RU2778411C2

RU2778411C2 - Способы культивирования клеток и наборы и устройство для них

Info

Publication number: RU2778411C2
Application number: RU2018118573A
Authority: RU
Inventors: Лотар ГЕРМЕРОТ; Кристиан ШТЕМБЕРГЕР; Патриция ГРЕФ
Original assignee: Джуно Терапьютикс Гмбх
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2016-10-20
Publication date: 2022-08-18

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу стимулирования Т-клеток, с помощью первого и второго стимулирующих средств, где первое стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD3, экспрессируемой на поверхности Т-клеток, и где второе стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD28, экспрессируемой на поверхности Т-клеток. Изобретение позволяет эффективно стимулировать Т-клетки. 2 н. и 82 з.п. ф-лы, 33 ил., 22 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] По данной заявке испрашивают приоритет предварительной заявки США № 62/245,249, поданной 22 октября 2015 года, которая озаглавлена «Methods for Culturing Cells and Kits and Apparatus for Same», которая включена посредством ссылки в полном объеме.

Включение списка последовательностей посредством ссылки

[0002] Данная заявка подана со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей предоставлен в виде файла с названием Списки последовательностей.txt, созданного 24 апреля 2018 года, который имеет размер 40752 байта. Информация в электронном формате о списке последовательностей включена посредством ссылки в полном объеме.

Область

[0003] Настоящее раскрытие относится в некоторых аспектах к инкубации или культивированию клеток, например, клеток-мишеней, и их композициям, а также к обогащению, разделению и/или отбору клеток, в том числе клеток-мишеней, используемых в такой инкубации, среди других компонентов, например, среди других клеток в композиции. Стадии инкубации и разделения можно осуществлять в различном порядке, или они могут пересекаться по времени. Способы обычно включают использование реактивов, средств и комплексов, которые (и/или которые содержат компоненты, которые) обратимо связываются друг с другом, где такое связывание в целом является обратимым с помощью добавления вещества. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления после или во время инкубации и/или отбора, реактивы можно диссоциировать посредством добавления вещества, чтобы сделать возможными последующую обработку, последующие раунды стимуляции или разделения и/или чтобы управлять качеством или количеством передачи сигнала, получаемого клетками. В некоторых аспектах, способы включают связывание средств с молекулой на поверхности клеток, тем самым предоставляя один или несколько сигналов для клеток. В способах в целом используют реактивы, которые содержат множество сайтов связывания для средств, такие как реактивы мультимеризации, и, таким образом, одно или несколько средств мультимеризуют посредством обратимого связывания с реактивом, например, тем самым создавая стимулирующий реактив (мультимеризованное средство) и/или реактив отбора (мультимеризованное средство отбора), имеющий стимулирующие средства или средства отбора, мультимеризованные на нем. В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в присутствии основы, такой как стационарная фаза или твердая фаза, которая в некоторых случаях представляет собой стационарную фазу или твердую фазу, с которой связывают средства отбора. В некоторых вариантах осуществления клетки, подлежащие стимуляции, иммобилизуют, обычно опосредованно, через предоставленные реактивы, на стационарной фазе. Также предусмотрены композиции, устройство и способы их применения.

Предпосылки

[0004] Доступны различные стратегии стимуляции и/или обогащения клеток и популяций клеток in vitro. Доступные стратегии включают таковые для обогащения и/или размножения антиген-специфических T-клеток in vitro для использования в адоптивной клеточной иммунотерапии или терапии злокачественных опухолей, для которых показано, что инфузии таких T-клеток имеют противоопухолевую реактивность в опухоленесущем организме-хозяине, или для использования при введении пациентам с вирусными инфекциями. Усовершенствованные стратегии необходимы для культивирования и обогащения и отбора клеток и популяций in vitro, в том числе для исследовательских, диагностических и терапевтических целей. Предусмотрены реактивы, способы, промышленные изделия и наборы, которые отвечают таким потребностям.

Краткое изложение

[0005] Предоставлены способы, которые включают манипулирование, культивирование и/или обработку клеток, таких как клетки-мишени и/или их композиции. Также предусмотрены композиции, средства, реактивы и устройства, а также промышленные изделия для использования в способах, например, в любых способах. Способы в целом включают инкубацию (например, культивирование) клеток, например, чтобы стимулировать клетки.

[0006] Например, в некоторых вариантах осуществления способы включают инкубацию композиции, содержащей клетки-мишени, в присутствии стимулирующего средства, которое обратимо связывают с реактивом. В некоторых аспектах, реактив содержит множество сайтов связывания стимулирующих средств, способных к обратимому связыванию со стимулирующим средством. Инкубацию можно осуществлять в условиях, в соответствии с которыми стимулирующее средство специфически связывается с молекулой, экспрессируемой на поверхности клеток-мишеней, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в клетках-мишенях.

[0007] В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают обогащение или отбор клеток и их композиций, таких как клетки-мишени, подлежащие стимуляции и/или костимулированные или костимулируемые. В некоторых вариантах осуществления способы включают как инкубацию (например, для стимуляции), так и обогащение или отбор клеток, например, чтобы отбирать конкретную популяцию клеток-мишеней и чтобы стимулировать или иным образом культивировать такие клетки, после отбора или одновременно с ним. В некоторых вариантах осуществления обогащение или отбор и стимуляцию осуществляют последовательно, в любом порядке, по меньшей мере с частичным перекрытием по времени, или осуществляют одновременно.

[0008] В некоторых вариантах осуществления различные стадии способов (и/или способы в полном объеме) осуществляют в закрытой системе, такой как стерильная система; среди предоставленных устройств и изделий имеют место таковые для использования при выполнении способов в таких закрытых или стерильных системах. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой T-клетки.

[0009] В некоторых аспектах способ включает инкубацию композиции, содержащей T-клетки, в присутствии средства (которое в некоторых случаях можно обозначать как первое средство, например, чтобы отличать его от дополнительных средств, например, второго, третьего и т. д. средств, используемых в способах или реактивах), и/или комплекса, содержащего его, такого как мультимеризованное средство или реактив, содержащий средства в мультимеризованной форме. Иммобилизация средства на реактиве может быть обратимой. В некоторых аспектах, множество сайтов связывания стимулирующих средств содержит один или несколько сайтов связывания, Z1, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, C1; и/или стимулирующее средство дополнительно содержит один или несколько партнеров связывания, C1. В некоторых аспектах, множество сайтов связывания стимулирующих средств содержит два или больше сайтов связывания, Z1, и/или дополнительно содержит один или несколько сайтов связывания, Z2, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, C1; и/или стимулирующее средство содержит два или больше партнеров связывания, C1. Стимулирующее средство дополнительно может содержать сайт связывания, B2, где специфическое связывание между стимулирующим средством и молекулой на поверхности клеток-мишеней включает взаимодействие между B2 и молекулой.

[0010] В некоторых аспектах, средство представляет собой рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, такое как то, которое способно доставлять или индуцировать или модулировать сигнал в клетке-мишени. Рецептор-связывающее средство (например, стимулирующее средство) можно обратимо связывать с реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с рецептор-связывающим средством и, таким образом, способных действовать в качестве мультимеризующего реактива, чтобы формировать мультимеры средства на олигомерном реактиве. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клеток, например, T-клетки, например, таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в клетках, например, T-клетках, в композиции.

[0011] В некоторых вариантах осуществления реактив, связанный со стимулирующим средством (его комплекс, который в некоторых случаях можно обозначать как стимулирующий реактив), явялется олигомерным по природе и при этом растворим, не связан с твердым носителем, бусиной, жесткой частицей, сферической или по существу сферической частицей или стационарной фазой. В некоторых аспектах, реактив имеет размер, который меньше чем 20 нм, меньше чем 10 нм, меньше чем 5 нм или меньше чем 1 нм. В некоторых случаях реактив имеет плотность меньше чем 1,2 г/см³ или меньше чем 1,0 г/см³.

[0012] В некоторых вариантах осуществления такое стимулирующее средство (например, первое средство) не является и не связано с или ассоциировано с твердым носителем, стационарной фазой, бусиной, микрочастицей, магнитной частицей и/или матрицей во время указанной инкубации, и/или является гибким, не содержит металлическую или магнитную сердцевину, состоит полностью или в первую очередь из органического мультимера, не является сферическим, не является по существу сферическим или однородным по геометрической форме и/или не является жестким.

[0013] В некоторых вариантах осуществления, в том числе таких вариантах осуществления, где реактив не связывают с твердой фазой или бусиной или другим компонентом, как описано, стимуляцию тем не менее осуществляют в присутствии основы, такой как стационарная фаза и/или твердая фаза. В некоторых аспектах, по меньшей мере множество клеток-мишеней иммобилизуют на такой основе во время по меньшей мере части инкубации. Иммобилизация необязательно обратима.

[0014] В некоторых вариантах осуществления стимуляция и обратимая иммобилизация на основе происходит через один и тот же реактив так, что реактив используют для разделения и стимуляции. Например, способы могут включать (a) объединение композиции, содержащей клетки-мишени, и стимулирующего средства, обратимо связанного с реактивом, который иммобилизуют на основе, где реактив содержит множество сайтов связывания стимулирующих средств, каждый способен к обратимому связыванию со стимулирующим средством, и способен к специфическому связыванию с молекулой, экспрессируемой на поверхности клеток-мишеней, тем самым иммобилизуя клетки-мишени на основе; и (b) разделение или удаление из иммобилизованных клеток-мишеней других клеток композиции; и (c) инкубацию по меньшей мере некоторых из иммобилизованных клеток-мишеней в присутствии стимулирующего средства, в условиях, в соответствии с которыми сигнал индуцируют или модулируют по меньшей мере во множестве клеток-мишеней.

[0015] В некоторых случаях, основа представляет собой или содержит стационарную фазу; и/или основа представляет собой или содержит твердый носитель. В некоторых аспектах, стимулирующее средство представляет собой первое средство и по меньшей мере часть инкубации осуществляют в присутствии второго реактива, который иммобилизуют на основе, и средства отбора, которое обратимо связывают с указанным вторым реактивом и также способно к связыванию с молекулой на клетках, тем самым содействуя обратимой иммобилизации клеток во время инкубации на основе. Второй реактив может содержать множество сайтов связывания средства отбора, например, один или несколько (например, два или больше) сайтов связывания, Y1, каждый способен к обратимому связыванию со средством отбора, например, через партнер связывания, D1, который содержит средство отбора. В некоторых вариантах осуществления средство отбора дополнительно содержит сайт связывания Y2, который также способен к связыванию с D1. В некоторых вариантах осуществления средство отбора дополнительно содержит сайт связывания, B1, например, так, что специфическое связывание между средством отбора и селективным маркером включает взаимодействие между B1 и селективным маркером.

[0016] В некоторых вариантах осуществления второй реактив и средство отбора обратимо связывают вместе в комплексе во время указанного объединения, где объединение осуществляют посредством объединения клеток с комплексом. В других вариантах осуществления второй реактив и средство отбора не находятся в комплексе во время указанного объединения, где объединение осуществляют посредством отдельного добавления второго реактива и средства отбора. Таким образом средства можно предварительно связывать или нет перед объединением с клетками или другими соединениями или композициями.

[0017] В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают обогащение или отбор, например, посредством объединения по меньшей мере множества клеток-мишеней; средства отбора, которое (i) способно к специфическому связыванию с селективным маркером, экспрессируемым одной или несколькими из по меньшей мере множества клеток-мишеней из множества, и (ii) иммобилизуют, или способно к иммобилизации, на основе, непосредственно или опосредованно; и (c) основы, в соответствии с чем одна или несколько клеток-мишеней из по меньшей мере множества становятся иммобилизованными на основе через средство отбора.

[0018] Способы дополнительно могут включать объединение, разделение и/или удаление из иммобилизованных клеток-мишеней, других клеток композиции, выполнение стадии промывания, которую можно осуществлять перед инициацией указанной инкубации.

[0019] Основа может содержать стационарную фазу и/или представляет собой или содержит твердый носитель.

[0020] В некоторых аспектах, обогащение и стимуляцию осуществляют последовательно или одновременно или с частичным перекрытием; в некоторых аспектах, инкубацию осуществляют и/или инициируют до объединения; или инкубацию осуществляют и/или инициируют после объединения. В некоторых аспектах объединение осуществляют во время по меньшей мере части инкубации.

[0021] В некоторых аспектах, обратимое связывание между различными компонентами в вариантах осуществления (например, между первым или стимулирующим средством и реактивом, например, реактивом мультимеризации, и/или между средством отбора и вторым реактивом, или любыми или всеми, описанными в качестве обратимо связывающих) можно разрушать посредством добавления вещества. В некоторых аспектах, вещество представляет собой или содержит свободный партнер связывания; или вещество представляет собой или содержит конкурентное средство; и/или вещество вызывает изменение, которое разрушает связывание отлично от конкуренции за указанное связывание. Таким образом, разрушение с помощью вещества может происходить посредством конкуренции, например, посредством конкуренции за связывание с одним компонентом другим, например, с более благоприятным свойством связывания с ним. В некоторых аспектах, вещество представляет собой то, которое не является вредоносным для клеток-мишеней или не является вредоносным для большинства клеток-мишеней, так что клетки можно использовать в определенных желаемых последующих применениях. В некоторых случаях, добавление вещества к клеткам-мишеням в количестве, достаточном для того, чтобы вызывать указанное разрушение, не снижает выживаемость и/или пролиферативную способность клеток меньше чем на или приблизительно до 90%, 80%, 70%, 60% или 50%, по сравнению с отсутствием вещества при в остальном тех же условиях. Образцовыми являются веществам, которые представляют собой или содержат пептид или полипептид, такие как те, которые связываются со стрептавидином или мутеинами стрептавидина и/или с их сайтами связывания биотина.

[0022] Вещество может включать молекулу из группы, состоящей из: стрептавидин-связывающих молекул; биотина; D-биотина; аналогов биотина; аналогов биотина, которые специфически связываются со стрептавидином или аналогом стрептавидина, имеющим аминокислотную последовательность Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷, или lle⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷, в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 стрептавидина дикого типа; и пептидов, содержащих или состоящих из последовательности, приведенной в любой из SEQ ID № 1, 4, 5 и 7. В других вариантах осуществления вещество представляет собой или содержит хелатор металлов, который необязательно представляет собой EDTA или EGTA.

[0023] В некоторых аспектах средства являются мономерными, такими как где они содержат только один из заданного сайта связывания, такими как стимулирующие средства, содержащие только один из сайта, B2, и/или средства отбора, содержащие только один из B1. Например в некоторых случаях, стимулирующее средство содержит только один сайт связывания, который специфически связывается с молекулой, стимулирующее средство специфически связывается с молекулой одновалентным образом и/или содержит только один сайт связывания, который специфически связывается с селективным маркером; и/или средство отбора специфически связывается с селективным маркером одновалентным образом.

[0024] Сайты связывания для обратимого связывания на стимулирующем реактиве/средстве (например, C и Z) могут представлять собой одно и то же или различное, соответственно, или могут быть разрушаемыми с помощью одного и того же вещества, или нет, с таковым на реактиве/средстве отбора (например, сайты связывания D и Y). Первый и второй реактивы могут по существу представлять собой одно и то же и необязательно отличное от того (например, связывающего средство отбора реактива), иммобилизуемого на основе.

[0025] Также предусмотрены средства, реактивы, комплексы и композиции или промышленные изделия, например, наборы, содержащие одно и то же, например, таковые для осуществления любого из вариантов осуществления способов. Например, предусмотрена композиция, содержащая стимулирующее средство, обратимо связанное с реактивом мультимеризации, который необязательно представляет собой первый реактив, где стимулирующее средство способно к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клетки-мишени, таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в клетке-мишени.

[0026] В некоторых вариантах осуществления композиция и/или изделие дополнительно содержит основу; второй реактив, иммобилизованный на основе; и средство отбора, которое способно к обратимому связыванию со вторым реактивом и способно к специфическому связыванию с селективным маркером на клетке-мишени.

[0027] Композиция дополнительно может содержать клетку-мишень и/или не клетку-мишень, которая не экспрессирует (первый) селективный маркер и/или второй селективный маркер, и клетка-мишень необязательно содержит рекомбинантную молекулу или нуклеиновую кислоту, экспрессирующую рекомбинантную молекулу, которая необязательно представляет собой химерный рецептор. Композиция дополнительно может содержать вещество, способное разрушать связывание.

[0028] В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие содержит стимулирующее средство, реактив, который обратимо связывается с ним, и необязательно второй реактив, который связывается со средством отбора, и необязательно средство отбора, и необязательно дополнительную основу, с реактивом, предварительно иммобилизованным на ней, или без него. Компоненты могут находиться в отдельных контейнерах или одних и тех же контейнерах или их сочетаниях. Реактивы, способные к обратимому связыванию, могут находиться в промышленном изделии предварительно связанными или отделенными для последующей функционализации реактивов с использованием средств. В некоторых аспектах, основа и вторая основа присутствуют в отдельных контейнерах, где указанные различные контейнеры необязательно соединяют по текучей среде друг с другом, делая возможным прохождение клеточной суспензии через или за пределы одной из основ, за которой следует другая; изделие дополнительно содержит вещество, способное разрушать обратимое связывание между одним или несколькими реактивами и одним или несколькими средствами.

[0029] В некоторых вариантах осуществления второй реактив дополнительно содержится в контейнере; и/или (первое) средство отбора и/или второе средство отбора дополнительно содержатся в контейнере; и/или промышленное изделие дополнительно содержит второй контейнер, необязательно содержащий (первое) стимулирующее средство и/или второе стимулирующее средство и/или первый реактив; и/или изделие дополнительно содержит третий контейнер, который содержит второе средство отбора и/или третий реактив; и/или изделие дополнительно содержит четвертый контейнер, который содержит вещество.

[0030] Также предусмотрены устройства для осуществления предоставленных способов, таких как любые из предоставленных вариантов осуществления способов. Такое устройство может в некоторых вариантах осуществления содержать любое из предоставленных композиций или предоставленных промышленных изделий. Устройство может содержать или дополнительно содержать впуск текучего вещества, такой как тот, который соединяют по текучей среде с композицией или с одним или несколькими компонентами устройства, и/или выпуск текучего вещества, соединяемый по текучей среде с композицией и/или одним или несколькими компонентами устройства.

[0031] В некоторых вариантах осуществления устройство содержит (a) стимулирующее средство, способное к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клетки-мишени, таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в клетке-мишени; (b) первый реактив, который способен к обратимому связыванию со стимулирующим средством; (c) второй реактив; (d) основу, (e) средство отбора, которое способно к обратимому связыванию со вторым реактивом и способно к специфическому связыванию с селективным маркером на клетке-мишени. Компоненты в (a)-(e) в некоторых аспектах присутствуют во множестве контейнеров, по меньшей мере некоторые из которых находятся в соединении по текучей среде, необязательно в закрытой или стерильной системе, в соответствии с чем один или несколько компонентов проходят из одного контейнера в другой внутри устройства. Устройство в некоторых аспектах дополнительно содержит выпуск образца, такой как тот, что соединен по текучей среде с по меньшей мере одной основой, например, стационарной фазой для хроматографии.

[0032] В некоторых вариантах осуществления промышленное изделие или устройство представляет собой функционально закрытую систему. Устройство дополнительно может содержать одно или несколько средств управления, способных регулировать или корректировать один или несколько признаков окружения, в котором осуществляют одну или несколько различных стадий, такие как pH, pO₂, pCO₂, и/или термостатическое средство управления одного или нескольких контейнеров или их компонентов и/или по меньшей мере одной из по меньшей мере одной стационарной фазы для хроматографии.

[0033] Изделие или устройство дополнительно может содержать соединение по текучей среде с контейнером, содержащим среду и/или одно или несколько питательных веществ и/или один или несколько источников углерода, в соответствии с чем соединение позволяет доставлять такую среду, питательные вещества и/или источники углерода в клетки внутри устройства, необязательно когда указанные клетки иммобилизуют на стационарной фазе для хроматографии. В некоторых аспектах, контейнер представляет собой выходной контейнер или контейнер состава, например, содержащий буферы или другие компоненты, подходящие для состава клеток. В некоторых аспектах, по меньшей мере один из перечисленных компонентов и/или контейнер, содержащий, или для его размещения, можно отсоединять от устройства стерильным или асептическим образом.

[0034] В некоторых вариантах осуществления способы осуществляют целиком или частично автоматизированным образом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления устройство или изделие способно осуществлять способ автоматизированным образом, например, таким путем, который снижает или устраняет необходимость пользовательского контроля или взаимодействия во время одной или нескольких стадий.

[0035] В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют после указанного объединения и способ дополнительно включает перенос клеток-мишеней композиции в другое окружение, указанное окружение подходит для культивирования или размножения клеток. В некоторых случаях, клетки переносят в закрытой системе или закрытом контейнере в другое окружение; или где перенос включает удаление клеток, переносимых таким образом, из первого контейнера и перенос клеток во второй контейнер. Другое окружение может находиться в инкубаторе. Перенос в некоторых аспектах осуществляют в закрытой системе, где указанный перенос включает перенос стерильно закупоренного контейнера, содержащего клетки, в стерильное окружение или в другое окружение внутри закупоренного контейнера и/или где указанный перенос осуществляют в стерильном окружении или в стерильных условиях.

[0036] В некоторых вариантах осуществления после переноса, клетки открепляют от стационарной фазы посредством разрушения указанного обратимого связывания и необязательно удаления указанных клеток из присутствия стационарной фазы. В некоторых случаях, удаленные клетки дополнительно размножают. В некоторых аспектах, управляют окружением, например, pH, pO₂, pCO₂ и/или температурой, и/или подают питательные вещества к клеткам, содержащимся по меньшей мере в одной из по меньшей мере одной стационарной фазы для хроматографии, при этом находящимся в окружении, подходящем для размножения, во время по меньшей мере части указанной инкубации, необязательно автоматизированным образом. Перенос для размножения в подходящее окружение может включать открепление стационарной фазы от клеток, пока указанная стационарная фаза присутствует в устройстве.

[0037] В некоторых вариантах осуществления способы включают признаки, такие как конкретные стадии, отбор конкретных средств и/или отбор конкретных реактивов, которые делают возможным управление или корректировку типа или силы или длительности сигнала, получаемого или модулируемого через реактив, и/или свойств выходной композиции или популяции(й) клеток, в конечном итоге создаваемой способами. В некоторых вариантах осуществления такие признаки возможны из-за благоприятных свойств средств и реактивов, таких как обратимость связывания индивидуальных компонентов средств или реактивов, и, таким образом, обратимость связывания мультимеризованных средств и клеток. Такие свойства реактивов можно использовать для достижения контроля многими путями. Например, в некоторых вариантах осуществления способы, через обратимость связывания, включают оказание временного управления сигналом, управляя длительностью периода, в котором клетки находятся в контакте с мультимеризованными средствами, и/или длительностью передачи сигнала, индуцированного ими.

[0038] В некоторых вариантах осуществления способы включают управление, например, точное управление длительностью периода времени, в течение которого такие средства связывают с клетками. Например, это можно осуществлять посредством активного обращения такого связывания в конкретный момент времени, и в некоторых случаях при этом все еще сохраняя клетки в течение дополнительного периода времени в других условиях культивирования, таких как инкубация при физиологической температуре и/или с различными питательными веществами. Таким образом, в противоположность другим способам, которые просто включают завершение всех или по существу всех сигналов, получаемых клетками, предоставленные способы в некоторых аспектах делают возможным специфическое завершение или разрушение сигналов, доставляемых с помощью конкретных реактивов.

[0039] Аналогичным образом, в некоторых вариантах осуществления обратимость допускает реактивы с модульной природой, что делает возможной замену одного или нескольких их компонентов без конструирования или новых реактивов, например, посредством просто обращения связывания и объединения с дополнительными средствами или реактивами, в условиях, где индуцируют обратимое связывание. Например, имея возможность обратимого связывания различных стимулирующих средств с одним и тем же реактивом мультимеризации, или одновременно или в различные моменты времени, пользователь предоставленных способов и композиций может корректировать природу конкретного доставляемого сигнала, например, посредством замены одного или нескольких стимулирующих средств на другое одно или несколько стимулирующих средств, например, чтобы индуцировать более сильный или более слабый или качественно иной сигнал, в зависимости от желаемого исхода.

[0040] В некоторых вариантах осуществления временное управление и модульность используют в комбинации, например, посредством инкубации клеток в присутствии одного средства в течение определенного периода времени, индукции обращения связывания посредством разрушения, после чего следует инкубация в присутствии другого или больше различных средств или реактивов. Например, в одном из вариантов осуществления T-клетки изначально стимулируют реактивом для того, чтобы доставлять сигнал конкретной силы или качества, и после определенного периода времени такой сигнал разрушают и замещают качественно или количественно иным (например, более сильным или более слабым или активирующим другие пути передачи сигнала или известным в качестве важного для других путей дифференцировки) сигналом. В некоторых вариантах осуществления такое управление обеспечивает преимущества, например, позволяющие пользователю максимизировать желаемые исходы (например, размножение или персистенцию), при этом избегая нежелательных исходов, таких как истощение или анергия.

[0041] В некоторых вариантах осуществления временного управления достигают посредством разрушения обратимого связывания реактивов или средств, например, посредством добавления вещества. Например, в некоторых вариантах осуществления в пределах периода времени, например, в пределах 5 суток после инициации инкубации и/или в пределах определенной процентной доли от общей длительности инкубации, например, в пределах 1/5, 1/4 1/3 или 1/2 времени, разрушают обратимое связывание между рецептор-связывающим средством и реактивом. Таким образом, в некоторых случаях способ ведет к созданию культивируемых T-клеток.

[0042] В некоторых аспектах, инкубацию осуществляют в условиях, в которых рецептор-связывающее средство специфически связывается с молекулой, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в одной или нескольких T-клетках в композиции.

[0043] В некоторых вариантах осуществления разрушение связывания между рецептор-связывающим средством и реактивом осуществляют больше чем 30 минут после инициации инкубации. Например, в некоторых аспектах, разрушение связывания между рецептор-связывающим средством и реактивом осуществляют между 1 часом и 4 сутками после инициации инкубации, между 6 часами и 3 сутками после инициации инкубации, между 12 часами и 2 сутками после инициации инкубации или между 1 сутками и 3 сутками после инициации инкубации. В некоторых случаях, разрушение связывания между рецептор-связывающим средством и реактивом осуществляют между приблизительно 1 часом и приблизительно 4 сутками после инициации инкубации, между приблизительно 6 часами и приблизительно 3 сутками после инициации инкубации, между приблизительно 12 часами и приблизительно 2 сутками после инициации инкубации или между приблизительно 1 сутками и приблизительно 3 сутками после инициации инкубации. В некоторых аспектах, разрушение осуществляют больше чем или ровно приблизительно 1 час после инициации указанной инкубации и в пределах 1 суток, 2 суток, 3 суток или 4 суток после инициации инкубации.

[0044] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство способно к инициации ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала в T-клетках. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство специфически связывается с элементом комплекса TCR/CD3. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство специфически связывается с CD3.

[0045] В некоторых вариантах осуществления молекула (молекула на поверхности T-клеток) представляет собой компонент комплекса TCR/CD3 или представляет собой CD3. В некоторых аспектах, молекула представляет собой первую молекулу и рецептор-связывающее средство, кроме того, способно к специфическому связыванию со второй молекулой на поверхности одной или нескольких T-клеток. В некоторых случаях вторая молекула способна к индукции или усилению, ослаблению или модификации сигнала, доставляемого через первую молекулу в T-клетки.

[0046] В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1. В некоторых аспектах, множество сайтов связывания, содержащихся в реактиве, включает два или больше сайтов связывания, Z1. В некоторых случаях, каждый из двух или сайтов связывания Z1 способен к связыванию с партнером связывания C1 для того, чтобы формировать обратимую связь между рецептор-связывающим средством и реактивом.

[0047] В некоторых вариантах осуществления разрушение связывания между рецептор-связывающим средством и реактивом включает введение в клетки композиции, содержащей вещество, способное к обращению связи между рецептор-связывающим средством и реактивом.

[0048] В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство представляет собой первое рецептор-связывающее средство и инкубацию дополнительно осуществляют в присутствии второго рецептор-связывающего средства. В некоторых таких случаях, второе рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию со второй молекулой на поверхности одной или нескольких T-клеток. В некоторых аспектах, вторая молекула способна усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу в T-клетки.

[0049] В некоторых вариантах осуществления реактив содержит множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию со вторым рецептор-связывающим средством. В некоторых таких случаях, второе рецептор-связывающее средство обратимо связывают с реактивом. В некоторых аспектах, множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с первым рецептор-связывающим средством, и множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию со вторым рецептор-связывающим средством, могут представлять собой одно и то же или могут отличаться.

[0050] В некоторых аспектах, второе рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1 или C2, который способен к обратимому связыванию с двумя или больше сайтами связывания Z1. В некоторых таких случаях, первое и второе рецептор-связывающие средства обратимо связывают с реактивом через два или больше сайтов связывания Z1. В некоторых случаях, второе рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C2 и реактив дополнительно содержит множество сайтов связывания Z2. Множество сайтов связывания Z2 может быть способно к связыванию с партнером связывания C2 для того, чтобы формировать обратимую связь между вторым рецептор-связывающим средством и реактивом. В некоторых аспектах, C2 и C1 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент. В некоторых случаях, Z1 и Z2 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент.

[0051] В некоторых случаях, реактив представляет собой первый реактив и инкубацию осуществляют в присутствии по меньшей мере второго реактива, который обратимо связывают со вторым рецептор-связывающим средством.

[0052] В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в условиях, в которых второе рецептор-связывающее средство специфически связывается со второй молекулой. В некоторых таких аспектах, связывание второго рецептор-связывающего средства со второй молекулой индуцирует или модулирует сигнал, например, который усиливает, ослабляет или модифицирует сигнал, доставляемый через первую молекулу в T-клетки.

[0053] В некоторых из любых таких вариантов осуществления, разрушение связывания между первым и вторым рецептор-связывающими средствами и реактивом завершает или уменьшает сигнал, индуцируемый или модулируемый первым рецептор-связывающим средством, и завершает или уменьшает сигнал, индуцируемый или модулируемый вторым рецептор-связывающим средством.

[0054] В настоящем описании в некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ культивирования T-клеток, который включает инкубацию композиции, содержащей T-клетки, в присутствии первого рецептор-связывающего средства, которое способно к специфическому связыванию с первой молекулой, экспрессируемой на поверхности T-клеток. В некоторых аспектах, связывание первого рецептор-связывающего средства с первой молекулой индуцирует или модулирует ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал в T-клетке. В некоторых таких вариантах осуществления, композицию дополнительно инкубируют в присутствии второго рецептор-связывающего средства, которое обратимо связывают с реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию со вторым рецептор-связывающим средством. В некоторых аспектах, второе рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию со второй молекулой на поверхности T-клеток. В некоторых случаях, связывание второго рецептор-связывающего средства со второй молекулой индуцирует или модулирует второй сигнал в T-клетке, например, чтобы усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу. В некоторых аспектах, в пределах 5 суток после инициации инкубации, обратимое связывание между вторым рецептор-связывающим средством и реактивом разрушают, тем самым создавая культивируемые T-клетки.

[0055] В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в условиях, в которых первое рецептор-связывающее средство специфически связывается с первой молекулой и/или второе рецептор-связывающее средство специфически связывается со второй молекулой, тем самым индуцируя или модулируя один или несколько сигналов в T-клетках.

[0056] В некоторых вариантах осуществления второе рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1. В некоторых таких вариантах осуществления, множество сайтов связывания, содержащихся в реактиве, включает два или больше сайтов связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 для того, чтобы формировать обратимую связь между вторым рецептор-связывающим средством и реактивом.

[0057] В некоторых аспектах, второй сигнал представляет собой сигнал, отличный от ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала. В некоторых случаях, второй сигнал способен усиливать или потенциировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.

[0058] В некоторых вариантах осуществления вторая молекула представляет собой костимулирующую молекулу, вспомогательную молекулу, цитокиновый рецептор, хемокиновый рецептор, молекулу иммунной контрольной точки или элемент семейства TNF или семейства рецепторов TNF. В некоторых случаях, вторая молекула представляет собой CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM. В некоторых таких случаях, вторая молекула представляет собой CD28. В некоторых вариантах осуществления модульная природа реактивов делает возможной замену одного или нескольких костимулирующих и/или активирующих реактивов, в том числе временно, во время заданной инкубации. Для целей отбора, модульность также может допускать последовательный отбор и/или стимуляцию, где реактивы удаляют между стадиями.

[0059] В некоторых аспектах, разрушение связывания между вторым рецептор-связывающим средством и реактивом (который может представлять собой второй реактив) включает введение в клетки композиции, содержащей вещество, способное к обращению связи между вторым рецептор-связывающим средством и реактивом, который может представлять собой второй реактив. В некоторых вариантах осуществления разрушение завершает или уменьшает сигнал, индуцируемый или модулируемый вторым рецептор-связывающим средством, или дополнительная молекула представляет собой CD28 и разрушение завершает или уменьшает CD28 костимулирующий сигнал в T-клетках.

[0060] В некоторых аспектах, после разрушения, композицию, содержащую T-клетки, дополнительно инкубируют. В некоторых таких аспектах, инкубацию и дополнительную инкубацию осуществляют в одном и том же сосуде. В некоторых случаях, дополнительную инкубацию осуществляют в присутствии вещества. В некоторых случаях, способ не включает удаление вещества, рецептор-связывающего средства, второго рецептор-связывающего средства и/или реактива из композиции клеток перед дополнительной инкубацией. В некоторых вариантах осуществления инкубацию и/или дополнительную инкубацию осуществляют при или приблизительно при 37°C±2°C. В некоторых случаях, инкубацию и/или дополнительную инкубацию осуществляют в присутствии дополнительного средства, которое способно доставлять сигнал в T-клетки. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство способно усиливать или индуцировать пролиферацию T-клеток, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток. В некоторых аспектах, дополнительное средство представляет собой цитокин, такой как IL-2, IL-15 или IL-7. В некоторых вариантах осуществления дополнительную инкубацию осуществляют в течение времени, которое составляет не больше чем 14 суток, не больше чем 12 суток, не больше чем 10 суток, не больше чем 8 суток или не больше чем 6 суток.

[0061] В настоящем описании в некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ культивирования T-клеток, включающий инкубацию композиции, содержащей T-клетки, в присутствии рецептор-связывающего средства, которое специфически связывается с молекулой CD28 на поверхности T-клеток в условиях для того, чтобы вызывать передачу сигнала через CD28 в клетках. В некоторых таких аспектах, в пределах 5 суток после инициации указанной инкубации, связывание рецептор-связывающего средства и молекулы CD28 устраняют или уменьшают, в соответствии с чем передачу сигнала CD28 завершают или уменьшают в клетках, тем самым создавая культивируемые T-клетки.

[0062] В некоторых случаях, устранение или уменьшение осуществляют в пределах 4 суток, в пределах 3 суток, в пределах 2 суток или в пределах 1 суток после инициации инкубации. В некоторых случаях, устранение или уменьшение включает промывание клеток, в соответствии с чем любое рецептор-связывающее средство, которое не связано специфически с CD28, удаляют или уменьшают в композиции. В некоторых аспектах, устранение включает обращение взаимодействия связывания между рецептор-связывающим средством и молекулой CD28, которое дополнительно включает промывание клеток для того, чтобы удалять или уменьшать рецептор-связывающее средство в композиции.

[0063] В некоторых аспектах, во время по меньшей мере части инкубации и/или после инкубации, T-клетки в композиции инкубируют в присутствии средства, которое специфически связывает молекулу комплекса TCR/CD3, в соответствии с чем ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал индуцируют или модулируют в клетках.

[0064] В настоящем описании в некоторых аспектах предоставлен способ культивирования T-клеток, включает инкубацию композиции, содержащей T-клетки, в присутствии рецептор-связывающего средства. В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство обратимо связывают с реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с рецептор-связывающим средством. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию с молекулой на поверхности T-клеток, отличной от CD28 или CD3, таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в T-клетках, тем самым создавая культивируемые T-клетки.

[0065] В некоторых аспектах, инкубацию осуществляют в условиях, в которых рецептор-связывающее средство специфически связывается с молекулой, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в T-клетках. В некоторых вариантах осуществления сигнал не представляет собой ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.

[0066] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1. в некоторых таких вариантах осуществления, множество сайтов связывания реактива включает два или больше сайтов связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 для того, чтобы формировать обратимую связь между рецептор-связывающим средством и реактивом.

[0067] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство представляет собой второе рецептор-связывающее средство и молекула представляет собой вторую молекулу. В некоторых таких вариантах осуществления, инкубацию дополнительно осуществляют в присутствии первого рецептор-связывающего средства, которое способно к специфическому связыванию с первой молекулой на поверхности одной или нескольких T-клеток, эта первая молекула способна к индукции или модулированию первого сигнала в одной или нескольких T-клетках в композиции. В некоторых аспектах, первое рецептор-связывающее средство обратимо связывают с реактивом, и реактив содержит множество сайтов связывания для первого рецептор-связывающего средства и второго рецептор-связывающего средства. В некоторых случаях, первое рецептор-связывающее средство обратимо связывают со вторым реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с первым рецептор-связывающим средством.

[0068] В некоторых вариантах осуществления первое рецептор-связывающее средство способно к инициации ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала в T-клетках. В некоторых аспектах, первое рецептор-связывающее средство специфически связывается с элементом комплекса TCR/CD3. В некоторых случаях, первое рецептор-связывающее средство специфически связывается с CD3.

[0069] В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание второго рецептор-связывающего средства со второй молекулой способно усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу. В некоторых случаях, специфическое связывание второго рецептор-связывающего средства со второй молекулой способно усиливать или потенцировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.

[0070] В настоящем описании в некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ культивирования T-клеток, этот способ включает инкубацию композиции, содержащей T-клетки, в присутствии первого рецептор-связывающего средства, которое обратимо связывают с реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с первым рецептор-связывающим средством. В некоторых случаях, первое рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию с первой молекулой на поверхности T-клеток, например, чтобы индуцировать или модулировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал в T-клетках в композиции. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию композиции, содержащей T-клетки, в присутствии второго рецептор-связывающего средства, которое можно обратимо связывать с реактивом, дополнительно содержащим множество сайтов связывания для второго рецептор-связывающего средства, или со вторым реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию со вторым рецептор-связывающим средством. В некоторых аспектах, второе рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию со второй молекулой на поверхности T-клеток, например, чтобы индуцировать или модулировать второй сигнал в T-клетках в композиции. В некоторых аспектах, вторая молекула отлична от CD28. В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в условиях, в которых сигнал и/или второй сигнал индуцируют или модулируют в T-клетках в композиции, тем самым создавая культивируемые T-клетки.

[0071] В некоторых вариантах осуществления первое рецептор-связывающее средство специфически связывается с элементом комплекса TCR/CD3 и/или первое рецептор-связывающее средство специфически связывается с CD3. В некоторых случаях, специфическое связывание второго рецептор-связывающего средства со второй молекулой способно к индукции или модулированию сигнала, отличного от ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала. В некоторых аспектах, специфическое связывание второго рецептор-связывающего средства со второй молекулой способно усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание второго рецептор-связывающего средства со второй молекулой способно усиливать или потенцировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.

[0072] В некоторых вариантах осуществления молекула, которая может представлять собой вторую молекулу, представляет собой CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137, (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, специфически связывается с CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM. В некоторых вариантах осуществления молекула, которая может представлять собой вторую молекулу, не представляет собой CD137, и/или рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, не связывается специфически с CD137.

[0073] В некоторых аспектах, первое рецептор-связывающее средство и второе рецептор-связывающее средство обратимо связываются с реактивом. В некоторых вариантах осуществления каждое из первого рецептор-связывающего средства и второго рецептор-связывающего средства индивидуально содержит партнер связывания C1, и множество сайтов связывания включает два или больше сайтом связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 для того, чтобы формировать обратимую связь между первым и вторым рецептор-связывающим средством и реактивом. В других вариантах осуществления первое рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1, второе рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C2, и множество сайтов связывания включает два или больше сайтов связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 и партнером связывания C2 для того, чтобы формировать обратимую связь между первым и вторым рецептор-связывающим средством и реактивом. В других дополнительных вариантах осуществления, первое рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1, второе рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C2 и множество сайтов связывания включает два или больше сайтов связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 для того, чтобы формировать обратимую связь между первым рецептор-связывающим средством и реактивом, и два или больше сайтов связывания, Z2, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C2 для того, чтобы формировать обратимую связь между вторым рецептор-связывающим средством и реактивом.

[0074] В настоящем описании в некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ культивирования клеток-мишеней, этот способ включает инкубацию композиции, содержащей клетки-мишени, в присутствии рецептор-связывающего средства. Рецептор-связывающее средство можно обратимо связывать с реактивом, который представляет собой аналог или мутеин стрептавидина, содержащий множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с рецептор-связывающим средством. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клеток-мишеней, например, чтобы индуцировать или модулировать сигнал в клетках-мишенях в композиции. В некоторых аспектах, мутеин стрептавидина имеет суммарный отрицательный заряд.

[0075] В настоящем описании в некоторых аспектах предоставлен способ культивирования клеток-мишеней, способ включает инкубацию композиции, содержащей клетки-мишени, в присутствии рецептор-связывающего средства, которое обратимо связывают с реактивом, который представляет собой аналог или мутеин стрептавидина, содержащий множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с рецептор-связывающим средством. В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клеток-мишеней таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в клетках-мишенях в композиции. В некоторых случаях, аналог или мутеин стрептавидина демонстрирует более высокую аффинность к стрептавидин-связывающему пептиду, содержащему последовательность аминокислот Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), чем стрептавидин или мутеин, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID №№ 1-6, тем самым создавая культивируемые клетки-мишени.

[0076] В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в условиях, в которых рецептор-связывающее средство специфически связывается с молекулой, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в одной или нескольких клетках-мишенях в композиции.

[0077] В некоторых случаях, множество сайтов связывания реактива включает два или больше сайтов связывания, Z1. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1, который способен к обратимому связыванию с сайтом связывания Z1, где обратимое связывание между C1 и Z1 затрагивает обратимое связывание между рецептор-связывающим средством и реактивом. В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина содержит множество сайтов связывания Z1, и множество рецептор-связывающих средств обратимо связывают с реактивом.

[0078] В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени включают клетки крови, лейкоциты, лимфоциты, B-клетки, популяцию B-клеток, T-клетки, популяцию T-клеток и/или естественные киллерные (NK) клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени включают антиген-специфические T-клетки или их популяцию, T-хелперные клетки или их популяцию, цитотоксические T-клетки или их популяцию, T-клетки памяти или их популяцию, регуляторные T-клетки или их популяцию, NK клетки или их популяцию, антиген-специфические B-клетки или их популяцию, B-клетки памяти или их популяцию, или регуляторные B-клетки или их популяцию. В некоторых аспектах, клетки-мишени представляют собой T-клетки.

[0079] В некоторых вариантах осуществления молекула присутствует на поверхности T-клеток, и рецептор-связывающее средство способно к индукции или модулированию сигнала в T-клетках в композиции. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство способно к инициации ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала в T-клетках и/или рецептор-связывающее средство специфически связывается с элементом комплекса TCR/CD3. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство специфически связывается с CD3. В некоторых случаях, молекула представляет собой первую молекулу и рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию с первой молекулой и, в некоторых случаях, второй молекулой на поверхности одной или нескольких клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления связывание со второй молекулой способно усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу.

[0080] В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство представляет собой первое рецептор-связывающее средство и инкубацию дополнительно осуществляют в присутствии второго рецептор-связывающего средства. Второе рецептор-связывающее средство может быть способно к специфическому связыванию со второй молекулой на поверхности одной или нескольких клеток-мишеней. В некоторых случаях, связывание второго рецептор-связывающего средства со второй молекулой способно к индукции или модулированию сигнала для того, чтобы усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу.

[0081] В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в условиях, в которых второе рецептор-связывающее средство специфически связывается со второй молекулой, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в клетках-мишенях в композиции для того, чтобы усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу. В некоторых вариантах осуществления мутеин или аналог стрептавидина содержит множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию со вторым рецептор-связывающим средством, в соответствии с чем второе рецептор-связывающее средство обратимо связывают с мутеином или аналогом стрептавидина.

[0082] В некоторых вариантах осуществления второе рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1 или C2, который способен к обратимому связыванию с двумя или больше сайтами связывания Z2, присутствующими в аналоге или мутеине стрептавидина.

[0083] В некоторых случаях, дополнительная молекула представляет собой CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM. В некоторых вариантах осуществления второе рецептор-связывающее средство специфически связывается с CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM. В некоторых аспектах, дополнительная молекула представляет собой CD40 и CD137. В некоторых случаях, второе рецептор-связывающее средство специфически связывается с CD40 или CD137.

[0084] В некоторых вариантах, второе рецептор-связывающее средство включает множество различных рецептор-связывающих средств, каждое из которых способно к индивидуальному связыванию с той же или другой второй молекулой на поверхности T-клеток в композиции для того, чтобы избирательно индуцировать или модулировать один или несколько сигналов в клетках.

[0085] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает разрушение обратимого связывания между первым и/или вторым рецептор-связывающим средством и реактивом. В некоторых аспектах, разрушение осуществляют в пределах 14 суток после инициации инкубации, в пределах 12 суток после инициации инкубации, в пределах 10 суток после инициации инкубации в пределах 8 суток после инициации инкубации или в пределах 6 суток после инициации инкубации.

[0086] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть инкубации осуществляют в присутствии дополнительного средства, которое способно доставлять сигнал в T-клетки. В некоторых случаях, дополнительное средство способно усиливать или индуцировать пролиферацию T-клеток, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток. В некоторых вариантах осуществления дополнительное средство представляет собой цитокин, такой как IL-2, IL-15 или IL-7. В некоторых случаях, дополнительное средство не связывается специфически с CD28 и/или индуцирует передачу сигнала CD28.

[0087] В некоторых вариантах осуществления T-клетки или клетки-мишени представляют собой эмбриональные клетки от субъекта. В некоторых случаях, T-клетки или клетки-мишени выделяют непосредственно у субъекта. В некоторых вариантах осуществления T-клетки представляют собой не фракционированные T-клетки, представляют собой обогащенные или выделенные CD3+ T-клетки, представляют собой обогащенные или выделенные CD4+ T-клетки или представляют собой обогащенные или выделенные CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления перед инкубацией T-клетки не обогащают по CD62L+ клеткам и/или не обогащают по наивным T-клеткам. В некоторых случаях, T-клетки или клетки-мишени представляют собой клетки человека.

[0088] В некоторых вариантах осуществления реактив не связывают с основой или твердым носителем во время указанной инкубации. В других вариантах осуществления реактив связывают с основой во время по меньшей мере части инкубации, в соответствии с чем множество T-клеток или клеток-мишеней обратимо иммобилизуют на основе во время по меньшей мере части инкубации. В некоторых таких вариантах осуществления, основа представляет собой твердый носитель или стационарную фазу.

[0089] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство, содержит только один сайт связывания, такой как B2. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство, специфически связывается с молекулой одновалентным образом. В некоторых вариантах осуществления второе рецептор-связывающее средство содержит только один сайт связывания, такой как B4. В некоторых случаях, второе рецептор-связывающее средство специфически связывается с молекулой одновалентным образом. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания, такой как B2 или B4, содержит связывающий участок антитела.

[0090] В некоторых аспектах, каждое рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство и/или второе рецептор-связывающее средство, индивидуально представляет собой фрагмент антитела, одновалентный фрагмент антитела, белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, молекулу, содержащую домены Ig, цитокин, хемокин, аптамер или молекулу MHC или их связывающие фрагменты. В некоторых таких аспектах, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство и/или второе рецептор-связывающее средство, включает фрагмент антитела, Fab-фрагмент, двухвалентный фрагмент антитела, такой как (Fab)₂'-фрагмент или двухвалентный одноцепочечный Fv (scFv) фрагмент. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство и/или второе рецептор-связывающее средство, представляет собой одновалентный фрагмент антитела, такой как Fab-фрагмент, Fv-фрагмент или scFv-фрагмент. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство и/или второе рецептор-связывающее средство, представляет собой белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, такую как аптамер, мутеин, основанный на полипептиде семейства липокалина, глутело, белок, основанный на анкириновом каркасе, белок, основанный на кристаллиновом каркасе, аднектин или авимер.

[0091] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство, включает средство, которое специфически связывается с CD3. Средство, которое специфически связывает CD3, может представлять собой антитело против CD3, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD3, одновалентный фрагмент антитела из антитела против CD3 или белковую CD3-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления второе рецептор-связывающее средство включает средство, которое специфически связывается с CD28, CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, OX40 и/или HVEM. Средство, которое специфически связывается с CD28, CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, OX40 и/или HVEM, может представлять собой антитело против CD28, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD28, фрагмент антитела из антитела против CD28, белковую CD28-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD90, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD90, фрагмент антитела из антитела против CD90, белковую CD90-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD95, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD95, фрагмент антитела из антитела против CD95, белковую CD95-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD154, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD154, одновалентный фрагмент антитела из антитела против CD154, белковую CD154-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD137, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD137, одновалентный фрагмент антитела из антитела против CD137, белковую CD137-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против ICOS, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против ICOS, фрагмент антитела из антитела против ICOS, белковую ICOS-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против LAT, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против LAT, фрагмент антитела из антитела против LAT, белковую LAT-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD27, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD27, фрагмент антитела из антитела против CD27, белковую CD27-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против OX40, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против OX40, фрагмент антитела из антитела против OX40, белковую OX40-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против HVEM, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против HVEM, фрагмент антитела из антитела против HVEM, белковую HVEM-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, лиганд 4-1BB или любую их смесь.

[0092] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой или содержит стрептавидин, авидин, аналог или мутеин стрептавидина, который обратимо связывает биотин, аналог биотина или его биологически активный фрагмент; аналог или мутеин авидина или стрептавидина, который обратимо связывает стрептавидин-связывающий пептид; реактив, который содержит по меньшей мере две хелатирующие группы K, где по меньшей мере две хелатирующие группы способны к связыванию с ионом переходного металла; средство, способное к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой; средство, способное к связыванию с глутатион-S-трансферазой; кальмодулин или его аналог; средство, способное к связыванию с кальмодулин-связывающим пептидом (CBP); средство, способное к связыванию с FLAG-пептидом; средство, способное к связыванию с HA-меткой; средство, способное к связыванию с мальтоза-связывающим белком (MBP); средство, способное к связыванию с эпитопом HSV; средство, способное к связыванию с эпитопом myc; или средство, способное к связыванию с биотинилированным белком-переносчиком.

[0093] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой или содержит аналог или мутеин стрептавидина или аналог или мутеин авидина, который обратимо связывается с биотином или биологически активным фрагментом; аналог или мутеин стрептавидина или аналог или мутеин авидина, который обратимо связывается с аналогом биотина или биологически активным фрагментом; и/или аналог или мутеин стрептавидина или аналог или мутеин авидина, который обратимо связывается со стрептавидин-связывающим пептидом.

[0094] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога или мутеина стрептавидина, который обратимо связывает биотин или биологически активный фрагмент; стрептавидин или аналог или мутеин авидина, который обратимо связывает стрептавидин-связывающий пептид; реактив, который содержит по меньшей мере две хелатирующие группы K, где по меньшей мере две хелатирующие группы способны к связыванию с ионом переходного металла; средство, способное к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой; средство, способное к связыванию с глутатион-S-трансферазой; кальмодулин или его аналог; средство, способное к связыванию с кальмодулин-связывающим пептидом (CBP); средство, способное к связыванию с FLAG-пептидом; средство, способное к связыванию с HA-меткой; средство, способное к связыванию с мальтоза-связывающим белком (MBP); средство, способное к связыванию с эпитопом HSV; средство, способное к связыванию с эпитопом myc; или средство, способное к связыванию с биотинилированным белком-переносчиком.

[0095] В некоторых вариантах осуществления реактив включает олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога или мутеина стрептавидина или и аналога или мутеина авидина. В некоторых аспектах, индивидуальные молекулы олигомера или полимера сшивают с помощью полисахарида или бифункционального линкера.

[0096] В некоторых вариантах осуществления множество сайтов связывания Z включает по меньшей мере 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 72 или больше сайтов связывания.

[0097] В некоторых аспектах, стрептавидин-связывающий пептид представляет собой Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 18) или Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 19).

[0098] В некоторых вариантах осуществления реактив содержит аналог или мутеин стрептавидина, содержащий аминокислотную последовательность Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ или lle⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 относительно положений в стрептавидине в последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID № 1. В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина содержит аминокислотную последовательность Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 относительно положений в стрептавидине в последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID № 1.

