JP6895959B2 - 細胞を培養するための方法ならびにそのためのキットおよび装置 - Google Patents
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Description
本出願は、「Methods for Culturing Cells and Kits and Apparatus for Same」という名称の、2015年10月22日付で出願された米国仮出願第62/245,252号、および「Methods for Culturing Cells and Kits and Apparatus for Same」という名称の、2015年10月22日付で出願された米国仮出願第62/245,261号からの優先権を主張するものであり、それらの各々の内容は参照によりその全体が組み入れられる。
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願される。配列表は、サイズが132,710バイトの、2016年10月20日に作成された735042003640SeqList.txtという名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によりその全体が組み入れられる。
本開示は、いくつかの局面において、リンパ球の集団のような細胞の組成物の、増大(増殖)の刺激、活性化、同時刺激および/または生存を誘導するためなどの、インキュベーションまたは培養に関する。いくつかの局面において、本開示は、細胞の表面上の分子への作用物質の結合と、それによって細胞に1つまたは複数のシグナルを提供することを伴う細胞集団の、例えば増大(増殖)、生存もしくは持続性の、刺激、活性化、同時刺激、または他の効果のための方法および試薬を提供する。場合によっては、試薬は、多量体形成試薬のような、作用物質のための複数の結合部位を含む試薬であり、したがって1つまたは複数の作用物質は、試薬に可逆的に結合することにより多量体化され、例えば、それによって、その上で多量体化された刺激物質を有する、刺激試薬(多量体化作用物質)を生成する。いくつかの局面において、多量体化作用物質は、細胞の集団の増大もしくは増殖または他の刺激を提供することができ、その後、そのような刺激物質は、可逆的結合の破壊によって除去することができる。組成物、装置およびその使用の方法も提供される。
そのようなT細胞の注入が腫瘍担持宿主において抗腫瘍反応性を有することが示されている養子細胞免疫療法もしくはがん療法用に、またはウイルス感染の処置用にインビトロで抗原特異的T細胞を増大するためになど、インビトロでT細胞集団を刺激するためにさまざまな戦略が利用可能である。研究、診断および治療目的のためになど、インビトロで細胞集団を増大するために改善された戦略が必要とされる。そのような必要性を満たす試薬、方法、製品およびキットが提供される。
標的細胞におけるシグナルを誘導またはモジュレートするための可逆的試薬を用いて、細胞およびその組成物をインキュベートするための、例えばそのような細胞を培養するための方法が本明細書において提供される。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。
を含むストレプトアビジン結合ペプチドに対して高い親和性を示し、それによって培養標的細胞をもたらす。
を含むストレプトアビジン結合ペプチドに対する親和性を示す。いくつかの態様において、作用物質は、試薬に可逆的に結合し、細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる。
[本発明1001]
以下の工程を含む、T細胞を培養するための方法:
(a)T細胞を含む組成物を、受容体結合物質の存在下でインキュベートする工程であって、該受容体結合物質が、(i)該受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)該組成物中のT細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の分子に特異的に結合する工程;および
(b)該インキュベーションの開始後5日以内に、受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊し、それによって培養T細胞が生成される工程。
[本発明1002]
受容体結合物質が分子に特異的に結合しそれによって組成物中の1つまたは複数のT細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後30分を超えてから実行される、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後1時間〜4日、前記インキュベーションの開始後6時間〜3日、前記インキュベーションの開始後12時間〜2日、もしくは前記インキュベーションの開始後1日〜3日に実行される;または
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後約1時間〜約4日、前記インキュベーションの開始後約6時間〜約3日、前記インキュベーションの開始後約12時間〜約2日、もしくは前記インキュベーションの開始後約1日〜約3日に実行される;または
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後約1時間もしくはそれを超えてから、前記インキュベーションの開始後1日、2日、3日、もしくは4日以内に、実行される、
本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
分子に対する受容体結合物質の結合が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始し;かつ/または
受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し;かつ/または
受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、
本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
分子が、TCR/CD3複合体の構成成分であるか、またはCD3である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
分子が第1の分子であり、受容体結合物質がさらに、1つまたは複数のT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができ、該第2の分子が、任意で、T細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを誘導するかもしくは増強するか、減衰させるか、または改変することができる、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み;かつ
複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、
本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記破壊が、受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
受容体結合物質が第1の受容体結合物質であり、1つまたは複数のT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる第2の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の結合が、T細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変する、本発明1010の方法。
[本発明1012]
試薬が、第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含み、それによって、第2の受容体結合物質が該試薬に可逆的に結合されている、本発明1010または本発明1011の方法。
[本発明1013]
第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位、および第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位が、同じであるかまたは異なることができる、本発明1012の方法。
[本発明1014]
第2の受容体結合物質が、2つ以上の結合部位Z1に可逆的に結合することができる結合パートナーC1またはC2を含み、それによって、第1および第2の受容体結合物質が、2つ以上の結合部位Z1を介して試薬に可逆的に結合されており;かつ/または
第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、該試薬が、結合パートナーC2に結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる複数の結合部位Z2をさらに含む、
本発明1012または本発明1013の方法。
[本発明1015]
C1およびC2が、同じもしくは実質的に同じであるか、または、同じもしくは実質的に同じ部分を含有し;かつ/または
Z1およびZ2が、同じもしくは実質的に同じであるか、または、同じもしくは実質的に同じ部分を含有する、
本発明1014の方法。
[本発明1016]
試薬が第1の試薬であり、少なくとも、第2の受容体結合物質に可逆的に結合されている第2の試薬の存在下で、インキュベーションが実行される、本発明1010または本発明1011の方法。
[本発明1017]
第2の受容体結合物質が第2の分子に特異的に結合しそれによってT細胞において第2のシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、本発明1010〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
第2のシグナルが、T細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変する、本発明1010〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記破壊が、第1の受容体結合物質と試薬との間、および/または第2の受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含む、本発明1010〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記破壊が、第1の受容体結合物質によって誘導またはモジュレートされたシグナルを終結または減少させ、かつ、第2の受容体結合物質によって誘導またはモジュレートされたシグナルを終結または減少させる、本発明1010〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
以下の工程を含む、T細胞を培養するための方法:
(a)T細胞を含む組成物を、
(i)T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを誘導またはモジュレートする様式で、T細胞の表面上に発現している第1の分子に特異的に結合する、第1の受容体結合物質;および
(ii)(i)第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)T細胞において第2のシグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合する、第2の受容体結合物質
の存在下でインキュベートする工程;ならびに
(b)該インキュベーションの開始後5日以内に、第2の受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊し、それによって培養T細胞が生成される工程。
[本発明1022]
第2のシグナルが、T細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変する、本発明1021の方法。
[本発明1023]
第1の受容体結合物質が第1の分子に特異的に結合しかつ/または第2の受容体結合物質が第2の分子に特異的に結合しそれによってT細胞において1つまたは複数のシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、本発明1021または本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後30分を超えてから実行される、本発明1021〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後1時間〜4日、前記インキュベーションの開始後6時間〜3日、前記インキュベーションの開始後12時間〜2日、もしくは前記インキュベーションの開始後1日〜3日に実行される;または
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後約1時間〜約4日、前記インキュベーションの開始後約6時間〜約3日、前記インキュベーションの開始後約12時間〜約2日、もしくは前記インキュベーションの開始後約1日〜約3日に実行される;または
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後約1時間もしくはそれを超えてから、前記インキュベーションの開始後1日、2日、3日、もしくは4日以内に、実行される、
本発明1021〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
第2の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み;かつ
複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、
本発明1021〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のシグナルである;
第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる;または
第2の分子が、共刺激分子、アクセサリー分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子であるか、または、TNFファミリーもしくはTNF受容体ファミリーのメンバーである、
本発明1007〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
第2の分子が、CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択される、本発明1007〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
第2の分子がCD28である、本発明1007〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
第2の分子が、接着分子であるかもしくはそれを含む、または、サイトカイン産生、ケモカイン産生、および/もしくは接着分子の発現を誘導する因子である、本発明1007〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
第2の受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1027または本発明1030の方法。
[本発明1032]
第2の受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
第2の受容体結合物質が、IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、およびTNFの中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1027、1030、および1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
第2の受容体結合物質が、IL-12R、IFN-γR、IL-4R、およびIL-17Rの中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
第2の受容体結合物質が、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、およびIL-17の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1027および1030〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1027または本発明1030の方法。
[本発明1035]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
第2の受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1027、1030、および1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
第2の受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1027、1030、1034、および1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
第2の受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する、本発明1027または本発明1030の方法。
[本発明1038]
第2の受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドである;または
第2の受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1027、1030、および1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
第2の受容体結合物質が、CXCR3、CCR7、CXCR1、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する;または
第2の受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1027、1030、1037、および1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
接着分子が、CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L (L-セレクチン)、およびCD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1027または本発明1030の方法。
[本発明1041]
接着分子が、LFA-1、L-セレクチン、VCAM-1、およびVLA-4の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1027、1030、および1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
因子が核因子である、本発明1027または本発明1030の方法。
[本発明1043]
因子が、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ(RORγ)またはRORαである、本発明1027、1030、および1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記破壊が、第2の受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含む、本発明1007〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記破壊が、第2の受容体結合物質によって誘導またはモジュレートされたシグナルを終結または減少させる、本発明1044の方法。
[本発明1046]
第2の分子がCD28であり、破壊が、T細胞においてCD28共刺激シグナルを終結または減少させる、本発明1044または本発明1045の方法。
[本発明1047]
1つまたは複数のT細胞の表面上の第3の分子に特異的に結合することができる第3の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行される、本発明1007〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
第1の受容体結合物質が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを誘導またはモジュレートする様式で、T細胞の表面上に発現している第1の分子に特異的に結合し;
第2の受容体結合物質が、第2の分子に特異的に結合し、それによってT細胞において第2のシグナルを誘導またはモジュレートし;かつ
第3の受容体結合物質が、該細胞において追加のシグナルを誘導またはモジュレートする、T細胞の表面上の第3の分子に特異的に結合する、
本発明1047の方法。
[本発明1049]
第1の分子がCD3である、本発明1047または本発明1048の方法。
[本発明1050]
第2のシグナルが、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変する、本発明1047〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
第2の分子が、共刺激分子、アクセサリー分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子であるか、または、TNFファミリーもしくはTNF受容体ファミリーのメンバーである、本発明1047〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
第2の分子が、CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択される、本発明1047〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
第2の分子がCD28である、本発明1047〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
第3の分子が、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体である、または、接着分子であるかもしくはそれを含む、または、サイトカイン産生、ケモカイン産生、および/もしくは接着分子の発現を誘導する因子である、本発明1047〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
第3の受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1054の方法。
[本発明1056]
第3の受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
第3の受容体結合物質が、IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、およびTNFの中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1054または本発明1055の方法。
[本発明1057]
第3の受容体結合物質が、IL-12R、IFN-γR、IL-4R、およびIL-17Rの中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
第3の受容体結合物質が、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、およびIL-17の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1054〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
第3の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1054の方法。
[本発明1059]
第3の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
第3の受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1054または本発明1058の方法。
[本発明1060]
第3の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
第3の受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1054、1058、および1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
第3の受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する、本発明1054の方法。
[本発明1062]
第3の受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドである;または
第3の受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1054または本発明1061の方法。
[本発明1063]
第3の受容体結合物質が、CXCR3、CCR7、CXCR1、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する;または
第3の受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1054、1061、および1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
接着分子が、CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-セレクチン)、およびCD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1054の方法。
[本発明1065]
接着分子が、LFA-1、L-セレクチン、VCAM-1、およびVLA-4の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1054または本発明1064の方法。
[本発明1066]
因子が核因子である、本発明1054の方法。
[本発明1067]
因子が、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ(RORγ)またはRORαである、本発明1054または本発明1066の方法。
[本発明1068]
第3の受容体結合物質が、第1の試薬もしくは第2の試薬に可逆的に結合されている;または
第3の受容体結合物質に可逆的に結合されているさらなる試薬の存在下で、インキュベーションが実行される、
本発明1047〜1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記破壊の後、T細胞を含む組成物をさらにインキュベートする工程を含む、本発明1001〜1068のいずれかの方法。
[本発明1070]
インキュベーションおよびさらなるインキュベーションが、同じ容器において実行され;かつ/または
さらなるインキュベーションが、前記物質の存在下で実行され;かつ/または
前記方法が、前記物質、受容体結合物質、第2の受容体結合物質、および/もしくは試薬を、さらなるインキュベーションの前に細胞組成物から除去する工程を含まない、
本発明1069の方法。
[本発明1071]
インキュベーションおよび/もしくはさらなるインキュベーションが、37℃±2℃でもしくは約37℃±2℃で実行され;かつ/または
インキュベーションおよび/もしくはさらなるインキュベーションが、T細胞にシグナルを送達することができるさらなる作用物質の存在下で実行される、
本発明1001〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
さらなる作用物質が、T細胞、CD4+ T細胞、および/またはCD8+ T細胞の増殖を増強または誘導することができる、本発明1071の方法。
[本発明1073]
さらなる作用物質が、IL-2、IL-15、およびIL-7の中から選択されるサイトカインである、本発明1072の方法。
[本発明1074]
さらなるインキュベーションが、14日を超えない、12日を超えない、10日を超えない、8日を超えない、または6日を超えない期間にわたって実行される、本発明1069〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
以下の工程を含む、T細胞を培養するための方法:
T細胞を含む組成物を、細胞においてCD28を介したシグナル伝達をもたらす条件下で、T細胞の表面上のCD28分子に特異的に結合する受容体結合物質の存在下でインキュベートする工程;および
該インキュベーションの開始後5日以内に、受容体結合物質とCD28分子との結合を排除するかまたは低減させ、これにより、CD28シグナル伝達が細胞において終結または減少し、それによって培養T細胞が生成される工程。
[本発明1076]
排除または低減が、インキュベーションの開始後4日以内、3日以内、2日以内、または1日以内に実行される、本発明1075の方法。
[本発明1077]
排除または低減が、
それによって、CD28に特異的に結合されていない任意の受容体結合物質が組成物から除去されるかもしくは低減する、細胞の洗浄;または
受容体結合物質を組成物から除去するためもしくは低減させるための細胞の洗浄を任意でさらに含む、受容体結合物質とCD28分子との間の結合相互作用の逆転
を含む、本発明1075または本発明1076の方法。
[本発明1078]
インキュベーションの少なくとも一部の間、および/またはインキュベーションの後に、組成物中のT細胞を、TCR/CD3複合体の分子に特異的に結合する作用物質の存在下でインキュベートし、それによって、TCR/CD3複合体関連シグナルが細胞において誘導またはモジュレートされる、本発明1075〜1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
標的細胞を含む組成物を、受容体結合物質の存在下でインキュベートする工程であって、該受容体結合物質が、(i)該受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており;かつ(ii)標的細胞においてシグナルを誘導もしくはモジュレートしかつ/または標的細胞の機能を変更する様式でCD28、CD3、またはCD40以外の標的細胞の表面上の分子に特異的に結合し、それによって培養標的細胞が生成される工程を含む、標的細胞を培養するための方法。
[本発明1080]
分子がCD137ではなく、かつ/または、受容体結合物質がCD137に特異的に結合しない、本発明1079の方法。
[本発明1081]
受容体結合物質が分子に特異的に結合しそれによって標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、本発明1079または本発明1080の方法。
[本発明1082]
シグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナルではない、本発明1079〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、本発明1079〜1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
分子が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択され;かつ/または
受容体結合物質が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、もしくはHVEMに特異的に結合する、
本発明1079〜1083のいずれかの方法。
[本発明1085]
受容体結合物質が第2の受容体結合物質であり、分子が第2の分子であり、1つまたは複数のT細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合することができる第1の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第1の分子が、任意で、組成物中の1つまたは複数のT細胞において第1のシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、本発明1079〜1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
第1の受容体結合物質が、第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質に対する複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されている;または
第1の受容体結合物質が、第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む第2の試薬に可逆的に結合されている、
本発明1085の方法。
[本発明1087]
第1の受容体結合物質が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができ;かつ/または
第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し;かつ/または
第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、
本発明1085または本発明1086の方法。
[本発明1088]
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、もしくは改変することができる;または
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる、
本発明1085〜1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
T細胞を含む組成物を、
(i)(i)第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)該組成物中のT細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合する、第1の受容体結合物質;および
(ii)(i)(a)第2の受容体結合物質に対する複数の結合部位をさらに含む試薬、または(b)第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む第2の試薬のいずれかに可逆的に結合されており、かつ(ii)該組成物中のT細胞において第2のシグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合し、該第2の分子がCD28以外である、第2の受容体結合物質
の存在下でインキュベートする工程であって、組成物中のT細胞においてシグナルおよび/または第2のシグナルが誘導またはモジュレートされる条件下で、該インキュベーションが行われ、それによって培養T細胞が生成される工程を含む、T細胞を培養するための方法。
[本発明1090]
第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し、かつ/または、第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、本発明1089の方法。
[本発明1091]
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のシグナルを誘導もしくはモジュレートすることができ;かつ/または
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、もしくは改変することができる;または
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる、
本発明1089または本発明1090の方法。
[本発明1092]
第2の分子が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択され;かつ/または
第2の受容体結合物質が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、もしくはHVEMに特異的に結合する、
本発明1085〜1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
第2の分子がCD137ではなく、かつ/または、第2の受容体結合物質がCD137に特異的に結合しない、本発明1085〜1092のいずれかの方法。
[本発明1094]
第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質が、試薬に可逆的に結合し;かつ
(i)第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質が各々個々に、結合パートナーC1を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第1および第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含むか;または
(ii)第1の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1および結合パートナーC2に結合して第1および第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含むか;または
(iii)第1の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第1の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1、および、各々が結合パートナーC2に結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z2を含む
のいずれかである、
本発明1085〜1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1079〜1083のいずれかの方法。
[本発明1096]
受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
受容体結合物質が、IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、およびTNFの中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1079〜1083および1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
受容体結合物質が、IL-12R、IFN-γR、IL-4R、およびIL-17Rの中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
受容体結合物質が、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、およびIL-17の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1079〜1083、1095、および1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1079〜1083のいずれかの方法。
[本発明1099]
受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1079〜1083および1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1079〜1083、1098、および1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する、本発明1079〜1083のいずれかの方法。
[本発明1102]
受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドである;または
受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1079〜1083および1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
受容体結合物質が、CXCR3、CCR7、CXCR1、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する;または
受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1079〜1083、1101、および1102のいずれかの方法。
[本発明1104]
接着分子が、CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-セレクチン)、およびCD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1079〜1083のいずれかの方法。
[本発明1105]
接着分子が、LFA-1、L-セレクチン、VCAM-1、およびVLA-4の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1079〜1083および1104のいずれかの方法。
[本発明1106]
因子が核因子である、本発明1079〜1083のいずれかの方法。
[本発明1107]
因子が、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ(RORγ)またはRORαである、本発明1079〜1083および1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
受容体結合物質が分子に特異的に結合しそれによって標的細胞においてシグナルを誘導もしくはモジュレートしかつ/または標的細胞における機能を変更する条件下で、インキュベーションが行われる、本発明1079〜1083および1095〜1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、本発明1079〜1083および1095〜1108のいずれかの方法。
[本発明1110]
受容体結合物質が追加の受容体結合物質であり、分子が追加の分子であり、1つまたは複数のT細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合することができる第1の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第1の分子が、任意で、組成物中の1つまたは複数のT細胞において第1のシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、本発明1079〜1083および1095〜1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
