CN111378040A

CN111378040A - 检测多种恶性肿瘤细胞的抗体及其应用

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Publication number: CN111378040A
Application number: CN201910015053.3A
Authority: CN
Inventors: 张素平; 汤姆·科佩斯; 吴柳风
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2039-01-08
Also published as: CN111378040B

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗ROR2抗体及其应用。该ROR2抗体具有CSASSSVSYMHWYQ、IYDTSKLAS和CQQWSSNPPTFGAG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTITSYLMHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；或者具有CKASQNVGTNVAWFQ、IYLASYRYS和CQQYNSYPLTFGGG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTFTNYWIQWM、LEWIGEINPSNGRTDYNEKFKNRAT和CANYRPGYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区等。

Description

检测多种恶性肿瘤细胞的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及检测多种肿瘤细胞的抗体及其应用，具体涉及一种抗ROR2抗体及其应用。

背景技术

酪氨酸激酶孤儿样受体ROR2是重要的发育相关调节蛋白，在胚胎发育早期，多种组织中均有较高的表达和对组织的增值，分化等具有重要的作用。妊娠中期后，ROR2的表达水平逐渐下降。除了在部分成骨细胞和子宫细胞之外，ROR2在成人组织中基本不表达。而目前研究表明，ROR2在许多肿瘤组织中高表达，包括骨肉瘤，黑色素瘤，结直肠癌和胃癌，乳腺癌，淋巴瘤，白血病等癌症。因此，许多学者认为ROR2是个疾病相关的基因，且可以作为理想的药物靶点。

ROR2是一个在胚胎发育过程中大量表达并起重要作用的一个酪氨酸激酶孤儿受体，而在成体大多数的组织中很难检测到，最近几年的研究发现，虽然大多数正常组织不表达ROR2，但是许多恶性肿瘤细胞包括乳腺癌，肺癌，胰腺癌等细胞却高表达ROR2；并且，ROR2表达水平越高的癌细胞，其恶性程度越高，越容易发生转移，复发，预后越差。ROR2通常在分化程度很低的肿瘤细胞上可以检测到，这类肿瘤细胞具有很强的复发和转移能力。

然而针对ROR2的药物研发还有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种抗ROR2抗体及其应用。

本发明是基于发明人的如下研究所发现的：在肿瘤的研究过程中，作为肿瘤干细胞的表面标记物，例如CD133,CD44,CD24,ALDH1等，无论在肿瘤细胞还是在正常的成体组织中都有表达，致使针对这些表面分子开发的抗肿瘤干细胞的药物对正常组织也会造成一定的毒害。而ROR2在肿瘤干细胞也有丰富的表达，但是在正常细胞中却表达较少，因此开发出针对ROR2的治疗性抗体对正常组织的伤害会比较小。所以，ROR2是理想的药物靶点。而针对ROR2所开发出的药物可以用于肿瘤和癌症的治疗中，且对正常组织的损害会比较小。

为此，本发明的发明人通过研究开发了针对ROR2抗原的特异性抗体，利用本申请所提供的抗体能够高特异性的与ROR2抗原结合，从而应用于肿瘤的靶向治疗以及ROR2抗原的特异性诊断和检测。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种抗ROR2抗体或抗原结合片段，包括下列至少之一：(1)具有CSASSSVSYMHWYQ、IYDTSKLAS和CQQWSSNPPTFGAG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTITSYLMHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；(2)具有CKASQNVGTNVAWFQ、IYLASYRYS和CQQYNSYPLTFGGG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTFTNYWIQWM、LEWIGEINPSNGRTDYNEKFKNRAT和CANYRPGYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；(3)具有CSASSSISYMYWYQ、IYDTSILAS和CQQWSSYPFTFGSG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTFTSYLIHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；与(1)～(3)相比，具有至少一个保守氨基酸取代的氨基酸序列。本文提供的抗体或抗原结合片段与ROR2抗原具有高亲和力，在0.0001μg/ml的浓度下，即表现出亲和性，可以用于多种和ROR2抗原相关的检测。而且，能够应用于肿瘤的治疗中，发挥靶向治疗作用。

根据本发明的实施例，以上所述的抗体或抗原结合片段可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段，包括下列至少之一：(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区；(b)具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区；(c)具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链可变区；与(a)～(c)相比，具有至少一个保守氨基酸取代的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段，包括下列至少之一：具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链；具有SEQ IDNO:9所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链；具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的重链。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面任一实施例所述的抗体或抗原结合片段。

根据本发明的实施例，所述多核苷酸包括下列至少之一：

具有SEQ ID NO:13所示的轻链可变区核苷酸序列和SEQ ID NO:14所示的重链可变区核苷酸序列；

具有SEQ ID NO:15所示的轻链可变区核苷酸序列和SEQ ID NO:16所示的重链可变区核苷酸序列；

具有SEQ ID NO:17所示的轻链可变区核苷酸序列和SEQ ID NO:18所示的重链可变区核苷酸序列；

具有SEQ ID NO:19所示的轻链核苷酸序列和SEQ ID NO:20所示的重链核苷酸序列；

具有SEQ ID NO:21所示的轻链核苷酸序列和SEQ ID NO:22所示的重链核苷酸序列；

具有SEQ ID NO:23所示的轻链核苷酸序列和SEQ ID NO:24所示的重链核苷酸序列；

与所述任一轻链可变区核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列，任选具有95％以上同源性的序列，优选为具有98％以上同源性的序列，更优选为具有99％以上同源性的序列；

与所述任一的重链可变区核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列，任选具有95％以上同源性的序列，优选为具有98％以上同源性的序列，更优选为具有99％以上同源性的序列；

与上述任一轻链核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列，任选具有95％以上同源性的序列，优选为具有98％以上同源性的序列，更优选为具有99％以上同源性的序列；

