三磷酸酶(GTP酶)的水平，其中所述GEF水平相对于标准对照的降低表明所述测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。

实施方案6.实施方案5的方法，其中所述GEF是ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6。

实施方案7.实施方案5的方法，其中所述GTP酶是RhoA或Rac1。

实施方案8.实施方案5-7中任一项的方法，其中所述GEF或GTP酶包含可检测部分。

实施方案9.实施方案1-8中任一项的方法，其中所述组合在Wnt5a蛋白存在的情况下发生。

实施方案10.实施方案1-9中任一项的方法，其中所述反应容器是包含固体支持物的柱。

实施方案11.实施方案1-9中任一项的方法，其中所述反应容器包含细胞。

实施方案12.实施方案11的方法，其中所述ROR1蛋白和所述ROR2蛋白在所述细胞的表面上表达。

实施方案13.实施方案11或12的方法，其中所述细胞是癌细胞。

实施方案14.实施方案13的方法，其中所述癌细胞是慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞。

实施方案15.实施方案14的方法，其中所述CLL细胞是MEC1细胞。

实施方案16.实施方案11-14中任一项的方法，其中所述细胞形成体外细胞培养物的一部分。

实施方案17.实施方案11-16中任一项的方法，其中所述细胞形成生物体的一部分。

实施方案18.实施方案17的方法，其中所述生物体是哺乳动物。

实施方案19.实施方案17的方法，其中所述生物体是小鼠。

实施方案20.实施方案1-19中任一项的方法，其中所述测试剂是抗体、小分子、肽、蛋白质或核酸。

实施方案21.实施方案1-17中任一项的方法，其中所述测试剂是抗体。

实施方案22.实施方案17或18的方法，其中所述抗体是抗ROR1抗体。

实施方案23.实施方案17或18的方法，其中所述抗体是抗ROR2抗体。

实施方案24.实施方案17-20中任一项的方法，其中所述抗体结合ROR1蛋白或ROR2蛋白。

实施方案25.实施方案21的方法，其中所述抗体结合KNG结构域。

实施方案26.实施方案17-22中任一项的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

实施方案27.实施方案17-22中任一项的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。

实施方案28.实施方案17-22中任一项的方法，其中所述抗体是scFv。

实施方案29.通过实施方案1-22中任一项的方法鉴定的抗体。

实施方案30.抑制ROR1-ROR2相互作用的方法，所述方法包括：(i)使通过实施方案1-22中任一项的方法鉴定的化合物与ROR1-ROR2复合物接触，其中所述复合物包含ROR1蛋白和ROR2蛋白；并且(ii)使所述化合物抑制所述ROR1蛋白与所述ROR2蛋白之间的相互作用，由此抑制ROR1-ROR2相互作用。

实施方案31.在对其有需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的通过实施方案1-22中任一项的方法鉴定的抗体、小分子、肽或核酸。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

<120> ROR1-ROR2结合的调节剂

<130> 48537-558001WO

<150> US 62/152,424

<151> 2015-04-24

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

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<211> 20

<212> DNA

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<212> DNA

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Ile Leu Gln

770

Claims

1.鉴定ROR1-ROR2结合的抑制剂的方法，所述方法包括：

(i)将测试剂与ROR1蛋白和ROR2蛋白组合于反应容器中；和

(ii)检测所述ROR1蛋白与所述ROR2蛋白的结合相对于标准对照的降低，由此鉴定ROR1-ROR2结合的抑制剂。

2.权利要求1的方法，其中所述检测包括在所述测试剂存在下，检测与所述ROR2蛋白结合的所述ROR1蛋白的水平，其中与所述ROR2蛋白结合的所述ROR1蛋白的水平相对于标准对照的降低表明所述测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。

3.权利要求1的方法，其中所述检测包括在所述测试剂存在下，检测未结合的ROR1蛋白或未结合的ROR2蛋白的水平，其中未结合的ROR1蛋白水平相对于标准对照的升高或未结合的ROR2蛋白水平相对于标准对照的升高表明所述测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述ROR1蛋白和所述ROR2蛋白包括可检测部分。

5.权利要求1的方法，其中所述检测包括在所述测试剂存在下，检测鸟嘌呤交换因子(GEF)蛋白活性或鸟苷三磷酸酶(GTP酶)蛋白活性的水平，其中所述GEF蛋白活性的水平或GTP酶蛋白活性的水平相对于标准对照的降低表明所述测试剂是ROR1-ROR2结合的抑制剂。

6.权利要求5的方法，其中所述GEF蛋白是ARHGEF1、ARHGEF2或ARHGEF6。

7.权利要求5的方法，其中所述GTP酶蛋白是RhoA或Rac1。

8.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述GEF蛋白或GTP酶蛋白包括可检测部分。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述组合在Wnt5a蛋白存在下发生。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述反应容器是包括固体支持物的柱。

11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述反应容器包括细胞。

12.权利要求11的方法，其中所述ROR1蛋白和所述ROR2蛋白表达于所述细胞的表面上。

13.权利要求11或12的方法，其中所述细胞是癌细胞。

14.权利要求13的方法，其中所述癌细胞是慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述CLL细胞是MEC1细胞。

16.权利要求11-14中任一项的方法，其中所述细胞形成体外细胞培养物的一部分。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述测试剂是抗体、小分子、肽、蛋白质或核酸。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述测试剂是抗体。

19.权利要求17或18的方法，其中所述抗体是抗ROR1抗体。

20.权利要求17或18的方法，其中所述抗体是抗ROR2抗体。

21.权利要求17-20中任一项的方法，其中所述抗体结合ROR1蛋白或ROR2蛋白。

22.权利要求21的方法，其中所述抗体结合KNG结构域。

23.权利要求17-22中任一项的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

24.权利要求17-22中任一项的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。

25.权利要求17-22中任一项的方法，其中所述抗体是scFv。