第1の受容体結合物質が、第1の受容体結合物質および追加の受容体結合物質に対する複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されている;または
第1の受容体結合物質が、第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む第2の試薬に可逆的に結合されている、
本発明1110の方法。
[本発明1112]
第1の受容体結合物質が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができ;かつ/または
第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し;かつ/または
第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、
本発明1110または本発明1111の方法。
[本発明1113]
第1の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC2に結合して第1の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z2を含む、本発明1110〜1112のいずれかの方法。
[本発明1114]
1つまたは複数のT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる第2の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第2の分子が、任意で、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変するように組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、本発明1110〜1113のいずれかの方法。
[本発明1115]
第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のシグナルである;
第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる;または
第2の分子が、共刺激分子、アクセサリー分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子であるか、または、TNFファミリーもしくはTNF受容体ファミリーのメンバーである、
本発明1114の方法。
[本発明1116]
第2の分子が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択され;かつ/または
第2の受容体結合物質が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、もしくはHVEMに特異的に結合する、
本発明1114または本発明1115の方法。
[本発明1117]
第2の分子が、CD28およびCD137の中から選択される、本発明1114〜1116のいずれかの方法。
[本発明1118]
第2の分子がCD28である、本発明1114〜1117のいずれかの方法。
[本発明1119]
標的細胞を含む組成物を、1つまたは複数の受容体結合物質の存在下でインキュベートする工程であって、該受容体結合物質が、(i)該受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含むストレプトアビジン類似体またはムテインである試薬に可逆的に結合されており;かつ(ii)該組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式で標的細胞の表面上の分子に特異的に結合し、該ストレプトアビジンムテインが、正味の負電荷を含むか、またはSEQ ID NO: 4もしくは6に示されるストレプトアビジンムテインよりも低い等電点を呈し、それによって培養標的細胞が生成される工程
を含む、標的細胞を培養するための方法。
[本発明1120]
標的細胞を含む組成物を、1つまたは複数の受容体結合物質の存在下でインキュベートする工程であって、該受容体結合物質が、(i)該受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含むストレプトアビジン類似体またはムテインである試薬に可逆的に結合されており;かつ(ii)該組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式で標的細胞の表面上の分子に特異的に結合し、該ストレプトアビジン類似体またはムテインが、アミノ酸の配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO: 8)を含むストレプトアビジン結合ペプチドに対して、SEQ ID NO: 1〜6のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含むストレプトアビジンまたはムテインよりも高い親和性を呈し、それによって培養標的細胞が生成される工程
を含む、標的細胞を培養するための方法。
[本発明1121]
受容体結合物質が分子に特異的に結合しそれによって組成物中の1つまたは複数の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、本発明1119または本発明1120の方法。
[本発明1122]
複数の結合部位が、2つ以上の結合部位Z1を含み;かつ
受容体結合物質が、結合部位Z1に可逆的に結合することができる結合パートナーC1を含み、C1とZ1との間の可逆的結合が、受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合をもたらす、
本発明1119〜1121のいずれかの方法。
[本発明1123]
ストレプトアビジン類似体またはムテインが、複数の結合部位Z1を含み、複数の受容体結合物質が、試薬に可逆的に結合されている、本発明1122の方法。
[本発明1124]
標的細胞が免疫細胞を含む、本発明1079〜1088および1095〜1123のいずれかの方法。
[本発明1125]
標的細胞が血液細胞を含み;
標的細胞が白血球を含み;
標的細胞がリンパ球を含み;
標的細胞がB細胞を含み;
標的細胞がB細胞集団を含み;
標的細胞がT細胞を含み;
標的細胞がT細胞集団を含み;かつ/または
標的細胞がナチュラルキラー(NK)細胞を含む、
本発明1079〜1088および1095〜1124のいずれかの方法。
[本発明1126]
標的細胞が、抗原特異的T細胞もしくはその集団、Tヘルパー細胞もしくはその集団、細胞傷害性T細胞もしくはその集団、メモリーT細胞もしくはその集団、調節性T細胞もしくはその集団、NK細胞もしくはその集団、抗原特異的B細胞もしくはその集団、メモリーB細胞もしくはその集団、または、調節性B細胞もしくはその集団を含む、本発明1079〜1088および1095〜1125のいずれかの方法。
[本発明1127]
標的細胞がT細胞である、本発明1079〜1088および1095〜1126のいずれかの方法。
[本発明1128]
分子が、T細胞の表面上に存在し、受容体結合物質が、組成物中のT細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、本発明1079〜1088および1095〜1127のいずれかの方法。
[本発明1129]
受容体結合物質が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができ;かつ/または
受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し;かつ/または
受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、
本発明1079〜1088および1095〜1128のいずれかの方法。
[本発明1130]
分子が第1の分子であり、受容体結合物質が、1つまたは複数の標的細胞の表面上の第1の分子および第2の分子に特異的に結合することができ、該第2の分子に対する結合が、標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする、本発明1079〜1088および1095〜1129のいずれかの方法。
[本発明1131]
第2の分子に対する結合が、任意で、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変することができる、本発明1130の方法。
[本発明1132]
受容体結合物質が第1の受容体結合物質であり、1つまたは複数の標的細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる第2の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第2の分子に対する結合が、任意で、標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、本発明1079〜1088および1095〜1129のいずれかの方法。
[本発明1133]
第2の分子に対する結合が、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変する、本発明1132の方法。
[本発明1134]
第2の受容体結合物質が第2の分子に特異的に結合しそれによって組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、本発明1132または1133の方法。
[本発明1135]
第2の分子に対する結合が、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変する、本発明1134の方法。
[本発明1136]
ストレプトアビジンムテインまたは類似体が、第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含み、それによって、第2の受容体結合物質がストレプトアビジンムテインまたは類似体に可逆的に結合されている、本発明1132〜1135のいずれかの方法。
[本発明1137]
第2の受容体結合物質が、ストレプトアビジン類似体またはムテインに存在する2つ以上の結合部位Z2に可逆的に結合することができる結合パートナーC1またはC2を含む、本発明1136の方法。
[本発明1138]
第2の分子が、CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択され;かつ/または
第2の受容体結合物質が、CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、もしくはHVEMに特異的に結合する、
本発明1130〜1137のいずれかの方法。
[本発明1139]
第2の分子がCD28である、本発明1130〜1138のいずれかの方法。
[本発明1140]
第2の分子が、CD40およびCD137の中から選択され;かつ/または
第2の受容体結合物質が、CD40もしくはCD137に特異的に結合する、
本発明1130〜1138のいずれかの方法。
[本発明1141]
第2の分子が、接着分子であるかもしくはそれを含む、または、サイトカイン産生、ケモカイン産生、および/もしくは接着分子の発現を誘導する因子である、本発明1130〜1137のいずれかの方法。
[本発明1142]
第2の受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1130〜1137および1141のいずれかの方法。
[本発明1143]
第2の受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
第2の受容体結合物質が、IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、およびTNFの中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1130〜1137、1141、および1142のいずれかの方法。
[本発明1144]
第2の受容体結合物質が、IL-12R、IFN-γR、IL-4R、およびIL-17Rの中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
第2の受容体結合物質が、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、およびIL-17の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1130〜1137、1141、および1142のいずれかの方法。
[本発明1145]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1130〜1137および1141のいずれかの方法。
[本発明1146]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
第2の受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1130〜1137および1145のいずれかの方法。
[本発明1147]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
第2の受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1130〜1137、1145、および1146のいずれかの方法。
[本発明1148]
第2の受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する、本発明1130〜1137および1141のいずれかの方法。
[本発明1149]
第2の受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドである;または
第2の受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1130〜1137および1148のいずれかの方法。
[本発明1150]
第2の受容体結合物質が、CXCR3、CCR7、CXCR1、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する;または
第2の受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1130〜1137、1145、および1146のいずれかの方法。
[本発明1151]
接着分子が、CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-セレクチン)、およびCD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1130〜1137および1141のいずれかの方法。
[本発明1152]
接着分子が、LFA-1、L-セレクチン、VCAM-1、およびVLA-4の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1130〜1137、1141、および1151のいずれかの方法。
[本発明1153]
因子が核因子である、本発明1130〜1137および1141のいずれかの方法。
[本発明1154]
因子が、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ(RORγ)またはRORαである、本発明1130〜1137、1141、および1153のいずれかの方法。
[本発明1155]
第2の受容体結合物質が、複数の異なる受容体結合物質を含み、その各々が個々に、組成物中のT細胞の表面上の同じまたは異なる第2の分子に結合して、細胞において1つまたは複数のシグナルを集合的に誘導またはモジュレートすることができる、本発明1010〜1078、1085〜1094、および1116〜1154のいずれかの方法。
[本発明1156]
第1および/または第2の受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊する工程をさらに含む、本発明1001〜1155のいずれかの方法。
[本発明1157]
破壊が、インキュベーションの開始後14日以内、インキュベーションの開始後12日以内、インキュベーションの開始後10日以内、インキュベーションの開始後8日以内、またはインキュベーションの開始後6日以内に実行される、本発明1156の方法。
[本発明1158]
インキュベーションの少なくとも一部が、T細胞にシグナルを送達することができるさらなる作用物質の存在下で実行される、本発明1001〜1157のいずれかの方法。
[本発明1159]
さらなる作用物質が、T細胞、CD4+ T細胞、および/またはCD8+ T細胞の増殖を増強または誘導することができる、本発明1158の方法。
[本発明1160]
さらなる作用物質が、IL-2、IL-15、およびIL-7の中から選択されるサイトカインである、本発明1158または本発明1159の方法。
[本発明1161]
さらなる作用物質が、CD28に特異的に結合せず、かつ/またはCD28シグナル伝達を誘導しない、本発明1158〜1160のいずれかの方法。
[本発明1162]
T細胞または標的細胞が、対象由来の初代細胞である、本発明1001〜1161のいずれかの方法。
[本発明1163]
T細胞または標的細胞が、対象から直接単離される、本発明1001〜1162のいずれかの方法。
[本発明1164]
T細胞が、分画されていないT細胞である、濃縮されたかもしくは単離されたCD3+ T細胞である、濃縮されたかもしくは単離されたCD4+ T細胞である、または、濃縮されたかもしくは単離されたCD8+ T細胞である、本発明1001〜1093および1127〜1163のいずれかの方法。
[本発明1165]
インキュベートする工程の前に、T細胞が、CD62L+細胞について濃縮されておらず、かつ/またはナイーブT細胞について濃縮されていない、本発明1001〜1093および1127〜1164のいずれかの方法。
[本発明1166]
T細胞または標的細胞が、ヒト細胞である、本発明1001〜1165のいずれかの方法。
[本発明1167]
試薬が、20 nm未満、10 nm未満、5 nm未満、もしくは1 nm未満であるサイズを有する;または
試薬が、1.2 g/cm 3 未満もしくは1.0 g/cm 3 未満の密度を有する、
本発明1001〜1166のいずれかの方法。
[本発明1168]
試薬が、前記インキュベーションの間、固体支持体、固定相、ビーズ、微粒子、磁性粒子、および/もしくはマトリックスではなく、かつそれらに結合されていないかもしくはそれらと会合しておらず;かつ/または
試薬が、柔軟性であり、金属もしくは磁性コアを含有せず、完全にもしくは主に有機多量体から構成されており、球形ではなく、実質的に球形もしくは均一な形状ではなく、かつ/もしくは硬直していない、
本発明1001〜1167のいずれかの方法。
[本発明1169]
試薬が、前記インキュベーションの間、支持体または固体支持体に結合されていない、本発明1001〜1168のいずれかの方法。
[本発明1170]
試薬が、インキュベーションの少なくとも一部の間、支持体に結合されており、それによって、複数のT細胞または標的細胞が、インキュベーションの少なくとも一部の間、支持体上に可逆的に固定化されている、本発明1001〜1168のいずれかの方法。
[本発明1171]
支持体が、固定相であるかもしくはそれを含み;かつ/または
支持体が、固体支持体であるかもしくはそれを含む、
本発明1170の方法。
[本発明1172]
各受容体結合物質が個々に、抗体断片、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、Igドメインを含有する分子、サイトカイン、ケモカイン、アプタマー、およびMHC分子、ならびにそれらの結合断片の中から選択される、本発明1001〜1171のいずれかの方法。
[本発明1173]
受容体結合物質が、抗体断片を含み;
受容体結合物質が、Fab断片を含み;
受容体結合物質が、F(ab') 2 断片および二価一本鎖Fv(scFv)断片の中から選択される二価抗体断片であり;
受容体結合物質が、Fab断片、Fv断片、およびscFv断片の中から選択される一価抗体断片であり;かつ/または
受容体結合物質が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ(glubody)、アンキリンスキャホールドをベースにしたタンパク質、結晶性スキャホールドをベースにしたタンパク質、アドネクチン、およびアビマー(avimer)の中から選択される、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子である、
本発明1001〜1172のいずれかの方法。
[本発明1174]
試薬が、ビオチン、ビオチン類似体、もしくはそれらの生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン;ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アビジンもしくはストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン;遷移金属イオンに結合することができる少なくとも2つのキレート基Kを含む試薬;オリゴヒスチジン親和性タグに結合することができる作用物質;グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合することができる作用物質;カルモジュリンもしくはその類似体;カルモジュリン結合ペプチド(CBP)に結合することができる作用物質;FLAG-ペプチドに結合することができる作用物質;HAタグに結合することができる作用物質;マルトース結合タンパク質(MBP)に結合することができる作用物質;HSVエピトープに結合することができる作用物質;mycエピトープに結合することができる作用物質;またはビオチニル化担体タンパク質に結合することができる作用物質であるか、あるいはそれを含む、本発明1001〜1118および1155〜1173のいずれかの方法。
[本発明1175]
試薬が、ビオチンまたは生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含み;
試薬が、ビオチン類似体または生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含み;かつ/または
試薬が、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含む、
本発明1001〜1118および1155〜1174のいずれかの方法。
[本発明1176]
試薬が、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン;ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジンもしくはアビジンの類似体もしくはムテイン;遷移金属イオンに結合することができる少なくとも2つのキレート基Kを含む試薬;オリゴヒスチジン親和性タグに結合することができる作用物質;グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合することができる作用物質;カルモジュリンもしくはその類似体;カルモジュリン結合ペプチド(CBP)に結合することができる作用物質;FLAG-ペプチドに結合することができる作用物質;HAタグに結合することができる作用物質;マルトース結合タンパク質(MBP)に結合することができる作用物質;HSVエピトープに結合することができる作用物質;mycエピトープに結合することができる作用物質;またはビオチニル化担体タンパク質に結合することができる作用物質の、オリゴマーまたはポリマーである、本発明1001〜1118および1155〜1175のいずれかの方法。
[本発明1177]
試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジ類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、本発明1001〜1118および1155〜1176のいずれかの方法。
[本発明1178]
試薬が、ストレプトアビジン類似体またはムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、本発明1001〜1177のいずれかの方法。
[本発明1179]
オリゴマーまたはポリマーの個々の分子が、多糖または二官能性リンカーによって架橋されている、本発明1176、1177、および1178のいずれかの方法。
[本発明1180]
ストレプトアビジン結合ペプチドが、
からなる群より選択される、本発明1174〜1179のいずれかの方法。
[本発明1181]
試薬が、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として44〜47位に対応する配列位置に、アミノ酸配列Val 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 もしくはlle 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 を含むストレプトアビジン類似体もしくはムテインを含む;または
ストレプトアビジン類似体もしくはムテインが、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として44〜47位に対応する配列位置に、アミノ酸配列Val 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 を含む、
本発明1001〜1180のいずれかの方法。
[本発明1182]
ストレプトアビジン類似体またはムテインが、
(a)SEQ ID NO: 3〜6、27、および28のいずれかに示されるアミノ酸の配列;
(b)SEQ ID NO: 3〜6、27、および28のいずれかに対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い配列同一性を呈し、Val 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 またはlle 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 に対応するアミノ酸配列を含有し、かつ、ビオチンもしくはその生物学的に活性な形態、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アミノ酸の配列;または
(c)ビオチンもしくはその生物学的に活性な形態、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、(a)または(b)の機能的断片
を含む、本発明1001〜1118および1155〜1181のいずれかの方法。
[本発明1183]
ストレプトアビジン類似体またはムテインが、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として117、120、および/または121に対応する位置に、1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、本発明1181または本発明1182の方法。
[本発明1184]
1つもしくは複数のアミノ酸置換が、Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121、もしくはPhe121の中から選択される;または
1つもしくは複数のアミノ酸置換が、Glu117、Gly120、もしくはTyr121の1つもしくは複数から選択される;または
アミノ酸置換が、Glu117、Gly120、もしくはTyr121から選択される、
本発明1183の方法。
[本発明1185]
ストレプトアビジン類似体またはムテインが、
(a)SEQ ID NO: 27または28に示されるアミノ酸の配列;
(b)SEQ ID NO: 28に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い配列同一性を呈し、Val 44 、Thr 45 、Ala 46 、Arg 47 、Glu 117 、Gly 120 、およびTyr 121 に対応するアミノ酸配列を含有し、かつ、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アミノ酸の配列;または
(c)ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、(a)または(b)の機能的断片
を含む、本発明1119〜1184のいずれかの方法。
[本発明1186]
試薬が、ストレプトアビジン類似体またはムテインであるかまたはそれを含み;かつ
結合パートナーC1および/または結合パートナーC2が、独立して、
からなる群より選択されるストレプトアビジン結合ペプチドを含む、
本発明1001〜1118および1155〜1185のいずれかの方法。
[本発明1187]
前記破壊が、受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の、細胞への導入を含む、本発明1001〜1078および1156〜1186のいずれかの方法。
[本発明1188]
物質が、遊離の結合パートナーであり、かつ/または競合物質である、本発明1187の方法。
[本発明1189]
組成物中の物質が、T細胞または標的細胞に対して有害ではなく、かつ/または、該物質の添加が、生存するT細胞または標的細胞のパーセンテージを、該物質を伴わない同等の条件または同じ条件下でのそれぞれT細胞または標的細胞のインキュベーションと比較した際に、90%、80%、70%、60%、または50%未満に低減させない、本発明1187または本発明1188の方法。
[本発明1190]
前記破壊が、T細胞または標的細胞において、受容体結合物質または第2の受容体結合物質の一方または両方によって誘導またはモジュレートされたシグナルを終結または減少させる、本発明1001〜1078および1156〜1189のいずれかの方法。
[本発明1191]
試薬が、ストレプトアビジン類似体もしくはムテインまたはそれらの生物学的に活性な断片であるか、またはそれを含み;かつ
物質が、ストレプトアビジン結合ペプチド、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチン、またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片を含む、
本発明1001〜1190のいずれかの方法。
[本発明1192]
物質が、
からなる群より選択されるストレプトアビジン結合ペプチドであり;かつ/または
物質が、C1もしくはその類似体であるか、またはC2もしくはその類似体である、
本発明1191の方法。
[本発明1193]
前記結合部位Z1と前記結合パートナーC1との間の可逆的結合、および/または前記結合部位Z2と前記結合パートナーC2との間の可逆的結合の解離定数(K D )が、10 -2 M〜10 -13 Mの範囲である、
本発明1001〜1192のいずれかの方法。
[本発明1194]
インキュベーションの前に、細胞を、組成物のT細胞もしくは標的細胞が含むマーカーに特異的に結合する選択物質と接触させ、それによってT細胞もしくは標的細胞を含む組成物が生成もしくは取得される;または
インキュベーションの少なくとも一部が、さらに、組成物のT細胞もしくは標的細胞が含むマーカーに特異的に結合する選択物質の存在下で実行され、培養T細胞が、マーカーを含むT細胞もしくは標的細胞について濃縮される、
本発明1001〜1193のいずれかの方法。
[本発明1195]
選択物質が、選択物質に特異的に結合することができる複数の結合部位をさらに含む試薬に可逆的に結合されている;または
選択物質が、選択物質に特異的に結合することができる複数の結合部位を含むさらなる試薬に可逆的に結合されている、
本発明1194の方法。
[本発明1196]
シグナルの誘導またはモジュレーションが、シグナルの誘導またはモジュレーションの非存在下でのT細胞のインキュベーションと比較して、培養T細胞の増大および/または活性化における増加をもたらす、本発明1001〜1195のいずれかの方法。
[本発明1197]
増加が、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍であるか、またはそれを上回る、本発明1196の方法。
[本発明1198]
追加のまたは第2のシグナルの誘導またはモジュレーションが、追加のまたは第2のシグナルの誘導またはモジュレーションの非存在下でのT細胞のインキュベーションと比較して、T細胞の増大および/または活性化を増加させる、本発明1007〜1197のいずれかの方法。
[本発明1199]
増加が、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍であるか、またはそれを上回る、本発明1198の方法。
[本発明1200]
インキュベーションの前の組成物中の、インキュベーションの後であるが破壊の非存在下での組成物中の、または、インキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合しかつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下における組成物中のT細胞と各々比較して、組成物中のT細胞の増大および/もしくは増殖を増加させる、組成物中のT細胞の代謝プロファイルを変更する、組成物中のCD8+ T細胞のサブセットを変更し;かつ/または、組成物中の長命メモリーT細胞のパーセンテージを増加させる、本発明1001〜1199のいずれかの方法。
[本発明1201]
CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、またはCD8+細胞の数またはパーセンテージが、インキュベーションの前の組成物中の、インキュベーションの後であるが破壊の非存在下での組成物中の、または、類似のインキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合しかつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下における組成物中のCD3+ T細胞、CD4+ T細胞、またはCD8+ T細胞の数またはパーセンテージとそれぞれ比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍増加している、培養T細胞;
組成物中のCD8+ T細胞の比率、またはCD8+ T細胞の相対比率もしくは正規化比率が、インキュベーションの前の組成物中の、インキュベーションの後であるが破壊の非存在下での組成物中の、または、類似のインキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合しかつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下における組成物中のCD8+ T細胞の比率、または相対比率もしくは正規化比率と比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍増加している、培養T細胞;
組成物中のCD62L+、任意で長命メモリーT細胞、またはメモリー幹細胞(T SCM )の数またはパーセンテージが、インキュベーションの前の組成物中の、インキュベーションの後であるが破壊の非存在下での組成物中の、または、類似のインキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合しかつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下における組成物中のCD62L+、長命メモリーT細胞、またはT SCM のいずれかの対応する細胞の集団の数またはパーセンテージと比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍増加している、培養T細胞
を結果としてもたらす、本発明1001〜1200のいずれかの方法。
[本発明1202]
培養T細胞が、組成物中の全T細胞に対するまたは組成物中の全細胞に対するパーセンテージとして35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、または90%を上回る、CD62Lについて表面が陽性(CD62L+)である表現型を含むT細胞サブセットを含む、本発明1001〜1201のいずれかの方法。
[本発明1203]
T細胞サブセットが、
(a)CD127+;ならびに/または
(b)CD45RA+、CD45RO-、CCR7+、およびCD27+のうちのいずれか1つまたは複数、ならびに、t-bet low 、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+、およびLFA-1+のうちのいずれか1つまたは複数
を含む表現型をさらに含む、本発明1202の方法。
[本発明1204]
T細胞サブセットが、
(a)低レベルのTCR再構成切除サークル(TREC)を含み;かつ/または
(b)任意でKi-67である増殖マーカーを発現しており;かつ/または
(c)刺激物質の存在下で増殖する能力を呈し;かつ/または
(d)刺激物質の存在下でIFN-γ、TNF、およびIL-2の中から選択されるサイトカインを産生する能力を呈する、
本発明1202または本発明1203の方法。
[本発明1205]
刺激物質が、抗原、恒常性サイトカイン、任意でIL-15および/もしくはIL-17であるか、または、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができる作用物質である、本発明1204の方法。
[本発明1206]
T細胞サブセットが、長命メモリーT細胞であるかまたはそれを含む、本発明1202〜1205のいずれかの方法。
[本発明1207]
T細胞サブセットが、Tメモリー幹細胞(T SCM )であるかまたはそれを含む、本発明1202〜1206のいずれかの方法。
[本発明1208]
集団のT細胞または標的細胞に組換え核酸分子を導入する工程をさらに含み、核酸分子が組換えタンパク質をコードし、それによって、細胞が組換えタンパク質を発現する、本発明1001〜1207のいずれかの方法。
[本発明1209]
組換え受容体が、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックT細胞受容体(TCR)である、本発明1208の方法。
[本発明1210]
インビトロまたはエクスビボで行われる、本発明1001〜1209のいずれかの方法。
[本発明1211]
培養細胞を、疾患または状態を有する対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001〜1210のいずれかの方法。
[本発明1212]
本発明1001〜1211のいずれかの方法によって産生された複数の培養T細胞または標的細胞、および任意で、薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
[本発明1213]
物質の添加後に、細胞が、30℃よりも高い温度で24時間超、48時間超、72時間超、または96時間超にわたって、インビトロまたはエクスビボでインキュベートされていない、本発明1212の組成物。
[本発明1214]
(a)受容体結合物質に結合することができる複数の結合部位を含む、試薬;および
(b)(i)試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)T細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の分子に特異的に結合することができ、該分子がCD28、CD3、またはCD40ではない、受容体結合物質
を含む、製造物品。
[本発明1215]
分子への結合が、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のT細胞におけるシグナルを誘導もしくはモジュレートし;かつ/または
分子への結合が、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化する、
本発明1215の製造物品。
[本発明1216]
分子が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択される、本発明1214または本発明1215の製造物品。
[本発明1217]
分子がCD137ではない、本発明1130〜1132のいずれかの製造物品。
[本発明1218]
受容体結合物質が、サイトカイン受容体に特異的に結合する、ケモカイン受容体に特異的に結合する、接着分子であるかもしくはそれを含む、または、サイトカイン産生、ケモカイン産生、および/もしくは接着分子の発現を誘導する因子である、本発明1217の製造物品。
[本発明1219]
受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1214または本発明1218の製造物品。
[本発明1220]
受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、およびTNFR2の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
受容体結合物質が、IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、およびTNFの中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1214、1218、および1219のいずれかの製造物品。
[本発明1221]
受容体結合物質が、IL-12R、IFN-γR、IL-4R、およびIL-17Rの中から選択されるサイトカインに特異的に結合する;または
受容体結合物質が、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、およびIL-17の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1214および1218〜1220のいずれかの製造物品。
[本発明1222]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、本発明1214または本発明1218の製造物品。
[本発明1223]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
第2の受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1214、1218、および1222のいずれかの製造物品。
[本発明1224]
第2の受容体結合物質が、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する;または
第2の受容体結合物質が、IL-7、IL-21、IL-2、IL-4、IL-9、およびIL-15の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1214、1218、1222、および1223のいずれかの製造物品。
[本発明1225]
