CN114349867A - 融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种融合蛋白。该融合蛋白包括：靶向抗体以及TGFβ信号阻断因子，所述靶向抗体包括Fab区和Fc区，所述Fc区具有A327Q、G237A和L235A突变。根据本发明实施例的融合蛋白在靶向抗体的介导下，实现了TGFβ信号阻断因子在靶向区域的聚集，增加了药效，促进抗肿瘤免疫反应，且有效延长了TGFβ信号阻断因子的半衰期，更为重要的是，根据本发明实施例的融合蛋白与Fc受体(FcR)的结合力弱，ADCC效应低，药物的毒副作用显著降低。

Description

融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及融合蛋白及其应用，更具体地，涉及靶向抗体以及TGF β信号阻断因子的融合蛋白，以及编码这类融合蛋白的核酸、构建体、重组细胞、药物组合物及其制药 用途。

背景技术

抗体的Fc区与许多Fc受体及配体相互作用，行使一系列重要的功能，称为效应器功能 (effector function)。IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE的为FcεR，IgA的为FcαR等等。已经鉴 定了FcγR的三个亚类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。Fc受体的另一种类型是新 生Fc受体(FcRn)。

由抗体Fc区介导的效应功能可以分为两种：(1)在抗体与抗原结合之后发挥作用的效应功能(这些功 能涉及参与补体级联反应或Fc受体(FcR)-负荷细胞)；和(2)不依赖于抗原结合而发挥作用的效应功能(这 些功能提供在血循环中的持续性和通过胞吞作用穿过细胞屏障的能力)。

近年来抗体Fc区常用来制备各种融合蛋白，融合蛋白的Fc段能够与各类免疫白细胞上表达的Fc γRs受体结合，从而产生Fc段介导的细胞毒作用(ADCC)以及补体依赖的细胞毒性(CDC)效应， 靶向杀伤功能蛋白受体阳性细胞，会影响融合蛋白发挥活性而为减弱治疗类融合蛋白Fc段与FcγRs受 体的亲和力而设计的基因突变，通常会导致融合蛋白与FcRn受体亲和力的下降，降低其在体内的半衰 期。

血管生成是从先前存在的脉管系统发展出新血管的过程。它在胚胎发育，组织正常生长，伤口愈合 中起重要作用，并且在许多疾病中起主要作用。在哺乳动物中，主要分离出5种参与血管生成的细胞因 子(Vascular endothelial growth factors,VEGFs)。这些细胞因子主要结合3种受体酪氨酸激酶—— VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3，以及一些共受体，包括硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)和神经毡蛋白。

VEGFR受体中，VEGFR1促进单核细胞和巨噬细胞的迁移。VEGFR1的可溶形式可以捕获VEGF， 竞争VEGF与VEGFR2的结合。VEGFR2参与正常生理过程和肿瘤的发生发展。VEGFR3对淋巴表皮 细胞发育起重要作用。

在哺乳动物中，主要有5个VEGF细胞因子，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎 盘生长因子(PlGF)。VEGF诱导血管生成和内皮细胞增殖，在调节血管生成中起重要作用VEGF-A有 几种剪接变体。主要的氨基酸包括：121、165、189和206个氨基酸，每个氨基酸都包含特定的外显子 添加。VEGF-A转录在缺氧时被激活并被激活的癌基因增强的转录因子，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)。 正常氧中的VEGF转录被许多致癌基因激活，包括H-ras和几个跨膜酪氨酸激酶，例如表皮生长因子受 体和ErbB2。与正常组织相比，这些途径共同导致了肿瘤中VEGF-A的明显上调，并且通常具有预后意 义。

VEGF牵涉到与血管生成增强有关的其他几种病理状况。例如，VEGF在牛皮癣和类风湿性关节炎 中均起作用。糖尿病性视网膜病变与高眼内VEGF水平有关。VEGF功能的抑制可通过阻断黄体功能导 致不孕，阻断VEGF或者VEGFR2的抗体已直接证明了VEGF在肿瘤生长中的重要性。因此，对VEGF 功能的干扰已成为以阻断血管生成为目的的肿瘤药物开发的重要方向。

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是属于调节细胞生长和分化的TGF-β超家 族。这一家族除TGF-β外，还有活化素、抑制素、缪勒氏管抑制质和骨形成蛋白。机体多种细胞均可 分泌非活性状态的TGF-β。在体外，非活性状态的TGF-β又称为latency associated peptide(LAP)，通 过酸裂解可被活化。在体内，酸性环境可存在于骨折附近和正在愈合的伤口。蛋白本身的裂解作用可使 TGF-β复合体变为活化TGF-β。

TGF-β在细胞的生长、分化和免疫功能中发挥重要的调节作用。

TGFβ可以抑制丝裂原、同种异体抗原刺激的T细胞增殖或IL-2依赖的T细胞生长，也可以抑制 IFN-γ诱导黑素瘤细胞MHCⅡ类抗原表达，并且，TGFβ还可以抑制PBMC中IFN-γ和TNF-α的产 生，并促进IL-6的表达。

TGFβ在肿瘤中，以细胞背景依赖的方式发挥肿瘤抑制或肿瘤促进的作用。TGF-β能够抑制原癌 基因c-myc的表达，但在肿瘤发展过程中，随着突变的引入或表观遗传修饰的变化后，癌细胞逐渐耐受 TGFβ信号的抑制作用，最终导致肿瘤的发展。

近年的研究发现，肿瘤微环境中TGFβ增加与免疫逃逸相关，TGFβ的增加会增加T细胞排斥， 阻断TH1效应T细胞的浸润。Tauriello等人发现TGFβ阻断使小鼠肝转移癌症模型对PD1/PDL1疗法 更敏感，而类似的Mariathasan等人报道了TGFβ阻断和PD-L1抗体联用，可以下调基质细胞的TGFβ 信号通路，促进T细胞渗透进肿瘤中，激活强烈的抗肿瘤免疫反应。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。现有技术中，单独的采用靶向拮抗 VEGF或VEGFRs的抗体，药效有限；单独采用靶向TGFβ受体2的抗体疗法临床前试验效果一般， 并且I期临床毒性很大；单独的采用靶向TGFβ的抗体会与游离的TGFβ结合，结合之后被细胞内化， 这种抗体/细胞因子复合物会被吞噬细胞吞噬并降解；单独的采用靶向拮抗VEGF或VEGFRs的抗体与 细胞因子结合后可能起到载体作用，从而抗体/细胞因子复合物常常以循环槽(circulating sink)作用积 累，最终崩解，将细胞因子释放到循环中。