[0099] В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID №№ 3-6. В некоторых аспектах, аналог или мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с любой из SEQ ID №№ 3-6 и содержит аминокислотную последовательность, соответствующую Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ или lle⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷. В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина обратимо связывается с биотином или его биологически активной формой, аналогом или мутеином биотина или его биологически активным фрагментом или стрептавидин-связывающим пептидом. В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина связывает функциональный фрагмент любой из указанных выше последовательностей, который обратимо связывается с биотином или его биологически активной формой, аналогом или мутеином биотина или его биологически активным фрагментом или стрептавидин-связывающим пептидом.

[0100] В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина дополнительно содержит замену или замены аминокислот в положении, соответствующем 117, 120 и/или 121 относительно положений в стрептавидине в последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID № 1. В некоторых вариантах осуществления замену или замены аминокислот выбирают из Glu¹¹⁷, Asp¹¹⁷, Arg¹¹⁷, Ser¹²⁰, Ala¹²⁰, Gly¹²⁰, Trp¹²¹, Tyr¹²¹ или Phe¹²¹. В некоторых вариантах осуществления замена или замены аминокислот представляют собой Glu¹¹⁷, Gly¹²⁰ или Tyr¹²¹.

[0101] В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID № 27 или 28. В некоторых аспектах, аналог или мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с SEQ ID №№ 28 и содержит аминокислотную последовательность, соответствующую Va1⁴⁴, Thr⁴⁵, Ala⁴⁶, Arg⁴⁷, Glu¹¹⁷, Gly¹²⁰ и Tyr¹²¹. В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина обратимо связывается с биотином или биологически активным фрагментом, аналогом или мутеином биотина или его биологически активным фрагментом или стрептавидин-связывающим пептидом. В некоторых вариантах осуществления аналог или мутеин стрептавидина обратимо связывает функциональный фрагмент любой из указанных выше последовательностей, который обратимо связывается с биотином или биологически активным фрагментом, аналогом или мутеином биотина или его биологически активным фрагментом или стрептавидин-связывающим пептидом.

[0102] В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C1 и/или партнер связывания C2, независимо, содержит стрептавидин-связывающий пептид, такой как Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 18) или Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 19);

[0103] В некоторых вариантах осуществления разрушение включает введение в клетки композиции, содержащей вещество, способное к обращению связи между рецептор-связывающим средством, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство и/или второе рецептор-связывающее средство, и реактивом. В некоторых вариантах осуществления вещество представляет собой свободный партнер связывания и/или представляет собой конкурентное средство. В некоторых вариантах осуществления вещество в композиции не является вредоносным для T-клеток или для клеток-мишеней. В некоторых аспектах, добавление вещества не снижает процентную долю выживающих T-клеток или клеток-мишеней до меньше чем 90%, 80%, 70%, 60% или 50%, по сравнению с инкубацией T-клеток или клеток-мишеней, соответственно, при сравнимых или тех же условиях, без вещества. В некоторых вариантах осуществления разрушение завершает или уменьшает сигнал, индуцированный или модицифированный одним или обоими из рецептор-связывающего средства или второго рецептор-связывающего средства в T-клетках или клетках-мишенях.

[0104] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой или содержит стрептавидин, авидин, аналог или мутеин стрептавидина или и аналог или мутеин авидина или их биологически активные фрагменты. В некоторых вариантах осуществления вещество содержит стрептавидин-связывающий пептид, биотин или биологически активный фрагмент, необязательно D-биотин, или аналог биотина или биологически активный фрагмент.

[0105] В некоторых вариантах осуществления вещество представляет собой стрептавидин-связывающий пептид, такой как Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID № 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 18) или Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 19). В некоторых вариантах осуществления вещество представляет собой C1 или его аналог или представляет собой C2 или его аналог.

[0106] В некоторых вариантах осуществления константа диссоциации (K_D) для обратимого связывания между сайтом связывания Z1 и партнером связывания C1 и/или для обратимого связывания между сайтом связывания Z2 и партнером связывания C2 находится в диапазоне от 10^-2 M до 10^-13 M.

[0107] В некоторых вариантах осуществления перед инкубацией клетки приводят в контакт со средством отбора, которое специфически связывается с маркером, который содержат T-клетки или клетки-мишени композиции, тем самым создавая или получая композицию, содержащую T-клетки или клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть инкубации осуществляют в присутствии средства отбора, которое специфически связывается с маркером, который содержат T-клетки или клетки-мишени композиции, и культивируемые T-клетки обогащают по T-клеткам или клеткам-мишеням, содержащим маркер.

[0108] В некоторых вариантах осуществления средство отбора обратимо связывают с реактивом, и реактив дополнительно содержит множество сайтов связывания, способных к специфическому связыванию средства отбора. В некоторых аспектах, средство отбора обратимо связывают со вторым реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к специфическому связыванию со средством отбора.

[0109] В некоторых вариантах осуществления индукция или модуляция сигнала вызывает увеличение размножения (пролиферации) и/или активации культивируемых T-клеток по сравнению с инкубацией T-клеток в отсутствие индукции или модуляции сигнала. В некоторых вариантах осуществления увеличение составляет по меньшей мере 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше. В некоторых вариантах осуществления индукция или модуляция дополнительного или второго сигнала увеличивает размножение (пролиферацию) и/или активацию T-клеток по сравнению с инкубацией T-клеток в отсутствие индукции или модуляции дополнительного или второго сигнала. В некоторых вариантах осуществления увеличение составляет по меньшей мере 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше.

[0110] В некоторых вариантах осуществления способы увеличивают размножение и/или пролиферацию и/или выживаемость и/или дифференцировку T-клеток или их конкретных подмножеств в композиции, например, в выходной композиции, создаваемой способами, изменяют метаболический профиль таких T-клеток или подмножеств в композиции, изменяют подмножество CD8+ T-клеток в композиции; и/или увеличивают процентную долю долгоживущих T-клеток памяти в композиции. В некоторых вариантах осуществления такое увеличение возникает по сравнению с начальной композицией, например, с клетками перед инкубацией. В некоторых аспектах, оно возникает по сравнению со схожей стимуляцией, осуществляемой в условиях, которые отличаются некоторым конкретным образом, таких как те, которые в остальном аналогичны, но в которых связывание не разрушают до конца инкубации (например, без контроля по времени), и/или те, которые в остальном аналогичны, но в которых используют другую комбинацию стимулирующих средств, такие как те, в которых костимулирующее средство имеет место среди мультимеризованных средств и отличается от одной или нескольких или любой костимулирующей молекулы, используемой в рассматриваемом стимулирующем средстве. Например, где рассматриваемое стимулирующее средство включает костимулирующее средство, отличное от CD28-связывающей молекулы, сравнительный или аналогичный набор условий может представлять собой тот, который включает инкубацию со стимулирующим средством или реактивом, который содержит средство, которое специфически связывает CD28 и/или индуцирует или модулирует передачу сигнала CD28, и необязательно содержит другое средство наряду с рассматриваемым реактивом, например, средство против CD3.

[0111] В некоторых вариантах осуществления способы ведут к культивируемым T-клеткам, где число или процентную долю CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток или CD8+ клеток увеличивают по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз по сравнению с числом или процентной долей CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток или CD8+ T-клеток, соответственно, в композиции перед инкубацией, после инкубации, но в отсутствие разрушения, или после инкубации в аналогичных или сравнительных условиях, но выполняемой в присутствии средства, которое специфически связывает CD28 и/или индуцирует или модулирует передачу сигнала CD28.

[0112] В некоторых вариантах осуществления способы ведут к культивируемым T-клеткам, в которых долю CD8+ T-клеток или относительную или нормализованную долю CD8+ T-клеток в композиции увеличивают по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз по сравнению с долей или относительной или нормализованной долей CD8+ T-клеток в композиции перед инкубацией, после инкубации, но в отсутствие разрушения, или после аналогичной или сравнительной инкубации, например, в присутствии средства, которое специфически связывает CD28 и/или индуцирует или модулирует передачу сигнала CD28.

[0113] В некоторых вариантах осуществления способы ведут к более высокому числу или относительному числу (например, доле) клеток, имеющих конкретный фенотип, таким как клетки, проявляющие свойства популяции более долгоживущих и/или менее дифференцированных клеток, такой как популяции долгоживущих клеток памяти или стволоподобные популяции, такие как те, которые экспрессируют высокие уровни CD62L, CD127, CCR7, Sca1 и/или CD27, и/или те, которые экспрессируют или содержат индикаторы пролиферации, а также индикаторы наивных или покоящихся фенотипов, такие как любые приведенные выше с фенотипом, который низок по окрашиванию T-bet, и/или представляет собой IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+. В некоторых аспектах, число или процентную долю CD62L+, необязательно долгоживущих T-клеток памяти или стволовых клеток памяти (T_SCM), в композиции увеличивают по меньшей мере 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно или 10-кратно по сравнению с числом или процентной долей соответствующей популяции клеток, любой из CD62L+, долгоживущих T-клеток памяти или T_SCM, в композиции перед инкубацией, после инкубации, но в отсутствие разрушения, или после аналогичной инкубации, но в присутствии средства, которое специфически связывает CD28 и/или индуцирует или модулирует передачу сигнала CD28. В некоторых вариантах осуществления стимуляция создает больше клеток менее дифференцированного более долгоживущего фенотипа, но которые размножены или персистируют так, что создают желаемое число клеток, по сравнению с аналогичными способами или реактивами.

[0114] В некоторых вариантах осуществления культивируемые T-клетки содержат больше чем 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% подмножества T-клеток, которые содержат фенотип, который представляет собой поверхность, положительную по CD62L (CD62L+), в виде процентной доли от всех T-клеток в композиции или всех клеток в композиции.

[0115] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток дополнительно содержит фенотип, включающий CD127+; и/или любое одно или несколько из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любое одно или несколько из t-bet^низк., IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+.

[0116] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет низкий уровень эксцизионных колец реаранжировки TCR (TREC); и/или экспрессирует маркер пролиферации, который может представлять собой Ki-67; и/или демонстрирует способность пролиферировать в присутствии стимулирующего средства; и/или демонстрирует способность продуцировать цитокин, такой как IFN-γ, TNF или IL-2, в присутствии стимулирующего средства.

[0117] В некоторых вариантах осуществления стимулирующее средство представляет собой антиген, гомеостатический цитокин, такой как IL-15 и/или IL-17, или представляет собой средство, которое способно к инициации ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала в T-клетках.

[0118] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток представляет собой или содержит долгоживущие T-клетки памяти. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток представляет собой или содержит стволовые T-клетки памяти (T_SCM).

[0119] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты в T-клетки или клетки-мишени популяции. В некоторых таких аспектах, молекула нуклеиновой кислоты может кодировать рекомбинантный белок, в соответствии с чем клетки экспрессируют рекомбинантный белок. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор или трансгенный T-клеточный рецептор (TCR). В некоторых аспектах, способ осуществляют in vitro или ex vivo.

[0120] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение культивируемых клеток субъекту, имеющему заболевание или состояние.

[0121] В настоящем описании в некоторых аспектах предоставлена композиция, содержащая множество культивируемых T-клеток или клеток-мишеней, получаемых способами, предоставленными в настоящем описании, и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент.

[0122] В некоторых вариантах осуществления после добавления вещества, клетки не инкубируют in vitro или ex vivo при температуре больше чем 30°C в течение больше чем 24 часов, больше чем 48 часов, больше чем 72 часов или больше чем 96 часов.

[0123] В настоящем описании в некоторых аспектах предоставлен обратимый реактив, содержащий реактив, содержащий множество сайтов связывания, способных к связыванию с рецептор-связывающим средством. В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство обратимо связывают с реактивом и оно способно к специфическому связыванию с молекулой на поверхности T-клеток таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в T-клетках, например, в которых молекула не представляет собой CD28 или CD3.

[0124] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула индуцирует или модулирует сигнал в T-клетке, отличный от ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала; и/или связывающая молекула усиливает или потенциирует ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.

[0125] В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM. В некоторых случаях, молекула не представляет собой CD137.

[0126] В некоторых вариантах осуществления реактивы, используемые в способах и композициях, представляют собой те, которые содержат аналог или мутеин стрептавидина, и в целом содержат их олигомеры, где мутеин содержит множество сайтов связывания, способных к связыванию со средством, обычно к обратимому связыванию с таким средством. Также предусмотрены такие реактивы. В некоторых аспектах, аналог или мутеин стрептавидина имеет суммарный отрицательный заряд и/или демонстрирует более высокую аффинность к стрептавидин-связывающему пептиду, содержащему последовательность аминокислот Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), чем стрептавидин или мутеин, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID №№ 1-6. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько средств обратимо связывают с реактивом, и они способны к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клетки. Также предусмотрены такие реактивы, средства и их комплексы.

[0127] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1. В некоторых аспектах, множество сайтов связывания включает два или больше сайтов связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 для того, чтобы формировать обратимую связь между рецептор-связывающим средством или средством и реактивом.

[0128] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство представляет собой второе рецептор-связывающее средство и молекула представляет собой вторую молекулу, и реактив дополнительно содержит: c) множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с первым рецептор-связывающим средством и d) первое рецептор-связывающее средство, которое i) обратимо связывают с реактивом и ii) способно к специфическому связыванию с первой молекулой на поверхности T-клетки.

[0129] В некоторых вариантах осуществления средство или первое рецептор-связывающее средство специфически связывается с элементом комплекса TCR/CD3 и/или первое рецептор-связывающее средство специфически связывается с CD3.

[0130] В некоторых вариантах осуществления каждое из первого рецептор-связывающего средства и второго рецептор-связывающего средства индивидуально содержит партнер связывания C1, и множество сайтов связывания включает два или больше сайтов связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 для того, чтобы формировать обратимую связь между первым и вторым рецептор-связывающим средством и реактивом. В некоторых аспектах, первое рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1, второе рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C2, и множество сайтов связывания включает два или больше сайтов связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 и партнером связывания C2 для того, чтобы формировать обратимую связь между первым и вторым рецептор-связывающим средством и реактивом. В некоторых вариантах осуществления первое рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C1, второе рецептор-связывающее средство содержит партнер связывания C2 и множество сайтов связывания включает два или больше сайтов связывания, Z1, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C1 для того, чтобы формировать обратимую связь между первым рецептор-связывающим средством и реактивом, и два или больше сайтов связывания, Z2, каждый из которых способен к связыванию с партнером связывания C2 для того, чтобы формировать обратимую связь между вторым рецептор-связывающим средством и реактивом.

[0131] В некоторых вариантах осуществления реактив имеет размер, который составляет меньше чем 20 нм, меньше чем 10 нм, меньше чем 5 нм или меньше чем 1 нм. В некоторых вариантах осуществления реактив имеет плотность меньше чем 1,2 г/см³ или меньше чем 1,0 г/см³. В некоторых вариантах осуществления реактив не связывают с основой или твердым носителем. В некоторых случаях реактив связывают или иммобилизуют на основе. В некоторых случаях, основа представляет собой твердый носитель или стационарную фазу. В некоторых аспектах, основа включает бусину, частицу, наночастицу или микросферу.

[0132] В некоторых вариантах осуществления каждое средство, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой первое рецептор-связывающее средство и/или второе рецептор-связывающее средство, индивидуально представляет собой фрагмент антитела, одновалентный фрагмент антитела, белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, молекулу, содержащую домены Ig, или их связывающие фрагменты.

[0133] В некоторых вариантах осуществления средство, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство и/или первое рецептор-связывающее средство, содержит фрагмент антитела. В некоторых аспектах, средство, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство и/или первое рецептор-связывающее, средство содержит Fab-фрагмент. В некоторых случаях, средство, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство и/или первое рецептор-связывающее средство, представляет собой двухвалентный фрагмент антитела, такой как (Fab)₂'-фрагмент или двухвалентный одноцепочечный Fv (scFv) фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство, рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство и/или первое рецептор-связывающее средство, представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и scFv-фрагмента.

[0134] В некоторых вариантах осуществления средство или первое рецептор-связывающее средство включает средство, которое специфически связывается с CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое специфически связывает CD3, представляет собой антитело против CD3, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD3, одновалентный фрагмент антитела из антитела против CD3 или белковую CD3-связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления средство или рецептор-связывающее средство, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, включает средство, которое специфически связывается с CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, OX40 и HVEM, такое как антитело против CD90, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD90, фрагмент антитела из антитела против CD90, белковая CD90-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD95, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD95, фрагмент антитела из антитела против CD95, белковая CD95-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD154, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD154, одновалентный фрагмент антитела из антитела против CD154, белковая CD154-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD137, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD137, одновалентный фрагмент антитела из антитела против CD137, белковая CD137-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против ICOS, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против ICOS, одновалентный фрагмент антитела из антитела против ICOS, белковая ICOS-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против LAT, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против LAT, одновалентный фрагмент антитела из антитела против LAT, белковая LAT-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против CD27, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против CD27, одновалентный фрагмент антитела из антитела против CD27, белковая CD27-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против OX40, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против OX40, одновалентный фрагмент антитела из антитела против OX40, белковая OX40-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами, антитело против HVEM, двухвалентный фрагмент антитела из антитела против HVEM, одновалентный фрагмент антитела из антитела против HVEM, белковая HVEM-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами или любая их смесь.

[0135] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой или содержит стрептавидин, авидин, аналог или мутеин стрептавидина или и аналог или мутеин авидина. В некоторых вариантах осуществления реактив содержит олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога или мутеина стрептавидина или и аналога или мутеина авидина.

[0136] В настоящем описании в некоторых аспектах предоставлен набор, содержащий реактив, раскрытый в настоящем описании, и необязательно инструкции по использованию. В некоторых вариантах осуществления набор содержит вещество, способное к обращению связи между рецептор-связывающим средством и реактивом. В некоторых вариантах осуществления набор содержит реактив, содержащий множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с рецептор-связывающим средством. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство обратимо связывают с реактивом, и оно способно к специфическому связыванию с молекулой, экспрессируемой на поверхности клеток-мишеней. В некоторых случаях, связывание с молекулой индуцирует или модулирует сигнал в клетках-мишенях. В некоторых случаях набор содержит вещество, способное к обращению связи между рецептор-связывающим средством и реактивом.

[0137] В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени представляют собой T-клетки. В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой или содержит стрептавидин, авидин, аналог или мутеин стрептавидина или и аналог или мутеин авидина. В некоторых вариантах осуществления реактив включает олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога или мутеина стрептавидина или и аналога или мутеина авидина.

[0138] В некоторых вариантах осуществления вещество включает стрептавидин-связывающий пептид, биотин или биологически активный фрагмент, необязательно D-биотин, или аналог биотина или биологически активный фрагмент.

[0139] В некоторых вариантах осуществления реактив имеет размер, который составляет меньше чем 20 нм, меньше чем 10 нм, меньше чем 5 нм или меньше чем 1 нм. В некоторых вариантах осуществления реактив имеет плотность меньше чем 1,2 г/см³ или меньше чем 1,0 г/см³. В некоторых вариантах осуществления реактив не связывают с основой или твердым носителем.

[0140] В настоящем описании в некоторых аспектах предоставлена композиция, содержащая множество T-клеток, генетически сконструированных для того, чтобы экспрессировать рекомбинантный рецептор, который специфически связывается с антигеном-мишенью. В некоторых случаях, больше чем 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% клеток включают подмножество T-клеток, содержащих фенотип поверхности, который представляет собой CD3+, CD4+ или CD8+ и CD62L+ и одно или несколько из CD127+, CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и одно или несколько из t-bet^низк., IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+, в качестве процентной доли всех T-клеток в композиции или всех клеток в композиции. В некоторых вариантах осуществления до или во время генетической инженерии множество T-клеток, содержащее подмножество T-клеток, не инкубируют в присутствии ингибитора GSK-P; не инкубируют в присутствии рекомбинантного гомеостатического цитокина, необязательно IL-7 или IL-15; или не обогащают по CD62L+ клеткам. В некоторых вариантах осуществления композиция не содержит ингибитор GSK-P или рекомбинантный гомеостатический цитокин, необязательно IL-7 или IL-15.

[0141] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток содержит по меньшей мере 5×10⁶, по меньшей мере 1×10⁶ или по меньшей мере 2×10⁶ клеток.

[0142] В настоящем описании в некоторых вариантах осуществления предусмотрена композиция, содержащая множество T-клеток, генетически сконструированных для того, чтобы экспрессировать рекомбинантный рецептор, который специфически связывается с антигеном-мишенью. В некоторых аспектах, генетически сконструированные T-клетки получают трансдукцией популяции T-клеток, содержащей подмножество T-клеток, имеющих фенотип поверхности, который представляет собой CD3+, CD4+ или CD8+ и CD62L+ и одно или несколько из CD127+, CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и одно или несколько из t-bet^низк., IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток присутствует в большей процентной доле от всех T-клеток в популяции или большем числе от всех T-клеток в популяции по сравнению с популяцией, содержащей эмбриональные T-клетки, которые выделяли или обогащали у субъекта-человека на основании поверхностной экспрессии одного или маркеров, содержащих фенотип. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток присутствует в большей процентной доле от всех T-клеток в популяции или большем числе от всех T-клеток в популяции по сравнению с популяцией T-клеток, которую инкубировали в присутствии ингибитора GSK-P. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток присутствует в большей процентной доле от всех T-клеток в популяции или большем числе от всех T-клеток в популяции по сравнению с популяцией T-клеток, которую инкубировали в присутствии рекомбинантного гомеостатического цитокина, необязательно IL-7 или IL-15. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток присутствует в большей процентной доле от всех T-клеток в популяции или большем числе от всех T-клеток в популяции по сравнению с популяцией T-клеток, которую стимулировали средством против CD3 и против CD8, но в которой стимуляция или активация протекала больше чем 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток или 5 суток и/или стимуляцию не прерывали в присутствии биотина или аналога биотина.

[0143] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток присутствует в популяции в или приблизительно больше чем 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% в качестве процентной доли от всех T-клеток в популяции. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток включает по меньшей мере 5×10⁶ клеток, 1×10⁶ клеток, 2×10⁶ клеток или больше.

[0144] В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

[0145] В настоящем описании в некоторых аспектах предоставлен способ лечения, включающий введение субъекту, имеющему заболевание или состояние, композиции, например, фармацевтической композиции, как раскрыто в настоящем описании.

[0146] В некоторых вариантах осуществления клетки содержат рекомбинантный рецептор, такой как химерный антигенный рецептор (CAR) или TCR. В некоторых аспектах, рекомбинантный рецептор, такой как CAR или трансгенный TCR, специфически связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или состоянием.

[0147] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой злокачественную опухоль и аутоиммунное заболевание или нарушение или инфекционное заболевание.

Краткое описание фигур

[0148] На фиг. 1A-E приведены схематические представления образцовых вариантов осуществления.

[0149] На фиг. 1A приведено схематическое представление реактива (или его репрезентативной части) с множеством сайтов связывания для обратимого связывания со средствами. В этом случае, реактив показан способным к обратимому связыванию с двумя средствами, каждое из которых способно к специфическому связыванию с молекулой на клетке. Реактив имеет множество сайтов связывания, в том числе множество сайтов связывания, Z1, каждый способен к обратимому связыванию со средствами. Каждое из первого и второго средств, которые, в некоторых случаях, могут представлять собой одно и то же, в приведенном схематическом представлении содержит по меньшей мере один партнер связывания C1. Партнер связывания C1 обратимо связывается с сайтом связывания Z1. Каждое из первого и второго средства также содержит сайт связывания, B2, который может специфически связываться с молекулой на поверхности клетки, которая, в некоторых случаях, может быть на той же клетке. Здесь, первое и второе средства показаны специфически связывающимися с молекулами на одной и той же клетке.

[0150] На фиг. 1B приведено схематическое представление реактива с множеством сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с первым и вторым средством, каждое из этих средств способно к специфическому связыванию с молекулой на первой и второй клетке, соответственно. Реактив имеет множество сайтов связывания Z1, каждый способен к обратимому связыванию со средством. Каждое из первого и второго средств, которые, в некоторых случаях, могут представлять собой одно и то же, содержит партнер связывания C1, который обратимо связывается с сайтом связывания Z1. Каждый из первого и второго средства содержит сайт связывания B2, который может специфически связываться с молекулой на поверхности клетки, которая, в некоторых случаях, может быть на одной и той же клетке или другой клетке. Здесь, первое средство связывают с молекулой на поверхности первой клетки и второе средство связывают с молекулой на поверхности второй клетки.

[0151] На фиг. 1C представлен реактив, способный к обратимому связыванию с первым и вторым средствами, каждое из этих средств способно к специфическому связыванию с молекулой на первой и второй клетке, соответственно. Реактив имеет множество сайтов связывания Z1 и Z2, которые могут представлять собой одно и то же или различное, каждый способен к обратимому связыванию с одним или обоими средствами. Первое средство содержит партнер связывания C1, который обратимо связывается с Z1; второе средство содержит партнер связывания C2, который может обратимо связываться с Z2. В некоторых случаях, C1 и C2 различны. В некоторых случаях, C1 и C2 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же. Первое средство содержит сайт связывания B1, которое может специфически связываться с молекулой на поверхности клетки, и второе средство содержит по меньшей мере один сайт связывания B3, который может специфически связываться с молекулой на поверхности клетки. Сайты связывания B1 и B3 в некоторых случаях связываются с двумя различными молекулами клеточной поверхности, или различными эпитопами на одной молекуле, или одними и теми же или различными молекулами на поверхности различных клеток. Здесь, первое средство показано связанным, через B1, с молекулой на поверхности первой клетки, и второе средство связывают с молекулой на поверхности второй клетки.

[0152] На фиг. 1D представлен реактив, способный к обратимому связыванию с первым и вторым средством, такими как средства отбора, каждое из которых способно к специфическому связыванию с молекулой на клетке. Реактив имеет множество сайтов связывания, в том числе Z1 и Z2, которые могут представлять собой одно и то же или различное, каждый способен к обратимому связыванию со средством. Первое средство содержит партнер связывания C1, который может специфически связываться с сайтом связывания Z1, и второе средство содержит по меньшей мере один партнер связывания C2, который может специфически связываться с сайтом связывания Z2. В некоторых случаях, C1 и C2 различны. В некоторых случаях, C1 и C2 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же. Первое средство содержит сайт связывания B1, который может специфически связываться с молекулой на поверхности клетки, и второе средство содержит сайт связывания B3, который может специфически связываться с молекулой на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления первое средство и второе средство может представлять собой средство отбора. Сайты связывания B1 и B3 могут связывать одни и те же или различные молекулы (например, рецептор) на поверхности клетки, одни и те же или различные эпитопы на молекуле, или одни и те же или различные молекулы на поверхности различных клеток. Здесь, первое средство связывают с первой молекулой на поверхности клетки и второе средство связывают со второй молекулой на поверхности той же клетки.

[0153] На фиг. 1E представлен реактив, обратимо связанный с первым и вторым средством, каждое из этих средств способно к специфическому связыванию с молекулой на клетке. Реактив имеет множество сайтов связывания, в том числе Z1 и Z2, которые могут представлять собой одно и то же или различное, каждый способен к обратимому связыванию со средством. Первое средство содержит партнер связывания C1, который может обратимо связываться с Z1 реактива, и второе средство содержит партнер связывания C2, который может обратимо связываться с Z2. В некоторых случаях, C1 и C2 различны. В некоторых случаях, C1 и C2 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же. Первое средство содержит по меньшей мере один сайт связывания B2, который может специфически связываться с молекулой на поверхности клетки, и второе средство содержит по меньшей мере один сайт связывания B4, который может специфически связываться с молекулой на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления первое средство и второе средство могут представлять собой стимулирующие средства. Сайты связывания B2 и B4 могут связывать одни и те же или различные молекулы на поверхности клетки, одни и те же или различные эпитопы на молекуле или одни и те же или различные молекулы на поверхности различных клеток. Здесь, первое средство связывают с первой молекулой на поверхности клетки и второе средство связывают со второй молекулой на поверхности той же клетки.

[0154] На фиг. 2A-E приведены схематические представления образцовых вариантов осуществления, как показано на фиг. 1A-E, соответственно, за исключением того, что изображенные реактивы показаны иммобилизованными на основе, такой как стационарная фаза.

[0155] На фиг. 3 приведено схематическое представление образцовых вариантов осуществления, в которых олигомерные реактивы используют для того, чтобы мультимеризовать стимулирующие средства, и получаемые комплексы инкубируют с клетками для того, чтобы доставлять сигналы к клеткам, после чего следует обращение связывания. В части A показан олигомерный реактив 1, который показан не связанным с какой-либо основой и гибким. Стимулирующие средства 2, которые представлены здесь в виде Fab-фрагментов и способны к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клетки, объединяют с реактивом. Средства содержат партнер связывания (например, партнер связывания C), который способен к обратимому связыванию с сайтом связывания (например, сайтом связывания Z) на реактиве, мультимеризующем средства. В части B показан партнер связывания, обратимо связывающийся с сайтом связывания на реактиве. Клетки 3 добавляют в систему. В части C показаны мультимеризованные средства (Fab-фрагменты), специфически связывающиеся с молекулами 4 на поверхности клетки 3. В части C изображенные средства представляют собой стимулирующие рецептор-связывающие средства, (например, первое рецептор-связывающее средство и/или второе рецептор-связывающее средство), которые могут индуцировать или модулировать сигнал в клетке при связывании средства, с молекулой на клетке. Как показано в части D, в композицию добавляют вещество 5, такое как конкурентный реактив (например, биотин), который может представлять собой вещество, которое проявляет более высокую аффинность связывания к сайту связывания на реактиве, чем к партнеру связывания на средстве, тем самым разрушая обратимое связывание между реактивом 1 и средством 2. В некоторых случаях, средство, например, Fab-фрагмент, также может диссоциировать из его взаимодействия с молекулой 4 на клетке 3. В некоторых случаях, это может разрушать, уменьшать и/или прерывать передачу сигнала в клетке.

[0156] На фиг. 4 приведено схематическое представление образцовых вариантов осуществления обратимой системы, прикрепленной к основе, такой как твердый носитель или поверхность, в том числе стационарная фаза. В части A показана основа 6, содержащая реактив 1. Средства 2, такие как Fab-фрагменты, способные к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клетки, добавляют в систему. Средства 2, такие как Fab-фрагменты, содержат партнер связывания (например, партнер связывания C), который способен к обратимому связыванию с сайтом связывания (например, сайтом связывания Z) на реактиве. В части B показан партнер связывания, обратимо связывающийся с сайтом связывания на реактиве. Клетки 3 добавляют в систему. В части C показаны средства 2, например, Fab-фрагменты, связывающиеся с молекулами 4 на поверхности клетки 3. В некоторых вариантах осуществления scFv содержат рецептор-связывающее средство или средство отбора. В некоторых вариантах осуществления средства, например, Fab-фрагменты, могут представлять собой рецептор-связывающее средство или средство отбора. В части C показано образцовое рецептор-связывающее средство или средства (например, первое рецептор-связывающее средство и/или второе рецептор-связывающее средство), которые могут индуцировать или модулировать сигнал в клетке при связывании средства, например, Fab-фрагмента, с молекулой на клетке. Добавляют вещество 5, такое как конкурентный реактив (например, биотин), которое может представлять собой вещество, которое проявляет более высокую аффинность связывания с сайтом связывания на реактиве, чем с партнером связывания на средстве, например, Fab-фрагменте, тем самым разрушая связывание между реактивом и средством. В части D показано разрушение связывания между средством 2, например, Fab-фрагментом, и реактивом, что приводит к диссоциации реактива и средства и, тем самым, клетки. В некоторых случаях, средство, например, Fab-фрагмент, также может диссоциировать из его взаимодействия с молекулой 4 на клетке 3. В некоторых случаях, это может разрушать, уменьшать и/или прерывать передачу сигнала в клетке.

[0157] На фиг. 5 приведено схематическое представление образцового варианта осуществления для стимуляции и обогащения по клеткам-мишеням, где стимуляцию осуществляют посредством инкубации клеток, которая происходит, по меньшей мере отчасти, в присутствии основы, 6, изображенной здесь в виде стационарной фазы, имеющей иммобилизованный на ней компонент(ы) реактива 1 для отбора клеток (часть A), который имеет сайт связывания для средства отбора 2, которое способно к связыванию с молекулой 4, присутствующей на некоторых или всех клетках-мишенях. Средство отбора 2 добавляют на основу с использованием иммобилизованного реактива 1 в условиях, в соответствии с которыми реактив и средство обратимо связываются, например, через сайты связывания, создавая олигомерный комплекс со средством, мультимеризованным на нем (часть B). Средство отбора может содержать больше чем одно средство. Альтернативно, обратимо связанный комплекс средства и реактива можно добавлять к стационарной фазе в виде комплекса для иммобилизации. Как показано, клетки 3, в том числе клетки-мишени, объединяют со стационарной фазой и комплексом мультимеризованного средства отбора, в соответствии с чем клетки-мишени становятся обратимо иммобилизованными на основе 6, через средство отбора 2 и реактив 6 (часть C). Необязательно, не связанные клетки удаляют, или перед добавлением стимулирующих средств или после этого. Комплекс, содержащий мультимеризованные стимулирующие средства 5, обратимо связанные с олигомерным реактивом 7, добавляют в условиях, в соответствии с которыми стимулирующее средство 5 специфически связывается с молекулой на клетках-мишенях, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в иммобилизованных клетках-мишенях, экспрессирующих маркер (часть D). В некоторых вариантах осуществления, где обратимое связывание между различными средствами и реактивами является обратимым с помощью того же вещества, вещество можно добавлять для разрушения обратимого связывания для того, чтобы удалять клетки из стационарной фазы и останавливать стимуляцию, например, посредством добавления одного вещества.

[0158] На фиг. 6A представлен график общего числа клеток, наблюдаемого после (i) обогащения образцов PBMC по клеткам, экспрессирующим один из различных указанных селективных маркеров (CD3+ обогащение, CD4+ обогащение, CD8+ обогащение), и (ii) инкубации обогащенных клеток в присутствии среды и IL-2, отдельно (незакрашенные столбцы) или с реактивом мультимеризации, обратимо связанным с Fab-фрагментами против CD3 и против CD28 (закрашенные столбцы). Инкубацию осуществляли на колонке, в присутствии стационарной фазы, на которой клетки обратимо иммобилизовали через средство со специфичностью к релевантному селективному маркеру.

[0159] На фиг. 6B изображены результаты для поверхностной экспрессии CD45RA и CD45RO на CD4+ и CD8+ клетках после (i) обогащения образцов PBMC по клеткам, экспрессирующим один из различных указанных селективных маркеров (CD3+ обогащение, CD4+ обогащение, CD8+ обогащение), и (ii) инкубации обогащенных клеток в присутствии среды и IL-2, отдельно (без стимуляции) или с реактивом мультимеризации, обратимо связанным с Fab-фрагментами против CD3 и против CD28 (a-CD3, a-CD28). Инкубацию осуществляли на колонке, в присутствии стационарной фазы, на которой клетки обратимо иммобилизовали через средство со специфичностью к релевантному селективному маркеру. Верхний ряд показывает окрашивание перед отбором или инкубацией.

[0160] На фиг. 6C изображены результаты для поверхностной экспрессии CD62L и CD69 CD4+ и CD8+ клеток после (i) обогащения образцов PBMC по клеткам, экспрессирующим один из различных указанных селективных маркеров (CD3+ обогащение, CD4+ обогащение, CD8+ обогащение), и (ii) инкубации обогащенных клеток в присутствии среды и IL-2, отдельно (без стимуляции) или с реактивом мультимеризации, обратимо связанным с Fab-фрагментами против CD3 и против CD28 (a-CD3, a-CD28). Инкубацию осуществляли на колонке, в присутствии стационарной фазы, на которой клетки обратимо иммобилизовали через средство со специфичностью к релевантному селективному маркеру.

[0161] На фиг. 7A-C представлены результаты эксперимента, в котором CD3+ T-клетки-респонденты пролиферировали после стимуляции in vitro с использованием αCD3 и αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на бусах, покрытых мутеином стрептавидина Strep-tactin^®. На фиг. 7A представлена гистограмма, показывающая распределение размеров (прямое рассеяние) стимулированных клеток, на фиг. 7B изображены гистограммы, представляющие степень пролиферации в соответствии с числом клеток на клеточное деление, которые показаны в верхней части на фиг. 7B (0 означает клетки без деления; 5 означает клетки, которые прошли через по меньшей мере 5 делений), и на 7C представлено изображение культуральной чашки после 4 суток стимуляции.

[0162] На фиг. 8A-E представлены результаты эксперимента, в котором CD3+ T-клетки-респонденты пролиферировали после стимуляции in vitro с использованием обратимых αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина, действующем растворимым реактивом. Для экспериментов, результаты которых представлены на фиг. 8A-E, 300000 CD3+ T-клеток-респондентов (Tresp) метили с использованием 2 мкМ сложного сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE) и стимулировали с использованием различных количеств препарата растворимого олигомерного мутеина стрептавидина, на котором иммобилизовали комбинацию αCD3 Fab-фрагмента и αCD28 Fab, оба несут Strep-tag в качестве стрептавидин-связывающего пептида на тяжелой цепи. («1×» соответствует 3 мкг олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного с использованием 0,5 мкг αCD3Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab; числа показывают количество, кратное «1×»). Клетки Tresp или оставались без стимуляции или их стимулировали с использованием пустых олигомерных мутеинов стрептавидина (без Fab), которые служили в качестве отрицательного контроля. Клетки Tresp высевали в двух повторениях в 48-луночные планшеты вместе с 300000 CD3-отрицательных аутологических клеток-кормушек (облучали с использованием 30 Гр) в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 20 Ед/мл интерлейкина 2 (IL-2). Клетки инкубировали при 37°C без замены среды и пролиферацию анализировали в соответствии с разведением CFSE после 5 суток посредством FACS анализа (фиг. 8B). На фиг. 8A показано распределение размеров клеток после 5 суток в культуре. Гистограммы показывают живые CD3+ клетки, тогда как на фиг. 8C представлены клетки после культуры, которые освобождали с помощью стимулирующих реактивов после обработки 1 мМ D-биотином и промывания. Диссоциацию и удаление мономерных Fab-фрагментов анализировали посредством повторного окрашивания с использованием олигомерного мутеина стрептавидина, меченного фикоэритрином (ST-PE) в качестве флуоресцентной метки, и представлена репрезентативная гистограмма. На фиг. 8D показано абсолютное число живых (отрицательных по трипановому синему) клеток после 5 суток, которые считали с использованием счетной камеры Neubauer и наносили на диаграмму в зависимости от соответствующих условий стимуляции. Медианы числа клеток представлены на фиг. 8D; планки ошибки показывают стандартное отклонение (SD). На фиг. представлено изображение культуральной чашки после 5 суток стимуляции.

[0163] На фиг. 9A-B представлена кинетика размножения при пролиферации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp), которые стимулировали in vitro или с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов или с использованием αCD3/αCD28/αCD8 Fab, которые обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина двух типов, действующем в качестве растворимого реактива. Олигомерный мутеин стрептавидина первого типа представлял собой фракцию олигомерного мутеина стрептавидина (n≥3), полученную в примере 3, (также обозначаемую в настоящем описании как «стандартный» или «меньший» остов олигомерного мутеина стрептавидина, проиллюстрированный символом треугольника верхушкой вниз на фиг. 9A-B), олигомерный мутеин стрептавидина второго типа, используемый в качестве растворимого реактива, представлял собой олигомер, который получали посредством проведения реакции растворимого олигомерного мутеина стрептавидина с биотинилированным сывороточным альбумином человека (HSA). Этот растворимый реактив, основанный на HSA также обозначают в настоящем описании как «больший» остов олигомерного мутеина стрептавидина). В экспериментах с фиг. 9A-B размножение осуществляли без замены среды. Результаты для CD4+ T-клеток-респондентов представлены на фиг. 9A, результаты для CD8+ T-клеток-респондентов представлены на фиг. 9B. В этом контексте, следует отметить, что экспериментально используемые растворимые реактивы, которые функционализированы посредством обратимого связывания первых средств и необязательно вторых и третьих средств, обозначают на фиг. как «мультимеризованные средства».

[0164] На фиг. 10A-B представлена кинетика размножения при пролиферации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp), которые стимулировали in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые представляли собой обратимо иммобилизованные фрагменты, которые обратимо иммобилизовали с использованием растворимых олигомерных мутеинов стрептавидина двух типов, действующих в качестве растворимого реактива. Олигомерный Strep-tactin^® первого типа представлял собой фракцию олигомерного мутеина стрептавидина (n≥3), полученную в примере 3 (также обозначаемую в настоящем описании как «стандартный остов олигомерного мутеина стрептавидина», проиллюстрированную символом треугольника верхушкой вверх на фиг. 10A-B), олигомерный мутеин стрептавидина второго типа, используемый в качестве растворимого реактива, представлял собой растворимый реактив, основанный на HSA, указанный выше «большой остов»). В экспериментах с фиг. 10A-B размножение осуществляли с заменой среды. Результаты CD4+ T-клеток-респондентов представлены на фиг. 10A, результаты для CD8+ T-клеток-респондентов представлены на фиг. 10B.

[0165] На фиг. 11A-B представлены комбинированные данные из результатов, полученных на фиг. 9-10, для кинетики размножения при пролиферации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов, где на фиг. фиг. 11A представлены результаты для CD4+ T-клеток и на фиг. 11B представлены результаты для CD8+ T-клеток. Прямые линии используют для культивирования с заменой среды в сутки 3, тогда как штриховые линии изображают значения, полученные для степени размножения без замены среды в сутки 3. Данные, представленные на фиг. 11A-B, нормализованы по входному числу клеток. Представлены только данные для Tresp, стимулированных олигомерным мутеином стрептавидина (n≥3), Tresp, стимулированных коммерчески доступными бусами против CD3/против CD28 (положительный контроль), и не стимулированных T-клеток (отрицательный контроль), но не данные о реактиве с «большим остовом».

[0166] На фиг. 12A-C представлена кинетика размножения и фенотип CD3+ центральных T-клеток памяти (T_CM) (CD3+CD62L+CD45RA-T_CM), поликлонально стимулированных in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина (с n≥3), описанном в примере 3. Графики, приведенные на фиг. 12A-B, представляют степень пролиферации в соответствии с числом клеток, собранных на момент времени, где на фиг. 12A представлена пролиферация в средах с добавлением только IL-2 и на фиг. 12B представлена пролиферация в средах с добавлением IL-2 и IL-15. На фиг. 12C представлен проточный цитометрический анализ T-клеточной экспрессии CD62L и CD127 после 14 суток культуры в этих переменных средах цитокинов.

[0167] На фиг. 13A-B представлен выход и фенотип при размножении очищенных CD8+ T-клеток-респондентов, стимулируемых in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимых олигомерных мутеинах стрептавидина двух типов, действующих растворимым реактивом. Олигомерный мутеин стрептавидина первого типа представлял собой фракцию олигомерного мутеина стрептавидина (полученную в примере 3 (стандартный остов), олигомерный мутеин стрептавидина второго типа, используемый в качестве растворимого реактива, представлял собой растворимый олигомер, описанный выше и называемый в настоящем описании как «большой» остов. В этих экспериментах, фракцию олигомерного стандартного мутеина стрептавидина (n≥3) также использовали в качестве реактива, который функционализировали или с использованием отдельных Fab-фрагментов (третий столбец на фиг. 13A и фиг. 13B) или с использованием комбинации αCD3 и αCD28 Fab-фрагментов. В дополнение к комбинированной стимуляции с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, также дополнительный αCD8 Fab-фрагмент (коммерчески доступный в IBA GmbH, Gottingen, Germany) иммобилизовали для того, чтобы тестировать, возможно ли предпочтительно стимулировать конкретную субпопуляцию T-клеток. На фиг. 13A представлена столбчатая диаграмма, которая представляет степень пролиферации в соответствии с числом клеток, собранных в сутки 6, по сравнению с отрицательными контролями (не стимулированные очищенные CD8+ T-клетки-респонденты), и нормализованных по положительному контролю (очищенные CD8+ T-респонденты, стимулированные коммерчески доступными бусами против CD3/против CD28 (бусы, на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28). На фиг. 13B представлен проточный цитометрический анализ T-клеточной экспрессии CD8 и молекулы поверхности T-клеток CD45RO (которая указывает на пролиферацию и активацию T-клеток) после клеточной культуры. Различные стимулирующие условия сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и не обнаруживали значимые различия (n.s.).

[0168] На фиг. 14A-B представлен выход и фенотип для размножения очищенных CD8+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина, действующем в качестве растворимого реактива, которые функционализировали или с использованием отдельных Fab-фрагментов или с использованием комбинации Fab-фрагментов (как уже описано выше). В этих экспериментах CD8+ T-клетки-респонденты стимулировали растворимым реактивом (растворимым олигомерным мутеином стрептавидина (1 мг/мл) из примера 3), который функционализировали с использованием различных количеств αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагментов, необязательно вместе с αCD8 Fab-фрагментом, описанным выше. Термин «1×» соответствует 1,5 мкг олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного с использованием 0,5 мкг только αCD3 Fab-фрагмента, и 1,5 мкг олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного с использованием 0,5 мкг только αCD28 Fab), или 3 мкл препарата олигомерного мутеина стрептавидина, нагруженного с использованием 0,5 мкг αCD3 Fab-фрагмента и 0,5 мкг αCD28 Fab, или 4,5 мкл препарата олигомерного мутеина стрептавидина, нагруженного с использованием 0,5 мкг strep-меченного αCD3 Fab, 0,5 мкг strep-меченного αCD8 и 0,5 мкг strep-меченного αCD28 Fab. Соответственно, термин «2×» соответствует 3,0 мкг олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного с использованием 1 мкг только αCD3 Fab-фрагмента, и 3,0 мкг олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного с использованием 1 мкг только αCD28 Fab, что обозначает, что использовали двойное количество иммобилизованного αCD3 Fab-фрагмента. Необработанные клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля и очищенные CD8+ T-респонденты, стимулированные коммерчески доступными бусами против CD3/против CD28 (бусы, на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28) в качестве положительного контроля. На фиг. 14A представлен график, на котором столбцы представляют степень пролиферации в соответствии с числом клеток, собранных в сутки 5, по сравнению с отрицательными контролями, и нормализованных по положительному контролю. На фиг. представлен FACS анализ T-клеточной экспрессии CD8 и CD45RO после клеточной культуры.

[0169] На фиг. 15A-B представлено размножение очищенных CD3+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина из примера 3, который служил в качестве растворимого реактива. В одном эксперименте, в дополнение к αCD3/αCD28 Fab-фрагментам, также αCD8 Fab-фрагмент, коммерчески доступный в IBA GmbH, Gottingen, Germany (№ по каталогу 6-8000-203), иммобилизовали на растворимом олигомере мутеина стрептавидина для того, чтобы тестировать, возможно ли предпочтительно стимулировать in vitro CD8+ субпопуляцию T-клеток в общей CD3+ культуре с использованием реактива, на котором также обратимо иммобилизован αCD8 Fab-фрагмент. Более подробно, 500000 очищенных CD3+ T-клеток-респондентов (Tresp) стимулировали с использованием 3 мкл препарата олигомерного мутеина стрептавидина (1 мг/мл), нагруженного комбинацией из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. В качестве альтернативного подхода, 4,5 мкл олигомерного мутеина стрептавидина нагружали с использованием 0,5 мкг αCD3 Fab, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab, описанных выше. Не стимулированные клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и Tresp, которые стимулировали бусами против CD3/против CD28 (бусами, на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28), служили в качестве положительного контроля. На фиг. 15A представлен график числа клеток (степень размножения) в культурах при каждых условиях. На фиг. 15B представлена доля CD4+ и CD8+ клеток при каждых условиях стимуляции.

[0170] На фиг. 16A-B показаны результаты дифференциальной мобилизации внутриклеточного кальция в клетках Jurkat, которые или метили αCD3 антителом OKT3 или Fab-фрагментами из OKT3, мультимеризованными с использованием Strep-tactin^® (также обозначаемыми в настоящем описании как Fab мультимеры). Для экспериментов на фиг. 16A, клетки Jurkat нагружали кальций-чувствительным красителем Indo-1-AM, и высвобождение кальция запускали посредством инъекции или αCD3 mAb OKT3 (черные квадраты) или αCD3 OKT3 Fab мультимеров (полученных из родительской клеточной линии OKT3) с предшествующим разрушением D-биотином или без него (темные серые треугольники и светлые серые круги, соответственно) по сравнению с инъекцией PBS (перевернутые белые треугольники). Применение иономицина служило в качестве положительного контроля. Осуществляли мониторинг изменений внутриклеточной концентрации Ca²⁺ с разрешением по времени посредством проточной цитометрии на основании изменения соотношения FL6/FL7. Для эксперимента на фиг. 16B, Indo-1-AM-меченные клетки Jurkat активировали с помощью различных αCD3 стимулов, как описано в примере 11; OKT3: верхний график и αCD3 Fab-мультимер: средний график), после чего следовало последующее (t=140 с) опосредованное D-биотином разрушение передачи сигнала αCD3 Fab-мультимера. αCD3 Fab-мультимер, предварительно диссоциированный с использованием D-биотина (нижний график), и иономицин служили в качестве отрицательного или положительного контроля. данные репрезентативны для трих различных экспериментов.

[0171] На фиг. 17 представлен результат обратимого окрашивания клеток с использованием OKT3 Fab-мультимеров против CD3. Свежие выделенные PBMC окрашивали или моноклональным антителом (левая точечная диаграмма, родительский клон для Fab-мультимеров) или когнатными PE-меченными Fab-мультимерами и анализировали или до (вторая точечная диаграмма слева) или после обработки D-биотином (средняя точечная диаграмма). Затем остающиеся Fab мономеры обнаруживали после последующих стадий промывания с использованием свежего PE-меченного Strep-Tactin^® (вторая точечная диаграмма справа). Окрашивание обратимо окрашенных клеток вторичным Fab-мультимером служило в качестве контроля (правая точечная диаграмма). Показаны только живые (PI^{отрицательные}) клетки. Числа на точечных диаграммах показывают процентную долю клеток в гейтах.

[0172] На фиг. 18 представлено выделение клеток посредством обратимого связывания Fab-фрагментов против CD28, мультимеризованных с использованием Strep-Tactin^®, меченного фикоэритрином в качестве флуоресцентной метки. CD28+ клетки отбирали/выделяли посредством магнитного отбора клеток с использованием Fab-мультимеров из свежих выделенных PMBC, как описано в публикации международной патентной заявки № WO2013/011011. Перед отбором осуществляли контрольное окрашивание клеток или с использованием когнатных флуоресцентных aCD28-мультимеров (левая точечная диаграмма) или с использованием антитела, направленного против легкой цепи иммуноглобулина κ (вторая точечная диаграмма слева, α-Ig κ mAb). После отбора, клетки обрабатывали D-биотином и впоследствии промывали для того, чтобы удалять магнитные бусы и Fab-мономеры. Высвобожденные CD28+ клетки впоследствии (повторно) окрашивали или с использованием αCD28 Fab-мультимеров (вторая точечная диаграмма справа) или с использованием α-Ig κ mAb (правая точечная диаграмма) для того, чтобы обнаруживать потенциально остающиеся Fab-мономеры. Показаны только живые (PI^{отрицательные}) CD3+ клетки. Числа на точечных диаграммах показывают процентную долю клеток в гейтах.

[0173] На фиг. 19A-B показано раннее формирование кластера T-клеток после активации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина (n≥3), описанном в примере 3. На 19A изображены результаты для CD4+ T-клеток и на фиг. 19B изображены результаты для CD8+ T-клеток. Показаны данные для Tresp, стимулированных растворимым реактивом мультимеризации (олигомерным мутеином стрептавидина), Tresp, стимулированных коммерчески доступными бусами против CD3/против CD28, (положительный контроль) и не стимулированных T-клеток (отрицательный контроль).