与上述任一重链核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列，任选具有95％以上同源性的序列，优选为具有98％以上同源性的序列，更优选为具有99％以上同源性的序列。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，包含本发明第二方面任一实施例所述的多核苷酸。

在本发明的一些实施例中，以上所述表达载体进一步包括：控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操作地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。

在本发明的一些实施例中，所述控制元件包括下列至少之一：启动子、增强子和终止子。

在本发明的一些实施例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，包含本发明第三方面任一实施例所述的表达载体。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种制备抗ROR2抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养本发明第四方面所述的重组细胞。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症，所述抗体或抗原结合片段为本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段。

根据本发明的第七方面，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于ROR2抗原的诊断检测，所述抗体或抗原结合片段为本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段。

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒用于免疫印迹、免疫沉淀、ELISA检测。

根据本发明的第八方面，本发明提供了一种药物组合物，包括：本发明第一方面任一实施例所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。

根据本发明的第九方面，本发明提供了一种抗ROR2的嵌合抗原受体，包括：胞外区、跨膜区和胞内区，所述胞外区包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为单链，所述抗体或抗原结合片段为本发明第一方面任一实施例所述的抗体或抗原结合片段。

根据本发明的第十方面，本发明提供了一种Car-T细胞，所述Car-T细胞表达本发明第九方面所述的抗ROR2的嵌合抗原受体。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的不同浓度的A12，B22，B30的Fab抗体的ELISA检测结果图。

图2是根据本发明的实施例提供的不同抗体的SDS-PAGE鉴定结果图。

图3是根据本发明的实施例提供的不同浓度的嵌合抗体的ELISA检测结果图。

图4是根据本发明的实施例提供的T47D细胞和231细胞中ROR2表达情况的SDS-PAGE鉴定结果图。

图5是根据本发明的实施例提供的不同嵌合抗体检测T47D细胞中ROR2的流式细胞测定结果图。

图6是根据本发明的实施例提供的不同嵌合抗体检测231细胞中ROR2的流式细胞测定结果图。

图7是根据本发明的实施例提供的利用A12嵌合抗体检测血液癌症病人ROR2表达情况的流式测定结果。

图8是根据本发明的实施例提供的利用A12嵌合抗体检测淋巴瘤病人组织ROR2表达情况的流式测定结果。

图9是根据本发明的实施例提供的利用不同嵌合抗体进行的免疫印迹测定结果图。

图10是根据本发明的实施例提供的不同嵌合抗体用于内源性ROR2蛋白检测的免疫沉淀测定结果图。

图11是根据本发明的实施例提供的不同嵌合抗体用于外源性ROR2蛋白检测的免疫沉淀测定结果图。

图12是根据本发明的实施例提供的A12-car结构图。

图13是根据本发明的实施例提供的能够表达CAR-T的淋巴细胞的比例的流式细胞测定结果图。

图14是根据本发明的实施例提供的A12-Car-T对ROR2表达阳性T47D细胞和ROR2表达阴性231细胞的杀伤结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。

抗体

本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。

在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。

本发明利用ROR2胞外段，通过免疫获得了高特异性的高亲和力的抗ROR2的Fab(antigen-binding fragment)抗体片段。利用该抗体片段能够与ROR2抗原特异性结合，从而可以靶向性治疗肿瘤等疾病。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或者抗原结合片段，所述抗体或者抗原结合片段具有CSASSSVSYMHWYQ、IYDTSKLAS和CQQWSSNPPTFGAG所示的轻链可变区，以及具有YTITSYLMHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示的重链可变区。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段分别具有CKASQNVGTNVAWFQ、IYLASYRYS和CQQYNSYPLTFGGG所示的轻链可变区，以及具有YTFTNYWIQWM、LEWIGEINPSNGRTDYNEKFKNRAT和CANYRPGYWGQG所示的重链可变区。在又一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段分别具有CSASSSISYMYWYQ、IYDTSILAS和CQQWSSYPFTFGSG所示的轻链可变区，以及YTFTSYLIHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示的重链可变区。以CSASSSVSYMHWYQ为例，其作为轻链可变区上的CDR区，能够高度特异性和抗原结合。具有上述CDR区的抗体或者抗原结合片段，能够特异性结合ROR2抗原，发挥ROR2抗体的功能。

在另一些实施方案中，本发明所提供的抗体或者抗原结合片段与上述任一轻链可变区和重链可变区相比，具有一个以上保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原(ROR2)能力的抗体片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏ROR2抗体或者与ROR2抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区序列和SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:3所示的轻链可变区序列和SEQ ID NO:4所示的重链可变区序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:5所示的轻链可变区序列和SEQ ID NO:6所示的重链可变区序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。

当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或者抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。

其中，具有SEQ ID NO:1所示轻链可变区序列和SEQ ID NO:2所示重链可变区序列的抗体也称为A12抗体，其轻链可变区序列VL(SEQ ID NO：1)为：

DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYCQQWSSNPPTFGAGTKLELK；

其重链可变区序列VH(SEQ ID NO:2)为：

QVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKAAGYTITSYLMHWVKQRPGQDLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSDVYYGVRFAYWGQGTLVTVS。

其中，具有SEQ ID NO:3所示轻链可变区序列和SEQ ID NO:4所示重链可变区序列的抗体也称为B22抗体，其轻链可变区序列VL(SEQ ID NO:3)为：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKPLIYLASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTNLEIKR；

其中，B22抗体的重链可变区序列VH(SEQ ID NO:4)为：

QVQLQQPGAALVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWIQWMKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTDYNEKFKNRATLTVDNSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCANYRPGYWGQGTSVTVSS。

其中，具有SEQ ID NO:5所示轻链可变区序列和SEQ ID NO:6所示重链可变区序列的抗体也称为B30抗体，其轻链可变区序列VL(SEQ ID NO:5)为：

DIVLTQSPVIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSILASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPFTFGSGTKLEIK；

其中，B30抗体的重链可变区序列VH(SEQ ID NO:6)

QVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKAAGYTFTSYLIHWVKQRPGQDLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSDVYYGVRFAYWGQGTLVTVSA。

在一些优选方案中，本发明提供了一种抗ROR2抗体，该抗体具有SEQ ID NO:7所示的轻链和SEQID NO:8所示的重链。

其中SEQ ID NO:7为：

DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYCQQWSSNPPTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；

SEQ ID NO:8为：

QVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKAAGYTITSYLMHWVKQRPGQDLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSDVYYGVRFAYWGQGTLVTVSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

在一些优选方案中，本发明提供了一种抗ROR2抗体，该抗体具有SEQ ID NO:9所示的轻链和SEQ ID NO:10所示的重链。

其中SEQ ID NO:9为：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKPLIYLASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

SEQ ID NO:10为：

QVQLQQPGAALVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWIQWMKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTDYNEKFKNRATLTVDNSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCANYRPGYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

在一些优选方案中，本发明提供了一种抗ROR2抗体，该抗体具有SEQ ID NO:11所示的轻链和SEQ ID NO:12所示的重链。

其中SEQ ID NO:11为：

DIVLTQSPVIMSASPGEKVTMTCSASSSISYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSILASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

SEQ ID NO:12为：

QVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKAAGYTFTSYLIHWVKQRPGQDLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSDVYYGVRFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

多核苷酸、表达载体、重组细胞

在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的多核苷酸，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。

为此，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码上述所述的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸分别编码A12抗体、B22抗体和B30抗体。

其中编码A12抗体的轻链可变区SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ ID NO:13)：

Gacatcgtgctgacccagtctccagccatcatgtctgctagccctggcgagaaagtgacaatgacctgctccgcctcctcctccgtgtcctacatgcactggtatcagcagaagtccggcacctctcctaagcggtggatctacgacacctccaagctggctagcggagtgcctgccagattttccggctctggctctggcacctcttactccctgaccatctcctccatggaagccgaggatgccgccatctactactgccagcagtggtctagcaaccctcctacctttggcgctggcaccaagctggaactgaag。

编码A12抗体的重链可变区SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:14)：

Caggttcagctgcagcagtctggacctgagctggttaagcctggtgcctccgtccggatgtcttgcaaggctgctggctacaccatcaccagctacctgatgcactgggtcaagcagaggccaggccaggacttggagtggatcggctacatcaacccctacaacgacggcaccaagtacaacgagaagttcaaggacaaggctaccctgacctccgacaagtcctcctccaccgcctacatggaactgtccagcctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccagatccgatgtgtactatggcgtcagattcgcctactggggccagggcacactggtcacagtttct。

其中编码B22抗体的轻链可变区SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ ID NO:15)：

编码B22抗体的重链可变区SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:16)：

Caggttcagttgcagcaacctggcgctgctctggttaagcctggcgcttctgtgaagctgtcctgcaaggcttccggctacaccttcaccaactattggatccagtggatgaagcagcggccaggccaaggcctggaatggatcggagagatcaacccttctaacggccggaccgactacaacgagaagttcaagaaccgggctaccctgaccgtggacaactcttctaccaccgcctacatgcagctgtccagcctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccaactacagacctggctattggggccagggcacctctgtgacagtctcttct。

其中编码B30抗体的轻链可变区SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ ID NO:17)：

Gacatcgtgatgacccagagccagaaattcatgtccacctccgtgggcgacagagtgtccgtgacatgcaaggcctctcagaacgtgggcaccaacgtggcctggttccagcagaaacctggccagtctcctaagcctctgatctacctggcctcctaccggtactctggcgtgcccgatagattcaccggctctggatctggcaccgacttcaccctgaccatctccaacgtgcagtctgaggacctggccgagtacttctgccagcagtacaacagctaccctctgacctttggcggaggcaccaacctggaaatcaag。

编码B30抗体的重链可变区SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:18)：

Caggttcagctgcagcagtctggacctgagctggttaagcctggtgcctccgtccggatgtcttgcaaggctgccggctacaccttcaccagctacctgatccactgggtcaagcagaggccaggccaggacttggagtggatcggctacatcaacccctacaacgacggcaccaagtacaacgagaagttcaaggacaaggctaccctgacctccgacaagtcctcctccaccgcctacatggaactgtccagcctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccagatccgatgtgtactatggcgtcagattcgcctactggggccagggcacactggtcacagtttctgct。

其中编码A12抗体的轻链SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:19)

Gacatcgtgctgacccagtctccagccatcatgtctgctagccctggcgagaaagtgacaatgacctgctccgcctcctcctccgtgtcctacatgcactggtatcagcagaagtccggcacctctcctaagcggtggatctacgacacctccaagctggctagcggagtgcctgccagattttccggctctggctctggcacctcttactccctgaccatctcctccatggaagccgaggatgccgccatctactactgccagcagtggtctagcaaccctcctacctttggcgctggcaccaagctggaactgaagagaacagtggccgctcctagcgtgttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtctggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaatagccaagagagcgtgaccgagcaggacagcaaggactctacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaagtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctttctagccctgtgaccaagagcttcaaccggggcgaatgt；

其中编码A12抗体的重链SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:20)

Caggttcagctgcagcagtctggacctgagctggttaagcctggtgcctccgtccggatgtcttgcaaggctgctggctacaccatcaccagctacctgatgcactgggtcaagcagaggccaggccaggacttggagtggatcggctacatcaacccctacaacgacggcaccaagtacaacgagaagttcaaggacaaggctaccctgacctccgacaagtcctcctccaccgcctacatggaactgtccagcctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccagatccgatgtgtactatggcgtcagattcgcctactggggccagggcacactggtcacagtttctgcctctacaaagggccctagtgtgttccctctggctcccagcagcaagtctacatctggcggaacagccgctctgggctgcctggtcaaggattactttcccgagcctgtgaccgtgtcctggaatagcggagcactgacaagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcaaagcagcggcctgtactctctgagcagcgtggtcacagtgcctagctctagcctgggcacccagacctacatctgcaatgtgaaccacaagcctagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccaagcagggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtccagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgtctcctggcaaa。