为了解决上述问题，本发明提出了一种双功能分子的融合蛋白，其包括(a)TGFβRII或其他能够结 合TGFβ的片段，和(b)结合至血管生成因子受体(VEGFR)蛋白质的抗体或其抗原结合片段。所述融 合蛋白可应用于癌症的治疗。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：靶 向抗体以及TGFβ信号阻断因子，所述靶向抗体包括Fab区和Fc区，所述Fc区具有A327Q、G237A和 L235A突变。需要说明的是，本申请所述的靶向抗体是指是能够特异性靶向结合抗原的抗体。本申请所 述的TGFβ信号阻断因子是指能够阻断TGFβ与受体的结合或能够阻断TGFβ与受体的结合后所引起的 下游信号通路反应的因子。

根据本发明实施例的融合蛋白在靶向抗体的介导下，实现了TGFβ信号阻断因子在靶向区域的聚 集，增加了药效，促进抗肿瘤免疫反应，且有效延长了TGFβ信号阻断因子的半衰期，更为重要的是， 根据本发明实施例的融合蛋白与Fc受体(FcR)的结合力弱，ADCC效应低，药物的毒副作用显著降低。

根据本发明的实施例，上述融合蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述靶向抗体为靶向VEGF或VEGFRs的抗体。进而所述融合蛋白可用于阻 断TGFβ信号通路，抑制肿瘤转移；阻断VEGF信号通路，抑制肿瘤血管生成；增强CD8+T细胞，减 少Treg细胞，并抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAM)增殖和髓源性抑制性细胞(MDSC)聚集。

根据本发明的实施例，所述VEGF包括选自VEGF-A、VEGF-B、PlGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-E、PlGF-2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、VEGF-A、VEGF-C、PlGF-2、VEGF-C、VEGF-D的至少之一。

根据本发明的实施例，所述VEGFR包括选自VEGFR1、NRP-1、VEGFR2、NRP-2、VEGFR3的至 少之一。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体为靶向VEGFR2抗体。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体特异性结合VEGFR的胞外区。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一 性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:4～6。

SYSMN(SEQ ID NO:1)。

SISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)。

VTDAFDI(SEQ ID NO:3)。

RASQGIDNWLG(SEQ ID NO:4)。

DASNLDT(SEQ ID NO:5)。

QQAKAFPPT(SEQ ID NO:6)。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体含有分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ IDNO:1、2和 3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列和分别如SEQ ID NO: 4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、 CDR3序列。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体具有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的重链可变区。

EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:7)。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体具有如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的轻链可变区。

DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLDTGVPSRFSGSG SGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGGGTKVDIKR(SEQ ID NO:8)。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体含有重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包括所述Fc 区，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体 的至少之一。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体。进而所述 抗体的免疫原性可以得到有效降低。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG1。

根据本发明的实施例，所述Fc区具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

EPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKQLPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGA(SEQ ID NO:9)。

需要说明的是，SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的第一位氨基酸在Eu编号(Eunumbering)中为第 216位。

根据本发明的实施例，所述靶向抗体具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链。

EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)。

DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLDTGVPSRFSGSG SGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC(SEQID NO:11)。

根据本发明的实施例，所述TGFβ信号阻断因子为结合TGFβ或TGFβR的片段或抗体。

根据本发明的实施例，所述结合TGFβ的片段为TGFβRII胞外结构域。TGFβRII胞外结构域可特 异性与TGFβ结合，阻断TGFβ与机体内TGFβR的结合，相比靶向TGFβ受体，体内毒性小。

根据本发明的实施例，所述TGFβRII胞外结构域具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVW RKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP D(SEQ IDNO:12)。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述连接肽的N端与所述靶向抗体的C 端相连，所述连接肽的C端与所述TGFβ信号阻断因子的N端相连。连接肽将两个功能不同的蛋白连 接起来，使其保持一定的距离，能够发挥各自的生物学功能而不相互影响。

根据本发明的实施例，所述连接肽的氨基酸序列具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸编码前面所述 的融合蛋白。将根据本发明实施例的核酸导入受体细胞后，表达前面所述的融合蛋白，实现对肿瘤细胞 的特异性杀伤。

根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述核酸分子具有SEQ ID NO:14或15所示的核苷酸序列。

重链核苷酸序列：

GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGCGCCTGA GCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACAGCATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGC AAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCAGCATCAGCAGCAGCAGCAGCTACATCTACTACGCCGACAGCGT GAAGGGCCGCTTCACCATCAGCCGCGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCC TGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGTGACCGACGCCTTCGACATCTGGGGC CAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCGCCTCTACCAAGGGACCCTCTGTGTTTCCTCTGGCTCCC TCCAGCAAGTCTACCTCTGGTGGAACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCTGAG CCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACATCTGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTG CAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAG AGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGGCCGGCGCCCCCAGCGT GTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGT GGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGAGCG TGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAA GCAGCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAG GTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGT GAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACT ACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACA ACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGCCGGCGGAGGCGGCAGCGGTGGCGG TGGCAGCGGAGGCGGCGGCAGCGGAGGTGGAGGCAGCGGCATCCCCCCCCACGTGCAGAAGAGC GTGAACAACGACATGATCGTGACCGACAACAACGGCGCCGTGAAGTTCCCCCAGCTGTGCAAGTTCTGCGACGTGCGCTTCAGCACCTGCGACAACCAGAAGAGCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCA GCATCTGCGAGAAGCCCCAGGAGGTGTGCGTGGCCGTGTGGCGCAAGAACGACGAGAACATCAC CCTGGAGACCGTGTGCCACGACCCCAAGCTGCCCTACCACGACTTCATCCTGGAGGACGCCGCCA GCCCCAAGTGCATCATGAAGGAGAAGAAGAAGCCCGGCGAGACCTTCTTCATGTGCAGCTGCAGC AGCGACGAGTGCAACGACAACATCATCTTCAGCGAGGAGTACAACACCAGCAACCCCGACTAA (SEQ ID NO:14)。