受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する、本発明1214または本発明1218の製造物品。
[本発明1226]
受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドである;または
受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1214、1218、および1225のいずれかの製造物品。
[本発明1227]
受容体結合物質が、CXCR3、CCR7、CXCR1、およびCXCR4の中から選択されるサイトカインに特異的に結合する;または
受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
本発明1214、1218、1225、および1226のいずれかの製造物品。
[本発明1228]
接着分子が、CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-セレクチン)、およびCD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1214または本発明1218の製造物品。
[本発明1229]
接着分子が、LFA-1、L-セレクチン、VCAM-1、およびVLA-4の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、本発明1214、1218、および1228のいずれかの製造物品。
[本発明1230]
因子が核因子である、本発明1214または本発明1218の製造物品。
[本発明1231]
因子が、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ(RORγ)またはRORαである、本発明1214、1218、および1230のいずれかの製造物品。
[本発明1232]
(a)作用物質に結合することができる複数の結合部位を含むストレプトアビジン類似体またはムテインである試薬であって、該ストレプトアビジン類似体またはムテインが、正味の負電荷を含む、または、SEQ ID NO: 4もしくは6に示されるアミノ酸の配列を含むストレプトアビジンムテインの等電点よりも低い等電点を呈し、かつ/または、アミノ酸の配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO: 8)を含むストレプトアビジン結合ペプチドに対して、SEQ ID NO: 4もしくは6のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含むストレプトアビジンもしくはムテインよりも高い親和性を呈する、試薬;および
(b)(i)該試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる、作用物質
を含む、製造物品。
[本発明1233]
受容体結合物質または作用物質が、結合パートナーC1を含み;かつ
複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質または作用物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、
本発明1214〜1232のいずれかの製造物品。
[本発明1234]
作用物質が、選択物質または受容体結合物質である、本発明1214〜1233のいずれかの製造物品。
[本発明1235]
作用物質が、
TCR/CD3複合体のメンバー、CD3、共刺激分子、アクセサリー分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子であるかもしくはそれを含む、または、TNFファミリーもしくはTNF受容体ファミリーのメンバーである、または、接着分子であるかもしくはそれを含む、または、サイトカイン産生、ケモカイン産生、および/もしくは接着分子の発現を誘導する因子である、分子
に特異的に結合する受容体結合物質である、本発明1234の製造物品。
[本発明1236]
受容体結合物質が第2の受容結合物質であり、分子が第2の分子であり、かつ、試薬が、
(c)第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位、および
(d)(i)試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)T細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合することができる、第1の受容体結合物質
をさらに含む、本発明1214〜1235のいずれかの製造物品。
[本発明1237]
作用物質または第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し、かつ/または、第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、本発明1232または本発明1236の製造物品。
[本発明1238]
(i)第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質が各々個々に、結合パートナーC1を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第1および第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む;または
(ii)第1の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1および結合パートナーC2に結合して第1および第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む;または
(iii)第1の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第1の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1、および、各々が結合パートナーC2に結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z2を含む、
本発明1236または本発明1237の製造物品。
[本発明1239]
試薬が、20 nm未満、10 nm未満、5 nm未満、もしくは1 nm未満であるサイズを有する;または
試薬が、1.2 g/cm 3 未満もしくは1.0 g/cm 3 未満の密度を有する、
本発明1214〜1238のいずれかの製造物品。
[本発明1240]
試薬が、支持体または固体支持体に結合されていない、本発明1214〜1239のいずれかの製造物品。
[本発明1241]
試薬が、支持体に結合されているかまたは固定化されている、本発明1214〜1240のいずれかの製造物品。
[本発明1242]
支持体が、固体支持体または固定相である、本発明1241の製造物品。
[本発明1243]
支持体が、ビーズ、粒子、ナノ粒子、またはマイクロスフェアを含む、本発明1241または本発明1242の製造物品。
[本発明1244]
作用物質が個々に、抗体断片、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、Igドメインを含有する分子、およびそれらの結合断片の中から選択される、本発明1214〜1243のいずれかの製造物品。
[本発明1245]
抗体断片が、F(ab') 2 断片および二価一本鎖Fv(scFv)断片の中から選択される二価抗体断片、または、Fab断片、Fv断片、およびscFv断片の中から選択される一価抗体断片である、本発明1214〜1244のいずれかの製造物品。
[本発明1246]
試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれらを含む;または
試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、
本発明1214〜1245のいずれかの製造物品。
[本発明1247]
本発明1214〜1246のいずれかの製造物品、および任意で使用説明書を含む、キット。
[本発明1248]
受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質をさらに含む、本発明1247のキット。
[本発明1249]
標的抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現するように遺伝子操作された複数のT細胞を含む組成物であって、
組成物中の全T細胞または組成物中の全細胞に対するパーセンテージとして35%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を上回る細胞が、CD3+、CD4+またはCD8+、およびCD62L+、ならびに、CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+、およびCD27+のうちの1つまたは複数、ならびに、t-bet low 、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+、およびLFA-1+のうちの1つまたは複数である表面表現型を含むT細胞サブセットを含み;かつ
(a)遺伝子操作前にまたは遺伝子操作の間、該T細胞サブセットを含む複数のT細胞が:
(i)GSK-P阻害剤の存在下でインキュベートされなかった;
(ii)組換え恒常性サイトカイン、任意でIL-7もしくはIL-15の存在下で、インキュベートされなかった;もしくは
(iii)CD62L+細胞について濃縮されなかった;または
(b)組成物が、GSK-P阻害剤、または組換え恒常性サイトカイン、任意でIL-7もしくはIL-15を含まない
のいずれかまたは両方である、組成物。
[本発明1250]
T細胞サブセットが、少なくとも5×10 6 個、少なくとも1×10 6 個、または少なくとも2×10 6 個の細胞を含む、本発明1251の組成物。
[本発明1251]
標的抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現するように遺伝子操作された複数のT細胞を含む組成物であって、
遺伝子操作されたT細胞が、CD3+、CD4+またはCD8+、およびCD62L+、ならびに、CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+、およびCD27+のうちの1つまたは複数、ならびに、t-bet low 、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+、およびLFA-1+のうちの1つまたは複数である表面表現型を含むT細胞サブセットを含むT細胞の集団の形質導入に由来し、該T細胞サブセットが、該集団中の全T細胞に対し、
(a)該表現型を含む1つもしくは複数のマーカーの表面発現に基づいてヒト対象から単離されたかもしくは濃縮された、初代T細胞を含む集団;または
(b)GSK-P阻害剤の存在下でインキュベートされたT細胞の集団;
(c)組換え恒常性サイトカイン、任意でIL-7もしくはIL-15の存在下でインキュベートされたT細胞の集団;または
(d)抗CD3および抗CD8によって刺激されたが、刺激もしくは活性化が1日、2日、3日、4日、もしくは5日を上回る期間にわたり、かつ/または刺激がビオチンもしくはビオチン類似体の存在下で妨害されなかった、T細胞の集団
のいずれかと比較して、より大きなパーセンテージで存在するかまたはより多い数で存在する、組成物。
[本発明1252]
T細胞サブセットが、前記集団中の全T細胞に対するパーセンテージとして35%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%を上回ってまたは約35%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、もしくは約90%を上回って、該集団に存在する;または
T細胞サブセットが、少なくとも細胞5×10 6 個、1×10 6 個、2×10 6 個、もしくはそれよりも多くを含む、
本発明1251の組成物。
[本発明1253]
薬学的組成物である、本発明1249〜1252のいずれかの組成物。
[本発明1254]
本発明1212、1213、および1249〜1253のいずれかの組成物を、疾患または状態を有する対象に投与する工程を含む、処置の方法。
[本発明1255]
細胞が、組換え受容体、キメラ抗原受容体、またはTCRを含み、かつ、組換え受容体、キメラ抗原受容体、またはトランスジェニックTCRが、疾患または状態と関連する抗原に特異的に結合する、本発明1254の処置の方法。
[本発明1256]
疾患または状態が、がん、および自己免疫性の疾患もしくは障害、または感染性疾患である、本発明1254または本発明1255の処置の方法。
図1Aは、作用物質への可逆的結合のための複数の結合部位を有する試薬(またはその代表部分)の概略図を示す。この場合、試薬は2つの作用物質に可逆的に結合することができるものとして示されており、作用物質のそれぞれは、細胞上の分子に特異的に結合することができる。この試薬は、複数の結合部位Z1を含めて、複数の結合部位を有し、それぞれが作用物質に可逆的に結合することができる。示した概略図では、第1および第2の作用物質は、場合によって同じでもよく、それぞれが少なくとも1つの結合パートナーC1を含む。結合パートナーC1は結合部位Z1に可逆的に結合する。第1および第2の作用物質は、それぞれ、結合部位B2をも含み、結合部位B2は細胞の表面上の分子に特異的に結合することができ、該分子は、ある場合には、同じ細胞上にあり得る。ここでは、第1および第2の作用物質が、同じ細胞上の複数の分子に特異的に結合するように示されている。
図1Bは、第1および第2の作用物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を有する試薬の概略図を示し、第1および第2の作用物質は、それぞれ、第1および第2の細胞上の分子に特異的に結合することができる。この試薬は複数の結合部位Z1を有し、それぞれが作用物質に可逆的に結合することができる。第1および第2の作用物質は、場合によって同じでもよく、それぞれが結合パートナーC1を含み、結合パートナーC1は結合部位Z1に可逆的に結合する。第1および第2の作用物質はそれぞれ結合部位B2を含み、結合部位B2は細胞の表面上の分子に特異的に結合することができ、該分子は、場合によって、同じ細胞または異なる細胞上にあり得る。ここでは、第1の作用物質が第1の細胞の表面上の分子に結合しており、第2の作用物質が第2の細胞の表面上の分子に結合している。
図1Cは、第1および第2の作用物質に可逆的に結合することができる試薬を示し、第1および第2の作用物質は、それぞれ、第1および第2の細胞上の分子に特異的に結合することができる。この試薬は、複数の結合部位Z1およびZ2を有し、これらは同じでも異なってもよく、それぞれが作用物質の一方または両方に可逆的に結合することができる。第1の作用物質は、Z1に可逆的に結合する結合パートナーC1を含む;第2の作用物質は、Z2に可逆的に結合することができる結合パートナーC2を含む。ある場合には、C1およびC2は異なる。ある場合には、C1およびC2は同じまたは実質的に同じである。第1の作用物質は、細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる結合部位B1を含み、第2の作用物質は、細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる少なくとも1つの結合部位B3を含む。結合部位B1およびB3は、場合によって、2つの異なる細胞表面分子、または単一分子上の異なるエピトープ、または異なる細胞の表面上の同じもしくは異なる分子に結合する。ここでは、第1の作用物質が第1の細胞の表面上の分子に、B1を介して結合しているとして示されており、第2の作用物質は第2の細胞の表面上の分子に、B3を介して結合している。
図1Dは、選択物質のような、第1および第2の作用物質に可逆的に結合することができる試薬を示し、第1および第2の作用物質は、それぞれ、細胞上の分子に特異的に結合することができる。この試薬は、Z1およびZ2を含む複数の結合部位を有し、これらは同じでも異なってもよく、それぞれが作用物質に可逆的に結合することができる。第1の作用物質は、結合部位Z1に特異的に結合することができる結合パートナーC1を含み、第2の作用物質は、結合部位Z2に特異的に結合することができる少なくとも1つの結合パートナーC2を含む。ある場合には、C1およびC2は異なる。ある場合には、C1およびC2は同じまたは実質的に同じである。第1の作用物質は、細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる結合部位B1を含み、第2の作用物質は、細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる結合部位B3を含む。いくつかの態様では、第1の作用物質および第2の作用物質は選択物質であり得る。結合部位B1およびB3は、1個の細胞の表面上の同じもしくは異なる分子(例えば、受容体)、1つの分子上の同じもしくは異なるエピトープ、または異なる細胞の表面上の同じもしくは異なる分子に結合することができる。ここでは、第1の作用物質は細胞の表面上の第1の分子に結合しており、第2の作用物質は同じ細胞の表面上の第2の分子に結合している。
図1Eは、第1および第2の作用物質に可逆的に結合された試薬を示し、これらの作用物質は、それぞれ、細胞上の分子に特異的に結合することができる。この試薬は、Z1およびZ2を含む複数の結合部位を有し、これらは同じでも異なってもよく、それぞれが作用物質に可逆的に結合することができる。第1の作用物質は、試薬のZ1に可逆的に結合することができる結合パートナーC1を含み、第2の作用物質は、Z2に可逆的に結合することができる結合パートナーC2を含む。ある場合には、C1およびC2は異なる。ある場合には、C1およびC2は同じまたは実質的に同じである。第1の作用物質は、細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる少なくとも1つの結合部位B2を含み、第2の作用物質は、細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる少なくとも1つの結合部位B4を含む。いくつかの態様では、第1の作用物質および第2の作用物質は刺激物質であり得る。結合部位B2およびB4は、1個の細胞の表面上の同じもしくは異なる分子、1つの分子上の同じもしくは異なるエピトープ、または異なる細胞の表面上の同じもしくは異なる分子に結合することができる。ここでは、第1の作用物質は細胞の表面上の第1の分子に結合しており、第2の作用物質は同じ細胞の表面上の第2の分子に結合している。
(図2)図2(A〜E)は、図2A〜2Eを含み、図1A〜1Eに示された例示的な実施態様の概略図を提供するが、ここでは、描かれた試薬が固定相のような支持体上に固定化されているとして示されている。
(図3)図3は、オリゴマー試薬を用いて刺激物質を多量体化し、得られた複合体を細胞とインキュベートして細胞にシグナルを送達し、続いて、その結合を逆転させる例示的な実施態様の概略図を示す。パネルAはオリゴマー試薬1を示し、この試薬1は支持体に結合されておらず、柔軟性であるとして示されている。ここではFabフラグメントとして示されて、細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる刺激物質2が、該試薬と組み合わされる。この刺激物質は、刺激物質を多量体化する試薬上の結合部位(例えば、結合部位Z)に可逆的に結合することができる、結合パートナー(例えば、結合パートナーC)を含む。パネルBは、試薬上の結合部位に可逆的に結合している結合パートナーを示す。細胞3がこのシステムに加えられる。パネルCは、細胞3の表面上の分子4に特異的に結合している、多量体化された刺激物質(Fabフラグメント)を示す。パネルCに描かれた刺激物質は、刺激性の受容体結合物質(例えば、第1の受容体結合物質および/または第2の受容体結合物質)であり、これは、細胞上の分子への刺激物質の結合時に、該細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートすることができる。パネルDに示されるように、競合試薬(例えば、ビオチン)のような物質5がこの組成物に添加され、これは、刺激物質上の結合パートナーに対してよりも試薬上の結合部位に対してより高い結合親和性を示し、それによって試薬1と刺激物質2との間の可逆的結合を破壊する物質であり得る。場合によっては、刺激物質、例えばFabフラグメントもまた、細胞3上の分子4との相互作用から解離させることができる。ある場合には、これは、細胞内のシグナル伝達を妨害し、減少させ、かつ/または終結させることができる。
(図4)図4は、固体支持体、または固定相を含む表面などの、支持体に取り付けられた可逆的システムの例示的な実施態様の概略図を提供する。パネルAは、試薬1を含む支持体6を示す。細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる、Fabフラグメントなどの作用物質2がこのシステムに添加される。作用物質2、例えばFabフラグメントは、試薬上の結合部位(例えば、結合部位Z)に可逆的に結合することができる結合パートナー(例えば、結合パートナーC)を含む。パネルBは、試薬上の結合部位に可逆的に結合している結合パートナーを示す。細胞3がこのシステムに添加される。パネルCは、細胞3の表面上の分子4に結合している作用物質2、例えばFabフラグメントを示す。いくつかの態様では、scFvが受容体結合物質または選択物質を構成する。いくつかの態様では、作用物質、例えばFabフラグメントは、受容体結合物質または選択物質であり得る。パネルCは、例示的な受容体結合物質(例えば、第1の受容体結合物質および/または第2の受容体結合物質)を示し、これは、細胞上の分子への該受容体結合物質、例えばFabフラグメント、の結合時に、該細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートすることができる。競合試薬(例えば、ビオチン)のような物質5が添加され、これは、作用物質、例えばFabフラグメント上の結合パートナーに対してよりも試薬上の結合部位に対してより高い結合親和性を示し、それによって試薬と作用物質との間の結合を破壊する物質であり得る。パネルDは、作用物質2、例えばFabフラグメントと試薬との間の結合の破壊を示し、それによって、作用物質からの、したがって細胞からの試薬の解離が生じる。場合によっては、作用物質、例えばFabフラグメントも、細胞3上の分子4との相互作用から解離させることができる。ある場合には、これは、細胞内のシグナル伝達を妨害し、減少させ、かつ/または終結させることができる。
(図5)図5(A〜C)は、オリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗CD3/抗CD28 FabによるT細胞の刺激後のT細胞増大に及ぼすD-ビオチンの添加の一時的効果を示す。図5A: 細胞培養中のD-ビオチン添加および培地交換の時点を含む実験条件および時系列の概略図である。図5B: 異なる時点でのD-ビオチンの添加を含めて、示された条件下での刺激後のCD3+、CD4+、およびCD8+細胞の総細胞計数(増大の程度)を示す。比較のため、破線の水平線は、陽性対照(抗CD3/抗CD28ビーズ)において増大されたCD3+、CD4+またはCD8+細胞の数を示す。図5C: 非刺激対照に対して正規化した場合のCD4+およびCD8+の倍増大を示す。
(図6A)図6(A〜D)は、刺激の開始1日後にD-ビオチンが加えられたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗CD3/抗CD28 FabによるCD3+ T細胞の短期活性化から生じる特徴を示す。図6A: 細胞培養中のD-ビオチン添加および培地交換の時点を含む実験条件および時系列の概略図である。
(図6B)図6(A〜D)は、刺激の開始1日後にD-ビオチンが加えられたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗CD3/抗CD28 FabによるCD3+ T細胞の短期活性化から生じる特徴を示す。図6B: 示された条件下で7日目の培養物における総細胞計数(増大の程度)を示す。破線の水平線は、D-ビオチン添加なしの抗CD3/抗CD28ビーズ陽性対照において増大された細胞の数を示す。
(図6C)図6(A〜D)は、刺激の開始1日後にD-ビオチンが加えられたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗CD3/抗CD28 FabによるCD3+ T細胞の短期活性化から生じる特徴を示す。図6C: 図6Bの培養物におけるCD4+およびCD8+細胞の割合を示す。破線の水平線は、D-ビオチン添加なしの陽性対照におけるCD4+およびCD8+細胞の画分を示す。
(図6D)図6(A〜D)は、刺激の開始1日後にD-ビオチンが加えられたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗CD3/抗CD28 FabによるCD3+ T細胞の短期活性化から生じる特徴を示す。図6D: 非刺激対照におけるCD4+またはCD8+細胞の数に対して正規化されたCD4+またはCD8+細胞の数を示す。水平線は、D-ビオチン添加なしの陽性抗CD3/抗CD28ビーズ対照において増大されたCD4+またはCD8+細胞の数を表す。
(図6E)図6E: 示された条件について7日目の培養物におけるCD4+およびCD8+ T細胞集団の両方についてのCD62LおよびCD127表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。
(図6F)図6F: 示された条件について7日目の培養物におけるCD4+およびCD8+ T細胞集団の両方についてのKi-67およびT-bet発現のフローサイトメトリー分析を示す。ST-MMは、抗CD3/抗CD28 Fab多量体化ムテインストレプトアビジン作用物質である。
(図7A)図7(A〜C)は、図6Aに記載された実験条件および時系列を用いて刺激の開始1日後にD-ビオチンが加えられたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗CD3/抗CD28 FabによるCD8+ T細胞の短期活性化から生じる特徴を示す。図7A: 示された条件下で7日目の培養物におけるCD8+細胞計数(増大の程度)を示す。破線の水平線は、D-ビオチン添加なしの抗CD3/抗CD28ビーズ陽性対照において増大された細胞の数を示す。
(図7B)図7(A〜C)は、図6Aに記載された実験条件および時系列を用いて刺激の開始1日後にD-ビオチンが加えられたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗CD3/抗CD28 FabによるCD8+ T細胞の短期活性化から生じる特徴を示す。図7B: 示された条件について7日目の培養物におけるCD62LおよびCD127表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。
(図7C)図7(A〜C)は、図6Aに記載された実験条件および時系列を用いて刺激の開始1日後にD-ビオチンが加えられたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗CD3/抗CD28 FabによるCD8+ T細胞の短期活性化から生じる特徴を示す。図7C: 示された条件について7日目の培養物におけるKi-67およびT-bet発現のフローサイトメトリー分析を示す。ST-MMは、抗CD3/抗CD28 Fab多量体化ムテインストレプトアビジン作用物質である。
(図8A)図8(A〜F)は、抗CD3 Fabおよびさまざまな共刺激分子によって可逆的に結合されたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬によるCD3+ T細胞の刺激から生じる特徴を示す。図8A: 示された条件下で6日目の培養物における細胞計数(増大の程度)を示す。破線の水平線は、陽性対照(抗CD3/抗CD28ビーズ)において増大された細胞の数を示す。
(図8B)図8(A〜F)は、抗CD3 Fabおよびさまざまな共刺激分子によって可逆的に結合されたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬によるCD3+ T細胞の刺激から生じる特徴を示す。図8B: 示された条件下で6日目の培養物における非刺激対照に対して正規化されたCD4+またはCD8+細胞の数を示す。陽性対照(抗CD3/抗CD28ビーズ)において増大され得られたCD4+またはCD8+細胞数を、破線の水平線によって示されるように100%に設定した。
(図8C)図8(A〜F)は、抗CD3 Fabおよびさまざまな共刺激分子によって可逆的に結合されたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬によるCD3+ T細胞の刺激から生じる特徴を示す。図8Cおよび8D: 示された条件について6日目のCD3+細胞培養物内のCD62L+/CD4+ (図8C)またはCD62L+/CD8+ (図8D)細胞のいずれかの正規化数を示す。陽性対照(抗CD3/抗CD28ビーズ)において増大され得られたCD62L+/CD4+またはCD62L+/CD8+細胞数を、水平線によって示されるように100%に設定した。
(図8D)図8(A〜F)は、抗CD3 Fabおよびさまざまな共刺激分子によって可逆的に結合されたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬によるCD3+ T細胞の刺激から生じる特徴を示す。図8Cおよび8D: 示された条件について6日目のCD3+細胞培養物内のCD62L+/CD4+ (図8C)またはCD62L+/CD8+ (図8D)細胞のいずれかの正規化数を示す。陽性対照(抗CD3/抗CD28ビーズ)において増大され得られたCD62L+/CD4+またはCD62L+/CD8+細胞数を、水平線によって示されるように100%に設定した。
(図8E)図8(A〜F)は、抗CD3 Fabおよびさまざまな共刺激分子によって可逆的に結合されたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬によるCD3+ T細胞の刺激から生じる特徴を示す。図8Eおよび図8F: 示された条件下で6日間培養された例示的CD3+細胞内のCD4+ (図8E)またはCD8+ (図8F)細胞のいずれかにおけるCD62LおよびCD69表面発現またはCD45ROおよびCD45RA表面発現のフローサイトメトリー分析を描く。
(図8F)図8(A〜F)は、抗CD3 Fabおよびさまざまな共刺激分子によって可逆的に結合されたオリゴマームテインストレプトアビジン試薬によるCD3+ T細胞の刺激から生じる特徴を示す。図8Eおよび図8F: 示された条件下で6日間培養された例示的CD3+細胞内のCD4+ (図8E)またはCD8+ (図8F)細胞のいずれかにおけるCD62LおよびCD69表面発現またはCD45ROおよびCD45RA表面発現のフローサイトメトリー分析を描く。
(図9A)図9(A〜D)は、各々が抗CD3および抗CD28によって可逆的に結合された、オリゴマームテインストレプトアビジン((Strep-Tactin(登録商標); ST-MM A))試薬またはオリゴマームテインストレプトアビジン(Strep-Tactin(登録商標) XT; ST-MM B)試薬のいずれかによるCD3+ T細胞の刺激から得られる特徴を示す。図9A: 示された条件下で5日目の培養物における細胞計数(増大の程度)を示す。破線の水平線は、陽性対照(抗CD3/抗CD28ビーズ)において増大された細胞の数を示す。
(図9B)図9(A〜D)は、各々が抗CD3および抗CD28によって可逆的に結合された、オリゴマームテインストレプトアビジン((Strep-Tactin(登録商標); ST-MM A))試薬またはオリゴマームテインストレプトアビジン(Strep-Tactin(登録商標) XT; ST-MM B)試薬のいずれかによるCD3+ T細胞の刺激から得られる特徴を示す。図9B: 図9Aの培養物におけるCD4+およびCD8+細胞の割合を示す。破線の水平線は、陽性対照(抗CD3/抗CD28ビーズ)におけるCD4+およびCD8+細胞の画分を示す。
(図9C)図9(A〜D)は、各々が抗CD3および抗CD28によって可逆的に結合された、オリゴマームテインストレプトアビジン((Strep-Tactin(登録商標); ST-MM A))試薬またはオリゴマームテインストレプトアビジン(Strep-Tactin(登録商標) XT; ST-MM B)試薬のいずれかによるCD3+ T細胞の刺激から得られる特徴を示す。図9C: 非刺激対照におけるCD4+またはCD8+細胞の数に対して正規化されたCD4+またはCD8+細胞の数を示す。水平線は、陽性抗CD3/抗CD28ビーズ対照において増大されたCD4+またはCD8+細胞の数を表す。
(図9D)図9(A〜D)は、各々が抗CD3および抗CD28によって可逆的に結合された、オリゴマームテインストレプトアビジン((Strep-Tactin(登録商標); ST-MM A))試薬またはオリゴマームテインストレプトアビジン(Strep-Tactin(登録商標) XT; ST-MM B)試薬のいずれかによるCD3+ T細胞の刺激から得られる特徴を示す。図9D: 示された条件について5日目の培養物におけるCD62LおよびCD69表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。
(図10)図10(A〜B)は、各々が抗CD3および抗CD28によって可逆的に結合された、オリゴマームテインストレプトアビジン((Strep-Tactin(登録商標); ST-MM A))試薬またはオリゴマームテインストレプトアビジン(Strep-Tactin(登録商標) XT; ST-MM B)試薬のいずれかによるCD8+ T細胞の刺激から得られる特徴を示す。図10A: 示された条件下で6日目の培養物における細胞計数(増大の程度)を示す。破線の水平線は、陽性対照(抗CD3/抗CD28ビーズ)において増大された細胞の数を示す。図10B: 示された条件について6日目の培養物におけるCD62L、CD69およびCD8表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。
(図11A)図11(A〜C)は、ストレプトアビジンムテインStrep-tactin(登録商標)被覆ビーズ上に可逆的に固定化されたαCD3 FabおよびαCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した後に、CD3+ Tレスポンダー細胞を増殖させた実験の結果を示す。図11Aは、刺激された細胞のサイズ分布(前方散乱)を示すヒストグラムである。
(図11B)図11(A〜C)は、ストレプトアビジンムテインStrep-tactin(登録商標)被覆ビーズ上に可逆的に固定化されたαCD3 FabおよびαCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した後に、CD3+ Tレスポンダー細胞を増殖させた実験の結果を示す。図11Bは、図11Bの最上部に示される細胞分裂ごとの細胞数に応じた増殖の程度を表すヒストグラムを示す(0は非分裂細胞を表し、5は少なくとも5回の分裂を繰り返した細胞を表す)。
(図11C)図11(A〜C)は、ストレプトアビジンムテインStrep-tactin(登録商標)被覆ビーズ上に可逆的に固定化されたαCD3 FabおよびαCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した後に、CD3+ Tレスポンダー細胞を増殖させた実験の結果を示す。図11Cは、4日間の刺激後の培養皿の写真を示す。
(図12)図12(A〜D)は、可溶性試薬として作用する可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化された可逆的αCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した後に、CD3+ Tレスポンダー細胞を増殖させた実験の結果を示す。結果を図12に示した実験の場合には、300,000個のCD3+レスポンダーT細胞(Tresp)を、2μMのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識し、αCD3 FabフラグメントとαCD28 Fabフラグメント(両方とも重鎖にストレプトアビジン結合ペプチドとしてStrep-tagを保有する)との組み合わせが固定化された、様々な量の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン調製物により刺激した。(「1×」は0.5μgのαCD3 Fabと0.5μgのαCD28 Fabで機能化された3μgのオリゴマーストレプトアビジンムテインに相当する;数字は「1×」の倍量を示す)。Tresp細胞は非刺激状態のままであったか、または陰性対照として用いたブランクのオリゴマーストレプトアビジンムテイン(Fabなし)により刺激した。Tresp細胞を、20U/mlのインターロイキン2(IL-2)を補充した1mlの細胞培養培地中に300,000個のCD3陰性自己支持細胞(30Gy照射したもの)と共に48ウェルプレートに2つ組で播種した。細胞を培地交換せずに37℃でインキュベートし、増殖を5日後にFACS分析でCFSE希釈により分析した(図12B)。図12Aは、培養5日後の細胞のサイズ分布を示す。ヒストグラムは生存CD3+細胞を示し、一方、図12Cは、1mMのD-ビオチンで処理して洗浄した後に、刺激試薬から遊離した培養後の細胞を示す。単量体Fabフラグメントの解離と除去は、蛍光標識としてフィコエリトリンで標識したオリゴマーストレプトアビジンムテイン(ST-PE)を用いて再染色することにより分析され、代表的なヒストグラムが示される。図12Dは、5日後の生存(トリパンブルー陰性)細胞の絶対数をノイバウエル計算盤(Neubauer counting chamber)でカウントし、それぞれの刺激条件に対してプロットしたグラフを示す。中央値細胞数が図12Dに示される;エラーバーは標準偏差(SD)を示す。図12Eは、5日間の刺激後の培養皿の写真を示す。
(図13)図13(A〜B)は、可溶性試薬として作用する2種類の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 FabフラグメントまたはαCD3/αCD28/αCD8 Fabのいずれかを用いてインビトロで刺激した、精製済みのCD4+およびCD8+ Tレスポンダー細胞(Tresp)の増殖の増大動態を示す。第1の種類のオリゴマーストレプトアビジンムテインは、実施例3で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテインの画分(n≧3)であった(本明細書では、「従来の」または「より小さい」オリゴマーストレプトアビジンムテイン骨格とも呼ばれ、図13(A〜B)に頂点が下にある三角形の記号で示される);可溶性試薬として使用される、このオリゴマーストレプトアビジンムテインの第2の種類は、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインをビオチン化ヒト血清アルブミン(HSA)と反応させることによって得られたオリゴマーであった。このHSAベースの可溶性試薬は、本明細書では「より大きな」オリゴマーストレプトアビジンムテイン骨格とも呼ばれる。図13(A〜B)の実験では、培地を交換せずに増大させた。CD4+ Tレスポンダー細胞の結果を図13Aに示し、CD8+ Tレスポンダー細胞の結果を図13Bに示す。これに関連して、第1の作用物質、任意で第2および第3の作用物質に可逆的に結合させることによって機能化された、実験的に使用される可溶性試薬は、図中では「多量体化作用物質」と呼ばれることに留意されたい。
(図14)図14(A〜B)は、可溶性試薬として作用する2種類の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインで可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した、精製済みのCD4+およびCD8+ Tレスポンダー細胞(Tresp)の増殖の増大動態を示す。第1の種類のオリゴマーStrep-tactin(登録商標)は、実施例3で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテインの画分(n≧3)であった(本明細書では、「従来のオリゴマーストレプトアビジンムテイン骨格」とも呼ばれ、図14(A〜B)に頂点が上にある三角形の記号で示される);可溶性試薬として使用される、このオリゴマーストレプトアビジンムテインの第2の種類は、HSAベースの可溶性試薬、上述の「大きな骨格」であった。図14(A〜B)の実験では、培地を交換して増大させた。CD4+ Tレスポンダー細胞の結果を図14Aに示し、CD8+ Tレスポンダー細胞の結果を図14Bに示す。
(図15)図15(A〜B)は、精製済みのCD4+およびCD8+ Tレスポンダー細胞の増殖の増大動態についての図13および図14で得られた結果からの結合データを示し、図15AはCD4+ T細胞の結果を示し、図15BはCD8+ T細胞の結果を示す。直線は、3日目に培地交換を行った培養に使用され、一方点線は、3日目に培地交換を行わないで得られた増大の程度の値を示す。図15(A〜B)に示されるデータは、投入細胞数に対して正規化される。オリゴマーストレプトアビジンムテイン(n≧3)で刺激したTresp、市販の抗CD3/抗CD28ビーズ(陽性対照)で刺激したTresp、および非刺激T細胞(陰性対照)についてのデータのみが示されており、「大きな骨格」を有する試薬に関するデータは示されていない。
(図16A)図16(A〜C)は、実施例3に記載される可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン(n≧3)に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロでポリクローナルに刺激した、CD3+セントラルメモリーT細胞(TCM) (CD3+CD62L+CD45RA-TCM)の増大動態および表現型を示す。図16(A〜C)に示されるグラフは、時点ごとに採取された細胞の数に応じた増殖の程度を表し、図16AはIL-2のみを補充した培地での増殖を示す。
(図16B)図16(A〜C)は、実施例3に記載される可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン(n≧3)に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロでポリクローナルに刺激した、CD3+セントラルメモリーT細胞(TCM) (CD3+CD62L+CD45RA-TCM)の増大動態および表現型を示す。図16(A〜C)に示されるグラフは、時点ごとに採取された細胞の数に応じた増殖の程度を表し、図16BはIL-2とIL-15を補充した培地での増殖を示す。
