CN108727470B - 一种多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多肽及其应用，所述多肽具有保守序列，所述保守序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明多肽利用细菌表面展示技术，高通量的筛选到靶向PD‑L1的亲和肽，通过T细胞激活实验证明本发明多肽能够特异性地与PD‑L1结合，并阻断PD‑L1对T细胞的抑制作用，达到激活T细胞的目的，可见，本发明的多肽在肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌等高表达PD‑L1的肿瘤治疗方面具有广泛的应用前景。

Description

一种多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种多肽及其应用，特别涉及一种靶向程序性死亡配体PD-L1的多肽及其应用。
背景技术
癌症已成为摧毁人类健康、剥夺人类生命的最危险的疾病之一。传统的肿瘤治疗方法存在各种弊端，例如，手术治疗只适用于体积较大、影像技术可检测的良性实体瘤，对于体积较小的肿瘤或者转移性肿瘤无能为力；放射疗法对局部组织的损伤较大；化学疗法需要全身给药，针对性差，给患者造成巨大的毒副作用。
鉴于以上肿瘤治疗方法中的缺陷，研究人员一直努力激活机体免疫系统，从而达到治疗肿瘤的目的。在其他药物治疗转移的黑色素瘤失效的情况下，CTLA-4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated Protein 4)抗体明显地提高了病人的存活率，这一革命性的成果给免疫法治疗肿瘤带来了新的希望。随着对免疫耐受、免疫抑制，调控抗肿瘤免疫效应以及肿瘤靶向治疗了解的深入，人们越来越坚信激活免疫系统能够在肿瘤病人体内提供长效的治疗作用。
肿瘤特异性T细胞的激活对整个免疫应答系统的调节极其关键，T细胞的激活除了需要TCR识别抗原呈递细胞(APC，Antigen-presenting cell)表面的MHC(MajorHistocompatibility Complex)-抗原肽复合物信号刺激外，即TCR-MHC-Peptide；还需要APC细胞与T细胞之间的共刺激信号，即B7-CD28分子，也常被成为免疫检验点(immunecheckpoint)。共刺激信号的缺乏将导致T细胞的无能，而过度激活则表现为自身性免疫疾病。
程序性死亡分子1(PD-1/CD279，Programmed Cell Death Protein 1)是新近发现的CD28家族成员，它的配基PD-L1(B7-H1/CD274，Programmed Death-ligand 1)分子是B7分子家族成员。PD-1/PD-L1是一对具有负性调控功能的协同刺激因子，在炎症反应或自身性疫疾病中起到抑制外周T细胞活性的作用；同时，PD-1/PD-L1信号抑制T细胞增殖，影响存活和功能(包括杀伤性和细胞分子释放等，促进肿瘤特异性的T细胞凋亡，促进CD4+T细胞转变成表达Foxp3+的调节T细胞(Tregs)，抵制毒T细胞(CTL)的杀伤作用。PD-1广泛表达于激活的T细胞、B细胞、DC(Dendritic Cell)细胞等；PD-L1在单核细胞、内皮细胞、肺、肝细胞等许多组织和细胞中组成型表达。迄今，在肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肝癌等许多细胞实体瘤细胞中大量表达。另外，PD-1在肿瘤侵润性淋巴细胞中表达上调，这可能是肿瘤细胞导致T细胞无能的主要原因。
PD-1/PD-L1信号通路作为T细胞细胞周期重要的检验点，发挥着独特的负性调控作用。药物阻断该靶点是干扰机体免疫系统，激活T细胞，达到抗肿瘤免疫治疗的重要途径之一，具有潜在的应用价值。PD-1抗体和PD-L1抗体用于治疗肿瘤已经取得了临床上的重要突破。但异源抗体治疗的安全性和制备的成本性等问题，阻碍着抗体类药物的发展。
CN 103897036 A公开了一种PD-1蛋白胞外段的亲和肽L8及其应用，该亲和肽L8的氨基酸序列为：Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-Ser，其对，对肿瘤的抑制效果明显，高亲和性多肽由于其制备成本低及副作用小等优点成为了机体抗肿瘤免疫治疗的重要佐剂，为肿瘤免疫治疗开辟了新的途径。
鉴于靶向多肽在作为靶向药物中的优势，筛选一种能够靶向PD-L1的多肽具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽及其应用，所述多肽利用细菌表面展示技术，高通量筛选到的靶向PD-L1的亲和肽，所述多肽在治疗抗肿瘤药物中具有广阔的应用前景。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多肽，其特征在于，所述多肽具有保守序列，所述保守序列的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.1：CWCWR，即Cys-Trp-Cys-Trp-Arg.