轻链核苷酸序列：

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCGTGAGCGCCAGCATCGGCGACCGCGTGACCAT CACCTGCCGCGCCAGCCAGGGCATCGACAACTGGCTGGGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGACACCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGC AGCGGCAGCGGCACCTACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACTTCGCCGTGTA CTTCTGCCAGCAGGCCAAGGCCTTCCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGACATCAAGA GAACTGTGGCCGCTCCATCCGTCTTCATTTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAGAGTGGCACCG CCTCTGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCCCGTGAGGCAAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATA ACGCCCTGCAGTCCGGAAATAGCCAGGAGTCTGTGACAGAACAGGACAGTAAGGATTCAACTTATT CTCTGTCTAGTACCCTGACACTGTCTAAAGCTGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCATGCGAAG TCACCCATCAGGGGCTGTCATCCCCTGTGACAAAGTCCTTTAATCGCGGTGAATGTTAA(SEQ ID NO:15)。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体携带前面所述 的核酸。将根据本发明实施例的构建体导入受体细胞后，其所携带的核酸与受体细胞的基因组整合或不 整合，表达前面所述的融合蛋白，抑制肿瘤微环境中血管的增生，促进抗肿瘤免疫反应。

根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述构建体的载体为PCDNA3.4A。

根据本发明的实施例，进一步包括启动子，所述启动子与所述核酸可操作的连接。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面 所述的核酸或前面所述的构建体。根据本发明实施例的重组细胞表达前面所述的融合蛋白，实现对抑制 肿瘤微环境中血管的增生，促进抗肿瘤免疫反应。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括 前面所述的融合蛋白、前面所述的核酸、前面所述的构建体或前面所述的重组细胞。根据本发明实施例 的药物组合物对肿瘤微环境中血管的增生的抑制作用、抗肿瘤免疫反应的促进作用更加显著。

根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药物上可接受的载体。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括PD-L1或PD-1抗体。根据本发明实施例融合蛋 白与PD-L1或PD-1抗体联用，用药剂量显著低于现有技术单独给与PD-L1或PD-1抗体，药物副作用 显著降低，药效更优。

在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的融合蛋白、前面所述的核酸、前面所述的构建体、 前面所述的重组细胞或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防血管增生 性疾病或肿瘤。根据本发明实施例的融合蛋白或核酸、构建体、重组细胞表达的融合蛋白能够特异性靶 向抗原，如VEGF或VEGFRs，由于VEGF与VEGFRs的结合具有促进血管增生的作用，因此，根据发 明实施例的融合蛋白所制备的药物可用于显著抑制血管增生，对血管增生性疾病起到治疗或预防作用， 同时根据本发明实施例的融合蛋白中的TGFβ信号阻断因子，可特异性阻断TGFβ与TGFβ受体的结合， 促进T细胞渗透进肿瘤中，激活强烈的抗肿瘤免疫反应，因此，根据发明实施例的融合蛋白所制备的药 物可用于激活抗肿瘤免疫反应，对肿瘤起到治疗或预防作用。

根据本发明实施例所提出的融合蛋白具有以下优势：

1、Fc区具有A327Q、G237A和L235A突变降低了与Fcγ受体结合力，ADCC效应低，药物的毒 副作用显著降低；

2、通过VEGF/VEGFR阻断抗体与TGFβ信号通路阻断因子的融合增强了抗肿瘤效果，有望提高抗 肿瘤血管生成疗法临床响应率；

3、与施用VEGF/VEGFR阻断抗体疗法相比，本申请融合蛋白达到相同效果时用药量会更低；

4、融合蛋白中的抗体是靶向细胞抗原，内化率低于抗体/细胞因子复合物，大大改善了抗体被中和 的问题；

5、融合蛋白避免了抗体与细胞因子结合产生的载体作用，不会产生循环槽作用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本 发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其 中：

图1是根据本发明实施例的抗VEGFR2抗体融合蛋白分子的结构及表达图；

图2是根据本发明实施例的ELISA检测抗体端与VEGFR2的结合活性图；

图3是根据本发明实施例的ELISA检测抗体端与VEGFR2的结合活性图；

图4是根据本发明实施例的FACS检测抗体端与细胞表面VEGFR2的结合活性图；

图5是根据本发明实施例的FACS检测抗体端与细胞表面VEGFR2的结合活性图；

图6是根据本发明实施例的融合蛋白阻断VEGF165与VEGFR2结合的活性图；

图7是根据本发明实施例的融合蛋白的T细胞增殖抑制的活性图；

图8是根据本发明实施例的融合蛋白的影响T细胞细胞因子分泌的活性图；

图9是根据本发明实施例的融合蛋白的对小鼠肿瘤模型的影响结果图；以及

图10是根据本发明实施例的融合蛋白的对小鼠生存曲线的影响结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例 是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

抗体

本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和 两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链 的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小， 称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL

和VH。在一个实施方案中，所述抗体为IgG类，在一个实施例中所述IgG类抗体为IgG1抗体。

在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。

重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的 CH长度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3 和CH4。

铰链区(hinge region)位于CH1与CH2之间，富含脯氨酸，易伸展弯曲，从而改变抗原结合部位之 间的距离，有利于抗体结合位于不同位置的抗原表位。铰链区易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生 不同的水解片段。

木瓜蛋白酶水解Ig的部位是在铰链区二硫键连接的两条重链的近N端，可将Ig裂解为两个完全相 同的Fab段和一个Fc段。

Fab段即抗原结合片段(fragment antigenbinding，Fab)，由一条完整的轻链与重链的VH和CHl结构 域组成。本申请中Fab段靶向VEGF或VEGF受体(VEGFRs)。

VEGF(血管内皮生长因子)家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、PlGF(胎盘生 长因子)及VEGF-F。血管内皮生长因子通过与其受体相联系而发挥各自的生物学功能。这些受体包含跨 膜酪氨酸激酶受体VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和神经纤毛蛋白受体(NRP-1和NRP-2)。VEGF家族 成员在诱导血管和淋巴管的形成中起着重要的作用。

VEGF受体的一些例子包括蛋白酪氨酸激酶受体，如文献中提到的flt-1(VEGFR-1)，KDR和 flk-1(VEGFR-2)。除非另有说明或以其它方式清楚地说明，本说明书将遵循VEGF受体的常规文献命名 法。

VEGF受体(VEGFRs)	VEGF(VEGF配体)
		VEGFR1	VEGF-A、VEGF-B、PlGF
NRP-1	VEGF-A、VEGF-B、VEGF-E、PlGF-2
		VEGFR2	VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F
NRP-2	VEGF-A、VEGF-C、PlGF-2
		VEGFR3	VEGF-C、VEGF-D、

阻断VEGF及其受体间的相互作用，可以抑制血管发生及肿瘤生长。

在一些实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白，其所包含的抗VEGFR2抗体，具有SEQ ID NO： 1～3所示氨基酸序列的重链可变区CDR序列和SEQ IN NO:4～6所示氨基酸序列的重链可变区CDR序列。

Fc段即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由Ig的CH2和CH3结构域组成。Fc段无抗原结 合活性，是Ig与效应分子或细胞相互作用的部位。术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗 体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、 Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。这些相应器功能多与Fc与Fc受体(Fcγ受体) 结合有关，Fcγ受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。

