CN113388638A - 一种同时结合TGFβ和VEGF的双靶点融合蛋白质粒的构建方法 - Google Patents
一种同时结合TGFβ和VEGF的双靶点融合蛋白质粒的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，步骤如下：设计并构建了融合蛋白、VEGFR‑1、TβR‑II基因和引物合成，PCR扩增；以pCI/Y2质粒为模板，设计引物，PCR扩增获得Fc基因；将Fc基因片段经重组PCR方法获得TF融合基因片段；对TF融合基因片段进行Nhe I和EcoR I双酶切，质粒pIRESpuro3用同一组酶进行双酶切，将两种酶切片段回收后进行连接反应，得到质粒pIRESpuro3/TF；对构建成功的pIRESpuro3/TF质粒进行BspE I和EcoR I双酶切，同时用同一组酶对已得到的融合基因片段进行双酶切，酶切片段回收后进行连接反应，得到质粒。本发明构建的质粒瞬转细胞后，得到所需融合蛋白，纯化后经鉴定均有良好的活性和亲和力，为后续研究和开发该类药物用于临床肿瘤治疗奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白工程技术领域，公开一种同时结合TGFβ和VEGF的双靶点融合蛋白质粒的构建方 法。
背景技术
选择性靶向治疗癌症，同时又要克服药物相关的副作用，仍是当今抗肿瘤药物研究的一个挑 战。某些蛋白在肿瘤细胞中过表达，使得肿瘤细胞从特征结构及生化等方面区别于正常生理细胞。 这种异于正常细胞的特性，可以使选择性受体优先被其配体识别，并作为抗癌靶向分子。其中， TGFβ和VEGF在肿瘤生长、发展与演变过程中发挥重要作用。
转化生长因子beta(transforming growth factor beta，TGFβ)家族通过与其受体结合，调控不同 的细胞演变进程，包括细胞的增殖、凋亡、分化、迁移、致瘤性和转移，对正常组织内环境的稳 定起重要作用。TGFβ是TGFβ超家族的成员，它是由超过30个密切相关的蛋白组成，包括骨形态发 生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、激活素、抑制素和节点家族等。在哺乳动物中， TGFβ主要有三种亚型，分别为TGFβ-1，TGFβ-2和TGFβ-3。TGFβ对多种肿瘤发生发展起重要作用， 因此阻断TGFβ信号传导成为肿瘤治疗有效途径。虽然TGFβ拮抗剂在不同类型癌症的治疗中取得了 一些显著性疗效，但其长期效率和潜在不良副作用仍有待确定。特别是，无法判断TGFβ拮抗剂是 否会阻断TGFβ在肿瘤中所有作用。目前，单靶点TGFβ治疗肿瘤还存在局限性，而联合用药或多靶 点抗肿瘤药物的研发，可弥补这一缺陷，协同或增强治疗效果，也是未来临床用药发展的新趋势。
血管内皮生长因子(Vascμlar endothelial growth factors，VEGFs)最初作为血管通透性因子 (vascμlar permeability factor，VPF)被发现，是一种由肿瘤细胞所分泌，能够增加血管通透性的 细胞因子。现在研究已表明，VPF属于一个由多个基因编码的多肽生长因子家族VEGFs，其主要 生物学功能包括调节胚胎发育中血液和淋巴血管生成、促进伤口的愈合和维持机体血管内环境的 稳定。过量或过少VEGF的产生都会使血管或淋巴管生成失衡，并导致许多疾病。VEGFs家族由 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(placenta growth factor，P1GF) 组成，其中VEGF-A，VEGF-B、VEGF-C和P1GF为哺乳动物血管形成所必须，而VEGF-C和-D 主要调节淋巴管的形成。VEGF在人体多种肿瘤中都存在过表达。TGFβ信号转导通路不仅使肿瘤 细胞上皮-间充质转化(EpithelialMesenchymalTransition)，免疫抑制，还能协同VEGF促肿瘤血 管形成，加速肿瘤发展、扩散和转移。单一应用阻断TGFβ信号通路的单克隆抗体，在临床I期实 验中其疗效虽已得到证实，但安全性和不良反应都还有待确定，而VEGF及其受体阻断剂已有报 道其严重的不良反应。
发明内容
为解决现有技术的问题，本发明采用基因和生物工程技术将TβR-II的胞外结构域与VEGFR-1 的胞外段第2结构域以及IgG1的Fc段核苷酸序列相连，构建了一种能够表达同时靶向TGFβ和 VEGF的融合蛋白的质粒。通过在真核细胞的瞬转表达融合蛋白，初步研究了它们与TGFβ和VEGF 的亲和力以及生物活性。为进一步在细胞及动物体上实验研究药效奠定了基础。
本发明通过以下技术方案进行实现：
一方面，本发明提供一种能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，具 体步骤如下：
步骤一：设计并构建了不同构型的融合蛋白、VEGFR-1、TβR-II基因和引物合成，并进行PCR扩增；
步骤二：以pCI/Y2质粒为模板，设计引物，进行PCR扩增获得Fc基因；
步骤三：将Fc基因片段经重组PCR方法获得TF融合基因片段；
步骤四：对TF融合基因片段进行Nhe I和EcoR I双酶切，质粒pIRESpuro3用同一组酶进行双酶切， 将两种酶切片段回收后进行连接反应，得到质粒pIRESpuro3/TF；
步骤五：对构建成功的pIRESpuro3/TF质粒进行BspE I和EcoR I双酶切，同时用同一组酶对已 得到的融合基因片段进行双酶切，酶切片段回收后进行连接反应，得到质粒。
进一步地，所述融合蛋白分别为TβR-II-VEGFR-1-Fc、Fc-VEGFR-1-TβR-II、 TβR-II-Fc-VEGFR-1、VEGFR-1-Fc-TβR-II、TβR-II-Fc和VEGFR-1-Fc(分别简写为TVF、FVT、TFV、VFT、TF和VF)。
进一步地，所述PCR扩增的引物有：
进一步地，所述融合基因片段分别为VF、TVF、FVT、TFV和VFT。
进一步地，所述质粒分别为pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、pIRESpuro3/TFV、pIRESpuro3/VFT和pIRESpuro3/VF。
进一步地，所述酶切片段与载体pIRESpuro3连接，培养获得质粒。