本发明中，所述的保守序列的获得方式通过从随机的细菌多肽库中筛选可以与PD-L1特异结合的多肽序列，通过分析这些多肽序列，发明人意外地发现了能够和PD-L1特异结合的多肽序列都具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
根据本发明，所述多肽为SEQ ID NO.2-4所示的氨基酸序列中的任意一种或至少两种的组合，优选为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2-4所示的氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.2：YASYHCWCWRDPGRS
SEQ ID NO.3：YSAYQCWCWRQQGTS
SEQ ID NO.4：YHQYSCWCWRPPGPY.
本发明中，发明人通过偏向库的构建，通过在保守序列两侧分别连接任意5个亲水氨基酸，将这些序列与PD-L1进行结合，又发现SEQ ID NO.2-4所示的氨基酸序列出现的频率很高，通过再进一步验证这三个氨基酸序列与PD-L1结合的特异性，发现这三个序列都能够和PD-L1结合，且SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列与PD-L1结合的效果最好。
第二方面，本发明提供一种DNA片段，其包含编码如第一方面所述多肽的核酸序列。
第三方面，本发明提供一种重组载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有如第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核酸序列，如第三方面所述的重组载体或如第四方面所述的重组细胞。
根据本发明，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的药物组合物的应用，所述药物组合物在制备肿瘤定位诊断试剂、抗肿瘤药物或PD-L1靶向制剂中的应用。
根据本发明，所述肿瘤为高表达PD-L1的肿瘤都是可行的，所述肿瘤选自但不限于肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌等PD-L1高表达肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述多肽作为一种药物治疗肿瘤的前提是该肿瘤细胞高表达PD-L1，而PD-L1在许多肿瘤细胞中，如黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌和肝癌中都是组成型高表达，所以所述多肽也能够作为治疗其他癌症的药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的发明人通过从随机的细菌多肽库中筛选可以与PD-L1特异结合的多肽序列，通过分析这些多肽序列，发明人意外地发现了能够和PD-L1特异结合的多肽序列都具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，通过进一步的偏向库的构建，发明人找到了SEQ IDNO.2-4所示的氨基酸序列，其与PD-L1的结合效果最好；
(2)本发明多肽及其产品能够与PD-L1特异的结合，结合常数可达到ka＝3192Ms-1，解离平衡常数KD为95×10-9M，可见其结合慢但不易脱落，且所述多肽能够特异性的靶向并阻断PD-1/PD-L1信号通路，对T细胞的抑制作用，达到激活T细胞的目的，具有抗肿瘤的活性；
(3)本发明的多肽在肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌等PD-L1高表达相关肿瘤治疗方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1(A)为从随机多肽库中筛选PD-L1靶向多肽，图1(B)为多肽序列分析；