包含降低Fc受体结合的修饰的抗体一般具有与相应未修饰抗体相比降低的效应器功能，特别是降 低的ADCC。因而，在一个实施方案中，所述降低IgG类抗体对Fc受体的结合亲和力的修饰降低IgG 类抗体的效应器功能。在一个具体实施方案中，所述效应器功能为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)。

本申请所提出的融合蛋白中的F_C具有A327Q、G237A和L235A突变，Fcγ受体(FcγR)的结合力 弱，ADCC效应低，药物的毒副作用显著降低。常见的Fc变体还包含K447位的缺失，或为了在Fc的 C末端连接其他蛋白避免发生酶解而致K447A突变，Fc区447位缺失或突变不会影响Fc变体与Fcγ 受体的亲和力和/或FcRn的亲和力。需要说明的是，本申请所出现的Fc区编号依据Eu编号(Eu numbering)。

TGFβ信号阻断因子是指能够阻断TGFβ与受体的结合或能够阻断TGFβ与受体的结合后所引起 的下游信号通路反应的因子，包括结合TGFβ或TGFβR的片段或抗体，例如，结合TGFβ的片段为 TGFβRII胞外结构域。TGFβRII胞外结构域可特异性与TGFβ结合，阻断TGFβ与机体内TGFβR 的结合，相比靶向TGFβ受体，体内毒性小。

术语“连接肽”为包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽。连接肽是本领域中已知的 或本文中记载的。合适的、非免疫原性的连接肽包括例如(G₄S)_n、(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽接头。“n”一般 是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。

核酸分子、构建体、重组细胞

在制备或者获取本申请所述的融合蛋白的过程中，可以利用表达这些融合蛋白的核酸分子，与不同 的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应融合蛋白。

为此，本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述融合蛋白。

在一些实施方案中，所述分离核酸分子具有如SEQ ID NO:14或15所示核苷酸序列。其中，SEQ ID NO:14所示核苷酸编码融合蛋白中“抗VEGFRs抗体重链-连接肽-TGFβRII胞外结构域”部分，SEQ ID NO:15所示核苷酸编码融合蛋白中“抗VEGFRs抗体轻链”部分。其中，融合蛋白的结构示意图可参考 图1。

在一些实施方案中，所述分离的核酸分子与上述SEQ ID NO:14或15所示的核苷酸序列至少具有 90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的核酸分子。在将上述分离的多核苷酸 连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制 多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并 非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指 将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥 其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码融合蛋白的多核苷酸，可以分别独立的插入 到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid-X 质粒。

本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物 细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的融合蛋白。通过该重组细胞进行 培养，即可以获得相应融合蛋白。

药物组合物及制药用途

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的融合蛋白和药学可接受的载体。

本文提供的融合蛋白可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提 供的融合蛋白以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有 溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、 磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合 物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可 包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

例如，本发明的融合蛋白可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物 组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液 体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药 物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。

癌症或者肿瘤可以是任何不受调控的细胞生长。本发明药物组合物可以治疗或预防的肿瘤。

在利用本发明所提供的融合蛋白治疗上述疾病时，可以将本发明提供的融合蛋白提供给受试者即 可。为此，本发明提供了一种用于治疗上述疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的融 合蛋白。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明 所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该 特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明 本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描 述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得 的常规产品。

实施例1融合蛋白VEGFR2/TGFβRII trap的表达

采用TGFβRII受体(SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)的胞外结构域(SEQ ID NO:12)作为融合 蛋白中免疫调节分子部分，将靶向VEGFR的Ramucirumab抗体(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)作 为融合蛋白的靶向部分，以(Gly₄Ser)₄G作为连接序列(SEQ ID NO:13)。将Ramucirumab抗体和TGFβRII 胞外结构域的N端连接，形成Anti-VEGFR2-TGFβRII胞外区融合蛋白(R0469)(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:18)。在融合结合处，抗体重链的C末端赖氨酸残基(K)被突变成丙氨酸(A)，减少融合蛋白的 切割水解。对于R0469采用瞬时或稳定转染的标准方案，用位于相同表达载体或分开的表达载体中的编 码抗VEGFR2轻链的DNA和编码抗VEGFR2/TGFβRII受体的DNA来转染哺乳动物细胞。

人TGFβRII同种型A前体多肽(NCBI RefSeq登录号：NP_001020018.1)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDN NGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYH DFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAIS VIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGK GRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQY WLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKND LTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEM TSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHD PEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK(SEQ ID NO:16)。

人TGFβRII同种型B前体多肽(NCBI RefSeq登录号：NP_003233.4)

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQK SCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFF MCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKT RKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAV KIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWED LRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLAN SGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREH PCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSG RSCSEEKIPEDGSLNTTK(SEQ ID NO:17)。

分泌的人IgG1.6亚型抗VEGFR2-TGFBRII Trap的重链多肽序列

EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKQLPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHV QKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENIT LETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO:18)。

我们构建表达了多个Fc亚型的Ramucirumab-TGFβRII trap分子，包括人IgG1.6、人IgG1、鼠IgG1 (SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:21)，R0469的hIgG1.6 亚型。类似的，Lilly公司Ramucirumab的Fc部分为野生型人IgG1亚型，我们将Ramucirumab的Fc部 分换成和上述一致的鼠IgG1、鼠IgG2a、人IgG1、人IgG1.6，表达制备了对应的Anti-VEGFR2抗体。 此外，我们还构建表达了同型对照抗体-TGFβRII胞外区融合蛋白，和Anti-VEGFR2抗体一起在后续实 验中用作Anti-VEGFR2-TGFβRIITrap的对照。

分泌的人IgG1亚型抗VEGFR2-TGFBRII Trap的重链多肽序列

EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVLPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHV QKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENIT LETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD(SEQ ID NO:19)。

分泌的鼠IgG1亚型抗VEGFR2-TGFBRII Trap的重链多肽序列

EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAA QTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAH PASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVD DVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVY TIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSN WEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVPKSVNSDVM ASDNGGAVKLPQLCKFCDVRLSTCDNQKSCMSNCSITAICEKPHEVCVAVWRKNDKNITLETVCHDPK LTYHGFTLEDAASPKCVMKEKKRAGETFFMCACNMEECNDYIIFSEEYTTSSPD(SEQ ID NO:20)。

分泌的鼠IgG1亚型抗VEGFR2-TGFBRII Trap的轻链多肽序列

DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLDTGVPSRFSGSG SGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGGGTKVDIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLN NFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPI VKSFNRNEC(SEQID NO:21)。