进一步地，所述步骤五构建好的重组质粒瞬转HEK293细胞进行蛋白表达，并比较几种不同构 型蛋白的表达量，用以进行后续实验。
进一步地，所述不同构型蛋白分别为TF、VF、TVF、FVT、TFV和VFT蛋白。
进一步地，所述不同构型蛋白通过Protein A亲和层析法纯化获得融合蛋白TF、VF、TVF、FVT、 TFV和VFT，并利用SDS-PAGE和Western Blot鉴定纯化产物的分子量及纯度。
进一步地，所述融合蛋白采用酶联免疫吸附法对其活性以及与其配体的结合能力进行了评价 与分析。
本发明采用基因合成TβR-II和VEGFR-1序列，用PCR扩增构建TβR-II-Fc、VEGFRI-Fc、 TβR-II-VEGFRI-Fc、Fc-VEGFRI-TβR-II、TβR-II-Fc-VEGFRI和VEGFRI-Fc-TβR-II重组基因片段。 然后，分别将这六种基因分别插入表达载体pIRESpuro3中，获得重组表达质粒pIRESpuro3/TV、 pIRESpuro3/FV、pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、pIRESpuro3/TFV和pIRESpuro3/VFT。将上 述表达质粒转化至宿主菌XL-blue1，筛选高效率转化子，摇瓶培养，抽提质粒，酶切鉴定，并送 样测序验证。最后，瞬转细胞表达蛋白TF、VF、TVF、TFV、VFT和FVT。用ELISA测定各自的 表达量，亲和层析法纯化蛋白，并通过SDS-PAGE和Western Blot对纯化产物的分子量及纯度进 行鉴定，通过配体受体亲和力实验验证各蛋白的活性。
相对于现有技术，本发明提供的技术方案具备有益效果如下：本发明以构建一种同时结合TGFβ 和VEGF的双靶点融合蛋白，同时阻断TGFβ和VEGF及其信号通路，达到治疗目的。为实现该目的，构建 了多种不同分子构型且能够同时结合TGFβ和VEGF的双靶点融合蛋白，从蛋白表达量、与靶蛋白结合 能力以及蛋白生物活性方面对这几种不同构型融合蛋白进行了评估，筛选出最佳分子组合的融合 蛋白。
(1)本发明通过成功构建重组表达质粒pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、pIRESpuro3/TFV、pIRESpuro3/VFT、pIRESpuro3/VF、pIRESpuro3/TF。
(2)质粒瞬转HEK293细胞表达目的蛋白，收集的细胞培养上清，纯化得到融合蛋白TF、 VF、TVF、FVT、TFV、VFT，并鉴定了蛋白的分子量以及测定其浓度，纯化后经鉴定均有良好的 活性和亲和力。
(3)利用ELISA方法对蛋白的活性以及与其配体亲和力进行了初步分析。六种蛋白与配体 (Tβ1、VEGF165和VEGF-B)都有良好的亲和力，且同时靶向Tβ1和VEGF-B无显著性差异。
综上所述，本发明完成了六种不同构型融合蛋白TVF、TFV、VFT、FVT、TF、VF的构建，并且初步鉴定了融合蛋白的活性，表达量比较结果显示，TVF构型融合蛋白表达量显著性高于TFV、 VFT和FVT构型蛋白，为后续研究和开发该类药物用于临床肿瘤治疗奠定了基础，为后续融合蛋 白体内体外实验提供了材料。
附图说明
图1 TβR-II、VEGFR-1、Fc基因片段PCR扩增产物
图2 TF、VF、TVF、FVT、TFV、VFT基因片段PCR产物
图3 pIRESpuro3/TF、pIRESpuro3/VF、pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、pIRESpuro3/TFV、 pIRESpuro3/VFT酶切产物
图4融合蛋白TF、VF、TVF、FVT、TFV、VFT的HEK293细胞培养上清不同时间点的表达量
图5 SDS-PAGE检测；NC：HEK293细胞上清纯化后的蛋白M：Protein Ladder Mix
图6 Western Blot检测；NC：HEK293细胞上清纯化后的蛋白M：Protein LadderMix
图7融合蛋白的浓度
图8 ELISA检测纯化后融合蛋白与VEGF-B亲和力
图9 ELISA检测纯化后融合蛋白与TGF-β1亲和力
图10 ELISA检测TVF与双靶点结合的差异
图11 ELISA检测TVF与双靶点结合的差异
图12 ELISA检测TFV与双靶点结合的差异。
具体实施方式
以下实施例旨在说明本发明内容，而不是对本发明保护范围的进一步限定。
实施例1融合蛋白的构建
1.实验试剂的配制
(1)羧苄青霉素(100mg/ml)：称取1g羧苄青霉素钠盐，加入8ml ddH2O，轻轻混匀后静置3h，待完全溶解再加2ml ddH2O定容至10ml。在超净台内用0.22μm滤头过滤后用1.5m1无菌EP 管分装，1ml/管，保存在-20℃备用。
(2)LB培养基(1L)：秤取胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g， NaCl 10g的粉末加入800ml ddH2O溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.4，再加入200ml ddH2O定容至 1L，用高压灭菌锅灭菌20min，冷却后，放4℃保存备用。LB固体培养基：向1L的LB液体培养基中 加入10到15g琼脂粉即配成固体LB培养基，用高压灭菌锅灭菌20min，4℃保存备用。
(3)含羧苄青霉素的LB培养平板：向1L的LB液体培养基中加入10到15g琼脂粉即配成固体 LB培养基，用高压灭菌锅灭菌20min，4℃保存备用。取出150ml培养基，加热后室温冷却至50-60℃， 加入150μl Car，充分混匀后，将20ml培养基慢慢倒入平板，待冷却后置于4℃保存备用。
(4)1％琼脂糖凝胶配制：称取琼脂糖0.5g，将其溶解于50ml 1×TAE中，置于微波炉中加 热3次，使其充分溶解后，加入GelRed(1∶10000)，倒入插好梳子的凝胶板中，室温冷却20min， 凝固方可使用。
(5)MEM完全培养基配制：取无菌opti MEM Medium 500ml，加入10％的FBS、1％的谷 氨酰胺和1％的双抗。
(6)CD opti-CHO培养基配制(2L)：称取CD opti-CHO Medium粉末38.64g，溶于1800ml 的ddH2O中，调PH值至7.2-7.4后，用ddH2O定容至2L，在无菌超净台内用0.22uM滤膜过滤，4℃保 存。