图2为流式分析保守序列CWCWR与MDA-MB-231和MDA-MB-435的结合情况，其中，图2(A)为MDA-MB-231与对照多肽的结合情况，图2(B)为MDA-MB-231与PD-L1靶向多肽的结合情况，图2(C)为MDA-MB-435与对照多肽的结合情况，图2(D)为MDA-MB-435与PD-L1靶向多肽的结合情况；
图3(A)为偏向库构建原理图，图3(B)为从偏向库筛选PD-L1靶向多肽的结果，图3(C)为偏向库筛选到的多肽进行序列分析；
图4为多肽对PD-L1结合的特异性鉴定，其中，图4(A)TPP-1多肽与SPP-1多肽对PD-L1结合情况，图4(B)运用ELISA验证多肽的特异性，图4(C)-图4(F)为运用荧光显微镜展示多肽与细胞表面PD-L1结合的特异性；
图5为T细胞激活实验；
图6为多肽的体内活性验证，其中，图6(A)为TPP-1组和SPP-1组中肿瘤体积，图6(B)为总的生物荧光强度变化；
图7为通过比对干扰素-gamma和颗粒酶B的表达来验证TPP-1多肽对T细胞的激活，进而杀伤肿瘤细胞的作用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
材料：
下述实施例中涉及到的多肽均由上海吉尔生化有限公司合成和纯化；
下述实施例中涉及测序均由苏州金唯智生物科技有限公司进行；
实施例1从随机的细菌多肽库中筛选可与PD-L1特异结合的多肽序列
筛选可与PD-L1特异结合的多肽序列，包括如下步骤：
(1)使用蛋白荧光生物素标记试剂盒(Fluoreporter mini-biotin-xx proteinlabeling Kit)对PD-L1蛋白进行生物素标记(biotinylated)；
(2)本发明所使用的细菌表面多肽展示库整合在eCPX的N端，由15个随机氨基酸组成；从冻存的细菌库中取至少10倍库容量的菌接种到含氯霉素的LB培养基中，过夜培养；
(3)从过夜培养的细菌中按照1:50的比例取出一定量的细菌加入150mL含34μg/mL的氯霉素LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养2h至OD600值在0.5-0.6之间；
(4)以200μg/mL的量加入阿拉伯糖，在室温约25℃、200rpm的条件下诱导培养约1h，其OD600值达到0.8-1.0，按照一个OD等于1×109个细菌计算，按照细菌:磁珠个数比为100:1的比例，加入链霉亲和素包被的磁珠(Streptavidin-coated magnetic microbeads)进行磁珠的阴性分选；
(5)将不与链霉亲和素(Streptavidin)结合的细菌吸附进入下一轮的磁珠阳性分选，在阳性筛选中，混合液中PD-L1蛋白的浓度为40nM，在静音旋转混合器上4℃共同孵育45分钟；
(6)孵育结束后在3000g、4℃的条件下离心，移除上清液，并将沉淀重新悬浮在1mLPBS缓冲溶液中，按照磁珠:细菌个数比为1:100的比例将磁珠与重新悬浮在PBS缓冲液中的细菌混合，用PBS缓冲液清洗沉淀3次后用1mL LB重悬；
(7)清洗过程中每个样品取出10μL稀释100倍，涂布在固体LB平板上，37℃过夜培养，第二天根据长成的细菌克隆数量计算磁珠分选后的细菌库容量；
(8)富集后的细菌重悬在5mL的SOC培养基中，在37℃、200rpm的条件下过夜培养，用于流式分选；
(9)取100μL过夜培养的细菌接种到5mL的LB培养基中并成功诱导多肽表达，取库容10倍数目的菌与生物素化的PD-L1蛋白细菌混合，控制蛋白浓度低于40nM，在4℃、20rpm温和旋转的条件下共同孵育45分钟，再在4℃、3000g的条件下离心5分钟，弃除上清；
(10)将沉淀重新悬浮在100μL SAPE染液中共孵育30分钟，SAPE浓度为4nM，孵育结束后，在4℃、3000g的条件下离心5分钟，弃除上清；
(11)将沉淀重新悬浮在600μL的PBS缓冲液中，利用流式细胞仪对重新悬浮在PBS缓冲液中的细菌进行分选，将分选出来的细菌-蛋白复合体接种到含有葡萄糖的LB培养基中过夜培养。
经过1轮的MACS筛选和9轮的FACS筛选之后，菌库中能与PD-L1结合的细菌得到明显的富集。把前9轮的筛选结果峰图进行合并汇总，结果如图1(A)所示，可以明显看到PE荧光强度有显著增强。挑选40个克隆进行测序，得到测序结果后进行多肽序列的提取和分析，结果如图1(B)所示，发现保守序列SEQ ID NO.1：CWCWR。