实施例2融合蛋白VEGFR2/TGFβRII trap的表达

构建表达质粒瞬时转染人胚肾HEK 293细胞，分离纯化细胞产生的抗VEGFR2-TGFβRII Trap (R0469)，其在非还原条件下于SDS-PAGE上的条带分子量约为170kD(图1B)，在还原条件下于 SDS-PAGE上的条带分子量约为80kD。在尺寸排阻色谱上190kD峰后有一个小峰，质谱鉴定其为 TGFβRII的N末端部分中的位点处切割的抗VEGFR2-TGFBR2 trap的抗体部分。

实施例3ELISA检测VEGFR2-TGFβRII trap抗体端结合活性

抗体端结合检测用抗原为human VEGFR2-his(10012-H08H，购自Sinobiological)，检测流程如下：

1)用1×磷酸盐缓冲液(PBS)稀释anti-His Tag兔单抗(31-1048-00，购自RevMABBioscience) 至0.5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；

2)250μl 1×PBST(PBS+0.5％Tween20)洗涤3次，加入200μl含2％牛血清白蛋白(BSA)的 PBS室温封闭1小时；

3)250μl 1×PBST洗涤3次，加入human VEGFR2-his，室温孵育1小时；

4)250μl 1×PBST洗涤3次，加入梯度稀释的抗VEGFR2-TGFβRII trap，VEGFR2抗体(购自Lilly) 为阳性对照，室温孵育2小时；

5)250μl 1×PBST洗涤3次，每孔加入100μl稀释好的Goat-anti-human Fc-HRP藕联抗体或 Goat-anti-mouse Fc-HRP(Sigma，1:15k)，室温孵育1小时；

6)250μl 1×PBST洗涤3次，每孔加入100μl TMB显色液，室温避光孵育10分钟，加入50μl 2N H₂SO4 终止反应；

7)用iX3酶标仪(Molecular Device公司)读取450nM处的吸收值，分析作图。

如图2中所示，ELISA结果分析显示Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap融合蛋白抗体端保留了与VEGFR2 的结合活性。Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap融合蛋白与Anti-VEGFR2(Ramucirumab)抗体结合 VEGFR2-his EC50分别是311pM和291.6pM，阴性对照组的Isotype-hFC-TGFβRII Trap则无法结合 VEGFR2-his。

实施例4ELISA检测VEGFR2-TGFβRII trap抗体端和trap端体外结合活性

Trap端结合检测所用蛋白为human TGFβ1(CA59)、human TGFβ2(CJ79)和humanTGFβ3(CJ44) (TGFβ蛋白购自Novoprotein)，检测流程如下：

1)用1×磷酸盐缓冲液(PBS)稀释TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3至0.5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板， 4℃过夜；

2)250μl 1×PBST(PBS+0.5％Tween20)洗涤3次，加入200μl含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS 室温封闭1小时；

3)250 1×PBST洗涤3次，加入梯度稀释的VEGFR2-TGFβRII trap，VEGFR2抗体(购自Lilly)为 阳性对照，室温孵育2小时；

4)250μl 1×PBST洗涤3次，每孔加入100μl稀释好的Goat-anti-human Fc-HRP藕联抗体(Sigma， 1:15k)，室温孵育1小时；

5)250μl 1×PBST洗涤3次，每孔加入100μl TMB显色液，室温避光孵育10分钟，加入50μl 2N H₂SO4 终止反应；

6)用iX3酶标仪(Molecular Device公司)读取450nM处的吸收值，分析作图。

图3显示Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap可以结合包被在板上的TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，且亲和力 从高到底排列顺序是TGFβ1>TGFβ3>>TGFβ2。Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap结合TGFβ1和TGFβ3的EC₅₀值分别为134.7pM和160.4pM。

实施例5FACS检测抗VEGFR2-TGFβRII trap与细胞表面的VEGFR2的结合

用pcDNA3.4-VEGFR2瞬转质粒转染人胚肾HEK 293细胞，48-72小时后，收集转染后的细胞。采 用如下方法检测阳性抗体和融合蛋白与293-VEGFR2细胞的结合。

1)对细胞进行计数，将细胞以1×10⁵每孔的密度铺至96孔U底板；

2)细胞离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清液。

3)用含1％BSA的1×PBS梯度稀释抗体及融合蛋白以及阴性对照，每孔加入100μl稀释好的抗体 和融合蛋白，4℃孵育0.5小时。

4)细胞离心，1500rpm，4℃，5分钟，弃上清液。用含1％BSA的1×PBS洗一遍，细胞离心，1500 rpm，4℃，5分钟，弃上清液。

5)每孔用100μl稀释好的R-Phycoerythrin偶联Goat Anti-Human IgG,Fcγ抗体(购自Jackson Immunoresearch，1:400稀释)重悬，4℃避光孵育0.5小时。

6)细胞离心，1500rpm，4℃，5分钟，小心弃上清液。用含1％BSA的1×PBS洗一遍，细胞离心， 1500rpm，4℃，5分钟，弃上清液。

7)每孔加入100μl PBS，重悬细胞，用Beckman公司Cytoflex流式细胞仪检测。数据用Graphpad Prism5计算作图。

如图4中所示，FACS分析显示，Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap融合蛋白在瞬转表达人VEGFR2的 293细胞(293-VEGFR2细胞)上保留了与阳性对照抗体类似的结合力。阴性对照hFc-TGFβRII Trap 完全不结合293-VEGFR2细胞。未经转染的293细胞上MFI值很低，接近阴性对照的读值。

为进一步比较Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap融合蛋白与阳性抗体结合的差异，我们从100nM开始对 mIgG1亚型的相关分子进行了梯度稀释，检测融合蛋白及抗体对293-VEGFR2瞬转细胞的亲和力。 Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap和Anti-VEGFR2的结合EC₅₀分别是214.3pM和129.4pM，对照分子 Isotype-TGFβRII Trap抗体端不结合293-VEGFR2细胞(见图5)。Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap抗体端对 细胞的亲和力与Anti-VEGFR2抗体相当。

实施例6ELISA检测抗VEGFR2-TGFβRII Trap抗体端体外阻断活性

抗体端阻断活性检测用抗原为VEGFR2-Fc(10012-H02H，购自Sinobiological)和VEGF165-his(VE5-H5248，购自Acrobiosystems)，采用如下方法进行研究：

1)用1×PBS稀释VEGFR2-hFc至2μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；

2)250μl 1×PBST(PBS+0.5％Tween20)洗涤3次，加入200μl含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS 室温封闭1小时；