(7)细胞冻存液：50％FBS(胎牛血清)+40％完全培养基+10％DMSO(二基亚砜)。
(8)PBS缓冲液：称NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，溶于900ml ddH2O中，调pH值至7.4，定容至1L，高压灭菌，4℃保存。
(9)PBST缓冲液(ELISA洗涤液)：含0.05％Tween20的pH7.4 PBS缓冲液。
(10)0.05M碳酸盐缓冲液(ELISA包被液)：称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g，溶于800mlddH2O中，调pH值至9.6，加水定容止1L，4℃保存。
(11)3％BSA(ELISA封闭液)：牛血清白蛋白3g，加入100ml ddH2O中溶解。
(12)1％BSA(ELISA稀释液)：牛血清白蛋自1g，100ml PBS溶解完全即可。
(13)2M H2SO4(EILSA终止液)：用186ml ddH2O稀释10ml 98％H2SO4。
2.合成基因片段的序列来源
TβR-II基因序列来源于Gene Bank：M85079
VEGFR-1基因来源于NCBI Reference Sequence：NP_001153392.1
信号肽序列来源于pDisplayTM Vector
3.实验所需引物
根据实验设计，本发明中合成的PCR引物
4实验方法
4.1质粒构建
4.1.1TF、VF、TVF、FVT、TFV、VFT片段的获得
以金唯智生物科技有限公司合成的TβR-II-pUC57质粒、VEGFR-l-pUC57质粒及本发明构建保 存的Y2-pCI质粒为模板，通过PCR扩增获得目的基因TβR-II、VEGFR-1、Fc，电泳并切胶回收，然 后通过PCR连接获得TF、VF、TV和FT片段，电泳并切胶回收DNA片段，再通过PCR连接得到需要 的目的基因片段TVF、FVT、TFV和VFT，电泳切胶回收并保存。
(1)PCR扩增TβR-II、VEGFR-1、Fc体系如下：
(2)PCR连接TF、VF、TV、FT片段体系如下：
(3)PCR连接TVF、FVT、TFV、VFT片段的体系如下：
(4)DNA片段的回收：
a、Agarose gel的配制：称取琼脂糖4.0g，加入TAE 40ml，放入微波炉中加热溶解，待其充分 溶解后，再加入4μl的GelRedTM后，轻轻晃动混匀，倒入已插好梳子的凝胶板中，待混合液冷却凝 固便可使用。
b、电泳上样：将待检测PCR产物与6×loading buffer混匀，按一定顺序加入加样孔中，大约40min 后从电泳仪中拿出。从凝胶成像仪中判断电泳结果并保存拍照。
c、片段回收：在凝胶成像仪中，将目的条带切下，放入已知体重2ml EP管中称重后，算出凝 胶体积，用Axygen胶回收试剂盒进行回收。最后将回收的DNA溶液放在-20℃保存。
4.1.2质粒pIRESpuro3/TF、pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、pIRESpuro3/TFV、pIRESpuro3/VFT、pIRESpuro3/VF的构建：
Nhe I、EcoR I双酶切pIRESpuro3载体和TF的PCR连接片段，酶切完全后过柱纯化，用T4 连接酶将切开的片段TF与载体pIRESpuro3连接。转化酶连产物至Xl-blue1宿主菌后涂板，37℃ 培养过夜。然后挑取转化子，220rpm、37℃培养过夜，收集菌液，抽提质粒，进行酶切鉴定，并 送样测序。用BspEI和EcoRI双酶切已构建成功的TF/pIRESpuro3质粒及TFV、VFT、FVT、TVF、 V的PCR产物，酶切完全后过柱纯化，用T4连接酶将切开的片段TFV、VFT、FVT、TVF、V与 质粒TF/pIRESpuro3连接。转化酶连产物至Xl-blue1宿主菌后涂板，37℃培养过夜。然后挑取转 化子，220rpm、37℃培养过夜，收集菌液，抽提质粒，进行酶切鉴定，并送样测序。
(1)NheI、EcoRI双酶切pIRESpuro3载体和TF片段的酶切体系：
(2)T4连接酶连接TF片段与载体pIRESpuro3的连接体系：
| 50μl | |
| EcoR I和Nhe I双酶切回收的TGFβRII-Fc | 21 |
| EcoRI和Nhe I双酶切回收的pIRESpuro3 | 16 |
| 10×ligase buffer | 5 |
| T4 ligase | 4 |
| ddH<sub>2</sub>O | 4 |
室温连接2h
(3)BspE I和EcoR I双酶切TF/pIRESpuro3质粒和TVF、FVT、VFT、VF和TFV片段的酶切体系：(37℃酶切2h)
(4)T4连接酶连接VF、TVF、FVT、TFV和VFT片段与质粒TF/pIRESpuro3的连接体系：(室温连接2h)
(5)转化连接产物
准备好100μl Xl-blue1感受态细胞，置于冰上备用。转化时，将10μl连接产物加入感受态细胞中， 在冰上放置30min，42℃热激90s后，放回冰上5分钟，再加入1ml LB培养基，放入220rpm、37℃摇 床中振荡培养30分钟后，涂板于含有的ampicillin的LB平板上，220rpm、37℃培养过夜。
(6)质粒的小量抽提
a、取1-4ml在LB培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少)， 12,000×g离心1min，弃尽上清；
b、加250μl Buffer S1使悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；
加250μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶 液。此步骤不宜超过5min；
c、加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min；
d、吸取步骤d中的离心上清并转移到制备管中(置于2ml离心管(试剂盒内提供)中)12，000×g 离心1min，弃滤液；
e、将制备管置回离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心1min，弃滤液；