其中编码B22抗体的轻链SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:21)

Gacatcgtgatgacccagagccagaaattcatgtccacctccgtgggcgacagagtgtccgtgacatgcaaggcctctcagaacgtgggcaccaacgtggcctggttccagcagaaacctggccagtctcctaagcctctgatctacctggcctcctaccggtactctggcgtgcccgatagattcaccggctctggatctggcaccgacttcaccctgaccatctccaacgtgcagtctgaggacctggccgagtacttctgccagcagtacaacagctaccctctgacctttggcggaggcaccaacctggaaatcaagagaacagtggccgctcctagcgtgttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtctggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaatagccaagagagcgtgaccgagcaggacagcaaggactctacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaagtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctttctagccctgtgaccaagagcttcaaccggggcgaatgt。

其中编码B22抗体的重链SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:22)

Caggttcagttgcagcaacctggcgctgctctggttaagcctggcgcttctgtgaagctgtcctgcaaggcttccggctacaccttcaccaactattggatccagtggatgaagcagcggccaggccaaggcctggaatggatcggagagatcaacccttctaacggccggaccgactacaacgagaagttcaagaaccgggctaccctgaccgtggacaactcttctaccaccgcctacatgcagctgtccagcctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccaactacagacctggctattggggccagggcacctctgtgacagtctcttctgcctctacaaagggccctagtgtgttccctctggctcccagcagcaagtctacatctggcggaacagccgctctgggctgcctggtcaaggattactttcccgagcctgtgaccgtgtcctggaatagcggagcactgacaagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcaaagcagcggcctgtactctctgagcagcgtggtcacagtgcctagctctagcctgggcacccagacctacatctgcaatgtgaaccacaagcctagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccaagcagggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtccagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgtctcctggcaaa。

其中编码B30抗体的轻链SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:23)

Gacatcgtgctgacccagtctccagtgatcatgtccgcttctcccggcgagaaagtgacaatgacctgctccgcctcctccagcatctcctacatgtactggtatcagcagaagcccggctcctctcctcggctgctgatctacgatacctccatcctggcttccggcgtgccagtgcggttttctggttctggctctggcacctcctacagcctgaccatctccagaatggaagccgaggacgccgccacctactactgtcagcagtggtctagctaccccttcacctttggctccggcaccaagctggaaatcaagagaacagtggccgctcctagcgtgttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtctggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaatagccaagagagcgtgaccgagcaggacagcaaggactctacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaagtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctttctagccctgtgaccaagagcttcaaccggggcgaatgt。

其中编码B30抗体的重链SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ IDNO:24)：Caggttcagctgcagcagtctggacctgagctggttaagcctggtgcctccgtccggatgtcttgcaaggctgccggctacaccttcaccagctacctgatccactgggtcaagcagaggccaggccaggacttggagtggatcggctacatcaacccctacaacgacggcaccaagtacaacgagaagttcaaggacaaggctaccctgacctccgacaagtcctcctccaccgcctacatggaactgtccagcctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccagatccgatgtgtactatggcgtcagattcgcctactggggccagggcacactggtcacagtttctgctgcctctacaaagggccctagtgtgttccctctggctcccagcagcaagtctacatctggcggaacagccgctctgggctgcctggtcaaggattactttcccgagcctgtgaccgtgtcctggaatagcggagcactgacaagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcaaagcagcggcctgtactctctgagcagcgtggtcacagtgcctagctctagcctgggcacccagacctacatctgcaatgtgaaccacaagcctagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccaagcagggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtccagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgtctcctggcaaa。

在又一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与上述编码氨基酸的序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的多核苷酸。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。这些控制元件可以是启动子、增强子或者终止子等，只要能够调控基因的表达即可。而多核苷酸与控制元件只需可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如pcDNA质粒。

本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞(如293F细胞，CHO细胞等)中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。

药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体或者抗原结合片段和药学可接受的载体。

本文提供的抗ROR2抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗ROR2抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。

当然，本文中的抗ROR2抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述ROR2抗体。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用ROR2抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗ROR2抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗ROR2抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括ROR2相关疾病，例如各种癌症等等。当然本文提供的抗体也可以用于癌症的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。

这些癌症或者肿瘤可以是任何不受调控的细胞生长。具体地，可以是肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、淋巴癌、血癌等等。

在利用本发明所提供的抗ROR2抗体治疗癌症时，可以将本发明提供的抗ROR2抗体提供给受试者即可。为此，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的的抗体或其抗原结合片段。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本申请通过研究，开发了基于ROR2的抗多种肿瘤细胞甚至肿瘤干细胞的基于抗体的免疫治疗方法，包括ROR2的单克隆抗体，及新型的ROR2-Car T细胞治疗技术。

实施例1

我们利用ROR2蛋白，通过免疫小鼠，并借助于噬菌体文库技术，筛选得到B30、B22和A12抗体，这些抗体的ELISA检测如图1所示。其中图1中横坐标代表不同抗体的浓度，纵坐标代表所测定的OD450值。

对这些抗体样本进行氨基酸测序，其中一种抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，命名为A12抗体；一种抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，命名为B22抗体；一种抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，命名为B30抗体。

检测得到，A12抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:7，重链氨基酸序列为SEQ IDNO:8；B22抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:9，重链氨基酸序列为SEQ ID NO:10；B30抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:11，重链氨基酸序列为SEQ ID NO:12。

实施例2

(一)ROR2嵌合抗体的表达与纯化

分别利用A12抗体、B22抗体和B30抗体的可变区氨基酸序列推导出其DNA序列，并根据表达载体进行种属优化后建立嵌合抗体的表达序列，并克隆进pcDNA3.4载体内。