(図16C)図16(A〜C)は、実施例3に記載される可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン(n≧3)に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロでポリクローナルに刺激した、CD3+セントラルメモリーT細胞(TCM) (CD3+CD62L+CD45RA-TCM)の増大動態および表現型を示す。図16Cは、これらの異なるサイトカイン環境で14日間培養した後のCD62LおよびCD127表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。
(図17A)図17(A〜B)は、可溶性試薬として作用する2種類の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した、精製済みのCD8+ Tレスポンダー細胞の増大の収量および表現型を示す。第1の種類のオリゴマーストレプトアビジンムテインは、実施例3で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテインの画分(従来の骨格)であり、可溶性試薬として使用される、このオリゴマーストレプトアビジンムテインの第2の種類は、本明細書では「大きな」骨格と呼ばれる上記の可溶性オリゴマーであった。これらの実験では、従来のオリゴマーストレプトアビジンムテインの画分(n≧3)はまた、単一のFabフラグメント(図17Aおよび図17Bでは3番目のバー)により、またはαCD3 FabフラグメントとαCD28 Fabフラグメントとの組み合わせにより機能化された試薬としても用いられた。αCD3/αCD28 Fabフラグメントによる組み合わせ刺激に加えて、追加のαCD8 Fabフラグメント(IBA GmbH (Goettingen, ドイツ)から市販される)も固定化されたが、それは、特定のT細胞亜集団を選択的に刺激することが可能かどうかを試験するためであった。図17Aは、6日目に採取された細胞の数に応じた増殖の程度を表す棒グラフを示し、陰性対照(非刺激の精製CD8+ Tレスポンダー細胞)と比較され、陽性対照(市販の抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3およびαCD28モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されたビーズ)で刺激した精製CD8+ Tレスポンダー細胞)に対して正規化された。
(図17B)図17(A〜B)は、可溶性試薬として作用する2種類の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した、精製済みのCD8+ Tレスポンダー細胞の増大の収量および表現型を示す。第1の種類のオリゴマーストレプトアビジンムテインは、実施例3で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテインの画分(従来の骨格)であり、可溶性試薬として使用される、このオリゴマーストレプトアビジンムテインの第2の種類は、本明細書では「大きな」骨格と呼ばれる上記の可溶性オリゴマーであった。これらの実験では、従来のオリゴマーストレプトアビジンムテインの画分(n≧3)はまた、単一のFabフラグメント(図17Aおよび図17Bでは3番目のバー)により、またはαCD3 FabフラグメントとαCD28 Fabフラグメントとの組み合わせにより機能化された試薬としても用いられた。αCD3/αCD28 Fabフラグメントによる組み合わせ刺激に加えて、追加のαCD8 Fabフラグメント(IBA GmbH (Goettingen, ドイツ)から市販される)も固定化されたが、それは、特定のT細胞亜集団を選択的に刺激することが可能かどうかを試験するためであった。図17Bは、細胞培養後のCD8およびT細胞表面分子CD45RO (T細胞の増殖および活性化の指標である)の表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。一元配置ANOVAを用いて種々の刺激条件を比較したところ、有意差(n.s.)は検出されなかった。
(図18A)図18(A〜B)は、単一のFabフラグメントにより、またはFabフラグメントの組み合わせ(上記の通り)により機能化された可溶性試薬として作用する可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した、精製済みのCD8+ Tレスポンダー細胞の増大についての収量および表現型を示す。これらの実験では、CD8+ Tレスポンダー細胞を、任意で上記のαCD8 Fabフラグメントと共に、様々な量のαCD3 FabおよびαCD28 Fabフラグメントにより機能化された可溶性試薬(実施例3の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン(1mg/ml))で刺激した。用語「1×」とは、0.5μgのαCD3 Fabフラグメント単独で機能化されたオリゴマーストレプトアビジンムテイン1.5μgおよび0.5μgのαCD28 Fab単独で機能化されたオリゴマーストレプトアビジンムテイン1.5μgに相当するか、または0.5μgのαCD3 Fabフラグメントと0.5μgのαCD28 Fabを負荷したオリゴマーストレプトアビジンムテインの調製物3μl、もしくは0.5μgのstrep-tag付加αCD3 Fab、0.5μgのstrep-tag付加αCD8 Fabおよび0.5μgのstrep-tag付加αCD28 Fabを負荷したオリゴマーストレプトアビジンムテインの調製物4.5μlに相当する。したがって、用語「2×」は、1μgのαCD3 Fabフラグメント単独で機能化されたオリゴマーストレプトアビジンムテイン3.0μgおよび1μgのαCD28 Fab単独で機能化されたオリゴマーストレプトアビジンムテイン3.0μgに相当し、固定化されたαCD3 Fabフラグメントの量の2倍が使用されたことを意味する。未処理のTresp細胞を陰性対照とし、市販の抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3およびαCD28モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されたビーズ)で刺激した精製CD8+ Tレスポンダー細胞を陽性対照とした。図18Aは、5日目に採取された細胞の数に応じた増殖の程度を表す棒グラフを示し、陰性対照と比較され、陽性対照に対して正規化された。
(図18B)図18(A〜B)は、単一のFabフラグメントにより、またはFabフラグメントの組み合わせ(上記の通り)により機能化された可溶性試薬として作用する可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した、精製済みのCD8+ Tレスポンダー細胞の増大についての収量および表現型を示す。これらの実験では、CD8+ Tレスポンダー細胞を、任意で上記のαCD8 Fabフラグメントと共に、様々な量のαCD3 FabおよびαCD28 Fabフラグメントにより機能化された可溶性試薬(実施例3の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン(1mg/ml))で刺激した。用語「1×」とは、0.5μgのαCD3 Fabフラグメント単独で機能化されたオリゴマーストレプトアビジンムテイン1.5μgおよび0.5μgのαCD28 Fab単独で機能化されたオリゴマーストレプトアビジンムテイン1.5μgに相当するか、または0.5μgのαCD3 Fabフラグメントと0.5μgのαCD28 Fabを負荷したオリゴマーストレプトアビジンムテインの調製物3μl、もしくは0.5μgのstrep-tag付加αCD3 Fab、0.5μgのstrep-tag付加αCD8 Fabおよび0.5μgのstrep-tag付加αCD28 Fabを負荷したオリゴマーストレプトアビジンムテインの調製物4.5μlに相当する。したがって、用語「2×」は、1μgのαCD3 Fabフラグメント単独で機能化されたオリゴマーストレプトアビジンムテイン3.0μgおよび1μgのαCD28 Fab単独で機能化されたオリゴマーストレプトアビジンムテイン3.0μgに相当し、固定化されたαCD3 Fabフラグメントの量の2倍が使用されたことを意味する。未処理のTresp細胞を陰性対照とし、市販の抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3およびαCD28モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されたビーズ)で刺激した精製CD8+ Tレスポンダー細胞を陽性対照とした。図18Bは、細胞培養後のCD8およびCD45ROの表面発現のFACS分析を示す。
(図19)図19(A〜B)は、可溶性試薬として用いられる実施例3の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した精製CD3+ Tレスポンダー細胞の増大を示す。1つの実験では、αCD3/αCD28 Fabフラグメントに加えて、IBA GmbH (Goettingen, ドイツ)から市販されるαCD8 Fabフラグメント(カタログ番号6-8000-203)もストレプトアビジンムテインの可溶性オリゴマー上に固定化されたが、それは、αCD8 Fabフラグメントをも可逆的に固定化してある試薬を用いて、バルクCD3+培養物内のCD8+ T細胞亜集団をインビトロで選択的に刺激することが可能かどうかを試験するためであった。より詳細には、0.5μgのαCD3 Fabと0.5μgのαCD28 Fabとの組み合わせを負荷したオリゴマーストレプトアビジンムテイン(1mg/ml)の調製物3μlで500,000個の精製CD3+レスポンダーT細胞(Tresp)を刺激した。代替的アプローチとして、4.5μlのオリゴマーストレプトアビジンムテインに上記の0.5μgのαCD3 Fab、0.5μgのαCD8 Fabおよび0.5μgのαCD28 Fabを負荷した。非刺激Tresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3およびαCD28モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されたビーズ)で刺激したTrespを陽性対照として用いた。図19Aは、各条件における培養物中の細胞数(増大の程度)のグラフを示す。図19Bは、各刺激条件におけるCD4+細胞とCD8+細胞の割合を示す。
(図20A)図20(A〜B)は、αCD3抗体OKT3で標識した、またはStrep-tactin(登録商標)により多量体化されたOKT3のFabフラグメント(本明細書ではFab多量体とも呼ばれる)で標識した、Jurkat細胞における示差的細胞内カルシウム動員の結果を示す。図20Aの実験では、Jurkat細胞にカルシウム感受性色素Indo-1-AMを負荷し、αCD3 mAb OKT3 (黒四角)の注入、または事前のD-ビオチンによる妨害ありもしくは妨害なし(それぞれ、濃い灰色の三角および明るい灰色の円)のαCD3 OKT3 Fab多量体(親細胞株OKT3由来)の注入によってカルシウム放出を引き起こし、PBSの注入(逆白三角)と比較した。イオノマイシンの適用を陽性対照として用いた。細胞内Ca2+濃度の時間分解変化を、FL6/FL7比率の変化に基づいてフローサイトメトリーによってモニターした。
(図20B)図20(A〜B)は、αCD3抗体OKT3で標識した、またはStrep-tactin(登録商標)により多量体化されたOKT3のFabフラグメント(本明細書ではFab多量体とも呼ばれる)で標識した、Jurkat細胞における示差的細胞内カルシウム動員の結果を示す。図20Bの実験では、Indo-1-AMで標識したJurkat細胞を、実施例11に記載されるように、異なるαCD3刺激により活性化し(OKT3:上のグラフ、αCD3 Fab多量体:中央のグラフ)、続いてαCD3 Fab多量体シグナル伝達のその後(t=140s)のD-ビオチン媒介性妨害を行った。D-ビオチンで事前解離させたαCD3 Fab多量体(下のグラフ)およびイオノマイシンを、陰性対照または陽性対照として用いた。データは3つの異なる実験を代表する。
(図21)図21は、抗CD3 OKT3 Fab多量体による細胞の可逆的染色の結果を示す。新鮮分離したPBMCを、モノクローナル抗体(左のドットプロット、Fab多量体の親クローン)またはコグネイトPE標識Fab多量体のいずれかで染色し、D-ビオチンによる処理前(左から2番目のドットプロット)または処理後(中央のドットプロット)に分析した。その後、残存するFab単量体を、新鮮なPE標識Strep-Tactin(登録商標)を用いて後続の洗浄工程後に検出した(右から2番目のドットプロット)。可逆的に染色した細胞の二次Fab多量体染色を対照として用いた(右のドットプロット)。生存(PI陰性)細胞のみが示される。ドットプロット内の数字は、ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。
(図22)図22は、蛍光標識としてフィコエリトリンで標識したStrep-Tactin(登録商標)により多量体化された抗CD28 Fabフラグメントの可逆的結合による細胞の分離を示す。CD28+細胞は、国際特許出願公開WO2013/011011に記載されるように、新鮮分離したPMBCからFab多量体磁気細胞選別によって選別/分離された。選別前に、細胞を、コグネイト蛍光aCD28多量体(左のドットプロット)で、または免疫グロブリンκ軽鎖に対する抗体(左から2番目のドットプロット、αIgκmAb)で対照染色した。選別後、細胞をD-ビオチンで処理し、次いで洗浄して磁性ビーズとFab単量体を除去した。続いて、潜在的に残っているFab単量体を検出するために、遊離したCD28+細胞を、αCD28 Fab多量体(右から2番目のドットプロット)で、またはαIgκmAb(右のドットプロット)で(再)染色した。生存(PI陰性)CD3+細胞のみが示される。ドットプロット内の数字は、ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。
(図23)図23(A〜C)は、実施例3に記載される可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン(n≧3)に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した精製済みのCD4+およびCD8+ Tレスポンダー細胞の活性化後のT細胞の早期クラスター形成を示す。図23AはCD4+ T細胞の結果を示し、図23BはCD8+ T細胞の結果を示す。可溶性の多量体形成試薬(オリゴマーのストレプトアビジンムテイン)で刺激したTresp、市販の抗CD3/抗CD28ビーズで刺激したTresp(陽性対照)、および非刺激T細胞(陰性対照)のデータが示される。
(図24)図24(A〜F)は、ペプチド:MHC分子複合体(細胞への一次活性化シグナルを提供する第1の作用物質として作用する)およびαCD28 Fabフラグメント(細胞の表面上のアクセサリー分子に結合する第2の作用物質として作用する)の両方を用いてインビトロで刺激した精製CD3+CD62L+CD45RA- TCMレスポンダー細胞のバルク集団からの選択的抗原特異的(Ag特異的)増大の動態を示す;非刺激T細胞(陰性対照)が示される。抗原特異的ペプチドとMHC分子との複合体およびαCD28 Fabフラグメントの両方を、実施例3に記載したのと同じ可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン(n≧3)に可逆的に固定化した。図24Aで抗原特異的増大に使用したペプチドは、サイトメガロウイルス(CMV)に特異的であるHLA-C7/IE-1エピトープを表す、HLA-C702 MHC分子によって制限された前初期1タンパク質のアミノ酸309〜317のペプチド:
であった(Ameres et al, PLOS Pathogens, May 2013, vol. 9, issue 5, e1003383に記載される)。該ペプチドを提示するMHC I分子は、その重鎖のC末端に、IBA GmbH (Goettingen, ドイツ)から「Twin-Strep-tag (登録商標)」として市販されているストレプトアビジン結合ペプチド:
を保有する。図24Aは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化された細胞に一次活性化シグナルを提供する第1の作用物質として、このHLA-C7/IE-1エピトープに特異的なペプチド:MHC-I複合体を用いて増殖させた、Ag特異的細胞の画分についての例示的なフローサイトメトリー分析を示す。図24B〜図24Eのグラフは、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに可逆的に固定化された細胞に一次活性化シグナルを提供する第一の作用物質として、抗原特異的ペプチドとMHC I分子との異なる複合体を用いて、図24Aと同様に時点ごとに採取された、特異的ペプチド:MHC I多量体陽性細胞の数に応じたさらなるAg特異性の増大動態を示す。より詳細には、図24Bは、CMVのpp65エピトープ(HLA-A2402によって制限されたアミノ酸341〜350:
)に特異的なペプチド:MHC-I複合体を用いて増大させたAg特異的細胞の増大を示す;図24Cは、CMVのpp65エピトープ(HLA-B702によって制限されたアミノ酸265〜274:
)に特異的な別のペプチド:MHC-I複合体を用いて増殖させたAg特異的細胞の増大を示す;図24Dは、アデノウイルスのヘキソン(hexon)5エピトープ(HLA-B702によって制限されたアミノ酸114〜124:
)に特異的なペプチド:MHC-I複合体を用いて増殖させたAg特異的細胞の増大を示す;図24Eは、CMVのHLA-B7/IE-1309〜317エピトープ(
)に特異的なペプチド:MHC-I複合体を用いて増殖させたAg特異的細胞の増大を示す(例示的なFACSデータ、上記図24A参照)。Twin Strep(登録商標)-Tagを有するすべてのペプチド:MHC分子は、IBA GmbHから市販されている。これに関連して、C末端に「Twin-Strep-tag(登録商標)」を有するHLA-A*2402、HLA-B*0702およびHLA-C*0702分子のアミノ酸配列は、添付の配列表にSEQ ID NO: 42、43および44として示され、一方β2ミクログロブリン(HLAコード化分子を意味するα鎖と共に、それぞれのMHC I分子を形成する)のアミノ酸配列は、添付の配列表にSEQ ID NO: 45として示される。また、図24Fは、図24DからのHLA-B7/ヘキソン5 114-124刺激/増大細胞についての14日間培養後のCD62LおよびCD127表面発現の例示的なフローサイトメトリー分析を示す。
(図25)図25は、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに第1および第2の作用物質として可逆的に固定化された、a)抗原特異的ペプチドMHC I複合体およびb)αCD28 Fabフラグメントを用いてインビトロで刺激した、精製CD3+CD62L+CD45RA-TCMレスポンダー細胞からの選択的Ag特異的増大の動態を示す。この目的のために、500,000個のCD3+CD62L+CD45RA-レスポンダーTCM細胞(Tresp)を、ストレプトアビジン結合ペプチドを備えた0.5μgのペプチド:MHCクラスI複合体(この特定のペプチドは、HLA-B0702によって制限されたアデノウイルスのヘキソン5タンパク質のアミノ酸114〜124:
を表す;上記参照)および0.5μgのαCD28 Fabで機能化されたStreptactin多量体形成試薬の調製物3μlを用いて、Ag特異的に刺激した。代替刺激として、Streptactin多量体形成試薬の調製物4.5μlに0.5μgのこのペプチド:MHCクラスI複合体、0.5μgのαCD8 Fabおよび0.5μgのαCD28 Fabを負荷した。比較のために、0.5μgのαCD3 Fabと0.5μgのαCD28 Fabとの組み合わせを負荷したStreptactin多量体形成試薬(1mg/ml)の調製物3μlを用いて、ポリクローナル刺激を行った。再び上記の代替刺激条件として、0.5μgのαCD3 Fab、0.5μgのαCD8 Fabおよび0.5μgのαCD28 Fabを負荷したStreptactin多量体の調製物4.5μlを使用した。未処理(非刺激)のTresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズでポリクローナル刺激したTresp細胞を陽性対照とした。Tresp細胞を、48ウェルプレートで、30U/mlのIL-2および5ng/mlのIL-15を補充した細胞培養培地1ml中に播種した。細胞を、3日ごとに培地交換して37℃でインキュベートし、細胞数を7日および14日後に分析した。図25に示す写真は、アデノウイルスのHLA-B7/ヘキソン5エピトープについて例示されるAg特異的刺激の5日目のクラスター形成の程度を表す。
(図26)図26(A〜B)は、αCD19キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように改変された形質導入Jurkat細胞の、可溶性多量体形成試薬として実施例3のオリゴマーStrep-tactin(登録商標)を用いて刺激された、細胞内シグナル伝達カスケードの活性化を示す。CARの特異性は、典型的には、CD19などの標的/腫瘍関連抗原に特異的に結合して、それをT細胞特異的シグナル伝達にリンクさせる、モノクローナル抗体(mAb)の抗原結合領域からアセンブルされたscFv領域に由来する(Hudecek et al, Clin Cancer Res. 2013 June 15; 19(12): 3153-3164に記載される)。この実験では、Jurkat細胞に一次活性化シグナルを提供する第1の作用物質として、αCD19 CARの天然リガンドを含むCD19の細胞外ドメイン(ECD)、ならびにαCD19-CAR内のIgG4スペーサーを認識するポリクローナルαIgG F(ab)2フラグメント(ロバ抗ヒトF(ab)2はJackson Immuno Research社から市販される)も使用した。可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインへの可逆的固定化は、CD19のECDのC末端に融合されたストレプトアビジン結合ペプチド:
によって、またはαIgGのビオチン化(Fab)2フラグメントによって提供された(ストレプトアビジンムテイン「m2」は低い親和性でビオチンに結合するので、この結合は可逆的であり、例えば、過剰の遊離ビオチンの添加によって置き換えられる)。図26Aの対照実験では、300,000個のCD3+ Jurkatレスポンダー細胞(Jresp)を、αCD3 FabおよびαCD28 Fabで機能化されたオリゴマーStreptactin (1mg/ml)の調製物の混合物の様々な量を用いて刺激した(「×1」は、0.5μgのaCD3 Fabおよび0.5μgのaCD28 Fabで機能化された3μgの多量体化Streptactinに相当する - ポリクローナル多量体化作用物質)。図26Bの実験では、オリゴマーStreptactinの調製物3μlがCD19の細胞外ドメイン(ECD) 0.5μg(×1)もしくは1μg(×2)で機能化された;または、オリゴマーStreptactinの調製物3μlがIgG4スペーサーを認識するαIgG 0.5μg(×1)もしくは1μg(×2)を負荷された(これらは両方ともCAR特異的多量体化作用物質である)。抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3およびαCD28モノクローナル抗体を不可逆的に固定化したビーズ)またはPMAおよびイオノマイシンで刺激したJrespを陽性対照として用いた。Jresp細胞を、1.5mlエッペンドルフチューブで30U/mlのIL-2を補充した細胞培養培地200μl中に播種した。細胞を37℃でインキュベートし、氷上に置き、0分から20分の刺激後に溶解させた。リン酸化ERKの検出は、活性MAPKシグナル伝達を示し、ハウスキーパーβアクチンの染色は、条件および時点ごとの総タンパク質の等量のローディングを示す。
(図27)フローサイトメトリーによって評価した、オリゴマームテインストレプトアビジン試薬に可逆的に結合したαCD3/αCD28 Fabによる刺激後のCD3+ T細胞におけるCa2+-流に及ぼすD-ビオチンの添加の影響を示す。多量体化試薬を60秒の時点(矢印「E」)で培養物に添加し、培養物をそのままにした(左パネル)か、または200秒の時点(矢印「B」)でD-ビオチンの添加および400秒の時点(矢印「I」)でイオノマイシンの添加によってさらに処理した。
(図28A)培養中0、3および7日目に評価した、αCD3/αCD28 Fabと可逆的に結合した多量体化作用物質(1日目にD-ビオチンの添加ありもしくはなし)による刺激または対照抗CD3/抗CD28ビーズによる刺激後のCD3+ T細胞の活性化から生じる細胞計数(増大の程度)を示す。非刺激細胞を陰性対照として含めた。**: p ≦ 0.05, 対応のある両側t検定。
(図28B)培養中3および7日目に評価した、αCD3/αCD28 Fabと可逆的に結合した多量体化作用物質(1日目にD-ビオチンの添加ありもしくはなし)による刺激または対照抗CD3/抗CD28ビーズによる刺激後のCD3+ T細胞の活性化から生じるアネキシンV陽性細胞(アポトーシスを示す)のパーセントを示す。非刺激細胞を陰性対照として含めた。**: p ≦ 0.05, 対応のある両側t検定。
(図29)培養中3日目(d3)および7日目(d7)にCFSE希釈を測定することによって評価した、αCD3/αCD28 Fabと可逆的に結合した多量体化作用物質(2日目にD-ビオチンの添加ありもしくはなし)による刺激または対照抗CD3/抗CD28ビーズによる刺激後のCD3+ T細胞の活性化から生じる細胞周期進入および増殖を示す。非刺激細胞を陰性対照として含めた。
(図30)培養中24時間および72時間の時点でWST-1アッセイ法により評価した、αCD3/αCD28 Fabと可逆的に結合した多量体化作用物質(2日目にD-ビオチンの添加ありもしくはなし)による刺激または対照抗CD3/抗CD28ビーズによる刺激後のCD4-またはCD8-精製T細胞の代謝活性を示す。非刺激細胞を陰性対照として含めた。
(図31)αCD3/αCD28 Fabと可逆的に結合した多量体化作用物質で刺激され、(1) 分裂細胞の選別後にさらに培養され、かつさらには刺激されていない(選別精製)、(2) 分裂細胞の選別後にさらに培養され、かつ多量体化作用物質で再刺激された(選別精製、再刺激)または(3) 選別なしでさらに培養され、もしくはさらに再刺激された(非選別) CD3+ T細胞の増大能を示す。全ての条件についてさらなる培養後1日目にD-ビオチンを添加した(破線)。
T細胞のような標的細胞の組成物を刺激する、例えば、増大する、その生存または持続性、その分化を誘導するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、本方法は、受容体結合分子のような、標的細胞の表面上の分子に結合し、それによって細胞に、場合によっては一次活性化シグナルでありうる、シグナルを提供することができる可逆的試薬システムに関する。いくつかの態様において、本方法は、一次活性化シグナルおよび/またはアクセサリーシグナルもしくは共刺激シグナルのような、シグナルを細胞に提供する、1つまたは複数の作用物質、例えば第1の作用物質、第2の作用物質などが結合している多量体形成試薬でありうる、試薬を利用する。いくつかの態様において、一次活性化シグナルは、それ自体として、増大/増殖するように細胞を活性化するのに十分でありうる。この第1の作用物質は、多量体形成試薬に可逆的にまたは不可逆的に結合することができる。多量体形成試薬は、細胞の表面上のアクセサリー分子を刺激する第2の作用物質にも結合していてもよい。第2の作用物質は、細胞表面上の表面のアクセサリー分子に結合すると、それにより活性化細胞を刺激して増大させうる。また、この第2の作用物質は、多量体形成試薬に可逆的にまたは不可逆的に結合することができる。いくつかの局面において、1つまたは複数の追加の作用物質を利用して、細胞において追加のシグナルをモジュレートまたは誘導することもできる。いくつかの態様において、提供される方法は、可逆的試薬の時間制御妨害によって細胞の刺激を一時的に制御する段階を伴う。
いくつかの態様において、本方法は、標的細胞を含む複数の細胞を、作用物質が可逆的に結合している1つまたは複数の多量体形成試薬と接触させる段階のような、インキュベートする段階を伴う。いくつかの態様において、多量体形成試薬は、固体支持体上に固定化されていてもまたは可溶性であってもよく、それによって細胞のインキュベーションの少なくとも一部の間に、細胞は多量体形成試薬と接触する。1つの局面において、本明細書に開示される方法は、細胞集団の連続的増大であり、その中で完全なリンパ球集団が刺激/増大され、増大に必要とされる試薬はその後、適当な固定相上でのクロマトグラフィーにより取り除かれる。いくつかの態様において、培養細胞である増大/刺激された細胞は、任意で、例えばT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)をトランスフェクトされ、そしていくつかの局面において、導入されたT細胞受容体またはキメラ抗原受容体に結合する異なる刺激分子を用いた第2の刺激増大に供され得る。
いくつかの態様において、本方法は、細胞の表面上の分子(細胞表面分子)に結合することができる少なくとも1つの作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)が試薬に可逆的に結合されている可逆的システムを使用する。いくつかの例において、試薬は、作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む。いくつかの例において、試薬は、多量体形成試薬である。いくつかの態様において、少なくとも1つの作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)は、その分子のエピトープまたは領域に特異的に結合することができる少なくとも1つの結合部位Bを含み、かつ試薬の少なくとも1つの結合部位Zに特異的に結合する結合パートナーCも含む。いくつかの例において、結合パートナーCと少なくとも1つの結合部位Zとの間の結合相互作用は、非共有結合的相互作用である。いくつかの態様において、結合パートナーCと少なくとも1つの結合部位Zとの間の結合相互作用、例えば非共有結合的相互作用は、可逆的である。
いくつかの態様において、試薬は、作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合することができる1つまたは複数の結合部位Zを含む。いくつかの態様において、試薬は、試薬が複数の作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)に可逆的に結合することができる、例えば多量体形成試薬であるよう、各々が作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)に含まれる結合パートナーCに特異的に結合することができる複数の結合部位Zを含む。いくつかの態様において、試薬は、個別分子(例えば、単量体)のオリゴマーもしくはポリマー、または各々が少なくとも1つの結合部位Zを含む個別分子を形成する複合体(例えば、四量体)である。いくつかの態様において、試薬は、少なくとも2つの結合部位Z、少なくとも3つの結合部位Z、少なくとも4つの結合部位Z、例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72個またはそれ以上の結合部位Zを含む。結合部位はすべて同じであり得るか、または複数の結合部位は1つもしくは複数の異なる結合部位(例えば、Z1、Z2、Z3等)を含み得る。
1. 支持体
いくつかの態様において、試薬は、支持体、例えば固体支持体もしくは表面、例えばビーズ、または固定相(クロマトグラフィーマトリクス)に含まれる。いくつかのそのような態様において、試薬は、支持体に可逆的に固定化される。いくつかの例において、試薬は、共有結合を通じて支持体に固定化される。いくつかの局面において、試薬は、非共有結合により支持体に可逆的に固定化される。
いくつかの態様において、試薬は、固体支持体に結合されない、すなわち、それは可溶性形態で存在するかまたは可溶性である。原則として、支持体、例えば固体支持体または固定相に固定化される試薬の場合と同じ試薬が使用され得る。例えば、上記の試薬の任意の例が、そのような試薬を支持体に固定化または付加することなく、例えば、固体支持体または固定相に付加せずに使用され得る。いくつかの態様において、試薬は、結合パートナーCとの相互作用を通じた結合物質への可逆的結合のための複数の結合部位Zを含む。いくつかの例において、試薬は、個別分子のオリゴマーもしくはポリマー、または個別分子を形成するサブユニットの複合体のオリゴマーもしくはポリマー(例えば、二量体、三量体もしくは四量体タンパク質のオリゴマーもしくはポリマー)である。いくつかの態様において、試薬は、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー、カルモジュリンオリゴマー、あるいは、遷移金属イオンに結合することができ、それによってその試薬をオリゴヒスチジン親和性タグ、多量体グルタチオン-S-トランスフェラーゼまたはビオチニル化担体タンパク質に結合できるようにする少なくとも2つのキレート基Kを提供する化合物(オリゴマー)であり得る。
いくつかの態様において、作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)は、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面分子に結合するための1つまたは複数の結合部位Bを有する。したがって、いくつかの例において、作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)は、1つの結合部位Bまたは複数の結合部位Bを含み、作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)と標的細胞の表面上の分子との間の特異的結合は、Bと分子との間の相互作用を含む。いくつかの態様において、作用物質は、1つの結合部位しか含まない、すなわち一価である。いくつかの態様において、作用物質(例えば、受容体結合物質または選択物質)は、細胞表面分子に結合することができる少なくとも2つ、例えば、3つ、4つまたは5つの結合部位Bを含む複数の結合部位Bを有する。いくつかのそのような局面において、少なくとも2つまたは複数の結合部位Bは、同一であり得る。いくつかの態様において、少なくとも2つまたは複数の結合部位Bの1つまたは複数は、異なり得る(例えば、B1およびB2であり得る)。
(Strep-tag(登録商標)とも呼ばれ、SEQ ID NO:7に示される)である。1つの例において、ペプチド配列は、
(Strep-tag(登録商標)IIとも呼ばれ、SEQ ID NO:8に示される)である。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続的配置を含み、2つのモジュール間の距離は少なくとも0かつ50アミノ酸以下であり、1つの結合モジュールは3〜8アミノ酸を有し、少なくとも配列His-Pro-Xaa(SEQ ID NO:9)を含み、Xaaはグルタミン、アスパラギンまたはメチオニンであり、他の結合モジュールは、(例えばSEQ ID NO:11に示される)同じまたは異なるストレプトアビジンペプチドリガンドを有する(例えば、国際公開PCT出願番号WO02/077018;米国特許第7,981,632号を参照のこと)。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、SEQ ID NO:13または14のいずれかに示される式を有する配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドリガンドは、SEQ ID NO:15〜19のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する。大部分の例において、すべてのこれらのストレプトアビジン結合ペプチドは、同じ結合部位、すなわちストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する。そのようなストレプトアビジン結合ペプチドの1つまたは複数がビオチンパートナーC、例えばC1およびC2として使用される場合、多量体形成試薬は典型的に、ストレプトアビジンムテインである。
(Strep-tag(登録商標)IIとも呼ばれ、SEQ ID NO:8に示される)を含み得る。
、マルトース結合タンパク質(MBP)、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Dの配列
のHSVエピトープ、配列
の転写因子c-mycの「myc」エピトープ、V5タグ
またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を含み得る。そのような態様において、抗体または抗体フラグメントであり得る試薬の1つまたは複数の結合部位Zと抗原との間で形成される複合体は、遊離抗原、すなわち遊離ペプチド(エピトープタグ)または遊離タンパク質(例えば、MBPもしくはCBP)を添加することによって競合的に妨げられ得る。いくつかの態様において、親和性タグはまた、オリゴヌクレオチドタグであり得る。いくつかの例において、そのようなオリゴヌクレオチドタグは、例えば、試薬に連結されたまたは試薬に含まれる相補的配列を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるために使用され得る。
およびN-メタクリロイル-(L)-システインメチルエステルを含むオリゴヒスチジン含有配列に結合させるために使用される。
いくつかの態様において、作用物質は、受容体結合物質である。いくつかの態様において、受容体結合物質は、細胞の表面上の分子(例えば、受容体)に結合し、作用物質と分子との間の結合は、細胞内でシグナルを誘導または調整することができる。いくつかの例において、細胞表面分子(例えば、受容体)は、シグナル伝達分子である。いくつかのそのような例において、受容体結合物質は、1つまたは複数の細胞によって発現されるシグナル伝達分子に特異的に結合することができる。いくつかの例において、受容体結合物質は、刺激物質であり、刺激物質は、細胞表面分子、例えば受容体への結合により細胞(例えば、T細胞)内でシグナルを誘導することができる任意の作用物質であり得る。
いくつかの態様において、第1の受容体結合物質、例えば第1の刺激物質は、細胞、例えばT細胞内でTCR/CD3複合体関連シグナル(例えば、TCRの関与を介したシグナル1)を刺激し得る。いくつかの局面において、第1の受容体結合物質、例えば第1の刺激物質は、CD3に特異的に結合する結合物質であり得る。いくつかの例において、CD3に特異的に結合する第1の受容体結合物質、例えば第1の刺激物質は、抗CD3抗体、抗CD3抗体の二価抗体フラグメント、抗CD3抗体の一価抗体フラグメントおよび抗体様結合特性を有するタンパク質性CD3結合分子からなる群より選択され得る。二価抗体フラグメントは、F(ab')2フラグメントまたは二価単鎖Fvフラグメントであり得、一価抗体フラグメントは、Fabフラグメント、Fvフラグメントおよび単鎖Fvフラグメント(scFv)からなる群より選択され得る。いくつかの例において、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD3結合分子は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとしたムテイン、グルボディ、アンキリンスキャホールドをベースにしたタンパク質、結晶性スキャホールドをベースにしたタンパク質、アドネクチンまたはアビマーであり得る。
いくつかの態様において、受容体結合物質、例えば、第2の受容体結合物質、例えば刺激物質は、分子を発現する細胞、例えばT細胞またはB細胞に対して、共刺激シグナルまたはアクセサリーシグナルを提供する分子に結合する。いくつかの態様において、受容体結合物質、例えば刺激物質は、分子を発現する細胞、例えばT細胞に対して、T細胞活性化シグナル2、例えば共刺激シグナルを刺激または活性化する分子に結合する。いくつかの態様において、受容体結合物質は、分子を発現する細胞、例えばT細胞に対してアクセサリーシグナルを提供する。
いくつかの態様において、第2または追加の受容体結合物質でありうる受容体結合物質に対する、細胞、例えばT細胞上の分子は、作用物質の結合時に、サイトカインシグナル、ケモカインシグナル、細胞接着シグナル、T細胞活性化シグナル3または追加のシグナル、例えば環境シグナルを刺激または活性化する細胞表面分子に結合する。いくつかの態様において、第2または追加の受容体結合物質でありうる受容体結合物質が特異的に結合する細胞、例えばT細胞上の分子は、サイトカイン受容体またはケモカイン受容体である。場合によっては、受容体結合物質、例えば追加の受容体結合物質は、接着分子であるか、またはそれを含み、サイトカイン産生、ケモカイン産生、接着分子の発現を誘導する因子であり、ならびに/あるいはアクセサリーシグナルおよび/または追加のシグナル、例えば環境シグナルを刺激および/またはモジュレートすることに関与している。
いくつかの態様において、作用物質は選択物質である。いくつかの態様において、選択物質は、細胞表面分子のような、細胞の表面上の分子に結合する。場合によっては、細胞表面分子は選択マーカーである。そのような場合には、選択物質は、1つまたは複数の細胞によって発現される選択マーカーに特異的に結合することができる。いくつかの態様において、試薬に可逆的に結合する選択物質を用いて、細胞の選択または単離を容易にすることができる。
組成物中の標的細胞(例えば、T細胞)の表面上の分子に結合することができ、かつ作用物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されている作用物質(例えば、第1の、第2の、および/またはさらなる受容体結合物質、例えば刺激物質、または選択物質)の存在下で、標的細胞(例えば、T細胞)を含む該組成物をインキュベートする工程を含む細胞を培養する方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、インキュベーションは、作用物質が細胞上の分子に結合する、例えば特異的に結合する条件下で実施される。いくつかの例において、特定の受容体結合物質(例えば、刺激物質)に関して、そのような結合は、組成物中の標的細胞(例えば、T細胞)においてシグナル、例えば、記載されるような一次シグナルまたはアクセサリーシグナルを誘導または調節することができる。いくつかの態様において、分子に対する作用物質の結合は、組成物中の標的細胞の刺激、活性化、増大(増殖)および/または分化の1つまたは複数をもたらす。