[0174] На фиг. 20A-B показана кинетика избирательного антиген-специфического (Аг-специфического) размножения из общей популяции очищенных CD3+CD62L+CD45RA- T_CM клеток-респондентов, которые стимулировали in vitro с использованием как комплекса пептид:молекула MHC (который выполняет функцию первого средства, которое обеспечивает первичный сигнал активации для клеток), так и αCD28 Fab-фрагмента (который выполняет функцию второго средства, которое связывает вспомогательную молекулу на поверхности клеток), и не стимулированных T-клеток (отрицательный контроль). Как комплекс антиген-специфического пептида с молекулой MHC, так и αCD28 Fab-фрагмент обратимо иммобилизовали на одном и том же растворимом олигомерном мутеине стрептавидина (с n≥3), описанном в примере 3. Пептид, используемый для антиген-специфического размножения на фиг. 20A, представлял собой пептид CRVLCCYVL (SEQ ID № 38), аминокислоты 309-317 предраннего белка 1, ограниченный молекулой MHC HLA-C702 (описано в Ameres et al., PLOS Pathogens, May 2013, том 9, выпуск 5, e1003383), представляющий эпитоп HLA-C7/IE-1, который специфичен для цитомегаловируса (CMV). Молекула MHCI, которая представляет пептид, несет на C-конце ее тяжелой цепи стрептавидин-связывающий пептид (SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK (SEQ ID № 16), который коммерчески доступен в виде «Twin-Strep-tag^®» в IBA GmbH, Gottingen, Germany). На фиг. 20A показан образцовый проточный цитометрический анализ для фракции Аг-специфических клеток, которые пролиферировали при использовании комплекса пептид:MHC-I, специфичного для этого эпитопа HLA-C7/IE-1, в качестве первого средства, которое обеспечивает первичный сигнал активации для клеток, обратимо иммобилизованных на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина. Графики на фиг. с 20B до фиг. 20E иллюстрируют кинетику размножения дополнительных Аг-специфичностей в соответствии с числом положительных по специфичному пептиду:MHCI и мультимеру клеток, собранных на момент времени по аналогии с фиг. 20A, используя отдельные комплексы антиген-специфического пептида с молекулой MHCI в качестве первого средства, которое обеспечивает первичный сигнал активации для клеток, обратимо иммобилизованных на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина. Более подробно, на фиг. 20B показано размножение Аг-специфических клеток, которые размножали с использованием комплекса пептид:MHC-I, специфичного для эпитопа pp65 из CMV (аминокислоты 341-350 (QYDPVAALF)(SEQ ID № 39), ограниченные с помощью HLA-A2402), на фиг. 2°C показано размножение Аг-специфических клеток, которые размножали с использованием другого комплекса пептид:MHC-I, специфичного для эпитопа pp65 из CMV (аминокислоты 265-274 (RPHERNGFTV)(SEQ ID № 40), ограниченного с помощью HLA-B702), на фиг. 20D показано размножение Аг-специфических клеток, которые пролиферировали при использовании комплекса пептид:MHC-I, специфичного для эпитопа гексона 5 аденовирусов (аминокислоты 114-124 (CPYSGTAYNSL)(SEQ ID № 41), ограниченного с помощью HLA-B702), на фиг. 20E показано размножение Аг-специфических клеток, которые пролиферировали при использовании комплекса пептид:MHC-I, специфичного для эпитопа HLA-B7/IE-1309-317 из CMV данные образцовой FACS см. выше, фиг. 20A). Все пептид:молекулы MHC, несущие метку Twin Strep^®, коммерчески доступны в IbaGmbH. В этом контексте аминокислотные последовательности молекул HLA-A*2402, HLA-B*0702 и HLA-C*0702, которые несут «Twin-Strep-tag^®» в качестве своего C-конца, представлены в виде SEQ ID № 42, 43 и 44 в сопроводительных списках последовательностей, тогда как аминокислотная последовательность микроглобулина β2 (который формирует вместе с α цепью, что обозначает кодируемые молекулы HLA, соответствующие молекуле MHCI) представлена в виде SEQ ID № 45 в сопроводительном списке последовательностей. Кроме того, на фиг. 20F показан образцовый проточный цитометрический анализ T-клеточной экспрессии CD62L и CD127 после 14 суток культуры для HLA-B7/Hexon5114-124-стимулированных/размноженных клеток с фиг. 20D.

[0175] На фиг. 21 представлена кинетика избирательного Аг-специфического размножения из очищенных CD3+CD62L+CD45RA-T_CM клеток-респондентов, которые стимулировали in vitro с использованием a) антиген-специфических пептидных комплексов MHCI и b) αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали в качестве первого и второго средства на растворимых олигомерных мутеинах стрептавидина. С этой целью 500000 CD3+CD62L+CD45RA- T_CM клеток-респондентов (Tresp) стимулировали Аг-специфически с использованием 3 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг комплексов пептидов:MHC класса I, оснащенных стрептавидин-связывающим пептидом (специфичный пептид представляет аминокислоты 114-124 (CPYSGTAYNSL, SEQ ID № 41) белка гексон 5 аденовируса, который ограничен с помощью HLA-B0702, см. выше), и 0,5 мкг αCD28 Fab. В качестве альтернативы, 4,5 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin, нагруженного с использованием 0,5 мкг этого комплекса пептида:MHC класса I, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Для сравнения, поликлональную стимуляцию осуществляли, используя 3 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin (1 мг/мл), загруженного с использованием или комбинации 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Снова, в качестве альтернативных условий стимуляции, описанных выше, использовали 4,5 мкл препарата мультимеров Streptactin, нагруженных с использованием 0,5 мкг αCD3 Fab, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля и клетки Tresp, стимулированные поликлонально бусами против CD3/против CD28, в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2 и 5 нг/мл IL-15. Клетки инкубировали при 37°C с заменой среды каждые 3 суток и число клеток анализировали после 7 и 14 суток. Фотографии, приведенные на фиг. 21, представляют степень формирования кластера в сутки 5 для Аг-специфической стимуляции, как показано на примере для HLA-B7/эпитопа гексона 5 аденовируса.

[0176] На фиг. 22A-B показана активация внутриклеточных сигнальных каскадов трансдуцированных клеток Jurkat, которые модифицировали для того, чтобы экспрессировать αCD19 химерный антигенный рецептор (CAR), и которые стимулировали с использованием олигомерного Strep-tactin^® из примера 3 в качестве растворимого реактива мультимеризации. Специфичность CAR обычно извлекают из scFv-области, собранной из антиген-связывающей области моноклонального антитела (mAb), которое специфически связывает целевой/опухолеассоциированный антиген, такой как CD19, и связывает его со специфической передачей сигналов T-клеток (описано в Hudecek et al, Clin Cancer Res. 2013 June 15; 19(12): 3153-3164. В экспериментах внеклеточный домен (ECD) из CD19, который содержит естественный лиганд αCD19 CAR, а также поликлональный αIgG F(ab)₂ фрагмент, который распознает спейсер IgG4 (F(ab)₂ осла против человека, коммерчески доступный в Jackson Immuno Research) в αCD19-CAR, также использовали в этом эксперименте в качестве первого средства, которое обеспечивает первичный сигнал активации для клеток Jurkat. Обратимую иммобилизацию на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина обеспечивали с помощью пептида стрептавидина SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK (SEQ ID № 16), который сливали с C-концом ECD из CD19, или с помощью биотинилированного (Fab)₂ фрагмента из αIgG (поскольку мутеин стрептавидина «m2» связывает биотин со сниженной аффинностью, это связывание является обратимым и, например, может быть вытеснено посредством добавления избытка свободного биотина). В контрольном эксперименте с фиг. 22A, 300000 CD3+ клеток-респондентов Jurkat (Jresp) стимулировали различными количествами смеси препаратов олигомерного Streptactin (1 мг/мл), который функционализировали с использованием αCD3 Fab и αCD28 Fab («1×» соответствует 3 мкг мультимеризованного Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг aCD3 Fab и 0,5 мкг aCD28 Fab -поликлонального мультимеризованного средства). В эксперименте с фиг. 22B 3 мкл препарата олигомерного Streptactin функционализировали с использованием 0,5 мкг (×1) или 1 мкг (×2) внеклеточного домена (ECD) из CD19 или с использованием 3 мкл препарата олигомерного Streptactin, нагруженного с использованием 0,5 мкг (×1) или 1 мкг (×2) αIgG, которое распознает спейсер IgG4, (оба они являются CAR-специфическим мультимеризованным средством). Jresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28 (бусами, на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28) или PMA и иономицином, служили в качестве положительных контролей. Клетки Jresp высевали в 1,5 мл пробирки Eppendorf в 200 мкл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C и помещали на лед и лизировали после от 0 мин до 20 мин стимуляции. Обнаружение фосфорилированного ERK указывает на активную MAPK перадачу сигналов, окрашивание β-актина домашнего хозяйства указывает на нагрузку равными количествами общего белка на условие и момент времени.

Подробное описание

[0177] В настоящем описании предусмотрены способы инкубации (культивирования) и/или обогащения или отбора клеток из композиции клеток. Например, среди предоставленных вариантов осуществления имеют место способы размножения, активации, содействия выживаемости или дифференцировке (или ее отсутствию) и/или индукции различных других эффектов в клетках-мишенях; и/или отделения клеток-мишеней от других клеток и/или других компонентов или их обогащения по сравнению с такими другими компонентами. В некоторых аспектах, клетки представляют собой T-клетки, такие как не сортированные T-клетки или клетки конкретного подмножества T-клеток.

[0178] Все публикации, в том числе патентные документы, научные статьи и базы данных, упоминаемые в этой заявке, включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждую индивидуальную публикацию индивидуально включали посредством ссылки. Если определение, приведенное в настоящем описании, противоречит или иным образом не соответствует определению, приведенному в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, которые включены в настоящее описание посредством ссылки, определение, приведенное в настоящем описании, превалирует над определением, которое включено в настоящее описание посредством ссылки. Например, содержание международной заявки PCT № PCT/EP2015/058339 включено посредством ссылки в полном объеме.

[0179] Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, служат только организационным целям, и их не следует толковать в качестве ограничения описанного объекта изобретения.

I. ОБЗОР СПОСОБОВ, СИСТЕМ И РЕАКТИВЫ

[0180] В настоящем описании предусмотрены способы инкубации (культивирования) клеток для размножения, активации, содействия выживаемости или дифференцировке (или ее отсутствию) и/или индукции различных других эффектов в клетках-мишенях. В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы также включают одну или несколько других стадий процессов, в том числе одно или несколько из отбора, выделения, обогащения и/или отбора клеток в композиции клеток и/или трансдукции клеток. В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы осуществляют в присутствии мультимеризованного средства, где одно или несколько связывающих средств (например, фрагменты антител, такие как Fab) обратимо связывают с реактивом мультимеризации, например, реактивом олигомерного мутеина стрептавидина.

[0181] В некоторых вариантах осуществления культивирование и/или обогащение клеток осуществляют, целиком или частично, в присутствии и/или когда клетки находятся на основе, такой как стационарная фаза и/или твердый носитель. В некоторых вариантах осуществления основа представляет собой хроматографическую матрицу, такую как где инкубацию осуществляют, когда клетки находятся в колонке, содержащей стационарную фазу. В некоторых вариантах осуществления способы осуществляют, когда клетки иммобилизуют, в целом опосредованно, на основе, например, колонке. Иммобилизация обычно обратима, так что клетки могут быть удалены с основы после инкубации.

[0182] В некоторых вариантах осуществления основа предусматривает способность обогащать композицию клетками или отбирать конкретные клетки во время, до или после инкубации. Например, в некоторых вариантах осуществления используют твердый носитель, функционализированный средством со специфичностью к одной или нескольким клеткам-мишеням (например, маркеру T-клетки, такому как CD3), и желаемые T-клетки объединяют с основой и позволяют им связываться с основой, что делает их опосредованно иммобилизованными. В некоторых аспектах, клетки-мишени стимулируют, пока они иммобилизованы на основе, например, посредством добавления мультимеризованного реактива и/или через средства, связанные с основой. Таким образом в некоторых аспектах, предоставленные способы и другие варианты осуществления благоприятны в том отношении, что они позволяют проводить множество стадий обработки (например, стимуляцию и отбор) в одном и том же контейнере и/или закрытой системе или системе(ах), которые могут обеспечивать признаки увеличенной эффективности и безопасности. Образцовый вариант осуществления представлен на фиг. 5.

[0183] В некоторых вариантах осуществления способы относятся к системам обратимых реактивов, способным к связыванию с молекулами на поверхности клеток-мишеней, таким как реактивы, содержащие рецепторные связывающие молекулы, например, стимулирующие средства, которые тем самым могут предоставлять сигнал для клеток, который, в некоторых случаях, может представлять собой первичный сигнал активации. В некоторых вариантах осуществления в способах используют реактивы, которые могут представлять собой реактивы мультимеризации, имеющие связанные с ним одно или несколько средств, например, стимулирующих средств, таких как первое средство, второе средство и т. д., которое предоставляет сигнал для клеток, такой как первичный сигнал активации и/или вспомогательный или костимулирующий сигнал. В некоторых вариантах осуществления первичного сигнала активации по существу может быть достаточно для того, чтобы активировать клетки для размножения/пролиферации. Это первое средство можно связывать обратимо или также необратимо с реактивом мультимеризации. Реактив мультимеризации может иметь связанное с ним также второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток. Второе средство, при связывании со вспомогательной молекулой на поверхности на поверхности клеток, может тем самым стимулировать активированные клетки к размножению. Также это второе средстве можно связывать обратимо или также необратимо с реактивом мультимеризации. Реактив мультимеризации может быть иммобилизованным на твердом носителе или растворимым. В некоторых вариантах осуществления реактив мультимеризации находится на основе, которая представляет собой стационарную фазу, и по меньшей мере часть инкубации осуществляют в колонке, содержащей стационарную фазу.

[0184] В одном из аспектов, способ, раскрытый в настоящем описании, представляет собой последовательное размножение популяции клеток, где стимулируют/размножают полную популяцию лимфоцитов, затем удаляют реактивы, необходимые для размножения, посредством хроматографии на подходящей стационарной фазе. В некоторых вариантах осуществления размноженные/стимулированные клетки, которые представляют собой культивируемые клетки, необязательно трансфицируют, например, T-клеточным рецептором или химерным антигенным рецептором (CAR) и, в некоторых аспектах, их можно подвергать второму стимулированному размножению с использованием другой стимулирующей молекулы, которая связывается со введенным T-клеточным рецептором или химерным антигенном рецептором.

[0185] Способы размножения популяций T-клеток in vitro в отсутствие экзогенных факторов роста или низких количеств экзогенных факторов роста известны в данной области (см., например, патент США 6352694 B1 и европейский патент EP 0 700 430 B1). В целом, в таких способах используют поверхности твердой фазы больше 1 мкМ, на которых иммобилизуют различные связывающие средства (например, антитело против CD3 и/или антитело против CD28). Например, Dynabeads^® CD3/CD28 (Invitrogen) представляют собой коммерчески доступные реактивы для размножения T-клеток, которые представляют собой однородные, 4,5 мкм суперпарамагнитные, стерильные, не пирогенные полистироловые бусы, покрытые смесью аффинно-очищенных моноклональных антител против молекул CD3 и CD28 клеточной поверхности на T-клетках человека. Однако, в некоторых случаях, такие магнитные бусы, например, сложно внедрять в способ для того, чтобы размножать клетки в условиях, необходимых для клинических исследований или терапевтических целей, поскольку нужно убеждаться, что эти магнитные бусы полностью удалены перед введением размноженных T-клеток пациенту.

[0186] В некоторых вариантах осуществления способы, предусмотренные в настоящем описании, направлены на эти вопросы. В некоторых аспектах, предоставленные реактивы являются обратимыми, так что стимулирующие средства можно удалять из композиции клеток. Также, в некоторых аспектах, реактив, например, реактив мультимеризации, с которым связывают стимулирующие средства, не иммобилизуют на основе, например, не иммобилизуют на твердом носителе или поверхности. Таким образом, в некоторых аспектах, реактив, например, реактив мультимеризации, является гибким и не жестким. В некоторых вариантах осуществления реактив может адаптироваться к клеточной поверхности или соответствовать ей. В некоторых вариантах осуществления возможно иммобилизовать реактив на основе, такой как твердый носитель, в том числе стационарная фаза. В некоторых вариантах осуществления такие способы можно использовать согласованно со средствами отбора с использованием схожих средств отбора, в которых одну или несколько клеток-мишеней можно отбирать и, одновременно или последовательно, экспонировать для стимулирующих средств. Таким образом, в некоторых аспектах, на стимуляцию конкретных клеток или подмножеств клеток может влиять отбор и выделение совместно со стимуляцией.

[0187] В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы включают культивирование, например, приведение в контакт, композиции клеток с реактивом, например, реактивом мультимеризации, с которым связывают одно или несколько рецептор-связывающих средств (например, стимулирующих средств) (см., например, фиг. 4A и B). В некоторых вариантах осуществления после приведения композиции клеток в контакт с реактивом мультимеризации и обычно инкубации популяции клеток с реактивом мультимеризации, популяция клеток формирует комплексы/связывается с реактивом мультимеризации через первое средство. Другие популяции клеток, содержащиеся в начальном образце, которые не имеют специфической молекулы клеточной поверхности, не связываются с реактивом мультимеризации. В этом отношении, следует отметить, что популяция клеток обычно имеет множество копий молекулы клеточной поверхности на ее поверхности, и связывание этого множества копий обычно необходимо для стимуляции или активации.

[0188] Таким образом, реактив мультимеризации предусматривает обычно больше чем один сайт связывания, например, Z1, в котором, в некоторых случаях, множество средств может быть обратимо связано для того, чтобы представлять первое средство, второе средство и/или другие средства с достаточной плотностью для популяции клеток. В этом отношении, следует отметить, что реактив мультимеризации может по существу иметь множество сайтов связывания, например, Z1, например, мутеин стрептавидина (который является гомотетрамером) в своем нативном состоянии имеет четыре таких сайта связывания, например, Z1, и дополнительно может быть олигомеризован. В некоторых случаях реактив может иметь только один сайт связывания, например, Z1, для обратимого связывания партнера связывания, например, C1. Таким примером является мультимерный кальмодулин. Кальмодулин по существу имеет только один сайт связывания для кальмодулин-связывающих пептидов. Однако кальмодулин можно биотинилировать и затем проводить реакцию с олигомерами стрептавидина (см. также далее), тем самым предоставляя реактив мультимеризации, в котором множество молекул кальмодулина представлены с высокой плотностью на «каркасе», тем самым предоставляя мультимерный кальмодулин.

[0189] В некоторых вариантах осуществления после инкубации или другого подходящего времени, в которое стимуляцию желательно разрушать, связывание между партнером связывания C, например, C1, обратимо связанного средства и сайтом связывания Z, например, Z1, реактива мультимеризации разрушают посредством разрушения соответствующей обратимой связи. В некоторых случаях, разрушения можно достигать посредством добавления конкурента в инкубационную/реакционную смесь, содержащую популяцию клеток, связанных с реактивом мультимеризации. Для конкурентного разрушения (которое можно понимать как конкурентное элюирование) обратимой связи между партнером связывания C, например, C1, обратимо связанного средства и сайтом связывания Z, например, Z1, реактива мультимеризации, инкубационную смесь/популяцию клеток можно приводить в контакт со свободным первым партнером связывания C, например, C1, или аналогом указанного первого партнера связывания C, который способен разрушать связь между первым партнером связывания и сайтом связывания Z, например, Z1. В примере партнер связывания C, например, C1, представляет собой стрептавидин-связывающий пептид, который связывается с сайтом связывания биотина в стрептавидине, первый свободный партнер может представлять собой соответствующий свободный стрептавидин-связывающий пептид или аналог, который связывается конкурентно. Такой аналог может представлять собой, например, биотин или производное биотина, такое как дестиобиотин.

[0190] В некоторых вариантах осуществления добавление свободного партнера или его аналога ведет к вымещению партнера связывания C, например, C1, из реактива мультимеризации и, таким образом, поскольку партнер связывания содержится в обратимо связанном средстве, достигают вымещения такого средства из реактива мультимеризации. Это вымещение средства в свою очередь ведет к диссоциации первого средства от молекулы клеточной поверхности, в частности, если аффинность связывания для связи между первым средством и рецептором клеточной поверхности имеет константу диссоциации (K_D) в диапазоне от 10^-2 M до 10^-13 M и, таким образом, также является обратимой. Благодаря этой диссоциации, в некоторых аспектах, также завершают стимуляцию популяции клеток.

[0191] В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания молекул антител с их антигеном, в том числе, например, молекулы рецептора клеточной поверхности, обычно находится в диапазоне аффинностей K_D от 10^-7 M приблизительно до 10^-13 M. Таким образом, стандартные моноклональные антитела можно использовать в качестве средства (первого или второго, рецептор-связывающего, например, стимулирующего средства или средства отбора). В некоторых вариантах осуществления во избежание любых нежелательных эффектов авидности, которые ведут к более сильному связыванию, моноклональные антитела также можно использовать в форме их одновалентных фрагментов антитела, таких как Fab-фрагменты или одноцепочечные Fv-фрагменты.

[0192] Таким образом, предоставленный способ имеет такое преимущество, что период времени стимуляции или размножения популяции клеток можно точно контролировоать и, таким образом, также можно точно контролировать функциональный статус популяции клеток. В некоторых аспектах, кратковременная активация клеток, таких как T-клетки, посредством добавления вещества, такого как конкурентное средство (например, биотин или аналог) в пределах 5 суток после стимуляции ведет к пролиферации и стимуляции клеток, но изменяет одну или несколько характеристик или признаков клеток, такие как процентная доля CD4 или CD8 T-клеток, соотношение CD8/CD4, фенотипические маркеры и/или состояние дифференцировки. Например, в некоторых аспектах, способность временно контролировать сигнал с использованием вариантов осуществления предоставленных реактивов, может вести к увеличению менее дифференцированной популяции долгоживущих T-клеток, таких как долгоживущие T-клетки памяти. В некоторых случаях, временное управление сигналом, например, посредством разрушения связывания мультимеризованного средства с использованием конкурентного вещества, можно использовать для подгонки или корректировки относительного размножения и/или персистенции конкретных субпопуляций по сравнению с другими (например, CD4+ в сравнении с CD8+).

[0193] В некоторых вариантах осуществления из-за диссоциации обратимо связанного средства или средств от молекулы клеточной поверхности, предоставленный способ имеет такое дополнительное преимущество, что стимулированная популяция клеток не содержит стимулирующие средства в конце периода стимуляции. Также в некоторых вариантах осуществления все другие реактивы, используемые в способе, а именно средства (например, первое или второе, рецептор-связывающие средства, например, стимулирующие средства или средства отбора), а также конкурентный реактив партнера связывания C, например, C1, или его аналог можно легко удалять из стимулированной популяции клеток через «картридж удаления» (см., например, описанное в международной патентной заявке № WO 2013/124474). В некоторых случаях, например, в которых реактив мультимеризации иммобилизуют на твердом носителе, таком как поверхность биореактора или магнитная бусина, его удерживают. Таким образом, использование картриджа удаления для удаления свободного средства и конкурентного реактива может включать загрузку элюированного образца (например, образца, полученного после разрушения обратимого связывания) на вторую хроматографическую колонку.

[0194] В некоторых вариантах осуществления эта хроматографическая колонка имеет подходящую стационарную фазу, которая представляет собой и матрицу аффинной хроматографии и, одновременно, может действовать в качестве гельпроникающей матрицы. В некоторых аспектах, эта матрица аффинной хроматографии имеет аффинный реактив, иммобилизованный на ней. В некоторых вариантах осуществления аффинный реактив может представлять собой, например, стрептавидин, мутеин стрептавидина, авидин, мутеин авидина или их смесь. В некоторых вариантах осуществления средство (например, первое или второе, рецептор-связывающие средства, например, стимулирующие средства или средства отбора), конкурентный реактив партнера связывания C, C1, связывают с аффинным реактивом, тем самым иммобилизуя на хроматографической матрице. Как результат, элюированный образец, содержащий выделенную и размноженную популяцию клеток, обедняют по средству (например, первому или второму, рецептор-связывающим средствам, например, стимулирующим средствам или средствам отбора) и конкурентному реактиву. В некоторых вариантах осуществления культивируемая композиция не содержит любые реагенты, которые в некоторых аспектах благоприятны для использования в связи с диагностическими применениями (например, дополнительная сортировка FACS^TM) или для любого терапевтического применения, основанного на клетках.

[0195] В некоторых вариантах осуществления способность удалять реактив и другие компоненты из композиции имеет такое дополнительное преимущество, что можно избегать любого твердого носителя, такого как магнитные бусы. В некоторых вариантах осуществления это обозначает отсутствие риска или минимальный риск контаминации активированных T-клеток такими магнитными бусами. В некоторых вариантах осуществления это также обозначает, что процесс, который соответствует стандартам GMP, можно создать легче по сравнению с другими способами, такими как использование Dynabeads®, где следует принимать дополнительные меры, чтобы гарантировать, что конечная популяция размноженных T-клеток не содержит магнитные бусы. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления использование растворимого средства мультимеризации значительно упрощает удаление их же из популяции активированных клеток (T-клетки, B-клетки или также естественные киллерные клетки), поскольку клетки можно просто осаждать посредством центрифугирования, а супернатант, в том числе растворимый реактив мультимеризации, можно выбрасывать. Альтернативно, растворимый реактив мультимеризации можно удалять из популяции размноженных клеток в гельпроникающей матрице картриджа удаления так, как описано выше (например, международная публикация патентной заявки № WO 2013/124474). В некоторых вариантах осуществления, например, в тех вариантах осуществления, в которых твердая фаза (например, магнитные бусы) не присутствует, также предусмотрена автоматизированная закрытая система для размножения клеток, которую можно встраивать в известные системы размножения клеток, такие как the Xuri Cell Expansion System W25 и WAVE Bioreactor 2/10 System, доступные в GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom) или the Quantum^® Cell Expansion System, доступную в TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA). В некоторых вариантах осуществления, где используют твердую фазу и/или стационарную фазу, тот факт, что стимуляцию осуществляют в присутствии стационарной фазы или твердой фазы или что клетки можно стимулировать, пока они иммобилизованы, позволяет проводить весь процесс отбора и/или стимуляции в контейнере, например, колонке, в стерильной или закрытой системе.

[0196] В некоторых аспектах, способы, предоставленные в настоящем описании, могут включать популяцию клеток, которые несут по меньшей мере две специфические молекулы клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления первая молекула клеточной поверхности вовлечена в первичный сигнал активации для популяции клеток, тогда как вторая молекула клеточной поверхности представляет собой вспомогательную молекулу на клеточной поверхности, которая вовлечена в предоставление стимула клеткам. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с реактивом мультимеризации, который обратимо связывает первое средство, которое обеспечивает первичный сигнал активации клеткам, и второе средство, которое индуцирует или модулирует дополнительный сигнал, например, стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток. Популяция клеток может представлять собой, например, популяцию T-клеток, в которой молекула клеточной поверхности представляет собой комплекс TCR/CD3 и молекула клеточной поверхности представляет собой вспомогательную молекулу CD28. Кроме того, как раскрыто в настоящем описании, также предусмотрено направленное воздействие на другие вспомогательные молекулы, такие как одна или несколько из CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 и HVEM. В некоторых аспектах, стимуляция через такие другие вспомогательные молекулы может вести к вести к увеличению популяции менее дифференцированных, и, в некоторых случаях, долгоживущих T-клеток, таких как долгоживущие T-клетки памяти, по сравнению со стандартной стимуляцией через CD28. В некоторых вариантах осуществления связывание комплекса TCR/CD3 в качестве первичного сигнала активации и связывание вспомогательной молекулы (например, CD28 или другой вспомогательной молекулы) может быть необходимо для размножения/пролиферации T-клеток.

[0197] В некоторых вариантах осуществления реактив мультимеризации содержит по меньшей мере один сайт связывания Z, например, Z1, для обратимого связывания первого средства, и первое средсто также содержит по меньшей мере один партнер связывания C, например, C1, где партнер связывания C, например, C1, способен к обратимому связыванию с сайтом связывания Z, например, Z1, реактива мультимеризации. Таким образом, первое средство, когда приводят в контакт или инкубируют с реактивом мультимеризации, можно обратимо связывать с реактивом мультимеризации через обратимую связь, образуемую между партнером связывания C, например, C1, и сайтом связывания Z, например, Z1. Кроме того, второе средство может содержать партнер связывания C, например, C2, где партнер связывания C2 способен к обратимому связыванию с сайтом связывания Z, например, Z2, соответственно, реактива мультимеризации. В некоторых вариантах осуществления второе средство, когда его приводят в контакт или инкубируют с реактивом мультимеризации, обратимо связывают с реактивом мультимеризации через обратимую связь, образуемую между партнером связывания C, например, C1, и сайтом связывания Z, например, Z2. В некоторых случаях, C1 и C2 могут представлять собой одно и то же или по существу одно и то же и/или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент. В некоторых случаях, Z1 и Z2 могут представлять собой одно и то же или по существу одно и то же и/или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент.

[0198] В некоторых вариантах осуществления, при использовании в качестве партнеров связывания C1 и C2, фрагменты, которые связываются с одним и тем же сайтом связывания реактива мультимеризации, имеет такое преимущество, что один и тот же конкурентный реактив (первого партнера связывания C1 и также второго партнера связывания C2) или его аналог можно использовать для разрушения, и в некоторых случаях завершения, размножения популяции клеток-мишеней (например, T-клеток) и для высвобождения этой популяции клеток-мишеней (например, T-клеток) из реактива мультимеризации.

[0199] В некоторых случаях для получения связывающие средства (например, например первое или второе рецептор-связывающие средства, например, стимулирующие средства или средства отбора) содержат партнер связывания C, партнер связывания C, например, C1 или C2, можно предоставлять с помощью соответствующего экспрессирующего вектора, используемого для рекомбинантного получения средства (например, фрагмента антитела) с тем, чтобы партнер связывания C, например, C1 или C2, представлял собой часть пептида слияния со средством на N-конце или C-конце. В некоторых вариантах осуществления в контексте средства, которое представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, партнер связывания C, например, C1 или C2, может присутствовать на C-конце легкой или тяжелой цепи. Также этот способ клонирования рекомбинантного белка, такого как вариабельные домены молекулы антитела, и рекомбинантного продуцирования соответствующего белка, например, фрагмента антитела, хорошо известен специалисту в данной области, см., например, Skerra, A. (1994). В некоторых вариантах осуществления молекулу антитела можно создавать из искусственных связывающих молекул с антителоподобными свойствами против заданной мишени, такой как CD3 или CD28 или другие молекулы вспомогательных или стимулирующих средств, как описано, например, в общеизвестных эволюционных способах, таких как фаговый дисплей (рассмотрен, например, в Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1-е изд., Academic Press, New York NY; Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424, или Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93), рибосомный дисплей (рассмотрен в Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405) или мРНК дисплей, как сообщалось в Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755.

II. СИСТЕМЫ ОБРАТИМЫХ РЕАКТИВОВ И СВЯЗАННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

[0200] В некоторых вариантах осуществления в способах используют обратимые системы, в которых по меньшей мере одно средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора), способное к связыванию с молекулой на поверхности клетки (молекулой клеточной поверхности), обратимо ассоциировано с реактивом. В некоторых случаях реактив содержит множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию со средством (например, рецептор-связывающим средством или средством отбора). В некоторых случаях реактив представляет собой реактив мультимеризации. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) содержит по меньшей мере один сайт связывания B, который может специфически связывать эпитоп или область молекулы, и также содержит партнер связывания C, который специфически связывается с по меньшей мере одним сайтом связывания Z реактива. В некоторых случаях, взаимодействие связывания между партнером связывания C и по меньшей мере одним сайтом связывания Z представляет собой нековалентное взаимодействие. В некоторых вариантах осуществления взаимодействие связывания, такое как нековалентное взаимодействие, между партнером связывания C и по меньшей мере одним сайтом связывания Z, является обратимым.

[0201] В некоторых вариантах осуществления обратимое ассоциирование может быть опосредовано присутствием вещества, такого как конкурентный реактив (также называемый реактив-элюент), который представляет собой или содержит сайт связывания, который также способен к связыванию с по меньшей мере одним сайтом связывания Z. В целом, вещество (например, конкурентный реактив) может действовать в качестве конкурента из-за более высокой аффинности связывания для сайта связывания Z, присутствующего в реактиве, и/или из-за присутствия в более высоких концентрациях, чем партнер связывания C, тем самым открепляя и/или диссоциируя партнер связывания C от реактива. В некоторых вариантах осуществления аффинность вещества (например, конкурентного реактива) к по меньшей мере одному сайту связывания Z больше аффинности партнера связывания C средства (например, рецептор-связывающего средства или средства отбора) к по меньшей мере одному сайту связывания Z. Таким образом, в некоторых случаях, связь между сайтом связывания Z реактива и партнером связывания C средства (например, рецептор-связывающего средства или средства отбора) можно разрушать посредством добавления вещества (например, конкурентного реактива), тем самым делая ассоциирование средства (например, рецептор-связывающего средства или средства отбора) и реактива обратимым.

[0202] Реактивы, которые можно использовать в таких обратимых системах, описаны и известны в данной области, см. например, патенты США №№ 5168049; 5506121; 6103493; 7776562; 7981632; 8298782; 8735540; 9023604; и международные опубликованные заявки PCT №№ WO2013/124474 и WO2014/076277. Неограничивающие примеры реактивов и партнеров связывания, способных к формированию обратимого взаимодействия, а также веществ (например, конкурентных реактивов), способных к обращению такого связывания, описаны далее.

A. Реактив

[0203] В некоторых вариантах осуществления реактив содержит один или множество сайтов связывания Z, которые способны к обратимому связыванию с партнерами связывания C, которое содержит средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора). В некоторых вариантах осуществления реактив содержит множество сайтов связывания Z, каждый из которых способен к специфическому связыванию с партнером связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), так что реактив способен к обратимому связыванию с множеством средств (например, рецептор-связывающим средством или средством отбора), например, представляет собой реактив мультимеризации. В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой олигомер или полимер индивидуальных молекул (например, мономеров) или комплексов, которые образуют индивидуальную молекулу (например, тетрамер), каждое содержит по меньшей мере один сайт связывания Z. В некоторых вариантах осуществления реактив содержит по меньшей мере два сайта связывания Z, по меньшей мере три сайта связывания Z, по меньшей мере четыре сайта связывания Z, например, по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72 или больше сайтов связывания Z. Все сайты связывания могут представлять одно и то же или множество сайтов связывания могут содержать один или несколько различных сайтов связывания (например, Z1, Z2, Z3 и т.д.).

[0204] В некоторых вариантах осуществления два или больше средств (например, рецептор-связывающих средств или средств отбора) ассоциируют с, например, обратимо связывают с, реактивом, например, через один или множество сайтов связывания Z, присутствующих на реактиве. В некоторых случаях, это ведет к средствам (например, рецептор-связывающим средствам или средствам отбора), расположенным близко друг с другу так, что эффект авидности может иметь место, если клетку-мишень, имеющую молекулу (по меньшей мере две ее копии) клеточной поверхности, приводят в контакт со средством (например, рецептор-связывающим средством или средством отбора), которое имеет один или несколько сайтов связывания B, способных к связыванию конкретной молекулы.

[0205] В некоторых вариантах осуществления два или больше различных средств (например, рецептор-связывающих средств или средств отбора), которые представляют собой одно и то же, т.е. содержат один и тот же сайт связывания B, можно обратимо связывать с реактивом. В некоторых вариантах осуществления возможно использовать по меньшей мере два различных средства (типа) (например, рецептор-связывающие средства или средства отбора), и в некоторых случаях, три или четыре различных средства (типа), например, два или больше различных рецептор-связывающих средств и/или средство отбора. Например, в некоторых вариантах осуществления реактив можно обратимо связывать с первым средством (например, рецептор-связывающим средством или средством отбора), содержащим сайт связывания B1, B2, B3 или B4 и т.д., и вторым средством (например, рецептор-связывающим средством или средством отбора), содержащим другой сайт связывания, например, другой сайт связывания B1, B2, B3 или B4. В некоторых случаях, сайт связывания первого средства и второго средства может представлять собой одно и то же. Например, в некоторых аспектах, каждое из по меньшей мере двух средств (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) может связываться с одной и той же молекулой. В некоторых случаях, сайт связывания первого средства и второго средства может отличаться. В некоторых аспектах, каждое из по меньшей мере двух средств (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) может связываться с отличающейся молекулой, такой как первая молекула, вторая молекула и так далее. В некоторых случаях, различные молекулы, такие как молекулы клеточной поверхности, могут присутствовать на одной и той же клетке-мишени. В других случаях, различные молекулы, такие как молекулы клеточной поверхности, могут присутствовать на различных клетках-мишенях, которые присутствуют в одной и той же популяции клеток. В определенном случае, третье, четвертое и так далее средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) можно ассоциировать с одним и тем же реактивом, каждое содержит дополнительный отличающийся сайт связывания.

[0206] В некоторых вариантах осуществления два или больше различных средств (например, рецептор-связывающие средства или средства отбора) содержат один и тот же партнер связывания C. В некоторых вариантах осуществления два или больше различных средств (например, рецептор-связывающие средства или средства отбора) содержат различные партнеры связывания. В некоторых аспектах, первое средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) может иметь партнер связывания C1, который может специфически связываться с сайтом связывания Z1, присутствующим на реактиве, и второе средство (например, рецептор-связывающие средства или средство отбора) может иметь партнер связывания C2, который может специфически связываться с сайтом связывания Z1 или с сайтом связывания Z2, присутствующими на реактиве. Таким образом, в некоторых случаях, множество сайтов связывания Z, содержащихся в реактиве, включает сайты связывания Z1 и Z2, которые способны к обратимому связыванию с партнерами связывания C1 и C2, соответственно, содержащимися в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора). В некоторых вариантах осуществления C1 и C2 представляют собой одно и то же и/или Z1 и Z2 представляют собой одно и то же. В других аспектах, один или несколько из множества сайтов связывания Z могут отличаться. В других случаях, один или несколько из множества партнеров связывания C могут отличаться. Специалист в данной области способен выбрать любую комбинацию различных партнеров связывания C, которые совместимы с реактивом, содержащим сайты связывания Z, до тех пор пока каждый из партнеров связывания C способен взаимодействовать, например, специфически связываться, с одним из сайтов связывания Z.

[0207] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой стрептавидин, мутеин или аналог стрептавидина, авидин, мутеин или аналог авидина (такой как нейтравидин) или их смесь, где такой реактив содержит один или несколько сайтов связывания Z для обратимого ассоциирования с партнером связывания C. В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C может представлять собой биотин, производное или аналог биотина или стрептавидин-связывающий пептид или другую молекулу, которая способна к специфическому связыванию со стрептавидином, мутеином или аналогом стрептавидина, авидином или мутеином или аналогом авидина. В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой или содержит стрептавидин, авидин, аналог или мутеин стрептавидина, или аналог или мутеин авидина, который обратимо связывает биотин, аналог биотина или его биологически активный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой или содержит аналог или мутеин стрептавидина или аналог или мутеин авидина, который обратимо связывает стрептавидин-связывающий пептид. В некоторых вариантах осуществления вещество (например, конкурентный реактив) может представлять собой биотин, производное или аналог биотина или стрептавидин-связывающий пептид, способный к конкуренции за связывание с партнером связывания C за один или несколько сайтов связывания Z. В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C и вещество (например, конкурентный реактив) являются различными, и вещество (например, конкурентный реактив) демонстрирует более высокую аффинность связывания с одним или несколькими сайтами связывания Z по сравнению с аффинностью партнера связывания.

[0208] В некоторых вариантах осуществления стрептавидин может представлять собой стрептавидин дикого типа, мутеины или аналоги стрептавидина, такие как стрептавидиноподобные полипептиды. Аналогичным образом, авидин, в некоторых аспектах, включает авидин дикого типа или мутеины или аналоги авидина, такие как нейтравидин, дегликозилированный авидин с модифицированными аргининами, который обычно демонстрирует более нейтральный pi и доступен в качестве альтернативы нативному авидину. В целом, дегликозилированные нейтральные формы авидина включают коммерчески доступные формы, такие как «Extravidin», доступный в Sigma Aldrich, или «Neutravidin», доступный в Thermo Scientific или Invitrogen, например.

[0209] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой стрептавидин или мутеин или аналог стрептавидина. В некоторых вариантах осуществления стрептавидин дикого типа (wt-стрептавидин) имеет аминокислотную последовательность, раскрытую в Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882 (SEQ ID № 1). В целом, стрептавидин в природе встречается в виде тетрамера из четырех идентичных субъединиц, т.е. он представляет собой гомотетрамер, где каждая субъединица содержит один сайт связывания для биотина, производного или аналога биотина или имитатора биотина. Образцовая последовательность субъединицы стрептавидина представляет собой последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID № 1, но такая последовательность также может включать последовательность, присутствующую в ее гомологах из других видов Streptomyces. В частности, каждая субъединица стрептавидина может проявлять высокую аффинность связывания с биотином с равновесной константой диссоциации (K_D) порядка приблизительно 10^-14 M. В некоторых случаях, стрептавидин может существовать в виде одновалентного тетрамера, в котором только один из четырех сайтов связывания функционален (Howarth et al. (2006) Nat. Methods, 3:267-73; Zhang et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63)), двухвалентного тетрамера, в котором два из четырех сайтов связывания являются функциональными (Fairhead et al. (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214), или может присутствовать в мономерной или димерной форме (Wu et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31; Lim et al. (2010) Biochemistry, 50:8682-91).

[0210] В некоторых вариантах осуществления стрептавидин может быть в любой форме, например, дикого типа или немодифицированный стрептавидин, такой как стрептавидин из видов Streptomyces или его функционально активный фрагмент, который содержит по меньшей мере одну функциональную субъединицу, содержащую сайт связывания для биотина, производного или аналога биотина или имитатора биотина, например, в целом содержит по меньшей мере одну функциональную субъединицу стрептавидина дикого типа из Streptomyces avidinii, приведенную в SEQ ID № 1, или ее функционально активный фрагмент. Например, в некоторых вариантах осуществления стрептавидин может содержать фрагмент стрептавидина дикого типа, который укорочен с N- и/или C-конца. Такие минимальные стрептавидины включают любой, который начинается на N-конце с области аминокислотных положений с 10 до 16 в SEQ ID № 1 и заканчивается на C-конце в области аминокислотных положений с 133 до 142 в SEQ ID № 1. В некоторых вариантах осуществления функционально активный фрагмент стрептавидина содержит последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID № 2. В некоторых вариантах осуществления стрептавидин, например, приведенный в SEQ ID № 2, дополнительно может содержать N-концевой метионин в положении, соответствующем Ala13 по нумерации, приведенной в SEQ ID № 1. Указание положения остатков в стрептавидине или мутеинах стрептавидина приведено в отношении нумерации остатков в SEQ ID № 1.

[0211] В некоторых аспектах, мутеины стрептавидина включают полипептиды, которые отличаются от последовательности немодифицированного стрептавидина или стрептавидина дикого типа одной или несколькими заменами, делециями или добавлениями аминокислот, но которые содержат по меньшей мере одну функциональную субъединицу, содержащую сайт связывания для биотина, производного или аналога биотина или стрептавидин-связывающего пептида. В некоторых аспектах, стрептавидиноподобные полипептиды и мутеины стрептавидина могут представлять собой полипептиды, которые по существу иммунологически эквивалентны стрептавидину дикого типа и способны к специфическому связыванию биотина, производных биотина или аналогов биотина с той же аффинностью, что у wt-стрептавидина, или другой. В некоторых случаях, стрептавидиноподобные полипептиды или мутеины стрептавидина могут содержать аминокислоты, которые не являются частью стрептавидина дикого типа, или они могут содержать только часть стрептавидина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления стрептавидиноподобные полипептиды представляют собой полипептиды, которые не идентичны стрептавидину дикого типа, поскольку организм-хозяин не имеет ферменты, которые необходимы для того, чтобы трансформировать продуцируемый организмом-хозяином полипептид в структуру стрептавидина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления стрептавидин также может быть представлен в виде тетрамеров стрептавидина и димеров стрептавидина, в частности, гомотетрамеров стрептавидина, гомодимеров стрептавидина, гетеротетрамеров стрептавидина и гетеродимеров стрептавидина. В целом, каждая субъединица обычно имеет сайт связывания для биотина или аналогов биотина или для стрептавидин-связывающих пептидов. Примеры стрептавидинов или мутеинов стрептавидина указаны, например, в WO 86/02077, DE 19641876 A1, US 6022951, WO 98/40396 или WO 96/24606.

[0212] В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина может содержать аминокислоты, которые не являются частью немодифицированного стрептавидина или стрептавидина дикого типа или могут содержать только часть стрептавидина дикого типа или немодифицированного стрептавидина. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит по меньшей мере одну субъединицу, которая может иметь одну или несколько замен аминокислот по сравнению с субъединицей немодифицированного стрептавидина или стрептавидина дикого типа, например, по сравнению с субъединицей стрептавидина дикого типа, приведенной в SEQ ID № 1, или ее функционально активный фрагмент, например, приведенный в SEQ ID № 2. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна субъединица мутеина стрептавидина может иметь по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных различий по сравнению со стрептавидином дикого типа или немодифицированным стрептавидином и/или содержит по меньшей мере одну субъединицу, которая содержит аминокислотную последовательность, которая проявляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID № 1 или 2, где такой мутеин стрептавидина демонстрирует функциональную активность по связыванию биотина, производного или аналога биотина или имитатора биотина. В некоторых вариантах осуществления замены аминокислот представляют собой консервативные или неконсервативные мутации. Примеры мутеинов стрептавидина известны в данной области, см., например, патенты США №№ 5168049; 5506121; 6022951; 6156493; 6165750; 6103493; или 6368813; или международную опубликованную заявку PCT № WO2014/076277.

[0213] В некоторых вариантах осуществления стрептавидин или мутеин стрептавидина включает белки, содержащие одну или больше чем одну функциональную субъединицу, содержащую один или несколько сайтов связывания Z для биотина, производного или аналога биотина или стрептавидин-связывающего пептида, например, две или больше, три или больше, четыре или больше и, в некоторых случаях, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше функциональных субъединиц. В некоторых вариантах осуществления стрептавидин или мутеин стрептавидина может включать мономер; димер, в том числе гетеродимер или гомодимер; тетрамер, в том числе гомотетрамер, гетеротетрамер, одновалентный тетрамер или двухвалентный тетрамер; или может включать его мультимеры или олигомеры более высокого порядка.

[0214] В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания стрептавидина или мутеина стрептавидина с партнером связывания пептидного лиганда составляет меньше чем 1×10^-4 M, 5×10^-4 M, 1×10^-5 M, 5×10^-5 M, 1×10^-6 M, 5×10^-6 M или 1×10^-7 M, но в целом больше чем 1×10^-13 M, 1×10^-12 M или 1×10^-11 M. Например, пептидные последовательности (Strep-метки), такие как раскрыто в патенте США № 5506121, могут действовать в качестве имитаторов биотина и демонстрировать аффинность связывания со стрептавидином, например, с K_D приблизительно между 10^-4 M и 10^-5 M. В некоторых случаях, аффинность связывания дополнительно можно усовершенствовать, создавая мутацию в молекуле стрептавидина, см., например, патент США № 6103493 или международную опубликованную заявку PCT № WO2014/076277. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания можно определять известными в данной области способами, такими как любые описанные далее.

[0215] В некоторых вариантах осуществления реактив, такой как стрептавидин или мутеин стрептавидина, демонстрирует аффинность связывания с партнером связывания пептидного лиганда, этот партнер связывания пептидного лиганда может представлять собой партнер связывания C, присутствующий в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора). В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность содержит последовательность с общей формулой, приведенной в SEQ ID № 9, например, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID № 10. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность имеет общую формулу, приведенную в SEQ ID № 11, например, приведенную в SEQ ID № 12. В одном из примеров, пептидная последовательность представляет собой Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (также называемую Strep-tag^®, которая приведена в SEQ ID № 7). В одном из примеров, пептидная последовательность представляет собой Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (также называемую Strep-tag^® II, которая приведена в SEQ ID № 8). В некоторых вариантах осуществления пептидный лиганд содержит последовательную компоновку из по меньшей мере двух стрептавидин-связывающих модулей, в которой расстояние между двумя модулями составляет по меньшей мере 0 и не больше чем 50 аминокислот, где один связывающий модуль имеет от 3 до 8 аминокислот и содержит по меньшей мере последовательность His-Pro-Xaa (SEQ ID № 9), где Xaa представляет собой глутамин, аспарагин или метионин, и где другой связывающий модуль имеет тот же или отличающийся пептидный лиганд стрептавидина, например, приведенный в SEQ ID № 11 (см., например, международную опубликованную заявку PCT № WO02/077018; патент США № 7981632). В некоторых вариантах осуществления пептидный лиганд содержит последовательность, имеющую формулу, приведенную в любой из SEQ ID № 13 или 14. В некоторых вариантах осуществления пептидный лиганд имеет последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID №№ 15-19.

[0216] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой или содержит мутеин стрептавидина. В некоторых вариантах осуществления мутеины стрептавидина содержат одну или несколько мутаций (например, замены аминокислот) по сравнению со стрептавидином дикого типа, приведенным в SEQ ID № 1, или его биологически активной частью. Например, биологически активные части стрептавидина могут включать варианты стрептавидина, укороченные на N- и/или C-конце, которые в некоторых случаях называют минимальным стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления укороченный на N-конце минимальный стрептавидин, в котором можно выполнять любую из мутаций, начинается на N-конце в области аминокислотных положений с 10 до 16 и заканчивается на C-конце в области аминокислотных положений с 133 до 142 по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID № 1. В некоторых вариантах осуществления укороченный на N-конце стрептавидин, в котором можно выполнять любые из мутаций, содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID № 2. В некоторых вариантах осуществления минимальный стрептавидин содержит аминокислотную последовательность от положения Ala13 до Ser139 и необязательно имеет N-концевой остаток метионина вместо Ala13. Для целей настоящего описания нумерация аминокислотных положений относится на всем протяжении к нумерации wt-стрептавидина, приведенного в SEQ ID № 1 (например, Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871-1882, см. также фиг. 3).

[0217] В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина представляет собой мутант, как описано в патенте США № 6103493. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит по меньшей мере одну мутацию в области аминокислотных положений с 44 до 53, на основании аминокислотной последовательности стрептавидина дикого типа, например, приведенной в SEQ ID № 1. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит мутацию в одном или нескольких остатках 44, 45, 46 и/или 47. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит замену Glu в положении 44 стрептавидина дикого типа на гидрофобную алифатическую аминокислоту, например, Val, Ala, Ile или Leu, любую аминокислоту в положении 45, алифатическую аминокислоту, такую как гидрофобная алифатическая аминокислота, в положении 46 и/или замену Val в положении 47 на основную аминокислоту, например, Arg или Lys, например, обычно Arg. В некоторых вариантах осуществления Ala находится в положении 46 и/или Arg находится в положении 47 и/или Val или Ile находится в положении 44. В некоторых вариантах осуществления мутант стрептавидина содержит остатки Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷, такие как изложено в образцовых мутеинах стрептавидина, содержащих последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID № 3 или SEQ ID № 4 (также известной как мутант стрептавидина 1, SAM1). В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит остатки Ile⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷, такие как изложено в образцовых мутеинах стрептавидина, содержащих последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID № 5 или 6 (также известной как SAM2). В некоторых случаях, такие мутеины стрептавидина описаны, например, в патенте США 6103493, и коммерчески доступны под торговой маркой Strep-Tactin^®.

[0218] В определенном варианте осуществления, мутеин стрептавидина представляет собой мутант, как описано в международной опубликованной заявке PCT № WO 2014/076277. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит по меньшей мере два остатка цистеина в области аминокислотных положений с 44 до 53 относительно аминокислотных положений, приведенных в SEQ ID № 1. В некоторых вариантах осуществления остатки цистеина присутствуют в положениях 45 и 52 для того, чтобы создавать дисульфидный мостик, соединяющий эти аминокислоты. В таком варианте осуществления, аминокислота 44 обычно представляет собой глицин или аланин и аминокислота 46 обычно представляет собой аланин или глицин и аминокислота 47 обычно представляет собой аргинин. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит по меньшей мере одну мутацию или аминокислотное различие в области аминокислотных остатков с 115 до 121 относительно аминокислотных положений, приведенных в SEQ ID № 1. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит по меньшей мере одну мутацию в аминокислотном положении 117, 120 и 121 и/или делецию аминокислот 118 и 119 и замену по меньшей мере аминокислотного положения 121.