其中，经过优化后未改变抗体的氨基酸序列，仅仅进行了密码子优化，优化后的编码氨基酸序列的核苷酸序列更容易在哺乳动物细胞中表达。因此，例如当表述A12嵌合抗体时，其氨基酸序列与上述A12抗体氨基酸序列相同，差别在于编码A12嵌合抗体的核苷酸序列进行了优化。

具体地，编码A12嵌合抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:19，编码A12嵌合抗体的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:20；

编码B22嵌合抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:21，编码B22嵌合抗体的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:22；

编码B30嵌合抗体的轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:23，编码B22嵌合抗体的重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:24。

再将构建好的质粒用PEI转染到293F细胞中，进行表达48小时。48小时后，回收上清，用ProteinA柱子进行纯化和层析/浓缩。纯化后的蛋白用SDS-PAGE胶进行鉴定，结果如图2所示，图2是ROR2-B30(SA120-1)，B22(SA120-2)，A12(SA120-3)纯化抗体SDS-PAGE鉴定结果，结果显示我们纯化的抗体具有较高的纯度。

图2中，从左向右，第一、二、三列代表为上样量为2.0μg的非还原性A12、B22、B30抗体样本的SDS-PAGE胶鉴定结果，第四列代表蛋白marker，第五、六、七列代表上样量为2.0μg的还原性A12、B22、B30抗体样本的SDS-PAGE胶鉴定结果，第八、九、十列分别代表上样量为0.5，1.0，2μg的还原性胎牛血清蛋白(BSA)样本的SDS-PAGE胶结果。

从图2可以看出，SDS-PAGE胶中显示还原性和非还原性的A12、B22、B30嵌合抗体条带大小正确，条带灰度值接近2μg的还原性胎牛血清蛋白(BSA)样本，说明我们纯化的抗体具有较高的纯度。

(二)ELASA验证纯化的ROR2嵌合抗体的亲和力

96孔板中加入ROR2胞外段蛋白包被过夜，5％牛奶封闭后，将纯化好的抗体进行稀释成不同浓度加入不同孔中，进行ELASA检测。OD450如图3所示，图3是不同浓度的B30嵌合抗体，B22嵌合抗体和A12嵌合抗体的OD450值，可见当嵌合抗体浓度较低(0.001ug/ml或0.0001ug/ml)时，抗体就已经具有亲和力，同时也说明我们的嵌合抗体能用于ELISA，且具有较高的亲和力。

(三)流式细胞术检测抗体的结合能力

纯化得到的抗体进行流式染色，进行检测T47D细胞(ROR2表达阳性，见图4)和231乳腺癌细胞(ROR2表达阴性，见图4)。结果如下图所示。流式结果显示，三个嵌合抗体都能特异性结合ROR2膜蛋白。

其中图4为Santa Cruz公司ROR2抗体检测T47D细胞和231细胞的ROR2的表达水平。图5为三个嵌合抗体流式检测T47D的ROR2的表达水平的结果，其中三个嵌合抗体的浓度均为10ug/ml。图6为三个嵌合抗体流式检测231的ROR2的表达水平的结果，三个嵌合抗体浓度均为10ug/ml。

实施例3

(一)A12嵌合抗体能检测不同血液癌症病人和淋巴瘤PDX的ROR2水平

获取不同血液癌症的病人的外周血，利用Ficoll分离出血液中的淋巴细胞，然后加入A12嵌合抗体(浓度为3ug/ml)，孵育1小时，然后和Alexa-488结合的抗小鼠IgG二抗孵育，并进行流式分析，结果如图7。其中图7中，ALL对应结果代表急性淋巴细胞白血病病人样本的流式检测结果，AML对应结果代表急性髓细胞白血病病人样本的流式检测结果。

从医院取得淋巴瘤的病人组织，然后建立PDX模型。取PDX小鼠长出的肿瘤组织，用human dissociation kit将组织分离成单细胞，然后加入A12嵌合抗体(浓度为3μg/ml)，孵育1小时，然后Alexa-488结合的抗小鼠IgG二抗孵育，并进行流式分析，从而对肿瘤细胞的ROR2水平进行检查。结果如图8所示。图8左图显示的是淋巴瘤病人肿瘤细胞的ROR2荧光强度的峰图，右边两个散点图显示淋巴瘤病人肿瘤细胞空白管和B16抗体染色管的细胞荧光强度分布情况。

(二)ROR2嵌合抗体能应用于免疫印迹(WB)

将带有His标签的鼠源的ROR2胞外端(mouse ROR2ex)和人源的ROR2胞外端(humanROR2ex)质粒和空载GFP转染到ROR2敲除的293T细胞(293T-ROR2-KO)中，48小时后，裂解细胞，提取总蛋白，变性后，用SDS-PAGE胶分离蛋白并进行免疫印迹反应，用三个ROR2的嵌合抗体(5ug/ml)检测ROR2的表达。结果如图9所示，表明ROR2-B30嵌合抗体，B22嵌合抗体和A12嵌合抗体均能应用于免疫印迹检测，且只能识别人的ROR2蛋白的胞外端。

(三)ROR2嵌合抗体能应用于免疫沉淀(IP)

为了鉴定ROR2嵌合抗体能否用于免疫沉淀，我们用ROR2表达阳性的293T细胞进行IP。将细胞裂解后，分别用B30嵌合抗体，B22嵌合抗体和A12嵌合抗体进行IP，IP后的蛋白用Santa Cruz的ROR2(货号：sc-374174)抗体进行免疫印迹检测ROR2蛋白。其中，IgG抗体作为阴性对照抗体(不能将ROR2沉淀下来)，Input为未进行免疫沉淀的细胞裂解液样本(能够表达ROR2蛋白)。结果如图10，IP结果表明三个抗体均能用于IP，能用于检测内源性的ROR2。