实施例2保守序列的特异性验证
PD-L1高表达的细胞MAD-MB-231细胞和PD-L1不表达的细胞MDA-MB-435细胞分别待融合度80％左右消化，PBS调整细胞浓度为106/mL，100μL/管细胞。分别加入PD-L1靶向多肽和对照多肽，使之终浓度为2μM，4℃旋转孵育30min，孵育结束后，1000rpm离心5min，沉淀用1mL PBS清洗2遍，流式细胞仪检测结合率，结果如图2(A)-图2(D)所示。
图2(A)-图2(D)显示了保守序列与MAD-MB-231细胞的结合率高于与MDA-MB-435细胞的结合率，表明保守序列与高表达PD-L1的细胞有一定的结合特异性。
实施例3偏向库的构建方法
将SEQ ID NO.:1的氨基酸序列两侧分别连接任意5个亲水氨基酸，并连接到eCPX的N端。编码上述多肽的序列用PCR方法扩增得到。PCR反应的模板是质粒pBAD33-eCPX。为提高所得到多肽的亲水性，随机氨基酸亲水性较多为宜，因此设计了序列为NVS的简并引物。
正向引物(SEQ ID NO.5)：CGTAGCTGGCCAGTCTGGCCAGNVSNVSNVSNVSNVSTGTTGGTGTTGGAGGNVSNVSNVSNVSNVSGGCGGTTCTGGTGGCAGCGG，其中，N代表A、T、C、G中的任意核苷酸，V代表A、C或G，S代表C或G；
反向引物(SEQ ID NO.6)：GGCTGAAAATCTTCTCTC。
PCR扩增产物用Sfi1酶切后连接到经相同酶切的pBAD33-eCPX载体中。改造后的pBAD33-eCPX质粒转化入大肠杆菌MC1061菌株，涂LB平板，计算单克隆数目。随机挑选20个单克隆利用pBAD-forward引物测序，对偏向库多样性，氨基酸偏向性做出基本判断。图3(A)显示了偏向库的构建原理，将X5CWCWRX5模式的多肽插入到pBAD33-eCPX的N端，通过计算LB平板上克隆数目，表明偏向库包含5×107个克隆。构建成功的偏向型的细菌展示库采用与随机展示库相同的方法进行PD-L1结合多肽的筛选工作，图3(B)显示经过1轮的MACS筛选和9轮的FACS筛选之后，菌库与PD-L1的结合效率明显提高。挑选20个克隆进行测序，得到测序结果后进行多肽序列的提取和分析，结果如图3(C)所示，SEQ ID NO.2(C1),SEQ ID NO.3(C2)和SEQ ID NO.4(C3)所示的氨基酸序列的出现频率都较高。
SEQ ID NO.2(C1)：YASYHCWCWRDPGRS
SEQ ID NO.3(C2)：YSAYQCWCWRQQGTS
SEQ ID NO.4(C3)：YHQYSCWCWRPPGPY
由于上述SEQ ID NO.2-4均具有与PD-L1特异结合的特性，且SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的效果最好，后续的实验均采用SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行。
实施例4 ELISA和荧光显微镜的方法表征多肽与PD-L1结合的特异性
荧光标记均为与多肽的N-端偶联FITC荧光分子。本实施例中，均以SEQ ID No.3：YASYHCWCWRDPGRS序列进行，命名为TPP-1，并设计了SEQ ID No.3的对照多肽SPP-1。用PBS把PD-L1，mPD-L1和hPD-L2分别稀释为1μg/mL，加入黑色的酶标板中，体积为100μL/孔。酶标板放在4℃下过夜孵育。次日，在无纺布上拍去孔中溶液，用含有0.01％Tween-20的PBST洗涤包被孔，每次1min，一共洗涤3次。向包被好的酶标孔中加入100μL使用PBST配制的2％(m/v)BSA封闭液，酶标板放在室温下，80rpm振荡封闭1h。结束后，用PBST洗涤3次，每次1min。向已封闭的酶标孔中加入10μM的FITC标记的多肽溶液100μL，在室温下80rpm振荡孵育1.5-2h。孵育结束后，用PBST洗涤每孔3次，每次3min。在酶标仪上测量每孔溶液的FITC荧光值。