[0219] В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит мутацию в положении, соответствующем положению 117, эта мутация может представлять собой мутацию в большой гидрофобный остаток, такой как Trp, Tyr или Phe, или заряженный остаток, такой Glu, Asp или Arg, или гидрофильный остаток, такой как Asn или Gln, или, в некоторых случаях, гидрофобные остатки Leu, Met или Ala, или полярные остатки Thr, Ser или His. В некоторых вариантах осуществления мутацию в положении 117 комбинируют с мутацией в положении, соответствующем положению 120, эта мутация может представлять собой мутацию в небольшой остаток, такой как Ser или Ala или Gly, и мутацией в положении, соответствующем положению 121, эта мутация может представлять мутацию в гидрофобный остаток, такой как объемный гидрофобный остаток, такой как Trp, Tyr или Phe. В некоторых вариантах осуществления мутацию в положении 117 комбинируют с мутацией в положении, соответствующем положению 120 стрептавидина дикого типа, приведенного в SEQ ID № 1, или его биологически активного фрагмента, эта мутация может представлять собой гидрофобный остаток, такой как Leu, Ile, Met или Val, или, обычно, Tyr или Phe, и мутацией в положении, соответствующем положению 121, по сравнению с положениями стрептавидина дикого типа, приведенного в SEQ ID № 1, или его биологически активного фрагмента, эта мутация может представлять собой мутацию в небольшой остаток, такой как Gly, Ala или Ser, или с Gln или с гидрофобным остатком, таким как Leu, Val, Ile, Trp, Tyr, Phe или Met. В некоторых вариантах осуществления такие мутеины также могут содержать остатки Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ или остатки Ile⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит остатки Val⁴⁴, Thr⁴⁵, Ala⁴⁶, Arg⁴⁷, Glu¹¹⁷, Gly¹²⁰ и Tyr¹²¹. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID № 27 или SEQ ID № 28, или последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID № 27 или SEQ ID № 28, содержит остатки Val⁴⁴, Thr⁴⁵, Ala⁴⁶, Arg⁴⁷, Glu¹¹⁷, Gly¹²⁰ и Tyr¹²¹ и демонстрирует функциональную активность по связыванию с биотином, аналогом биотина или стрептавидин-связывающим пептидом.

[0220] В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина может содержать любые из вышеуказанных мутаций в любой комбинации и получаемый мутеин стрептавидина может демонстрировать аффинность связывания, которая составляет меньше чем 2,7×10^-4 M для пептидного лиганда (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; также называемого Strep-tag^®, который приведен в SEQ ID № 7) и/или меньше чем 1,4×10^-4 M для пептидного лиганда (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; также называемого Strep-tag^® II, который приведен в SEQ ID № 8) и/или составляет меньше чем 1×10^-4 M, 5×10^-4 M, 1×10^-5 M, 5×10^-5 M, 1×10^-6 M, 5×10^-6 M или 1×10^-7 M, но в целом больше чем 1×10^-13 M, 1×10^-12 M или 1×10^-11 M для любого из пептидных лигандов, приведенных в любой из SEQ ID №№ 7-19.

[0221] В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина имеет последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID №№ 3-6, 27 или 28, или последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с последовательностью аминокислот, приведенной в любой из SEQ ID № 3-6, 27 или 28, и демонстрирует аффинность связывания, которая меньше чем 2,7×10^-4 M для пептидного лиганда (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; также называемого Strep-tag^®, который приведен в SEQ ID № 7) и/или меньше чем 1,4×10^-4 M для пептидного лиганда (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; также называемого Strep-tag^® II, который приведен в SEQ ID № 8) и/или составляет меньше чем 1×10^-4 M, 5×10^-4 M, 1×10^-5 M, 5×10^-5 M, 1×10^-6 M, 5×10^-6 M или 1×10^-7 M, но в целом больше чем 1×10^-13 M, 1×10^-12 M или 1×10^-11 M для любого из пептидных лигандов, приведенных в любой из SEQ ID №№ 7-19.

[0222] В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина также демонстрирует связывание с другими лигандами стрептавидина, такими как, но не ограничиваясь этим, биотин, иминобиотин, липоевая кислота, дестиобиотин, диаминобиотин, HABA (гидроксиазобензолбензойная кислота) и/или диметил-HABA. В некоторых вариантах осуществления мутеин стрептавидина демонстрирует аффинность связывания с другим лигандом стрептавидина, таким как биотин или дестиобиотин, которая больше аффинности связывания мутеина стрептавидина с пептидным лигандом имитатора биотина, например, который приведен в любой из SEQ ID №№ 7-19. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления биотин или аналог или производное биотина (например, дестиобиотин) можно использовать в качестве конкурентного реактива в предоставленных способах. Например, в качестве примера, взаимодействие мутеина стрептавидина, обозначаемого Strep-tactin^® (например, содержащего последовательность, приведенную в SEQ ID № 4), с пептидным лигандом, обозначаемым Strep-tag^® II (например, приведенным в SEQ ID № 8), характеризуют аффинностью связывания с K_D приблизительно 10^-6 M по сравнению с приблизительно 10^-13 M для взаимодействия биотин-стрептавидин. В некоторых случаях, биотин, которsй может связываться с высокой аффинностью с Strep-tactin^® с KD между или между приблизительно 10^-10 и 10^-13 M, может конкурировать с Strep-tag^® II за сайт связывания.

[0223] В некоторых случаях, реактив содержит по меньшей мере две хелатирующие группы K, которые могут быть способны к связыванию с ионом переходного металла. В некоторых вариантах осуществления реактив может быть способен к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, глутатион-S-трансферазой, кальмодулином или его аналогом, кальмодулин-связывающим пептидом (CBP), FLAG-пептидом, HA-меткой, мальтоза-связывающим белком (MBP), эпитопом HSV, эпитопом myc и/или биотинилированным белком-переносчиком.

[0224] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой олигомер или полимер. В некоторых вариантах осуществления олигомер или полимер можно создавать, соединяя непосредственно или опосредованно индивидуальные молекулы белка, как он существует в природе, непосредственно или опосредованно соединяя индивидуальные молекулы мономера или комплекса субъединиц, которые образуют индивидуальную молекулу (например, непосредственно или опосредованно соединяя димеры, тримеры, тетрамеры и т.д. белка, как он существует в природе). Например, тетрамерный гомодимер или гетеродимер стрептавидина или авидин можно обозначать как индивидуальную молекулу или наименьший строительный блок соответствующего олигомера или полимера. В некоторых вариантах осуществления олигомер или полимер может содержать связь для по меньшей мере 2 индивидуальных молекул белка (например, представляет собой 2-мер) или может представлять собой по меньшей мере 3-мер, 4-мер, 5-мер, 6-мер, 7-мер, 8-мер, 9-мер, 10-мер, 11-мер, 12-мер, 13-мер, 14-мер, 15-мер, 16-мер, 17-мер, 18-мер, 19-мер, 20-мер, 25-мер, 30-мер, 35-мер, 40-мер, 45-мер или 50-мер из индивидуальных молекул белка (например, мономеры, тетрамеры).

[0225] Олигомеры можно создавать с использованием любых известных в данной области способов, например, любых описанных в опубликованной патентной заявке США № US2004/0082012. В некоторых вариантах осуществления олигомер или полимер содержит две или больше индивидуальные молекулы, которые можно сшивать, например, с помощью полисахарида или бифункционального линкера.

[0226] В некоторых вариантах осуществления олигомер или полимер получают посредством сшивки индивидуальных молекул или комплекса субъединиц, которые образуют индивидуальную молекулу, в присутствии полисахарида. В некоторых вариантах осуществления олигомеры или полимеры можно получать посредством введения карбоксильных остатков в полисахарид, например, декстран. В некоторых аспектах, индивидуальные молекулы реактива (например, мономеры, тетрамеры) можно сопрягать через первичные аминогруппы внутренних остатков лизина и/или свободный N-конец с карбоксильными группами в остове декстрана с использованием стандартных реакций с карбодиимидом. В некоторых вариантах осуществления реакцию сочетания осуществляют при молярном соотношении приблизительно 60 молей индивидуальных молекул реактива (например, мономеров, тетрамеров) на моль декстрана.

[0227] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой олигомер или полимер одного или нескольких из стрептавидина или авидина или любого аналога или мутеина стрептавидина (например, Strep-Tactin® or Strep-Tactin® XT) или аналога или мутеина авидина (например, нейтравидина). В некоторых вариантах осуществления сайт связывания Z представляет собой природный сайт связывания биотина в авидине или стрептавидине, для которого может быть вплоть до четырех сайтов связывания в индивидуальной молекуле (например, тетрамер содержит четыре сайта связывания Z), в соответствии с чем гомотетрамер может содержать вплоть до 4 сайтов связывания, которые представляют собой одно и то же, т. е. Z1, тогда как гетеротетрамер может содержать вплоть до 4 сайтов связывания, которые могут быть различными, например, содержать Z1 и Z2. В некоторых вариантах осуществления олигомер создают или получают из множества индивидуальных молекул (например, множества гомотетрамеров) одного и того же стрептавидина, мутеина стрептавидина, авидина или мутеина авидина, и в этом случае каждый сайт связывания Z, например, Z1, олигомера представляет собой одно и то же. Например, в некоторых случаях, олигомер может содержать множество сайтов связывания Z1, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 или больше сайтов связывания Z1. В некоторых вариантах осуществления олигомер создают или получают из множества индивидуальных молекул, которые могут представлять собой гетеротетрамеры стрептавидина, мутеина стрептавидина, авидина или мутеина авидина, и/или из множества из двух или больше различных индивидуальных молекул (например, различные гомотетрамеры) стрептавидина, мутеина стрептавидина, авидина или мутеина авидина, которые различаются своими сайтами связывания Z, например, Z1 и Z2, и в этом случае в олигомере может присутствовать множество различных сайтов связывания Z, например, Z1 и Z2. Например, в некоторых случаях, олигомер может содержать множество сайтов связывания Z1 и множество сайтов связывания Z, которые, в комбинации, могут включать по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 или больше комбинированных сайтов связывания Z1 и Z2.

[0228] В некоторых случаях, соответствующий олигомер или полимер можно сшивать с помощью полисахарида. В одном из вариантов осуществления олигомеры или полимеры стрептавидина или авидина или аналогов стрептавидина или авидина (например, нейтравидина) можно получать посредством введения карбоксильных остатков в полисахарид, например, декстран, по существу как описано в Noguchi, A, et al., Bioconjugate Chemistry (1992) 3132-137 на первой стадии. В некоторых таких аспектах, затем стрептавидин или авидин или их аналоги можно связывать через первичные аминогруппы внутреннего остатка лизина и/или свободный N-конец с карбоксильными группами в остове декстрана, используя стандартную химическую реакцию с карбодиимидом на второй стадии. В некоторых случаях, сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина или авидина или любого аналога стрептавидина или авидина также можно получать посредством сшивки через бифункциональные молекулы, служащие в качестве линкера, такие как глутардиальдегид, или с помощью других способов, описанных в данной области.

[0229] В некоторых вариантах осуществления олигомер или полимер получают посредством сшивки индивидуальных молекул или комплекса субъединиц, которые образуют индивидуальную молекулу, используя бифункциональный линкер или другой химический линкер, такой как глутардиальдегид, или посредством других известных в данной области способов. В некоторых аспектах, сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина или авидина или любого мутеина или аналога стрептавидина или авидина можно получать посредством сшивки индивидуальных молекул стрептавидина или авидина через бифункциональные молекулы, служащие в качестве линкера, такие как глутардиальдегид, или другими способами, описанными в данной области. например, возможно создавать олигомеры мутеинов стрептавидина посредством введения тиоловых групп в мутеин стрептавидина (это можно выполнять, например, посредством реакции мутеина стрептавидина с 2-иминотиоланом (реактивом Трота) и посредством активации, например, в отдельной реакции, аминогрупп, доступных в мутеине стрептавидина. В некоторых вариантах осуществления этой активации аминогрупп можно достичь посредством реакции мутеина стрептавидина с коммерчески доступным гетеробифункциональным сшивателем, таким как сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) или сукцинимидил-6-[(β-малеимидопропионамидо)гексаноат (SMPH). В некоторых таких вариантах осуществления два продукт реакции, полученные таким образом, смешивают вместе, что обычно ведет к реакции тиоловых групп, содержащихся в одной партии модифицированного мутеина стрептавидина, с активированными (например, с помощью малеимидных функций) аминокислот другой партии модифицированного мутеина стрептавидина. В некоторых случаях, с помощью этой реакции формируют мультимеры/олигомеры мутеина стрептавидина. Эти олигомеры могут иметь любое подходящее число индивидуальных молекул, такое как по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 или больше, и степень олигомеризации может варьировать в соответствии с условиями реакции.

[0230] В некоторых вариантах осуществления олигомерный или полимерный реактив можно выделять с помощью эксклюзионной хроматографии, и любую желаемую фракцию можно использовать в качестве реактива. Например, в некоторых вариантах осуществления, после реакции модифицированного мутеина стрептавидина, в присутствии 2-иминотиолана и гетеробифункционального сшивателя, такого как сульфо-SMCC, олигомерный или полимерный реактив можно выделять с помощью эксклюзионной хроматографии, и любую желаемую фракцию можно использовать в качестве реактива. В некоторых вариантах осуществления олигомеры не имеют (и не должны иметь) единую молекулярную массу, но они могут иметь статистическое распределение масс, такое как распределение Гаусса. В некоторых случаях, любой олигомер с больше чем тремя тетрамерами стрептавидина или мутеина, например, гомотетрамерами или гетеротетрамерами, можно использовать в качестве растворимого реактива, например, обычно от 3 до 50 тетрамеров, например, гомотетрамеров или гетеротетрамеров, от 10 до 40 тетрамеров, например, гомотетрамеров или гетеротетрамеров, или от 25 до 35 тетрамеров, например, гомотетрамеров или гетеротетрамеров. Олигомеры могут иметь, например, от 3 до 25 тетрамеров мутеина стрептавидина, например, гомотетрамеров или гетеротетрамеров. В некоторых аспектах, при молекулярной массе приблизительно 50 кДа для мутеинов стрептавидина, растворимые олигомеры могут иметь молекулярную массу приблизительно от 150 кДа приблизительно до 2000 кДа, приблизительно от 150 кДа приблизительно до 1500 кДа, приблизительно от 150 кДа приблизительно до 1250 кДа, приблизительно от 150 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 150 кДа приблизительно до 500 кДа или приблизительно от 150 кДа приблизительно до 300 кДа, приблизительно от 300 кДа приблизительно до 2000 кДа, приблизительно от 300 кДа приблизительно до 1500 кДа, приблизительно от 300 кДа приблизительно до 1250 кДа, приблизительно от 300 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 300 кДа приблизительно до 500 кДа, приблизительно от 500 кДа приблизительно до 2000 кДа, приблизительно от 500 кДа приблизительно до 1500 кДа, приблизительно от 500 кДа приблизительно до 1250 кДа, приблизительно от 500 кДа до 1000 кДа, приблизительно от 1000 кДа приблизительно до 2000 кДа, приблизительно от 1000 кДа приблизительно до 1500 кДа, приблизительно от 1000 кДа приблизительно до 1250 кДа, приблизительно от 1250 кДа приблизительно до 2000 кДа или приблизительно от 1500 кДа приблизительно до 2000 кДа. В целом, поскольку каждая молекула стрептавидина/мутеина имеет четыре сайта связывания биотина, такой реактив может предоставлять от 12 до 160 сайтов связывания Z, например, от 12 до 100 сайтов связывания Z.

1. Формат реактива

a. Основа

[0231] В некоторых вариантах осуществления реактив содержится на основе, такой как твердый носитель или поверхность, например, бусина или стационарная фаза (хроматографическая матрица). В некоторых таких вариантах осуществления, реактив обратимо иммобилизуют на основе. В некоторых случаях реактив иммобилизуют на основе через ковалентные связи. В некоторых аспектах, реактив обратимо иммобилизуют на основе нековалентно.

[0232] В некоторых вариантах осуществления основа представляет собой твердый носитель. Любой твердый носитель (поверхность) можно использовать для обратимой иммобилизации реактива. Иллюстративные примеры твердых носителей, на которых реактив можно иммобилизовать, включают магнитную бусину, полимерную бусину, планшет для клеточной культуры, микротитровальный планшет, мембрану или полое волокно. В некоторых аспектах, полые волокна можно использовать в качестве биореактора в Quantum^® Cell Expansion System, доступной в TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA). В некоторых вариантах осуществления реактив ковалентно прикрепляют к твердому носителю. В других вариантах осуществления нековалентные взаимодействия также можно использовать для иммобилизации, например, на пластмассовых подложках. В некоторых вариантах осуществления реактив может представлять собой, например, стрептавидин или мутеин авидина, который обратимо связывает стрептавидин-связывающий пептид. Такие мутеины стрептавидина можно ковалентно прикреплять к любой поверхности, например, смоле (бусам), используемой для хроматографической очистки и коммерчески доступной в такой форме в IBA GmbH, Gottingen, например, в виде Strep-Tactin^® Sepharose, Strep-Tactin^® Superflow^®, Strep-Tactin^® Superflow^® высокой емкости или Strep-Tactin^® MacroPrep^®. Другие иллюстративные примеры, которые легко коммерчески доступны, представляют собой иммобилизованные металлические смолы для аффинной хроматографии (IMAC), такие как смолы TALON^® (Westburg, Leusden, The Netherlands), которые можно использовать для обратимой иммобилизации белков с олигогистидиновыми метками (гистидиновыми метками), например, для обратимого связывания средства (например, рецептор-связывающего средства или средства отбора), которое содержит в качестве партнера связывания C олигогистидиновую метку, такую как пента- или гексагистидиновая метка. Другие примеры включают кальмодулиновую сефарозу, доступную в GE Life Sciences, которую можно использовать вместе со средством (например, рецептор-связывающим средством или средством отбора), которое содержит кальмодулин-связывающий пептид в качестве партнера связывания C, или сефарозу, с которой связан глутатион. В некоторых таких случаях, партнер связывания C представляет собой глутатион-S-трансферазу.

[0233] В некоторых вариантах осуществления основа содержит стационарную фазу. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления реактив содержится на стационарной фазе (также называемой хроматографической матрицей). В некоторых таких вариантах осуществления, реактив обратимо иммобилизуют на стационарной фазе. В некоторых случаях реактив обратимо иммобилизуют на стационарной фазе через ковалентные связи. В некоторых аспектах, реактив обратимо иммобилизуют на стационарной фазе нековалентно.

[0234] Любой материал можно использовать в качестве хроматографической матрицы. В целом, подходящий хроматографический материал является по существу безвредным, т.е. не вредоносным для жизнеспособности клеток, например, когда используют в набитой хроматографической колонке при желаемых условиях. В некоторых вариантах осуществления стационарная фаза остается в предварительно определяемом местоположении, таком как предварительно определяемое положение, тогда как местоположение образца изменяют. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления стационарная фаза представляет собой часть хроматографической системы, через которую подвижная фаза течет (в проточном или порционном режиме) и где происходит распределение компонентов, содержащихся в жидкой фазе, (растворенных или диспергированных) между фазами.

[0235] В некоторых вариантах осуществления хроматографическая матрица имеет форму твердой или полутвердой фазы, тогда как образец, который содержит клетку-мишень, подлежащую выделению/отделению, представляет собой текучую фазу. Хроматографическая матрица может представлять собой материал в виде частиц (любого подходящего размера и геометрической формы) или монолитный хроматографический материал, в том числе бумажную подложку или мембрану. Таким образом, в некоторых аспектах, хроматография может представлять собой как колоночную хроматографию, так и плоскостную хроматографию. В некоторых вариантах осуществления в дополнение к стандартным хроматографическим колонкам, колонки, допускающие двунаправленный поток, такие как колонки PhyTip^®, доступные в PhyNexus, Inc. San Jose, CA, U.S.A., или наконечники пипетки можно использовать для способов, основанных на колонках/основанных на проточном режиме. Таким образом, в некоторых случаях, наконечники пипетки или колонки, допускающие двунаправленный поток, также содержатся хроматографическими колонками, которые можно использовать в представленных способах. В некоторых случаях, например, когда используют материал матрицы в виде частиц, материал матрицы в виде частиц может иметь, например, средний размер частицы приблизительно от 5 мкм приблизительно до 200 мкм, или приблизительно от 5 мкм приблизительно до 400 мкм, или приблизительно от 5 мкм приблизительно до 600 мкм. В некоторых аспектах, хроматографическая матрица может, например, представлять собой или содержать полимерную смолу или оксид металла или оксид металлоида. В некоторых аспектах, например, когда используют плоскостную хроматографию, материал матрицы может представлять собой любой материал, подходящий для плоскостной хроматографии, такой как стандартные мембраны, основанные на целлюлозе или основанные на органическом полимере (например, бумажная мембрана, нитроцеллюлозная мембрана или поливинилидендифторидная (PVDF) мембрана), или стеклянные пластины, покрытые диоксидом кремния. В одном из вариантов осуществления хроматографическая матрица/стационарная фаза представляет собой немагнитный материал или ненамагничиваемый материал.

[0236] В некоторых вариантах осуществления немагнитные или ненамагничиваемые хроматографические стационарные фазы, которые подходят для представленных способов, включают производные диоксида кремния или сшитый гель. В некоторых аспектах, сшитый гель может быть основан на природном полимере, например, класса полимеров, который встречается в природе. Например, природный полимер, на котором может быть основана хроматографическая стационарная фаза, представляет собой полисахарид. В некоторых случаях, соответствующий полисахарид обычно сшивают. Пример полисахаридной матрицы включает, но не ограничиваясь этим, агарозный гель (например, агароза Superflow™ или материал Sepharose®, такой как Superflow™ Sepharose®, которые коммерчески доступны при различных размерах бусин и пор) или гель сшитого декстрана(ов). Дополнительный иллюстративный пример представляет собой матрицу из сшитой агарозы в виде частиц, с которой ковалентно связывают декстран, которая коммерчески доступна (при различных размерах бусин и при различных размерах пор) в виде Sephadex^® или Superdex^®, оба доступны в GE Healthcare. Другой иллюстративный пример такого хроматографического материала представляет собой Sephacryl^®, который также доступен при различных размерах бусин и пор в GE Healthcare.

[0237] В некоторых вариантах осуществления сшитый гель также может быть основан на синтетическом полимере, например, на классе полимеров, которые не встречаются в природе. В некоторых аспектах, такой синтетический полимер, на котором основана хроматографическая стационарная фаза, представляет собой полимер, который имеет полярные мономерные единицы и который, следовательно, сам является полярным. Таким образом, в некоторых случаях, такой полярный полимер является гидрофильным. Гидрофильные молекулы, также называемые липофобными, в некоторых аспектах содержат фрагменты, которые могут формировать диполь-дипольные взаимодействия с молекулами воды. В целом, гидрофобные молекулы, также называемые липофильными, имеют склонность к отделению от воды.

[0238] Иллюстративные примеры подходящих синтетических полимеров представляют собой полиакриламид(ы), стирол-дивинилбензоловый гель и сополимер акрилата и диола или акриламида и диола. Иллюстративный пример представляет собой полиметакрилатный гель, коммерчески доступный в виде Fractogel^®. Дополнительным примером является сополимер этиленгликоля и метакрилата, коммерчески доступный в виде Toyopearl^®. В некоторых вариантах осуществления хроматографическая стационарная фаза также может содержать природные и синтетические полимерные компоненты, такие как композитная матрица или композит или сополимер полисахарида и агарозы, например, композит полиакриламида/агарозы, или полисахарида и N,N'-метиленбисакриламида. Иллюстративным примером сополимера декстрана и N,N'-метиленбисакриламида является указанный выше материал серии Sephacryl^®. В некоторых вариантах осуществления производное диоксида кремния может включать частицы диоксида кремния, которые связаны с синтетическим или природным полимером. Примеры таких вариантов осуществления включают, но не ограничиваясь этим, диоксид кремния с привитым полисахаридом, диоксид кремния с привитым поливинилпирролидоном, диоксид кремния с привитым полиэтиленоксидом, диоксид кремния с привитым поли(2-гидроксиэтиласпартамидом) и диоксид кремния с привитым поли(N-изопропилакриламидом).

[0239] В некоторых вариантах осуществления хроматографическая матрица представляет собой гельфильтрационную матрицу, например, когда используют в картридже удаления, как раскрыто в настоящем описании. В целом, гель-фильтрация может отличаться свойством, для воздействия которого она разработана. Таким образом, гельфильтрационная матрица в некоторых аспектах делает возможным разделение клеток или других биологических объектов главным образом на основании их размера. В некоторых таких аспектах, соответствующая хроматографическая матрица обычно представляет собой пористый материал в виде частиц, как указано выше. Хроматографическая матрица может иметь определенный эксклюзионный предел, который обычно определяют в единицах молекулярной массы, выше которой полностью исключено прохождение молекул в поры. В некоторых вариантах осуществления соответствующую молекулярную массу, определяющую эксклюзионный предел размера, можно выбирать так, чтобы она была ниже массы, соответствующей массе клетки-мишени. В таком варианте осуществления, предотвращают прохождение клетки-мишени в поры эксклюзионной хроматографической матрицы. Аналогичным образом, стационарная фаза может иметь поры, которые имеют размер, который меньше размера выбранной клетки-мишени. В иллюстративных вариантах осуществления хроматографическая матрица имеет средний размер пор от 0 приблизительно до 500 нм.

[0240] В некоторых вариантах осуществления компоненты, присутствующие в образце, такие как средства (например, рецептор-связывающие средства или средства отбора) или конкурентный реактив, могут иметь размер, который ниже эксклюзионного предела пор и, таким образом, могут входит в поры хроматографической матрицы. В некоторых аспектах, среди таких компонентов, которые способны частично или полностью проходить в объем поры, бóльшие молекулы с меньшим доступом в объем поры можно элюировать первыми, тогда как наименьшие молекулы обычно элюируют последними. В некоторых вариантах осуществления эксклюзионный предел хроматографической матрицы выбирают ниже максимальной ширины клетки-мишени. Таким образом, в некоторых аспектах, компоненты, которые имеют доступ в объем поры, могут оставаться в/на хроматографической матрице дольше, чем клетка-мишень. Таким образом, в некоторых случаях, клетки-мишени можно собирать в элюате хроматографической колонки отдельно от других веществ/компонентов образца. Следовательно, в некоторых аспектах, компоненты, такие как средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) или, где применимо, конкурентный реактив можно элюирвоать в более поздний момент времени из гельфильтрационной матрицы, чем клетку-мишень. В некоторых вариантах осуществления этот эффект можно дополнительно увеличивать, например, если гельпроникающая матрица содержит реактив (такой как ковалентно связанный с ней), который содержит сайты связывания Z, которые способны к связыванию средств (например, рецептор-связывающих средств или средств отбора) и/или конкурентного реактива, присутствующих в образце. В некоторых случаях, средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) и/или конкурентный реактив можно связывать с помощью сайтов связывания Z реактива и, тем самым, иммобилизовать на матрице. В некоторых аспектах, этот способ осуществляют в картридже удаления.

[0241] В некоторых вариантах осуществления хроматографическая матрица, используемая в представленных способах, также может содержать магнитно-притягиваемое вещество, такое как одна или несколько магнитно-притягиваемых частиц, или ферротекучее вещество. Соответствующая магнитно-притягиваемая частица может содержать реактив с сайтом связывания, который способен к связыванию клетки-мишени. В некоторых случаях, магнитно-притягиваемые частицы могут содержать диамагнитный, ферромагнитный, парамагнитный или суперпарамагнитный материал. В целом, суперпарамагнитный материал реагирует на магнитное поле индуцированным магнитным полем без результирующей постоянной намагниченности. Магнитные частици на основании оксида железа, например, коммерчески доступны в виде Dynabeads® в Dynal Biotech, в виде магнитных MicroBeads в Miltenyi Biotec, в виде магнитных пористых стеклянных бус в CPG Inc., а также в различных других источниках, таких как Roche Applied Science, BIOCLON, BioSource International Inc., micromod, AMBION, Merck, Bangs Laboratories, Polysciences или Novagen Inc., среди прочих. Магнитные наночастицы на основании суперпарамагнитного Co и FeCo, а также ферромагнитные Co нанокристаллы описаны, например, в Hutten, A. et al. (J. Biotech. (2004), 112, 47-63). В других вариантах осуществления хроматографическая матрица, используемая в представленных способах, не содержит какие-либо магнитно-притягиваемые вещества.

[0242] В некоторых вариантах осуществления предусмотрено устройство, которое содержит по меньшей мере одну компоновку из первой и второй стационарной фазы, такой как хроматографическая колонка для отбора клеток (картридж отбора) и вторая хроматографическая колонка (картридж удаления) для удаления реактивов. Устройство может содержать множество компоновок первой и второй стационарных фаз (хроматографических колонок), соединяемых по текучей среде последовательно. Устройство может содержать впуск образца, соединяемый по текучей среде с первой стационарной фазой первой компоновки первой и второй стационарных фаз. В некоторых вариантах осуществления устройство также может содержать выпуск образца для клеток, выпуск образца, соединяемый по текучей среде со второй стационарной фазой последней из по меньшей мере одной компоновки первой и второй стационарных фаз для хроматографии. В некоторых аспектах, устройство также может содержать контейнер конкурентного реактива, который соединяют по текучей среде с по меньшей мере одной из первых стационарных фаз компоновок первой и второй стационарных фаз.

b. Растворимое

[0243] В некоторых вариантах осуществления реактив не связывают с твердым носителем, т. е. он присутствует в растворимой форме или является растворимым. В принципе, тот же реактив можно использовать, как в случае реактива, который иммобилизуют на основе, такой как твердый носитель или стационарная фаза. Например, любые из образцовых реактивов, описанных выше, можно использовать без иммобилизации или прикрепления такого реактива к основе, например, не прикрепляя твердый носитель или стационарную фазу. В некоторых вариантах осуществления реактив содержит множество сайтов связывания, Z, для обратимого связывания со связывающим средством через взаимодействие с партнером связывания, C. В некоторых случаях реактив представляет собой олигомер или полимер индивидуальных молекул или олигомер или полимер комплекса субъединиц, которые образуют индивидуальную молекулу (например, олигомеры или полимеры димерного, тримерного или тетрамерного белка). В некоторых вариантах осуществления реактив может представлять собой, например, олигомер мутеина стрептавидина, олигомер кальмодулина, соединение (олигомер), которое предусматривает наименьшие две хелатирующие группы K, где по меньшей мере две хелатирующие группы способны к связыванию с ионом переходного металла, тем самым делая реактив способным к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, мультимерной глутатион-S-трансферазой или биотинилированным белком-переносчиком.

[0244] В некоторых вариантах осуществления реактив отличается отсутствием твердого носителя (поверхности), прикрепленного к реактиву. Например, в некоторых вариантах осуществления реактив не содержит или его не прикрепляют (непосредственно или опосредованно) к частице, бусине, наночастице, микросфере или другому твердому носителю. В некоторых вариантах осуществления реактив не является жестким, негибким или ригидным или не содержит или его не прикрепляют к жесткой, негибкой или ригидной поверхности. В некоторых вариантах осуществления реактив является гибким или по существу гибким. В некоторых случаях реактив способен корректироваться или адаптироваться к форме поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления реактив не или не имеет геометрическую форму, которая является сферической или по существу сферической.

[0245] В некоторых вариантах осуществления по существу весь, т.е. больше чем 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше реактива, состоит из органического материала или содержит его. Например, в некоторых вариантах осуществления больше чем 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше реактива состоят из липидов, углеводов, белков, пептидов или их смесей или содержат их. В некоторых вариантах осуществления реактив состоит из или содержит неотъемлемое отсутствие неорганического материала, неорганической сердцевины, например, металла, например, железа, синтетических или неорганических полимеров, таких как стироловые полимеры, например, полистирола, латекса, диоксида кремния или магнитных сердцевин. Например, в некоторых вариантах осуществления относительная процентная доля неорганического материала реактива или которая содержится в качестве части реактива составляет меньше чем 20%, 15%, 10%, 5% или меньше.

[0246] В некоторых вариантах осуществления большинство (т. е. больше чем 50%), например, больше чем 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или больше от общего объема реактива в водном растворе состоит из индивидуальных белковых молекул, которые содержат реактив, таких как олигомеры или полимеры индивидуальных молекул или комплекс субъединиц, которые образуют индивидуальную молекулу (например, тетрамерную молекулу). В некоторых вариантах осуществления общая плотность растворимого реактива составляет меньше чем 1,2 г/см³, 1,1 г/см³, 1,0 г/см³ или меньше.

[0247] В некоторых вариантах осуществления растворимый реактив, например, не прикрепляемый к основе или твердому носителю (например, не прикрепляют к бусине), имеет относительно малый размер, например, обычно меньше чем или приблизительно меньше чем 20 нм в размере, например, меньше чем или приблизительно меньше чем 15 нм, меньше чем или приблизительно меньше чем 10 нм, меньше чем или приблизительно меньше чем 5 нм или меньше.

[0248] В некоторых вариантах осуществления растворимый реактив, например, не прикрепляемый к основе или твердому носителю (например, не прикрепляют к бусине), является биологически инертным, т. е. является нетоксичным для живых клеток. В некоторых вариантах осуществления реактив может быть биоразрушаемым, например, его можно разрушать с помощью ферментативной активности или выводить с помощью фагоцитарных клеток.

[0249] В некоторых вариантах осуществления возможно проводить реакцию реактива (например, стрептавидина или мутеина, такого как тетрамерные мутеины стрептавидина) с носителем, таким как органический носитель. В некоторых аспектах, в дополнение к реакции с полисахаридом, также возможно использовать физиологически или фармацевтически приемлемые белки, такие как сывороточный альбумин (например, сывороточный альбумин человека (HSA) или бычий сывороточный альбумин (BSA)) в качестве белка-переносчика. В таком случае, реактив, такой как стрептавидин или мутеин стрептавидина (в виде индивидуального тетрамера или также в форме олигомеров), можно сопрягать с белком-переносчиком через нековалентное взаимодействие. В некоторых таких вариантах осуществления, биотинилированный BSA (который коммерчески доступен у различных поставщиков, таких как ThermoFisher Scientific, Sigma Aldrich или Vectorlabs, среди прочих) может вступать в реакцию с реактивом (например, мутеином стрептавидина). В некоторых аспектах, некоторые олигомеры реактива (например, олигомеры стрептавидина) могут нековалентно связываться через один или несколько сайтов связывания Z с биотинилированным белком-переносчиком, оставляя большинство сайтов связывания Z олигомера доступными для связывающего средства (например, рецептор-связывающего средства или средства отбора) и любого дополнительного средства, как раскрыто в настоящем описании. Таким образом, с помощью такого подхода можно получать растворимый реактив с множеством сайтов связывания Z.

[0250] В других вариантах осуществления реактив, такой как мутеин стрептавидина (в виде индивидуального тетрамера или также в форме олигомера) можно ковалентно связывать с синтетическим носителем, таким как молекула полиэтиленгликоля (PEG). Например, любую подходящую PEG молекулу можно использовать с этой целью, и молекула PEG и соответствующий реактив могут быть растворимыми. Обычно, молекулы PEG вплоть до молекулярной массы 1000 Да растворимы в воде или средах для культивирования, которые можно использовать в представленных способах. В некоторых случаях, такой реактив, основанный на PEG, можно получать с использованием коммерчески доступных активированных молекул PEG (например, производных PEG-NHS, доступных в NOF North America Corporation, Irvine, California, USA, или активированных производных PEG, доступных в Creative PEGWorks, Chapel Hills, North Carolina, USA) с аминогруппами мутеина стрептавидина.

B. Средства

[0251] В некоторых вариантах осуществления средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) имеет один или сайты связывания, B, для связывания с молекулой на поверхности клетки, например, молекулой клеточной поверхности. Таким образом, в некоторых случаях, средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) содержит сайт связывания B или множество сайтов связывания B, где специфическое связывание между средством (рецептор-связывающим средством или средством отбора) и молекулой на поверхности клеток-мишеней включает взаимодействие между B и молекулой. В некоторых вариантах осуществления средство содержит только один сайт связывания, т.е. является одновалентным. В некоторых вариантах осуществления средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) имеет по меньшей мере два, например, множество сайтов связывания B, в том числе три, четыре или пять сайтов связывания B, способных к связыванию с молекулой клеточной поверхности. В некоторых таких аспектах, по меньшей мере два или множество сайтов связывания B могут быть идентичными. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из по меньшей мере двух или множества сайтов связывания B могут отличаться (например, B1 и B2).

[0252] В некоторых вариантах осуществления одно или несколько различных средств (например, одно или несколько различных рецептор-связывающих средств, средств отбора или других средств, которые связываются с молекулой на клетке) обратимо связывают с реактивом. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 2, 3, 4 или больше различных средств обратимо связывают с одним и тем же реактивом. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два различных средства обратимо связывают с одним и тем же реактивом, в соответствии с чем каждый реактив содержит сайт связывания B или множество сайтов связывания B для специфического связывания между средством и молекулой. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два или больше средств содержат один и тот же сайт связывания B, например, для связывания одной и той же или по существу одной и той же молекулы. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два или больше средств содержат различные сайты связывания B, например, для связывания с различными молекулами. В некоторых вариантах осуществления первое средство (например, первое рецептор-связывающее средство или первое средство отбора) содержит сайт связывания B1, B2, B3, B4 и т.д. и второе средство (например, второе рецептор-связывающее средство или второе средство отбора) содержит другой из сайтов связывания B1, B2, B3, B4 и т. д. В некоторых вариантах осуществления первое средство (например, первое средство отбора) содержит сайт связывания B1 и второе средство (например, второе средство отбора) содержит сайт связывания B3. В некоторых вариантах осуществления первое средство (например, первое рецептор-связывающее средство) содержит сайт связывания B2 и второе средство (например, второе рецептор-связывающее средство) содержит сайт связывания B4. В любом из таких вариантов осуществления первое средство и второе средство могут содержать партнер связывания, C1 или C2. В некоторых вариантах осуществления C1 и C2 могут представлять собой одно и то же. В некоторых вариантах осуществления C1 и C2 различны. В некоторых вариантах осуществления первое средство и второе средство содержат один и тот же партнер связывания, C1.

[0253] В некоторых случаях, константа диссоциации (K_D) связывания между средством (например, через сайт связывания B) и сайтом связывания Z реактива может иметь значение в диапазоне приблизительно от 10^-2 M приблизительно до 10^-13 M или приблизительно от 10^-3 M приблизительно до 10^-12 M или приблизительно от 10^-4 M приблизительно до 10^-11M, или приблизительно от 10^-5M приблизительно до 10^-10 M. В некоторых вариантах осуществления константа диссоциации (K_D) для связывания между связывающим средством и молекулой низкой аффинности, например, в диапазоне K_D приблизительно от 10^-3 приблизительно до 10^-7 M. В некоторых вариантах осуществления константа диссоциации (K_D) для связывания между связывающим средством и молекулой высокой аффинности, например, в диапазоне K_D приблизительно от 10^-7 приблизительно до 1×10^-10 M.

[0254] В некоторых вариантах осуществления диссоциация связывания средства через сайт связывания B и молекулы происходит достаточно быстро, например, чтобы сделать возможным только временное окрашивание или ассоциирование клетки-мишени со средством после разрушения обратимой связи между реактивом и средством. В некоторых случаях, при выражении в единицах k_off (также называемой константой скорости диссоциации для связывания между средством (через сайт связывания B) и молекулой, k_off составляет приблизительно 0,5×10^-4 с^-1 или больше, приблизительно 1×10^-4 с^-1 или больше, приблизительно 2×10^-4 с^-1 или больше, приблизительно 3×10^-4 с^-1 или больше, приблизительно 4×10^-4 с^-1 или больше, приблизительно 5×10^-4 с^-1 или больше, приблизительно 1×10^-3 с^-1 или больше, приблизительно 1,5×10^-3 с^-1 или больше, приблизительно 2×10^-3 с^-1 или больше, приблизительно 3×10^-3 с^-1 или больше, приблизительно 4×10^-3 с^-1, приблизительно 5×10^-3 с^-1 или больше, приблизительно 1×10^-2 с или больше, или приблизительно 5×10^-1 с^-1 или больше. Специалист в данной области сможет эмпирически определять диапазон k_off, подходящий для конкретного взаимодействия средства и молекулы клетки (см., например, опубликованную заявку США № US2014/0295458). Например, средство с довольно высокой k_off, например, больше 4,0×10^-4 с^-1 можно использовать с тем, чтобы, после разрушения связанных комплексов, основную часть средства можно было удалять или диссоциировать в пределах одного часа. В других случаях, средство с более низкой k_off, например, 1,0×10^-4 с^-1, можно использовать, с тем, чтобы после разрушения связанных комплексов, основную часть средства можно было удалять или диссоциировать из клетки в пределах приблизительно 3 с половиной часов.

[0255] В некоторых вариантах осуществления K_D этой связи, а также K_D, k_off и k_on связи, сформированной между сайтом связывания B средства (например, рецептор-связывающего средства или средства отбора) и молекулой клеточной поверхности можно определять с помощью любых подходящих средств, например, посредством флуоресцентного титрования, равновесного диализа или поверхностного плазмонного резонанса.

[0256] В некоторых аспектах, молекула клеточной поверхности представляет собой молекулу, против которой можно направлять средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора). В некоторых вариантах осуществления молекула клеточной поверхности представляет собой пептид или белок, такой как рецептор, например, мембранный рецепторный белок. В некоторых вариантах осуществления рецептор представляет собой липид, полисахарид или нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления молекула клеточной поверхности, которая является белком, может представлять собой периферический мембранный белок или интегральный мембранный белок. Молекула клеточной поверхности может в некоторых вариантах осуществления иметь один или несколько доменов, которые пронизывают мембрану. В качестве некоторых иллюстративных примеров, мембранный белок с трансмембранным доменом может представлять собой сопряженный с G-белком рецептор, такой как рецепторы пахучих веществ, родопсиновый рецептор, родопсиновый феромоновый рецептор, рецептор пептидных гормонов, вкусовой рецептор, GABA рецептор, опиатный рецептор, серотониновый рецептор, Ca²⁺ рецептор, меланопсин, рецептор нейротрансмиттеров, такой как лиганд-зависимый, потенциал-зависимый или механический рецептор, в том числе ацетилхолиновый, никотиновый, адренергический, норэпинефриновый, катехоламиновый, L-DOPA-, дофаминовый и серотониновый (биогенного амина, эндорфиновый/энкефалиновый) нейропептидный рецептор, рецепторная киназа, такая как серин/треониновая киназа, тирозинкиназа, порин/канал, такой как хлоридный канал, калиевый канал, натриевый канал, OMP белок, ABC переносчик (АТФ-связывающий кассетный переносчик), такой как аминокислотный переносчик, Na-глюкозный переносчик, Na/йодидный переносчик, ионный переносчик, такой как светособирающий комплекс, оксидаза цитохрома C, АТФаза Na/K, H/K, Ca, рецептор клеточной адгезии, такой как металлопротеаза, интегрин или кадгерин.

[0257] В некоторых вариантах осуществления молекула клеточной поверхности может представлять собой антиген, определяющий желаемую популяцию или субпопуляцию клеток, например, популяцию или субпопуляцию клеток крови, например, лимфоцитов (например, T-клеток, T-хелперных клеток, например, CD4+ T-хелперных клеток, B-клеток или естественных киллерных клеток), моноцитов или стволовых клеток, например, CD34-положительных периферических стволовых клеток или стволовых клеток, экспрессирующих Nanog или Oct-4. Примеры T-клеток включают клетки, такие как CMV-специфические CD8+ T-лимфоциты, цитотоксические T-клетки, T-клетки памяти и регуляторные T-клетки (Treg). Иллюстративным примером Treg являются CD4 CD25 CD45RA регуляторные T-клетки и иллюстративным примером T-клеток памяти являются CD62L CD8+ специфические центральные T-клетки памяти. Молекула клеточной поверхности также может представлять собой маркер опухолевой клетки.

[0258] Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) имеет, в дополнение к сайту связывания B, который способен к связыванию молекулы клеточной поверхности, партнер связывания C. В некоторых аспектах, этот партнер связывания C способен к связыванию с сайтом связывания Z реактива, где реактив имеет один или несколько сайтов связывания для партнера связывания C. В некоторых вариантах осуществления нековалентная связь, которую можно формировать между партнером связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), и сайтом(ами) связывания Z реактива, может быть любой желаемой силы и аффинности, и может быть разрушаемой или обратимой в условиях, при которых осуществляют способ. Средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) может содержать по меньшей мере один, в том числе два, три или больше дополнительных партнеров связывания C и реактив может содержать по меньшей мере два, например, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или больше сайтов связывания Z для партнера связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора). Как описано в патенте США 7776562, патенте США 8298782 или международной патентной заявке WO 2002/054065, можно выбирать любую комбинацию партнера связывания C и реактива с одним или несколькими соответствующими сайтами связывания Z, например, такую, что партнер связывания C и сайт связывания Z способны обратимо связываться в комплексе, например, чтобы вызывать эффект авидности.

[0259] Партнер связывания C, содержащийся в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), например, может быть основан на углеводороде (в том числе полимерном) и содержать группы азота, фосфора, серы, карбена, галогена или псевдогалогена. В некоторых аспектах, он может представлять собой спирт, органическую кислоту, неорганическую кислоту, амин, фосфин, тиол, дисульфид, алкан, аминокислоту, пептид, олигопептид, полипептид, белок, нуклеиновую кислоту, липид, сахарид, олигосахарид или полисахарид. В качестве дополнительных примеров, также он может представлять собой катион, анион, поликатион, полианион, поликатион, электролит, полиэлектролит, углеродную нанотрубку или углеродную нанопену. В целом, такой партнер связывания C имеет более высокую аффинность к сайту связывания реактива, чем к другому веществу. Примеры соответствующего партнера связывания C включают, но не ограничиваясь этим, краун-эфир, иммуноглобулин, его фрагмент и белковую связывающую молекулу с антителоподобными функциями.

[0260] В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), включает биотин, и реактив включает аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается с биотином. В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), включает аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином, и реактив включает стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается с соответствующим аналогом биотина. В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), включает стрептавидин- или авидин-связывающий пептид и реактив включает стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается с соответствующим стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.

[0261] В некоторых вариантах осуществления реактив представляет собой стрептавидин, такой как мутеин стрептавидина, включая любое описанное выше (например, приведенное в SEQ ID №№ 3-6), и партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), может включать стрептавидин-связывающий пептид. В некоторых вариантах осуществления стрептавидин-связывающий пептид может содержать последовательность с общей формулой, приведенной в SEQ ID № 9, например, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID № 10. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность имеет общую формулу, приведенную в SEQ ID № 11, например, приведенную в SEQ ID № 12. В одном из примеров, пептидная последовательность представляет собой Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (также называемую Strep-tag^®, приведенную в SEQ ID № 7). В одном из примеров, пептидная последовательность представляет собой Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (также называемый Strep-tag^® II, приведенный в SEQ ID № 8). В некоторых вариантах осуществления пептидный лиганд содержит последовательную компоновку из по меньшей мере двух стрептавидин-связывающих модулей, где расстояние между двумя модулями составляет по меньшей мере 0 и не больше чем 50 аминокислот, где один связывающий модуль имеет от 3 до 8 аминокислот и содержит по меньшей мере последовательность His-Pro-Xaa (SEQ ID № 9), где Xaa представляет собой глутамин, аспарагин или метионин, и где другой связывающий модуль имеет тот же или другой пептидный лиганд стрептавидина, например, приведенный в SEQ ID № 11 (см., например, международную опубликованную заявку PCT № WO02/077018; патент США № 7981632). В некоторых вариантах осуществления пептидный лиганд содержит последовательность, имеющую формулу, приведенную в любой из SEQ ID № 13 или 14. В некоторых вариантах осуществления пептидный лиганд имеет последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID №№ 15-19. В большинстве случаев, все эти стрептавидин-связывающие пептиды связываются с одним и тем же сайтом связывания, а именно сайтом связывания биотина в стрептавидине. Если один или несколько таких стрептавидин-связывающих пептидов используют в качестве партнеров связывания C, например, C1 и C2, реактив мультимеризации обычно представляет собой мутеин стрептавидина.

[0262] В некоторых вариантах осуществления стрептавидин-связывающий пептид дополнительно можно модифицировать. В некоторых вариантах осуществления стрептавидин-связывающий пептид может содержать пептидную последовательность Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (также называемую Strep-tag^® II, которая приведена в SEQ ID № 8), конъюгированную с заряженной никелем trisNTA (также называемой His-STREPPER или His/Strep-tag^®II Adapter).

[0263] В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C средства (например, рецептор-связывающего средства или средства отбора) содержит фрагмент, известный специалисту в данной области как аффинная метка. В таком варианте осуществления, реактив может содержать соответствующий партнер связывания, например, антитело или фрагмент антитела, который, как известно, связывается с аффинной меткой. В качестве некоторых иллюстративных примеров известных аффинных меток, партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), может включать динитрофенол или дигоксигенин, олигогистидин, полигистидин, домен иммуноглобулина, мальтоза-связывающий белок, глутатион-S-трансферазу (GST), хитин-связывающий белок (CBP) или тиоредоксин, кальмодулин-связывающий пептид (CBP), FLAG-пептид, HA-метку (последовательность: Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (SEQ ID № 20), VSV-G-метку (последовательность: Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys) (SEQ ID № 21), HSV-метку (последовательность: Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp) (SEQ ID № 22), эпитоп T7 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly) (SEQ ID № 22), мальтоза-связывающий белок (MBP), эпитоп HSV последовательности Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp (SEQ ID № 24) гликопротеина D вируса простого герпеса, эпитоп «myc» фактора транскрипции c-myc последовательности Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu (SEQ ID № 25), V5-метку (последовательность: Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr) (SEQ ID № 26) или глутатион-S-трансферазу (GST). В таких вариантах осуществления, комплекс, образуемый между одним или несколькими сайтами связывания Z реактива, который может представлять собой антитело или фрагмент антитела, и антигеном, можно разрушать конкурентно посредством добавления свободного антигена, т. е. свободного пептида (эпитопной метки) или свободного белка (такого как MBP или CBP). В некоторых вариантах осуществления аффинная метка также может представлять собой олигонуклеотидную метку. В некоторых случаях, такую олигонуклеотидную метку, например, можно использовать для гибридизации с олигонуклеотидом с комплементарной последовательностью, связанной с реактивом или включенной в него.

[0264] Дополнительные примеры подходящего партнера связывания C включают, но не ограничиваясь этим, лектин, белок A, белок G, металл, ион металла, производные нитрилотриуксусной кислоты (NT A), мотивы RGD, декстран, полиэтиленимин (PEI), окислительно-восстановительный полимер, гликопротеины, аптамеры, краситель, амилозу, мальтозу, целлюлозу, хитин, глутатион, кальмодулин, желатин, полимиксин, гепарин, NAD, NADP, лизин, аргинин, бензамидин, поли-U или олиго-dT. Известно, что лектины, такие как конкавалин A, связываются с полисахаридами и гликозилированными белками. Иллюстративным примером красителя является триазиновый краситель, такой как цибракон синий F3G-A (CB) или красный HE-3B, который специфически связывает NADH-зависимые ферменты. Обычно зеленый A связывается с CoA белками, сывороточным альбумином человека и дегидрогеназами. В некоторых случаях, красители 7-аминоактиномицин D и 4',6-диамидино-2-фенилиндол связываются с ДНК. В целом, катионы металлов, таких как Ni, Cd, Zn, Co или Cu, обычно используют для связывания аффинных меток, таких как олигогистидин-содержащая последовательность, в том числе гексагистидиновая или His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys метка (MAT-метка)(SEQ ID № 35), и сложный N-метакрилоил-(L)-цистеинметиловый эфир.

[0265] В некоторых вариантах осуществления связывание между партнером связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), и одним или несколькими сайтами связывания Z реактива происходит в присутствии двухвалентного, трехвалентного или четырехвалентного катиона. В связи с этим, в некоторых вариантах осуществления реактив содержит двухвалентный, трехвалентный или четырехвалентный катион, обычно удерживаемый, например, в комплексе, подходящим хелатором. В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), может содержать фрагмент, который включает, например, комплексы, двухвалентный, трехвалентный или четырехвалентный катион. Примеры соответствующего хелатора металлов, включают, но не ограничиваясь этим, этилендиамин, этилен-диаминтетрауксусную кислоту (EDTA), этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), N,N-бис(карбоксиметил)глицин (также называемый нитрилотриуксусной кислотой, NTA), 1,2-бис(о-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (BAPTA), 2,3-димеркапто-1-пропанол (димеркапрол), порфин и гем. В качестве примера, EDTA образует комплекс с большинством одновалентных, двухвалентных, трехвалентных и четырехвалентных ионов металла, таких как, например, серебро (Ag+), кальций (Ca²⁺), марганец (Mn²⁺), медь (Cu²⁺), железо (Fe²⁺), кобальт (Co⁺) и цирконий (Zr⁴⁺), тогда как BAPTA является специфичной для Ca²⁺. В качестве иллюстративного примера, стандартный способ, используемый в данной области, представляет собой формирование комплекса между олигогистидиновой меткой и ионами меди (Cu²⁺), никеля (Ni²⁺), кобальта (Co²⁺) или цинк (Zn²⁺), которые представлены хелатором нитрилотриуксусной кислотой (NTA).