为了进一步验证ROR2抗体是否能进行IP，我们给293T细胞转染带有Flag标签的pcDNA-ROR2-Flag质粒。Flag标签是由八个亲水氨基酸DYKDDDDK组成的多肽片段，能够与蛋白融合，而且不会占据蛋白表位或者结构域，避免影响蛋白的功能、分泌性以及转运等各方面性能，利用Flag标签标记目的蛋白，若标签有表达，目的蛋白也会有表达。然后分别用B30嵌合抗体，B22嵌合抗体，A12嵌合抗体和Flag进行IP，分别用Flag和B30嵌合抗体，B22嵌合抗体，A12嵌合抗体进行免疫印迹(IB)。结果如图11所示，结果显示不管是ROR2抗体还是Flag标记抗体进行IP，IB结果中都能检测到ROR2(130kD)条带。

从以上实验可以看出，通过利用免疫小鼠的脾脏构建噬菌体文库，筛选高亲和力的特异性识别ROR2的单克隆抗体。然后进行诊断功能的检测，验证了我们筛选获得的特异性识别ROR2的抗体，可以作为临床精确诊断肿瘤细胞做出帮助；为将来进入临床治疗ROR2阳性的肿瘤病人奠定基础。并且可以确定ROR2抗体影响的信号通路，为将来的临床试验中提供用来预测病人对药物的反应的生物标记(biomarker)。

实施例4

实验进一步验证了本发明提供的ROR2抗体，开发ROR2-Car T细胞治疗技术，用于疾病的靶向治疗。

1、ROR2-A12Car的构建

我们采用二代的Car序列，用筛选出来的具有高亲和力的抗ROR2的抗体A-12构建ROR2-Car。

2、A12car结构

A12CAR由CD8leader，A12scFv-VL，18氨基酸linker，A12scFv-VH，CD8铰链区，CD8跨膜区，4-1BB共刺激因子结构，CD3ζ链结构构成，如图12所示。

3、CAR-T能够结合ROR2

用终浓度2μg/ml的生物素化ROR2蛋白与A12-CAR-T细胞冰上共孵育30分钟，然后用带有PE荧光的亲和链霉素标记ROR2蛋白，冰上15分钟，用流式细胞术检测能够与ROR2蛋白结合的CAR-T的比例。流式结果如图13所示。图13中，左图为空白管散点图，右图为ROR2蛋白结合抗体染色散点图，结果显示有59.1％的淋巴细胞表达A12-CarT。

4、CAR-T体外杀伤靶细胞

将未转化的T细胞(NT)，转化空载的CD532A-T，和转化A12-CAR的CAR-A12-T细胞与两种靶细胞在96孔板中共培养。其中一种是表达ROR2的T-47D乳腺癌细胞系，一种是不表达ROR2的MDA-MB-231乳腺癌细胞系。每孔12000个靶细胞，120000个T细胞，E:T＝10:1，共培养12小时，然后用乳酸脱氢酶释放试验检测对靶细胞的杀伤情况。杀伤率根据公式％细胞毒性＝(实验组-效应细胞自发-靶细胞自发)/(靶细胞最大-靶细胞自发)x100计算。得出的杀伤率再以未转化的T细胞(NT)组对靶细胞的杀伤率为基准进行标准化。结果如图14所示，A12-Car-T能显著杀伤ROR2表达阳性的T47D细胞，但并不能杀伤ROR2表达阴性231细胞。

从以上实验可以看出，开发ROR2-Car T细胞治疗技术，用我们筛选出来的具有高亲和力的ROR2抗体，进一步开发Car-T细胞治疗技术，ROR2-Car T细胞治疗目前国内外没有任何报道。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 检测多种恶性肿瘤细胞的抗体及其应用

<130> PIDC3186451A

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A12轻链可变区

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A12重链可变区

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Leu Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asp Val Tyr Tyr Gly Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B22轻链可变区

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 4

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B22重链可变区

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gln Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 5

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B30轻链可变区

<400> 5

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B30重链可变区

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asp Val Tyr Tyr Gly Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 7

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A12轻链

<400> 7

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 8

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> A12重链

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Leu Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asp Val Tyr Tyr Gly Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 9

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B22轻链

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 10

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B22重链

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gln Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 11

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B30轻链

<400> 11

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 12

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> B30重链

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asp Val Tyr Tyr Gly Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 13

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A12轻链可变区编码序列

<400> 13

gacatcgtgc tgacccagtc tccagccatc atgtctgcta gccctggcga gaaagtgaca 60

atgacctgct ccgcctcctc ctccgtgtcc tacatgcact ggtatcagca gaagtccggc 120

acctctccta agcggtggat ctacgacacc tccaagctgg ctagcggagt gcctgccaga 180

ttttccggct ctggctctgg cacctcttac tccctgacca tctcctccat ggaagccgag 240

gatgccgcca tctactactg ccagcagtgg tctagcaacc ctcctacctt tggcgctggc 300

accaagctgg aactgaag 318

<210> 14

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A12重链可变区编码序列

<400> 14

caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggttaagc ctggtgcctc cgtccggatg 60

tcttgcaagg ctgctggcta caccatcacc agctacctga tgcactgggt caagcagagg 120

ccaggccagg acttggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 180

aacgagaagt tcaaggacaa ggctaccctg acctccgaca agtcctcctc caccgcctac 240

atggaactgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagatccgat 300

gtgtactatg gcgtcagatt cgcctactgg ggccagggca cactggtcac agtttct 357

<210> 15

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B22轻链可变区编码序列

<400> 15

gacatcgtgc tgacccagtc tccagccatc atgtctgcta gccctggcga gaaagtgaca 60

atgacctgct ccgcctcctc ctccgtgtcc tacatgcact ggtatcagca gaagtccggc 120

acctctccta agcggtggat ctacgacacc tccaagctgg ctagcggagt gcctgccaga 180

ttttccggct ctggctctgg cacctcttac tccctgacca tctcctccat ggaagccgag 240

gatgccgcca tctactactg ccagcagtgg tctagcaacc ctcctacctt tggcgctggc 300

accaagctgg aactgaag 318

<210> 16

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B22重链可变区编码序列

<400> 16

caggttcagt tgcagcaacc tggcgctgct ctggttaagc ctggcgcttc tgtgaagctg 60

tcctgcaagg cttccggcta caccttcacc aactattgga tccagtggat gaagcagcgg 120

ccaggccaag gcctggaatg gatcggagag atcaaccctt ctaacggccg gaccgactac 180

aacgagaagt tcaagaaccg ggctaccctg accgtggaca actcttctac caccgcctac 240

atgcagctgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgcgc caactacaga 300