f、将制备管置回离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心1min，弃滤液，以同样的方法再 用700μl Buffer W2洗涤一次，弃滤液；
g、将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min，弃滤液；
h、将制备管移入新的1.5ml离心管中(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加60-80μl Eluent或 去离子水，室温静置1分钟，12,000×g离心2分钟；
(7)用Nhe I、EcoR I对已构建完成的质粒pIRESpuro3/TF、pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、pIRESpuro3/TFV、plRESpuro3/VFT和pIRESpuro3/VF进行双酶切验证(37℃ 酶切2h)，酶切体系如下：
5转染以及表达量比较
5.1转染
(1)HEK293细胞的培养
复苏HEK293细胞后，添加10％胎牛血清、1％谷氨酰胺和1％双抗的opti MEMMedium完全 培养基培养。当细胞处于对数生长准备转染(培养条件37℃，5％CO2)。
(2)用Lipofectamine 2000瞬转质粒pIRESpuro3/TF、pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、 pIRESpuro3/TFV、pIRESpuro3/VFT、pIRESpuro3/VF
a)转染前1天，用红血球计数板进行细胞计数，Trypan Blue染色检测细胞存活率(应大于 99％)，铺于6孔板中(细胞密℃应为1×106cell/孔)。
b)转染前半小时用Opti-
Reduced Serum Medium换液，放回培养箱继续培养。然后用 250μl的Opti-
Reduced Serum Medium稀释4.0μg质粒，轻轻混匀后，室温静置5min。
c)Lipofectamine 2000用10μl的Opti-
Reduced Serum Medium稀释，轻轻混匀后，室 温静置5min。
d)5min过后，将稀释后的Lipofectamine 2000加入稀释后的DNA中轻轻混合，室温静置20 min。
e)将DNA/PH(250μl+250μl)混合物加入已铺好细胞的6孔板中，来回混匀，然后将皿放 回培养箱，静置培养。
f)转染4h后将6孔板中的培养基用不含血清，含双抗、谷氨酰胺的新鲜opti-
Medium 换掉，继续培养。
5.2表达量的比较
用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测每种蛋白的表达情况。分别收取转染72h、96h、120h、144h、 168h后的细胞培养上清4℃，4000rpm离心10min回收待用。
双抗体夹心酶联免疫吸附法：
a、提前1天用碳酸盐缓冲液(0.05M CBS，pH9.6)稀释anti-Fc单抗(01-10-20)到4μg/ml 包被酶标板，放在4℃。
b、移除包被液，用3％BSA封闭(37℃孵箱中孵育2h，100μl/孔)，用PBST(含0.05％Tween20) 洗涤3次。
c、按梯度(500倍、1000倍、2000倍)加入用1％BSA稀释的样品TF、VF、TVF、FVT、TFV、VFT以及按梯度(8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0.5ng/ml、0.125ng/ml、0.0625ng/ml) 稀释的FC标品(37℃孵箱中孵育1h，50μl/孔)，用PBST(含0.05％Tween20)洗涤3次。
d、加入用1％BSA稀释的HRP-anti-human Fc(1∶50000)(37℃孵箱中孵育1h，50μl/孔)， 用PBST(含0.05％Tween20)洗涤6次，再用ddH2O洗涤2次。
e、加入TMB避光显色，用2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450的数值，并进行分析。
实验结果：
质粒的构建
(1)将合成基因TβR-II(472bp)、VEGFR-1(304bp)、Fc(680bp)进行PCR扩增，扩增后电泳 结果显示与预期相符。(如图1)
(2)以扩增后的基因TβR-II、VEGFR-1和Fc为模板，通过重叠PCR方法连接构建TF、VF、 TVF、FVT、TFV、VFT不同构型的基因。片段理论值大小分别为1225bp、1090bp以及1557bp为PCR产物的电泳结果显示与预期相符，如图2所示。
(3)NheI和EcoRI双酶切验证重组质粒pIRESpuro3/TF(5171bp+1225bp)，pIRESpuro3/VF (5171bp+1090bp)，pIRESpuro3/TVF(5171bp+1557bp)，pIRESpuro3/FVT(5171bp+1557bp)， pIRESpuro3/TFV(5171bp+1557bp)，pIRESpuro3/VFT(5171bp+1557bp)酶切产物电泳结果(如 图3)。
(4)pIRESpuro3/TF、pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、pIRESpuro3/VFT、pIRESpuro3/VF 质粒测序结果，经DNAMAN软件比对，没有发生碱基突变，TF/pIRESpuro3载体构建成功。 pIRESpuro3/TFV测序结果经DNAMAN软件比对，第1196位碱基由G突变为A，但其编码的氨 基酸没有发生突变，因此，TFV/pIRESpuro3载体构建成功。
6表达量比较
将六种不同构型融合蛋白转染HEK293细胞后，分别收取第72h、96h、120h、144h、168h的 细胞培养上清，用Anti-Fc抗体包被酶标板，测得每种融合蛋白的表达情况。(如图4)
本实施例成功构建质粒pIRESpuro3/TF、pIRESpuro3/VF、pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、 pIRESpuro3/TFV及pIRESpuro3/VFT，并选择用HEK293细胞进行转染，因为HEK293细胞极少表 达细胞外配体所需的内生受体，易转染，且转染效率可达90％左右，有利于目的蛋白表达、纯化。