[0266] В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), содержит кальмодулин-связывающий пептид и реактив содержит мультимерный кальмодулин, как описано в патенте США 5985658, например. В некоторых вариантах осуществления партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), содержит FLAG-пептид и реактив содержит антитело, которое связывается с FLAG-пептидом, например, FLAG-пептидом, который связывается с моноклональным антителом 4E11, как описано в патенте США 4851341. В одном из вариантов осуществления партнер связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), содержит олигогистидиновую метку и реактив содержит антитело или ион переходного металла, связывающий олигогистидиновую метку. В некоторых случаях, разрушение всех этих связанных комплексов можно выполнять посредством хелатирования иона металла, например, хелатирования кальция, например, посредством добавления EDTA или EGTA. В некоторых вариантах осуществления кальмодулин, антитела, такие как 4E11, или хелатированные ионы металла или свободные хелаторы можно мультимеризовать стандартными способами, например, посредством биотинилирования и комплексообразования со стрептавидином или авидином или их олигомерами или посредством введения карбоксильных остатков в полисахарид, например, декстран, по существу как описано в Noguchi, A, et al. Bioconjugate Chemistry (1992) 3132-137, на первой стадии и связвания кальмодулина или антител или хелатированных ионов металла или свободных хелаторов через первичные аминогруппы с карбоксильными группами в полисахаридном, например, декстрановом, остове с использованием стандартной реакции с карбодиимидом на второй стадии. В некоторых таких вариантах осуществления связывание между партнером связывания C, который содержится в средстве (например, рецептор-связывающем средстве или средстве отбора), и одним или несколькими сайтами связывания Z реактива можно разрушать посредством хелатирования иона металла. Хелатирование металла можно выполнять, например, посредством добавления EGTA или EDTA.

[0267] В некоторых вариантах осуществления средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора), которое специфически связывается с молекулой клеточной поверхности, например, может содержаться в антителе, его фрагменте или белковой связывающей молекуле с антителоподобными функциями. В некоторых вариантах осуществления сайт связывания B средства представляет собой связывающий участок антитела, например, представляет собой или содержит одну или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) антитела. Примеры (рекомбинантных) фрагментов антител включают, но не ограничиваясь этим, Fab-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv), двухвалентный фрагмент антитела, такой как (Fab)₂'-фрагмент, диатела, триатела (Iliades, P., et al., FEB S Lett (1997) 409, 437-441), декатела (Stone, E., et al., Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94) и другие доменные антитела (Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490). В некоторых вариантах осуществления средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) может содержать двухвалентную белковую искусственную связывающую молекулу, такую как димерный мутеин липокалина, который также известен как «дуокалин».

[0268] В некоторых вариантах осуществления средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора) может иметь один сайт связывания B, т.е. оно может быть одновалентным. Примеры одновалентных средств (например, рецептор-связывающих средств или средств отбора) включают, но не ограничиваясь этим, одновалентный фрагмент антитела, белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами или молекулу MHC. Примеры одновалентных фрагментов антитела включают, но не ограничиваясь этим, Fab-фрагмент, Fv-фрагмент и одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), в том числе двухвалентный одноцепочечный Fv-фрагмент.

[0269] В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент, такой как Fab-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv), двухвалентный фрагмент антитела, такой как F(ab')₂-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой или извлекают из исходного антитела, для которого известно, что оно связывается с молекулой клетки, представляющей интерес. Различные молекулы антител или их фрагменты против молекул клеточной поверхности хорошо известны в данной области, и любые из их множества можно использовать в качестве средств в способах в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его фрагмент, которое содержит одну или несколько замен аминокислот в вариабельной тяжелой цепи исходного или эталонного антитела, например, чтобы создавать антитело с измененной аффинностью или которое демонстрирует достаточно высокую скорость диссоциации, как описано выше. Например, образцы таких мутаций известны в контексте мутантов антитела 13B8.2 против CD4 (см., например, патент США № 7482000, публикацию заявки на патент США № US2014/0295458 или международную патентную заявку № WO2013/124474), и любые из таких мутаций можно создавать в другом исходном или эталонном антителе.

[0270] В некоторых аспектах, средство (например, рецептор-связывающее средство или средство отбора), которое может быть одновалентным, например, содержать одновалентный фрагмент антитела или одновалентную искусственную связывающую молекулу (белковую или другую), такую как мутеин, основанный на полипептиде семейства липокалина (также известном как «Антикалин^®»), или двухвалентной молекулой, такой как антитело или фрагмент, в которой оба сайта связывания сохранены, например, F(ab')₂ фрагмент.

[0271] Пример белковой связывающей молекулы с антителоподобными функциями включает мутеин, основанный на полипептиде семейства липокалина (см., например, WO 03/029462, Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903). В целом, липокалины, такие как билин-связывающий белок, липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов человека, аполипопротеин D человека или липокалин слез человека, содержат естественные лиганд-связывающие сайты, которые можно модифицировать с тем, чтобы они связывали заданную мишень. Дополнительные примеры белковой связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами, которые можно использовать в качестве средства (например, рецептор-связывающего средства или средства отбора), которое специфически связывается с молекулой клеточной поверхности, включают, но не ограничиваясь этим, так называемые глутела («glubody») (см., например, международную патентную заявку № WO 96/23879), белки, основанные на анкириновом каркасе (Mosavi, L.K., et al., Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448) или кристаллиновом каркасе (например, международная патентная заявка № WO 01/04144) белки, описанные в Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187, аднектины, тетранектины и авимеры. В целом, авимеры, в том числе поливалентные авимерные белки, полученные посредством перетасовки экзонов семейства рецепторных доменов человека, содержат так называемые A-домены, которые встречаются в виде нитей из множества доменов в нескольких рецепторах клеточной поверхности (Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). Аднектины, в целом получаемые из домена фибронектина человека, обычно содержат три петли, которые можно конструировать для иммуноглобулиноподобного связывания с мишенями (Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658). Тетранектины, в целом получаемые из соответствующего гомотримерного белка человека, аналогичным образом обычно содержат области петель в домене лектина C-типа, которые можно конструировать для желаемого связывания. Пептоиды, которые, в некоторых случаях, могут действовать в качестве белковых лигандов, обычно представляют собой олиго(N-алкил)глицины, которые отличаются от пептидов тем, что боковая цепь соединена с амидным азотом вместо атома углерода. Пептоиды обычно устойчивы к протеазам и другим модифицирующим ферментам и могут иметь значительно более высокую проницаемость в клетки, чем пептиды (см., например, Kwon, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509).

[0272] Дополнительные примеры подходящих белковых связывающих молекул включают, но не ограничиваясь этим, EGF-подобный домен, Kringle-домен, домен фибронектина I типа, домен фибронектина II типа, домен фибронектина III типа, домен PAN, домен Gla, домен SRCR, домен ингибитора панкреатического трипсина быка/Куница, тендамистат, домен ингибитора сериновой протеазы типа Kazal, домен трилистника (P-типа), домен фактора фон Виллебранда типа C, анафилатоксинподобный домен, домен CUB, повтор тироглобулина I типа, домен LDL-рецептора класса A, домен Sushi, домен Link, домен тромбоспондина I типа, домен иммуноглобулина или иммуноглобулиноподобный домен (например, доменные антитела или антитела тяжелых цепей верблюда), домен лектина C-типа, домен MAM, домен фактора фон Виллебранда типа A, домен соматомедина B, домен WAP-типа ядра с четырьмя дисульфидными связями, домен C типа F5/8, домен гемопексина, домен SH2, домен SH3, EGF-подобный домен ламининового типа, домен C2, «каппатела» (Ill et al. Protein Eng (1997) 10, 949-57, так называемое «миниантитело» (Martin et al, EMBO J (1994) 13, 5303-5309), диатело (Holliger et al., PNAS USA (1993)90, 6444-6448), так называемый «Janusis» (Traunecker et al, EMBO J (1991) 10, 3655-3659, или Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52), нанотело, микротело, аффилин, аффитело, ноттин, убиквитин, белок с цинковым пальцем, аутофлуоресцентный белок или белок с повтором, богатым лейцином. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты с антителоподобными функциями может представлять собой аптамер. В целом, аптамер укладывается в определенных трехмерный мотив и демонстрирует высокую аффинность к заданной структуре-мишени.

1. Рецептор-связывающие средства

[0273] В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой рецептор-связывающее средство. В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство связывается с молекулой (например, рецептором) на поверхности клетки, это связывание между средством и молекулой способно к индукции или модулированию сигнала в клетках. В некоторых случаях, молекула клеточной поверхности (например, рецептор) представляет собой сигнальную молекулу. В некоторых таких случаях, рецептор-связывающее средство способно к специфическому связыванию с сигнальной молекулой, экспрессируемой одной или несколькими клетками. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство представляет собой стимулирующее средство, которое может представлять собой любое средство, которое способно к индукции сигнала в клетке (например, T-клетке) при связывании с молекулой клеточной поверхности, такой как рецептор. В некоторых вариантах осуществления сигнал может быть иммуностимулирующим, и в этом случае рецептор-связывающее средство или стимулирующее средство способно к индукции или модулированию сигнала, который участвует в или который стимулирует иммунный ответ с помощью клетки (например, T-клетки), например, увеличение пролиферации или размножения иммунных клеток, активация клеток иммунной системы, дифференцировка клеток иммунной системы, секреция цитокинов, цитотоксическая активность или одна или несколько других функциональных активностей клетки иммунной системы. В определенном варианте осуществления, сигнал может быть ингибирующим, и в этом случае рецептор-связывающее средство или стимулирующее средство способно к индукции или модулированию сигнала в клетке (например, T-клетке), которая вовлечена в или ингибирует иммунный ответ, например, ингибирует или снижает пролиферацию или размножение иммунных клеток, активацию клеток иммунной системы, дифференцировку клеток иммунной системы, секрецию цитокинов, цитотоксическую активность или одну или несколько других функциональных активностей клетки иммунной системы.

[0274] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, представляет собой первое рецептор-связывающее средство, например, первое стимулирующее средство. В некоторых аспектах, первое рецептор-связывающее средство, например, первое стимулирующее средство, связывается с молекулой рецептора на поверхности клеток. Таким образом, в некоторых случаях, первое рецептор-связывающее средство, например, первое стимулирующее средство, индуцирует или модулирует сигнал. В некоторых аспектах, индукция или модуляция сигнала с помощью первого рецептор-связывающего средства, например, первого стимулирующего средства, вызывает активацию, стимуляцию и/или размножение (пролиферацию) клеток. Таким образом, в некоторых случаях, первое рецептор-связывающее средство, например, первое стимулирующее средство, предоставляет первичный сигнал активации для клеток, тем самым активируя клетки.

[0275] В некоторых вариантах осуществления популяция клеток может представлять собой популяцию лимфоцитов, включая, но без ограничения, популяцию B-клеток, популяцию T-клеток или популяцию естественных киллерных клеток. Иллюстративные примеры популяций клеток представляют собой B-клетки, несущие CD40 или CD137 (обе популяции клеток могут пролиферировать при связывании только первого средства, которое обеспечивает сигнал активации, например, лиганда 4-1BB; или молекулы антитела αCD40 или молекулы антитела αCD137 (см., например, Zhang et al., 2010, J Immunol, 184:787-795)). Другие иллюстративные примеры для средств (первого или второго), которые можно использовать для размножения B-клеток, представляют собой средства, которые связываются с IgG, CD19, CD28 или CD14, например, молекулы антител αCD19, αIgG, αCD28 или αCD14. Также предусмотрено, что первое или второе средства для размножения B-клеток могут содержать лиганды для Toll-подобных рецепторов или интерлейкины, такие как IL-21 (см., например, Dienz O, et al. 2009. J. Exp. Med. 206:69). Следует отметить, что липополисахарид-зависимая активация B-клеток также предусмотрена в вариантах осуществления настоящего изобретения, поскольку липополисахарид также можно использовать в качестве первого средства и оснащать партнером связывания C1, как используют в настоящем описании.

[0276] Другие иллюстративные примеры подходящих популяций клеток включают популяцию T-клеток, которая размножается после активации посредством связывания первого средства с TCR/CD3 и связывания второго средства со вспомогательной молекулой на T-клетке, такой как CD28. В этом случае, первое средство стимулирует ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал в T-клетках и второе средство обеспечивает вторичный стимул посредством связывания CD28 в качестве вспомогательной молекулы. Средства, которые можно использовать для размножения T-клеток, также могут включать интерлейкины, такие как IL-2, IL-7, IL-15 или IL-21 (см., например, Cornish et al. 2006, Blood. 108(2):600-8, Bazdar and Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81(22):12670-12674, Battalia et al., 2013, Immunology, 139(1):109-120). Другие иллюстративные примеры средств, которые можно использовать для размножения T-клеток, представляют собой средства, которые связываются с CD8, CD45 или CD90, такие как антитела αCD8, αCD45 или αCD90. Иллюстративные примеры популяции T-клеток, включая антиген-специфические T-клетки, T-хелперные клетки, цитотоксические T-клетки, T-клетки памяти (иллюстративным примером T-клеток памяти являются CD62L+CD8+ специфические центральные T-клетки памяти) или регуляторные T-клетки (иллюстративным примером Treg являются CD4+CD25+CD45RA+ регуляторные T-клетки).

[0277] Другой иллюстративный пример подходящей популяции клеток включает естественные киллерные клетки (NK клетки), которые, например, можно размножать с использованием средств, которые связываются с CD16 или CD56, таких как, например, αCD16 или αCD56 антитела. В иллюстративном примере для такого αCD16 антитела представляет собой антитело 3G8 с последовательностью VH, приведенной в SEQ ID № 36, и последовательностью VL, приведенной в SEQ ID № 37 (см., например, Hoshino et al, Blood. декабрь 1991 года, 15;78(12):3232-40.). Другое средство, которое можно использовать для размножения NK клеток, может представлять собой IL-15 (см., например, Vitale et al. 2002. Anatomical Record. 266:87-92). Еще один другой иллюстративный пример подходящей популяции клеток включает моноциты, которые, например, можно размножать с использованием средства, которое связывается с CD14, такого как молекула αCD14 антитела.

[0278] В некоторых вариантах осуществления первое рецептор-связывающее средство, например, первое стимулирующее средство, может стимулировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал в клетках, например, T-клетках. В некоторых аспектах, первое рецептор-связывающее средство, например, первое стимулирующее средство, может представлять собой связывающее средство, которое специфически связывает CD3. В некоторых случаях, первое рецептор-связывающее средство, например, первое стимулирующее средство, которое специфически связывает CD3, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD3, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD3, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD3 и белковой CD3-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Двухвалентный фрагмент антитела может представлять собой F(ab')₂-фрагмент или двухвалентный одноцепочечный Fv-фрагмент, тогда как одновалентный фрагмент антитела можно выбирать из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и одноцепочечного Fv-фрагмента (scFv). В некоторых случаях, белковая CD3-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами может представлять собой аптамер, мутеин, основанный на полипептиде семейства липокалина, глутело, белок, основанный на анкириновом каркасе, белок, основанный на кристаллиновом каркасе, аднектин или авимер.

[0279] В некоторых вариантах осуществления Fab-фрагмент против CD3 можно получать из CD3-связывающего моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией OKT3 (ATCC^® CRL-8001™; см. также патент США № 4361549). Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антитела против CD3 OKT3 описаны в Arakawa et al., J. Biochem. 120, 657-662 (1996) и содержат аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID № 31 и 32, соответственно.

[0280] В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, представляет собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство. В некоторых случаях, второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство, связывается с молекулой на поверхности клеток, такой как молекула клеточной поверхности, например, молекула рецептора. В некоторых вариантах осуществления второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство, способно усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу. В некоторых вариантах осуществления второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство, индуцирует или модулирует сигнал, например, второй или дополнительный сигнал. В некоторых аспектах, второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство, может усиливать или потенцировать сигнал, индуцируемый первым рецептор-связывающим средством, например, первым стимулирующим средством. В некоторых вариантах осуществления второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство, связывается со вспомогательной молекулой и/или может стимулировать или индуцировать вспомогательный или вторичный сигнал в клетке. В некоторых аспектах, второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство, связывается с костимулирующей молекулой и/или предоставляет костимулирующий сигнал.

[0281] В некоторых вариантах осуществления рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство, связывается, например, специфически связывается, со второй молекулой, которая может представлять собой костимулирующую молекулу, вспомогательную молекулу, цитокиновый рецептор, хемокиновый рецептор, молекулу иммунной контрольной точки или элемент семейства TNF или семейства рецепторов TNF.

[0282] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой CD28 и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), специфически связывает CD28. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает CD28, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD28, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD28, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD28 и белковой CD28-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Двухвалентный фрагмент антитела может представлять собой F(ab')₂-фрагмент или двухвалентный одноцепочечный Fv-фрагмент, тогда как одновалентный фрагмент антитела можно выбирать из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и одноцепочечного Fv-фрагмента (scFv). Белковая CD28-связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами может представлять собой аптамер, мутеин, основанный на полипептиде семейства липокалина, глутело, белок, основанный на анкириновом каркасе, белок, основанный на кристаллиновом каркасе, аднектин и авимер.

[0283] В некоторых вариантах осуществления Fab-фрагмент против CD28 можно получать из антитела CD28.3 (депонировано в виде синтетической одноцепочечной Fv конструкции под номером доступа GenBank AF451974.1; см. также Vanhove et al., BLOOD, 15 июля 2003 года, том 102, № 2, страницы 564-570), тяжелая и легкая цепь которого содержит SEQ ID № 33 и 34, соответственно.

[0284] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой CD90 и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), специфически связывает CD90. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает CD90, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD90, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD90, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD90 и белковой CD90-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области. См., например, антитело против CD90 G7 (Biolegend, № по каталогу 105201).

[0285] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой CD95 и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), специфически связывает CD95. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает CD95, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD95, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD95, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD95 и белковой CD95-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области. Например, в некоторых аспектах, антитело против CD90 может представлять собой моноклональное CH11 мыши против CD95 человека (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) или может представлять собой mAb против CD95 7C11 или против APO-1, такое как описано в Paulsen et al. Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631.

[0286] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке или B-клетке, может представлять собой CD137 и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), специфически связывает CD137. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает CD137 можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD137, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD137, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD137 и белковой CD137-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области. Например, антитело против CD137 может представлять собой LOB12, IgG2a или LOB12.3, IgG1, как описано в Taraban et al. Eur J Immunol. 2002 Dec;32(12):3617-27. См. Также, например, US6569997, US6303121, Mittler et al. Immunol Res. 2004;29(1-3):197-208.

[0287] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, B-клетке, может представлять собой CD40 и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство) специфически связывает CD40. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство (которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает CD40, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD40, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD40, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD40 и белковой CD40-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами.

[0288] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой CD40L (CD154) и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство) специфически связывает CD40L. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает CD40L, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD40L, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD40L, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD40L и белковой CD40L-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области. Например, антитело против CD40L в некоторых аспектах может представлять собой Hu5C8, как описано в Blair et al. JEM, том 191, № 4, 651-660. См. также, например, WO1999061065, US20010026932, US7547438, WO2001056603.

[0289] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой индуцибельный костимулятор T-клеток (ICOS) и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство) специфически связывает ICOS. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает ICOS, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против ICOS, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против ICOS, одновалентного фрагмента антитела из антитела против ICOS и белковой ICOS-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области. См., например, US20080279851 и Deng et al. Hybrid Hybridomics. 2004 Jun;23(3):176-82.

[0290] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой линкер для активации T-клеток (LAT) и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство) специфически связывает LAT. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает LAT, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против LAT, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против LAT, одновалентного фрагмента антитела из антитела против LAT и белковой LAT-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области.

[0291] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой CD27 и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство) специфически связывает CD27. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает CD27, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD27, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD27, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD27 и белковой CD27-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области. См., например, WO2008051424.

[0292] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой OX40 и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство) специфически связывает OX40. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает OX40, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против OX40, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против OX40, одновалентного фрагмента антитела из антитела против OX40 и белковой OX40-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области. См., например, WO2013038191, Melero et al. Clin Cancer Res. 2013 Mar 1;19(5):1044-53.

[0293] В некоторых вариантах осуществления молекула на клетке, например, T-клетке, может представлять собой HVEM и рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство) специфически связывает HVEM. В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, (например, которое может представлять собой второе рецептор-связывающее средство, например, второе стимулирующее средство), которое специфически связывает HVEM, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против HVEM, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против HVEM, одновалентного фрагмента антитела из антитела против HVEM и белковой HVEM-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. Антитело или антиген-связывающий фрагмент можно извлекать из любого, известного в данной области. См., например, WO2006054961, WO2007001459, Park et al. Cancer Immunol Immunother. 2012 Feb;61(2):203-14.

[0294] В любых из приведенных выше примеров, двухвалентный фрагмент антитела может представлять собой (Fab)₂'-фрагмент или двухвалентный одноцепочечный Fv-фрагмент, тогда как одновалентный фрагмент антитела можно выбирать из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и одноцепочечного Fv-фрагмента (scFv). В любых из приведенных выше примеров, белковая связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами может представлять собой аптамер, мутеин, основанный на полипептиде семейства липокалина, глутело, белок, основанный на анкириновом каркасе, белок, основанный на кристаллиновом каркасе, аднектин и авимер.

[0295] В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, специфически направленно воздействует на молекулу, экспрессируемую на поверхности клеток-мишеней, где молекула представляет собой TCR или химерный антигенный рецептор. Например, молекулу, экспрессируемую на поверхности клетки-мишени, выбирают из комплекса антигенного рецептора T-клетки или B-клетки, цепи CD3, CD3ζ, антиген-связывающей части T-клеточного рецептора или B-клеточного рецептора или химерного антигенного рецептора. В некоторых случаях, рецептор-связывающее средство направленно воздействует на комплексы пептидов:MHC класса I.

[0296] В некоторых вариантах осуществления стимулирующее средство связывается с внеклеточным доменом с гистидиновой меткой из молекулы, экспрессируемой на поверхности клеток-мишеней. В некоторых случаях, стимулирующее средство содержит пептидную последовательность Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (также называемую Strep-tag^® II, приведенную в SEQ ID № 8), конъюгированную с заряженной никелем trisNTA (также называемой His-STREPPER или His/Strep-tag^®II Adapter). В некоторых вариантах осуществления молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, которая имеет гистидиновую метку, представляет собой CD19.

[0297] В некоторых аспектах, рецептор-связывающее средство, например, стимулирующее средство, специфически связывается с антительной частью рекомбинантного рецептора, например, CAR. В некоторых случаях, антительная часть рекомбинантного рецептора содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, такую как шарнирная область, например, шарнирная область IgG4, и/или CH1/CL и/или Fc-область. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть относится к IgG человека, такому как IgG4 или IgG1. В некоторых случаях реактив нагружают с использованием αIgG, который распознает спейсер IgG4.

2. Средства отбора

[0298] В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой средство отбора. В некоторых вариантах осуществления средство отбора связывается с молекулой на поверхности клетки, такой как молекула клеточной поверхности. В некоторых случаях, молекула клеточной поверхности представляет собой селективный маркер. В некоторых таких случаях, средство отбора способно к специфическому связыванию с селективным маркером, экспрессируемым одной или несколькими клетками. В некоторых вариантах осуществления средство или средства отбора, которые обратимо связывают с реактивом, можно использовать для того, чтобы содействовать отбору или выделению клеток.

[0299] В некоторых аспектах, молекула клеточной поверхности, например, селективный маркер, может представлять собой антиген, определяющий желаемую популяцию или субпопуляцию клеток, например, популяцию или субпопуляцию клеток крови, например, лимфоцитов (например, T-клеток, T-хелперных клеток, например, CD4+ T-хелперных клеток, B-клеток или естественных киллерных клеток), моноцитов или стволовых клеток, например, CD34-положительных периферических стволовых клеток или стволовых клеток, экспрессирующих Nanog или Oct-4. В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой маркер, экспрессируемый на поверхности T-клеток или подмножества T-клеток, такого как CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA и/или CD45RO. Примеры T-клеток включают клетки, такие как CMV-специфические CD8+ T-лимфоциты, цитотоксические T-клетки, T-клетки памяти и регуляторные T-клетки (Treg). Иллюстративный пример Treg включает CD4 CD25 CD45RA регуляторные T-клетки и иллюстративный пример T-клеток памяти включает CD62L CD8+ специфические центральные T-клетки памяти. Молекула клеточной поверхности, например, селективный маркер, также может представлять собой маркер опухолевой клетки.

[0300] В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой CD4 и средство отбора специфически связывает CD4. В некоторых аспектах, средство отбора, которое специфически связывает, CD4 можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD4, двухвалентного фрагмент антитела из антитела против CD4, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD4 и белковой CD4-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD4, такое как двухвалентный фрагмент антитела или одновалентный фрагмент антитела (например, CD4 Fab-фрагмент), можно получать из антитела 13B8.2 или функционально активного мутанта 13B8.2, который сохраняет специфическое связывание с CD4. Например, образцовые мутанты антитела 13B8.2 или m13B8.2 описаны в патенте США № 7482000, заявке на патент США № US2014/0295458 или международную патентную заявку № WO2013/124474; и Bes, C, et al. J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003). Мутантный Fab-фрагмент, называемый «ml3B8.2», несет вариабельный домен CD4-связывающего мышиного антитела 13B8.2 и константный домен, содержащий константный домен CH1 человека типа γ, для тяжелой цепи и константный домен легкой цепи человека типа κ, как описано в патенте США 7482000. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD4, например, мутант антитела 13B8.2, содержит замену аминокислоты H91A в вариабельной легкой цепи, замену аминокислоты Y92A в вариабельной легкой цепи, замену аминокислоты H35A в вариабельной тяжелой цепи и/или замену аминокислоты R53A в вариабельной тяжелой цепи, каждая по нумерации Кабат. В некоторых аспектах, по сравнению с вариабельными доменами Fab-фрагмента 13B8.2 в ml3B8.2, остаток His в положении 91 легкой цепи (положение 93 в SEQ ID № 30) мутирован в Ala и остаток Arg в положении 53 тяжелой цепи (положение 55 в SEQ ID № 29) мутирован в Ala. В некоторых вариантах осуществления реактив, который обратимо связывают со средством против CD4 или его фрагментом, коммерчески доступен или его получают из реактива, который коммерчески доступен (например, № по каталогу 6-8000-206 или 6-8000-205 или 6-8002-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0301] В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой CD8 и средство отбора специфически связывает CD8. В некоторых аспектах, средство отбора, которое специфически связывает CD8, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD8, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD8, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD8 и белковой CD8-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD8, такое как двухвалентный фрагмент антитела или одновалентный фрагмент антитела (например, CD8 Fab-фрагмент), можно получать из антитела OKT8 (например, ATCC CRL-8014) или его функционально активного мутанта, который сохраняет специфическое связывание с CD8. В некоторых вариантах осуществления реактив, который обратимо связывают со средством против CD8 или его фрагментом, коммерчески доступен или его получают из реактива, который коммерчески доступен (например, № по каталогу 6-8003 или 6-8000-201; IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0302] В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой CD3 и средство отбора специфически связывает CD3. В некоторых аспектах, средство отбора, которое специфически связывает CD3, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD3, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD3, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD3 и белковой CD3-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD3, такое как двухвалентный фрагмент антитела или одновалентный фрагмент антитела (например, CD3 Fab-фрагмент), можно получать из антитела OKT3 (например, ATCC CRL-8001; см., например, Stemberger et al. PLoS One. 2012; 7(4): e35798) или его функционально активного мутанта, который сохраняет специфическое связывание с CD3. В некоторых вариантах осуществления реактив, который обратимо связывают со средством против CD3 или его фрагментом, коммерчески доступен или его получают из реактива, который коммерчески доступен (например, № по каталогу 6-8000-201, 6-8001-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0303] В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой CD25 и средство отбора специфически связывает CD25. В некоторых аспектах, средство отбора, которое специфически связывает CD25, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD25, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD25, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD25 и белковой CD25-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD25, такое как двухвалентный фрагмент антитела или одновалентный фрагмент антитела (например, CD25 Fab-фрагмент), можно получать из антитела FRT5 (см., например, Stemberger et al. 20128) или его функционально активного мутанта, который сохраняет специфическое связывание с CD25. В некоторых вариантах осуществления реактив, который обратимо связывают со средством против CD4 или его фрагментом, коммерчески доступен или его получают из реактива, который коммерчески доступен (например, № по каталогу 6-8000-205 или 6-8000-207 или 6-8004-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0304] В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой CD62L и средство отбора специфически связывает CD62L. В некоторых аспектах, средство отбора, которое специфически связывает CD62L, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD62L, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD62L, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD62L и белковой CD62L-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD62L, такое как двухвалентный фрагмент антитела или одновалентный фрагмент антитела (например, CD62L Fab-фрагмент), можно получать из антитела DREG56 (например, ATCC HB300; см., например, Stemberger et al. 2012) или его функционально активного мутанта, который сохраняет специфическое связывание с CD62L. В некоторых вариантах осуществления реактив, который обратимо связывают со средством против CD62L или его фрагментом, коммерчески доступен или его получают из реактива, который коммерчески доступен (например, № по каталогу 6-8000-204 или 6-8005-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0305] В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой CD45RA и средство отбора специфически связывает CD45RA. В некоторых аспектах, средство отбора, которое специфически связывает CD45RA, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD45RA, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD45RA, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD45RA и белковой CD45RA-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD45RA, такое как двухвалентный фрагмент антитела или одновалентный фрагмент антитела (например, CD45RA Fab-фрагмент), можно получать из антитела MEM56 (например, Millipore 05-1413; см., например, Stemberger et al., 2012) или его функционально активного мутанта, который сохраняет специфическое связывание с CD45RA. В некоторых вариантах осуществления реактив, который обратимо связывают со средством против CD45RA или его фрагментом, коммерчески доступен или его получают из реактива, который коммерчески доступен (например, № по каталогу 6-8000-208 или 6-8007-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0306] В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой CD45RO и средство отбора специфически связывает CD45RO. В некоторых аспектах, средство отбора, которое специфически связывает CD45RO, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD45RO, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD45RO, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD45RO и белковой CD45RO-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления реактив, который обратимо связывают со средством против CD45RO или его фрагментом, коммерчески доступен или его получают из реактива, который коммерчески доступен (например, № по каталогу 6-8000-209 или 6-8012-020; IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0307] В некоторых вариантах осуществления селективный маркер может представлять собой CD154 и средство отбора специфически связывает CD154. В некоторых аспектах, средство отбора, которое специфически связывает CD154, можно выбирать из группы, состоящей из антитела против CD154, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD154, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD154 и белковой CD154-связывающей молекулы с антителоподобными связывающими свойствами. В некоторых вариантах осуществления реактив, который обратимо связывают со средством против CD154 или его фрагментом, коммерчески доступен или его получают из реактива, который коммерчески доступен (например, № по каталогу 6-8000-202 или 6-5510-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0308] В любых из приведенных выше примеров, двухвалентный фрагмент антитела может представлять собой (Fab)₂'-фрагмент или двухвалентный одноцепочечный Fv-фрагмент, тогда как одновалентный фрагмент антитела можно выбирать из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и одноцепочечного Fv-фрагмента (scFv). В любых из приведенных выше примеров, белковая связывающая молекула с антителоподобными связывающими свойствами может представлять собой аптамер, мутеин, основанный на полипептиде семейства липокалина, глутело, белок, основанный на анкириновом каркасе, белок, основанный на кристаллиновом каркасе, аднектин и авимер.

III. СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК

[0309] Предоставлены способы модуляции одной или нескольких клеток посредством культивирования или инкубации композиции, содержащей клетки-мишени (например, T-клетки), в присутствии рецептор-связывающего средства, например, стимулирующего средства, которое обратимо связывают с реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию рецептор-связывающим средством, например, стимулирующим средством. В некоторых вариантах осуществления способы осуществляют в условиях, в которых стимулирующее средство специфически связывается с молекулой, экспрессируемой на поверхности клетки-мишени, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в клетке-мишени.

[0310] В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы осуществляют на основе, где во время по меньшей мере части инкубации или культивирования множество клеток-мишеней иммобилизуют на основе. В некоторых аспектах, реактив мультимеризации или другой реактив мультимеризации, способный к ассоциации или связыванию с клетками-мишенями, иммобилизуют на основе так, что множество клеток-мишеней становится иммобилизованным на основе через связывание между связывающим средством реактива мультимеризации и клетками-мишенями. В некоторых вариантах осуществления реактив обратимо связывают со связывающим средством, таким как средство отбора, которое специфически связывается с молекулой на поверхности клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления реактив мультимеризации, иммобилизованный на основе, например, в стационарной фазе (например, колонке), представляет собой тот же реактив, обратимо связанный с рецептор-связывающим средством, например, стимулирующим средством. В некоторых вариантах осуществления реактив мультимеризации, обратимо связанный с рецептор-связывающим средством, например, стимулирующим средством, представляет собой первый реактив и реактив мультимеризации, иммобилизованный на основе, например, в стационарной фазе (например, колонке), представляет собой второй реактив. В некоторых аспектах, первый реактив может представлять собой растворимый реактив, который загружают на колонку. В некоторых аспектах, первый реактив также можно иммобилизовать на основе, например, в стационарной фазе (например, колонке).

[0311] В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы культивирования клеток включают инкубацию композиции, содержащей клетки-мишени (например, T-клетки), в присутствии средства (например, первого или второго, рецептор-связывающих средств, например, стимулирующих средств или средств отбора), которое способно к связыванию с молекулой на поверхности клеток-мишеней (например, T-клетки) в композиции и которое обратимо связывают с реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию со средством. В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в условиях, в которых средство связывается, например, специфически связывается с молекулой на клетке. В некоторых случаях, для определенных рецептор-связывающих средств (например, стимулирующих средств), такое связывание может индуцировать или модулировать сигнал в клетках-мишенях (например, T-клетках) в композициях, такой как первичный сигнал или вспомогательный сигнал, как описано. В некоторых вариантах осуществления связывание средства с молекулой ведет к одному или нескольким из стимуляции, активации, размножения (пролиферации) и/или дифференцировки клеток-мишеней в композиции.

[0312] В некоторых вариантах осуществления предоставленный способ можно использовать для избирательной индукции размножения популяции клеток ex vivo, таких как B-клетки, T-клетки или естественные киллерные клетки. В некоторых случаях, стимуляция может быть в отсутствие экзогенных факторов роста, таких как лимфокины, и вспомогательных клеток. В некоторых вариантах осуществления пролиферацию этих клеток, таких как B-клетки или T-клетки, можно индуцировать без потребности в антигене, таким образом предоставляя популяцию размноженных клеток, такую как популяция T-клеток, которая является поликлональной в отношении антигенной реактивности. Способы, раскрытые в настоящем описании, могут обеспечивать продолжительную пролиферацию выбранной популяции T-клеток, таких как CD4+ или CD8+ T-клетки, в течение длительного периода времени, чтобы получать многократное увеличение числа этих клеток относительно исходной популяции T-клеток. В целом, в случае (клонального) размножения популяции лимфоцитов, как раскрыто в настоящем описании, все потомство может обладать той же антигенной специфичностью, что и популяция клеток, которую выбирали для размножения.

[0313] В некоторых вариантах осуществления способы относятся к размножению популяции антиген-специфических T-клеток. В некоторых вариантах осуществления для получения популяции антиген-специфических T-клеток, T-клетки приводят в контакт с антигеном в форме, подходящей для запуска первичного сигнала активации в T-клетке, т. е., антиген презентируют T-клетке так, что запускают сигнал в T-клетке через комплекс TCR/CD3. Например, антиген можно презентировать T-клетке с помощью антигенпредставляющей клетки в сочетании с молекулой MHC. Антигенпредставляющую клетку, такую как B-клетка, макрофаг, моноцит, дендритная клетка, клетка Лангерганса или другая клетка, которая может презентировать антиген T-клетке, можно инкубировать с T-клеткой в присутствии антигена (например, растворимого антигена) так, что антигенпредставляющая клетка презентирует антиген T-клетке. Альтернативно, клетку, экспрессирующую антиген, представляющий интерес, можно инкубировать с T-клеткой. Например, опухолевую клетку, экспрессирующую опухолеассоциированные антигены, можно инкубировать с T-клеткой вместе для того, чтобы индуцировать опухолеспецифичный ответ. Аналогичным образом, клетку, инфицированную патогеном, например, вирусом, которая презентирует антигены патогена, можно инкубировать с T-клеткой. После антиген-специфической активации популяции T-клеток, клетки можно размножать в соответствии с предоставленными способами. Например, после создания антигенной специфичности, T-клетки можно размножать посредством культуры с антителом против CD3 (используемым в качестве первого средства) и антителом против CD28 (используемым в качестве второго средства) в соответствии со способами, описанным в настоящем описании. В другом варианте осуществления первое средство может представлять собой комплекс MHCI:пептид, который связывается с антиген-специфической популяцией T-клеток. В таком варианте осуществления можно использовать любой антиген-специфический пептид, который известен и который может образовывать комплекс с соответствующей молекулой MHCI. Альтернативно, также возможно использовать в качестве первого средства естественный лиганд рецептора, который запускает размножение клеток. Например, внеклеточный домен CD19 можно использовать для того, чтобы вызывать активацию внутриклеточных сигнальных каскадов клеток, трансдуцированных для того, чтобы экспрессировать химерный CD19-связывающий антигенный рецептор (CAR). Образцовые аспекты вышеуказанного приведены в примерах.

[0314] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ культивирования популяции клеток in vitro, который включает приведение в контакт образца, содержащего композицию, содержащую множество клеток, с реактивом мультимеризации. Реактив мультимеризации имеет обратимо иммобилизованное на нем (связанное с ним) средство (первое или второе дополнительное, рецептор-связывающее, например, стимулирующее средство или средство отбора), которое можно использовать для отбора, стимуляции, размножения и/или дифференцировки клеток. В некоторых вариантах осуществления, первое средство, которое обеспечивает первичный сигнал активации для клеток, где реактив мультимеризации содержит по меньшей мере один сайт связывания Z1 для обратимого связывания первого средства. Первое средство содержит по меньшей мере один партнер связывания C1, где партнер связывания C1 способен к обратимому связыванию с сайтом связывания Z1 реактива мультимеризации, где первое средство связывают с реактивом мультимеризации через обратимую связь, образуемую между партнером связывания C1 и сайтом связывания Z1. Первое средство связывается с молекулой рецептора на поверхности клеток, тем самым обеспечивая первичный сигнал активации для клеток и тем самым активируя клетки.

[0315] В некоторых вариантах осуществления реактив мультимеризации иммобилизуют на основе, такой как твердая поверхность. В некоторых вариантах осуществления реактив мультимеризации не связывают с основой, например, не связывают с твердой поверхностью или стационарной фазой.

[0316] Например, в некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ размножения популяции клеток in vitro, который включает приведение в контакт образца, содержащего популяцию клеток, с реактивом мультимеризации, где реактив мультимеризации не иммобилизуют на твердом носителе, т.е. он находится в растворимой форме, и имеет связанное с ним средство (первое или второе, рецептор-связывающее, например, стимулирующее средство или средство отбора), которое можно использовать для отбора, стимуляции, размножения и/или дифференцировки клеток. В некоторых вариантах осуществления средство, например, первое средство, которое обеспечивает первичный сигнал активации для клеток, обратимо связывают с реактивом мультимеризации. Реактив мультимеризации содержит по меньшей мере один сайт связывания, например, Z1, для связывания первого средства, где первое средство содержит по меньшей мере один партнер связывания, например, C1, где партнер связывания C1 способен к связыванию с сайтом связывания Z1 реактива мультимеризации. В некоторых вариантах осуществления первое средство связывают с реактивом мультимеризации через связь, образуемую между партнером связывания C1 и сайтом связывания Z1, и первое средство связывается с молекулой рецептора на поверхности клеток, тем самым обеспечивая первичный сигнал активации для клеток и тем самым активируя клетки. В некоторых вариантах осуществления, когда используют растворимый реактив мультимеризации, связь между связывающей частью C, например, C1, и сайтом связывания Z, например, Z1, не обязана быть обратимой.

[0317] Например, в некоторых вариантах осуществления предоставленные способы также включают использование реактива мультимеризации, имеющего связанное с ним второе средство, например, вспомогательные или костимулирующие молекулы, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток. В некоторых случаях реактив мультимеризации иммобилизуют на основе, например, твердом носителе или стационарной фазе. В некоторых вариантах осуществления реактив мультимеризации не иммобилизуют на основе, т. е. он находится растворимой форме. В некоторых вариантах осуществления второе средство содержит партнер связывания, например, C2, где партнер связывания, например, C2, способен к обратимому связыванию с сайтом связывания, например, Z2, реактива мультимеризации, где второе средство связывают с реактивом мультимеризации через обратимую связь, образуемую между партнером связывания C2 и сайтом связывания Z2. В некоторых вариантах осуществления связь, образуемая между партнером связывания C1 и сайтом связывания Z1, может быть обратимой, и связь, образуемая между партнером связывания C2 и сайтом связывания Z2, может быть обратимой. В этом случае, константа диссоциации (K_d) для обратимого связывания между указанным сайтом связывания Z1 и указанным партнером связывания C1 и/или для обратимого связывания между указанным сайтом связывания Z2 и указанным партнером связывания C2 может находиться в диапазоне от 10^-2 M до 10^-13 M. В некоторых аспектах, например, когда реактив мультимеризации не связывают с основой (например, не связывают с твердым носителем или стационарной фазой), связь, образуемая между партнером связывания C1 и сайтом связывания Z1, может быть необратимой и/или также связь, образуемая между партнером связывания C2 и сайтом связывания Z2, может быть необратимой

[0318] В некоторых случаях, второе средство связывается со вспомогательной молекулой на поверхности на поверхности клеток, тем самым стимулируя активированные клетки. В этом варианте осуществления перво средство может стимулировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал в T-клетках и может представлять собой связывающее средство, которое специфически связывает CD3. В этом варианте осуществления вспомогательная молекула на T-клетке можте представлять собой CD28, и второе средство, которое связывает вспомогательную молекулу, представляет собой связывающий реактив, который специфически связывает CD28. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления находят, что также можно использовать направленное воздействие на другие вспомогательные молекулы, которые, в некоторых случаях, могут изменять, например, улучшать, один или несколько признаков, свойств или характеристик культивируемых клеток. В некоторых вариантах осуществления вспомогательная молекула может представлять собой одно или несколько из CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM (например, антитело против CD90, антитело против CD95, антитело против CD137 и антитело против CD154, антитело против ICOS, антитело против LAT, антитело против CD27, антитело против OX40 или антитело против HVEM, соответственно. Образцовые средства, такие как рецептор-связывающие средства (например, стимулирующие средства), описаны далее.

[0319] В некоторых вариантах осуществления предоставленный способ можно осуществлять при любой температуре, при которой жизнеспособность популяции клеток является по меньшей мере по существу не нарушенной. В некоторых вариантах осуществления условия, при которых осуществляют инкубацию или культуру, включают любые условия, которые являются по меньшей мере по существу не опасными, не вредоносными или по меньшей мере по существу не нарушающими жизнеспособность, например, при которых процентная доля популяции клеток, которые подлежат размножению, при полной жизнеспособности, составляет по меньшей мере 70%, в том числе по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 99,5%. В некоторых вариантах осуществления предоставленный способ осуществляют при температуре приблизительно 20°C или выше. В зависимости от популяции клеток, подлежащих размножению, подходящий температурный диапазон может составлять, например, приблизительно от 20°C приблизительно до 45°C, в том числе приблизительно от 25°C приблизительно до 40°C, или приблизительно от 32°C до 37°C. В некоторых вариантах осуществления способ в соответствии с изобретением осуществляют при постоянном значении температуры или при выбранном значении температуры±приблизительно 5°C, ±приблизительно 4°C, ±приблизительно 3°C, ±приблизительно 2°C, ±приблизительно 1°C или±приблизительно 0,5°C. Специалист в данной области способен эмпирически определять подходящую температуру, учитывая природу клеток и условия размножения. Обычно клетки человека размножают при такой температуре, как 37°C.

[0320] В соответствии с раскрытием в настоящем описании, также предоставлены мультимеризованные средства или композиции, содержащие реактивы мультимеризации, которые способны к размножению популяции клеток. Такое мультимеризованное средство, которое способно к размножению популяции клеток, представляет собой реактив мультимеризации, который не связывают с основой (например, в растворимой форме) и содержит по меньшей мере один сайт связывания Z, например, Z1, для обратимого связывания первого средства, которое обеспечивает первичный сигнал активации для клеток, где реактив мультимеризации имеет обратимо связанное с ним указанное первое средство, которое обеспечивает первичный сигнал активации для клеток; где первое средство содержит по меньшей мере один партнер связывания C, например, C1, где партнер связывания C1 способен к обратимому связыванию с по меньшей мере одним сайтом связывания Z1 реактива мультимеризации, где первое средство связывают с реактивом мультимеризации через обратимую связь, образуемую между партнером связывания C1 и сайтом связывания Z1. Здесь следует отметить, что такой реактив мультимеризации может иметь иммобилизованное на нем любое из первых средств, коорые описаны в настоящем описании.

[0321] В некоторых вариантах осуществления мультимеризованное средство, предоставленное в настоящем описании, дополнительно может содержать по меньшей мере один сайт связывания, например, Z2, для обратимого связывания второго средства, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток, где реактив мультимеризации имеет обратимо связанное с ним второе средство, которое стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток, где второе средство содержит партнер связывания, например, C2, где партнер связывания C2 способен к связыванию с по меньшей мере одним сайтом связывания Z2 реактива мультимеризации. В этом варианте осуществления второе средство связывают с реактивом мультимеризации через связь, образуемую между партнером связывания C2 и сайтом связывания Z2. В некоторых вариантах осуществления второе средство представляет собой любое, которое может связываться с CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM (например, антитело против CD90, антитело против CD95, антитело против CD137 и антитело против CD154, антитело против ICOS, антитело против LAT, антитело против CD27, антитело против OX40 или антитело против HVEM, соответственно).

[0322] В некоторых вариантах осуществления культивирование композиции, содержащей клетки-мишени (например, T-клетки), с мультимеризованным средством (например, мутеином стрептавидина против CD3/против CD28 или его олигомером) можно осуществлять в биореакторе, таком как половолоконный биореактор (например, половолоконный биореактор Quantum^® Cell Expansion System) или биореактор с пластмассовым мешком (например, Cellbag^®, используемый в Xuri Cell Expansion System W25 из GE Healthcare).

[0323] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает приведение в контакт культивируемых клеток-мишеней (например, T-клеток) в реакционной смеси (например, содержащей клетки-мишени, например, T-клетки, связанные с реактивом мультимеризации, например, через первое средство и второе средство) с (i) конкурентным реактивом (например, свободным первым партнером связывания C, например, C1) или его аналогом, способным разрушать связь между первым партнером связывания, например, C1, и сайтом связывания, например, Z1, и/или (например, в случае необходимости) (ii) вторым конкурентным реактивом, например, свободным вторым партнером связывания, например, C2, или его аналогом, способным разрушать связь между вторым партнером связывания C2 и сайтом связывания Z2. Поступая таким образом, разрушают обратимую связь между указанным партнером связывания C1 первого средства и указанными сайтами связывания Z1, а также обратимую связь между указанным партнером связывания C2 второго средства и указанным сайтом связывания Z2 указанного реактива мультимеризации, тем самым высвобождая в элюат T-клетки, связанные с реактивом мультимеризации через первое средство и второе средство и разрушая стимуляцию и/или размножение T-клеток.

[0324] В некоторых вариантах осуществления конкурентный реактив (например, первый и/или второй конкурентный реактив) добавляют в пределах 5 суток после инициации инкубации, например, в пределах 4 суток, 3 суток, 2 суток или 1 суток). Таким образом, контролируя время, в которое разрушают стимуляцию, один или несколько конкретных признаков культивируемых T-клеток, элюируемых из мультимеризованного средства, можно изменять, как раскрыто в настоящем описании.

[0325] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает отделение или удаление одного или нескольких компонентов, остающихся после обратимой диссоциации компонентов. В некоторых вариантах осуществления любой несвязанный или остаточный биотин в культивируемых клетках-мишенях (например, T-клетках) можно отделять или удалять. В некоторых вариантах осуществления реактив мультимеризации удаляют или отделюят от клеток в композиции культивируемых клеток-мишеней. Например, в некоторых вариантах осуществления разделение/удаление можно осуществлять с использованием второй стационарной фазы. С этой целью, смесь, содержащую клетки-мишени (например, T-клетки) и растворимый реактив мультимеризации, подвергают, до или после нанесения на первую стационарную фазу, описанную выше, хроматографии на подходящей второй стационарной фазе. Эта вторичная стационарная фаза может представлять собой гельфильтрационную матрицу и/или матрицу аффинной хроматографии, где гельфильтрационная матрица и/или матрица аффинной хроматографии содержит аффинный реактив. Аффинный реактив, содержащийся на хроматографической смоле, включает партнер связывания D, который (специфически) связывается с сайтом связывания Z1 и/или сайтом связывания Z2, если присутствует, реактива мультимеризации, тем самым иммобилизуя реактив мультимеризации на стационарной фазе. Если используют реактив мультимеризации, основанный на стрептавидине, и как первое, так и второе средства имеют стрептавидин-связывающий пептид в качестве партнера связывания C1 или C2, партнер связывания D, который содержится в аффинном реактиве этой второй стационарной фазы, может представлять собой биотин. Растворимый олигомер стрептавидина или мутеина стрептавидина, который используют в качестве реактива мультимеризации, после этого связывается с биотином, который обычно ковалентно связывают с хроматографической матрицей, такой как Biotin-sepharose™, которая коммерчески доступна. В некоторых таких вариантах осуществления, культивируемые клетки (например, культивируемые T-клетки) можно извлекать из реактива мультимеризации.

A. Клетки

[0326] В некоторых вариантах осуществления образец популяции клеток может быть из любого подходящего источника, обычно весь образец ткани организма или текучего вещества организма, такого как кровь. В последнем случае, образец может представлять собой, например, популяцию мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), которую можно получать стандартными способами выделения, такими как градиент клеток крови в фиколле. Однако популяция клеток, подлежащих стимуляции ли размножению, также может быть в очищенной форме и может быть выделена с использованием технологии обратимого окрашивания/выделения клеток, как описано в патенте США 7776562, патенте США 8298782, международной патентной заявке № WO02/054065 или международной патентной заявке № WO2013/011011. Альтернативно, популяцию клеток также можно получать посредством сортировки клеток через отрицательную магнитную иммунную адгезию, как описано в патенте США 6352694 B1 или европейском патенте EP 0 700 430 B1. Если способ выделения, описанный здесь, используют в базовом исследовании, образец может представлять собой клетки из экспериментов с клеточными культурами in vitro. Образец обычно получают в форме текучего вещества, такого как раствор или дисперсия.

[0327] Клетки, содержащиеся в композиции, содержащие клетки-мишени, в целом представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, и обычно представляют собой клетки человека. В некоторых вариантах осуществления клетки получают из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов или представляют собой клетки иммунной системы, такие как клетки врожденного или приобретенного иммунитета, например, миелоидные или лимфоидные клетки, в том числе лимфоциты, обычно T-клетки и/или NK клетки. Другие образцовые клетки включают стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, в том числе индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Клетки обычно представляют собой эмбриональные клетки, такие как те, которые выделены непосредственно у субъекта и/или выделены у субъекта и заморожены.

[0328] В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предусмотрены обратимо связанные средства, такие как мультимеризованные средства, способные к размножению популяции или субпопуляции лимфоцитов, содержащейся в популяции лимфоцитов. Популяция лимфоцитов, подлежащая размножению, может представлять собой любую подходящую популяцию, например, популяцию B-клеток, популяцию T-клеток или популяцию естественных киллерных клеток. популяция T-клеток может представлять собой популяцию антиген-специфических T-клеток, популяцию клеток T-хелперов, популяцию цитотоксических T-клеток, T-клеток памяти, регуляторных T-клеток или естественных киллерных T-клеток. Соответственно, в таких вариантах осуществления мультимеризованного средства первое средство способно стимулировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал в T-клетках. Первое средство, присутствующее в мультимеризованном средстве, таким образом, может представлять собой связывающий реактив, который специфически связывает CD3, тогда как второе средство, которое связывает вспомогательную молекулу, например, может представлять собой связывающее средство, которое специфически связывает CD28, CD137 CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM.

[0329] В некоторых вариантах осуществления клетки включают одно или несколько подмножеств T-клеток или клети других типов, такие как популяции не сортированных T-клеток, CD3+, CD4+ клетки, CD8+ клетки и их субпопуляции, такие как те, которые определяют по функции, состоянию активации, зрелости, потенциалу к дифференцировке, размножению, рециркуляции, локализации и/или способности к персистенции, антигенной специфичности, типу антигенного рецептора, присутствию в конкретном органе или компартменте, маркеру или профилю секреции цитокинов и/или степени дифференцировки. В отношении субъекта, подлежащего лечению, клетки могут быть аллогенными и/или аутологическими. Способы включают типовые способы. В некоторых аспектах, например, для типовых технологий, клетки являются плюрипотентными и/или мультипотентными, например, стволовыми клетками, например, индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPSC). В некоторых вариантах осуществления способы включают выделение клеток у субъекта, их подготовку, обработку, культивирование и/или конструирование, как раскрыто в настоящем описании, и повторное их введение тому же пациенту, до или после криосохранения.