CHO-K1细胞和CHO-K1/PD-L1细胞提前1天铺24孔板，使之融合度80％左右，过夜培养后，吸掉培养基，2mL PBS清洗2遍，分别加入终浓度为5μM荧光标记的多肽1mL，70rpm室温避光振荡孵育30min，弃上清，每孔加入2mL PBS，室温70rpm摇床上，清洗2遍。每孔加入1mL4％多聚甲醛溶液，室温固定10min。PBS清洗两遍后，每孔加入0.5mL终浓度为2μg/mL的Hoechst33342，避光染色10min，荧光显微镜观察多肽与不同细胞的结合情况，并拍照记录。
图4(A)显示TPP-1多肽与PD-L1的结合随着多肽浓度升高而增多，对照多肽SPP-1则没有此种情况。图4(B)表明TPP-1与PD-L1结合相比于mPD-L1，hPD-L2具有较好的特异性，图4(C)-4(F)则显示了荧光显微镜下TPP-1多肽与特异性的与高表达PD-L1的CHO-K1细胞结合。
实施例5本发明多肽与PD-L1的亲和力测定
多肽采用表面等离子体共振仪Biacore T200来分析多肽和PD-L1间的亲和力。实验中使用XanTEX芯片来进行相关实验。具体过程如下：首先以10μL/min的流速进样50μLNHS/EDC混合液(0.05mol/L NHS和0.2mol/L EDC,使用前按体积比1:1混合)，用于活化芯片表面葡萄糖的羧基；活化结束后注射醋酸钠稀释的PD-L1蛋白，按照10μL/min的流速进样5分钟，待固定信号达到2000RU以上后用20μL的1M盐酸乙醇胺封闭7分钟。之后将待检测的靶向多肽溶解在HBS缓冲液(PH＝7.4)中，并配成0.625μg/mL，1.25μg/mL，2.5μg/mL，5.0μg/mL，10.0μg/mL的浓度梯度，25μL/min的流速进样，大约进样15min。
SPR采用单循环测定TPP-1多肽与PD-L1的结合特性，随着多肽浓度的升高，TPP-1与PD-L1的响应呈增加的趋势。用Biacore T200软件分析数据，得到解离平衡常数KD为95×10-9M。而解离常数kd＝3.022×10-4，结合常数ka＝3192Ms-1。该平衡解离常数可知TPP-1与PD-L1结合是一个较慢的反应过程，同时，一旦结合上，解离也较难。
实施例6本发明多肽对T细胞激活的影响
取正常人外周血10mL，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。应用CD4抗体和流式分选CD4+ T细胞。分选后的细胞用含有200ng/mL的CD3/CD28抗体，20ng/mL IL2的IMDM完全培养基，置于37℃，5％CO2环境下培养。根据培养基的颜色2-3天更换新鲜培养基，激活的CD4+T细胞大量扩增，7-10天后冻存。
T细胞激活实验中，将CD3抗体浓度调整到0.5μg/mL，Corning 96孔板每孔100μL，4℃孵育过夜。复苏CD4+ T细胞，使用IMDM培养基，添加10％FBS，20ng/ml IL2培养过夜。用PBS将PD-L1蛋白稀释到75μg/mL，每孔加入20μL，同时加入对照抗体MEDI4736，TPP-1多肽和对照多肽SPP-1，37℃孵育3-4h，加入T细胞，每孔150μL，包含3-4万个细胞，37℃继续培养48h，取50μL细胞培养上清，用ELISA的方法测定IFN-gamma含量。
图5显示10μg/mL的MEDI4736抗体表现出对PD-L1的完全抑制作用。10μg/mL的TPP-1多肽对PD-L1的抑制作用较小，当多肽浓度提高到50μg/mL时，TPP-1多肽对PD-L1表现出明显的抑制作用。细胞因子IFN-gamma的分泌回归到CD3抗体激活状态。SPP-1多肽在50μg/mL时仍然不能表现出对PD-L1的抑制作用。表明TPP-1多肽能够阻断PD-L1对T细胞的抑制作用，达到激活T细胞的目的。
实施例7本发明多肽的抗肿瘤活性检测方法
H460特异性的CD8+ T细胞能够特异性的杀伤H460细胞，并释放细胞因子IFN-gamma。当肿瘤细胞高表达PD-L1时，T细胞的活性将受到抑制。阻断PD-1/PD-L1通路将有助于提高T细胞活性，从而达到治疗肿瘤的目的。