理论上，瞬转72h-96h后，蛋白表达量最高，所以分别收集了转染后72h、96h、120h、144h、 168h的细胞上清，并且用Antibody To Human IgG(Fc)(01-10-20)抗体包被酶标板，本实验室 制备的Fc蛋白作为标准品，用双抗体夹心法ELISA对收集的细胞上清中蛋白表达量进行了比较， 发现目的蛋白在转染后第120h和144h时表达量相对较高，且TVF是几种不同构型融合蛋白中表 达量最高。
实施例2融合蛋白的纯化与活性鉴定
1.实验试剂的配制方法
(1)10％(W/V，g/ml)过硫酸铵(APs)的配制(1ml)：称取0.1g过硫酸铵，加入1ml的ddH2O， 将固体粉末彻底溶解，贮存于4℃备用。
(2)1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)：用90ml的ddH2O完全溶解Tris(MW 121.14)18.15g后，用 HCl调pH值至8.8，最后用ddH2O定容至100ml，4℃保存。
(3)1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)：用90ml的ddH2O完全溶解Tris(MW121.14)12.10g后，用HCl 调pH值至6.8，最后用ddH2O定容至100ml，4℃保存。
(4)10％SDS：称取SDS粉末10g，加ddH2O至100ml，置于50℃水浴溶解，室温保存。
(5)TBS缓冲液：称取Tris粉末2.42g和氯化钠29.2g，加入900ml的ddH2O，将固体粉末完全溶 解后，用HCl调pH值至7.5，最后用ddH2O定容至1L，4℃存放备用。
(6)2×Loading Buffer：(5m1)
(7)5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制(1L)：
| Tris粉末 | 15.1g | |
| Glycine(甘氨酸) | 94g | |
| 10％SDS | 50ml | |
| ddH<sub>2</sub>O | 1L | |
| 4℃保存备用 |
(8)1×转膜缓冲液：(1L)
| Tris粉末 | 3.03g | |
| Glycine(甘氨酸) | 14.4g | |
| 甲醇 | 200ml | |
| ddH<sub>2</sub>O | 1L | |
| 4℃保存备用 |
(9)TBST洗脱液：(500ml)
| TBS缓冲液 | 500ml | |
| Tween-20 | 0.5ml | |
| 4℃保存备用 |
(10)Western Blot封闭液：(10ml)
| 脱脂奶粉 | 0.5g | |
| TTBS | 10ml | |
| 4℃保存备用 |
2实验方法
2.1融合蛋白的纯化
2.1.1融合蛋白的大量制备
(1)HEK293细胞的扩大培养
选择复苏后5代之内生长情况良好的HEK293细胞放大到3个T225培养瓶中，待细胞占T225瓶底 80％时，传代至8个T225中。约3天后后，细胞占瓶底90％时，准备转染。(培养条件37℃，5％CO2)
(2)大量细胞转染
转染前1d，选择处于对数生长期的细胞用胰酶消化离心、计数。以1.1×107cell/皿密度铺于15cm2皿中。转染时，用无血清培养基分别将质粒和PEI稀释，然后将稀释后的PEI加入稀释后的质粒中， 20分钟后加入已铺好细胞的皿中，放回37℃、5％CO2孵箱中，4h后将培养基换为CD opti-
Medium继续培养。
2.1.2 Protein A亲和层析法纯化蛋白TF、VF、TVF、TFV、FVT、VFT
(1)蛋白样品处理：12，000rpm，4℃，离心10min，取上清。
(2)准备AKTA纯化仪器。
(3)连接纯化管路。
(4)用10倍体积的水以1ml/min清洗proteinA柱。
(5)用5-10倍平衡液(20mM Na2HPO3，150mM NaCl，pH 7.0)平衡1ml/min proteinA柱，至基 线平稳。
(6)将处理后的蛋白样品按1ml/min流速上样，收集流穿液。
(7)用5-10倍洗涤液(20mM Na2HPO3，150mM NaCl，pH 7.0)洗涤1ml/min proteinA柱，至基线 平稳，收集洗涤液。
(8)用洗脱液(0.1M甘氨酸盐酸缓冲液，pH3.0)洗脱结合的蛋白；用含有50μl中和液(1M Tris， pH 9.0)的EP管，按峰型分管收集洗脱液。
(9)5-10倍平衡液(20mMNa2HPO3，150mMNaCl，pH 7.0)清洗proteinA柱。
(10)5-10倍脱气后的水清洗proteinA柱。
(11)用20％的乙醇保存protein A柱。
2.1.3 SDS-PAGE及Western Blot鉴定纯化后蛋白TF、VF、TVF、TFV、FVT、VFT。
(1)配制两块12％分离胶的SDS-PAGE。
(2)根据Elisa测定的浓度调整六种蛋白浓度至70ng/ml，并分别用不含还原剂的loading buffer 和含有还原剂的loading buffer处理蛋白。
(3)按350ng/well蛋白的量进行上样。
(4)100V电压跑浓缩胶；150V跑分离胶。
(5)电泳结束后，一块胶用考马斯亮蓝R-250染液进行染色，并用脱色液进行脱色处理；另 一块胶用NC进行转膜(300mA，90min)。
(6)转膜结束后，用5％奶粉溶液封闭1h。
(7)用PBST洗涤膜3次(5min/次)。
(8)加入5％奶粉溶液稀释的HRP-Anti-human Fc(1：25000)，室温反应1h。
(9)用PBST洗涤膜3次(10min/次)。
(10)用TMB溶液显色。
2.1.4 ELISA测定纯化后融合蛋白的量
(1)提前1d用碳酸盐缓冲液(0.05M CBS，pH9.6)稀释anti-Fc单抗(01-10-20)到4μg/ml 包被酶标板，4℃过夜。
(2)移除包被液，用3％BSA封闭(37℃孵箱中孵育2小时，100μl/孔)，用PBST(含0.05％ Tween20)洗涤3次。
(3)按梯度(500倍、2500倍、10000倍)加入用1％BSA稀释的样品TF、VF、TVF、FVT、TFV、VFT以及按梯度(20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.3125ng/ml、 0.15625ng/ml、0ng/m1)稀释的FC标品(37℃孵箱中孵育1小时，50μl/孔)，用PBST(含0.05％ Tween20)洗涤3次。