[0330] В некоторых вариантах осуществления T-клетки, такие как CD3+, CD4+ или CD8+ клетки, дополнительно не обогащают по другому маркеру. В некоторых вариантах осуществления T-клетки дополнительно не обогащают по CD62L+ клеткам.

[0331] Среди подтипов и субпопуляций T-клеток и/или CD4+ и/или CD8+ T-клеток - наивные T (T_N) клетки, эффекторные T-клетки (T_EFF), T-клетки памяти и их подтипы, такие как стволовая T-клетка памяти (T_SCM), центральная T-клетка памяти (T_CM), эффекторная T-клетка памяти (T_EM) или окончательно дифференцированные эффекторные T-клетки памяти, опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (TIL), незрелые T-клетки, зрелые T-клетки, хелперные T-клетки, цитотоксические T-клетки, ассоциированные со слизистой инвариантные T-клетки (MAIT), встречающиеся в природе и адаптивные регуляторные T-клетки (Treg), хелперные T-клетки, такие как TH1 клетки, TH2 клетки, TH3 клетки, TH17 клетки, TH9 клетки, TH22 клетки, фолликулярные хелперные T-клетки, α/β T-клетки и δ/γ T-клетки.

[0332] В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой естественные киллерные (NK) клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой моноциты или гранулоциты, например, миелоидные клетки, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и/или базофилы.

Получение клеток

[0333] В некоторых вариантах осуществления получение клеток включает одну или несколько стадий культивирования и/или получения. Клетки можно выделять из образца, такого как биологический образец, например, тот, что получен или извлечен у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъектом, у которого выделяют клетки, является тот, кто имеет заболевание или состояние или нуждается в клеточной терапии или кому будут вводить клеточную терапию. Субъект в некоторых вариантах осуществления представляет собой человека, нуждающегося в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, обрабатывают и/или конструируют.

[0334] Соответственно, клетки в некоторых вариантах осуществления представляют собой эмбриональные клетки, например, эмбриональные клетки человека. Образцы включают ткань, текучее вещество и другие образцы, взятые непосредственно у субъекта, а также образцы, являющиеся результатом одной или нескольких стадий обработки, таких как разделение, центрифугирование, генетическая инженерия (например, трансдукция вирусным вектором), промывание и/или инкубация. Биологический образец может представлять собой образец, полученный непосредственно из биологического источника, или образец, который обработан. Биологические образцы включают, но не ограничиваясь этим, текучие вещества организма, такие как кровь, плазма, сыворотка, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов, в том числе обработанные образцы, полученные из них.

[0335] В некоторых аспектах, образец, из которого получают или выделяют клетки, представляет собой кровь или образец, полученный из крови, или он представляет собой или его извлекают из продукта афереза или лейкафереза. Образцовые образцы включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), лейкоциты, костный мозг, тимус, тканевой биоптат, опухоль, лейкоз, лимфому, лимфатический узел, ассоциированную с кишечником лимфоидную ткань, ассоциированную со слизистой лимфоидную ткань, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкое, желудок, кишечник, ободочную кишку, почку, поджелудочную железу, молочную железу, кость, предстательную железу, шейку матки, яички, яичники, миндалину или другой орган и/или клетки, полученные из него. Образцы включают, в контексте клеточной терапии, например, адоптивной клеточной терапии, образцы из аутологических и аллогенных источников.

[0336] В некоторых вариантах осуществления клетки получают из клеточных линий, например, линий T-клеток. Клетки в некоторых вариантах осуществления получают из ксеногенного источника, например, от мыши, крысы, не являющегося человеком примата или свиньи.

[0337] В некоторых вариантах осуществления выделение клеток включает одну или несколько стадий получения и/или разделения клеток не на основании аффинности. В некоторых примерах, клетки промывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствии одного или нескольких реактивов, например, чтобы удалять нежелательные компоненты, обогащать желаемые компоненты, лизировать или удалять клетки, чувствительные к конкретным реактивам. В некоторых примерах клетки разделяют на основании одного или нескольких свойств, таких как плотность, адгезивные свойства, размер, чувствительность и/или устойчивость к конкретным компонентам.

[0338] В некоторых примерах, клетки из циркулирующей крови субъекта получают, например, посредством афереза или лейкафереза. Образцы, в некоторых аспектах, содержат лимфоциты, в том числе T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядросодержащие белые клетки крови, красные клетки крови и/или тромбоциты и в некоторых аспектах содержат клетки, отличные от красных клеток крови и тромбоцитов.

[0339] В некоторых вариантах осуществления клетки крови, собранные у субъекта, промывают, например, чтобы удалять фракцию плазмы и помещать клетки в подходящий буфер или среды для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В некоторых вариантах осуществления промывающий раствор не содержит кальций и/или магний и/или многие или все двухвалентные катионы. В некоторых аспектах, стадию промывания выполняют в полуавтоматической «проточной» центрифуге (например, клеточный процессор Cobe 2991, Baxter) по инструкциям производителя. В некоторых аспектах, стадию промывания выполняют посредством тангенциального поточного фильтрования (TFF) по инструкциям производителя. В некоторых вариантах осуществления клетки ресуспендируют в различных биосовместимых буферах после промывания, например, таких как PBS, не содержащий Ca⁺⁺/Mg⁺⁺. В определенных вариантах осуществления компоненты образца клеток крови удаляют и клетки ресуспендируют непосредственно в культуральных средах.

[0340] В некоторых вариантах осуществления способы включают способы разделения клеток на основании плотности, такие как получение белых клеток крови из периферической крови посредством лизиса красных клеток крови и центрифугирования через градиент Percoll или Ficoll.

[0341] В некоторых вариантах осуществления способы выделения включают разделение клеток различных типов на основании экспрессии или присутствия в клетке одной или нескольких конкретных молекул, таких как маркеры поверхности, например, белки поверхности, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любой известный способ разделения на основании таких маркеров. Способы разделения могут включать любые из тех, что раскрыты в настоящем описании, в том числе способы с использованием систем обратимых реактивов, например, средств (таких как рецептор-связывающие средства или средства отбора) и реактивов, как раскрыто в настоящем описании.

[0342] В некоторых вариантах осуществления разделение представляет собой разделение на основании аффинности или иммуноаффинности. Например, выделение в некоторых аспектах включает разделение клеток и популяций клеток на основании экспрессии или уровня экспрессии клеток для одного или нескольких маркеров, обычно поверхностных клеточных маркеров, например, посредством инкубации с антителом или партнером связывания, которые специфически связываются с такими маркерами, за чем обычно следуют стадии промывания и отделения клеток, с которыми связано антитело или партнер связывания, от тех клеток, с которыми не связано антитело или партнер связывания.

[0343] Такие стадии разделения могут быть основаны на положительном отборе, при котором клетки, с которыми связаны реактивы, сохраняют для дальнейшего использования, и/или отрицательном отборе, при котором сохраняют клетки, с которыми не связано антитело или партнер связывания. В некоторых примерах, обе фракции сохраняют для дальнейшего использования. В некоторых аспектах, отрицательный отбор может быть особенно эффективным, когда не доступно антитело, которое специфически идентифицирует тип клеток в гетерогенной популяции, так что разделение лучше всего осуществляют на основании маркеров, экспрессируемых клетками, отличными от желаемой популяции.

[0344] Разделение не обязательно ведет к 100% обогащению или удалению конкретной популяции клеток или клеток, экспрессирующих конкретный маркер. Например, положительный отбор или обогащение клеток конкретного типа, таких как те, которые экспрессируют маркер, относится к увеличению числа или процентной доли таких клеток, но не обязано вести к полному отсутствию клеток, не экспрессирующих маркер. Аналогичным образом, отрицательный отбор, удаление или истощение клеток конкретного типа, таких как те, которые экспрессируют маркер, относится к снижению числа или процентной доли таких клеток, но не обязано вести к полному удалению всех таких клеток.

[0345] В некоторых примерах, осуществляют несколько раундов стадий разделения, где положительно или отрицательно отобранную фракцию с одной стадии подвергают другой стадии разделения, такой как последующий положительный или отрицательный отбор. В некоторых примерах, одна стадия разделения позволяет истощать клетки, экспрессирующие несколько маркеров одновременно, например, посредством инкубации клеток с множеством антител или партнеров связывания, каждый обладает специфичностью к маркеру, направленному на отрицательный отбор. Аналогичным образом, несколько типов клеток можно одновременно отбирать положительно посредством инкубации клеток с множеством антител или партнеров связывания, экспрессируемых на клетках различных типов.

[0346] Например, в некоторых аспектах, конкретные субпопуляции T-клеток, такие как клетки, положительные или экспрессирующие высокие уровни одного или нескольких маркеров поверхности, например, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и/или CD45RO+ T-клетки, выделяют с помощью способов положительного или отрицательного отбора.

[0347] Например, CD3+, CD28+ T-клетки можно отбирать положительно с использованием CD3/CD28 конъюгированных магнитных бус (например, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).

[0348] В некоторых вариантах осуществления выделение осуществляют посредством обогащения по конкретной популяции клеток с помощью положительного отбора, или истощения конкретной популяции клеток, с помощью отрицательного отбора. В некоторых вариантах осуществления положительный или отрицательный отбор выполняют посредством инкубации клеток с одним или несколькими антителами или другим связывающим средством, которое специфически связывается с одним или несколькими маркерами поверхности, экспрессируемыми или экспрессируемыми (маркер⁺) на относительно высоком уровне (маркер^высок.) на положительно или отрицательно отобранных клетках, соответственно.

[0349] В некоторых вариантах осуществления T-клетки выделяют из образца PBMC с помощью отрицательного отбора маркеров, экспрессируемых на не T-клетках, таких как B-клетки, моноциты или другие белые клетки крови, например, CD14. В некоторых аспектах, стадию отбора по CD4+ или CD8+ используют для того, чтобы выделять CD4+ хелперные и CD8+ цитотоксические T-клетки. Такие CD4+ и CD8+ популяции дополнительно можно сортировать по субпопуляциям посредством положительного или отрицательного отбора по маркерам, экспрессируемым или экспрессируемым с относительно высокой степенью на одной или нескольких субпопуляциях наивных, эффекторных T-клеток и/или T-клеток памяти.

[0350] В некоторых вариантах осуществления CD8+ клетки дополнительно обогащают или истощают по наивным, центральным клеткам памяти, эффекторным клеткам памяти и/или центральным стволовым клеткам памяти, например, с помощью положительного или отрицательного отбора на основании антигенов поверхности, ассоциированных с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления обогащение по центральным T-клеткам памяти (TCM) осуществляют для увеличения эффекта, например, для усовершенствования долгосрочной выживаемости, размножения и/или приживления после введения, что в некоторых аспектах является особенно прочным в таких субпопуляциях. См. Terakura et al. (2012) Blood, 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. В некоторых вариантах осуществления объединение TCM-обогащенных CD8+ T-клеток и CD4+ T-клеток дополнительно усиливает эффект.

[0351] В определенных вариантах осуществления, T-клетки памяти присутствуют как в CD62L+, так и в CD62L- подмножестве CD8+ лимфоцитов периферической крови. PBMC можно обогащать или истощать по CD62L-CD8+ и/или CD62L+CD8+ фракциям, например, с использованием антител против CD8 и против CD62L.

[0352] В некоторых вариантах осуществления обогащение по центральным T-клеткам памяти (T_CM) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD127; в некоторых аспектах, оно основано на отрицательном отборе клеток, экспрессирующих или высоко экспрессирующих CD45RA и/или гранзим B. В некоторых аспектах, выделение CD8+ популяции, обогащенной T_CM клетками, осуществляют посредством истощения клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA, и положительного отбора или обогащения по клетка, экспрессирующим CD62L. В одном из аспектов, обогащение центральных T-клеток памяти (T_CM) осуществляют, начиная от отрицательной фракции клеток, отобранных на основании экспрессии CD4, которую подвергают отрицательному отбору на основании экспрессии CD14 и CD45RA и положительному отбору на основании CD62L. Такие отборы в некоторых аспектах осуществляют одновременно и в других аспектах осуществляют последовательно, в любом порядке. В некоторых аспектах, ту же стадию отбора на основании экспрессии CD4, используемую при получении CD8+ популяции или субпопуляции клеток, также используют для того, чтобы создавать CD4+ популяцию или субпопуляцию клеток, так что положительную и отрицательную фракции из разделения на основании CD4 сохраняют и используют в последующих стадиях способов, необязательно после одной или нескольких дополнительных стадий положительного или отрицательного отбора.

[0353] CD4+ T-хелперные клетки сортируют на наивные, центральные клетки памяти и эффекторные клетки посредством идентификации популяций клеток, которые имеют антигены клеточной поверхности. CD4+ лимфоциты можно получать стандартными способами. В некоторых вариантах осуществления наивные CD4+ T-лимфоциты представляют собой CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления центральные CD4+ клетки памяти представляют собой CD62L+ и CD45RO+. В некоторых вариантах осуществления эффекторные CD4+ клетки представляют собой CD62L- и CD45RO-.

[0354] В одном из примеров, для обогащения CD4+ клеток с помощью отрицательного отбора, коктейль моноклональных антител обычно содержит антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или партнер связывания связывают с твердым носителем или матрицей, такой как магнитная бусина или парамагнитная бусина, чтобы сделать возможным разделение клеток для положительного и/или отрицательного отбора. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и популяции клеток разделяют или выделяют с использованием иммуномагнитных (или аффинномагнитных) способов разделения (рассмотренных в Methods in Molecular Medicine, том 58: Metastasis Research Protocols, том 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, стр. 17-25, под редакцией: S. A. Brooks и U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

[0355] В некоторых аспектах, образец или композиция клеток, подлежащие разделению, инкубируют с небольшим, намагничиваемым или магнитно-чувствительным материалом, таким как магнитно-чувствительные частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные бусы (например, такие как бусы Dynalbeads или MACS). Магнитно-чувствительный материал, например, частицу, в целом непосредственно или опосредованно прикрепляют к партнеру связывания, например, антителу, который специфически связывается с молекулой, например, маркером поверхности, присутствующей на клетке, клетках или популяции клеток, которые желают отделять, например, которые желают отбирать отрицательно или положительно.

[0356] В некоторых вариантах осуществления магнитная частица или бусина содержит магнитно-чувствительный материал, связанный со специфическим связывающим элементом, таким как антитело или другой партнер связывания. Существует множество общеизвестных магнитно-чувствительных материалов, используемых в магнитных способах разделения. Подходящие магнитные частицы включают те, которые в Molday, патент США № 4452773, и в описании европейского патента EP 452342 B, которые включены, таким образом, посредством ссылки. Частицы коллоидных размеров, такие как те, что описаны у Owen, патент США № 4795698, и Liberti et al., патент США № 5200084, представляют собой другие примеры.

[0357] Инкубацию в целом осуществляют в условиях, в соответствии с которыми антитела или партнеры связывания, или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реактивы, которые специфически связываются с такими антителами или партнерами связывания, которые прикрепляют к магнитной частице или бусине, специфически связываются с молекулами клеточной поверхности, если они присутствуют на клетках в образце.

[0358] В некоторых аспектах, образец помещают в магнитное поле, и те клетки, которые имеют магнитно-чувствительные или намагничиваемые частицы, прикрепленные к ним, притягивают к магниту и отделяют от не меченых клеток. Для положительного отбора, сохраняют клетки, которые притягивают к магниту; для отрицательного отбора, сохраняют клетки, которые не притягивают (не меченые клетки). В некоторых аспектах, комбинацию положительного и отрицательного отбора осуществляют во время одной и той же стадии отбора, где положительные и отрицательные фракции сохраняют и дополнительно обрабатывают или подвергают дополнительным стадиям разделения.

[0359] В определенных вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы покрывают первичными антителами или другими партнерами связывания, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В определенных вариантах осуществления магнитные частицы прикрепляют к клеткам через покрывание первичными антителами со специфичностью к одному или нескольким маркерам. В определенных вариантах осуществления клетки, вместо бус, метят первичным антителом или партнером связывания и затем добавляют магнитные частицы, покрытые вторичным антителом со специфичностью к клеткам определенного типа или другим партнером связывания (например, стрептавидином). В определенных вариантах осуществления покрытые стрептавидином магнитные частицы используют в сочетании с биотинилированными первичными или вторичными антителами.

[0360] В некоторых вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы оставляют прикрепленными к клеткам, которые впоследствии подлежат инкубации, культивированию и/или конструированию; в некоторых аспектах, частицы оставляют прикрепленными к клеткам для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые или магнитно-чувствительные частицы удаляют из клеток. Способы удаления намагничиваемых частиц из клеток известны и включают, например, использование конкурентных не меченых антител, намагничиваемых частиц или антител, конъюгированных с расщепляемыми линкерами, и т.д. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые частицы являются биоразрушаемыми.

[0361] В некоторых вариантах осуществления отбор на основании аффинности происходит через магнитно-активированную сортировку клеток (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Системы магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) допускают отбор высокой чистоты для клеток, имеющих намагниченные частицы, прикрепленные к ним. В определенных вариантах осуществления MACS работает в режиме, в котором не целевые и целевые частицы последовательно элюируют после наложения внешнего магнитного пола. То есть клетки, прикрепленные к намагниченным частицам, удерживают на месте, тогда как не прикрепленные частицы элюируют. Затем, после завершения этой первой стадии элюирования, частицы, которые удерживало магнитное поле и которые не могли быть элюированы, высвобождают каким-либо образом так, что их можно элюировать и извлекать. В определенных вариантах осуществления не клетки-мишени метят и истощают в гетерогенной популяции клеток.

[0362] В определенных вариантах осуществления выделение или разделение осуществляют с использованием системы, устройства или устройства, который осуществляет одну или несколько из стадий выделения, подготовки клеток, разделения, обработки, инкубации, культивирования и/или формулирования в способах. В некоторых аспектах, систему используют для того, чтобы осуществлять каждую из этих стадий в замкнутом или стерильном окружении, например, чтобы минимизировать ошибки, пользовательское вмешательство и/или контаминацию. В одном из примеров, система представляет собой систему, как описано в международной публикации патентной заявки № WO2009/072003 или US 20110003380 A1.

[0363] В некоторых вариантах осуществления система или устройство осуществляет одну или несколько, например, все, из стадий выделения, обработки, конструирования и формулирования в интегрированной или автономной системе и/или автоматизированным или программируемым образом. В некоторых аспектах, система или устройство содержит компьютер и/или компьютерную программу в связи с системой или устройством, которые позволяют пользователю программировать, управлять, оценивать результат и/или корректировать различные аспекты стадий обработки, выделения, конструирования и формулирования.

[0364] В некоторых аспектах, разделение и/или другие стадии осуществляют с использованием системы CliniMACS (Miltenyi Biotec), например, для автоматизированного разделения клеток на уровне клинического масштаба в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать встроенный микрокомпьютер, блок магнитного разделения, перистальтический насос и различные клапаны с зажимами. Встроенный компьютер в некоторых аспектах контролирует все компоненты прибора и управляет системой для того, чтобы осуществлять повторные процедуры в стандартизированной последовательности. Блок магнитного разделения в некоторых аспектах содержит перемещаемый постоянный магнит и держатель для колонки для отбора. Перистальтический насос управляет скоростью потока на всем протяжении комплекта трубок и, вместе с клапанами с зажимами, обеспечивает управляемый поток буфера через систему и непрерывную суспензию клеток.

[0365] В системе CliniMACS, в некоторых аспектах, используют связанные с антителами намагничиваемые частицы, которые поставляют в стерильном, не пирогенном растворе. В некоторых вариантах осуществления, после мечения клеток магнитными частицами, клетки промывают для того, чтобы удалять избыток частиц. Затем мешок подготовки клеток соединяют с комплектом трубок, который в свою очередь соединяют с мешком, содержащим буфер, и мешком для сбора клеток. Комплект трубок состоит из предварительно собранных стерильных трубок, в том числе перед колонкой, и разделительной колонки и предназначен только для одного использования. После инициации программы разделения, система автоматически вносит образец клеток на разделительную колонку. Меченые клетки удерживают в колонке, тогда как не меченые клетки удаляют с помощью ряда стадий промывания. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования в способах, описанных в настоящем описании, являются не меченными, и их не удерживают в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования в способах, описанных в настоящем описании, метят и удерживают в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для использования в способах, описанных в настоящем описании, элюируют из колонки после удаления магнитного поля и собирают в мешок для сбора клеток.

[0366] В определенных вариантах осуществления разделение и/или другие стадии осуществляют с использованием системы CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). Система CliniMACS Prodigy в некоторых аспектах оснащена блоком обработки клеток, который делает возможным автоматизированное промывание и фракционирование клеток посредством центрифугирования. Система CliniMACS Prodigy также может содержать встроенную камеру и программное обеспечение распознавания образов, которое определяет оптимальную конечную точку фракционирования клеток посредством различения макроскопических слоев исходного клеточного продукта. Например, периферическую кровь можно автоматически разделять на слои эритроцитов, белых клеток крови и плазмы. Система CliniMACS Prodigy также может содержать встроенную камеру культивирования клеток, которая выполняет протоколы клеточной культуры, такие как, например, дифференцировка и размножение клеток, загрузка антигеном и долгосрочная клеточная культура. Входные порты могут предусматривать стерильное удаление и восполнение сред, и можно осуществлять мониторинг клеток с использованием встроенного микроскопа. См., например, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, и Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[0367] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) через проточную цитометрию, при которой поток текучего вещества несет клетки, окрашенные по нескольким поверхностным клеточным маркерам. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) через сортировку (FACS) в препаративном масштабе. В определенных вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем описании, собирают и обогащают (или истощают) с использованием чипов микроэлектромеханических систем (MEMS) в комбинации с системой обнаружения на основании FACS (см., например, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; и Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. В обоих случаях клетки можно метить с использованием нескольких маркеров, допускающих выделение четко определенных подмножеств T-клеток с высокой чистотой.

[0368] В некоторых вариантах осуществления антитела или партнеры связывания метят с использованием одного или нескольких поддающихся обнаружению маркеров, чтобы содействовать разделению для положительного и/или отрицательного отбора. Например, разделение может быть основано на связывании с флуоресцентно меченными антителами. В некоторых примерах, разделение клеток на основании связывания антител или других партнеров связывания со специфичностью к одному или нескольким поверхностным клеточным маркерам осуществляют в текучем потоке, например, посредством активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS), в том числе препаративного масштаба (FACS), и/или чипов микроэлектромеханических систем (MEMS), например, в комбинации с системой обнаружения проточной цитометрией. Такие способы делают возможным положительный и отрицательный отбор на основании нескольких маркеров одновременно.

[0369] В некоторых вариантах осуществления способы получения включают стадии заморозки, например, криосохранения, клеток, до или после выделения, инкубации и/или конструирования. В некоторых вариантах осуществления стадией заморозки и последующего оттаивания удаляют гранулоциты и, в определенной степени, моноциты в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в растворе для заморозки, например, после стадии промывания для того, чтобы удалять плазму и тромбоциты. В некоторых аспектах, можно использовать любые из различных известных растворов для заморозки и параметров. Один из примеров включает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% сывороточного альбумина человека (HSA), или других подходящих сред для заморозки клеток. Затем его разводят 1:1 с использованием сред с тем, чтобы конечная концентрация DMSO и HSA составляла 10% и 4%, соответственно. Затем клетки замораживают до -80°C. со скоростью 1° в минуту и хранят в паровой фазе в резервуаре для хранения в жидком азоте.

[0370] В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или культивируют до или в связи с генетической инженерией. Стадии инкубации могут включать культуру, культивирование, стимуляцию, активацию и/или размножение. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего средства. Такие условия включают те, которые разработаны для того, чтобы индуцировать пролиферацию, размножение, активацию и/или выживаемость клеток в популяции, чтобы имитировать антигенную экспозицию и/или подготавливать клетки для генетической инженерии, например, для введения рекомбинантного антигенного рецептора.

[0371] Условия могут включать одно или несколько из конкретных сред, температуры, содержания кислорода, содержания диоксида углерода, времени, средств, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, партнеры связывания, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы и любые другие средства, разработанные для того, чтобы активировать клетки.

[0372] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия или средства включают одно или несколько средств, например, лиганд, который способен к активации внутриклеточного сигнального домена комплекса TCR. В некоторых аспектах, средство включает или инициирует внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в T-клетке. Такие средства могут включать антитела, такие как те, которые обладают специфичностью к TCR компоненту и/или костимулирующему рецептору, например, против CD3, против CD28, например, связанные с твердым носителем, таким как бусина, и/или один или несколько цитокинов. Необязательно, способ размножения дополнительно может включать стадию добавления антитела против CD3 и/или против CD28 в среду для культивирования (например, в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 нг/мл). В некоторых вариантах осуществления стимулирующие средства включают IL-2 и/или IL-15, например, концентрация IL-2 составляет по меньшей мере приблизительно 10 Ед/мл.

[0373] В некоторых аспектах, инкубацию осуществляют в соответствии со способами, такими как те, которые описаны в патенте США № 6,040,177 на Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, и/или Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[0374] В некоторых вариантах осуществления T-клетки размножают посредством добавления в композицию клеток-кормушек, таких как не делящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), (например, так, что получаемая популяция клеток содержит по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, или 40 или больше PBMC клеток-кормушек на каждый T-лимфоцит в начальной популяции, подлежащей размножению); и инкубации культуры (например, в течение периода времени, достаточного для размножения определенного числа T-клеток). В некоторых аспектах, не делящиеся клетки-кормушки могут содержать γ-облученные PBMC клетки-кормушки. В некоторых вариантах осуществления PBMC облучают γ-лучами в диапазоне приблизительно от 3000 до 3600 рад для того, чтобы предотвращать клеточное деление. В некоторых аспектах, клетки-кормушки добавляют в среду для культивирования перед добавлением популяций T-клеток.

[0375] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают температуру, подходящую для роста T-лимфоцитов человека, например, по меньшей мере приблизительно 25 градусов по Цельсию, в целом по меньшей мере приблизительно 30 градусов и в целом ровно или приблизительно 37 градусов по Цельсию. Необязательно, инкубация дополнительно может включать добавление не делящихся EBV-трансформированных лимфобластоидных клеток (LCL) в качестве клеток-кормушек. LCL можно облучать γ-лучами в диапазоне приблизительно от 6000 до 10000 рад. LCL клетки-кормушки в некоторых аспектах предоставляют в любом подходящем количестве, например, в соотношении LCL клеток-кормушек и начальных T-лимфоцитов по меньшей мере приблизительно 10:1.

[0376] В определенных вариантах осуществления, антиген-специфические T-клетки, такие как антиген-специфические CD4+ и/или CD8+ T-клетки, получают посредством стимуляции наивных или антиген-специфических T-лимфоцитов с использованием антигена. Например, можно создавать антиген-специфические линии или клоны T-клеток для цитомегаловирусных антигенов посредством выделения T-клеток у инфицированных субъектов и стимуляции клеток in vitro с использованием того же антигена.

B. Устройство и промышленные изделия

[0377] В некоторых вариантах осуществления также предоставлен устройство или промышленное изделие. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена компоновка биореактора и первой стационарной фазы для хроматографии. Биореактор подходит для размножения клеток, а стационарная фаза подходит для разделения клеток и удаления реактивов. Первая стационарная фаза представляет собой гельфильтрационную матрицу и/или матрицу аффинной хроматографии, где гельфильтрационная матрица и/или матрица аффинной хроматографии содержит аффинный реактив, где аффинный реактив содержит сайт связывания Z1, специфически связывающийся с партнером связывания C1, содержащимся в первом средстве, и/или аффинный реактив содержит сайт связывания Z2, специфически связывающийся с партнером связывания C2, содержащимся во втором средстве. Первая стационарная фаза, тем самым, подходит для иммобилизации на ней первого средства и/или второго средства, первого партнера связывания C1 и/или свободного второго партнера связывания C2. Вдобавок биореактор и стационарную фазу соединяют по текучей среде. Эту компоновку можно использовать при последовательном размножении, как изложено выше, и можно встраивать в известные системы размножения клеток, такие как Quantum^® Cell Expansion System) или the Xuri Cell Expansion System W25.

[0378] В этой компоновке первая стационарная фаза или содержится в хроматографической колонке или представляет собой плоскую стационарную фазу. Компоновка дополнительно может содержать вторую стационарную фазу, которую соединяют по текучей среде с первой стационарной фазой. Вторичная стационарная фаза может представлять собой гельфильтрационную матрицу и/или матрицу аффинной хроматографии, где гельфильтрационная матрица и/или матрица аффинной хроматографии содержит аффинный реактив. Этот аффинный реактив может содержать партнер связывания D, который (специфически) связывается с сайтом связывания Z1 реактива мультимеризации и тем самым подходит для иммобилизации реактива мультимеризации на стационарной фазе.

[0379] Изобретение, кроме того, направлено в некоторых вариантах осуществления на устройство для очистки (например, отбора) и культивирования, например, стимуляции или размножения, композиции клеток, устройство содержит по меньшей мере одну компоновку биореактора и первой стационарной фазы или второй стационарной фазы для хроматографии, как определено выше.

[0380] Устройство дополнительно может содержать множество компоновок биореактора и стационарной фазы, соединенных по текучей среде последовательно.

[0381] Устройство может содержать впуск образца, соединенный по текучей среде с биореактором из компоновки биореактора и стационарной фазы для хроматографии. Устройство также может содержать выпуск образца для очищенных и размноженных клеток-мишеней, выпуск образца соединяют по текучей среде со стационарной фазой последней из по меньшей мере одной компоновки биореактора и стационарной фазы для хроматографии.

[0382] В некоторых вариантах осуществления устройство можно разрабатывать как функционально закрытую систему.

C. Образцовые признаки культивируемых клеток

[0383] В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки-мишени, (например, культивируемые T-клетки), которые могут включать культивируемые клетки, создаваемые или получаемые в соответствии со способами, предоставленными в настоящем описании, проявляют один или несколько конкретных фенотипических и/или функциональных признаков на основании или в связи с их способностью к пролиферации, экспрессией маркера поверхности, состоянием дифференцировки, состоянием активации и/или метаболическим профилем. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток-мишеней (например, культивирование T-клеток) в соответствии с любым из предоставленных способов ведет к изменению параметра, ассоциированного с функцией (например, увеличению или уменьшению функциональной активности) или фенотипом (например, более высокая или более низкая экспрессия маркера или маркеров) клеток по сравнению с соответствующей или связанной функцией или фенотипом клеток в композиции перед инкубацией в соответствии со способами, предоставленными в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления культивируемые T-клетки демонстрируют изменение в отношении параметра из размножения и/или способности к пролиферации, распределения или соотношения CD4+/CD8+ T-клеток, экспрессии маркера поверхности, функциональной активности или метаболического профиля.

[0384] В некоторых вариантах осуществления изменение параметра, как измеряют в культивируемых T-клетках, сравнивают или связывают с тем же или схожим параметром, как измеряют в эталонной композиции или препарате T-клеток. Обычно, T-клетки в эталонной композиции или препарате T-клеток включают или получены из той же или по существу той же композиции T-клеток перед инкубацией с обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), за исключением того, что такие клетки не подвергали инкубации или подвергали другой инкубации. В некоторых вариантах осуществления эталонный препарат T-клеток подвергают инкубации с использованием по существу того же протокола или условий (например, тип стимулирующих средств или средства, формат стимулирующего средства или средств, по существу то же начальное число клеток, промывания, присутствие или отсутствие дополнительных реактивов, время инкубации, температура инкубации), за исключением того, что по меньшей мере однин аспект, и в некоторых случаях только однин аспект, такой инкубации в эталонном препарате T-клеток отличается от инкубации с получением культивируемых T-клеток.

[0385] В некоторых вариантах осуществления эталонная композиция или препарат T-клеток представляет собой композицию, содержащую T-клетки перед инкубацией с обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина).

[0386] В некоторых вариантах осуществления культивируемые T-клетки создают посредством инкубации с обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина) в течение меньше чем 5 суток и/или где ассоциирование такого средства с одной или несколькими молекулами на клетке разрушают (например, в присутствии конкурентного реактива, например, биотина или аналога биотина), например, разрушают в пределах 5 суток от инициации инкубации с использованием такого средства. Например, в некоторых аспектах, культивируемые T-клетки создают или получают после инкубации с обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), как раскрыто в настоящем описании, где инкубацию завершают и/или разрушают в пределах 5 суток после инициации такой инкубации (например, в пределах или приблизительно 4, 3, 2, или 1 суток или меньше), и/или где конкурентное средство (например, биотин), из-за которого от клеток диссоциирует обратимо-связанное средство, добавляют к инкубируемым клеткам в пределах 5 суток после инициации такой инкубации (например, в пределах или приблизительно 4, 3, 2, или 1 суток или меньше). В некоторых вариантах осуществления эталонный препарат T-клеток создают или получают после инкубации с тем же или по существу тем же обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), но где инкубацию осуществляют в течение больше чем 5 суток, не завершают и/или разрушают для уменьшения или прерывания сигнала, индуцируемого или модулируемого в клетке, и/или где препарат T-клеток получают без добавления конкурентного средства (например, биотина или аналога биотина), из-за которого реактив диссоциирует от клеток.

[0387] В некоторых вариантах осуществления культивируемые T-клетки создают посредством инкубации с обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), где рецептор-связывающее средство (например, стимулирующее средство) представляет собой то, которое не связывается с CD28 и/или индуцирует передачу сигнала, т. е. не представляет собой антитело против CD28 или его фрагмент. Например, в некоторых вариантах осуществления культивируемые T-клетки получают или создают после инкубации с обратимо-связанным реактивом, где одно или несколько стимулирующих средств обратимо связывают с мутеином стрептавидина, где по меньшей мере одно стимулирующее средство обладает специфичностью к CD3 (например, антитело против CD3 или его фрагмент) и второе стимулирующее средство может обладать специфичностью к одному или нескольким из CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, OX40 или HVEM (например, антитело против CD90, антитело против CD95, антитело против CD137, и антитело против CD154, антитело против ICOS, антитело против LAT, антитело против CD27, антитело против OX40 или антитело против HVEM, соответственно, или их антиген-связывающие фрагменты). В некоторых вариантах осуществления эталонный препарат T-клеток представляет собой T-клеточную культуру, создаваемую или получаемую после инкубации с обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), но где реактив содержит средство, которое специфически связывает CD28 и/или индуцирует или модулирует передачу сигнала CD28. Например, в некоторых вариантах осуществления эталонный препарат T-клеток создают или получают после инкубации композиции T-клеток с Dynabeads^®против CD3/против CD28, бусами ExPact^® против CD3/против CD28 или другим стимулирующим средством против CD3/против CD28. В некоторых вариантах осуществления такое другое стимулирующее средство против CD3/против CD28 представляет собой то, в котором антительные реактивы связывают с основой (например, твердым носителем), например, бусиной, частицей, магнитной частицей или бусиной, наночастицей или микросферой. В некоторых вариантах осуществления культивируемые T-клетки получают посредством инкубации с обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), которое растворимо, т. е. не связано с основой (например, твердым носителем).

[0388] Например, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены культивируемые T-клетки, например, получаемые в соответствии с любым из способов, предусмотренных в настоящем описании, где культивируемые T-клетки создают или получают после инкубации с обратимо-связанным средством, как раскрыто в настоящем описании (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), где культивируемые T-клетки отличаются усиленным размножением и/или способностью к пролиферации по сравнению с эталонной композицией или препаратом T-клеток. В некоторых вариантах осуществления усиленные размножение и/или способность к пролиферации включают увеличение числа или процентной доли CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток в культивируемых T-клетках по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток, соответственно, в эталонной композиции или препарате T-клеток.

[0389] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культивируемые T-клетки, например, получаемые в соответствии с любым из способов, предусмотренных в настоящем описании, где культивируемые T-клетки создают или получают после инкубации с обратимо-связанным средством, как раскрыто в настоящем описании (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), где культивируемые T-клетки отличаются усиленными размножением и/или способностью к пролиферации CD3+ T-клеток по сравнению с эталонной T-клеточной культурой. В некоторых вариантах осуществления усиленные размножение и/или способность к пролиферации включают увеличение числа или процентной доли CD3+ T-клеток в культивируемых T-клетках по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей CD3+ T-клеток в эталонной композиции или препарате T-клеток.

[0390] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культивируемые T-клетки, например, получаемые в соответствии с любым из способов, предусмотренных в настоящем описании, где культивируемые T-клетки создают или получают после инкубации с обратимо-связанным средством, как раскрыто в настоящем описании (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), где культивируемые T-клетки отличаются усиленными размножением и/или способностью к пролиферации CD4+ T-клеток по сравнению с эталонной композицией или препаратом T-клеток. В некоторых вариантах осуществления усиленное размножение и/или способность к пролиферации включают увеличение числа или процентной доли CD4+ T-клеток в культивируемых T-клетках по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей CD4+ T-клеток в эталонной композиции или препарате T-клеток.

[0391] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культивируемые T-клетки, например, получаемые в соответствии с любым из способов, предусмотренных в настоящем описании, где культивируемые T-клетки создают или получают после инкубации с обратимо-связанным средством, как раскрыто в настоящем описании (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), где культивируемые T-клетки отличаются усиленными размножением и/или способностью к пролиферации CD8+ T-клеток по сравнению с эталонной композицией или препаратом T-клеток. В некоторых вариантах осуществления усиленные размножение и/или способность к пролиферации включают увеличение числа или процентной доли CD8+ T-клеток в культивируемых T-клетках по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей CD8+ T-клеток в эталонной композиции или препарате T-клеток.

[0392] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культивируемые T-клетки, например, получаемые в соответствии с любым из способов, предусмотренных в настоящем описании, где культивируемые T-клетки создают или получают после инкубации с обратимо-связанным средством, как раскрыто в настоящем описании (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), где культивируемые T-клетки отличаются измененным распределением CD8+/CD4+ T-клеток или нормализованным распределением T-клеток, таким как измененное соотношение CD8+/CD4+ или нормализованное соотношение CD8+/CD4+ T-клеток, по сравнению с эталонной композицией или препаратом T-клеток. Соотношение CD8+/CD4+ или нормализованное соотношение можно увеличивать или уменьшать. В некоторых вариантах осуществления измененное соотношение CD8+/CD4+ T-клеток является результатом увеличения числа или процентной доли или нормализованного числа или процентной доли CD8+ T-клеток в культивируемых T-клетках по отношению к или по сравнению с числом или процентной долей или нормализованным числом или процентной долей в эталонной композиции или препарате. В некоторых вариантах осуществления число CD8+ T-клеток в культивируемых T-клетках увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей CD8+ T-клеток или нормализованным числом или процентной долей CD8+ T-клеток в эталонной композиции или препарате T-клеток. В некоторых вариантах осуществления соотношение CD8+/CD4+ T-клеток или нормализованное соотношение CD8+/CD4+ увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с соотношением CD8+/CD4+ T-клеток или нормализованным соотношением CD8+/CD4+ в эталонной композиции или препарате T-клеток. В некоторых вариантах осуществления число, процентную долю или соотношение в культивируемых T-клетках или в композиции или препарате нормализуют по числу, процентной доле или соотношению в начальной композиции, содержащей T-клетки перед инкубацией.

[0393] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культивируемые T-клетки, получаемые в соответствии с любым из способов, предусмотренных в настоящем описании, где культивируемые T-клетки создают или получают после инкубации с обратимо-связанным средством, как раскрыто в настоящем описании (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина), и где культивируемые T-клетки отличаются измененным профилем экспрессии маркеров поверхности по сравнению с эталонной композицией или препаратом T-клеток. В некоторых вариантах осуществления измененный профиль экспрессии маркеров поверхности обусловлен изменением числа или процентной доли одного или нескольких подмножеств T-клеток, которые являются положительными, отрицательными, высокими или низкими по одному или нескольким маркерам поверхности, выбранным из CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, CCR7, CD27, CD28, CD122, t-bet, IL-7Rα, CD95, IL-2Rβ, CXCR3, LFA-1, KLRG1. В некоторых вариантах осуществления число или процентную долю подмножества T-клеток в культивируемых T-клетках увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей подмножества T-клеток в эталонной композиции или препарате.

[0394] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках (например, подмножество T-клеток, которое увеличивают в культивируемых T-клетках по сравнению с эталонной композицией или препаратом) демонстрирует ослабленную или сниженную дифференцировку или состояние активации по сравнению с эталонной композицией или препаратом T-клеток. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток не представляет собой или не содержит фенотип эффекторных T-клеток (T_E) или эффекторных T-клеток памяти (T_EM). В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток содержит фенотип поверхности, который представляет собой одно или несколько из CD62L⁺, CCR7⁺, CD27⁺, CD28⁺ или KLRG1^низк./-. В некоторых вариантах осуществления такое подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей подмножества T-клеток в эталонной композиции или культуре T-клеток.

[0395] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках (например, подмножество T-клеток, которое увеличивают в культивируемых T-клетках по сравнению с эталонной композицией или препаратом) является положительным по CD62L и/или IL-7Rα (CD127) и/или отрицательным или низким по t-bet. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток является положительным по CD45RA и/или отрицательным или низким по CD45RO. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток является положительным по одному или нескольким из CCR7, CD45RA, CD62L, CD27, CD28, IL-7Rα (CD127), CD95, IL-2Rβ, CXCR3 и LFA-1 и/или отрицательным по CD45RO. В некоторых вариантах осуществления такое подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей подмножества T-клеток в эталонной композиции или культуре T-клеток.

[0396] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках (например, подмножество T-клеток, которое увеличивают в культивируемых T-клетках по сравнению с эталонной композицией или препаратом) представляет собой или содержит клетки, которые являются положительными по CD62L (CD62L+). В некоторых вариантах осуществления такое подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей подмножества T-клеток в эталонной композиции или культуре T-клеток.

[0397] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках (например, подмножество T-клеток, которое увеличивают в культивируемых T-клетках по сравнению с эталонной композицией или препаратом) представляет собой или содержит клетки, которые представляют собой CD62L+ и a) любое одно или несколько из CD45RA^низк./+, CD45RO^низк./+, CCR7+ и CD27+ и b) любое одно или несколько из t-bet^низк., IL-7Rα+ (CD127+), CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток также может представлять собой CD3+, CD4+ или CD8+. В некоторых вариантах осуществления такое подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей подмножества T-клеток в эталонной композиции или культуре T-клеток.

[0398] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток, такое как подмножество CD62L+ T-клеток, в культивируемых T-клетках представляет собой или содержит или имеет общие фенотипические характеристики с T-клетками памяти или их конкретными подмножествами, такими как долгоживущие T-клетки памяти. В некоторых вариантах осуществления такие T-клетки памяти представляют собой центральные T-клетки памяти (T_CM) или стволовые T-клетки памяти (T_SCM). В некоторых вариантах осуществления T-клетки памяти представляют собой T_SCM клетки. T_SCM клетки можно описать как имеющие одно или несколько фенотипических различий или функциональных признаков по сравнению с другими подмножествами T-клеткок памяти или по сравнению с наивными T-клетками, например, менее дифференцированными или более наивными (см., например, Ahlers and Belyakov (2010) Blood, 115:1678); Cieri et al. (2015) Blood, 125:2865; Flynn et al. (2014) Clinical & Translational Immunology, 3, e20; Gattinoni et al. (2012) Nat. Med., 17:1290-1297; Gattinoni et al. (2012) Nat. Reviews, 12:671; Li et al. (2013) PLOS ONE, 8:e67401; и опубликованную заявку PCT № WO2014/039044). В некоторых случаях полагают, что T_SCM клетки представляют собой только T-клетки памяти, способные создавать эффекторные T-клетки и все три подмножества T-клеток памяти (T_SCM, T_CM и T_EM). В некоторых аспектах, T_SCM клетки обладают самой высокой выживаемостью и пролиферационным ответом на антигенные или гомеостатические стимулы из всех подмножеств T-клеток памяти и наименьшим износом в отсутствие когнатного антигена. В некоторых вариантах осуществления менее дифференцированные T_SCM клетки могут демонстрировать большее размножение, долгосрочную жизнеспособность и разрушение клеток-мишеней-мишеней после адоптивного переноса, чем другие T-клетки памяти, и, таким образом, могут быть способны опосредовать более эффективное лечение меньшим количеством перенесенных клеток, чем это было бы возможно для T_CM или T_EM клеток.

[0399] В некоторых аспектах, примеры фенотипических или функциональных признаков, о которых сообщалось или которые известны для T_SCM клеток, включают, например, то, что такие клетки a) представляют собой CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+, CD27+, CD28+, IL-7Rα+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+; b) представляют собой CD45RA+, CCR7+, CD62L+ и CD95+; c) представляют собой CD45RA+, CD45RO+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+ и IL-2Rβ+; d) представляют собой CD45RO-, CD45RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD127+ и CD95+; e) представляют собой CD45RA+, CD44+/-, CD62L+, CD127+, IL-2Rβ+, CD28+, CD43-, KLRG1-, перфорин- и гранзимВ-; f) экспрессируют высокие уровни CCR7, CD62L, CD27 и CD28, промежуточные уровни CD95 и IL-2Rβ, низкие уровни CD45RA и не экспрессируют CD45RO или KLRG-1; или g) экспрессируют высокие уровни CD62L, низкие уровни CD44 и t-bet и представляют собой Sca-1+; и/или обладают промежуточной способностью к продуцированию IL-2, низкой способностью к продуцированию IFNγ, низкой цитотоксичностью и высокой способностью к самоподдержанию.

[0400] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках (например, подмножество T-клеток, которое увеличивают в культивируемых T-клетках по сравнению с эталонной композицией или препаратом) представляет собой или содержит T-клетки памяти, такие как долгоживущие T-клетки памяти. В некоторых вариантах осуществления T-клетки памяти представляют собой центральные T-клетки памяти (T_CM). В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику CD45RA-, CD45RO^низк./+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+ CD122+ и/или KLGR1^низк.. В некоторых вариантах осуществления такое подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей подмножества T-клеток в эталонной композиции или культуре T-клеток.

[0401] В некоторых вариантах осуществления T-клетки памяти представляют собой стволовые центральные T-клетки памяти (T_SCM). В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику CD45RA^низк./+, CD45RO^низк./+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+, CD122+ и/или KLGR1-. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику CD45RA^низк./+, CD45RO-, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+, CD122+ и/или KLGR1-. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+, CD27+, CD28+, IL-7Rα+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и/или LFA-1+. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику CD45RA+, CCR7+, CD62L+ и/или CD95+. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику CD45RA+, CD45RO+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+ и/или IL-2Rβ+. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику CD45RO-, CD45RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD127+ и/или CD95+. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику CD45RA+, CD44+/-, CD62L+, CD127+, IL-2Rβ+, CD28+, CD43-, KLRG1-, перфорин- и/или гранзимВ-. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток экспрессирует высокие уровни CCR7, CD62L, CD27 и/или CD28, промежуточные уровни CD95 и/или IL-2Rβ, низкие уровни CD45RA и/или не экспрессирует CD45RO и/или KLRG-1. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток экспрессирует высокие уровни CD62L, низкие уровни CD44 и t-bet и/или представляет собой Sca-1+. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток имеет фенотипическую характеристику промежуточной способности к продуцированию IL-2, низкой способности к продуцированию IFNγ, низкой цитотоксичности и/или высокой способности к самоподдержанию. В некоторых вариантах осуществления такое подмножество T-клеток в культивируемых T-клетках увеличивают по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше) по сравнению с числом или процентной долей подмножества T-клеток в эталонной композиции или культуре T-клеток.

[0402] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток, такое как любое подмножество T-клеток, описанное выше, присутствует в более высокой процентной доле от всех T-клеток в культивируемых T-клетках или большем числе от всех T-клеток в культивируемых T-клетках по сравнению с эталонной композицией или препаратом T-клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля подмножества T-клеток в культивируемых T-клетках в качестве процентной доли от всех T-клеток или всех клеток в культуре составляет по меньшей мере 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше. В некоторых вариантах осуществления процентная доля подмножества T-клеток в культивируемых клетках, такого как любое подмножество T-клеток, описанное выше, составляет больше, например, больше по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере 5 или больше раз, чем соответствующая процентная доля подмножества клеток в культуре T-клеток, выделенной или обогащенной непосредственно от субъекта-человека на основании поверхностной экспрессии одного или маркеров, содержащих фенотип, но без инкубации или культуры. В некоторых вариантах осуществления общее число, относительное число или нормализованное число T-клеток подмножества в культивируемых клетках, например, любое подмножество T-клеток, описанное выше, составляет больше, например, больше по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере 5 или больше раз, чем число, относительное число или нормализованное число в подмножестве T-клеток в эталонной композиции или препарате T-клеток, такой как любая эталонная композиция или препарат T-клеток, описанный выше, например, композиция T-клеток перед инкубацией с обратимо-связанным средством (например, мультимеризованным средством, такой как инкубация со стимулирующим средством, обратимо связанным с олигомерным мутеином стрептавидина) в соответствии с любым из способов, предоставленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления число T-клеток, соответствующих подмножеству T-клеток, присутствующих в T-клеточной культуре, составляет по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1×10⁶ клеток, 2×10⁶ клеток, 3×10⁶ клеток, 4×10⁶ клеток, 5×10⁶ клеток или больше.

[0403] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток представляет собой CD62L+ и/или IL-7Rα+ (CD127+) и процентная доля CD62L+ и/или IL-7Rα+ (CD127+) подмножества в культивируемых T-клетках в виде процентной доли от всех T-клеток или всех клеток в культуре составляет по меньшей мере 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток представляет собой CD45RA-, CD45RO^низк./+ и/или KLRG1^низк. и процентная доля CD45RA-, CD45RO^низк./+, и/или KLRG1^низк. подмножества в культивируемых T-клетках в виде процентной доли от всех T-клеток или всех клеток в культуре составляет по меньшей мере 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток представляет собой CD45RA^низк./+, CD45RO^низк./+ и/или KLRG1- и процентная доля CD45RA^низк./+, CD45RO^низк./+ и/или KLRG1- подмножества в культивируемых T-клетках в виде процентной доли от всех T-клеток или всех клеток в культуре составляет по меньшей мере 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше.

[0404] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток представляет собой или содержит T_CM клетки. В некоторых вариантах осуществления процентная доля T_CM подмножества в культивируемых T-клетках в виде процентной доли от всех T-клеток или всех клеток в культуре составляет по меньшей мере 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше.

[0405] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток представляет собой или содержит T_SCM клетки. В некоторых вариантах осуществления процентная доля T_SCM подмножества в культивируемых T-клетках в виде процентной доли от всех T-клеток или всех клеток в культуре составляет по меньшей мере 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или больше.

[0406] В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток, таких как CD62L+ T-клетки, имеет или проявляет a) низкий уровень эксцизионных колец реаранжировки TCR (TREC); и/или b) экспрессирует маркер пролиферации (например, Ki-67); и/или c) проявляет способность пролиферировать в присутствии стимулирующего средства; и/или d) проявляет способность продуцировать цитокин, выбранный из IFN-γ, TNF и IL-2, в присутствии стимулирующего средства; и/или e) является рефракторным к износу в отсутствие стимулирующего средства; и/или f) способно создавать T_SCM, T_CM, T_EM, и T_EFF клетки; и/или g) имеет низкую цитотоксичность; и/или h) может создавать тот же или более сильный ответ после адоптивного переноса меньшего количества клеток, чем при использовании T_CM или T_EM клеток. В некоторых вариантах осуществления стимулирующее средство представляет собой антиген, гомеостатический цитокин (например, IL-15 или IL-17) или представляет собой средство, которое способно к инициации ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала в T-клетках. В некоторых вариантах осуществления способность продуцировать цитокин включает низкую способность продуцировать IFNγ и/или промежуточную способность продуцировать IL-2.