いくつかの態様において、細胞集団の試料は、任意の適当な供給源、典型的には体組織または体液、例えば血液の、すべての試料由来であり得る。後者の例において、試料は、例えば、標準的な単離方法、例えば、血液細胞のフィコール勾配によって取得され得る末梢血単核細胞(PBMC)の集団であり得る。刺激または増大される細胞集団は、しかし、精製された形態でもあり得、米国特許7,776,562、米国特許8,298,782、国際特許出願公開WO02/054065または国際特許出願公開WO2013/011011に記載される可逆的細胞染色/単離技術を用いて単離され得る。あるいは、細胞の集団はまた、米国特許6,352,694 B1または欧州特許出願EP 0 700 430 B1に記載される負の磁気免疫付着を通じた細胞選別によって取得され得る。本明細書に記載される単離方法が基礎研究で使用される場合、試料は、インビトロ細胞培養実験の細胞であり得る。試料は典型的に、液体、例えば溶液または分散液の形態で調製され得る。
いくつかの態様において、細胞の調製は、1回または複数回の培養および/または調製工程を含む。細胞は、試料、例えば生物学的試料、例えば対象から得られたまたは対象由来のものから単離され得る。いくつかの態様において、細胞を単離する対象は、疾患もしくは状態を有する者または細胞療法を必要とする者または細胞療法を受けるであろう者である。対象は、いくつかの態様において、特定の治療的介入、例えばそのために細胞を単離、処理および/または改変する養子細胞療法を必要とするヒトである。
いくつかの態様において、装置または製造物品も提供される。いくつかの態様において、バイオリアクターおよびクロマトグラフィーのための第1の固定相の配置が提供される。バイオリアクターは、細胞の増大に適しており、固定相は、細胞の分離および試薬の除去に適している。第1の固定相は、ゲル濾過マトリクスおよび/または親和性クロマトグラフィーマトリクスであり、ゲル濾過マトリクスおよび/または親和性クロマトグラフィーマトリクスは、親和性試薬、例えば記載されたような多量体形成試薬を含み、該試薬は、第1の作用物質に含まれる結合パートナーC(例えば、C1)に特異的に結合する結合部位Z(例えば、Z1)を含み、かつ/または親和性試薬、例えば記載されたような多量体形成試薬は、第2の作用物質に含まれる結合パートナーC(例えば、C2)に特異的に結合する結合部位Z(例えば、Z2)を含む。いくつかの態様において、ゲル濾過マトリクスおよび/または親和性クロマトグラフィーマトリクスは、親和性試薬、例えば記載されたような多量体形成試薬を含み、該試薬は、追加の作用物質に含まれる結合パートナーC(例えば、第1または第2の作用物質に含まれるものと同じまたは異なる)に特異的に結合する結合部位Z(例えば、第1または第2の作用物質と同じまたは異なる)を含む。それによって第1の固定相は、第1の作用物質、第2の作用物質、および/または追加の作用物質、結合パートナーC、例えば第1の結合パートナーC1および/または遊離した第2の結合パートナーC2を自身に固定化するのに適している。加えて、バイオリアクターおよび固定相は、流体的に接続される。この配置は、上で説明されているような連続増大で使用され得、公知の細胞増大システム、例えばQuantum(登録商標)細胞増大システムまたはXuri Cell Expansion System W25に組み込まれ得る。
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法にしたがい生成または生産された培養細胞を含み得る培養標的細胞(例えば、培養T細胞)は、それらの増殖能、表面マーカー発現、分化状態、活性化状態および/または代謝プロフィールに基づくまたは関連する1つまたは複数の特定の表現型および/または機能的特徴を示す。いくつかの態様において、提供される方法のいずれかにしたがう標的細胞の培養(例えば、T細胞の培養)は、細胞の機能(例えば、機能的活性の増加もしくは減少)または表現型(例えば、マーカーもしくはマーカー群のより高いもしくはより低い発現)に関連するパラメータを、本明細書に提供される方法にしたがうインキュベート前の組成物中の細胞の対応するまたは各々の機能または表現型と比較して変化させる。いくつかの態様において、培養T細胞は、増大および/もしくは増殖活性、CD4+/CD8+ T細胞分布もしくは比率、表面マーカー発現、機能的活性または代謝プロフィールのパラメータに関する変化を示す。
いくつかの態様において、培養細胞は、操作された受容体、例えばキメラ抗原受容体 (CAR) またはT細胞受容体 (TCR) などの操作された抗原受容体を含有するか、または含有するように操作される。そのような細胞の集団、T細胞またはCD8+細胞もしくはCD4+細胞などのある特定の型の細胞が濃縮または選択されているような、そのような細胞を含有するおよび/またはそのような細胞について濃縮された組成物もまた提供される。組成物には、薬学的組成物、および養子細胞療法などのための投与用の製剤が含まれる。対象、例えば患者に、細胞および組成物を投与する治療法もまた提供される。
遺伝子操作された細胞を生成するための方法、核酸、組成物、およびキットが提供される。遺伝子操作は一般に、レトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換などによる、組換え構成成分または操作された構成成分をコードする核酸の、培養細胞を含有する組成物への導入を含む。
細胞は一般に、組換え受容体、例えば抗原受容体などを発現し、これには機能的非TCR抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体 (CAR)、および他の抗原結合受容体、例えばトランスジェニックT細胞受容体 (TCR) などが含まれる。受容体には、他のキメラ受容体もまた含まれる。
いくつかの態様において、遺伝子操作された抗原受容体には、組換えT細胞受容体 (TCR) および/または天然に存在するT細胞からクローニングされたTCRが含まれる。いくつかの態様では、標的抗原(例えば、がん抗原)に対する高親和性T細胞クローンが、同定され、患者から単離され、細胞に導入される。いくつかの態様において、標的抗原に対するTCRクローンは、ヒト免疫系遺伝子(例えば、ヒト白血球抗原系またはHLA)を用いて操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製されている。例えば、腫瘍抗原を参照されたい(例えば、Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180およびCohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808を参照されたい)。いくつかの態様では、標的抗原に対するTCRを単離するために、ファージディスプレイが使用される(例えば、Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395およびLi (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354を参照されたい)。
いくつかの態様において、細胞および方法は、それぞれが同じまたは異なる抗原を認識し、典型的にはそれぞれが異なる細胞内シグナル伝達構成成分を含む、2種またはそれ以上の遺伝子操作された受容体を細胞上に発現させるなどのマルチターゲティング戦略を含む。そのようなマルチターゲティング戦略は、例えば、国際特許出願公開WO2014055668 A1(例えば、オフターゲット細胞、例えば正常細胞上には個々に存在するが、処置されるべき疾患または状態の細胞上にのみ共に存在する2種類の異なる抗原を標的とする、活性化CARと共刺激CARとの組み合わせを記載している)、およびFedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013)(活性化CARおよび阻害性CARを発現する細胞、例えば、活性化CARが、正常細胞または非罹患細胞と処置されるべき疾患または状態の細胞との両方に発現されるある抗原に結合し、阻害性CARが、正常細胞または処置が望ましくない細胞にのみ発現される別の抗原に結合する細胞などを記載している)に記載されている。
遺伝子操作された構成成分、例えば抗原受容体、例えばCARまたはTCRを導入するための様々な方法が周知であり、提供される方法および組成物と共に使用され得る。例示的な方法には、ウイルス、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、およびエレクトロポレーションによるものを含む、受容体をコードする核酸を導入するための方法が含まれる。
操作された受容体(例えば、操作された抗原受容体)、例えばCARまたはTCRを含有する組成物、ならびに、操作された細胞を含有する組成物例えば薬学的組成物および製剤、もまた提供される。本明細書で提供される方法のいずれかによって生成される複数の培養T細胞または標的細胞、および任意で薬学的に許容される賦形剤を含有する組成物もまた提供される。抗原が発現される疾患、状態、および障害の処置における、または検出、診断、および予後診断方法におけるような、組成物の使用方法およびその使用もまた提供される。
「薬学的製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であって、かつその製剤が投与される対象にとって容認できないほどの毒性がある付加的な構成成分を含有しない調製物を指す。
細胞、集団、および組成物を投与する方法、ならびにがんを含む疾患、状態、および障害を処置または予防するためのそのような細胞、集団、および組成物の使用が提供される。いくつかの態様では、細胞、集団、および組成物が、例えば養子T細胞療法などの養子細胞療法によって、処置されるべき特定の疾患または状態を有する対象または患者に投与される。いくつかの態様では、操作された組成物ならびにインキュベーションおよび/または他の加工段階の後の生成終了組成物などの、提供される方法によって調製された細胞および組成物が、疾患もしくは状態を有するかまたはそれらのリスクがある対象などの対象に投与される。いくつかの局面において、本方法はそれにより、操作されたT細胞によって認識される抗原を発現するがんにおける腫瘍量を減らすことなどによって、疾患または状態の1つまたは複数の症状を処置する、例えば改善する。
特に定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語、表記、ならびに他の技術用語および科学用語または用語法はすべて、特許請求される主題が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語を、明確にするためにおよび/またはすぐに参照できるように本明細書において定義するが、本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野において一般に理解されているものとの実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
提供される態様は、以下である。
1.以下の工程を含む、T細胞を培養するための方法:
(a)(i)受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)該組成物中のT細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる受容体結合物質の存在下で、T細胞を含む組成物をインキュベートする工程;および
(b)該インキュベーションの開始後5日以内に、受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊し、それによって培養T細胞が生成される工程。
2.受容体結合物質が分子に特異的に結合しそれによって、組成物中の1つまたは複数のT細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、態様1に記載の方法。
3.前記破壊が、前記インキュベーションの開始後30分を超えてからもたらされる、態様1または態様2に記載の方法。
4.前記破壊が、前記インキュベーションの開始後1時間〜4日、前記インキュベーションの開始後6時間〜3日、前記インキュベーションの開始後12時間〜2日、もしくは前記インキュベーションの開始後1日〜3日にもたらされる;または
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後約1時間〜約4日、前記インキュベーションの開始後約6時間〜約3日、前記インキュベーションの開始後約12時間〜約2日、もしくは前記インキュベーションの開始後約1日〜約3日にもたらされる;または
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後約1時間もしくはそれを超えてから、前記インキュベーションの開始後1日、2日、3日、もしくは4日以内に、もたらされる、
態様1〜3のいずれか1つに記載の方法。
5.受容体結合物質が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができ;かつ/または
受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し;かつ/または
受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、
態様1〜4のいずれか1つに記載の方法。
6.分子が、TCR/CD3複合体の構成成分であるか、またはCD3である、態様1〜5のいずれか1つに記載の方法。
7.分子が第1の分子であり、受容体結合物質がさらに、1つまたは複数のT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができ、該第2の分子が、任意で、T細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを誘導するかもしくは増強するか、減衰させるか、または改変することができる、態様1〜6のいずれか1つに記載の方法。
8.受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み;かつ
複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、
態様1〜7のいずれか1つに記載の方法。
9.前記破壊が、受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含む、態様1〜8のいずれか1つに記載の方法。
10.受容体結合物質が第1の受容体結合物質であり、1つまたは複数のT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる第2の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第2の分子が、任意で、T細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変することができる、態様1〜9のいずれか1つに記載の方法。
11.試薬が、第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含み、それによって、第2の受容体結合物質が該試薬に可逆的に結合されている、態様10に記載の方法。
12.第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位、および第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位が、同じであるかまたは異なることができる、態様11に記載の方法。
13.第2の受容体結合物質が、2つ以上の結合部位Z1に可逆的に結合することができる結合パートナーC1またはC2を含み、それによって、第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質が、2つ以上の結合部位Z1を介して試薬に可逆的に結合されており;かつ/または
第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、該試薬が、結合パートナーC2に結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる複数の結合部位Z2をさらに含む、
態様11または態様12に記載の方法。
14.C2およびC1が、同じもしくは実質的に同じであるか、または、同じもしくは実質的に同じ部分を含有し;かつ/または
Z1およびZ2が、同じもしくは実質的に同じであるか、または、同じもしくは実質的に同じ部分を含有する、
態様13に記載の方法。
15.試薬が第1の試薬であり、少なくとも、第2の受容体結合物質に可逆的に結合されている第2の試薬の存在下で、インキュベーションが実行される、態様1〜14のいずれか1つに記載の方法。
16.第2の受容体結合物質が第2の分子に特異的に結合しそれによってT細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変するシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、態様10〜15のいずれか1つに記載の方法。
17.前記破壊が、第1の受容体結合物質と試薬との間、および/または第2の受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含む、態様7〜16のいずれか1つに記載の方法。
18.前記破壊が、第1の受容体結合物質によって誘導またはモジュレートされたシグナルを終結または減少させ、かつ、第2の受容体結合物質によって誘導またはモジュレートされたシグナルを終結または減少させる、態様7〜17のいずれか1つに記載の方法。
19.以下の工程を含む、T細胞を培養するための方法:
(a)T細胞を含む組成物を、
(i)T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを誘導またはモジュレートする様式で、T細胞の表面上に発現している第1の分子に特異的に結合することができる、第1の受容体結合物質;および
(ii)(i)第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変するようにT細胞において第2のシグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる、第2の受容体結合物質
の存在下でインキュベートする工程;ならびに
(b)該インキュベーションの開始後5日以内に、第2の受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊し、それによって培養T細胞が生成される工程。
20.第1の受容体結合物質が第1の分子に特異的に結合しかつ/または第2の受容体結合物質が第2の分子に特異的に結合しそれによってT細胞において1つまたは複数のシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、態様19に記載の方法。
21.第2の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み;かつ
複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、
態様19または態様20に記載の方法。
22.第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のシグナルである;
第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる;または
第2の分子が、共刺激分子、アクセサリー分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子であるか、または、TNFファミリーもしくはTNF受容体ファミリーのメンバーである、
態様7〜21のいずれか1つに記載の方法。
23.第2の分子が、CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択される、態様7〜22のいずれか1つに記載の方法。
24.第2の分子がCD28である、態様7〜23のいずれか1つに記載の方法。
25.前記破壊が、第2の受容体結合物質と、第2の試薬であることができる試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含む、態様7〜24のいずれか1つに記載の方法。
26.前記破壊が、第2の受容体結合物質によって誘導もしくはモジュレートされたシグナルを終結もしくは減少させる;または
追加の分子がCD28であり、破壊が、T細胞においてCD28共刺激シグナルを終結もしくは減少させる、
態様7〜25のいずれか1つに記載の方法。
27.前記破壊の後、T細胞を含む組成物をさらにインキュベートする工程を含む、態様1〜26のいずれか1つに記載の方法。
28.インキュベーションおよびさらなるインキュベーションが、同じ容器において実行され;かつ/または
さらなるインキュベーションが、物質の存在下で実行され;かつ/または
前記方法が、物質、受容体結合物質、第2の受容体結合物質、および/もしくは試薬を、さらなるインキュベーションの前に細胞組成物から除去する工程を含まない、
態様27に記載の方法。
29.インキュベーションおよび/もしくはさらなるインキュベーションが、37℃±2℃でもしくは約37℃±2℃で実行され;かつ/または
インキュベーションおよび/もしくはさらなるインキュベーションが、T細胞にシグナルを送達することができるさらなる作用物質の存在下で実行される、
態様1〜28のいずれか1つに記載の方法。
30.さらなる作用物質が、T細胞、CD4+ T細胞、および/またはCD8+ T細胞の増殖を増強または誘導することができる、態様29に記載の方法。
31.さらなる作用物質が、IL-2、IL-15、およびIL-7の中から選択されるサイトカインである、態様30に記載の方法。
32.さらなるインキュベーションが、14日を超えない、12日を超えない、10日を超えない、8日を超えない、または6日を超えない期間にわたって実行される、態様27〜32のいずれか1つに記載の方法。
33.以下の工程を含む、T細胞を培養するための方法:
T細胞を含む組成物を、細胞においてCD28を介したシグナル伝達をもたらす条件下で、T細胞の表面上のCD28分子に特異的に結合する受容体結合物質の存在下でインキュベートする工程;および
該インキュベーションの開始後5日以内に、受容体結合物質とCD28分子との結合を排除するかまたは低減させ、これにより、CD28シグナル伝達が細胞において終結または減少し、それによって培養T細胞が生成される工程。
34.排除または低減が、インキュベーションの開始後4日以内、3日以内、2日以内、または1日以内にもたらされる、態様33に記載の方法。
35.排除または低減が、
それによって、CD28に特異的に結合されていない任意の受容体結合物質が組成物から除去されるかもしくは低減する、細胞の洗浄;または
受容体結合物質を組成物から除去するためもしくは低減させるための細胞の洗浄を任意でさらに含む、受容体結合物質とCD28分子との間の結合相互作用の逆転
を含む、態様33または態様34に記載の方法。
36.インキュベーションの少なくとも一部の間、および/またはインキュベーションの後に、組成物中のT細胞を、TCR/CD3複合体の分子に特異的に結合する作用物質の存在下でインキュベートし、それによって、TCR/CD3複合体関連シグナルが細胞において誘導またはモジュレートされる、態様33〜35のいずれか1つに記載の方法。
37.T細胞を含む組成物を、(i)受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており;かつ(ii)T細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式でCD28またはCD3以外のT細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる受容体結合物質の存在下で、インキュベートし、それによって培養T細胞が生成される工程を含む、T細胞を培養するための方法。
38.受容体結合物質が分子に特異的に結合しそれによってT細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、態様37に記載の方法。
39.シグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナルではない、態様37または態様38に記載の方法。
40.受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、態様37〜39のいずれか1つに記載の方法。
41.受容体結合物質が第2の受容体結合物質であり、分子が第2の分子であり、1つまたは複数のT細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合することができる第1の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第1の分子が、任意で、組成物中の1つまたは複数のT細胞において第1のシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、態様37〜40のいずれか1つに記載の方法。
42.第1の受容体結合物質が、第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質に対する複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されている;または
第1の受容体結合物質が、第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む第2の試薬に可逆的に結合されている、
態様41に記載の方法。
43.第1の受容体結合物質が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができ;かつ/または
第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し;かつ/または
第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、
態様41または態様42に記載の方法。
44.第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、もしくは改変することができる;または
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる、
態様41〜43のいずれか1つに記載の方法。
45.T細胞を含む組成物を、
(i)(i)第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)該組成物中のT細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合することができる、第1の受容体結合物質;および
(ii)(i)第2の受容体結合物質に対する複数の結合部位をさらに含む試薬に、または第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む第2の試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)該組成物中のT細胞において第2のシグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができ、該第2の分子がCD28以外である、第2の受容体結合物質
の存在下でインキュベートする工程であって、組成物中のT細胞においてシグナルおよび/または第2のシグナルが誘導またはモジュレートされる条件下で該インキュベーションが行われ、それによって培養T細胞が生成される工程を含む、T細胞を培養するための方法。
46.第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し、かつ/または、第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、態様44に記載の方法。
47.第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のシグナルを誘導もしくはモジュレートすることができ;かつ/または
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、もしくは改変することができる;または
第2の分子に対する第2の受容体結合物質の特異的結合が、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる、
態様45または態様46に記載の方法。
48.第2の分子であることができる分子が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択され;かつ/または
第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、もしくはHVEMに特異的に結合する、
態様37〜47のいずれか1つに記載の方法。
49.第2の分子であることができる分子が、CD137ではなく、かつ/または、第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、CD137に特異的に結合しない、態様37〜48のいずれか1つに記載の方法。
50.第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質が、試薬に可逆的に結合し;かつ
(i)第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質が、各々個々に、結合パートナーC1を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第1および第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含むか;または
(ii)第1の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1および結合パートナーC2に結合して第1および第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含むか;または
(iii)第1の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第1の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1、および各々が結合パートナーC2に結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z2を含む
のいずれかである、
態様42〜49のいずれか1つに記載の方法。
51.標的細胞を含む組成物を、(i)受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含むストレプトアビジン類似体またはムテインである試薬に可逆的に結合されており;かつ(ii)該組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式で標的細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる受容体結合物質の存在下で、インキュベートし、該ストレプトアビジンムテインが、正味の負電荷を含むか、またはSEQ ID NO: 4もしくはSEQ ID NO: 6に示されるストレプトアビジンムテインの等電点未満の等電点を呈し、それによって培養標的細胞が生成される工程を含む、標的細胞を培養するための方法。
52.標的細胞を含む組成物を、(i)受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含むストレプトアビジン類似体またはムテインである試薬に可逆的に結合されており;かつ(ii)該組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式で標的細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる受容体結合物質の存在下で、インキュベートし、該ストレプトアビジン類似体またはムテインが、アミノ酸の配列
を含むストレプトアビジン結合ペプチドに対して、SEQ ID NO: 1〜6のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含むストレプトアビジンまたはムテインよりも高い親和性を呈し、それによって培養標的細胞が生成される工程を含む、標的細胞を培養するための方法。
53.受容体結合物質が分子に特異的に結合しそれによって組成物中の1つまたは複数の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、態様51または態様52に記載の方法。
54.複数の結合部位が、2つ以上の結合部位Z1を含み;かつ
受容体結合物質が、結合部位Z1に可逆的に結合することができる結合パートナーC1を含み、C1とZ1との間の可逆的結合が、受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合をもたらす、
態様51〜53のいずれか1つに記載の方法。
55.ストレプトアビジン類似体またはムテインが、複数の結合部位Z1を含み、複数の受容体結合物質が、試薬に可逆的に結合されている、態様54に記載の方法。
56.標的細胞が血液細胞を含み;
標的細胞が白血球を含み;
標的細胞がリンパ球を含み;
標的細胞がB細胞を含み;
標的細胞がB細胞集団を含み;
標的細胞がT細胞を含み;
標的細胞がT細胞集団を含み;かつ/または
標的細胞がナチュラルキラー(NK)細胞を含む、
態様51〜56のいずれか1つに記載の方法。
57.標的細胞が、抗原特異的T細胞もしくはその集団、Tヘルパー細胞もしくはその集団、細胞傷害性T細胞もしくはその集団、メモリーT細胞もしくはその集団、調節性T細胞もしくはその集団、NK細胞もしくはその集団、抗原特異的B細胞もしくはその集団、メモリーB細胞もしくはその集団、または、調節性B細胞もしくはその集団を含む、態様51〜56のいずれか1つに記載の方法。
58.標的細胞がT細胞である、態様51〜57のいずれか1つに記載の方法。
59.分子が、T細胞の表面上に存在し、受容体結合物質が、組成物中のT細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、態様51〜58のいずれか1つに記載の方法。
60.受容体結合物質が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができ;かつ/または
受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し;かつ/または
受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、
態様51〜59のいずれか1つに記載の方法。
61.分子が第1の分子であり、受容体結合物質が、1つまたは複数の標的細胞の表面上の第1の分子および第2の分子に特異的に結合することができ、該第2の分子に対する結合が、任意で、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変することができる、態様51〜60のいずれか1つに記載の方法。
62.受容体結合物質が第1の受容体結合物質であり、1つまたは複数の標的細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる第2の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第2の分子に対する結合が、任意で、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変するようにシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、態様51〜61のいずれか1つに記載の方法。
63.第2の受容体結合物質が第2の分子に特異的に結合しそれによって第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変するように組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする条件下で、インキュベーションが行われる、態様62に記載の方法。
64.ストレプトアビジンムテインまたは類似体が、第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含み、それによって、第2の受容体結合物質がストレプトアビジンムテインまたは類似体に可逆的に結合されている、態様62または態様63に記載の方法。
65.第2の受容体結合物質が、ストレプトアビジン類似体またはムテインに存在する2つ以上の結合部位Z2に可逆的に結合することができる結合パートナーC1またはC2を含む、態様64に記載の方法。
66.追加の分子が、CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択され;かつ/または
第2の受容体結合物質が、CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、もしくはHVEMに特異的に結合する、
態様61〜65のいずれか1つに記載の方法。
67.追加の分子が、CD40およびCD137の中から選択され;かつ/または
第2の受容体結合物質が、CD40もしくはCD137に特異的に結合する、
態様61〜66のいずれか1つに記載の方法。
68.第2の受容体結合物質が、複数の異なる受容体結合物質を含み、その各々が個々に、組成物中のT細胞の表面上の同じまたは異なる第2の分子に結合して、細胞において1つまたは複数のシグナルを集合的に誘導またはモジュレートすることができる、態様11〜67のいずれか1つに記載の方法。
69.第1および/または第2の受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊する工程をさらに含む、態様37〜68のいずれか1つに記載の方法。
70.破壊が、インキュベーションの開始後14日以内、インキュベーションの開始後12日以内、インキュベーションの開始後10日以内、インキュベーションの開始後8日以内、またはインキュベーションの開始後6日以内にもたらされる、態様69に記載の方法。
71.インキュベーションの少なくとも一部が、T細胞にシグナルを送達することができるさらなる作用物質の存在下で実行される、態様37〜70のいずれか1つに記載の方法。
72.さらなる作用物質が、T細胞、CD4+ T細胞、および/またはCD8+ T細胞の増殖を増強または誘導することができる、態様71に記載の方法。
73.さらなる作用物質が、IL-2、IL-15、およびIL-7の中から選択されるサイトカインである、態様71または態様72に記載の方法。
74.さらなる作用物質が、CD28に特異的に結合せず、かつ/またはCD28シグナル伝達を誘導しない、態様71〜73のいずれか1つに記載の方法。
75.T細胞または標的細胞が、対象由来の初代細胞である、態様1〜74のいずれか1つに記載の方法。
76.T細胞または標的細胞が、対象から直接単離される、態様1〜75のいずれか1つに記載の方法。
77.T細胞が、分画されていないT細胞である、濃縮されたかもしくは単離されたCD3+ T細胞である、濃縮されたかもしくは単離されたCD4+ T細胞である、または、濃縮されたかもしくは単離されたCD8+ T細胞である、態様1〜50および57〜76のいずれか1つに記載の方法。
78.インキュベートする工程の前に、T細胞が、CD62L+細胞について濃縮されておらず、かつ/またはナイーブT細胞について濃縮されていない、態様1〜50および57〜77のいずれか1つに記載の方法。
79.T細胞または標的細胞が、ヒト細胞である、態様1〜78のいずれか1つに記載の方法。
80.試薬が、20 nm未満、10 nm未満、5 nm未満、もしくは1 nm未満であるサイズを有する;または
試薬が、1.2 g/cm3未満もしくは1.0 g/cm3未満の密度を有する、
態様1〜80のいずれか1つに記載の方法。
81.試薬が、前記インキュベーションの間、支持体または固体支持体に結合されていない、態様1〜80のいずれか1つに記載の方法。
82.試薬が、インキュベーションの少なくとも一部の間、支持体に結合されており、それによって、複数のT細胞または標的細胞が、インキュベーションの少なくとも一部の間、支持体上に可逆的に固定化されている、態様1〜80のいずれか1つに記載の方法。
83.支持体が、固体支持体または固定相である、態様82に記載の方法。
84.第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、前記結合部位B2のうちの1つのみを含み;かつ/または
第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、一価様式で分子に特異的に結合する、
態様1〜83のいずれか1つに記載の方法。
85.第2の受容体結合物質が、前記結合部位B4のうちの1つのみを含み;かつ/または
第2の受容体結合物質が、一価様式で分子に特異的に結合する、
態様1〜84のいずれか1つに記載の方法。
86.結合部位B2および/またはB4が、抗体結合部位を含む、態様84または態様85に記載の方法。
87.第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質が、各々個々に、抗体断片、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、Igドメインを含有する分子、サイトカイン、ケモカイン、アプタマー、およびMHC分子、ならびにそれらの結合断片の中から選択される、態様1〜86のいずれか1つに記載の方法。
88.第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質が、抗体断片を含み;
第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質が、Fab断片を含み;
第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質が、F(ab')2断片および二価一本鎖Fv(scFv)断片の中から選択される二価抗体断片であり;
第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質が、Fab断片、Fv断片、およびscFv断片の中から選択される一価抗体断片であり;かつ/または
第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリンスキャホールドをベースにしたタンパク質、結晶スキャホールドをベースにしたタンパク質、アドネクチン、およびアビマーの中から選択される、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子である、
態様1〜87のいずれか1つに記載の方法。
89.第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、任意で、抗CD3抗体、抗CD3抗体の二価抗体断片、抗CD3抗体の一価抗体断片、および抗体様結合特性を有するタンパク質性CD3結合分子からなる群より選択される、CD3に特異的に結合する作用物質を含み、かつ/または