(4)加入用1％BSA稀释的HRP-anti-human Fc(1∶50000(37℃孵箱中孵育1小时，50μl/ 孔)，用PBST(含0.05％Tween20)洗涤6次，再用ddH2O洗涤2次。
(5)加入TMB避光显色，用2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450的数值，并进行分析。
2.2融合蛋白的活性鉴定
2.2.1 ELISA鉴定蛋白TVF、TFV、FVT、VFT、VF与配体Vb的结合能力。
(1)用碳酸盐缓冲液(0.05M CBS，pH9.6)稀释Vb因子浓度至5.12ug/ml，按25μl/well包被酶 标板，4℃过夜(阴性对照：不包被Vb因子)。
(2)移除包被液，用3％BSA封闭(37℃孵箱中孵育2小时，100μl/孔)，然后用PBST(含 0.05％Tween20)洗涤3次。
(3)用1％BSA按梯度(2000nM、1000nM、500nM、250nM、83.33nM、27.78nM、9.26nM、3.09nM、1.03nM、0.34nM、0)分别稀释TVF、TFV、FVT、VFT及VEGFRI五种蛋白(如下表，按 50μl/well加入上述Elisa板，37℃孵育1h)，用PBST(含0.05％Tween20)洗涤3次。
(4)用1％BSA稀释的HRP-anti-human Fc(1∶50000)(37℃孵箱中孵育1小时，50μl/孔)。移 除包被液，PBST洗涤6次，再用ddH2O洗涤2次。
(6)加入TMB避光显色，用2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450的数值，并进行数据 处理。
2.2.2 ELISA鉴定蛋白TVF、TFV、FVT、VFT、TF与配体Tβ1结合力。
(1)用碳酸盐缓冲液(0.05M CBS，pH9.6)分别稀释TVF、TFV、FVT、VFT及TβRII五种蛋 白稀释至浓度2ug/ml。如下表设计按25μl/well包被酶标板，4℃过夜(阴性对照：不包板蛋白)。
(2)移除包被液，用3％BSA封闭(37℃孵箱中孵育2小时，100μl/孔)，然后用PBST(含 0.05％Tween20)洗涤3次。
(3)用1％BSA按梯度(50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、 0.78125ng/ml、0.390625ng/ml、0.195313ng/ml、0.097656ng/ml、0)稀释Tβ1因子，按50μl/well 加入上述Elisa板，37℃反应1h，然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤3次。
(4)加入用1％BSA稀释的生物素-anti-Tβ1(0.2ug/ml)(37℃孵箱中孵育1小时，50μl/孔)， 然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤5次。
(5)加入用1％BSA稀释的HRP-anti生物素(1∶2000)(37℃孵箱中孵育45分钟，50μl/孔)， 然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤6次，再用ddH2O洗涤2次。
(6)加入TMB避光显色，用2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450的数值，并进行数 据处理。
2.2.3 ELISA鉴定蛋白TVF在结合Tβ1因子前提下对结合VEGF165因子的影响。
(1)用碳酸盐缓冲液(0.05M CBS，pH 9.6)将TVF蛋白稀释至浓度2ug/ml。如下表设计按 25μl/well包被酶标板，4℃过夜(阴性对照：不包板蛋白)。
(2)移除包被液，用3％BSA封闭(37℃孵箱中孵育2小时，100μl/孔)，然后用PBST(含 0.05％Tween20)洗涤3次。
(3)加入10ng/ml浓度的Tβl因子，37℃反应1小时，然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤 3次。
(4)用1％BSA按梯度(10000ng/ml、3333.33ng/ml、1111.11ng/ml、37.37ng/ml、123.46ng/ml、 41.15ng/ml、13.72ng/ml、4.57ng/ml、1.52ng/ml、0.516ng/ml、0)稀释VEGF165因子，并按50μl/well 加入上述Elisa板，37℃反应1h，，然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤5次。
(5)加入用1％BSA稀释的生物素-anti-VEGF165(0.2ug/m1)(37℃孵箱中孵育1小时，50μl/ 孔)，然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤5次。
(6)加入用1％BSA稀释的HRP-anti生物素(1∶2000)(37℃孵箱中孵育45分钟，50μl/孔)， 然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤6次，再用ddH2O洗涤2次。
(7)加入TMB避光显色，用2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450的数值，并进行数 据处理。
2.2.4 ELISA鉴定蛋白TVF、TFV在结合Vb因子前提下对结合Tβ1因子的影响。
(1)用碳酸盐缓冲液(0.05M CBS，pH 9.6)将TVF、TFV两种蛋白稀释至浓度2ug/ml。如 下表设计按25μl/well包被酶标板，4℃过夜(阴性对照：不包板蛋白)。
(2)移除包被液，用3％BSA封闭(37℃孵箱中孵育2小时，100μl/孔)，然后用PBST(含 0.05％Tween20)洗涤3次。
(3)加入10ug/ml浓度的VB因子，37℃反应1小时，然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤 3次。