3)250μl 1×PBST洗涤3次，加入50μl梯度稀释的抗体和融合蛋白(模式1)或加入50μl 1μg/ml VEGF165-his(模式2)，室温孵育1小时；

4)加入50μl 1μg/ml VEGF165-his梯度稀释的抗体和融合蛋白(模式1)或加入50μl梯度稀释的抗 体和融合蛋白(模式2)，室温孵育1小时；

5)250μl 1×PBST洗涤3次，每孔加入100μl稀释好的Goat-anti-his-HRP藕联抗体(Sigma，1:15k)， 室温孵育1小时。

6)250μl 1×PBST洗涤3次，每孔加入100μl TMB显色液，室温避光孵育10分钟，加入50μl 2N H2SO4 终止反应。

7)用iX3酶标仪(Molecular Device公司)读取450nM处的吸收值，分析作图。

检测抗VEGFR2-TGFβRII Trap抗体端体外阻断活性我们采取2种模式。模式1先加抗体或者融合 蛋白孵育，然后加入VEGF165-his。模式2先VEGF165-his，然后加入抗体或者融合蛋白孵育。

图6显示Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap具有阻断蛋白水平VEGF165和VEGFR2的结合的能力。图 6A中(模式1)，Ramucirumab和Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap阻断VEGFR2-VEGF结合的IC₅₀值分别 为354.1pM和328pM，阻断能力接近。图6B中(模式2)，Ramucirumab和Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap 曲线完全重合，二者阻断能力一致。

实施例7T细胞增殖抑制试验

前人的研究表明TGFβ1会明显抑制T细胞的增殖，为了验证Anti-VEGFR2-TGFβRIITrap融合蛋白 Trap端在细胞水平的功能，我们检测了在TGFβ存在情况下，Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap对T细胞增 殖的影响。实验采用如下示例性方法：

1)使用人淋巴细胞分离液密度梯度离心从健康志愿者的全血中，分离外周血单个核细胞(PBMC)，使 用人T细胞富集试剂盒(STEMCELL，10951)，根据说明从PBMC中分离T细胞，使用CFSE(eBioscience， 85-65-0850-84)对T细胞进行染色，具体操作参考试剂说明书，CFSE的使用浓度为1μM；

2)将融合蛋白、CD3/CD28 beads(life，40203D)和经CFSE染色后的T细胞进行共孵育，T细胞 的数量为5X10⁴个/well，CD3/CD28 beads与T细胞的比例为1:10，在培养箱进行培养；

3)第五天后，流式检测T细胞的CFSE值，算出T细胞在每一代中所占的比例。

如图7所示，不加入TGFβ时，左侧门中的T细胞增殖比例为26.4％，加入TGFβ后，细胞增值比 例降低未6.22％。不含Trap的Anti-VEGFR2加入体系后，左侧门中增殖并无明显变化(从6.22％提高 到8.34％)，而Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap加入后，左侧门中部分的增殖从6.22％增加到29.4％，接近 不加TGFβ1的对照组的增殖率(26.4％)。Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap与Anti-VEGFR2对照组相比，说 明促进T细胞增殖的作用是TGFβRⅡTrap依赖的。

实施例8活化T细胞释放IFNγ检测

为了研究Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap对T淋巴细胞的启动作用，我们用CD3/CD28磁珠刺激激活 T细胞，并检测了在TGFβ存在情况下，Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap对T细胞激活后分泌IFNγ的影响。

1)使用人淋巴细胞分离液密度梯度离心从健康志愿者的全血中，分离外周血单个核细胞(PBMC)，使 用人T细胞富集试剂盒(STEMCELL，10951)，根据说明从PBMC中分离T细胞；

2)将融合蛋白、CD3/CD28 beads(life，40203D)和分离的新鲜T细胞进行共孵育，T细胞的数量 为5X10⁴个/well，CD3/CD28 beads与T细胞的比例为1:10，在培养箱进行培养；

3)第五天时，用ELISA测定培养上清中的IFNγ水平。

如图8所示，在T细胞与beads比例为10:1和30:1下，未加TGFβ1组IFNγ的分泌量为289.40pg/ml 和56.86pg/ml。加入TGFβ1后，IFNγ分泌量大幅度降低至74.06pg/ml和54.01pg/ml。含Trap的 Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap加入体系后，IFNγ的分泌量重新提高到437.12pg/ml和203.96pg/ml，而 不含Trap的对照Anti-VEGFR2则无法促进IFNγ的分泌。

实施例9通过Fortebio法鉴定不同亚型融合蛋白与Fc受体的亲和力(数据来自FPX007)

本专利构建的Anti-VEGFR2-mTrap分子包含hIgG1和hIgG1.6亚型的，hIgG1.6在设计时通过突变 削弱了hIgG1与FcR gamma的结合，延长融合蛋白的半衰期，PCT/CN2020/118409全文内容引入本申 请。为了证明这一点，我们对不同亚型融合蛋白与Fc受体的亲和力进行了检测。具体方法如下：

1)FcR gamma I(购自Acrobiosystems)用1×PBST缓冲液稀释到2ug/ml，并以此浓度固化到分子互相 作用分析仪ForteBIO(Octet)的Anti-Penta-HIS(HIS1K)(18-5120，Fortebio)探针上，将此受体对应的 分析物R0354、R0355、R0356、hIgG1(403502，Biolegend)和hIgG4(403702，Biolegend)分别用1*PBST 缓冲液稀释到66.67nM；

2)FcRn，FcR gamma IIa，FcR gamma IIb以及FcR gamma IIIa(购自Acrobiosystems)分别用1×PBST 稀释到3ug/ml，并以此浓度固化到HIS1K探针上,每个受体对应的分析物R0354、R0355、R0356、hIgG1、 hIgG4分别用1×PBST缓冲液稀释到2μM；

3)用PBST平衡探针60s，分别结合各个受体180s，再次用PBST平衡探针90s后，再与对应的分析 物R0354、R0355、R0356、hIgG1、hIgG4结合180s，然后于PBST中解离300s；

4)探针于10mM甘氨酸中再生中和以后，再按照这个方法进行下个循环的平衡，结合，解离以及再 生中和。所有循环转速都设定为1000rpm；实验温度为30℃。

与野生型对照品hIgG1以及hIgG4相比较，R0354、R0355、R0356三种分子与FcRgamma I，FcR gamma IIa，FcR gamma IIb，FcR gamma IIIa四个受体几乎不结合，但是与FcRn的亲和力没有明显的减 弱，与预期结果一致(见表1)。