本发明中使用的表达荧光素酶基因的H460细胞(H460-luc)通过转染包装荧光素酶基因的病毒颗粒，并在1μg/mL嘌呤霉素的压力筛选下获得。
新鲜分离PBMC细胞，并借助流式细胞仪分选CD8+ T细胞，含有200ng/mL CD3/CD28抗体及20ng/mL IL2的IMDM完全培养基体外激活该细胞，根据细胞密度和培养基颜色，每2-3天添加新鲜培养基。H460-luc细胞培养基中加入终浓度为10μg/mL的丝裂霉素C，37℃继续培养2h，PBS清洗两次后，将培养第5天的T细胞加入到H460-luc细胞中，继续共培养3天，收获H460细胞特异的CD8+T细胞。
选取5-6周龄的Balb/c雌性裸鼠，在SPF环境中培养3天后，右侧大腿后侧注射H460-luc及激活CD8+ T细胞，按照4:1预先混合后注射，每只小鼠注射2.5x106。多肽从第2天开始肿瘤原位给药，每3天给药1次，剂量为5mg/kg，共计给药6次。注射H460-luc细胞7天后用进行IVIS Lumina II进行活体成像，分析肿瘤大小，活体成像每周进行一次，待肿瘤体积可以测量时，隔3天测量肿瘤体积并给小鼠称重。统计分析每组动物荧光强度，肿瘤体积及动物体重变化，并分析多肽的抗肿瘤活性。
图6(A)-图6(B)显示肿瘤的体积随着注射H460-luc的时间增加而增大。在15天之前，TPP-1多肽组和SPP-1多肽组肿瘤体积没有明显变化。在20天左右，对照组肿瘤明显增大，而实验组受到了一定程度的抑制。荧光素酶基因表达情况与肿瘤体积呈现相似的趋势。
参图7，在观察肿瘤体积35天后，处死小鼠，取肿瘤组织进行免疫组化的研究，运用干扰素-gamma(IFN-gamma)和颗粒酶B(Granzyme B)的抗体对组织切片进行染色，结果显示给予TPP-1多肽的小鼠组，干扰素和颗粒酶B的表达均明显高于对照组，证实TPP-1多肽对肿瘤的抑制作用是激活T细胞，通过活化的T细胞对肿瘤细胞进行杀伤导致的。
综上所述，本发明多肽及其产品能够与PD-L1特异的结合，结合常数可达到ka＝3192Ms-1，解离平衡常数KD为95×10-9M，可见其结合慢但不易脱落，且所述多肽能够特异性的靶向并阻断PD-1/PD-L1信号通路，对T细胞的抑制作用，达到激活T细胞的目的，具有抗肿瘤的活性；本发明的多肽在肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌等相关的疾病治疗方面具有广泛的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽具有保守序列，所述保守序列的氨基酸序列为SEQID NO.1所示的氨基酸序列；所述多肽为SEQ ID NO.2-4所示的氨基酸序列中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一种DNA片段，其特征在于，其包含编码权利要求1所述多肽的核酸序列。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有至少一个拷贝的如权利要求3所述的DNA片段。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求4所述的表达载体。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1所述的多肽，如权利要求3所述的DNA片段，如权利要求4所述的重组载体或如权利要求5所述的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
8.一种如权利要求6所述的药物组合物的应用，其特征在于，所述药物组合物在制备肿瘤定位诊断试剂、抗肿瘤药物或PD-L1靶向制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或肝癌PD-L1高表达肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
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