[0407] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены культивируемые T-клетки, например, получаемые в соответствии с любым из способов, предусмотренных в настоящем описании, где культивируемые T-клетки создают или получают после инкубации, как раскрыто в настоящем описании, и где культивируемые T-клетки отличаются модифицированным профилем функциональной активности по сравнению с эталонной композицией или препаратом T-клеток. В некоторых вариантах осуществления культивируемые T-клетки или конкретное подмножество T-клеток, присутствующее в культуре, демонстрирует измененный профиль функциональной активности по сравнению с эталонной композицией или препаратом или по сравнению с подмножеством T-клеток в эталонной композиции или препарате, такой как функциональная активность, которую изменяют (например, повышают или снижают) по меньшей мере 1,5-кратно, 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно, 10-кратно. В некоторых вариантах осуществления функциональную активность выбирают из одного или нескольких из a) низкого уровня эксцизионных колец реаранжировки TCR (TREC); и/или b) экспрессии маркера пролиферации (например, Ki-67); и/или c) способность пролиферировать в присутствии стимулирующего средства; и/или d) способности продуцировать цитокин, выбранный из IFN-γ, TNF и IL-2, в присутствии стимулирующего средства; и/или e) рефракторности к износу в отсутствие стимулирующего средства; и/или f) способность создавать T_SCM, T_CM, T_EM и T_EFF клетки; и/или g) наличия низкой цитотоксичности. В некоторых вариантах осуществления стимулирующее средство представляет собой антиген, гомеостатический цитокин (например, IL-15 или IL-17) или представляет собой средство, которое способно к инициации ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала в T-клетках. В некоторых вариантах осуществления способность продуцировать цитокин включает низкую способность продуцировать IFNγ и/или промежуточную способность продуцировать IL-2. В некоторых вариантах осуществления подмножество T-клеток содержит T-клетки памяти, такие как долгоживущие T-клетки памяти, в культивируемых T-клетках. В некоторых вариантах осуществления T-клетки памяти представляют собой T_SCM клетки.

[0408] В некоторых вариантах осуществления культивируемые T-клетки или конкретное подмножество T-клеток, присутствующее в культуре, могут создавать такой же или более сильный ответ после адоптивного переноса меньшего количества клеток, чем можно достичь с помощью эталонной композиции или препарата или с помощью подмножества T-клеток в эталонной композиции или препарате. В некоторых вариантах осуществления такого ответа достигают с использованием по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, посредством по меньшей мере приблизительно любого из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или более) меньшего количества клеток. В некоторых вариантах осуществления ответ увеличивают или он больше по меньшей мере приблизительно в 2 раза (например, по меньшей мере приблизительно в любое из 3 раз, 4 раз, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или больше).

[0409] В некоторых вариантах осуществления процентная доля подмножества T-клеток в культивируемых клетках, такого как любое подмножество T-клеток, описанное выше, больше, например, больше по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере 5 раз или более, чем соответствующее подмножество клеток в препарате T-клеток, который инкубировали в присутствии ингибитора GSK-P. В некоторых вариантах осуществления композиция культивируемых T-клеток не содержит ингибитор GSK-P.

[0410] В некоторых вариантах осуществления процентная доля подмножества T-клеток в культивируемых клетках, такого как любое подмножество T-клеток, описанное выше, больше, например, больше по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере 5 или более раз, чем соответствующее подмножество клеток, которое инкубировали в присутствии рекомбинантного гомеостатического цитокина, необязательно IL-7 или IL-15. В некоторых вариантах осуществления композиция культивируемых T-клеток не содержит рекомбинантный (например, экзогенный) цитокин IL-7 или рекомбинантный (например, экзогенный) цитокин IL-15.

[0411] В некоторых вариантах осуществления композицию культивируемых T-клеток получали или создавали в соответствии с любым из способов, предусмотренных в настоящем описании, в которых вещество, такое как конкурентное средство, добавляли к T-клеткам для того, чтобы разрушать, например, уменьшать и/или прерывать, передачу сигнала стимулирующего средства или средств. В некоторых вариантах осуществления композиция культивируемых T-клеток содержит присутствие вещества, такого как конкурентное средство, например, биотин или аналог биотина, например, D-биотин. В некоторых вариантах осуществления вещество, такое как конкурентное средство, например, биотин или аналог биотина, например, D-биотин, присутствует в количестве, которое по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере 5 раз, по меньшей мере 10 раз, по меньшей мере 100 раз, по меньшей мере 1000 или более раз выше, чем количество вещества в эталонной композиции или препарате культивируемых T-клеток, к которым вещество не добавляли экзогенно во время инкубации. В некоторых вариантах осуществления количество вещества, такого как конкурентное средство, например, биотин или аналог биотина, например, D-биотин, в композиции культивируемых T-клеток составляет от или приблизительно от 10 мкМ до 100 мкМ, от 100 мкМ до 1 мМ, от 100 мкМ до 500 мкМ или от 10 мкМ до 100 мкМ.

IV. СПОСОБЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСТРУИРОВАНИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК, АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ГЕНЕТИЧЕСКИ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ

[0412] В некоторых вариантах осуществления клетки можно конструировать до или после культивирования клеток, как раскрыто в настоящем описании (например, отбора, обогащения и/или стимуляции), и в некоторых случаях одновременно с культивированием или инкубацией или во время по меньшей мере ее части. В некоторых вариантах осуществления клетки, которые подлежат конструированию, представляют собой культивируемые клетки, или в некоторых случаях, клетки можно трансдуцировать перед осуществлением культивирования, как раскрыто в настоящем описании.

[0413] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетки-мишени популяции, эта нуклеиновая кислота кодирует рекомбинантный белок, в соответствии с чем клетки экспрессируют рекомбинантный белок. В некоторых аспектах, клетки представляют собой эмбриональные клетки и введение происходит ex vivo. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют после или во время указанной инкубации и/или пока клетки иммобилизуют на основе. В некоторых вариантах осуществления способ конструирования клеток осуществляют во время по меньшей мере части инкубации или культивирования клеток, пока клетки иммобилизуют на твердом носителе. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают загрузку или добавление вирусных частиц, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок, в клетки, иммобилизованные на основе, и/или в клетки, полученные или диссоциированные из такой основы после инкубации или культивирования там. Такие способы ведут к клеткам, которые экспрессируют рекомбинантный белок, эта экспрессия, в некоторых аспектах, происходит во время по меньшей мере части инкубации.

[0414] В некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки содержат или их конструируют для того, чтобы они содержали сконструированный рецептор, например, сконструированный антигенный рецептор, такой как химерный антигенный рецептор (CAR) или T-клеточный рецептор (TCR). Также предусмотрены популяции таких клеток, композиции, содержащие такие клетки и/или обогащенные такими клетками, например, в которых обогащают или отбирают клетки определенного типа, такие как T-клетки или CD8+ или CD4+ клетки. Среди композиций имеют место фармацевтические композиции и составы для введения, например, для адоптивной клеточной терапии. Также предусмотрены терапевтические способы введения клеток и композиций субъектам, например, пациентам.

[0415] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления культивируемые клетки содержат одну или несколько нуклеиновых кислот, введенных посредством генетической инженерии, и, тем самым, экспрессируют рекомбинантные или генетически сконструированные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления перенос генов выполняют посредством первой стимуляции культивируемых клеток, например, посредством их объединения со стимулом, который индуцирует ответ, такой как пролиферация, выживаемость и/или активация, например, как измеряют по экспрессии цитокина или маркеру активации, после чего следует трансдукция активированных клеток и размножение в культуре до чисел, достаточных для клинического применения.

[0416] В некоторых контекстах, сверхэкспрессия стимулирующего фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для субъекта. Таким образом, в некоторых контекстах, сконструированные клетки содержат генные сегменты, которые обеспечивают восприимчивость клеток к отрицательному отбору in vivo, например, при введении в адоптивной иммунотерапии. Например, в некоторых аспектах, культивируемые клетки конструируют с тем, чтобы их можно было устранять в результате изменения состояния пациента in vivo, которому их вводят. Отрицательный отбираемый фенотип может быть результатом инсерции гена, который придает чувствительность ко вводимому средству, например, соединению. Отрицательные селективные гены включают ген тимидинкиназы вируса простого герпеса I типа (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 2: 223,1977), который придает чувствительность к ганцикловиру; клеточный ген гипоксантинфосфрибозилтрансферазы (HPRT), клеточный ген аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), бактериальную цитозиндезаминазу, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)). В некоторых аспектах, культивируемые клетки дополнительно конструируют для того, чтобы содействовать экспрессии цитокинов или других факторов.

A. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антигенные рецепторы, например, химерные антигенные рецепторы

[0417] Предоставлены способы, нуклеиновые кислоты, композиции и наборы для получения генетически сконструированных клеток. Генетическая инженерия в целом включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный или сконструированный компонент, в композицию, содержащую культивируемые клетки, например, посредством ретровирусной трансдукции, трансфекции или трансформации.

[0418] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, т. е., обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, таком как тот, который получен из другого организма или клетки, который, например, как правило, не находят в клетке, подлежащей генетическому конструированию, и/или организме, из которого такую клетку извлекают. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не являются встречающимися в природе, такими как нуклеиновые кислоты, которые не находят в природе, в том числе та, которая содержит химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из клеток нескольких различных типов.

1. Химерные антигенные рецепторы (CAR)

[0419] Клетки в целом экспрессируют рекомбинантные рецепторы, такие как антигенные рецепторы, включая функциональные не TCR антигенные рецепторы, например, химерные антигенные рецепторы (CAR) и другие антиген-связывающие рецепторы, такие как трансгенные T-клеточные рецепторы (TCR). Также среди рецепторов имеют место другие химерные рецепторы.

[0420] Образцовые антигенные рецепторы, в том числе CAR, и способы конструирования и введения таких рецепторов в клетки, включают те, которые описаны, например, в международных публикациях патентных заявок №№ WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 публикациях патентных заявок США №№ US2002131960, US2013287748, US20130149337, патентах США №№ 6451995, 7446190, 8252592,, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118 и европейской патентной заявке № EP2537416, и/или те, которые описаны в Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS one 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. В некоторых аспектах, антигенные рецепторы включают CAR, как описано в патенте США № 7446190, и те, которые описаны в международной публикации патентной заявки № WO/2014055668 A1. Примеры CAR включают CAR, как раскрыто в любой из указанных выше публикаций, таких как WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190, патент США № 8389282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; и Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). См. также WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190 и патент США № 8389282. Химерные рецепторы, такие как CAR, в целом содержат внеклеточный антиген-связывающий домен, такой как часть молекулы антитела, обычно вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL) антитела, например, scFv-фрагмент антитела.

[0421] В некоторых вариантах осуществления антиген, на которой направлен рецептор, представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления он представляет собой углевод или другую молекулу. В некоторых вариантах осуществления антиген является избирательно экспрессируемым или сверхэкспрессированным на клетках заболевания или состояния, например, опухоли, или патогенных клетках, по сравнению с нормальными или нецелевыми клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессирован на нормальных клетках и/или экспрессирован на сконструированных клетках.

[0422] Антигены, на которые направлены рецепторы, в некоторых вариантах осуществления включают сиротский рецептор тирозинкиназы ROR1, tEGFR, Her2, L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелин, CEA и поверхностный антиген гепатита B, антифолатный рецептор, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3 или 4, FBP, фетальный рецептор ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-α, IL-13R-α2, kdr, легкую цепь κ, Льюиса Y, молекулу адгезии клетки L1, MAGE-A1, мезотелин, MUC1, MUC16, PSCA, лиганды NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетальный антиген, ROR1, TAG72, VEGF-R2, эмбриональный опухолевый антиген (CEA), специфичный антиген предстательной железы, PSMA, Her2/neu, рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, эфрин B2, CD123, c-Met, GD-2 и MAGE A3, CE7, опухоль Вильмса 1 (WT-1), циклин, такой как циклин A1 (CCNA1), и/или биотинилированные молекулы и/или молекулы, экспрессируемые HIV, HCV, HBV или другими патогенами.

[0423] В некоторых вариантах осуществления CAR связывает патоген-специфический антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR обладает специфичностью к вирусным антигенам (таким как HIV, HCV, HBV и т. д.), бактериальным антигенам и/или паразитарным антигенам.

[0424] В некоторых вариантах осуществления антительная часть рекомбинантного рецептора, например, CAR, дополнительно содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, такую как шарнирная область, например, шарнирная область IgG4, и/или CH1/CL и/или Fc-область. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть относится к IgG человека, такому как IgG4 или IgG1. В некоторых аспектах, часть константной области служит в качестве спейсерной области между компонентом распознавания антигена, например, scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может иметь длину, которая обеспечивает увеличенную восприимчивость клетки после связывания антигена, по сравнению с отсутствием спейсера. Образцовые спейсеры, например, шарнирные области, включают те, которые описаны в международной публикации патентной заявки № WO2014031687. В некоторых примерах, спейсер составляет или составляет приблизительно 12 аминокислот в длину или составляет не больше чем 12 аминокислот в длину. Образцовые спейсеры включают те, которые имеют по меньшей мере приблизительно от 10 до 229 аминокислот, приблизительно от 10 до 200 аминокислот, приблизительно от 10 до 175 аминокислот, приблизительно от 10 до 150 аминокислот, приблизительно от 10 до 125 аминокислот, приблизительно от 10 до 100 аминокислот, приблизительно от 10 до 75 аминокислот, приблизительно от 10 до 50 аминокислот, приблизительно от 10 до 40 аминокислот, приблизительно от 10 до 30 аминокислот, приблизительно от 10 до 20 аминокислот или приблизительно от 10 до 15 аминокислот и включая любое целое между конечными точками любого из перечисленных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область имеет приблизительно 12 аминокислоты или меньше, приблизительно 119 аминокислот или меньше или приблизительно 229 аминокислот или меньше. Образцовые спейсеры включают отдельно шарнир IgG4, шарнир IgG4, соединенный с доменами CH2 и CH3, или шарнир IgG4, соединенный с доменом CH3.

[0425] Этот домен распознавания антигена обычно соединяют с одним или несколькими внутриклеточными сигнальными компонентами, такими как сигнальные компоненты, которые имитируют активацию через комплекс антигенного рецептора, такой как комплекс TCR, в случае CAR, и/или сигнал через другой рецептор клеточной поверхности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий компонент (например, антитело) соединяют с одним или несколькими трансмембранными и внутриклеточными сигнальными доменами. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен сливают со внеклеточным доменом. В одном из вариантов осуществления используют трансмембранный домен, который в природе ассоциирован с одним из доменов в рецепторе, например, CAR. В некоторых случаях, трансмембранный домен выбирают или модифицируют посредством замены аминокислоты для того, чтобы избегать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или других поверхностных мембранных белков для того, чтобы минимизировать взаимодействия с другими элементами рецепторного комплекса.

[0426] Трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления извлекают или из природного или из синтетического источника. Когда источник является природным, домен в некоторых аспектах извлекают из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают те, которые получают из (т. е. содержат по меньшей мере трансмембранную область(и) из) α, β или ζ-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и/или CD154. Альтернативно трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления является синтетическим. В некоторых аспектах, синтетический трансмембранный домен содержит преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах, триплет фенилаланина, триптофана и валина находят на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления связь опосредована линкерами, спейсерами и/или трансмембранным доменом(ами).

[0427] Среди внутриклеточных сигнальных доменов имеют место те, которые имитируют или аппроксимируют сигнал через природный антигенный рецептор, сигнал через такой рецептор в комбинации с костимулирующим рецептором и/или сигнал только через костимулирующий рецептор. В некоторых вариантах осуществления короткий олиго- или полипептидный линкер, например, линкер из 2-10 аминокислот в длину, такой как тот, который содержит глицины и серины, например, дублет глицин-серин, присутствует и формирует связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR.

[0428] Рецептор, например, CAR, в целом содержит по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный компонент или компоненты. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как цепь TCR CD3 который опосредует активацию T-клеток и цитотоксичность, например, ζ-цепь CD3. Таким образом, в некоторых аспектах, антиген-связывающую часть соединяют с одним или несколькими модулями клеточной сигнализации. В некоторых вариантах осуществления модули клеточной сигнализации включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или другие трансмембранные домены CD. В некоторых вариантах осуществления рецептор, например, CAR, дополнительно содержит часть одной или нескольких дополнительных молекул, таких как Fc рецептор γ, CD8, CD4, CD25, или CD16. Например, в некоторых аспектах, CAR или другой химерный рецептор включает химерную молекулу между CD3-ζ (CD3-дзета) или Fc рецептором γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.

[0429] В некоторых вариантах осуществления при лигировании CAR или другого химерного рецептора, цитоплазматический домен или внутриклеточный сигнальный домен рецептора активирует по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или ответов клетки иммунной системы, например, T-клетки, сконструированной для того, чтобы экспрессировать CAR. Например, в некоторых контекстах, CAR индуцирует функцию T-клетки, такую как цитолитическая активность или T-хелперная активность, такая как секреция цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления усеченную часть внутриклеточного сигнального домена антигенного рецепторного компонента или костимулирующей молекулы используют вместо интактной иммуностимулирующей цепи, например, если она передает сигнал эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или домены включают цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора (TCR) и в некоторых аспектах также таковые из корецепторов, которые в естественной контексте действуют согласованно с такими рецепторами для того, чтобы инициировать сигнальную трансдукцию после вовлечения антигенного рецептора.

[0430] В контексте природного TCR, полная активация в целом требует не только передачи сигнала через TCR, но также костимулирующего сигнала. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления для содействия полной активации, компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала также включен в CAR. В других вариантах осуществления CAR не содержит компонент для создания костимулирующего сигнала. В некоторых аспектах, дополнительный CAR экспрессируют в той же клетке, и он предусматривает компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала.

[0431] Активацию T-клеток в некоторых аспектах описывают как опосредованную цитоплазматическими сигнальными последовательностями двух классов: те, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и те, которые действуют антиген-независимым образом для того, чтобы способствовать вторичному или костимулирующему сигналу (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах, CAR содержит один или оба таких сигнальных компонента.

[0432] В некоторых аспектах, CAR содержит первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM. Примеры ITAM-содержащих первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают те, которые получают из TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CDS, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(ы) в CAR содержит(содержат) цитоплазматический сигнальный домен, его часть или последовательность, полученную из CD3ζ.

[0433] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит сигнальный домен и/или трансмембранную часть костимулирующего рецептора, например, CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 и ICOS. В некоторых аспектах, тот же CAR содержит как активирующие, так и костимулирующие компоненты.

[0434] В некоторых вариантах осуществления активирующий домен содержится в одном CAR, тогда как костимулирующий компонент предоставляют с помощью другого CAR, распознающего другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включают активирующие или стимулирующие CAR, костимулирующие CAR, совместно экспрессируемые на одной и той же клетке (см. WO2014/055668). В некоторых аспектах, клетки содержат один или несколько стимулирующих или активирующих CAR и/или костимулирующий CAR. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно содержат ингибирующие CAR (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (декабрь 2013 года), такие как CAR, распознающие антиген, отличный от того, который ассоциирован с и/или специфичен для заболевания или состояния, в соответствии с чем активирующий сигнал, доставляемый через CAR, направленный на заболевание, уменьшают или ингибируют посредством связывания ингибирующего CAR с его лигандом, например, чтобы снижать эффекты вне мишени.

[0435] В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит трансмембранный и сигнальный домен CD28, соединенный с внутриклеточным доменом CD3 (например, CD3-ζ). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит химерные костимулирующие домены CD28 и CD137 (4-1BB, TNFRSF9), соединенные с внутриклеточным доменом CD3ζ.

[0436] В некоторых вариантах осуществления CAR охватывает один или несколько, например, два или больше, костимулирующих доменов и активирующий домен, например, первичный активирующий домен, в цитоплазматической части. Образцовые CAR включают внутриклеточные компоненты CD3-ζ, CD28 и 4-1BB.

[0437] В некоторых вариантах осуществления CAR или другой антигенный рецептор дополнительно содержит маркер, такой как маркер клеточной поверхности, который можно использовать для того, чтобы подтверждать трансдукцию или конструирование клетки для того, чтобы экспрессировать рецептор, такой как усеченный вариант рецептора клеточной поверхности, такой как усеченный EGFR (tEGFR). В некоторых аспектах, маркер включает целиком или частично CD34 (например, усеченную форму), NGFR или рецептор эпидермального фактора роста (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим линкерную последовательность, такую как расщепляемая линкерная последовательность, например, T2A. См. WO2014031687.

[0438] В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой молекулу, например, белок клеточной поверхности, не встречающуюся в природе на T-клетках или не встречающуюся в природе на поверхности T-клеток или их частях.

[0439] В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой не собственную молекулу, например, не собственный белок, т. е. тот, который не распознается в качестве «собственного» иммунной системой организма-хозяина, в который осуществляют адоптивный перенос клеток.

[0440] В некоторых вариантах осуществления маркер не выполняет терапевтическую функцию и/или не вызывает эффекта, отличного от того, который подлежит использованию в качестве маркера для генетической инженерии, например, для отбора успешно сконструированных клеток. В других вариантах осуществления маркер может представлять собой терапевтическую молекулу или молекулу, иным образом проявляющую некоторый желаемый эффект, например, лиганд для клеток, встречающихся in vivo, например, костимулирующая молекула или молекула иммунной контрольной точки, для усиления и/или ослабления ответов клеток при адоптивном переносе и встрече с лигандом.

[0441] В некоторых случаях, CAR обозначают как CAR первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах, CAR первого поколения представляет собой тот, который обеспечивает только индуцированный CD3-цепью сигнал при связывании антигена; в некоторых аспектах, CAR второго поколения представляет собой тот, который обеспечивает такой сигнал и костимулирующий сигнал, такой как тот, который содержит внутриклеточный сигнальный домен из костимулирующего рецептора, такого как CD28 или CD137; в некоторых аспектах, CAR третьего поколения представляет собой тот, который содержит несколько костимулирующих доменов различных костимулирующих рецепторов.

[0442] В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент антитела. В некоторых аспектах, химерный антигенный рецептор содержит внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержит scFv и внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых аспектах, внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен ζ-цепи из цепи CD3-ζ (CD3-дзета). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит трансмембранный домен, соединяющий внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых аспектах, трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы T-клетки. В некоторых аспектах, костимулирующая молекула T-клетки представляет собой CD28 или 41BB.

[0443] Термины «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо, чтобы отослать к полимеру аминокислотных остатков, и они не ограничены минимальной длиной. Полипептиды, в том числе предоставленные рецепторы и другие полипептиды, например, линкеры или пептиды, могут содержать аминокислотные остатки, включая природные и/или не природные аминокислотные остатки. Термины также включают послеэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, сиалирование, ацетилирование и фосфорилирование. В некоторых аспектах, полипептиды могут содержать модификации в отношении нативной или природной последовательности до тех пор, пока белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, через сайт-специфический мутагенез, или могут быть случайными, например, через мутации организмов-хозяев, которые продуцируют белки, или ошибками из-за ПЦР амплификации.

[0444] В некоторых вариантах осуществления рецептор, например, CAR, экспрессируемый клетками в последующей дозе, содержит по меньшей мере один иммунореактивный эпитоп в качестве рецептора, например, CAR, экспрессируемый клетками первой дозы. В некоторых аспектах, рецептор, например, CAR, экспрессируемый клетками, вводимыми в последующей дозе, идентичен рецептору, например, CAR, экспрессируемому с помощью первой дозы, или является по существу идентичным рецептору, например, CAR, экспрессируемому клетками, вводимым в первой дозе.

[0445] Рекомбинантные рецепторы, такие как CAR, экспрессируемые клетками, вводимыми субъекту в различных дозах, обычно распознают или специфически связываются с молекулой, которая экспрессирована, ассоциирована и/или специфична для подлежащего лечению заболевания или состояния или его клеток. При специфическом связывании с молекулой, например, антигеном, рецептор в целом доставляет иммуностимулирующий сигнал, такой как ITAM-трансдуцированный сигнал, в клетку, тем самым содействуя иммунному ответу, направленному на заболевание или состояние. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки в первой дозе экспрессируют CAR, который специфически связывается с антигеном, экспрессируемым клеткой или тканью заболевания или состояния или ассоциированным с заболеванием или состоянием.

2. TCR

[0446] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированные антигенные рецепторы включают рекомбинантные T-клеточные рецепторы (TCR) и/или TCR, клонированные из встречающихся в природе T-клеток. В некоторых вариантах осуществления высокоаффинный T-клеточный клон для антигена-мишени (например, антигена злокачественной опухоли) идентифицируют, выделяют у пациента и вводят в клетки. В некоторых вариантах осуществления TCR клон для антигена-мишени создают в трансгенных мышах, сконструированных с использованием генов иммунной системы человека (например, системы лейкоцитарного антигена человека или HLA). См., например, опухолевые антигены (см., например, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 и Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808. В некоторых вариантах осуществления фаговый дисплей используют для того, чтобы выделять TCR к антигену-мишени (см., например, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 и Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354.

[0447] В некоторых вариантах осуществления после получения T-клеточного клона, α и β цепи TCR выделяют и клонируют в вектор экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления α и β гены TCR соединяют через пептид 2A рибосомного перепрыгивания пикорнавирусов с тем, чтобы совместно экспрессировать обе цепи. В некоторых вариантах осуществления генетический перенос TCR выполняют через ретровирусные или лентивирусные векторы, или через транспозоны (см., например, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; and Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683.

3. Множественное направленное воздействие

[0448] В некоторых вариантах осуществления клетки и способы включают стратегии множественного направленного воздействия, такие как экспрессия двух или больше генетически сконструированных рецепторов на клетке, каждый распознает тот же или отличающийся антиген и обычно каждый содержит отличающийся внутриклеточный сигнальный компонент. Такие стратегии множественного направленного воздействия описаны, например, в международной публикации патентной заявки № WO 2014055668 A1 (где описаны комбинации активирующих и костимулирующих CAR, например, направленных на два различных антигена, присутствующих по отдельности вне мишени, например, на нормальных клетках, но присутствующих вместе только на клетках заболевания или состояния, подлежащего лечению) и Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (декабрь 2013 года) (где описаны клетки, экспрессирующие активирующий и ингибирующий CAR, такие как те, на которых активирующий CAR связывается с одним антигеном, экспрессируемым как на нормальных или не больных клетках, так и на клетках заболевания или состояния, подлежащего лечению, и ингибирующий CAR связывается с другим антигеном, экспрессируемым только на нормальных клетках или клетках, которые не желают лечить).

[0449] Например, в некоторых вариантах осуществления клетки содержат рецептор, экспрессирующий первый генетически сконструированный антигенный рецептор (например, CAR или TCR), который способен к индукции активирующего сигнала для клетки, в целом при специфическом связывании с антигеном, распознаваемым первым рецептором, например, первым антигеном. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит второй генетически сконструированный антигенный рецептор (например, CAR или TCR), например, химерный костимулирующий рецептор, который способен к индукции костимулирующего сигнала в клетке иммунной системы, в целом при специфическом связывании со вторым антигеном, распознаваемым вторым рецептором. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген представляют собой одно и то же. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген различны.

[0450] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй генетически сконструированный антигенный рецептор (например, CAR или TCR) способен к индукции активирующего сигнала в клетке. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внутриклеточный сигнальный компонент, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы. В некоторых вариантах осуществления активация, индуцируемая первым рецептором, включает сигнальную трансдукцию или изменение экспрессии белка в клетке, что ведет к инициации иммунного ответа, такой как фосфорилирование ITAM и/или инициация каскада ITAM-опосредованной сигнальной трансдукции, формирование иммунологического синапса и/или кластеризация молекул около связанного рецептора (например, CD4 или CD8 и т. д.), активация одного или нескольких факторов транскрипции, таких как NF-κB и/или AP-1, и/или индукция экспрессии генов таких факторов, как цитокины, пролиферация и/или выживаемость.

[0451] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй рецептор содержит внутриклеточные сигнальные домены костимулирующих рецепторов, таких как CD28, CD137 (4-1 BB), OX40 и/или ICOS. В некоторых вариантах осуществления первый и второй рецепторы содержат внутриклеточные сигнальные домены костимулирующих рецепторов, которые различны. В одном из вариантов осуществления первый рецептор содержит костимулирующую сигнальную область CD28 и второй рецептор содержит костимулирующую сигнальную область 4-1BB, или наоборот.

[0452] В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй рецептор содержит как внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы, так и внутриклеточный сигнальный домен костимулирующего рецептора.

[0453] В некоторых вариантах осуществления первый рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен, содержащий ITAM или ITAM-подобные мотивы, и второй рецептор содержит внутриклеточный сигнальный домен костимулирующего рецептора. Костимулирующий сигнал в комбинации с активирующим сигналом, индуцированным в одной и той же клетке, представляет собой то, что ведет к иммунному ответу, такому как устойчивый и продолжительный иммунный ответ, такой как увеличенная экспрессия гена, секреция цитокинов и других факторов и опосредованные T-клетками эффекторные функции, такие как уничтожение клеток.

[0454] В некоторых вариантах осуществления ни лигирование первого рецептора отдельно, ни лигирование второго рецептора отдельно не индуцирует устойчивый иммунный ответ. В некоторых аспектах, если лигируют только один рецептор, клетка становится толерантной или нечувствительной к антигену или ингибированной и/или не поддается индукции к пролиферации или секреции факторов или осуществлению эффекторных функций. Однако в некоторых таких вариантах осуществления, когда лигируют множество рецепторов, например, при встрече клетки, экспрессирующей первый и второй антигены, достигают желаемого ответа, такого как полная иммунная активация или стимуляция, например, на что указывает секреция одного или нескольких цитокинов, пролиферация, персистенция и/или выполнение иммунной эффекторной функции, такой как цитотоксическое уничтожение клетки-мишени.

[0455] В некоторых вариантах осуществления два рецептора индуцируют, соответственно, активирующий и ингибирующий сигнал для клетки, так что связывание одного рецептора с его антигеном активирует клетку или индуцирует ответ, но связывание вторым ингибирующим рецептором его антигена индуцирует сигнал, который подавляет или снижает этот ответ. Примеры представляют собой комбинации активирующих CAR и ингибирующих CAR или iCAR. Например, можно использовать такую стратегию, в которой активирующий CAR связывает антиген, экспрессируемый при заболевании или состоянии, но который также экспрессируют нормальные клетки, и ингибирующий рецептор связывается с отдельным антигеном, который экспрессируют нормальные клетки, но не клетки заболевания или состояния.

[0456] В некоторых вариантах осуществления стратегию множественного направленного воздействия используют в случае, когда антиген, ассоциированный с конкретным заболеванием или состоянием, экспрессирует не больная клетка и/или экспрессирует сама сконструированная клетка, или временно (например, при стимуляции в сочетании с генетической инженерией) или перманентно. В таких случаях, необходимость лигирования двух отдельных и индивидуально специфичных антигенных рецепторов позволяет улучшать специфичность, избирательность и/или эффект.

[0457] В некоторых вариантах осуществления множество антигенов, например, первый и второй антигены, являются экспрессируемыми на клетке, ткани или заболевании или состоянии, подлежащем направленному воздействию, например, на клетке злокачественной опухоли. В некоторых аспектах, клетка, ткань, заболевание или состояние представляет собой множественную миелому или клетку множественной миеломы. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из множества антигенов в целом также экспрессируют на клетке, на которую не желают направленно воздействовать с использованием клеточной терапии, такую как нормальная или не больная клетка или ткань и/или сам сконструированные клетки. В таких вариантах осуществления, с помощью необходимости лигирования нескольких рецепторов для достижения ответа клетки достигают специфичности и/или эффекта.

B. Векторы и способы генетической инженерии

[0458] Различные способы введения генетически сконструированных компонентов, например, антигенных рецепторов, например, CAR или TCR, хорошо известны, и их можно использовать с предоставленными способами и композициями. Образцовые способы включают таковые для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, в том числе через вирусную, например, ретровирусную или лентивирусную, трансдукцию, транспозоны и электропорацию.

[0459] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в культивируемые клетки с использованием рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, таких как, например, векторы, получаемые из вируса обезьян 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol., ноябрь 2011 года, 29(11): 550-557.

[0460] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор имеет последовательность длинногго концевого повтора (LTR), например, ретровирусный вектор, полученный из вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса мышиных эмбриональных стволовых клеток (MESV), вируса мышиных стволовых клеток (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV) или аденоассоциированного вируса (AAV). Большинство ретровирусных векторов получают из мышиных ретровирусов. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают те, которые извлекают из любого источника в клетках птицы или млекопитающего. Ретровирусы обычно являются амфотропными, что обозначает, что они способны к инфицированию клеток-хозяев нескольких биологических видов, в том числе человека. В одном из вариантов осуществления ген, подлежащий экспрессии, заменяет ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Описано множество иллюстративных ретровирусных систем (например, патенты США №№ 5219740; 6207453; 5219740; Miller and Rosman (1989) Biomethods 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

[0461] Известны способы лентивирусной трансдукции. Образцовые способы описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.

[0462] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки через электропорацию (см., например, Chicaybam et al., (2013) PLoS one 8(3): e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки через транспозицию (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Другие способы введения и экспресси генетического материала в клетках иммунной системы включают трансфекцию с фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), слияние протопластов, опосредованную катионными липосомами трансфекцию; бомбардировку микрочастицами с использованием частиц вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и копреципитацию ДНК с фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

[0463] Другие подходы и векторы для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, представляют собой те, что описаны, например, в международной публикации патентной заявки № WO2014055668 и патенте США № 7446190.

[0464] В некоторых вариантах осуществления клетки, например, T-клетки, можно трансфицировать или во время или после размножения, например, с использованием T-клеточного рецептора (TCR) или химерного антигенного рецептора (CAR). Эту трансфекцию для введения гена желаемого рецептора можно осуществлять, например, с использованием любого подходящего ретровирусного вектора. Затем генетически модифицированную популяцию клеток можно освобождать от начального стимула (например, стимула CD3/CD28) и впоследствии стимулировать стимулом второго типа, например, через рецептор, введенный de novo). Этот стимул второго типа может включать антигенный стимул в форме пептида/молекулы MHC, когнатного (сшивка) лиганда генетически введенного рецептора (например, естественного лиганда CAR) или любого лиганда (такого как антитело), который непосредственно связывается с каркасом нового рецептора (например, посредством распознавания константных областей в рецепторе). См., например, Cheadle et al., «Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy» Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 или Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine, том 65: 333-347 (2014).

[0465] Среди дополнительных нуклеиновых кислот, например, генов для введения, имеют место те, которые усовершенствуют эффект терапии, например, содействуя жизнеспособности и/или функции перенесенных клеток; гены, предоставляющие генетический маркер для отбора и/или оценки клеток, например, чтобы оценивать выживаемость или локализацию in vivo; гены для усовершенствования безопасности, например, делающие клетку восприимчивой к отрицательному отбору in vivo, как описано в Lupton S. D. et al., Mol. и Cell Biol., 11:6 (1991); и Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); см. также публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601 Lupton et al., описывающие использование бифункциональных отбираемых слитых генов, получаемых слиянием доминантного положительного селективного маркера с отрицательным селективным маркером. См., например, Riddell et al., патент США № 6040177, в столбцах 14-17. В некоторых случаях, можно использовать вектор, который не требует активировать клетки, например, T-клетки. В некоторых таких случаях, клетки можно отбирать и/или трансдуцировать перед активацией.

V. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА И РАЗМНОЖЕНИЕ

[0466] В некоторых вариантах осуществления экспрессируемые клетки из основы, которые инкубировали, например, смешивали с, одним или несколькими стимулирующими условиями или стимулирующими средствами, дополнительно инкубируют вне основы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает перенос клеток-мишеней композиции в другое окружение. Например, окружение подходит для клеточной культуры или размножения. В некоторых вариантах осуществления клетки переносят в закрытой системе или закрытом контейнере в другое окружение. В некоторых случаях, перенос включает удаление клеток из первого контейнера во второй контейнер. В некоторых случаях, другое окружение находится в инкубаторе.

[0467] В некоторых вариантах осуществления перенос осуществляют в закрытой системе. В некоторых случаях стерильно закупоренный контейнер с клетками переносят в стерильное окружение или в другое окружение в закупоренном контейнере. В некоторых вариантах осуществления перенос осуществляют в стерильном окружении или в стерильных условиях.

[0468] В некоторых вариантах осуществления обратимое связывание между стимулирующим средством и реактивом разрушают перед переносом клеток-мишеней в другое окружение. В некоторых вариантах осуществления клетки переносят и удаляют из основы посредством разрушения обратимого связывания между средством и реактивом. В некоторых случаях, разрушения достигают добавлением биотина. В некоторых аспектах, разрушение высвобождает клетки-мишени из иммобилизованного реактива. В некоторых вариантах осуществления разрушение высвобождает клетки-мишени из реактива перед дополнительной инкубацией и размножением клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени отделяют от реактива и конкурентного средства перед дополнительной инкубацией и размножением.

[0469] В некоторых других вариантах осуществления, обратимое связывание между стимулирующим средством и реактивом не разрушают перед переносом клеток-мишеней в другое окружение. В некоторых вариантах осуществления, клетки-мишени, связанные со средством, обратимо связанным с реактивом, переносят в другое окружение для размножения. В некоторых аспектах, за дополнительной инкубацией и размножением клеток следует добавление конкурентного средства, которое разрушает обратимое связывание между реактивом и средством. В некоторых случаях, разрушения достигают добавлением биотина. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления разрушение высвобождает клетки из реактива после дополнительной инкубации и/или размножения клеток-мишеней.

[0470] В некоторых вариантах осуществления дополнительная инкубация и размножение происходит при температурах, больших, чем комнатная температура, таких как больше чем или больше чем приблизительно 25°C, например, обычно больше чем или больше чем приблизительно 32°C, 35°C или 37°C. В некоторых вариантах осуществления дополнительную инкубацию осуществляют при температуре, равной или приблизительно равной 37°C±2°C, например, при температуре, равной или приблизительно равной 37°C. В некоторых вариантах осуществления дополнительная инкубация происходит в течение времени между или приблизительно между 12 часами и 96 часами, например, по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 12 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 72 часа или 96 часов.

[0471] В некоторых вариантах осуществления дополнительная инкубация и размножение происходит в закрытой системе. В некоторых вариантах осуществления после экспрессии клеток из стационарной фазы, клетки инкубируют, например, смешивают, с одним или стимулирующими условиями или стимулирующими средствами, например, в контейнер (например, мешок), контейнер, содержащий клетки, инкубируют в течение дополнительной части времени. В некоторых вариантах осуществления контейнер, такой как мешок, инкубируют при температуре, равной или приблизительно равной 37°C±2°C в течение времени между или приблизительно между 1 часом и 48 часами, 4 часами и 36 часами, 8 часами и 30 часами или 12 часами и 24 часами, включительно.

[0472] В некоторых вариантах осуществления качалка биореактора может качать или возбуждать контейнер (например, мешок), тем самым обеспечивая движение (например, аэрацию и смешивание) клеток в мешке, чтобы содействовать культивированию клеток. Качание или возбуждение биореактора также может обеспечивать эффективный газообмен с поверхности газ-жидкость. Примеры биореакторов с платформами качающего движения, совместимых с компоновками биореакторного мешка, раскрытыми в настоящем описании, включают, но не ограничиваясь этим, GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20|50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems и Pall XRS Bioreactor Systems.

VI. КОМПОЗИЦИИ, СОСТАВЫ И СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ

[0473] Также предусмотрены композиции, содержащие сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок, такой как рекомбинантный рецептор (например, сконструированный антигенный рецептор), такой как CAR или TCR, и композиции, содержащие сконструированные клетки, в том числе фармацевтические композиции и составы. Также предусмотрены способы использования и использование композиций, например, при лечении заболеваний, состояний и нарушений, при которых экспрессирован антиген, или в способах обнаружения, диагностики и прогностики.

A. Композиции/составы

[0474] Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который имеет такую форму, которая дает возможность биологической активности активного ингредиента, содержащегося в ней, быть эффективной и которая не содержит дополнительные компоненты, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому вводят состав.

[0475] «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который является не токсичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничиваясь этим, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

[0476] В некоторых аспектах, выбор носителя отчасти зависит от конкретной клетки и/или способа введения. Соответственно, существуют различные подходящие составы. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах, используют смесь двух или больше консервантов. Консерванты или их смеси обычно присутствуют в количестве приблизительно от 0,0001% приблизительно до 2% по массе общей композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд., ред. Osol, A. (1980). Фармацевтически приемлемые носители в целом не токсичны для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают, но не ограничиваясь этим: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензилхлорид аммония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (меньше приблизительно 10 остаток) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как полиэтиленгликоль (PEG).

[0477] Буферные средства в некоторых аспектах включены в композиции. Подходящие буферные средства включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах, используют смесь двух или больше буферных средств. Буферное средство или их смеси обычно присутствуют в количестве приблизительно от 0,001% приблизительно до 4% по массе общей композиции. Известны способы получения вводимых фармацевтических композиций. Образцовые способы описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21-е изд. (May 1, 2005).

[0478] Состав или композиция также может содержать больше одного активного ингредиента, которые можно использовать для конкретного показания, заболевания или состояния, подлежащего лечению с использованием клеток, предпочтительно тех, которые имеют активности, комплементарные клетке, где соответствующие активности не оказывают нежелательного влияния друг на друга. Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предполагаемой цели. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит другие фармацевтически активные средства или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические средства, например, аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевину, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т. д. В некоторых вариантах осуществления клетки или антитела вводят в форме соли, например, фармацевтически приемлемой соли. Подходящие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли включают те, которые получают из неорганических кислот, таких как соляная, бромистоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислоты, и органических кислот, таких как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфоновая кислоты, например, п-толуолсульфоновая кислота.

[0479] Активные ингредиенты можно заключить в микрокапсулы, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию формулируют в виде комплекса включения, такого как циклодекстриновый комплекс включения, или в виде липосомы. Липосомы могут служить для направленного воздействия на клетки-хозяева (например, T-клетки или NK клетки) в конкретной ткани. Доступны многие способы получения липосом, такие как те, которые описаны, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), и патентах США 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.

[0480] В фармацевтической композиции в некоторых аспектах можно использовать системы доставки с медленным высвобождением, отсроченным высвобождением и замедленным высвобождением так, что доставка композиции происходит до и в течение достаточного времени для того, чтобы вызывать сенсибилизацию места, подлежащего лечению. Доступны и известны системы доставки с высвобождением многих типов. Такие системы позволяют избегать повторного введения композиции, тем самым увеличивая удобство для субъекта и врача.

[0481] Фармацевтическая композиция в некоторых вариантах осуществления содержит клетки в количествах эффективных для лечения или предотвращения заболевания или состояния, таких как терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество. Терапевтический или профилактический эффект в некоторых вариантах осуществления мониторинг осуществляют посредством периодической оценки субъектов, которых лечат. Для повторных введений в течение нескольких суток или долее, в зависимости от состояния, лечение повторяют до желаемой супрессии возникающих симптомов заболевания. Однако можно использовать и можно определять другие схемы дозирования. Желаемую дозу можно доставлять с помощью введения одного болюса композиции, посредством введения нескольких болюсов композиции или посредством непрерывного инфузионного введения композиции.

[0482] Клетки можно вводить с использованием стандартных способов введения, составов и/или устройств. Предусмотрены составы и устройства, такие как шприцы и флаконы, для хранения и введения композиций. Введение клеток может быть аутологическим или гетерологичным. Например, иммунореактивные клетки или предшественники можно получать у одного субъекта и вводить тому же субъекту или другому, совместимому субъекту. Иммунореактивные клетки, полученные из периферической крови, или их потомство (например, полученные in vivo, ex vivo или in vitro) можно вводить через локализованную инъекцию, в том числе катетерное введение, системную инъекцию, локализованную инъекцию, внутривенную инъекцию или парентеральное введение. При введении, терапевтическую композицию (например, фармацевтическую композицию, содержащую генетически модифицированную иммунореактивную клетку), в целом формулируют в инъецируемой форме стандартной дозы (раствор, суспензия, эмульсия).

[0483] Составы включают те, которые для орального, внутривенного, интраперитонеального, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, сублингвального или суппозиторного введения. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток вводят парентерально. Термин «парентеральное», как используют в настоящем описании, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и интраперитонеальное введение. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток вводят субъекту с использованием периферической системной доставки посредством внутривенной, интраперитонеальной или подкожной инъекции.

[0484] Композиции в некоторых вариантах осуществления предоставляют в виде стерильных жидких препаратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий, или вязких композиций, которые в некоторых аспектах могут быть буферными с выбранным pH. Жидкие препараты обычно получать легче, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции несколько удобнее вводить, в частности, посредством инъекции. Вязкие композиции, с другой стороны, можно формулировать в подходящем диапазоне вязкости, чтобы обеспечивать более длинные периоды контакта с конкретными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут содержать носители, которые могут представлять собой растворители или диспергирующие среды, содержащие, например, воду, физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси.

[0485] Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством внедрения клеток в растворитель, такой как смесь с подходящим носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, декстроза или тому подобное. Композиции также могут быть лиофилизированными. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие, диспергирующие или эмульгирующие средства (например, метилцеллюлоза), pH буферные средства, гелеобразующие или увеличивающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы, красители и т. п., в зависимости от пути введения и желаемого препарата. В некоторых аспектах можно обращаться к текстам стандартов для того, чтобы получать подходящие препараты.

[0486] Можно добавлять различные добавки, которые увеличивают стабильность и стерильность композиций, в том числе антимикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие средства и буферы. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Пролонгированную абсорбцию инъецируемой фармацевтической формы можно осуществлять с помощью средств, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

[0487] Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, эти матрицы имеют форму профилированных изделий, например, пленок или микрокапсул.

[0488] Составы, подлежащие использованию для введения in vivo, обычно стерильны. Стерильность легко можно обеспечивать, например, посредством фильтрования через стерилизующие фильтровальные мембраны.

B. Способы введения

[0489] Предоставлены способы введения клеток, популяции и композиции, а также использования таких клеток, популяций и композиций для лечения или предотвращения заболеваний, состояний и нарушений, в том числе злокачественных опухолей. В некоторых вариантах осуществления клетки, популяции и композиции вводят субъекту или пациенту, имеющему конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, например, через адоптивную клеточную терапию, такую как адоптивная T-клеточная терапия. В некоторых вариантах осуществления клетки и композиции, получаемые с помощью предоставленных способов, такие как сконструированные композиции и послепроизводственные композиции после инкубации и/или других стадий обработки, вводят субъекту, такому как субъект, имеющий заболевание или состояние или его риск. В некоторых аспектах, способами, тем самым лечат, например, улучшают заболевание или состояние, например, один или несколько симптомов, посредством уменьшения опухолевой нагрузки в злокачественной опухоли, экспрессирующей антиген, распознаваемый сконструированной T-клеткой.

[0490] Известны способы введения клеток для адоптивной клеточной терапии, которые можно использовать в связи с предоставленными способами и композициями. Например, описаны способы адоптивной T-клеточной терапии, например, в публикации патентной заявки США № 2003/0170238 на Gruenberg et al; патенте США № 4690915 на Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). См., например, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS one 8(4): e61338.

[0491] Как используют в настоящем описании, «субъект» представляет собой млекопитающее, такое как человек или другое животное, и обычно представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления субъект, например, пациент, которому вводят клетки, популяции клеток или композиции, представляет собой млекопитающее, обычно примата, такого как человек. В некоторых вариантах осуществления приматом является мартышка или человекообразная обезьяна. Субъектом может быть самец или самка любого подходящего возраста, в том числе детеныши, молодые, подростковые, взрослые и старческие субъекты. В некоторых вариантах осуществления субъектом является млекопитающее, не относящееся к приматам, такое как грызун.

[0492] Как используют в настоящем описании, «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «лечащий») относится к полному или частичному уменьшению интенсивности или уменьшению заболевания или состояния или нарушения, или симптома, нежелательного эффекта или исхода, или фенотипа, ассоциированного с ними. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваясь этим, предотвращение возникновения или повторного возникновения заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазов, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или облегчение состояния заболевания, и ремиссию или улучшенный прогноз. Термины не подразумевают полное излечение заболевания или полное устранение любого симптома или эффекта(ов) при всех симптомах или исходах.

[0493] Как используют в настоящем описании, «замедление развития заболевания» обозначает откладывание, препятствование, замедление, задержку, стабилизацию, супрессию и/или отсрочивание развития заболевания (такого как злокачественная опухоль). Эта задержка может иметь переменную длительность по времени, в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуума, подлежащих лечению. Специалисту в данной области очевидно, что достаточная или значимая задержка, по эффекту, может включать предотвращение у того индивидуума, у которого не развивается заболевание. Например, можно отсрочивать позднюю стадию злокачественной опухоли, например, развитие метастазов.

[0494] «Предотвращение», как используют в настоящем описании, включает обеспечение профилактики в отношении возникновения или повторного возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого пока не диагностировано заболевание. В некоторых вариантах осуществления предоставленные клетки и композиции используют для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

[0495] Как используют в настоящем описании, «супрессируют» функцию или активность представляет снижение функции или активности по сравнению условиями, в остальном схожими, за исключением условия или параметра, представляющего интерес, или альтернативно, по сравнению с другим состоянием. Например, клетки, которые супрессируют опухолевый рост, снижают скорость роста опухоли по сравнению со скоростью роста опухоли в отсутствие клеток.

[0496] «Эффективное количество» средства, например, фармацевтического состава, клеток или композиции в контексте введения относится к количеству, эффективному, в дозах/количествах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого результата, такого как терапевтический или профилактический результат.

[0497] «Терапевтически эффективное количество» средства, например, фармацевтического состава или клеток, относится к количеству, эффективному, в дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого терапевтического результата, например, для лечения заболевания, состояния или нарушения, и/или фармакокинетического или фармакодинамического эффекта лечения. Терапевтически эффективное количество может варьировать в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и масса субъекта, и вводимых популяций клеток. В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы включают введение клеток и/или композиций в эффективных количествах, например, терапевтически эффективных количествах.

[0498] «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному, в дозах и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, но не обязательно, поскольку профилактическую дозу используют у субъектов до заболевания или на его ранней стадии, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.

[0499] Заболевание или состояние, которое лечат, может представлять собой любое, при котором экспрессия антигена ассоциирована с и/или вовлечена в этиологию заболевания, состояния или нарушения, например, вызывает, усиливает или иным образом участвует в таком заболевании, состоянии или нарушении. Образцовые заболевания и состояния могут включать заболевания или состояния, ассоциированные со злокачественным новообразованием или трансформацией клеток (например, злокачественной опухоли), аутоиммунным или воспалительным заболеванием или инфекционным заболеванием, например, обусловленные бактериальным, вирусным или другим патогеном. Образцовые антигены, которые включают антигены, ассоциированные с различными заболеваниями и состояниями, которые можно лечить, описаны выше. В конкретных вариантах осуществления химерный антигенный рецептор или трансгенный TCR специфически связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или состоянием.

[0500] Таким образом, предоставленные способы и использования включают способы и использования для адоптивной клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение клеток или композиций, содержащих клетки, субъекту, в ткань или клетку, например, ту, которая имеет или имеет риск, или которую подозревают в наличии заболевания, состояния или нарушения. В некоторых вариантах осуществления клетки, популяции и композиции вводят субъекту, имеющему конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, например, через адоптивную клеточную терапию, такую как адоптивная T-клеточная терапия. В некоторых вариантах осуществления клетки или композиции вводят субъекту, такому как субъект, у которого присутствует или который имеет риск заболевания или состояния, улучшать один или несколько симптомов заболевания или состояния.

[0501] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапию, осуществляют посредством аутологического переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают у субъекта, который будет принимать клеточную терапию, или из образца, извлеченного у такого субъекта. Таким образом, в некоторых аспектах, клетки получают у субъекта, например, пациента, нуждающегося в лечении, и клетки, после выделения и обработки вводят тому же субъекту.

[0502] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапию, осуществляют посредством аллогенного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают у субъекта, отличного от субъекта, который будет принимать или который в конечном итоге принимает клеточную терапию, например, первого субъекта. В таких вариантах осуществления, клетки затем вводят другому субъекту, например, второму субъекту, того же биологического вида. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субъекты генетически идентичны. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субъекты генетически схожи. В некоторых вариантах осуществления второй субъект экспрессирует HLA того же класса или супертипа, что и первый субъект. Клетки можно вводить с помощью любых подходящих средств. Дозирование и введение может зависеть отчасти от того, является ли введение коротким или хроническим. Различные режимы дозирования включают, но не ограничиваясь этим, однократное или множественные введения в различные моменты времени, введение болюса и импульсную инфузию.

[0503] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапию, осуществляют посредством аллогенного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным образом получают у субъекта, отличного от субъекта, который будет принимать или который в конечном итоге принимает клеточную терапию, например, первого субъекта. В таких вариантах осуществления, клетки затем вводят другому субъекту, например, второму субъекту, того же биологического вида. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субъекты генетически идентичны. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субъекты генетически схожи. В некоторых вариантах осуществления второй субъект экспрессирует HLA того же класса или супертипа, что и первый субъект. Клетки можно вводить с помощью любых подходящих средств. Дозирование и введение может зависеть отчасти от того, является ли введение коротким или хроническим. Различные режимы дозирования включают, но не ограничиваясь этим, однократное или множественные введения в различные моменты времени, введение болюса и импульсную инфузию.