表1：Fortebio法评价R0354、R0355、R0356、hIgG1、hIgG4分别与FcR gamma I(表1a)，FcR gamma IIa(表1b)，FcR gamma IIb(表1c)，FcR gamma IIIa(表1d)以及FcRn(表1e)受体的亲和力

表1a

样品ID	上样样品ID	k<sub>a</sub>(1/Ms)	k<sub>d</sub>(1/s)	K<sub>D</sub>(M)
					R0354	FcR gamma I	4.18E+05	4.87E-03	1.17E-08
R0355	FcR gamma I	8.89E+05	1.00E-02	1.13E-08
					R0356	FcR gamma I	6.44E+04	1.67E-03	2.59E-08
hIgG1	FcR gamma I	3.41E+05	9.18E-04	2.69E-09
					hIgG4	FcR gamma I	9.45E+06	4.96E-02	5.24E-09

表1b

表1c

样品ID	上样样品ID	k<sub>a</sub>(1/Ms)	k<sub>d</sub>(1/s)	K<sub>D</sub>(M)
					R0354	FcR gamma IIb	1.63E+03	1.07E-02	6.56E-06
R0355	FcR gamma IIb	1.63E+04	2.25E-02	1.38E-06
					R0356	FcR gamma IIb	1.53E+04	2.15E-02	1.41E-06
hIgG1	FcR gamma IIb	3.47E+03	2.05E-03	5.91E-07
					HIgG4	FcR gamma IIb	8.49E+03	2.15E-03	2.53E-07

表1d

样品ID	上样样品ID	k<sub>a</sub>(1/Ms)	k<sub>d</sub>(1/s)	K<sub>D</sub>(M)
					R0354	FcR gamma IIIa	2.01E+03	9.83E-03	4.89E-06
R0355	FcR gamma IIIa	1.76E+03	1.47E-02	8.35E-06
					R0356	FcR gamma IIIa	3.13E+03	1.74E-03	5.56E-06
hIgG1	FcR gamma IIIa	1.17E+03	1.16E-03	9.91E-07
					HIgG4	FcR gamma IIIa	5.92E+04	1.07E-03	5.53E-07

表1e

样品ID	上样样品ID	k<sub>a</sub>(1/Ms)	k<sub>d</sub>(1/s)	K<sub>D</sub>(M)
					R0354	FcRn	1.05E+04	4.47E-03	4.24E-07
R0355	FcRn	9.45E+03	1.87E-03	1.97E-07
					R0356	FcRn	3.94E+05	5.72E-02	1.45E-07
hIgG1	FcRn	3.38E+04	5.93E-03	1.75E-07
					HIgG4	FcRn	3.98E+04	5.53E-03	1.39E-07

实施例10.肿瘤模型中Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap的体内抗肿瘤评价

为了确定Anti-VEGFR2-TGFβRII Trap在体内抗肿瘤的效果，我们从南模生物采购了表达人源 VEGFR2的人源化小鼠.该小鼠通过ES细胞打靶方式利用同源重组，将小鼠VEGFR2基因替换为人源 VEGFR2，从而表达人VEGFR2蛋白，取代小鼠内源VEGFR2蛋白的表达。小鼠品系为 C57BL/6-Kdr^{em1(hKDR)Smoc}，6周龄-10周龄的雄性小鼠。具体实验方法为：

1)将小鼠黑色素瘤细胞(B16-F1)培养在含有10％胎牛血清(Gibco)、1％谷氨酰胺与1％青霉素- 链霉素(1:1)的高糖DMEM培养基(Gibco)中。

2)收集对数生长期的B16-F1细胞，调节细胞浓度至1×10⁶/mL。取雌性BALB/C小鼠65只，皮下 接种B16-F1细胞，接种体积为0.2mL/小鼠，即2×10⁵/小鼠。

3)接种当天记为第0天(D0)，接种当天将小鼠按瘤体积随机分为5组，每组7只，开始给药。抗体 和融合蛋白用PBS稀释，给药分组见下表(表2)。

表2：

1)第0天第一次给药后，于第2天、第4天、第6天分别按上述剂量再给药3次，一共给药4次。

2)第9天开始测量肿瘤体积并记录，之后每周2次用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。以公式：(1/2) X长径X(短径)2计算肿瘤体积(见图9)。每只小鼠达到实验终点时(肿瘤体积超过2000mm³达到 仁慈终点)，颈椎脱臼法处死小鼠，记录生存曲线(图10)。

所有动物在给药和观察期存活，平均体重略有增加。与同型对照组相比，Anti-VEGFR2-TGFβR2 trap腹腔给药4次对B16-F1模型肿瘤生长有显著的抑瘤作用(TGI＝79.9％)，Anti-VEGFR2抗体单用组 TGI仅为42.9％，同时，R0469组有1只鼠肿瘤完全消退，而其他组则未观察到肿瘤完全消退的小鼠

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例” 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施 例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描 述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在 不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或 示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为 对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和 变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司

<120> 融合蛋白及其应用

<130> SI4210266

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Tyr Ser Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210> 9

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala

225 230

<210> 10

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Leu Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 12

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 14

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaggtgcagc tggtgcagag cggcggcggc ctggtgaagc ccggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacagca tgaactgggt gcgccaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcagca gcagcagcta catctactac 180

gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acgccaagaa cagcctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcgtgacc 300

gacgccttcg acatctgggg ccagggcacc atggtgaccg tgagcagcgc ctctaccaag 360

ggaccctctg tgtttcctct ggctccctcc agcaagtcta cctctggtgg aacagctgcc 420

ctgggctgcc tggtcaagga ttactttcct gagcctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 480

gctctgacat ctggcgtgca cacctttcca gctgtgctgc agtcctccgg cctgtactct 540

ctgtcctctg tcgtgaccgt gccttccagc tctctgggca cccagaccta catctgcaat 600

gtgaaccaca agccttccaa caccaaggtg gacaagagag tggagcccaa gagctgcgac 660

aagacccaca cctgcccccc ctgccccgcc cccgagctgg ccggcgcccc cagcgtgttc 720

ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagcc gcacccccga ggtgacctgc 780

gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840

gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgcgaggagc agtacaacag cacctaccgc 900

gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960

aaggtgagca acaagcagct gcccgccccc atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc 1020

cagccccgcg agccccaggt gtacaccctg ccccccagcc gcgacgagct gaccaagaac 1080

caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140

gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggacagcgac 1200

ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaaga gccgctggca gcagggcaac 1260

gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1320

agcctgagcc ccggcgccgg cggaggcggc agcggtggcg gtggcagcgg aggcggcggc 1380

agcggaggtg gaggcagcgg catccccccc cacgtgcaga agagcgtgaa caacgacatg 1440

atcgtgaccg acaacaacgg cgccgtgaag ttcccccagc tgtgcaagtt ctgcgacgtg 1500

cgcttcagca cctgcgacaa ccagaagagc tgcatgagca actgcagcat caccagcatc 1560

tgcgagaagc cccaggaggt gtgcgtggcc gtgtggcgca agaacgacga gaacatcacc 1620

ctggagaccg tgtgccacga ccccaagctg ccctaccacg acttcatcct ggaggacgcc 1680

gccagcccca agtgcatcat gaaggagaag aagaagcccg gcgagacctt cttcatgtgc 1740

agctgcagca gcgacgagtg caacgacaac atcatcttca gcgaggagta caacaccagc 1800

aaccccgact aa 1812

<210> 15

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc gtgagcgcca gcatcggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgcc gcgccagcca gggcatcgac aactggctgg gctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccagcaacc tggacaccgg cgtgcccagc 180

cgcttcagcg gcagcggcag cggcacctac ttcaccctga ccatcagcag cctgcaggcc 240

gaggacttcg ccgtgtactt ctgccagcag gccaaggcct tcccccccac cttcggcggc 300

ggcaccaagg tggacatcaa gagaactgtg gccgctccat ccgtcttcat ttttccccct 360

agcgacgaac agctgaagag tggcaccgcc tctgtggtct gtctgctgaa caatttctac 420

ccccgtgagg caaaggtgca gtggaaagtc gataacgccc tgcagtccgg aaatagccag 480

gagtctgtga cagaacagga cagtaaggat tcaacttatt ctctgtctag taccctgaca 540

ctgtctaaag ctgactacga gaagcacaaa gtgtatgcat gcgaagtcac ccatcagggg 600

ctgtcatccc ctgtgacaaa gtcctttaat cgcggtgaat gttaa 645

<210> 16

<211> 592

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp

20 25 30

Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn

35 40 45

Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

50 55 60

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

65 70 75 80

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

85 90 95

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

100 105 110

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

115 120 125

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

130 135 140

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

145 150 155 160

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

165 170 175

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val

180 185 190

Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile

195 200 205

Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser

210 215 220

Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His

225 230 235 240

Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys

245 250 255

Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp

260 265 270

Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu

275 280 285

Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe

290 295 300

Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser

305 310 315 320

Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu

325 330 335

Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe

340 345 350

His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser

355 360 365

Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala

370 375 380

His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile

385 390 395 400

Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu

405 410 415

Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr

420 425 430

Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg

435 440 445

Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val

450 455 460

Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp

465 470 475 480

Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu

485 490 495

Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met

500 505 510

Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe

515 520 525

Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu

530 535 540

Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala

545 550 555 560

Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser

565 570 575

Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

580 585 590

<210> 17

<211> 567

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

20 25 30

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

35 40 45

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

50 55 60

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

65 70 75 80

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

130 135 140

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu

145 150 155 160

Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu

165 170 175

Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn

180 185 190

Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys

195 200 205

Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg

210 215 220

Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu

225 230 235 240

Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala

245 250 255

Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu

260 265 270

Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys

275 280 285

Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile

290 295 300

Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln

305 310 315 320

Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr

325 330 335

Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser

340 345 350

Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys

355 360 365

Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn

370 375 380

Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu

385 390 395 400

Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser

405 410 415

Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser

420 425 430

Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr

435 440 445

Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val

450 455 460

Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu

465 470 475 480

His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly

485 490 495

Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met

500 505 510

Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg

515 520 525

Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu

530 535 540

Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp

545 550 555 560

Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

565

<210> 18

<211> 603

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

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195 200 205

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210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met

465 470 475 480

Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys

485 490 495

Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met

500 505 510

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530 535 540

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580 585 590

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595 600

<210> 19

<211> 603

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

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Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Leu Pro Leu Ala

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210 215 220

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275 280 285

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290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

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435 440 445

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Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met

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Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys

485 490 495

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580 585 590

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595 600

<210> 20

<211> 597

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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195 200 205

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210 215 220

Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val

245 250 255

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Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln

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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala

305 310 315 320

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325 330 335

Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala

340 345 350

Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu

355 360 365

Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr

370 375 380

Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr

385 390 395 400

Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe

405 410 415

Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys

420 425 430

Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro

450 455 460

His Val Pro Lys Ser Val Asn Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly

465 470 475 480

Gly Ala Val Lys Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu

485 490 495

Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr

500 505 510

Ala Ile Cys Glu Lys Pro His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys

515 520 525

Asn Asp Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu

530 535 540

Thr Tyr His Gly Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val

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595

<210> 21

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro

85 90 95

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

Claims (13)

1.一种融合蛋白，其特征在于，包括：靶向抗体以及TGFβ信号阻断因子，所述靶向抗体包括Fab区和Fc区，所述Fc区具有A327Q、G237A和L235A突变。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向抗体为靶向VEGF或VEGFRs的抗体；

任选地，所述VEGF包括选自VEGF-A、VEGF-B、PlGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-E、PlGF-2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、VEGF-A、VEGF-C、PlGF-2、VEGF-C、VEGF-D的至少之一；

任选地，所述VEGFRs包括选自VEGFR1、NRP-1、VEGFR2、NRP-2、VEGFR3的至少之一；

任选地，所述靶向抗体为靶向VEGFR2抗体；

任选地，所述靶向抗体特异性结合VEGFR的胞外区。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：

重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3，

轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:4～6；

任选地，所述靶向抗体含有分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列和分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；

任选地，所述靶向抗体具有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的重链可变区；

任选地，所述靶向抗体具有如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的轻链可变区。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向抗体含有重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包括所述Fc区，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一；

任选地，所述靶向抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体；

任选地，所述靶向抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG1。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc区具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向抗体具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链。

7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述TGFβ信号阻断因子为结合TGFβ或TGFβR的片段或抗体；

任选地，所述结合TGFβ的片段为TGFβRII胞外结构域；

任选地，所述TGFβRII胞外结构域具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白进一步包括连接肽，所述连接肽的N端与所述靶向抗体的C端相连，所述连接肽的C端与所述TGFβ信号阻断因子的N端相连；

任选地，所述连接肽的氨基酸序列具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

9.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～8任一项所述的融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸具有SEQ ID NO:14或15所示的核苷酸序列。

11.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～8任一项所述的融合蛋白、权利要求9或10所述的核酸分子。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括药物上可接受的载体。

13.权利要求1～8任一项所述的融合蛋白、权利要求9或10所述的核酸分子或权利要求11或12所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防血管增生性疾病或肿瘤。

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