cctggctatt ggggccaggg cacctctgtg acagtctctt ct 342

<210> 17

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B30轻链可变区编码序列

<400> 17

gacatcgtga tgacccagag ccagaaattc atgtccacct ccgtgggcga cagagtgtcc 60

gtgacatgca aggcctctca gaacgtgggc accaacgtgg cctggttcca gcagaaacct 120

ggccagtctc ctaagcctct gatctacctg gcctcctacc ggtactctgg cgtgcccgat 180

agattcaccg gctctggatc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccaa cgtgcagtct 240

gaggacctgg ccgagtactt ctgccagcag tacaacagct accctctgac ctttggcgga 300

ggcaccaacc tggaaatcaa g 321

<210> 18

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B30重链可变区编码序列

<400> 18

caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggttaagc ctggtgcctc cgtccggatg 60

tcttgcaagg ctgccggcta caccttcacc agctacctga tccactgggt caagcagagg 120

ccaggccagg acttggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 180

aacgagaagt tcaaggacaa ggctaccctg acctccgaca agtcctcctc caccgcctac 240

atggaactgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagatccgat 300

gtgtactatg gcgtcagatt cgcctactgg ggccagggca cactggtcac agtttctgct 360

<210> 19

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A12轻链编码序列

<400> 19

gacatcgtgc tgacccagtc tccagccatc atgtctgcta gccctggcga gaaagtgaca 60

atgacctgct ccgcctcctc ctccgtgtcc tacatgcact ggtatcagca gaagtccggc 120

acctctccta agcggtggat ctacgacacc tccaagctgg ctagcggagt gcctgccaga 180

ttttccggct ctggctctgg cacctcttac tccctgacca tctcctccat ggaagccgag 240

gatgccgcca tctactactg ccagcagtgg tctagcaacc ctcctacctt tggcgctggc 300

accaagctgg aactgaagag aacagtggcc gctcctagcg tgttcatctt cccaccttcc 360

gacgagcagc tgaagtctgg cacagcctct gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420

agagaagcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa tagccaagag 480

agcgtgaccg agcaggacag caaggactct acctacagcc tgagcagcac cctgacactg 540

agcaaggccg actacgagaa gcacaaagtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctt 600

tctagccctg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgaatgt 639

<210> 20

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A12重链编码序列

<400> 20

caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggttaagc ctggtgcctc cgtccggatg 60

tcttgcaagg ctgctggcta caccatcacc agctacctga tgcactgggt caagcagagg 120

ccaggccagg acttggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 180

aacgagaagt tcaaggacaa ggctaccctg acctccgaca agtcctcctc caccgcctac 240

atggaactgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagatccgat 300

gtgtactatg gcgtcagatt cgcctactgg ggccagggca cactggtcac agtttctgcc 360

tctacaaagg gccctagtgt gttccctctg gctcccagca gcaagtctac atctggcgga 420

acagccgctc tgggctgcct ggtcaaggat tactttcccg agcctgtgac cgtgtcctgg 480

aatagcggag cactgacaag cggcgtgcac acctttccag ctgtgctgca aagcagcggc 540

ctgtactctc tgagcagcgt ggtcacagtg cctagctcta gcctgggcac ccagacctac 600

atctgcaatg tgaaccacaa gcctagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag 660

agctgcgaca agacccacac ctgtcctcca tgtcctgctc cagaactgct cggcggacct 720

tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatcagcag aacccctgaa 780

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggatcccg aagtgaagtt caattggtac 840

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaacagc 900

acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 960

tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgctccta tcgagaaaac catcagcaag 1020

gccaagggcc agcctaggga accccaggtt tacacactgc ctccaagcag ggacgagctg 1080

accaagaatc aggtgtccct gacctgcctc gtgaagggct tctacccttc cgatatcgcc 1140

gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agacaacccc tcctgtgctg 1200

gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag tggacaagtc cagatggcag 1260

cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320

aagtccctga gcctgtctcc tggcaaa 1347

<210> 21

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B22轻链编码序列

<400> 21

gacatcgtga tgacccagag ccagaaattc atgtccacct ccgtgggcga cagagtgtcc 60

gtgacatgca aggcctctca gaacgtgggc accaacgtgg cctggttcca gcagaaacct 120

ggccagtctc ctaagcctct gatctacctg gcctcctacc ggtactctgg cgtgcccgat 180

agattcaccg gctctggatc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccaa cgtgcagtct 240

gaggacctgg ccgagtactt ctgccagcag tacaacagct accctctgac ctttggcgga 300

ggcaccaacc tggaaatcaa gagaacagtg gccgctccta gcgtgttcat cttcccacct 360

tccgacgagc agctgaagtc tggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420

cccagagaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caatagccaa 480

gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tctacctaca gcctgagcag caccctgaca 540

ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaaa gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600

ctttctagcc ctgtgaccaa gagcttcaac cggggcgaat gt 642

<210> 22

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B22重链编码序列

<400> 22

caggttcagt tgcagcaacc tggcgctgct ctggttaagc ctggcgcttc tgtgaagctg 60

tcctgcaagg cttccggcta caccttcacc aactattgga tccagtggat gaagcagcgg 120

ccaggccaag gcctggaatg gatcggagag atcaaccctt ctaacggccg gaccgactac 180

aacgagaagt tcaagaaccg ggctaccctg accgtggaca actcttctac caccgcctac 240

atgcagctgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgcgc caactacaga 300

cctggctatt ggggccaggg cacctctgtg acagtctctt ctgcctctac aaagggccct 360

agtgtgttcc ctctggctcc cagcagcaag tctacatctg gcggaacagc cgctctgggc 420

tgcctggtca aggattactt tcccgagcct gtgaccgtgt cctggaatag cggagcactg 480

acaagcggcg tgcacacctt tccagctgtg ctgcaaagca gcggcctgta ctctctgagc 540

agcgtggtca cagtgcctag ctctagcctg ggcacccaga cctacatctg caatgtgaac 600

cacaagccta gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc 660

cacacctgtc ctccatgtcc tgctccagaa ctgctcggcg gaccttccgt gttcctgttt 720

cctccaaagc ctaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ctgaagtgac ctgcgtggtg 780

gtggatgtgt cccacgagga tcccgaagtg aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 840

gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagtaca acagcaccta cagagtggtg 900

tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960

tccaacaagg ccctgcctgc tcctatcgag aaaaccatca gcaaggccaa gggccagcct 1020

agggaacccc aggtttacac actgcctcca agcagggacg agctgaccaa gaatcaggtg 1080

tccctgacct gcctcgtgaa gggcttctac ccttccgata tcgccgtgga atgggagagc 1140

aatggccagc ctgagaacaa ctacaagaca acccctcctg tgctggacag cgacggctca 1200

ttcttcctgt acagcaagct gacagtggac aagtccagat ggcagcaggg caacgtgttc 1260

agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg 1320

tctcctggca aa 1332

<210> 23

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B30轻链编码序列

<400> 23

gacatcgtgc tgacccagtc tccagtgatc atgtccgctt ctcccggcga gaaagtgaca 60

atgacctgct ccgcctcctc cagcatctcc tacatgtact ggtatcagca gaagcccggc 120

tcctctcctc ggctgctgat ctacgatacc tccatcctgg cttccggcgt gccagtgcgg 180

ttttctggtt ctggctctgg cacctcctac agcctgacca tctccagaat ggaagccgag 240

gacgccgcca cctactactg tcagcagtgg tctagctacc ccttcacctt tggctccggc 300

accaagctgg aaatcaagag aacagtggcc gctcctagcg tgttcatctt cccaccttcc 360

gacgagcagc tgaagtctgg cacagcctct gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420

agagaagcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa tagccaagag 480

agcgtgaccg agcaggacag caaggactct acctacagcc tgagcagcac cctgacactg 540

agcaaggccg actacgagaa gcacaaagtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctt 600

tctagccctg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgaatgt 639

<210> 24

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> B30重链编码序列

<400> 24

caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggttaagc ctggtgcctc cgtccggatg 60

tcttgcaagg ctgccggcta caccttcacc agctacctga tccactgggt caagcagagg 120

ccaggccagg acttggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 180

aacgagaagt tcaaggacaa ggctaccctg acctccgaca agtcctcctc caccgcctac 240

atggaactgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagatccgat 300

gtgtactatg gcgtcagatt cgcctactgg ggccagggca cactggtcac agtttctgct 360

gcctctacaa agggccctag tgtgttccct ctggctccca gcagcaagtc tacatctggc 420

ggaacagccg ctctgggctg cctggtcaag gattactttc ccgagcctgt gaccgtgtcc 480

tggaatagcg gagcactgac aagcggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcaaagcagc 540

ggcctgtact ctctgagcag cgtggtcaca gtgcctagct ctagcctggg cacccagacc 600

tacatctgca atgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaact gctcggcgga 720

ccttccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaacccct 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900

agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacacac tgcctccaag cagggacgag 1080

ctgaccaaga atcaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc ttccgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga cagtggacaa gtccagatgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgtc tcctggcaaa 1350

Claims

1.一种抗ROR2抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括下列至少之一：

(1)具有CSASSSVSYMHWYQ、IYDTSKLAS和CQQWSSNPPTFGAG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTITSYLMHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；

(2)具有CKASQNVGTNVAWFQ、IYLASYRYS和CQQYNSYPLTFGGG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTFTNYWIQWM、LEWIGEINPSNGRTDYNEKFKNRAT和CANYRPGYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；

(3)具有CSASSSISYMYWYQ、IYDTSILAS和CQQWSSYPFTFGSG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTFTSYLIHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；

与(1)～(3)相比，具有至少一个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

任选地，包括下列至少之一：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区；

(b)具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区；

(c)具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链可变区；

与(a)～(c)相比，具有至少一个保守氨基酸取代的氨基酸序列；

任选地，包括下列至少之一：

具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链；

具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链；

具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链和SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的重链。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的抗体或抗原结合片段；

任选地，所述多核苷酸包括下列至少之一：

3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的多核苷酸；

任选地，进一步包括：

控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操作地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达；

任选地，所述控制元件包括下列至少之一：启动子、增强子和终止子；

任选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

4.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求3所述的表达载体。

5.一种制备抗ROR2抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括培养权利要求4所述的重组细胞。

6.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。

7.权利要求1所述的抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于ROR2抗原的诊断检测；

任选地，所述试剂盒用于免疫印迹、免疫沉淀和/或ELISA检测。

8.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。

9.一种抗ROR2的嵌合抗原受体，其特征在于，包括：胞外区、跨膜区和胞内区，

所述胞外区包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为单链，所述抗体或抗原结合片段为权利要求1所述的抗体或抗原结合片段。

10.一种Car-T细胞，其特征在于，所述Car-T细胞表达权利要求9所述的抗ROR2的嵌合抗原受体。