第2の受容体結合物質が、任意で、抗CD28抗体、抗CD28抗体の二価抗体断片、抗CD28抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD28結合分子、抗CD90抗体、抗CD90抗体の二価抗体断片、抗CD90抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD90結合分子、抗CD95抗体、抗CD95抗体の二価抗体断片、抗CD95抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD95結合分子、抗CD154抗体、抗CD154抗体の二価抗体断片、抗CD154抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD154結合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体の二価抗体断片、抗CD137抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD137結合分子、抗ICOS抗体、抗ICOS抗体の二価抗体断片、抗ICOS抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ICOS結合分子、抗LAT抗体、抗LAT抗体の二価抗体断片、抗LAT抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性LAT結合分子、抗CD27抗体、抗CD27抗体の二価抗体断片、抗CD27抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD27結合分子、抗OX40抗体、抗OX40抗体の二価抗体断片、抗OX40抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性OX40結合分子、抗HVEM抗体、抗HVEM抗体の二価抗体断片、抗HVEM抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性HVEM結合分子、および4-1BBリガンド、ならびにこれらの任意の混合物からなる群より選択される、CD28、CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40、および/またはHVEMに特異的に結合する作用物質を含む、
態様1〜88のいずれか1つに記載の方法。
90.試薬が、ビオチン、ビオチン類似体、もしくはそれらの生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン;ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するアビジンもしくはストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン、遷移金属イオンに結合することができる少なくとも2つのキレート基Kを含む試薬;オリゴヒスチジン親和性タグに結合することができる作用物質;グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合することができる作用物質;カルモジュリンもしくはその類似体;カルモジュリン結合ペプチド(CBP)に結合することができる作用物質;FLAG-ペプチドに結合することができる作用物質;HAタグに結合することができる作用物質;マルトース結合タンパク質(MBP)に結合することができる作用物質;HSVエピトープに結合することができる作用物質;mycエピトープに結合することができる作用物質;または、ビオチニル化担体タンパク質に結合することができる作用物質であるか、あるいはそれを含む、態様1〜50および68〜89のいずれか1つに記載の方法。
91.試薬が、ビオチンまたは生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含み;
試薬が、ビオチン類似体または生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含み;かつ/または
試薬が、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含む、
態様1〜94のいずれか1つに記載の方法。
92.試薬が、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン;ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジンもしくはアビジンの類似体もしくはムテイン;遷移金属イオンに結合することができる少なくとも2つのキレート基Kを含む試薬;オリゴヒスチジン親和性タグに結合することができる作用物質;グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合することができる作用物質;カルモジュリンもしくはその類似体;カルモジュリン結合ペプチド(CBP)に結合することができる作用物質;FLAG-ペプチドに結合することができる作用物質;HAタグに結合することができる作用物質;マルトース結合タンパク質(MBP)に結合することができる作用物質;HSVエピトープに結合することができる作用物質;mycエピトープに結合することができる作用物質;またはビオチニル化担体タンパク質に結合することができる作用物質の、オリゴマーまたはポリマーである、態様1〜91のいずれか1つに記載の方法。
93.試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジ類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、態様1〜92のいずれか1つに記載の方法。
94.オリゴマーまたはポリマーの個々の分子が、多糖または二官能性リンカーによって架橋されている、態様92または態様93に記載の方法。
95.複数の結合部位が、少なくとも2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、72個、またはそれよりも多い結合部位を含む、態様1〜94のいずれか1つに記載の方法。
96.ストレプトアビジン結合ペプチドが、
からなる群より選択される、態様90〜95のいずれか1つに記載の方法。
97.試薬が、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として44〜47位に対応する配列位置に、アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47もしくはlle44-Gly45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジン類似体もしくはムテインを含む;または
ストレプトアビジン類似体もしくはムテインが、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として44〜47位に対応する配列位置に、アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47を含む、
態様1〜96のいずれか1つに記載の方法。
98.ストレプトアビジン類似体またはムテインが、
(a)SEQ ID NO: 3〜6、27、および28のいずれかに示されるアミノ酸の配列;
(b)SEQ ID NO: 3〜6、27、および28のいずれかに対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い配列同一性を呈し、Val44-Thr45-Ala46-Arg47またはlle44-Gly45-Ala46-Arg47に対応するアミノ酸配列を含有し、かつ、ビオチンもしくはその生物学的に活性な形態、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アミノ酸の配列;または
(c)ビオチンもしくはその生物学的に活性な形態、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、(a)または(b)の機能的断片
を含む、態様1〜51および68〜97のいずれか1つに記載の方法。
99.ストレプトアビジン類似体またはムテインが、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として117、120、および/または121に対応する位置に、1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、態様97または態様98に記載の方法。
100.1つもしくは複数のアミノ酸置換が、Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121、もしくはPhe121の中から選択される;または
1つもしくは複数のアミノ酸置換が、Glu117、Gly120、もしくはTyr121の1つもしくは複数から選択される;または
アミノ酸置換が、Glu117、Gly120、もしくはTyr121から選択される、
態様99に記載の方法。
101.ストレプトアビジン類似体またはムテインが、
(a)SEQ ID NO: 27または28に示されるアミノ酸の配列;
(b)SEQ ID NO: 28に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い配列同一性を呈し、Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120、およびTyr121に対応するアミノ酸配列を含有し、かつ、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アミノ酸の配列;または
(c)ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、(a)または(b)の機能的断片
を含む、態様51〜100のいずれか1つに記載の方法。
102.結合パートナーC1および/または結合パートナーC2が、独立して、
からなる群より選択されるストレプトアビジン結合ペプチドを含む、
態様1〜101のいずれか1つに記載の方法。
103.前記破壊が、第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質と、試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の、細胞への導入を含む、態様1〜36および69〜102のいずれか1つに記載の方法。
104.物質が、遊離の結合パートナーであり、かつ/または競合物質である、態様103に記載の方法。
105.組成物中の物質が、T細胞または標的細胞に対して有害ではなく、かつ/または、該物質の添加が、生存するT細胞または標的細胞のパーセンテージを、該物質を伴わない同等の条件または同じ条件下でのそれぞれT細胞または標的細胞のインキュベーションと比較した際に、90%、80%、70%、60%、または50%未満に低減させない、態様103または態様104に記載の方法。
106.前記破壊が、T細胞または標的細胞において、受容体結合物質または第2の受容体結合物質の一方または両方によって誘導またはモジュレートされたシグナルを終結または減少させる、態様1〜36および69〜105のいずれか1つに記載の方法。
107.試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテイン、またはそれらの生物学的に活性な断片であるか、またはそれを含み;かつ
物質が、ストレプトアビジン結合ペプチド、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチン、またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片を含む、
態様10〜18、22〜32、および69〜107のいずれか1つに記載の方法。
108.物質が、
からなる群より選択されるストレプトアビジン結合ペプチドであり;かつ/または
物質が、C1もしくはその類似体であるか、またはC2もしくはその類似体である、
態様107に記載の方法。
109.前記結合部位Z1と前記結合パートナーC1との間の可逆的結合、および/または前記結合部位Z2と前記結合パートナーC2との間の可逆的結合の解離定数(KD)が、10-2 M〜10-13 Mの範囲である、
態様1〜108のいずれか1つに記載の方法。
110.インキュベーションの前に、細胞を、組成物のT細胞もしくは標的細胞が含むマーカーに特異的に結合する選択物質と接触させ、それによって、T細胞もしくは標的細胞を含む組成物を生成もしくは取得する;または
インキュベーションの少なくとも一部が、さらに、組成物のT細胞もしくは標的細胞が含むマーカーに特異的に結合する選択物質の存在下で実行され、培養T細胞が、マーカーを含むT細胞もしくは標的細胞について濃縮される、
態様1〜109のいずれか1つに記載の方法。
111.選択物質が、選択物質に特異的に結合することができる複数の結合部位をさらに含む試薬に、可逆的に結合されている;または
選択物質が、選択物質に特異的に結合することができる複数の結合部位を含む第2の試薬に、可逆的に結合されている、
態様110に記載の方法。
112.シグナルの誘導またはモジュレーションが、シグナルの誘導またはモジュレーションの非存在下でのT細胞のインキュベーションと比較して、培養T細胞の増大(増殖)および/または活性化における増加をもたらす、態様1〜110のいずれか1つに記載の方法。
113.増加が、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍であるか、またはそれよりも大きい、態様112に記載の方法。
114.追加のまたは第2のシグナルの誘導またはモジュレーションが、追加のまたは第2のシグナルの誘導またはモジュレーションの非存在下でのT細胞のインキュベーションと比較して、T細胞の増大(増殖)および/または活性化を増加させる、態様7〜113のいずれか1つに記載の方法。
115.増加が、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍であるか、またはそれを上回る、態様114に記載の方法。
116.インキュベーションの前、インキュベーションの後であるが破壊の非存在下、または、インキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合し、かつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下の、組成物中のT細胞と各々比較して、組成物中のT細胞の増大および/もしくは増殖を増加させる、組成物中のT細胞の代謝プロファイルを変更する、組成物中のCD8+ T細胞のサブセットを変更し;かつ/または、組成物中の長命メモリーT細胞のパーセンテージを増加させる、態様1〜115のいずれか1つに記載の方法。
117.CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、またはCD8+細胞の数またはパーセンテージが、インキュベーションの前の組成物中の、インキュベーションの後であるが破壊の非存在下での組成物中の、または、類似のインキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合しかつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下における組成物中のCD3+ T細胞、CD4+ T細胞、またはCD8+ T細胞の数またはパーセンテージとそれぞれ比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍増加している、培養T細胞;
組成物中のCD8+ T細胞の比率、またはCD8+ T細胞の相対比率もしくは正規化比率が、インキュベーションの前の組成物中の、インキュベーションの後であるが破壊の非存在下での組成物中の、または、類似のインキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合しかつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下における組成物中のCD8+ T細胞の比、または相対比率もしくは正規化比率と比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍増加している、培養T細胞;
組成物中のCD62L+、任意で長命メモリーT細胞、またはメモリー幹細胞(TSCM)の数またはパーセンテージが、インキュベーションの前の組成物中の、インキュベーションの後であるが破壊の非存在下での組成物中の、または、類似のインキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合しかつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下における組成物中のCD62L+、長命メモリーT細胞、またはTSCMのいずれかの対応する細胞の集団の数またはパーセンテージと比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍増加している、培養T細胞
を結果としてもたらす、態様1〜116のいずれか1つに記載の方法。
118.培養T細胞が、組成物中の全T細胞に対するまたは組成物中の全細胞に対するパーセンテージとして35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、または90%を上回る、CD62Lについて表面が陽性(CD62L+)である表現型を含むT細胞サブセットを含む、態様1〜117のいずれか1つに記載の方法。
119.T細胞サブセットが、
(a)CD127+;ならびに/または
(b)CD45RA+、CD45RO-、CCR7+、およびCD27+のうちのいずれか1つまたは複数、ならびに、t-betlow、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+、およびLFA-1+のうちのいずれか1つまたは複数
を含む表現型をさらに含む、態様118に記載の方法。
120.T細胞サブセットが、
(a)低レベルのTCR再構成切除サークル(TREC)を含み;かつ/または
(b)任意でKi-67である増殖マーカーを発現されており;かつ/または
(c)刺激物質の存在下で増殖する能力を呈し;かつ/または
(d)刺激物質の存在下でIFN-γ、TNF、およびIL-2の中から選択されるサイトカインを産生する能力を呈する、
態様118または態様119に記載の方法。
121.刺激物質が、抗原、恒常性サイトカイン、任意でIL-15および/もしくはIL-17であるか、または、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができる作用物質である、態様120に記載の方法。
122.T細胞サブセットが、長命メモリーT細胞であるかまたはそれを含む、態様118〜121のいずれか1つに記載の方法。
123.T細胞サブセットが、Tメモリー幹細胞(TSCM)であるかまたはそれを含む、態様118〜122のいずれか1つに記載の方法。
124.集団のT細胞または標的細胞に組換え核酸分子を導入する工程をさらに含み、核酸分子が組換えタンパク質をコードし、それによって、細胞が組換えタンパク質を発現する、態様1〜123のいずれか1つに記載の方法。
125.組換え受容体が、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックT細胞受容体(TCR)である、態様124に記載の方法。
126.インビトロまたはエクスビボで行われる、態様1〜125のいずれか1つに記載の方法。
127.培養細胞を、疾患または状態を有する対象に投与する工程をさらに含む、態様1〜126のいずれか1つに記載の方法。
128.態様1〜127のいずれか1つに記載の方法によって産生された複数の培養T細胞または標的細胞、および任意で、薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
129.物質の添加後に、細胞が、30℃よりも高い温度で、24時間超、48時間超、72時間超、または96時間超にわたって、インビトロまたはエクスビボでインキュベートされていない、態様128に記載の組成物。
130.(a)受容体結合物質に結合することができる複数の結合部位を含む、試薬;および
(b)(i)試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)T細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする様式でCD28またはCD3ではないT細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる、受容体結合物質
を含む、製造物品。
131.分子への結合が、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のT細胞におけるシグナルを誘導もしくはモジュレートし;かつ/または
分子への結合が、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化する、
態様130に記載の製造物品。
132.分子が、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択される、態様130または態様131に記載の製造物品。
133.分子がCD137ではない、態様130〜132のいずれか1つに記載の製造物品。
134.(a)作用物質に結合することができる複数の結合部位を含むストレプトアビジン類似体またはムテインである試薬であって、該ストレプトアビジン類似体またはムテインが、正味の負電荷を含む、または、SEQ ID NO: 4もしくは6に示されるアミノ酸の配列を含むストレプトアビジンムテインよりも低い等電点を呈し、かつ/または、アミノ酸の配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO: 8)を含むストレプトアビジン結合ペプチドに対して、SEQ ID NO: 4もしくは6に示されるアミノ酸の配列を含むストレプトアビジンもしくはムテインよりも高い親和性を呈する、試薬;および
(b)(i)該試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる、作用物質
を含む、製造物品。
135.受容体結合物質または作用物質が、結合パートナーC1を含み;かつ
複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質または作用物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、
態様130〜134のいずれか1つに記載の製造物品。
136.受容体結合物質が第2の受容結合物質であり、分子が第2の分子であり、かつ、試薬が、(c)第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位、および(d)(i)試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)T細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合することができる、第1の受容体結合物質をさらに含む、態様130〜133のいずれか1つに記載の製造物品。
137.作用物質または第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し、かつ/または、第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、態様134または態様136に記載の製造物品。
138.(i)第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質が、各々個々に、結合パートナーC1を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第1および第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む;または
(ii)第1の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1および結合パートナーC2に結合して第1および第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む;または
(iii)第1の受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、第2の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して第1の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1、および各々が結合パートナーC2に結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z2を含む、
態様136または態様137に記載の製造物品。
139.試薬が、20 nm未満、10 nm未満、5 nm未満、もしくは1 nm未満であるサイズを有する;または
試薬が、1.2 g/cm3未満もしくは1.0 g/cm3未満の密度を有する、
態様130〜139のいずれか1つに記載の製造物品。
140.試薬が、支持体または固体支持体に結合されていない、態様130〜139のいずれか1つに記載の製造物品。
141.試薬が、支持体に結合されているかまたは固定化されている、態様130〜140のいずれか1つに記載の製造物品。
142.支持体が、固体支持体または固定相である、態様141に記載の製造物品。
143.支持体が、ビーズ、粒子、ナノ粒子、またはマイクロスフェアを含む、態様141または態様142に記載の製造物品。
144.作用物質、第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質が、各々個々に、抗体断片、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、Igドメインを含有する分子、およびそれらの結合断片の中から選択される、態様130〜143のいずれか1つに記載の製造物品。
145.作用物質、第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第1の受容体結合物質が、抗体断片を含む;
作用物質、第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第1の受容体結合物質が、Fab断片を含む;
作用物質、第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第1の受容体結合物質が、F(ab')2断片および二価一本鎖Fv(scFv)断片の中から選択される二価抗体断片である;または
作用物質、第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第1の受容体結合物質が、Fab断片、Fv断片、およびscFv断片の中から選択される一価抗体断片である、
態様130〜144のいずれか1つに記載の製造物品。
146.作用物質または第1の受容体結合物質が、任意で、抗CD3抗体、抗CD3抗体の二価抗体断片、抗CD3抗体の一価抗体断片、および抗体様結合特性を有するタンパク質性CD3結合分子からなる群より選択される、CD3に特異的に結合する作用物質を含み、かつ/または
作用物質、または第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、任意で、抗CD90抗体、抗CD90抗体の二価抗体断片、抗CD90抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD90結合分子、抗CD95抗体、抗CD95抗体の二価抗体断片、抗CD95抗体の抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD95結合分子、抗CD154抗体、抗CD154抗体の二価抗体断片、抗CD154抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD154結合分子、抗CD137抗体、抗CD137抗体の二価抗体断片、抗CD137抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD137結合分子、抗ICOS抗体、抗ICOS抗体の二価抗体断片、抗ICOS抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性ICOS結合分子、抗LAT抗体、抗LAT抗体の二価抗体断片、抗LAT抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性LAT結合分子、抗CD27抗体、抗CD27抗体の二価抗体断片、抗CD27抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性CD27結合分子、抗OX40抗体、抗OX40抗体の二価抗体断片、抗OX40抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性OX40結合分子、抗HVEM抗体、抗HVEM抗体の二価抗体断片、抗HVEM抗体の一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性HVEM結合分子、およびこれらの任意の混合物からなる群より選択される、CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40、またはHVEMに特異的に結合する作用物質を含む、
態様130〜145のいずれか1つに記載の製造物品。
147.試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含む;または
試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、
態様130〜147のいずれか1つに記載の製造物品。
148.態様130〜147のいずれか1つに記載の製造物品、および任意で使用説明書を含む、キット。
149.受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質をさらに含む、態様148に記載のキット。
150.(a)(i)受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬;および(ii)該試薬に可逆的に結合されており、かつ標的細胞の表面上に発現している分子に特異的に結合することができる受容体結合物質であって、任意で、該分子に対する結合が、標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートする、受容体結合物質、を含む可逆的試薬;ならびに
(b)受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質
を含む、キット。
151.標的細胞がT細胞である、態様150に記載のキット。
151.試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含む;または
試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、
態様150または態様151に記載のキット。
152.物質が、ストレプトアビジン結合ペプチド、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチン、またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片を含む、態様149〜151のいずれか1つに記載のキット。
153.試薬が、20 nm未満、10 nm未満、5 nm未満、もしくは1 nm未満であるサイズを有する;または
試薬が、1.2 g/cm3未満もしくは1.0 g/cm3未満の密度を有する、
態様150〜152のいずれか1つに記載のキット。
154.試薬が、支持体または固体支持体に結合されていない、態様150〜153のいずれか1つに記載のキット。
155.標的抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現するように遺伝子操作された複数のT細胞を含む組成物であって、
組成物中の全T細胞または組成物中の全細胞に対するパーセンテージとして、35%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を上回る細胞が、CD3+、CD4+またはCD8+、およびCD62L+、ならびに、CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+、およびCD27+のうちの1つまたは複数、ならびに、t-betlow、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+、およびLFA-1+のうちの1つまたは複数である表面表現型を含むT細胞サブセットを含み;かつ
(a)遺伝子操作前にまたは遺伝子操作の間、該T細胞サブセットを含む複数のT細胞が:
(i)GSK-P阻害剤の存在下でインキュベートされなかった;
(ii)組換え恒常性サイトカイン、任意でIL-7もしくはIL-15の存在下でインキュベートされなかった;もしくは
(iii)CD62L+細胞について濃縮されなかった;または
(b)組成物が、GSK-P阻害剤、または組換え恒常性サイトカイン、任意でIL-7もしくはIL-15を含まない
のいずれかまたは両方である、組成物。
156.T細胞サブセットが、少なくとも5×106個、少なくとも1×106個、または少なくとも2×106個の細胞を含む、態様155に記載の組成物。
157.標的抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現するように遺伝子操作された複数のT細胞を含む組成物であって、
遺伝子操作されたT細胞が、CD3+、CD4+またはCD8+、およびCD62L+、ならびに、CD127+、CD45RA+、CD45RO-、CCR7+、およびCD27+のうちの1つまたは複数、ならびに、t-betlow、IL-7Ra+、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+、およびLFA-1+のうちの1つまたは複数である表面表現型を含むT細胞サブセットを含むT細胞の集団の形質導入に由来し、該T細胞サブセットが、該集団中の全T細胞に対し、
(a)該表現型を含む1つもしくは複数のマーカーの表面発現に基づいてヒト対象から単離されたかもしくは濃縮された、初代T細胞を含む集団;または
(b)GSK-P阻害剤の存在下でインキュベートされたT細胞の集団;
(c)組換え恒常性サイトカイン、任意でIL-7もしくはIL-15の存在下でインキュベートされたT細胞の集団;または
(d)抗CD3および抗CD8によって刺激されたが、刺激もしくは活性化が、1日、2日、3日、4日、もしくは5日を上回る期間にわたり、かつ/または刺激がビオチンもしくはビオチン類似体の存在下で妨害されなかった、T細胞の集団
のいずれかと比較して、より大きなパーセンテージで存在するかまたはより多い数で存在する、組成物。
158.T細胞サブセットが、集団中の全T細胞に対するパーセンテージとして、35%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%を上回ってまたは約35%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%を上回って、該集団に存在する;または
T細胞サブセットが、少なくとも細胞5×106個、1×106個、2×106個、もしくはそれよりも多くを含む、
態様156に記載の組成物。
159.薬学的組成物である、態様155〜158のいずれか1つに記載の組成物。
160.態様128、態様129、および態様154〜158のいずれか1つに記載の組成物を、疾患または状態を有する対象に投与する工程を含む、処置の方法。
161.細胞が、組換え受容体、キメラ抗原受容体、またはTCRを含み、かつ、組換え受容体、キメラ抗原受容体、またはトランスジェニックTCRが、疾患または状態と関連する抗原に特異的に結合する、態様160に記載の処置の方法。
162.疾患または状態が、がん、および自己免疫性の疾患もしくは障害、または感染性疾患である、態様160または態様161に記載の処置の方法。
163.(i)受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており;かつ(ii)標的細胞においてシグナルを誘導もしくはモジュレートしかつ/または標的細胞の機能を変更する様式でCD28、CD3、CD137、またはCD40以外の標的細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる受容体結合物質の存在下で、標的細胞を含む組成物をインキュベートし、それによって培養標的細胞が生成される工程を含む、標的細胞を培養するための方法。
164.受容体結合物質が、サイトカイン受容体に特異的に結合する、ケモカイン受容体に特異的に結合する、接着分子であるかもしくはそれを含む、または、サイトカイン産生、ケモカイン産生、および/もしくは接着分子の発現を誘導する因子である、態様163に記載の方法。
165.受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、TNFR2、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、態様163または態様164に記載の方法。
166.受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、TNFR2、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
受容体結合物質が、IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、TNF、IL-7、IL-21、およびIL-9の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
態様163〜165のいずれか1つに記載の方法。
167.受容体結合物質が、IL-12R、IFN-γR、IL-4R、およびIL-17Rの中から選択されるサイトカインに特異的に結合する;または
受容体結合物質が、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、およびIL-17の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
態様163〜165のいずれか1つに記載の方法。
168.受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する、態様163または態様164に記載の方法。
169.受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドである;または
受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
態様163、態様164、または態様168に記載の方法。
170.受容体結合物質が、CXCR3、CCR7、CXCR1、およびCXCR4の中から選択されるサイトカインに特異的に結合する;または
受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
態様163、態様164、態様168、または態様169のいずれか1つに記載の方法。
171.接着分子が、CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-セレクチン)、およびCD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、態様163または態様164に記載の方法。
172.接着分子が、LFA-1、L-セレクチン、VCAM-1、およびVLA-4の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、態様171に記載の方法。
173.因子が核因子である、態様163または態様164に記載の方法。
174.因子が、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ(RORγ)またはRORαである、態様163、態様164、または態様173に記載の方法。
175.標的細胞が血液細胞を含み;
標的細胞が白血球を含み;
標的細胞がリンパ球を含み;
標的細胞がB細胞を含み;
標的細胞がB細胞集団を含み;
標的細胞がT細胞を含み;
標的細胞がT細胞集団を含み;かつ/または
標的細胞がナチュラルキラー(NK)細胞を含む、
態様163〜174のいずれか1つに記載の方法。
176.標的細胞が免疫細胞を含む、態様163〜175のいずれか1つに記載の方法。
177.標的細胞が、抗原特異的T細胞もしくはその集団、Tヘルパー細胞もしくはその集団、細胞傷害性T細胞もしくはその集団、メモリーT細胞もしくはその集団、調節性T細胞もしくはその集団、NK細胞もしくはその集団、抗原特異的B細胞もしくはその集団、メモリーB細胞もしくはその集団、または、調節性B細胞もしくはその集団を含む、態様163〜176のいずれか1つに記載の方法。
178.標的細胞がT細胞である、態様163〜177のいずれか1つに記載の方法。
179.標的細胞が、対象由来の初代細胞である、態様163〜178のいずれか1つに記載の方法。
180.受容体結合物質が分子に特異的に結合しそれによって標的細胞においてシグナルを誘導もしくはモジュレートし、かつ/または標的細胞における機能を変更する条件下で、インキュベーションが行われる、態様163〜179のいずれか1つに記載の方法。
181.受容体結合物質が、結合パートナーC1を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、態様163〜180のいずれか1つに記載の方法。
182.受容体結合物質が追加の受容体結合物質であり、分子が追加の分子であり、1つまたは複数のT細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合することができる第1の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第1の分子が、任意で、組成物中の1つまたは複数のT細胞において第1のシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、態様163〜181のいずれか1つに記載の方法。
183.第1の受容体結合物質が、第1の受容体結合物質および追加の受容体結合物質に対する複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されている;または
第1の受容体結合物質が、第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む第2の試薬に可逆的に結合されている、
態様182に記載の方法。
184.第1の受容体結合物質が、T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを開始することができ;かつ/または
第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し;かつ/または