(4)用1％BSA按梯度(50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、 0.78125ng/ml、0.390625ng/ml、0.195313ng/ml、0.097656ng/ml、0)稀释Tβ1因子，并按50μl/well 加入上述Elisa板，37℃反应1h，，然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤5次。
(5)加入用1％BSA稀释的生物素-anti-Tβ1(0.2ug/ml)(37℃孵箱中孵育1小时，50μl/孔)， 然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤5次。
(6)加入用1％BSA稀释的HRP-anti生物素(1∶2000)(37℃孵箱中孵育45分钟，50μl/孔)， 然后用PBST(含0.05％Tween20)洗涤6次，再用ddH2O洗涤2次。
(7)加入TMB避光显色，用2M H2SO4终止显色，用酶标仪读取OD450的数值，并进行数 据处理。
3实验结果
3.1融合蛋白纯化后，SDS-PAGE及Western Blot电泳结果
(1)融合蛋白FVT(54kDa)、VFT、TFV、TVF、TβRII-Fc(42kDa)、VEGFR1-Fc(37kDa) 用Protein亲和层析法纯化后，SDS-PAGE(如图5)及Western Blot(如图6)电泳鉴定其分子量大小较理论值偏大，究其原因可能是蛋白在表达过程中进行了修饰，如：糖基化等。
(2)细胞培养上清经ProteinA亲和层法纯化后，得到融合蛋白FVT、VFT、TFV、TVF、TF、 VF。ELISA测得的融合蛋白的量(如图7)
3.2融合蛋白活性鉴定结果
(1)ELISA检测融合蛋白VF、TVF、FVT、TFV、VFT与其配体VEGF-B亲和力。(如图8)
| VF | TVF | FVT | TFV | VFT | |
| IC50(nM) | 66.22 | 116.02 | 84.93 | 23.88 | 67.73 |
(2)ELISA检测融合蛋白VF、TVF、FVT、TFV、VFT与其配体TGF-β1亲和力。(如图9)
| TF | TVF | FVT | TFV | VFT | |
| IC50(pM) | 181.44 | 159.04 | 168.31 | 191.04 | 165.33 |
(4)ELISA检测TVF在结合Tβ1因子的前提下结合VEGF165的结果验证。(如图10)
| no Tβ1 | add Tβ1 | |
| IC50(nM) | 10.049 | 12.99006 |
(5)ELISA检测TVF(如图11)和TFV(如图12)在结合因子VB的前提下结合Tβ1的结果验证。
| no Vb | add Vb | |
| IC50[pM] | 111.98 | 156.06 |
本发明通过将构建的质粒大量瞬转HEK293细胞表达目的蛋白，收集细胞培养上清，纯化得 到融合蛋白TF、VF、TVF、FVT、TFV和VFT。用SDS-PAEG和Western Blot鉴定纯化后的蛋白 分子量和纯度，其值与理论大小相符，并测定了蛋白的浓度。然后用ELISA对纯化后的融合蛋白 的活性以及与其配体亲和力进行了初步分析，结果显示，这六种蛋白与其配体结合率在一定范围 内随着配体浓度升高，且蛋白活性越强，并且靶向结合TGFβ和VEGF无显著性差异。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本 发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不 偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军西部战区总医院
<120> 一种同时结合TGFβ和VEGF的双靶点融合蛋白质粒的构建方法
<130> 2021
<141> 2021-03-22
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cggcctagct agcatggaga cagacacact cctgc 35
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
catcgccaga ctaacactat tggaggagga agtggaggag gaagtggagg aggaagtact 60
attcctcctc atgtccagaa 80
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tccactggtg actccggaac tattcctcct catgtccaga a 41
<210> 4
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tccctgtctc cgggtaaagg aggaggaagt ggaggaggaa gtggaggagg aagtactatt 60
cctcctcatg tccagaa 77
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atcggggttg gaagtgttat ac 22
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgcccggaat tcttatcatt gaaatatgac tagcaacaaa tcggggttgg aagtgttata 60
c 61
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ttgaaatatg actagcaaca aatcggggtt ggaagtgtta tac 43
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
acttccaacc ccgatggagg aggaagtgga ggaggaagtg gaggaggaag tatggggcgt 60
ccttttgtc 69
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tccactggtg actccggaat ggggcgtcct tttgtc 36