第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、
態様182または態様183に記載の方法。
185.第1の受容体結合物質が、結合パートナーC2を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC2に結合して第1の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z2を含む、態様182〜184のいずれか1つに記載の方法。
186. 1つまたは複数のT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる第2の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第2の分子が、任意で、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変するように組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、態様182〜185のいずれか1つに記載の方法。
187.第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のシグナルである;
第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる;または
第2の分子が、共刺激分子、アクセサリー分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子であるか、または、TNFファミリーもしくはTNF受容体ファミリーのメンバーである、
態様186に記載の方法。
188.第2の分子が、CD28およびCD137の中から選択される、態様186または態様187のいずれか1つに記載の方法。
189.第2の分子がCD28である、態様186〜188のいずれか1つに記載の方法。
190.第2の受容体結合物質が、結合パートナーC3を含み、複数の結合部位が、各々が結合パートナーC3に結合して第1の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z3を含む、態様186〜188のいずれか1つに記載の方法。
191.C1およびC2、C1およびC3、C2およびC3、または、C1、C2、およびC3が、同じもしくは実質的に同じであるか、または、同じもしくは実質的に同じ部分を含有する;
Z1およびZ2、Z1およびZ3、Z2およびZ3、または、Z1、Z2、およびZ3が、同じもしくは実質的に同じであるか、または、同じもしくは実質的に同じ部分を含有する、
態様163〜190のいずれか1つに記載の方法。
192.試薬が、インキュベーションの少なくとも一部にわたって、支持体上に固定化されているか、または固定化されることができ、それによって、(追加の、第1のおよび/または第2の)受容体結合物質が、支持体上に固定化されているか、または固定化されることができる、態様163〜191のいずれか1つに記載の方法。
193.支持体が、固定相であるかもしくはそれを含み;かつ/または
支持体が、固体支持体であるかもしくはそれを含む、
態様192に記載の方法。
194.試薬が、前記インキュベーションの間、固体支持体、固定相、ビーズ、微粒子、磁性粒子、および/もしくはマトリックスではなく、かつそれらに結合されていないかもしくはそれらと会合しておらず;かつ/または
試薬が、柔軟性であり、金属もしくは磁性コアを含有せず、完全にもしくは主に有機多量体から構成されており、球形ではなく、実質的に球形もしくは均一な形状ではなく、かつ/もしくは硬直していない;
試薬が、20 nm未満、10 nm未満、5 nm未満、もしくは1 nm未満であるサイズを有する;または
試薬が、1.2 g/cm3未満もしくは1.0 g/cm3未満の密度を有する、
態様163〜191のいずれか1つに記載の方法。
195.追加の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、結合部位B1を含み;かつ/または
追加の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、該結合部位B1のうちの1つのみを含み;かつ/または
追加の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、一価様式で分子に特異的に結合する、
態様163〜194のいずれか1つに記載の方法。
196.第1の受容体結合物質が、結合部位B2を含み;かつ/または
第1の受容体結合物質が、該結合部位B2のうちの1つのみを含み;かつ/または
第1の受容体結合物質が、一価様式で分子に特異的に結合する、
態様163〜195のいずれか1つに記載の方法。
197.第2の受容体結合物質が、結合部位B4を含み;かつ/または
第2の受容体結合物質が、該結合部位B4のうちの1つのみを含み;かつ/または
第2の受容体結合物質が、一価様式で分子に特異的に結合する、
態様163〜196のいずれか1つに記載の方法。
198.結合部位B2および/またはB4が、抗体結合部位を含む、態様195〜197のいずれか1つに記載の方法。
199.追加の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、サイトカイン、ケモカイン、または接着分子の中から選択される、態様163〜198のいずれか1つに記載の方法。
200.(追加の、第1のおよび/または追加の)受容体結合物質が、各々個々に、抗体断片、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、Igドメインを含有する分子、アプタマー、およびMHC分子、ならびにそれらの結合断片の中から選択される、態様163〜199のいずれか1つに記載の方法。
201.(追加の、第1のおよび/または追加の)受容体結合物質が、抗体断片を含む;
(追加の、第1のおよび/または追加の)受容体結合物質が、Fab断片を含む;
(追加の、第1のおよび/または追加の)受容体結合物質が、F(ab')2断片および二価一本鎖Fv(scFv)断片の中から選択される二価抗体断片である;
(追加の、第1のおよび/または追加の)受容体結合物質が、Fab断片、Fv断片、およびscFv断片の中から選択される一価抗体断片であり;かつ/または
(追加の、第1のおよび/または追加の)受容体結合物質が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリンスキャホールドをベースにしたタンパク質、結晶スキャホールドをベースにしたタンパク質、アドネクチン、およびアビマーの中から選択される、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子である、
態様163〜200のいずれか1つに記載の方法。
202.試薬が、ビオチン、ビオチン類似体、もしくはそれらの生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン;ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アビジンもしくはストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン;遷移金属イオンに結合することができる少なくとも2つのキレート基Kを含む試薬;オリゴヒスチジン親和性タグに結合することができる作用物質;グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合することができる作用物質;カルモジュリンもしくはその類似体;カルモジュリン結合ペプチド(CBP)に結合することができる作用物質;FLAG-ペプチドに結合することができる作用物質;HAタグに結合することができる作用物質;マルトース結合タンパク質(MBP)に結合することができる作用物質;HSVエピトープに結合することができる作用物質;mycエピトープに結合することができる作用物質;またはビオチニル化担体タンパク質に結合することができる作用物質であるか、またはそれを含む、態様163〜201のいずれか1つに記載の方法。
203.試薬が、ビオチンまたは生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含む;
試薬が、ビオチン類似体または生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含み;かつ/または
試薬が、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、またはアビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含む、
態様163〜202のいずれか1つに記載の方法。
204.試薬が、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンの類似体もしくはムテイン;ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジンもしくはアビジンの類似体もしくはムテイン;遷移金属イオンに結合することができる少なくとも2つのキレート基Kを含む試薬;オリゴヒスチジン親和性タグに結合することができる作用物質;グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合することができる作用物質;カルモジュリンもしくはその類似体;カルモジュリン結合ペプチド(CBP)に結合することができる作用物質;FLAG-ペプチドに結合することができる作用物質;HAタグに結合することができる作用物質;マルトース結合タンパク質(MBP)に結合することができる作用物質;HSVエピトープに結合することができる作用物質;mycエピトープに結合することができる作用物質;またはビオチニル化担体タンパク質に結合することができる作用物質の、オリゴマーまたはポリマーである、態様163〜203のいずれか1つに記載の方法。
205.試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジ類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、態様163〜204のいずれか1つに記載の方法。
206.オリゴマーまたはポリマーの個々の分子が、多糖または二官能性リンカーによって架橋されている、態様204または態様205に記載の方法。
207.複数の結合部位が、少なくとも2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、72個、またはそれよりも多い結合部位を含む、態様163〜206のいずれか1つに記載の方法。
208.ストレプトアビジン結合ペプチドが、
からなる群より選択される、態様202〜207のいずれか1つに記載の方法。
209.試薬が、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として44〜47位に対応する配列位置に、アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47もしくはlle44-Gly45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジン類似体もしくはムテインを含む;または
ストレプトアビジン類似体もしくはムテインが、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として44〜47位に対応する配列位置に、アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47を含む、
態様163〜208のいずれか1つに記載の方法。
210.ストレプトアビジン類似体またはムテインが、
(a)SEQ ID NO: 3〜6、27、または28のいずれかに示されるアミノ酸の配列;
(b)SEQ ID NO: 3〜6、27、または28のいずれかに対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い配列同一性を呈し、Val44-Thr45-Ala46-Arg47またはlle44-Gly45-Ala46-Arg47に対応するアミノ酸配列を含有し、かつ、ビオチンもしくはその生物学的に活性な形態、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アミノ酸の配列;または
(c)ビオチンもしくはその生物学的に活性な形態、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、(a)または(b)の機能的断片
を含む、態様163〜209のいずれか1つに記載の方法。
211.ストレプトアビジン類似体またはムテインが、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として117、120、および/または121に対応する位置に、1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、態様209または態様210に記載の方法。
212.1つもしくは複数のアミノ酸置換が、Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121、もしくはPhe121の中から選択される;または
1つもしくは複数のアミノ酸置換が、Glu117、Gly120、もしくはTyr121の1つもしくは複数から選択される;または
アミノ酸置換が、Glu117、Gly120、もしくはTyr121から選択される、
態様211に記載の方法。
213.ストレプトアビジン類似体またはムテインが、
(a)SEQ ID NO: 27または28に示されるアミノ酸の配列;
(b)SEQ ID NO: 28に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い配列同一性を呈し、Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120、およびTyr121に対応するアミノ酸配列を含有し、かつ、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アミノ酸の配列;または
(c)ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、(a)または(b)の機能的断片
を含む、態様163〜212のいずれか1つに記載の方法。
214.結合パートナーC1および/または結合パートナーC2が、独立して、
からなる群より選択されるストレプトアビジン結合ペプチドを含む、
態様163〜213のいずれか1つに記載の方法。
215.第1および/または第2の受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊する工程をさらに含む、態様163〜214のいずれか1つに記載の方法。
216.前記破壊が、第1の受容体結合物質であることができる受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質と、試薬との間の結合を逆転させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含む、態様215に記載の方法。
217.物質が、遊離の結合パートナーであり、かつ/または競合物質である、態様216に記載の方法。
218.組成物中の物質が、T細胞または標的細胞に対して有害ではなく、かつ/または、該物質の添加が、生存するT細胞または標的細胞のパーセンテージを、該物質を伴わない同等の条件または同じ条件下でのT細胞または標的細胞のインキュベーションとそれぞれ比較した際に、90%、80%、70%、60%、または50%未満に低減させない、態様216または態様217に記載の方法。
219.前記破壊が、T細胞または標的細胞において、受容体結合物質または第2の受容体結合物質の一方または両方によって誘導またはモジュレートされたシグナルを終結または減少させる、態様215〜218のいずれか1つに記載の方法。
220.試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジン類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテイン、またはそれらの生物学的に活性な断片であるか、またはそれを含み;かつ
物質が、ストレプトアビジン結合ペプチド、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチン、またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片を含む、
態様215〜219のいずれか1つに記載の方法。
221.物質が、
からなる群より選択されるストレプトアビジン結合ペプチドであり;かつ/または
物質が、C1、C2、もしくはC3、またはそれらの類似体である、
態様220に記載の方法。
222.シグナルの誘導またはモジュレーションが、シグナルの誘導またはモジュレーションの非存在下での組成物中の標的細胞、任意でT細胞と比較して、化学走性、接着、サイトカイン産生、増殖(増大)、細胞傷害活性、代謝活性の中から選択される、変更された活性を結果としてもたらし;かつ/または
インキュベーションの前の組成物中の標的細胞、任意でT細胞の機能活性と比較して、変更された機能活性が、化学走性、接着、サイトカイン産生、増殖(増大)、細胞傷害活性、代謝活性の中から選択され;かつ/または
培養標的細胞が、インキュベーションの前の組成物中の標的細胞、任意でT細胞の機能活性と比較して、化学走性、接着、サイトカイン産生、増殖(増大)、細胞傷害活性、代謝活性の中から選択される、変更された活性を呈する、
態様163〜221のいずれか1つに記載の方法。
223.活性が、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれよりも大きく変更される、態様222に記載の方法。
224.T細胞または標的細胞の集団中に、組換えタンパク質をコードする組換え核酸分子を導入する工程をさらに含み、それによって、細胞が組換えタンパク質を発現する、態様163〜223のいずれか1つに記載の方法。
225.組換え受容体が、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックT細胞受容体(TCR)である、態様224に記載の方法。
226.インビトロまたはエクスビボで行われる、態様163〜225のいずれか1つに記載の方法。
227.培養細胞を、疾患または状態を有する対象に投与する工程をさらに含む、態様163〜226のいずれか1つに記載の方法。
228.態様163〜227のいずれか1つに記載の方法によって産生された複数の培養T細胞または標的細胞、および任意で、薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
229.物質の添加後に、細胞が、30℃よりも高い温度で、24時間超、48時間超、72時間超、または96時間超にわたって、インビトロまたはエクスビボでインキュベートされていない、態様228に記載の組成物。
230.(a)受容体結合物質に結合することができる複数の結合部位を含む、試薬;および
(b)(i)試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)細胞においてシグナルを誘導もしくはモジュレートする、または細胞において機能活性を変更する様式でCD28、CD3、CD137、またはCD40ではない標的細胞の表面上の分子に特異的に結合することができる、受容体結合物質
を含む、製造物品。
231.受容体結合物質が、サイトカイン受容体に特異的に結合する、ケモカイン受容体に特異的に結合する、接着分子であるかもしくはそれを含む、または、サイトカイン産生、ケモカイン産生、および/もしくは接着分子の発現を誘導する因子である、態様230に記載の製造物品。
232.受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、TNFR2、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合する、態様230または態様231に記載の製造物品。
233.受容体結合物質が、IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1、TNFR2、IL-7R、IL-21R、およびCD132(IL受容体共通γ鎖)の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドであり;かつ/または
受容体結合物質が、IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、TNF、IL-7、IL-21、およびIL-9の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
態様230〜232のいずれか1つに記載の製造物品。
234.受容体結合物質が、IL-12R、IFN-γR、IL-4R、およびIL-17Rの中から選択されるサイトカインに特異的に結合する;または
受容体結合物質が、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、およびIL-17の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
態様230〜232のいずれか1つに記載の製造物品。
235.受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるケモカイン受容体に特異的に結合する、態様68または態様69に記載の製造物品。
236.受容体結合物質が、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3、およびCXCR4の中から選択されるサイトカイン受容体に特異的に結合するリガンドである;または
受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
態様230、態様231、または態様235に記載の製造物品。
237.受容体結合物質が、CXCR3、CCR7、CXCR1、およびCXCR4の中から選択されるサイトカインに特異的に結合する;または
受容体結合物質が、CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、およびCCL25の中から選択されるリガンドであるか、もしくはそれらの生物学的に活性な断片である、
態様68、態様69、態様235、または態様236のいずれか1つに記載の製造物品。
238.接着分子が、CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-セレクチン)、およびCD29/CD49d(VLA-4)、CD106(VCAM-1)の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、態様230または態様231に記載の製造物品。
239.接着分子が、LFA-1、L-セレクチン、VCAM-1、およびVLA-4の中から選択されるか、またはそれらの生物学的に活性な断片である、態様238に記載の製造物品。
240.因子が核因子である、態様230または態様231に記載の製造物品。
241.因子が、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体γ(RORγ)またはRORαである、態様230、態様231、または態様240に記載の製造物品。
242.受容体結合物質または作用物質が、結合パートナーC1を含み;かつ
複数の結合部位が、各々が結合パートナーC1に結合して受容体結合物質または作用物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位Z1を含む、
態様230〜241のいずれか1つに記載の製造物品。
243.受容体結合物質が追加の受容結合物質であり、分子が追加の分子であり、かつ、試薬が、(c)第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位、および(d)(i)試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)T細胞の表面上の第1の分子に特異的に結合することができる、第1の受容体結合物質をさらに含む、態様230〜241のいずれか1つに記載の製造物品。
244.第1の受容体結合物質が、TCR/CD3複合体のメンバーに特異的に結合し、かつ/または、第1の受容体結合物質が、CD3に特異的に結合する、態様243に記載の製造物品。
245. 1つまたは複数のT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる第2の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行され、該第2の分子が、任意で、第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変するように組成物中の標的細胞においてシグナルを誘導またはモジュレートすることができる、態様243または態様244に記載の製造物品。
246.第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のシグナルである;
第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる;または
第2の分子が、共刺激分子、アクセサリー分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子であるか、または、TNFファミリーもしくはTNF受容体ファミリーのメンバーである、
態様245に記載の製造物品。
247.第2の分子が、CD28またはCD137の中から選択される、態様245または態様246のいずれか1つに記載の製造物品。
248.第2の分子がCD28である、態様245〜247のいずれか1つに記載の製造物品。
249.試薬が、インキュベーションの少なくとも一部にわたって、支持体上に固定化されているか、または固定化されることができ、それによって、(追加の、第1のおよび/または第2の)受容体結合物質が、支持体上に固定化されているか、または固定化されることができる、態様230〜248のいずれか1つに記載の製造物品。
250.支持体が、固定相であるかもしくはそれを含み;かつ/または
支持体が、固体支持体であるかもしくはそれを含む、
態様249に記載の製造物品。
251.試薬が、前記インキュベーションの間、固体支持体、固定相、ビーズ、微粒子、磁性粒子、および/もしくはマトリックスではなく、かつそれらに結合されていないかもしくはそれらと会合しておらず;かつ/または
試薬が、柔軟性であり、金属もしくは磁性コアを含有せず、完全にもしくは主に有機多量体から構成されており、球形ではなく、実質的に球形もしくは均一な形状ではなく、かつ/もしくは硬直していない;
試薬が、20 nm未満、10 nm未満、5 nm未満、もしくは1 nm未満であるサイズを有する;または
試薬が、1.2 g/cm3未満もしくは1.0 g/cm3未満の密度を有する、
態様230〜248のいずれか1つに記載の製造物品。
252.追加の受容体結合物質、第1の受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、各々個々に、抗体断片、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子、Igドメインを含有する分子、およびそれらの結合断片の中から選択される、態様230〜251のいずれか1つに記載の製造物品。
253.追加の受容体結合物質、第1の受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、抗体断片を含む;
追加の受容体結合物質、第1の受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、Fab断片を含む;
追加の受容体結合物質、第1の受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、F(ab')2断片および二価一本鎖Fv(scFv)断片の中から選択される二価抗体断片である;または
追加の受容体結合物質、第1の受容体結合物質、および/または第2の受容体結合物質であることができる受容体結合物質が、Fab断片、Fv断片、およびscFv断片の中から選択される一価抗体断片である、
態様230〜252のいずれか1つに記載の製造物品。
254.試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジ類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインであるか、またはそれを含む;または
試薬が、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジ類似体もしくはムテイン、または、および、アビジン類似体もしくはムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、
態様230〜253のいずれか1つに記載の製造物品。
255.態様230〜254のいずれか1つに記載の製造物品、および任意で使用説明書を含む、キット。
256.受容体結合物質と試薬との間の結合を逆転させることができる物質をさらに含む、態様255に記載のキット。
257.物質が、ストレプトアビジン結合ペプチド、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、任意でD-ビオチン、またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片を含む、態様256に記載のキット。
以下の実施例は、例証目的のみで含まれ、本発明の範囲を限定するようには意図されない。
刺激物質(抗CD3および抗CD28 Fab断片)を、オリゴマーストレプトアビジンムテインである多量体形成試薬への可逆的結合によって多量体化した。試薬は、Fab断片上に存在するペプチドタグに対する複数の結合部位を含有していた。オリゴマーストレプトアビジンムテインは、Strep-tactin(登録商標)mlと命名されているストレプトアビジンムテイン(SEQ ID NO: 6に示されるアミノ酸のムテイン配列を含有する、ストレプトアビジンホモテトラマー、例えば、米国特許第6,103,493号およびVoss and Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982を参照されたい)を、スルホ-SMCC(スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、製品番号22122 Thermo Scientific)およびイミノチオラン(製品番号26101 Thermo Scientific)で、製造業者の説明書(Thermo Scientific)に従ってポリマー化することによって調製した。オリゴマーストレプトアビジンムテイン分子を、サイズ排除クロマトグラフィーによって、モノマー(未反応)およびダイマーのストレプトアビジンから分離した。
を有する2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含有するストレプトアビジンペプチド結合配列に融合させた。ペプチドタグ付加Fab断片を、組み換え生産した(国際特許出願公開第WO 2013/011011号および第WO 2013/124474号を参照されたい)。
T細胞を、多量体化され、可逆的に結合している作用物質(抗CD3/抗CD28 Fab断片)を含有する、実施例1に記載された試薬とインキュベートした。多量体化抗CD3および抗CD28 Fabと細胞との間の相互作用を、D-ビオチンの添加により、開始後の様々な時点で破壊した。D-ビオチンは、ストレプトアビジンムテイン上の結合パートナーに対する結合について、作用物質上のstrep-tagと競合し、それにより結合を破壊する。
D-ビオチンでの破壊を介した、実施例1および2に記載された試薬を用いたT細胞刺激の時間的制御の影響を、評価した。本研究においては、バルクCD3+ T細胞を、実施例1および2に記載されたように選択し、多量体化CD3/CD28物質または様々な対照試薬の1つとインキュベートした。図6Aに示されるように、D-ビオチンを、実施例2に記載されたように、ある特定の試料に添加し、他のものには添加せず、細胞を、刺激の開始後8日目まで(3日目に培地交換して)培養した。無処理(無刺激)の細胞が、陰性対照として役割を果たした。細胞を、3日目に培地交換して、37℃でインキュベートした。7日後、個々の試験ウェルを、再懸濁して細胞を採取し、個々に微小遠心管に移して、細胞の存続および/もしくは増大を評価するために細胞数について、ならびに/または、様々なマーカー(例えば、CD4、CD8、CD62L、およびCD127)の表面発現ならびに/もしくはKi-67およびT-betの核発現を評価するためにフローサイトメトリー解析によって、解析した。例示的な結果を、図6B〜6Fに示す。データは、各々の試験された条件および対照について二連を包含する、3回の独立した実験を代表するものである。
CD4+細胞の実質的な存在を伴わないCD8+細胞に対する影響を評価するために、本質的に実施例3におけるようであるが、バルクCD3+細胞の刺激とは対照的に、培養細胞をCD8+細胞について濃縮して、研究を実行した。例示的な結果を、図7A〜7Cに示す。データは、各々の試験された条件および対照について二連を包含する、3回の独立した実験を代表するものである。
代替的な刺激物質およびそれらの組み合わせとのインキュベーション後に細胞を評定する、追加的な研究を実行し、提供される試薬のいくつかの態様について、所望の成果または表現型を促進するためのアウトプット組成物を設計または加減するために、試薬のモジュラー特性を使用できることを例証した。抗CD3 Fabおよび1つまたは2つの追加的なFabを含有する様々な多量体化作用物質を、記載された抗CD3 Fabおよび抗CD28 Fabに加えて、T細胞においてシグナルを送達するか、モジュレートするか、または増すことができる追加的なFab(抗CD90、抗CD95、抗CD137、および抗CD154)を使用したことを除いて、実施例1に記載されたように生成させた。異なる条件について、Fabを、様々な二重および三重の組み合わせにおいて、試薬に可逆的に結合させた。
SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸のムテイン配列を含有するストレプトアビジンホモテトラマーである代替的なストレプトアビジンムテイン(例えば、国際公開されたPCT出願第WO 2014/076277号)を使用して、実施例1に記載されたものと実質的に同じである方法を用いて、可溶性オリゴマー試薬を生成した。抗CD3および抗CD28 Fab断片を、実質的に実施例1に記載されたように、各Fab断片に融合させたストレプトアビジンペプチド結合パートナーを介して、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインに固定化した(ST-MM B)。結果として生じた抗CD3/CD28 Fab多量体化試薬(ST-MM B)でのT細胞の刺激を、実施例1において生成された抗CD3/CD28 Fab多量体化試薬(本明細書において比較のためにST-MM Aと命名される)でのT細胞の刺激と比較した。
300,000個のCD3+CD62L-レスポンダーT細胞(Tresp、非動員ドナーアフェレーシス生成物から連続磁気濃縮によって単離)を3μM CFSEで標識し、0.5μg αCD3 Fab断片のみ、0.5μg αCD28 Fab断片のみ、または0.5μg αCD3 Fab断片と0.5μg αCD28 Fabとの混合物のいずれかが負荷されたStreptactin(登録商標)ビーズの調製物 15μl(10 mg磁気粒子/ml、35μg Streptactin(登録商標)/mgビーズが負荷された)のうちの5μlで刺激した。
とカルボキシ末端で融合させた。αCD3 Fab断片を、結合パートナーC1として機能するストレプトアビジン結合ペプチドを有する第1作用物質として使用し、αCD28 Fab断片を、結合パートナーC2として機能するストレプトアビジン結合ペプチドを有する第2作用物質として使用した。(四量体)ストレプトアビジンムテイン「Strep-tactin(登録商標)」は、両Fab断片が可逆的に固定化された試薬として機能する。
本実施例では、CD3+ Tレスポンダー細胞(フィコール勾配から得られた新たなPBMCの試料から磁気選択によって単離)を、可溶性試薬として作用する可溶性オリゴマーStrep-tactin(登録商標)上に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fab断片でインビトロにおいて刺激した後、増大した。オリゴマーストレプトアビジンムテインは、製造業者 (Thermo Scientific) のプロトコルに従って、Strep-tactin(登録商標)をスルホ-SMCC(スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸、製品番号22122 Thermo Scientific)およびイミノチオラン(製品番号26101 Thermo Scientific)と重合させることによって得た。サイズ排除クロマトグラフィーによって、単量体(未反応)および二量体のストレプトアビジンムテインからオリゴマーストレプトアビジンムテインを分離し、このようにして得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン (n≧3) の画分を可溶性試薬として使用した。
本実施例では、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fab断片でインビトロにおいて刺激した精製CD4+ Tレスポンダー細胞およびCD8+ Tレスポンダー細胞 (Tresp) の増殖の増大動態を調べた。この目的のために、2つの異なるサイズの可溶性オリゴマーStrep-tactin(登録商標)ムテインが、可溶性試薬としての役割を果たした。第1の種類のオリゴマーStrep-tactin(登録商標)は、実施例8で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン (n≧3) の画分であった(本明細書では「従来のオリゴマーストレプトアビジンムテイン骨格」とも称される、図13(A〜B)では先端が上を向いている三角形記号によって示される)。可溶性試薬として使用された第2の種類のこのオリゴマーストレプトアビジンムテインは、ビオチン化ヒト血清アルブミンと反応させたオリゴマーストレプトアビジンムテイン (n≧3) であった(本明細書では「大きなオリゴマーストレプトアビジンムテイン骨格」とも称される)。
を有する、上記実施例で使用された0.5μg αCD3 Fabと0.5μg αCD28 Fabとの組み合わせを負荷した。加えて、4.5μlの従来のオリゴマーストレプトアビジンムテイン骨格に、0.5μg αCD3 Fab断片、0.5μg αCD8 Fab断片(IBA GmbH Gottingen、これも同様にFab断片のC末端においてストレプトアビジン結合ペプチド
を有する)、および0.5μg αCD28 Fab断片を負荷した。未処理(非刺激)のTresp細胞を陰性対照とし、市販の抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3モノクローナル抗体およびαCD28モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ)で刺激したTresp細胞を陽性対照とした。Tresp細胞を、30U/ml IL-2を補充した細胞培養液(10% (v/v) ウシ胎仔血清、0.025% (w/v) L-グルタミン、0.025% (w/v) L-アルギニン、0.1% (w/v) HEPES、0.001% (w/v) ゲンタマイシン、0.002% (w/v) ストレプトマイシン、0.002% (w/v) ペニシリンを補充したRPMI 1640 (Gibco)) 1ml中、48ウェルプレートに2つ組で播種した。培地交換せずに細胞を37℃でインキュベートし、1日、3日、および6日後に細胞数を解析した。図13(A〜B)の実験では、培地交換せずに増大を実施した。CD4+ Tレスポンダー細胞についての結果を図13Aに示し、CD8+ Tレスポンダー細胞についての結果を図13Bに示し、グラフは、CD4+ Tresp(図13A)および図13BにおけるCD8+ Trespについて、時点ごとに収集された細胞の数に従った増殖の程度を表す。
本実施例では、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fab断片でインビトロにおいて刺激した精製CD4+ Tレスポンダー細胞およびCD8+ Tレスポンダー細胞 (Tresp) の増殖の増大動態を調べた。この目的のために、2つの異なるサイズの可溶性オリゴマーStrep-tactin(登録商標)ムテインが、可溶性試薬としての役割を果たした。第1の種類のオリゴマーStrep-tactin(登録商標)は、実施例8で得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン (n≧3) の画分であった(本明細書では「従来のオリゴマーストレプトアビジンムテイン骨格」とも称される、図14(A〜B)では先端が下を向いている三角形記号によって示される)。可溶性試薬として使用された第2の種類のこのオリゴマーストレプトアビジンムテインは、実施例8で得られたオリゴマーStrep-tactin (n≧3) をビオチン化ヒト血清アルブミンと反応させることによって得られた。この可溶性オリゴマー試薬は、本明細書において「大きなオリゴマーストレプトアビジンムテイン骨格」とも称される。
本実施例では、「より小さな」多量体化作用物質ならびに陽性対照および陰性対照について、実施例9および10の統合データを投入細胞数に対して正規化した。「より大きな」多量体化作用物質に関して、正規化データは得られなかった。実施例9および10においてに説明したように、400,000〜500,000個のCD4+レスポンダーT細胞またはCD8+レスポンダーT細胞 (Tresp) を、多量体化作用物質の調製物(1mg/ml;0.5μg αCD3 Fab断片および0.5μg αCD28 Fab断片が固定化されている) 3μlで刺激した。未処理(非刺激)のTresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズで刺激したTresp細胞を陽性対照とした。Tresp細胞を、30U/ml IL-2を補充した細胞培養液1ml中、48ウェルプレートに2つ組で播種した。3日目に培地交換しつつ(図15(A〜B)における直線)または培地交換せずに(図15(A〜B)における破線)細胞を37℃でインキュベートし、1日、3日、および6日後に細胞数を解析した。図15Aの正規化データから明らかであるように、抗CD3/抗CD28ビーズを用いる増大は約1.8倍の増大率をもたらしたのに対して、αCD3 Fab断片およびαCD28 Fab断片が可逆的に固定化された「より小さな」可溶性試薬は、CD4+ T細胞の約2.5倍の増大をもたらした。したがって、多量体化作用物質を使用することで、抗CD3/抗CD28ビーズよりも、CD4+ T細胞の増大はさらに改善される。同様に、図15Bにより、多量体化作用物質を用いて、最初の3日以内は少なくとも抗CD3/抗CD28ビーズと同程度効率的にCD8+ T細胞を増大することができたことが確認される。
本実施例では、500,000個のCD3+CD62L+CD45RA-レスポンダーTCM細胞 (Tresp) を、0.5μg αCD3 Fabと0.5μg αCD28 Fabとの組み合わせが負荷された実施例8の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテインの調製物 (1mg/ml) 3μlで刺激した。さらに、0.5μg αCD3 Fab、0.5μg αCD8 Fab、および0.5μg αCD28 Fabが負荷されたオリゴマーストレプトアビジンムテインの調製物4.5μlをさらなる刺激条件として使用した。未処理(非刺激)のTresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3モノクローナル抗体およびαCD28モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されている)で刺激したTresp細胞を陽性対照とした。Tresp細胞を、30U/ml IL-2のみまたは30U/ml IL-2および5ng/ml IL-15を補充した細胞培養液1ml中、48ウェルプレートに播種した。3日ごとに培地交換しながら細胞を37℃でインキュベートし、7日および14日後に細胞数を解析した。グラフは、図16AのIL-2のみを補充した培地および図16BのIL-2およびIL-15を補充した培地における、時点ごとに収集された細胞の数に従った増殖の程度を表す。図16Aおよび図16Bの両方からわかるように、αCD3 Fab断片およびαCD28 Fab断片が可逆的に結合している可溶性試薬は、抗CD3/抗CD28ビーズよりも優れた細胞増大をもたらす。図16Cの、可変サイトカイン環境中で14日間培養した後のCD62LおよびCD127表面発現のフローサイトメトリー解析によってさらに示されるように、多量体化作用物質を使用する実験アプローチは、本明細書で選択された両条件下で、抗CD3/抗CD28ビーズを用いる増大よりも高い含有量のCD127発現長寿命メモリーT細胞を保持する。このことは、本発明の組成物の方法および本明細書に記載される方法のさらなる利点を示す。
本実施例では、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fab断片でインビトロにおいて刺激した精製CD8+ Tレスポンダー細胞の増大を調べた。加えて、CD8+ T細胞に関する増大の特異性を高めるためにαCD8-Fabを試薬に添加する効果を調べた。
本実施例では、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に異なる量で可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fab断片でインビトロにおいて刺激して増大されたCD8+ Tレスポンダー細胞 (Tresp) の収量および表現型を調べた。
本実験は、可溶性試薬として機能する実施例8の可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に可逆的に固定化されたαCD3/αCD28 Fab断片でインビトロにおいて刺激した精製CD3+ Tレスポンダー細胞の増大を示す。1つの実験では、可逆的αCD3/αCD28多量体化作用物質でインビトロにおいて特定のT細胞亜集団を優先的に刺激することが可能であるかどうかを試験するために、αCD3/αCD28 Fab断片に加えて、IBA GmbH、Gottingen, Germanyから市販されているαCD8 Fab断片(カタログ番号6-8000-203)を可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に固定化した。より詳細には、500,000個の精製CD3+レスポンダーT細胞 (Tresp) を、0.5μgのαCD3 Fabと0.5μgのαCD28 Fabとの組み合わせが負荷されたオリゴマーストレプトアビジンムテインの調製物 (1mg/ml) 3μlで刺激した。代替アプローチとして、4.5μlのオリゴマーストレプトアビジンムテインに0.5μg αCD3 Fab、0.5μg strep-tag付加αCD8 Fab、および0.5μg strep-tag付加αCD28 Fabを負荷した。未処理のTresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3モノクローナル抗体およびαCD28モノクローナル抗体が不可逆的に固定化されているビーズ)で刺激したTrespを陽性対照とした。図19Aからわかるように、αCD3 Fab断片、αCD28 Fab断片、およびまたαCD8 Fab断片が可逆的に負荷された試薬は、最大数の増大されたCD3+ T細胞をもたらした。増大された細胞の数はおよそ1x106個であり、収量は、市販の抗CD3/抗CD28ビーズを用いるこれらのT細胞の増大よりも約30%高かった。加えて、およびより重要なことには、図19Bに示されるように、αCD3 Fab断片、αCD28 Fab断片、およびαCD8 Fab断片を有するこの試薬を用いた場合、抗CD3/抗CD28ビーズ、または本明細書に記載されるような第1作用物質および第2作用物質としてαCD3 Fab断片およびαCD28 Fab断片のみを有する可溶性試薬を用いた増大の両方と比較して、CD8+ T細胞の量が最も多かった。したがって、本実験もまた、所望の細胞集団に一次活性化シグナルを提供する第1作用物質、および任意で共刺激シグナルを提供する第2作用物質に加えて、所望の細胞集団の活性化に特異的なさらなる作用物質を試薬上に固定化することができるという、本明細書に記載される組成物および方法の利点を示す。したがって、そのようにすることによって、本明細書に記載される組成物および方法は、例えば種々の異なる亜集団を含む試料から任意の所望の細胞集団または細胞亜集団を優先的に増大するまたは選択的に濃縮する可能性を提供する。
ここでは、αCD3抗体クローンOKT3またはStrep-tactin(登録商標)で多量体化されたOKT3のFab断片のいずれかで標識されたJurkat細胞において誘導された差次的細胞内カルシウム動員のリアルタイムフローサイトメトリー (low-cytometric) 解析について調べた。
本実施例では、αCD3 Fab多量体による細胞の可逆的染色について調べる。新たに単離されたPBMCを、αCD3モノクローナル抗体クローンOKT3(左のドットプロット、Fab多量体の親クローン)または同族のフィコエリトリン (PE) 標識OKT3 Fab多量体のいずれかで染色し、D-ビオチンで処理する前(左から2番目のドットプロット)または後(中央のドットプロット)に解析した。次いで、新たなPE標識Strep-Tactin(登録商標)を用いて、その後の洗浄段階後に、残存するFab単量体を検出した(右から2番目のドットプロット)。可逆的に染色された細胞の二次Fab多量体染色を陽性対照とした(右のドットプロット)。生/死を判別するためのヨウ化プロピジウム (PI) による染色において陰性である生存CD3細胞のみを図21に示す。ドットプロット中の数字は、ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。本実験により、多量体形成試薬としてのStreptactinで多量体化された抗CD3 Fab断片によるCD3+ PBMCの染色が、D-ビオチンの添加によって完全に可逆的であること、および一価Fab断片のみではPBMC上に存在するCD3分子に結合しないことが示される。
本実施例は、Strep-Tactin(登録商標)磁気粒子(この磁気粒子は、IBA GmbH Gottingen, Germanyから入手可能である)で多量体化された抗CD28 Fab断片の可逆的結合による細胞の単離を示す。上記の実施例7に記載される抗体CD28.3に由来するFab断片をこの目的のために使用した。本質的に国際特許出願公開WO2013/011011に記載されているように、新たに単離されたPMBCからFab多量体磁気細胞選択によってCD28+細胞を選択/単離した。結果を図22に示す。選択の前に、対照選択としての同族蛍光αCD28多量体(左のドットプロット)または免疫グロブリンカッパ軽鎖に対する抗体(左から2番目のドットプロット、α-IgカッパmAb)のいずれかで、細胞を対照染色した。選択後、CD28+細胞をD-ビオチンで処理し、次に洗浄して磁気ビーズおよびFab単量体を除去した。次に、遊離したCD28+細胞をαCD28 Fab多量体(右から2番目のドットプロット)またはα-IgカッパmAb(右のドットプロット)のいずれかで(再)染色して、残存している可能性のあるFab単量体を検出した。生存(PI陰性)CD3+細胞のみを示す。ドットプロット中の数字は、ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。図22は、CD28+細胞が、このような多量体化抗CD28 Fab断片を用いてPMBCから単離され得ること、および抗CD28 Fab単量体を含む単離試薬がすべて、選択後に除去され得ることを示す。
本実施例では、400,000個のCD4+レスポンダーT細胞またはCD8+レスポンダーT細胞 (Tresp) を、0.5μg αCD3 Fabと0.5μg αCD28 Fabとの組み合わせが負荷されたオリゴマーStreptactin多量体形成試薬の調製物 (1mg/ml) 3μlで刺激した。未処理(非刺激)のTresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズで刺激したTresp細胞を陽性対照とした。Tresp細胞を、30U/ml IL-2を補充した細胞培養液1ml中、48ウェルプレートに2つ組で播種した。細胞を37℃でインキュベートし、1日および2日後に顕微鏡で解析した。CD4+ Tresp(図23A)およびCD8+ Tresp(図23B)の刺激を、それぞれ抗CD3/抗CD28ビーズ(中央の列)および多量体化作用物質(下の列)について示す。写真は、クラスター形成の程度を表す:見やすくするために、図23Aおよび図23Bでは、可溶性ストレプトアビジムテインオリゴマーによる刺激について、例示的なクラスターを丸で示す。Dynabead刺激におけるクラスターは、濃い色の刺激粒子の蓄積によって容易に視認される。明らかであるように、可溶性オリゴマー多量体形成試薬を使用する本発明の増大方法を用いた場合に、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の両方について、早期にクラスターが形成された。
本実施例では、精製CD3+CD62L+CD45RA-TCMレスポンダー細胞からの選択的抗原特異的(Ag特異的)増大の動態および表現型を調べた。
を有する。
)を認識するAg特異的細胞の細胞数の20倍増加(図24Bを参照されたい)から、CMVのHLA-B7/IE-1309〜317エピトープ
を認識するAg特異的細胞の数の98倍増加(図24Eを参照されたい)に及ぶ)、それによって本発明の増大方法がAg特異的細胞の増大に十分に適用可能であることを示す。最後に、図24Fに示される、(アデノウイルスの)HLA-B7/ヘキソン5エピトープに関する14日間の培養後のCD62LおよびCD127の表面発現の例示的なフローサイトメトリー解析から、本発明の可溶性多量体形成試薬を用いる実験アプローチが、ポリクローナルのおよびAg特異的な刺激条件において、より高い含有量のCD127発現長寿命メモリーT細胞を保持することがさらに確認される。
本実施例では、可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン上に第1作用物質および第2作用物質として可逆的に固定化された(a) 抗原特異的ペプチドMHC I複合体および(b) αCD28 Fab断片でインビトロにおいて刺激した精製CD3+CD62L+CD45RA-TCMレスポンダー細胞からの選択的Ag特異的増大の動態について調べる。
を表す)および0.5μg αCD28 Fabで機能化されたStreptactin多量体形成試薬の調製物3μlを用いてAg特異的に刺激した。代替法として、Streptactin多量体形成試薬の調製物4.5μlに、0.5μgのこのペプチド:MHCクラスI複合体、0.5μg αCD8 Fab、および0.5μg αCD28 Fabを負荷した。比較のために、0.5μg αCD3 Fabと0.5μg αCD28 Fabとの組み合わせが負荷されたStreptactin多量体形成試薬の調製物 (1mg/ml) 3μlを用いて、ポリクローナル刺激を実施した。さらに上記の代替の刺激条件として、0.5μg αCD3 Fab、0.5μg αCD8 Fab、および0.5μg αCD28 Fabが負荷されたStreptactin多量体の調製物4.5μlを使用した。未処理(非刺激)のTresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズでポリクローナル刺激したTresp細胞を陽性対照とした。Tresp細胞を、30U/ml IL-2および5ng/ml IL-15を補充した細胞培養液1ml中、48ウェルプレートに播種した。3日ごとに培地交換しながら細胞を37℃でインキュベートし、7日および14日後に細胞数を解析した。図25に示される写真は5日目のクラスター形成の程度を表し、例示的なAg特異的刺激がアデノウイルスのHLA-B7/ヘキソン5エピトープについて示される。図25からわかるように、元のCD3+CD62L+CD45RA-TCMレスポンダー集団から、このようなアデノウイルス抗原特異的細胞を特異的に増大することができた。
本実施例では、腫瘍特異的キメラ抗原受容体 (CAR)、すなわちこの場合CD19を発現するように改変されており、かつ可溶性多量体形成試薬として実施例8のオリゴマーStrep-tactin(登録商標)を用いて刺激した形質導入Jurkat細胞の細胞内シグナル伝達カスケードの活性化を調べた。
本実施例では、複数の可逆的ペプチド:MHC/αCH28 Fab-Streptamer多量体でインビトロにおいて刺激したTレスポンダー細胞の単一プールからの並列抗原特異的(Ag特異的)増大の動態を調べる。
300,000個のCD3+レスポンダーT細胞 (Tresp) を、0.5μg αCD3 Fabと0.5μg αCD28 Fabとの組み合わせが負荷されたStreptactin多量体形成試薬の調製物 (1mg/ml) 3μlもしくは大きなStreptactin骨格を用いる多量体形成試薬の調製物 (0.1mg/ml) 3μl、または0.5μg αCD3 Fab、0.5μg αCD8 Fab、および0.5μg αCD28 Fabが負荷されたStreptactinベースの多量体形成試薬の調製物4.5μl、または0.5μg αCD3 Fabのみおよび0.5μg αCD28 Fabのみ(各Fab断片は同様にストレプトアビジン結合ペプチドを有する)を有するStreptactinベースの多量体形成試薬の調製物の混合物3μlで刺激する。未処理のTresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3 mAbおよびαCD28 mAbでコーティングされたビーズ)で刺激したTrespを陽性対照とする。Tresp細胞を、30U/ml IL-2を補充した細胞培養液1ml中、48ウェルプレートに2つ組で播種する。細胞を37℃でインキュベートし、3日後に培地交換し、6日後に解析する。
300,000個のCD3+レスポンダーT細胞 (Tresp) を、様々な量の、αCD3 Fab断片のみおよびαCD28 Fab断片のみで機能化されたStreptactinベースの多量体形成試薬の調製物 (1mg/ml) の混合物(0.5μg αCD3 Fab断片のみで機能化されたStreptactinベースの多量体形成試薬1.5μg、および0.5μg αCD28 Fab断片のみで機能化されたStreptactinベースの多量体形成試薬1.5μg)、または様々な量の、αCD8 Fab断片を伴ってもしくは伴わずにαCD3 Fab断片およびαCD28 Fab断片で機能化されたStreptactinベースの多量体形成試薬の調製物の混合物(各Fab断片はここでもストレプトアビジン結合ペプチドを有する)(αCD8 Fab断片を伴わずに0.5μg αCD3 Fab断片および0.5μg αCD28 Fab断片で機能化されたStreptactinベースの多量体形成試薬3μg、または0.5μg αCD3 Fab断片、0.5μg αCD8 Fab断片、および0.5μg αCD28 Fab断片が負荷されたStreptactin多量体形成試薬の調製物4.5μl、この場合Fab断片は同様にストレプトアビジン結合ペプチドを有する)で刺激する。未処理のTresp細胞を陰性対照とし、抗CD3/抗CD28ビーズ(αCD3 mAbおよびαCD28 mAbでコーティングされたビーズ)で刺激したTrespを陽性対照とする。Tresp細胞を、30U/ml IL-2を補充した細胞培養液1ml中、48ウェルプレートに播種する。細胞を37℃でインキュベートし、3日後に培地交換し、6日後に解析する。
初代ヒトT細胞の刺激に対する、(D-ビオチン添加により)可逆的多量体化試薬を介した細胞刺激を妨害する影響を、Ca2+流動を評価することによってモニターした。健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)からCD3精製されたT細胞に、カルシウムセンサー色素をロードし、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬上に可逆的に結合している多量体化抗CD3/抗CD28 Fab断片を含有する試薬とインキュベートして、フローサイトメトリー解析によってCa2+流動について評価した。抗CD3/抗CD28多量体化作用物質を、60秒で添加し、培養物を、邪魔せずに放置したか、または200秒で、D-ビオチン添加で処理した。T細胞のカルシウム流動の誘導が、多量体形成試薬からのFab断片の解離によってシグナルを妨害した後でも依然として可能であったことを確認するために、イオノマイシンを400秒で添加した。
抗CD3/抗CD28シグナルとのインキュベーション、およびその解離後に、健常ドナーPBMCから単離されたT細胞の増大を評価した。T細胞を、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬に可逆的に結合している多量体化抗CD3/抗CD28 Fab断片を含有する試薬の添加後に、7日間インキュベートした。培養の1日目に、多量体化作用物質を解離するためにD-ビオチンを添加したか、または、細胞を邪魔せずに放置した(1日目のD-ビオチン添加なし)。対照として、細胞を、抗CD3/抗CD28磁気ビーズと7日間インキュベートした。総細胞数およびアネキシンV陽性細胞の画分を、培養の0、3、または7日目に評価した。図28Aおよび28Bに示されるように、1日目に解離させた(ビオチンを1日目に添加した)抗CD3/抗CD28多量体化作用物質と培養したCD3+ T細胞は、細胞を完全に7日間、(D-ビオチン添加を伴わずに)多量体化作用物質とインキュベートした培養物、および細胞を対照の抗CD3/抗CD28ビーズとインキュベートした培養物の両方と比較して、増強された増大および(減少したアネキシンV染色によって示されるような)低減したアポトーシスを示した。
細胞増殖の指標としての細胞の代謝活性を、安定なテトラゾリウム塩WST-1の可溶性ホルマザン色素複合体への切断の比色モニタリングによって評価した。この作用物質の切断は、概して、生細胞におけるNAD(P)Hの糖分解産生に依存するため、ホルマザン色素の程度は、概して、培養物における代謝的に活性な細胞の数に直接的に相関することができる。本研究において、CD4精製されたT細胞またはCD8精製されたT細胞を、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬上に可逆的に結合している抗CD3/抗CD28多量体化Fab断片(2日目のD-ビオチン添加を伴うかまたは伴わない)、または対照の抗CD3/抗CD28磁気ビーズ試薬とインキュベートした。細胞の培養後の1日目、2日目、または3日目に、細胞をWST-1試薬とインキュベートし、450 nmでの吸光度を読み取り値として測定することにより、代謝活性のレベルを評価した。結果を、アッセイされ、細胞数あたりのWST-1の比率として示されている、培養物中の細胞の数に対して正規化した。
CFSE色素で標識されたCD3+細胞を、ストレプトアビジンムテインのオリゴマー形態上に可逆的に結合している、多量体化抗CD3/抗CD28 Fab断片を含有する可逆的試薬の存在下で培養した。1日目に、D-ビオチンを、図31に示されるようにいくつかの試料に添加した。示されたようないくつかの条件下で、細胞を、3日目に、CFSElow(非分裂)細胞について選別した。選別された細胞を、刺激のさらなる添加なしで培養した(選別精製(図31を参照されたい))か、または追加的な抗CD3/抗CD28多量体化作用物質とさらに混合した(選別精製、再刺激(図31を参照されたい))。選別されていない細胞(3日目にCFSEレベルに基づいて選別されなかった細胞)もまた、並行して評価した。無刺激の細胞に対して正規化された細胞の増大を、15日目までモニターした。
様々なT細胞マーカーの発現を、様々なタイプのレトロウイルス媒介性形質導入を含む様々な条件に供したT細胞の、それらを、D-ビオチンの添加により誘導される1日目の解離を伴うかまたは伴わずに、可逆的に結合する抗CD3/抗CD28多量体化作用物質とインキュベートすることによる刺激後に、評価した。健常ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)からCD3精製されたT細胞に、各々が異なるキメラ抗原受容体をコードする様々なレトロウイルスベクター粒子の1つを形質導入し、培養において増大させ、凍結し、融解した。細胞を、オリゴマーストレプトアビジンムテインに対する可逆的結合によって多量体化された、多量体化抗CD3/抗CD28 Fab断片を含有する実施例1に記載された試薬の添加後に、7日間インキュベートした。培養の1日目に、いくつかの試料において細胞から多量体化作用物質を解離させるためにD-ビオチンを添加し、他方、他のものにおいては、細胞および試薬を邪魔せずに放置した(1日目のD-ビオチンの添加なし)。他の試料において、細胞を、抗CD3/抗CD28磁気ビーズと7日間インキュベートした。数多くのT細胞活性化および/または他の表現型マーカーの各々の表面および/または細胞内発現について陽性の細胞のパーセンテージを、様々な時間に評価した。
Claims (53)
- 以下の工程を含む、T細胞を培養するための方法:
(a)T細胞を含む組成物を、一価抗体断片を含む受容体結合物質の存在下でインキュベートする工程であって、該受容体結合物質が、(i)該受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)該組成物中のT細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の分子に特異的に結合する工程;および
(b)該インキュベーションの開始後5日以内に、受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊し、それによって培養T細胞が生成される工程。 - 分子が、TCR/CD3複合体の構成成分であるか、またはCD3である、請求項1に記載の方法。
- 受容体結合物質が、結合パートナーを含み、かつ、試薬の複数の結合部位が、各々が結合パートナーに結合して受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記破壊が、試薬から受容体結合物質を解離させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含み、ここで、
該試薬から受容体結合物質を解離させることができる物質が、競合物質であり、受容体結合物質に可逆的に結合することができる試薬の複数の結合部位に対する該物質の結合親和性が、受容体結合物質に可逆的に結合することができる試薬の複数の結合部位に対する受容体結合物質の結合親和性より高い、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記破壊が、試薬から受容体結合物質を解離させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含み、ここで、該物質が遊離した結合パートナーである、請求項3または4に記載の方法。
- 受容体結合物質が第1の受容体結合物質であり、前記分子が第1の分子であり、1つまたは複数のT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合することができる第2の受容体結合物質の存在下で、インキュベーションがさらに実行される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の分子に対する第2の受容体結合物質の結合が、T細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変する、請求項6に記載の方法。
- 試薬が、第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含み、それによって、第2の受容体結合物質が該試薬に可逆的に結合されており、該第2の受容体結合物質が一価抗体断片を含む、請求項6または請求項7に記載の方法。
- 第2の受容体結合物質が、結合パートナーを含み、かつ、試薬の複数の結合部位が、各々が結合パートナーに結合して受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位を含み、それによって、第1および第2の受容体結合物質が、2つ以上の結合部位を介して試薬に可逆的に結合されている、請求項8に記載の方法。
- 前記破壊が、試薬から第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質を解離させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含み、ここで、
該試薬から第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質を解離させることができる物質が、競合物質であり、試薬の複数の結合部位に対する該物質の結合親和性が、(i) 第1の受容体結合物質に可逆的に結合することができる試薬の複数の結合部位に対する第1の受容体結合物質、および、(ii) 第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる試薬の複数の結合部位に対する第2の受容体結合物質、の結合親和性より高い、請求項8または9に記載の方法。 - 前記破壊が、試薬から第1の受容体結合物質および第2の受容体結合物質を解離させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含み、ここで、該物質が遊離した結合パートナーである、請求項9または10に記載の方法。
- 以下の工程を含む、T細胞を培養するための方法:
(a)T細胞を含む組成物を、
(i)T細胞においてTCR/CD3複合体関連シグナルを誘導またはモジュレートする様式で、T細胞の表面上に発現している第1の分子に特異的に結合する、第1の受容体結合物質;および
(ii)(i)第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬に可逆的に結合されており、かつ(ii)T細胞において第2のシグナルを誘導またはモジュレートする様式でT細胞の表面上の第2の分子に特異的に結合する、一価抗体断片を含む第2の受容体結合物質
の存在下でインキュベートする工程;ならびに
(b)該インキュベーションの開始後5日以内に、第2の受容体結合物質と試薬との間の可逆的結合を破壊し、それによって培養T細胞が生成される工程。 - 第2のシグナルが、T細胞において第1の分子を介して送達されたシグナルを増強するか、減衰させるか、または改変する、請求項12に記載の方法。
- 前記破壊が、前記インキュベーションの開始後30分を超えてから実行される、請求項12または請求項13に記載の方法。
- 前記破壊が、前記インキュベーションの開始後1時間〜4日、前記インキュベーションの開始後6時間〜3日、前記インキュベーションの開始後12時間〜2日、もしくは前記インキュベーションの開始後1日〜3日に実行される;または
前記破壊が、前記インキュベーションの開始後1時間もしくはそれを超えてから、前記インキュベーションの開始後1日、2日、3日、もしくは4日以内に、実行される、
請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナル以外のシグナルである;または
第2のシグナルが、TCR/CD3複合体関連シグナルを増強もしくは強化することができる、
請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。 - 第2の分子が、共刺激分子、アクセサリー分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子であるか、または、TNFファミリーもしくはTNF受容体ファミリーのメンバーである、請求項6〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の分子が、CD28、CD90(Thy-1)、CD95(Apo-/Fas)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40、およびHVEMの中から選択される、請求項6〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の分子がCD28である、請求項6〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の分子がCD3であり、第2の分子がCD28である、請求項6〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の受容体結合物質が、結合パートナーを含み、かつ、複数の結合部位が、各々が結合パートナーに結合して第2の受容体結合物質と試薬との間に可逆的結合を形成することができる2つ以上の結合部位を含む、請求項12〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記破壊が、試薬から第2の受容体結合物質を解離させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含み、ここで、
該試薬から第2の受容体結合物質を解離させることができる物質が、競合物質であり、第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる試薬の複数の結合部位に対する該物質の結合親和性が、第2の受容体結合物質に可逆的に結合することができる試薬の複数の結合部位に対する第2の受容体結合物質の結合親和性より高い、請求項12〜21のいずれか一項に記載の方法。 - 前記破壊が、試薬から第2の受容体結合物質を解離させることができる物質を含む組成物の細胞への導入を含み、ここで、該物質が遊離した結合パートナーである、請求項21または22に記載の方法。
- 前記破壊の後、T細胞を含む組成物をさらにインキュベートする工程を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- インキュベーションおよびさらなるインキュベーションが、同じ容器において実行され;かつ/または
さらなるインキュベーションが、前記試薬から受容体結合物質を解離させることができる物質の存在下で実行され;かつ/または
前記方法が、前記試薬から受容体結合物質を解離させることができる物質、受容体結合物質、第2の受容体結合物質、および/もしくは試薬を、さらなるインキュベーションの前に細胞組成物から除去する工程を含まず;かつ/または
インキュベーションおよび/もしくはさらなるインキュベーションが、37℃±2℃で実行され;かつ/または
インキュベーションおよび/もしくはさらなるインキュベーションが、T細胞にシグナルを送達することができるさらなる作用物質の存在下で実行される、
請求項24に記載の方法。 - インキュベーションまたはさらなるインキュベーションが、T細胞、CD4+ T細胞、および/またはCD8+ T細胞の増殖を増強または誘導することができるさらなる作用物質の存在下で実行される、請求項24または請求項25に記載の方法。
- さらなる作用物質が、IL-2、IL-15、およびIL-7の中から選択されるサイトカインである、請求項26に記載の方法。
- さらなるインキュベーションが、14日を超えない、12日を超えない、10日を超えない、8日を超えない、または6日を超えない期間にわたって実行される、請求項24〜27のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞が、対象由来の初代細胞である、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞が、分画されていないT細胞である、濃縮されたかもしくは単離されたCD3+ T細胞である、濃縮されたかもしくは単離されたCD4+ T細胞である、または、濃縮されたかもしくは単離されたCD8+ T細胞である、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞が、ヒト細胞である、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 試薬が、前記インキュベーションの間、固体支持体、固定相、ビーズ、微粒子、磁性粒子、および/もしくはマトリックスではなく、かつそれらに結合されていないかもしくはそれらと会合しておらず;または
試薬が、インキュベーションの少なくとも一部の間、支持体に結合されており、それによって、複数のT細胞が、インキュベーションの少なくとも一部の間、支持体上に可逆的に固定化されている、
請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。 - 試薬が、柔軟性であり、金属もしくは磁性コアを含有せず、完全にもしくは主に有機多量体から構成されており、球形ではなく、実質的に球形もしくは均一な形状ではなく、かつ/もしくは硬直していない、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 一価抗体断片が、Fab断片、Fv断片、およびscFv断片の中から選択される、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の受容体結合物質が抗CD3 Fabであり、第2の受容体結合物質が抗CD28 Fabである、請求項6〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 試薬が、
ビオチン、ビオチン類似体、もしくはそれらの生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンのムテイン、
ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アビジンもしくはストレプトアビジンのムテイン、
遷移金属イオンに結合することができる少なくとも2つのキレート基Kを含む試薬、
オリゴヒスチジン親和性タグに結合することができる作用物質、
グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合することができる作用物質、
カルモジュリンもしくはその類似体、
カルモジュリン結合ペプチド(CBP)に結合することができる作用物質、
FLAG-ペプチドに結合することができる作用物質、
HAタグに結合することができる作用物質、
マルトース結合タンパク質(MBP)に結合することができる作用物質、
HSVエピトープに結合することができる作用物質、
mycエピトープに結合することができる作用物質、または
ビオチニル化担体タンパク質に結合することができる作用物質
であるか、あるいはそれを含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。 - 試薬が、
ビオチンもしくは生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンのムテイン、
ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジンもしくはアビジンのムテイン、
遷移金属イオンに結合することができる少なくとも2つのキレート基Kを含む試薬、
オリゴヒスチジン親和性タグに結合することができる作用物質、
グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合することができる作用物質、
カルモジュリンもしくはその類似体、
カルモジュリン結合ペプチド(CBP)に結合することができる作用物質、
FLAG-ペプチドに結合することができる作用物質、
HAタグに結合することができる作用物質、
マルトース結合タンパク質(MBP)に結合することができる作用物質、
HSVエピトープに結合することができる作用物質、
mycエピトープに結合することができる作用物質、または
ビオチニル化担体タンパク質に結合することができる作用物質
の、オリゴマーまたはポリマーである、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。 - 試薬が、ストレプトアビジンムテインのオリゴマーまたはポリマーを含む、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- オリゴマーまたはポリマーの個々の分子が、多糖または二官能性リンカーによって架橋されている、請求項37または38に記載の方法。
- 試薬が、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として44〜47位に対応する配列位置に、アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47もしくはlle44-Gly45-Ala46-Arg47を含むストレプトアビジンムテインを含む;または
ストレプトアビジンムテインが、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジンにおける位置を基準として44〜47位に対応する配列位置に、アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47を含む、
請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。 - ストレプトアビジンムテインが、
(a)SEQ ID NO: 3〜6、27、および28のいずれかに示されるアミノ酸の配列;または
(b)SEQ ID NO: 3〜6、27、および28のいずれかに対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれよりも高い配列同一性を呈し、Val44-Thr45-Ala46-Arg47またはlle44-Gly45-Ala46-Arg47に対応するアミノ酸配列を含有し、かつ、ビオチンもしくはその生物学的に活性な形態、ビオチン類似体もしくはムテインもしくはそれらの生物学的に活性な断片、またはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、アミノ酸の配列
を含む、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。 - 試薬が、ストレプトアビジンムテインであるかまたはそれを含み、かつ、結合バートナーが、SEQ ID NO:15〜19のいずれかに記載のアミノ酸の配列を含むストレプトアビジン結合ペプチドを含む、請求項3〜11および21〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 試薬が、ストレプトアビジンムテインまたはそれらの生物学的に活性な断片であるか、またはそれを含み;かつ
試薬から受容体結合物質を解離させることができる物質が、ストレプトアビジン結合ペプチド、ビオチンもしくは生物学的に活性な断片、D-ビオチン、またはビオチン類似体もしくは生物学的に活性な断片を含む、
請求項4〜11および22〜43のいずれか一項に記載の方法。 - 試薬から受容体結合物質を解離させることができる物質が、D-ビオチンまたはデスチオビオチンを含む、請求項4〜11および22〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 試薬から受容体結合物質を解離させることができる物質が、SEQ ID NO:15〜19のいずれかに記載のアミノ酸の配列を含むストレプトアビジン結合ペプチドである、請求項44または45に記載の方法。
- インキュベーションの前に、前記方法が、細胞を、組成物のT細胞が含むマーカーに特異的に結合する選択物質と接触させ、それによってT細胞を含む組成物を生成もしくは取得することを含む;または
インキュベーションの少なくとも一部が、さらに、組成物のT細胞が含むマーカーに特異的に結合する選択物質の存在下で実行され、培養T細胞が、マーカーを含むT細胞または標的細胞について濃縮される、
請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。 - 選択物質が、選択物質に特異的に結合することができる複数の結合部位をさらに含む試薬に可逆的に結合されている;または
選択物質が、選択物質に特異的に結合することができる複数の結合部位を含むさらなる試薬に可逆的に結合されている、
請求項48に記載の方法。 - シグナルの誘導またはモジュレーションが、シグナルの誘導またはモジュレーションの非存在下でのT細胞のインキュベーションと比較して、培養T細胞の増大および/または活性化における増加をもたらす、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
- インキュベーションの前の組成物中の、インキュベーションの後であるが可逆的結合を破壊せずに、または、インキュベーションの後であるが、CD28に特異的に結合しかつ/またはCD28シグナル伝達を誘導もしくはモジュレートする作用物質の存在下における組成物中のT細胞と各々比較して、組成物中のT細胞の増大および/もしくは増殖を増加させる、組成物中のT細胞の代謝プロファイルを変更する、組成物中のCD8+ T細胞のサブセットを変更し;かつ/または、組成物中の長命メモリーT細胞のパーセンテージを増加させる、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物のT細胞に組換え核酸分子を導入する工程をさらに含み、核酸分子が組換えタンパク質をコードし、それによって、細胞が組換えタンパク質を発現する、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックT細胞受容体(TCR)である、請求項52に記載の方法。
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