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tccctgtctc cgggtaaagg aggaggaagt ggaggaggaa gtggaggagg aagtatgggg 60
cgtccttttg tc 72
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aatagtgtta gtctggcgat gg 22
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tgcccggaat tcttatcaaa tagtgttagt ctggcgatgg 40
<210> 13
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
cagactaaca ctattggagg aggaagtgga ggaggaagtg gaggaggaag tgacaaaact 60
cacacatgcc c 71
<210> 14
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
acttccaacc ccgatggagg aggaagtgga ggaggaagtg gaggaggaag tgacaaaact 60
cacacatgcc c 71
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tccactggtg actccggaga caaaactcac acatgccc 38
<210> 16
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ttgctagtca tatttcaagg aggaggaagt ggaggaggaa gtggaggagg aagtgacaaa 60
actcacacat gccc 74
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cccggaattc ttatcattta cccggagaca ggg 33
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
tttacccgga gacagggag 19
Claims (10)
1.一种能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，具体步骤如下：
步骤一：设计并构建了不同构型的融合蛋白、VEGFR-1、TβR-II基因和引物合成，并进行PCR扩增；
步骤二：以pCI/Y2质粒为模板，设计引物，进行PCR扩增获得Fc基因；
步骤三：将Fc基因片段经重组PCR方法获得TF融合基因片段；
步骤四：对TF融合基因片段进行NheI和EcoRI双酶切，质粒pIRESpuro3用同一组酶进行双酶切，将两种酶切片段回收后进行连接反应，得到质粒pIRESpuro3/TF；
步骤五：对构建成功的pIRESpuro3/TF质粒进行BspEI和EcoRI双酶切，同时用同一组酶对已得到的融合基因片段进行双酶切，酶切片段回收后进行连接反应，得到质粒。
2.根据权利要求1所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述融合蛋白分别为TβR-II-VEGFR-1-Fc、Fc-VEGFR-1-TβR-II、TβR-II-Fc-VEGFR-1、VEGFR-1-Fc-TβR-II、TβR-II-Fc和VEGFR-1-Fc。
3.根据权利要求1所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述PCR扩增的引物有：
primer T-1F 
primer T-2F 
primer T-3F 
primer T-4F 
primer T-1R 
primer T-2R 
primer T-3R 
primer V-2F 
primer V-3F 
primer V-4F 
primer V-2R 
primer V-3R 
primer I-2F 
primer I-5F 
primer I-6F 
primer I-7F 
primer I-1R 
primer-I-2R 
4.根据权利要求1所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述融合基因片段分别为VF、TVF、FVT、TFV和VFT。
5.根据权利要求1所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述质粒分别为pIRESpuro3/TVF、pIRESpuro3/FVT、pIRESpuro3/TFV、pIRESpuro3/VFT和pIRESpuro3/VF。
6.根据权利要求1所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述酶切片段与载体pIRESpuro3连接，培养获得质粒。
7.根据权利要求1所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述步骤五构建好的重组质粒瞬转HEK293细胞进行蛋白表达，并比较几种不同构型蛋白的表达量，用以进行后续实验。
8.根据权利要求7所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述不同构型蛋白分别为TF、VF、TVF、FVT、TFV和VFT蛋白。
9.根据权利要求7所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述不同构型蛋白通过Protein A亲和层析法纯化获得融合蛋白TF、VF、TVF、FVT、TFV和VFT，并利用SDS-PAGE和Western Blot鉴定纯化产物的分子量及纯度。
10.根据权利要求1所述能够表达同时靶向TGFβ和VEGF的融合蛋白的质粒的构建方法，其特征在在于，所述融合蛋白采用酶联免疫吸附法对其活性以及与其配体的结合能力进行了评价与分析。
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