[0504] После введения клеток, в некоторых вариантах осуществления, измеряют биологическую активность популяции сконструированных клеток, например, с помощью любых из множества известных способов. Параметры оценки включают специфическое связывание сконструированной или природной T-клетки или другой клетки иммунной системы с антигеном, in vivo, например, посредством визуализации, или ex vivo, например, посредством ELISA или проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления способность сконструированных клеток уничтожать клетки-мишени можно измерять с использованием любого подходящего способа, известного в данной области, такого как анализы цитотоксичности, описанные, например, в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), и Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). В определенных вариантах осуществления биологическую активность клеток измеряют посредством анализа экспрессии и/или секреции одного или нескольких цитокинов, таких как CD107a, IFNγ, IL-2 и TNF. В некоторых аспектах биологическую активность измеряют посредством оценки клинического исхода, такой как снижение опухолевой нагрузки или массы.

[0505] В определенных вариантах осуществления сконструированные клетки дополнительно модифицируют любым числом путей так, что увеличивают их терапевтический или профилактический эффект. Например, сконструированный CAR или TCR, экспрессируемый популяцией, можно конъюгировать непосредственно или опосредованно через линкер с направленным фрагментом. Практика конъюгации соединений, например, CAR или TCR, с направленными фрагментами известна в данной области. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) и патент США 5087616.

VII. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0506] Пока не определено иное, все термины данной области, обозначения и другие технически и научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, предназначены для того, чтобы иметь то же значение, в каком их обычно понимает специалист в области, к которой относится заявленный объект изобретения. В некоторых случаях, термины с общепринятыми значениями определены в настоящем описании для прозрачности и/или удобства обращения, и включение таких определений в настоящее описание не обязательно толковать как отражение существенного отличия от того, что обычно понимают в данной области.

[0507] Как используют в настоящем описании, формы единственного числа включают множественное число, пока контекст явно не диктует иное. Например, форма единственного числа обозначает «по меньшей мере один» или «один или несколько». Понятно, что аспекты и вариации, описанные в настоящем описании, включают аспекты и вариации «состоит» и/или «состоит по существу из».

[0508] На всем протяжении этого раскрытия, различные аспекты заявленного объекта изобретения представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона служит лишь удобству и краткости, и его не следует толковать в качестве негибкого ограничения объема заявленного объекта изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как включающее конкретно раскрытые все возможные поддиапазоны, а также индивидуальные числовые значения в этом диапазоне. Например, где предоставлен диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом этого диапазона и любым другим указанным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне предусмотрено в заявленном объекте изобретения. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов можно независимо включать в меньшие диапазоны, и они также включены в заявленный объект изобретения, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих пределов, также включены в заявленный объект изобретения. Это применимо независимо от ширины диапазона.

[0509] Термин «приблизительно», как используют в настоящем описании, относится к обычному диапазону ошибки для соответствующего значения, который известен специалисту в данной области техники. Упоминание о «приблизительном» значении или параметре в настоящем описании включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на это значение или параметр per se. Например, описание, касающиеся «приблизительно X», включает описание «X».

[0510] Термин «вектор», как используют в настоящем описании, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Термин включает вектор в качестве самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую его введи. Определенные векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми их функционально связывают. Такие векторы обозначают в настоящем описании как «экспрессирующие векторы». Среди векторов присутствуют вирусные векторные частицы, такие как ретровирусные, например, гаммаретровирусные и лентивирусные векторные частицы.

[0511] Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые вводили экзогенную нуклеиновую кислоту, в том числе потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают эмбриональную трансформированную клетку и потомство, полученное из нее, независимо от числа пассирований. Потомство может быть не полностью идентичным, по содержанию нуклеиновых кислот, исходной клетке, но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое имеет ту же функцию или биологическую активность, как при скрининге или отборе исходно трансформированной клетки, включено в настоящее описание.

[0512] Как используют в настоящем описании, композиция относится к любой смеси двух или больше продуктов, веществ или соединений, в том числе клеток. Она может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водное, не водное или любое их сочетание.

[0513] Как используют в настоящем описании, «обогащение» в отношении клеток одного или нескольких конкретных типов или популяции клеток относится к увеличению числа или процентной доли типа клеток или популяции, например, по сравнению с общим числом клеток в объеме композиции, или относительно клеток других типов, например, с помощью положительного отбора на основании маркеров, экспрессируемых популяцией или клеткой, или с помощью отрицательного отбора на основании маркера, не присутствующего в популяции клеток или клетке, подлежащей истощению. Термин не требует полного удаления других клеток, типа клеток или популяций для композиции и не требует, чтобы клетки, обогащенные таким образом, присутствовали в или даже около 100% в обогащенной композиции.

[0514] Как используют в настоящем описании, утверждение о том, что клетка или популяция клеток является «положительной» по конкретному маркеру, относится к поддающемуся обнаружению присутствию на или в клетке конкретного маркера, обычно маркера поверхности. В отношении маркера поверхности, термин относится к присутствию поверхностной экспрессии, как обнаруживают посредством проточной цитометрии, например, посредством окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и обнаружения указанного антитела, где окрашивание поддается обнаружению посредством проточной цитометрии на уровне по существу выше окрашивания, обнаруживаемого при осуществлении той же процедуры с использованием контроля с совпадающим изотипом при в остальном идентичных условиях, и/или на уровне, по существу схожем с таковым для клетки, о которой известно, что она положительна по маркеру, и/или на уровне по существу выше такового для клетки, о которой известно, что она отрицательна по маркеру.

[0515] Как используют в настоящем описании, утверждение, что клетка или популяция клеток является «отрицательной» по конкретному маркеру, относится к отсутствию существенного поддающегося обнаружению присутствия на или в клетке конкретного маркера, обычно маркера поверхности. В отношении маркера поверхности, термин относится к отсутствию поверхностной экспрессии, как обнаруживают посредством проточной цитометрии, например, посредством окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и обнаружения указанного антитела, где окрашивание не обнаруживают посредством проточной цитометрии на уровне по существу выше окрашивания, обнаруживаемого при осуществлении той же процедуры с использованием контроля с совпадающим изотипом при в остальном идентичных условиях, и/или на уровне по существу ниже такового для клетки, о которой известно, что она положительна по маркеру, и/или на уровне, по существу схожем по сравнению с таковым для клетки, о которой известно, что она отрицательна по маркеру.

[0516] Термин «экспрессия», как используют в настоящем описании, относится к процессу, с помощью которого происходит продуцирование полипептида на основании кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ген. Процесс может включать транскрипцию, посттранскрипционный контроль, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционный контроль, посттрансляционную модификацию или любое их сочетание.

[0517] Как используют в настоящем описании, субъект включает любой живой организм, такой как человек и другие млекопитающие. Млекопитающие включают, но не ограничиваясь этим, человека и не относящихся к человеку животных, в том числе сельскохозяйственных животных, спортивных животных, грызунов и домашних животных.

[0518] Как используют в настоящем описании, контроль относится к образцу, который по существу идентичен тестовому образцу, за исключением того, что его не обрабатывают с использованием тестового параметра, или, если он представляет собой образец плазмы, он может быть от нормального добровольца, не пораженного состоянием, представляющим интерес. Контроль также может представлять собой внутренний контроль.

VII. ОБРАЗЦОВЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0519] Среди предоставленных вариантов осуществления имеют место:

1. Способ модулирования клеток, способ включает инкубацию композиции, содержащей клетки-мишени, в присутствии стимулирующего средства, которое обратимо связывают с реактивом, который необязательно представляет собой первый реактив, этот реактив содержит множество сайтов связывания стимулирующих средств, способных к обратимому связыванию со стимулирующим средством, в условиях, в соответствии с которыми стимулирующее средство специфически связывается с молекулой, экспрессируемой на поверхности клеток-мишеней, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в клетках-мишенях.

2. Способ по варианту осуществления 1, в котором:

множество сайтов связывания стимулирующих средств содержат один или несколько сайтов связывания, Z1, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, C1; и

стимулирующее средство дополнительно содержит один или несколько партнеров связывания, C1.

3. Способ по варианту осуществления 2, в котором:

множество сайтов связывания стимулирующих средств содержит два или больше сайтов связывания, Z1, и/или дополнительно содержит один или несколько сайтов связывания, Z2, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, C1; и/или

стимулирующее средство содержит два или больше партнеров связывания, C1.

4. Способ по любому из вариантов осуществления 1-3, в котором стимулирующее средство дополнительно содержит сайт связывания B2, где специфическое связывание между стимулирующим средством и молекулой на поверхности клеток-мишеней включает взаимодействие между B2 и молекулой.

5. Способ по любому одному из вариантов осуществления с 1 до 4, в котором по меньшей мере множество клеток-мишеней иммобилизуют на основе во время по меньшей мере части инкубации, где иммобилизация необязательно обратима.

6. Способ по варианту осуществления 5, в котором:

основа представляет собой или содержит стационарную фазу; и/или

основа представляет собой или содержит твердый носитель.

7. Способ по варианту осуществления 5 или 6, в котором реактив представляет собой первый реактив и по меньшей мере часть инкубации осуществляют в присутствии (a) второго реактива, который иммобилизуют на основе, и (b) средства отбора, обратимо связанного с указанным вторым реактивом;

где специфическое связывание с помощью средства отбора с селективным маркером, экспрессируемым по меньшей мере множеством клеток-мишеней, вызывает обратимую иммобилизацию указанного по меньшей мере множества клеток-мишеней на основе.

8. Способ по варианту осуществления 7, в котором второй реактив содержит множество сайтов связывания средства отбора, каждый способне к обратимому связыванию со средством отбора.

9. Способ по варианту осуществления 8 или варианту осуществления 14, в котором:

множество сайтов связывания средства отбора содержит один или несколько сайтов связывания, Y1, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, D1; и

средство отбора дополнительно содержит один или несколько партнеров связывания, D1.

10. Способ по варианту осуществления 9, в котором множество сайтов связывания средства отбора содержит два или больше сайтов связывания, Y1, и/или дополнительно содержит один или несколько сайтов связывания, Y2, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, D1; и/или

средство отбора содержит два или больше партнеров связывания, D1.

11. Способ по варианту осуществления 5 или 6, в котором обратимой иммобилизации по меньшей мере множества клеток-мишеней содействует обратимая иммобилизация реактива на основе во время указанной по меньшей мере части инкубации.

12. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, в котором:

первый реактив не является и не связан с или ассоциирован с твердым носителем, стационарной фазой, бусиной, микрочастицей, магнитной частицей и/или матрицей во время указанной инкубации, и/или

первый реактив является гибким, не содержит металлическую или магнитную сердцевину, полностью или в первую очередь состоит из органического мультимера, не является сферическим, не является по существу сферическим или однородным по геометрической форме и/или не является жестким.

13. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, который дополнительно включает объединение:

(a) по меньшей мере множества клеток-мишеней;

(b) средства отбора, которое (i) способно к специфическому связыванию с селективным маркером, экспрессируемым одной или несколькими из по меньшей мере множества клеток-мишеней из множества, и (ii) иммобилизуют или способно к иммобилизации на основе, непосредственно или опосредованно; и

(c) основы;

тем самым одна или несколько клеток-мишеней из по меньшей мере множества становятся иммобилизованными на основе через средство отбора.

14. Способ, который включает:

(1) объединение (a) композиции, содержащей клетки-мишени, (b) средства отбора, которое (i) способно к специфическому связыванию с селективным маркером, экспрессируемым одной или несколькими из по меньшей мере множества клеток-мишеней из множества, и (ii) иммобилизуют или способно к иммобилизации на основе, непосредственно или опосредованно; и (c) основы, в соответствии с чем одну или несколько клеток-мишеней из по меньшей мере множества иммобилизуют на основе через средство отбора; и

(2) инкубацию по меньшей мере множества клеток-мишеней в присутствии стимулирующего средства, обратимо связанного с реактивом, который необязательно представляет собой первый реактив, (первый) реактив содержит множество сайтов связывания стимулирующих средств, каждый способен к обратимому связыванию со стимулирующим средством, в условиях, в соответствии с которыми стимулирующее средство специфически связывается с молекулой, экспрессируемой на поверхности клеток-мишеней, тем самым индуцируя или модулируя сигнал в клетках-мишенях.

15. Способ по варианту осуществления 13 или 14, в котором:

средство отбора дополнительно содержит один или несколько партнеров связывания, D1, которые необязательно способны к обратимому связыванию с сайтом связывания, Z1; и/или

средство отбора дополнительно содержит один или несколько партнеров связывания, D1, которые необязательно способны к обратимому связыванию с сайтом связывания, Y1.

16. Способ по любому из вариантов осуществления 10-11, который дополнительно включает, после указанного объединения, отделение и/или удаление других клеток композиции от иммобилизованных клеток-мишеней.

17. Способ по варианту осуществления 16 или 17, который дополнительно включает выполнение стадии промывания.

18. Способ по любому из вариантов осуществления 15-17, в котором указанное отделение и/или указанную стадию промывания осуществляют перед инициацией указанной инкубации.

19. Способ по любому из вариантов осуществления 13-18, в котором основа представляет собой или содержит стационарную фазу и/или представляет собой или содержит твердый носитель.

20. Способ по любому из вариантов осуществления 13-19, в котором:

указанную инкубацию осуществляют и/или инициируют перед указанным объединением; или

указанную инкубацию осуществляют и/или инициируют после указанного объединения.

21. Способ по любому из вариантов осуществления 13-20, в котором указанное объединение осуществляют во время по меньшей мере части указанной инкубации.

22. Способ по любому из вариантов осуществления 13-21, в котором иммобилизация средства отбора на основе обратима.

23. Способ по любому из вариантов осуществления 14-22, в котором множество сайтов связывания стимулирующих средств содержит один или несколько сайтов связывания, Z1, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, C1; и

24. Способ по варианту осуществления 23, в котором:

25. Способ по любому из вариантов осуществления 13-24, в котором стимулирующее средство дополнительно содержит сайт связывания B2, где специфическое связывание между стимулирующим средством и молекулой на поверхности клеток-мишеней включает взаимодействие между B2 и молекулой.

26. Способ по любому из вариантов осуществления 13-25, в котором:

указанный реактив представляет собой первый реактив; и

иммобилизация средства отбора на основе является опосредованной и происходит через обратимое связывание средства отбора со вторым реактивом, который иммобилизуют на основе.

27. Способ по варианту осуществления 26, в котором второй реактив содержит множество сайтов связывания средства отбора, способных к обратимому связыванию со средством отбора.

28. Способ по варианту осуществления 27, в котором указанное множество сайтов связывания средства отбора содержит сайт связывания, Y1, который способен к связыванию с партнером связывания, D1, один или несколько из которых содержит средство отбора.

29. Способ по варианту осуществления 28, в котором:

указанное множество сайтов связывания средства отбора содержит два или больше сайтов связывания, Y1, и/или дополнительно содержит один или несколько сайтов связывания, Y2, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, D1; и/или

30. Способ по любому одному из вариантов осуществления 26-29, в котором второй реактив и средство отбора обратимо связывают вместе в комплексе во время указанного объединения, где объединение осуществляют посредством объединения клеток с комплексом.

31. Способ по любому из вариантов осуществления 26-30, в котором второй реактив и средство отбора не находятся в комплексе во время указанного объединения, где объединение осуществляют посредством отдельного добавления второго реактива и средства отбора.

32. Способ по любому одному из вариантов осуществления с 7 до 10 и с 13 до 31, в котором средство отбора дополнительно содержит сайт связывания, B1, и специфическое связывание между средством отбора и селективным маркером включает взаимодействие между B1 и селективным маркером.

33. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 32 или с 45 до 72, в котором:

обратимое связывание между стимулирующим средством и первым реактивом можно разрушать посредством добавления вещества; и/или

обратимое связывание между средством отбора и первым реактивом или средством отбора и вторым реактивом можно разрушать посредством добавления вещества; и/или

каждое из обратимого связывания между стимулирующим средством и первым реактивом и обратимрого связывания между средством отбора и вторым реактивом и/или первым реактивом можно разрушать посредством добавления вещества;

обратимое связывание между вторым стимулирующим средством и первым реактивом или четвертым реактивом можно разрушать посредством добавления вещества; и/или

обратимое связывание между вторым средством отбора и первым реактивом и/или вторым средством отбора и вторым реактивом и/или вторым средством отбора и третьим реактивом можно разрушать посредством добавления вещества; и/или

каждое из обратимого связывания между вторым стимулирующим средством и первым реактивом или четвертым реактивом и обратимого связывания между вторым средством отбора и первым реактивом, вторым реактивом и/или третьим реактивом можно разрушать посредством добавления вещества.

34. Способ по варианту осуществления 33 или 100 или композиция по варианту осуществления 120 или промышленное изделие по варианту осуществления 128 или устройство по варианту осуществления 131, где:

вещество представляет собой или содержит свободный партнер связывания; или

вещество представляет собой или содержит конкурентное средство; и/или

вещество вызывает изменение, отлично от конкуренции за указанное связывание, которое разрушает связывание.

35. Способ по варианту осуществления 34, в котором веществом не является вредоносным для клеток-мишеней или для большинства клеток-мишеней и/или в котором добавление вещества к клеткам-мишеням в количестве, достаточном для того, чтобы вызывать указанное разрушение, не снижает выживаемость и/или пролиферативную способность клеток на меньше чем или приблизительно 90%, 80%, 70%, 60% или 50%, по сравнению с отсутствием вещества при в остальном тех же условиях.

36. Способ по варианту осуществления 37, в котором вещество представляет собой или содержит пептид или полипептид.

37. Способ по любому одному из вариантов осуществления с 33 до 36, в котором:

вещество содержит молекулу из группы, состоящей из: стрептавидин-связывающих молекул; биотина; D-биотина; аналогов биотина; аналогов биотина, которые специфически связываются со стрептавидином или аналогом стрептавидина, имеющим аминокислотную последовательность Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ или lle⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷, в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 стрептавидина дикого типа; и пептидов, содержащих или состоящих из последовательности, приведенной в любой из SEQ ID № 1, 4, 5 и 7; или

вещество содержит хелатор металлов, который необязательно представляет собой EDTA или EGTA.

38. Способ по любому одному из вариантов осуществления с 1 до 27,

в котором стимулирующее средство содержит только один из указанных сайтов связывания, B2;

в котором стимулирующее средство содержит только один сайт связывания, который специфически связывается с молекулой;

в котором стимулирующее средство специфически связывается с молекулой одновалентным образом;

в котором средство отбора содержит только один из указанных сайтов связывания, B1;

в котором средство отбора содержит только один сайт связывания, который специфически связывается с селективным маркером; и/или

в котором средство отбора специфически связывается с селективным маркером одновалентным образом.

39. Способ по любому из вариантов осуществления 4-13 и 25-38, в котором:

сайт связывания, B2, содержит связывающий участок антитела; и/или

сайт связывания, B1, содержит связывающий участок антитела.

40. Способ по любому из вариантов осуществления 1-39, в котором:

стимулирующее средство представляет собой или содержит средство, выбранное из группы, состоящей из фрагментов антител, фрагментов одновалентного антитела, белковых связывающих молекул с иммуноглобулиноподобными функциями, молекул, содержащих домены Ig, цитокинов, хемокинов, аптамеров, молекул MHC, комплексов MHC-пептид; лигандов рецепторов; и их связывающих фрагментов; и/или

стимулирующее средство содержит фрагмент антитела;

стимулирующее средство представляет собой или содержит Fab-фрагмент;

стимулирующее средство выбирают из группы двухвалентных фрагментов антител, состоящей из (Fab)₂'-фрагментов и двухвалентных одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов;

стимулирующее средство представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-фрагментов, Fv-фрагментов и scFv; и/или

стимулирующее средство представляет собой белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, выбранную из группы, состоящей из аптамеров, мутеинов, основанных на полипептиде семейства липокалина, глутел, белков, основанных на анкириновом каркасе, белков, основанных на кристаллиновом каркасе, аднектинов и авимеров; и/или

средство отбора представляет собой или содержит средство, выбранное из группы, состоящей из фрагментов антител, фрагментов одновалентного антитела, белковых связывающих молекул с иммуноглобулиноподобными функциями, молекул, содержащих домены Ig, цитокинов, хемокинов, аптамеров, молекул MHC, комплексов MHC-пептид; лигандов рецепторов; и их связывающих фрагментов; и/или

средство отбора содержит фрагмент антитела;

средство отбора представляет собой или содержит Fab-фрагмент;

средство отбора выбирают из группы двухвалентных фрагментов антител, состоящей из (Fab)₂'-фрагментов и двухвалентных одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов;

средство отбора представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-фрагментов, Fv-фрагментов и scFv; и/или

средство отбора представляет собой белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, выбранную из группы, состоящей из аптамеров, мутеинов, основанных на полипептиде семейства липокалина, глутел, белков, основанных на анкириновом каркасе, белков, основанных на кристаллиновом каркасе, аднектинов и авимеров.

41. Способ по любому из вариантов осуществления 1-40, в котором:

молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой белок или полипептид; и/или

селективный маркер представляет собой белок или полипептид.

42. Способ по любому из вариантов осуществления 1-41, в котором:

молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой или содержит элемент комплекса антигенного рецептора T-клетки или B-клетки;

молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой или содержит цепь CD3;

молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой или содержит CD3ζ;

молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой или содержит антиген-связывающую часть T-клеточного рецептора или B-клеточного рецептора;

молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой химерный антигенный рецептор;

специфическое связывание стимулирующего средства и молекулы способно доставлять первичный сигнал в T-клетку или B-клетку.

43. Способ по любому из вариантов осуществления 7-42, в котором:

селективный маркер представляет собой корецептор B-клетки или T-клетки;

селективный маркер представляет собой или содержит элемент комплекса антигенного рецептора T-клетки или B-клетки;

селективный маркер представляет собой или содержит цепь CD3;

селективный маркер представляет собой или содержит ζ-цепь CD3;

селективный маркер представляет собой или содержит CD8;

селективный маркер представляет собой или содержит CD4 и/или

специфическое связывание между средством отбора и селективным маркером не индуцирует сигнал или не индуцирует стимуляторный или активирующий или пролиферативный сигнал в клетках-мишенях.

44. Способ по любому из вариантов осуществления 1-43, в котором:

стимулирующее средство содержит комплекс MHC I:пептид или его функциональную часть, комплекс MHC II:пептид или его функциональную часть и/или способно доставлять стимулирующий сигнал через комплекс TCR/CD3 в T-клетке, CD3-содержащий комплекс в T-клетке и/или ITAM-содержащую молекулу в T-клетке, и/или

указанная индукция или модуляция указанного сигнала ведет к увеличению экспрессии цитокина в клетке-мишени, которая необязательно представляет собой IL-2, IFN-γ и/или IL-4.

45. Способ по любому из вариантов осуществления 1-44, в котором молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой первую молекулу и стимулирующее средство дополнительно способно к связыванию со второй молекулой, экспрессируемой на поверхности по меньшей мере множества клеток-мишеней.

46. Способ по любому из вариантов осуществления 1-44, в котором молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой первую молекулу, стимулирующее средство представляет собой первое стимулирующее средство и инкубацию дополнительно осуществляют в присутствии второго стимулирующего средства, которое способно к связыванию со второй молекулой, экспрессируемой на поверхности по меньшей мере множества клеток-мишеней.

47. Способ по варианту осуществления 46, в котором второе стимулирующее средство обратимо связывают с первым реактивом или обратимо связывают с четвертым реактивом.

48. Способ по варианту осуществления 46 или варианту осуществления 47, в котором:

второе стимулирующее средство содержит один или несколько партнеров связывания, C1;

второе стимулирующее средство содержит один или несколько партнеров связывания, C2, которые способны к связыванию со стимулирующим средством-сайт связывания; и/или

второе стимулирующее средство содержит один или несколько партнеров связывания, C2, которые способны к связыванию с сайтом связывания, Z2, и реактив дополнительно содержит один или несколько сайтов связывания Z2.

49. Способ по варианту осуществления 48, в котором:

C2 и C1 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент;

Z1 и Z2 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент.

50. Способ по любому из вариантов осуществления 46-49, в котором второе стимулирующее средство содержит один или несколько сайтов связывания, B4, которые содействуют специфическому связыванию между вторым стимулирующим средством и второй молекулой.

51. Способ по варианту осуществления 45, в котором стимулирующее средство дополнительно содержит один или несколько сайтов связывания, B4, которые содействуют его специфическому связыванию со второй молекулой.

52. Способ по любому из вариантов осуществления 45-51, в котором специфическое связывание средства или второго средства со второй молекулой способно усиливать, ослаблять или модифицировать сигнал, доставляемый через первую молекулу.

53. Способ по любому из вариантов осуществления 45-52, в котором:

вторая молекула представляет собой костимулирующую молекулу;

вторая молекула представляет собой вспомогательную молекулу; вторая молекула представляет собой цитокиновый рецептор;

вторая молекула представляет собой хемокиновый рецептор;

вторая молекула представляет собой молекулу иммунной контрольной точки; или

вторая молекула представляет собой элемент семейства TNF или семейства рецепторов TNF.

54. Способ по любому из вариантов осуществления 1-53, в котором:

(первая) молекула, которая представляет собой первую молекулу, представляет собой костимулирующую молекулу, цитокиновый рецептор, хемокиновый рецептор, молекулу иммунной контрольной точки, элемент семейства TNF или семейства рецепторов TNF или функциональную часть любого из вышеуказанного;

(первая) молекула содержит CD28, CD137 или CD40 лиганд или CD40 или OX40 или ICOS или функциональную часть любого из вышеуказанного; и/или

вторая молекула содержит CD28, CD137 или CD40 лиганд или CD40 или OX40 или ICOS или функциональную часть любого из вышеуказанного.

55. Способ по любому из вариантов осуществления 1-54, в котором:

(первое) стимулирующее средство или второе стимулирующее средство специфически связывается с CD3, и, необязательно, его выбирают из группы, состоящей из антитела против CD3, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD3, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD3 и белковой CD3-связывающей молекулы и/или

(первое) стимулирующее средство или второе стимулирующее средство специфически связывается с CD28, и, необязательно, его выбирают из группы, состоящей из антитела против CD28, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD28, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD28 и белковой CD28-связывающей молекулы, элемента семейства B7 или его части и их смесей;

(первое) стимулирующее средство или второе стимулирующее средство специфически связывается с CD137, и, необязательно, его выбирают из группы, состоящей из антитела против CD137, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD28, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD137, белковой CD137-связывающей молекулы, лиганда 4-1BB или его CD137-связывающей части и их смесей; и/или

(первое) стимулирующее и/или вторичное средство содержит средство, которое специфически связывается с CD40, и, необязательно, его выбирают из группы, состоящей из антитела против CD40, одновалентного фрагмента антитела из антитела против CD40, двухвалентного фрагмента антитела из антитела против CD40 и белковой CD40-связывающей молекулы, CD40 лиганда (CD154) и их смесей.

56. Способ по любому из вариантов осуществления с 7 до 55, в котором селективный маркер представляет собой первый селективный маркер и средство отбора дополнительно способно к связыванию со вторым селективным маркером, который экспрессирован на поверхности по меньшей мере множества клеток-мишеней.

57. Способ по любому из вариантов осуществления с 7 до 55, в котором селективный маркер представляет собой первый селективный маркер и средство отбора представляет собой первое средство отбора и инкубацию дополнительно осуществляют в присутствии второго средства отбора, которое способно к связыванию со вторым селективным маркером, который экспрессирован на поверхности по меньшей мере множества клеток-мишеней.

58. Способ по варианту осуществления 57, в котором:

второе средство отбора обратимо связывают со вторым реактивом или

второе средство отбора обратимо связывают с третьим реактивом, который иммобилизуют на основе или дополнительной основе.

59. Способ по варианту осуществления 57 или 58, в котором:

второе средство отбора содержит один или несколько партнеров связывания, D1; и/или

второе средство отбора содержит один или несколько партнеров связывания, D2, которые способны к связыванию с сайтом связывания, Y1; и/или

второе средство отбора содержит один или несколько партнеров связывания, D2, которые способны к связыванию с сайтом связывания, Y2, и второй реактив дополнительно содержит один или несколько сайтов связывания Y2.

60. Способ по варианту осуществления 59, в котором:

D2 и D1 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент;

Y1 и Y2 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент;

C1 и D1 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент; и/или

Z1 и Y1 представляют собой одно и то же или по существу одно и то же или содержат один и тот же или по существу один и тот же фрагмент.

61. Способ по любому из вариантов осуществления 57-60, в котором второе средство отбора содержит один или несколько сайтов связывания, B3, которые содействуют специфическому связыванию между вторым средством отбора и вторым селективным маркером.

62. Способ по любому из вариантов осуществления 56 и 58-61, в котором средство отбора дополнительно содержит один или несколько сайтов связывания, B3, которые содействуют его специфическому связыванию со вторым селективным маркером.

63. Способ по любому из вариантов осуществления 45-62,

в котором второе стимулирующее средство содержит только один из указанных сайтов связывания, B4;

в котором второе стимулирующее средство содержит только один сайт связывания, который специфически связывается со второй молекулой;

в котором второе стимулирующее средство специфически связывается с молекулой одновалентным образом;

в котором второе средство отбора содержит только один из указанных сайтов связывания, B3;

в котором второе средство отбора содержит только один сайт связывания, который специфически связывается со вторым селективным маркером; и/или

в котором второе средство отбора специфически связывается со вторым селективным маркером одновалентным образом.

64. Способ по любому из вариантов осуществления 50-63, в котором:

сайт связывания, B4, содержит связывающий участок антитела; и/или

сайт связывания, B3, содержит связывающий участок антитела.

65. Способ по любому из вариантов осуществления 45-64, в котором:

второе стимулирующее средство представляет собой или содержит средство, выбранное из группы, состоящей из фрагментов антител, фрагментов одновалентного антитела, белковых связывающих молекул с иммуноглобулиноподобными функциями, молекул, содержащих домены Ig, цитокинов, хемокинов, аптамеров, молекул MHC, комплексов MHC-пептид; лигандов рецепторов; и их связывающих фрагментов; и/или

второе стимулирующее средство содержит фрагмент антитела;

второе стимулирующее средство представляет собой или содержит Fab-фрагмент;

второе стимулирующее средство выбирают из группы двухвалентных фрагментов антител, состоящей из (Fab)₂'-фрагментов и двухвалентных одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов;

второе стимулирующее средство представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-фрагментов, Fv-фрагментов и scFv; и/или

второе стимулирующее средство представляет собой белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, выбранную из группы, состоящей из аптамеров, мутеинов, основанных на полипептиде семейства липокалина, глутел, белков, основанных на анкириновом каркасе, белков, основанных на кристаллиновом каркасе, аднектинов и авимеров; и/или

второе средство отбора представляет собой или содержит средство, выбранное из группы, состоящей из фрагментов антител, фрагментов одновалентного антитела, белковых связывающих молекул с иммуноглобулиноподобными функциями, молекул, содержащих домены Ig, цитокинов, хемокинов, аптамеров, молекул MHC, комплексов MHC-пептид; лигандов рецепторов; и их связывающих фрагментов; и/или

второе средство отбора содержит фрагмент антитела;

второе средство отбора представляет собой или содержит Fab-фрагмент;

второе средство отбора выбирают из группы двухвалентных фрагментов антител, состоящей из (Fab)₂'-фрагментов и двухвалентных одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов;

второе средство отбора представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-фрагментов, Fv-фрагментов и scFv; и/или

второе средство отбора представляет собой белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, выбранную из группы, состоящей из аптамеров, мутеинов, основанных на полипептиде семейства липокалина, глутел, белков, основанных на анкириновом каркасе, белков, основанных на кристаллиновом каркасе, аднектинов и авимеров.

66. Способ по любому из вариантов осуществления 45-65, в котором:

вторая молекула, экспрессируемая на поверхности клеток-мишеней, представляет собой белок или полипептид; и/или

второй селективный маркер представляет собой или содержит белок или полипептид.

67. Способ по любому из вариантов осуществления 56-66, в котором:

второй селективный маркер представляет собой корецептор B-клетки или T-клетки;

второй селективный маркер представляет собой или содержит элемент комплекса антигенного рецептора T-клетки или B-клетки;

второй селективный маркер представляет собой или содержит цепь CD3;

второй селективный маркер представляет собой или содержит ζ-цепь CD3;

второй селективный маркер представляет собой или содержит CD8;

второй селективный маркер представляет собой или содержит CD4 и/или

специфическое связывание между вторым средством отбора и вторым селективным маркером не индуцирует сигнал или не индуцирует стимуляторный или активирующий или пролиферативный сигнал, в клетках-мишенях.

68. Способ модуляции клетки, способ включает:

(a) объединение композиции, содержащей клетки-мишени, и стимулирующего средства, обратимо связанного с реактивом, который иммобилизуют на основе, где реактив содержит множество сайтов связывания стимулирующих средств, каждый способен к обратимому связыванию со стимулирующим средством, и способен к специфическому связыванию с молекулой, экспрессируемой на поверхности клеток-мишеней,

тем самым иммобилизуя клетки-мишени на основе; и

(b) отделение или удаление, от иммобилизованных клеток-мишеней, других клеток композиции; и

(c) инкубацию по меньшей мере некоторых из иммобилизованных клеток-мишеней в присутствии стимулирующего средства, в условиях, в соответствии с которыми сигнал индуцируют или модулируют по меньшей мере во множестве клеток-мишеней.

69. Способ по варианту осуществления 69, в котором основа представляет собой или содержит твердый носитель и/или стационарную фазу.

70. Способ по варианту осуществления 68 или варианту осуществления 69, в котором множество сайтов связывания стимулирующих средств содержит один или несколько сайтов связывания, Z1, которые способны к обратимому связыванию с партнером связывания, C1; и

71. Способ по варианту осуществления 70, в котором:

72. Способ по любому из вариантов осуществления 68-71, в котором стимулирующее средство дополнительно содержит сайт связывания B2, где специфическое связывание между стимулирующим средством и молекулой на поверхности клеток-мишеней включает взаимодействие между B2 и молекулой.

73. Способ по любому из вариантов осуществления с 2 до 72, в котором:

основа содержит смолу или матрицу;

основа содержит гельфильтрационную матрицу;

основа содержит хроматографическую матрицу; и/или

основа содержит мембрану на основе целлюлозы или на основе органического полимера.

74. Способ по варианту осуществления 73, в котором хроматографическая матрица присутствует в колонке и/или в котором хроматография представляет собой колоночную хроматографию или плоскостную хроматографию.

75. Способ по любому из вариантов осуществления 2-74, в котором основа содержит микрочастицу, жесткую частицу, магнитную частицу или бусину.

76. Способ по любому из вариантов осуществления 77, в котором основа представляет собой стационарную фазу, присутствующую в контейнере во время целых или частичных указанной инкубации и/или указанного приведения в контакт.

78. Способ по варианту осуществления 76, в котором контейнер включает контейнер, выбранный из группы, состоящей из: колонок, контейнеров, подходящих для двунаправленного потока, наконечников пипетки, пробирок и колонок, подходящих для протекания жидкого образца.

79. Способ по любому из вариантов осуществления 1-78, в котором:

клетки-мишени содержат клетки крови;

клетки-мишени содержат лейкоциты;

клетки-мишени содержат лимфоциты;

клетки-мишени содержат B-клетки;

клетки-мишени содержат популяцию B-клеток

клетки-мишени содержат T-клетки;

клетки-мишени содержат популяцию T-клеток; и/или

клетки-мишени содержат естественные киллерные (NK) клетки.

80. Способ по варианту осуществления 79, в котором клетки-мишени содержат антиген-специфические T-клетки или их популяцию, T-хелперные клетки или их популяцию, цитотоксические T-клетки или их популяцию, T-клетки памяти или их популяцию, регуляторные T-клетки или их популяцию или NK клетки или их популяцию, антиген-специфические B-клетки или их популяцию, B-клетки памяти или их популяцию или регуляторные B-клетки или их популяцию.

81. Способ по любому из вариантов осуществления 1-80, в котором индукция или модуляция сигнала индуцирует, ослабляет, ингибирует или усиливает активацию, пролиферацию, выживаемость и/или размножение.

82. Способ по любому из вариантов осуществления 1-81, в котором:

первый реактив представляет собой или содержит стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, аналог авидина, который обратимо связывается с биотином, реактив, который содержит по меньшей мере две хелатирующие группы, K, которые способны к связыванию с ионом переходного металла, средство, способное к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, средство, способное к связыванию с глутатион-S-трансферазой, кальмодулин или его аналог, средство, способное к связыванию с кальмодулин-связывающим пептидом (CBP), средство, способное к связыванию с FLAG-пептидом, средство, способное к связыванию с HA-меткой, средство, способное к связыванию с мальтоза-связывающим белком (MBP), средство, способное к связыванию с эпитопом HSV, средство, способное к связыванию с эпитопом myc, и/или средство, способное к связыванию с биотинилированным белком-переносчиком; и/или

второй реактив и/или третий реактив представляет собой или содержит стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина, который обратимо связывается с биотином, аналог авидина, который обратимо связывается с биотином, реактив, который содержит по меньшей мере две хелатирующие группы, K, которые способны к связыванию с ионом переходного металла, средство, способное к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой, средство, способное к связыванию с глутатион-S-трансферазой, кальмодулин или его аналог, средство, способное к связыванию с кальмодулин-связывающим пептидом (CBP), средство, способное к связыванию с FLAG-пептидом, средство, способное к связыванию с HA-меткой, средство, способное к связыванию с мальтоза-связывающим белком (MBP), средство, способное к связыванию с эпитопом HSV, средство, способное к связыванию с эпитопом myc, и/или средство, способное к связыванию с биотинилированным белком-переносчиком.

82. Способ по варианту осуществления 81, в котором:

первый реактив содержит олигомер или полимер; и/или

второй реактив содержит олигомер или полимер; и/или

третий реактив содержит олигомер или полимер.

83. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 82, в котором:

первый реактив содержит олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога стрептавидина или аналога авидина, этот олигомер или полимер содержит мономеры стрептавидина, авидина или аналога, которые сшивают с помощью полисахарида или бифункционального линкера; и/или

второй реактив содержит олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога стрептавидина или аналога авидина, этот олигомер или полимер содержит мономеры стрептавидина, авидина или аналога, которые сшивают с помощью полисахарида или бифункционального линкера; и/или

третий реактив содержит олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога стрептавидина или аналога авидина, этот олигомер или полимер содержит мономеры стрептавидина, авидина или аналога, которые сшивают с помощью полисахарида или бифункционального линкера

четвертый реактив содержит олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога стрептавидина или аналога авидина, этот олигомер или полимер содержит мономеры стрептавидина, авидина или аналога, которые сшивают с помощью полисахарида или бифункционального линкера.

84. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 83, в котором

второй реактив содержит три или больше мономеров стрептавидина или три или больше мономеров мутеина стрептавидина; и/или

второй реактив содержит три или больше мономеров стрептавидина или три или больше мономеров мутеина стрептавидина и/или

третий реактив содержит три или больше мономеров стрептавидина или три или больше мономеров мутеина стрептавидина; и/или

четвертый реактив содержит три или больше мономеров стрептавидина или три или больше мономеров мутеина стрептавидина.

85. Способ по любому из вариантов осуществления 1-84, в котором первый реактив и второй реактив и/или первый реактив и третий реактив и/или первый реактив и четвертый реактив представляют собой одно и то же или по существу одно и то же.

86. Способ по любому из вариантов осуществления 1-85, в котором:

первый реактив и второй реактив не представляют собой одно и то же;

первый реактив и третий реактив не представляют собой одно и то же; и/или

второй реактив и третий реактив не представляют собой одно и то же; и/или

первый реактив и четвертый реактив не представляют собой одно и то же; и/или

второй реактив и четвертый реактив не представляют собой одно и то же; и/или

третий реактив и четвертый реактив не представляют собой одно и то же.

87. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 86, в котором:

партнер связывания C1, партнер связывания C2, партнер связывания D1 и/или партнер связывания D2, независимо, содержат биотин, аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином; и/или

каждый из партнера связывания C1 и партнер связывания C2, независимо, содержит биотин, аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином; и/или

каждый из партнера связывания D1 и партнер связывания D2, независимо, содержит биотин, аналог биотина, который обратимо связывается со стрептавидином или авидином.

88. Способ по любому из вариантов осуществления 1-87, в котором:

(первый) реактив средство содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается с биотином;

(первый) реактив содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается с аналогом биотина; и/или

средство (первого) реактива содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается со стрептавидин-связывающим пептидом; и/или

(первый) реактив содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается со стрептавидин-связывающим пептидом, выбранным из группы, состоящей из Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 18) и Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 19).

89. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 88, в котором:

второй реактив и/или третий реактив и/или четвертый реактив содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается с биотином;

второй реактив и/или третий реактив и/или четвертый реактив содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается с аналогом биотина; и/или

второй реактив и/или третий реактив и/или четвертый реактив содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается со стрептавидин-связывающим пептидом; и/или

второй реактив и/или третий реактив и/или четвертый реактив содержит аналог стрептавидина или аналог авидина, который обратимо связывается со стрептавидин-связывающим пептидом, выбранным из группы, состоящей из Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID № 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 18) и Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 19).

90. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 89, в котором:

партнер связывания C1, партнер связывания C2, партнер связывания D1 и/или партнер связывания D2, независимо, содержит стрептавидин-связывающий пептид, выбранный из группы, состоящей из Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 18) и Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 19);

каждый из партнера связывания C1 и партнер связывания C2, независимо, содержит стрептавидин-связывающий пептид, выбранный из группы, состоящей из Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 18) и Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 19); и/или

каждый из партнера связывания D1 и партнер связывания D2, независимо, содержит стрептавидин-связывающий пептид, выбранный из группы, состоящей из Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 18) и Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID № 19).

91. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 90, в котором:

(первый) реактив содержит аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 стрептавидина дикого типа, или аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность lle⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 стрептавидина дикого типа; и/или

второй реактив и/или третий реактив и/или четвертый реактив содержит аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 стрептавидина дикого типа, или аналог стрептавидина, который содержит аминокислотную последовательность lle⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 стрептавидина дикого типа; и/или

сайт связывания Z1, сайт связывания Z2, сайт связывания Y1 и/или сайт связывания Z2, индивидуально, содержит аминокислотную последовательность Va1-Thr-Ala-Arg и/или содержит аминокислотную последовательность lle-Gly-Ala-Arg.

92. Способ по любому одному из вариантов осуществления с 1 до 91, в котором связывание между указанным партнером связывания C1 и/или партнером связывания C2, соответственно, и указанным сайтом связывания Z1 и/или Z2, соответственно, способно происходить в присутствии двухвалентного катиона и/или не способно происходить в отсутствие двухвалентного катиона, и/или его разрушают посредством удаления двухвалентных катионов.

93. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 92, в котором:

каждый из указанных партнеров связывания C1 и/или C2 и/или каждый из указанных партнеров связывания D1 и/или D2, независимо, содержит кальмодулин-связывающий пептид и (первый) реактив и/или второй реактив и/или третий реактив и/или четвертый реактив содержит кальмодулин, или

каждый из указанных партнеров связывания C1 и/или C2 и/или каждый из указанных партнеров связывания D1 и/или D2, независимо, содержит FLAG-пептид и (первый) реактив и/или второй реактив и/или третий реактив и/или четвертый реактив содержит антитело, связывающее FLAG-пептид, или

каждый из указанных партнеров связывания C1 и/или C2 и/или каждый из указанных партнеров связывания D1 и/или D2, независимо, содержит олигогистидиновую метку и указанный (первый) реактив и/или второй реактив и/или третий реактив и/или четвертый реактив содержит антитело, связывающее олигогистидиновую метку.

94. Способ по любому из вариантов осуществления 1-93, в котором связывание между указанным партнером связывания C1 и указанным сайтом связывания Z1 и/или между указанным партнером связывания C2 и/или указанным сайтом связывания Z2 и/или указанным партнером связывания D1 и указанным сайтом связывания Y1 и/или указанным партнером связывания D2 и указанным сайтом связывания Y2 способно к разрушению посредством хелатирования иона металла, которое необязательно выполняют посредством добавления EDTA или EGTA.

95. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 94, в котором:

партнеры связывания C1 и C2 являются различными и/или их взаимодействия с (первым) реактивом можно разрушать посредством добавления другого вещества или не посредством добавления одного и того же вещества;

партнеры связывания D1 и D2 являются разичными и/или их взаимодействия со вторым реактивом можно разрушать посредством добавления другого вещества или не посредством добавления одного и того же вещества;

партнеры связывания C1 и/или C2 являются отличающимися по сравнению с партнерами связывания D1 и/или D2 и/или их взаимодействия с первым реактивом и вторым реактивом, соответственно, можно разрушать посредством добавления другого вещества или не посредством добавления одного и того же вещества.

96. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 94, в котором:

партнеры связывания C1 и C2 идентичны или по существу идентичны и/или их взаимодействия с первым реактивом можно разрушать посредством добавления одного и того же вещества;

партнеры связывания D1 и D2 идентичны или по существу идентичны и/или их взаимодействия со вторым реактивом можно разрушать посредством добавления одного и того же вещества;

партнеры связывания C1 и/или C2 идентичны или по существу идентичны по сравнению с партнерами связывания D1 и/или D2 и/или их взаимодействия с первым реактивом и вторым реактивом, соответственно, можно разрушать посредством добавления одного и того же вещества.

97. Способ по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, который дополнительно включает:

разрушение обратимого связывания между (первым) стимулирующим средством и/или вторым стимулирующим средством, с одной стороны, и (первым) реактивом и/или четвертым реактивом, с другой стороны.

98. Способ по любому из вариантов осуществления с 2 до 97, который дополнительно включает

разрушение обратимого связывания между (первым) средством отбора и/или вторым средством отбора, с одной стороны, и вторым реактивом и/или третьим реактивом, с другой стороны.

99. Способ по варианту осуществления 98, в котором:

указанное разрушение осуществляют после указанной инкубации или инициируют после инициации указанной инкубации; и/или

указанное разрушение дополнительно разрушает обратимое связывание между (первым) стимулирующим средством и/или вторым стимулирующим средством и первым реактивом; и/или

объединение осуществляют перед инициацией инкубации и обратимое связывание между средством отбора и вторым реактивом не разрушают перед указанной инициацией.

100. Способ по варианту осуществления 98 или варианту осуществления 99, в котором указанное разрушение осуществляют посредством введения вещества, которое разрушает взаимодействие между партнером связывания C1 и/или C2 и сайт связывания Z1 и/или Z2.

101. Способ по любому из вариантов осуществления с 98 до 100, в котором указанное разрушение вызывает:

завершение или уменьшение сигнала, доставляемого посредством одного из стимулирующих средств; или

завершение или уменьшение стимуляции, активации или размножения клеток.

102. Способ по любому из вариантов осуществления с 98 до 101, в котором указанное разрушение включает введение в клетки композиции, содержащей вещество.

103. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 102, в котором:

константа диссоциации (K_D) для обратимого связывания между указанным сайтом связывания Z1 и указанным партнером связывания C1 и/или для обратимого связывания между указанным сайтом связывания Z2 и указанным партнером связывания C2 находится в диапазоне от 10^-2 M до 10^-13 M.

104. Способ по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, в котором композиция, которую приводят в контакт со вторым реактивом, дополнительно содержит не клетки-мишени, которые не содержат селективный маркер, молекулу, вторую молекулу и/или второй селективный маркер, и способ дополнительно включает отделение клеток-мишеней от не клеток-мишеней.

105. Способ по любому одному из предшествующих вариантов осуществления, который дополнительно включает, перед указанной инкубацией, размножение клеток, содержащихся в популяции клеток-мишеней, или где клетки размножены in vitro перед указанной инкубацией.

106. Способ по любому одному из предшествующих вариантов осуществления, где способ дополнительно включает замену среды или добавление вещества по меньшей мере один раз во время указанной инкубации.

107. Способ по любому одному из предшествующих вариантов осуществления, который дополнительно включает повторение одной или нескольких стадий способа итеративным образом, в соответствии с чем клетки одной или нескольких популяций последовательно выделяют и размножают по меньшей мере в двух циклах, где способ необязательно включает приведение в контакт клеток-мишеней в популяции с по меньшей мере двумя различными средствами отбора, на каждой их двух различных стадий приведения в контакт, соответственно, которые специфически связываются с двумя различными селективными маркерами, где по меньшей мере часть указанной инкубации осуществляют между приведением в контакт с двумя различными средствами отбора.

108. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 107,

который дополнительно включает введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетки-мишени популяции, эта нуклеиновая кислота кодирует рекомбинантный белок, в соответствии с чем клетки экспрессируют рекомбинантный белок, где указанное введение необязательно осуществляют после или во время указанной инкубации и/или пока клетки иммобилизованы на основе; или

где клетки, во время по меньшей мере части инкубации, экспрессируют рекомбинантный белок, введенный ex vivo.

109. Способ по варианту осуществления 108, в котором введение нуклеиновой кислоты осуществляют между множеством из по меньшей мере двух стадий приведения в контакт.

110. Способ по варианту осуществления 109, в котором одно из по меньшей мере двух средств отбора специфически связывается с рекомбинантным белком и/или одно из стимулирующих средств специфически связывается с рекомбинантным белком.

111. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 110, в котором первый реактив не иммобилизуют на основе.

112. Композиция, содержащая стимулирующее средство, обратимо связанное с реактивом, который необязательно представляет собой первый реактив, где стимулирующее средство способно к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клетки-мишени, таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в клетке-мишени.

113. Композиция по варианту осуществления 112, в которой указанный (первый) реактив содержит множество сайтов связывания стимулирующих средств, каждый способен к обратимому связыванию с указанным стимулирующим средством.

114. Композиция по варианту осуществления 113, в которой реактив представляет собой первый реактив, которая дополнительно содержит:

(a) основу;

(c) второй реактив, иммобилизованный на основе; и

(d) средство отбора, которое способно к обратимому связыванию со вторым реактивом и способно к специфическому связыванию с селективным маркером на клетке-мишени.

115. Композиция по варианту осуществления 114, в которой основа представляет собой или содержит стационарную фазу и/или твердый носитель.

116. Композиция по любому одному из вариантов осуществления с 112 до 115, в которой средство отбора обратимо связывают со вторым реактивом.

117. Композиция по любому из вариантов осуществления с 114 до 116, в которой (первый) реактив не связывают с основой.

118. Композиция по любому из вариантов осуществления с 114 до 117, в которой первый реактив и второй реактив представляют собой одно и то же или по существу одно и то же.

119. Композиция по любому из вариантов осуществления с 112 до 118, которая дополнительно содержит клетку-мишень и/или дополнительно содержит не клетку-мишень, которая не экспрессирует (первый) селективный маркер и/или второй селективный маркер, где клетка-мишень необязательно содержит рекомбинантную молекулу или нуклеиновую кислоту, экспрессирующую рекомбинантную молекулу, которая необязательно представляет собой химерный рецептор.

120. Композиция по любому из вариантов осуществления с 112 до 118, которая дополнительно содержит вещество, способное разрушать обратимое связывание между вторым реактивом и средством отбора и/или способное разрушать между первым реактивом и стимулирующим средством.

121. Промышленное изделие для очистки и модуляции клеток-мишеней, промышленное изделие содержит:

(a) стимулирующее средство, способное к специфическому связыванию с молекулой на поверхности клетки-мишени, таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в клетке-мишени;

(b) реактив, который необязательно представляет собой первый реактив, который содержит множество сайтов связывания стимулирующих средств, каждый способен к обратимому связыванию со стимулирующим средством.

122. Промышленное изделие по варианту осуществления 121, которое дополнительно содержит:

(c) второй реактив;

(d) основу, которая необязательно представляет собой или содержит стационарную фазу и/или твердый носитель; и

(e) средство отбора, которое способно к обратимому связыванию со вторым реактивом и способно к специфическому связыванию с селективным маркером на клетке-мишени.

123. Изделие по варианту осуществления 122, в котором второй реактив иммобилизуют на основе.

124. Изделие по любому из вариантов осуществления с 121 до 123, в котором (первый) реактив обратимо связывают со стимулирующим средством и/или в котором средство отбора обратимо связывают со вторым реактивом.

125. Композиция по любому из вариантов осуществления с 112 до 120 или промышленное изделие по любому из вариантов осуществления с 121 до 124, которые дополнительно содержат:

второе стимулирующее средство, способное к специфическому связыванию со второй молекулой на поверхности клетки-мишени и обратимому связыванию с первым реактивом и/или обратимому связыванию с четвертым реактивом; и/или

второе средство отбора, способное к специфическому связыванию со вторым селективным маркером, который (i) содержит клетка-мишень или (ii) содержит другая клетка-мишень, которая необязательно экспрессирует молекулу, с которой (первое) стимулирующее средство и/или второе стимулирующее средство специфически связывается.

126. Композиция или промышленное изделие по варианту осуществления 125, в которых второе средство отбора способно к обратимому связыванию со вторым реактивом, или изделие дополнительно содержит третий реактив, способный к обратимому связыванию со вторым средством отбора, это третье средство необязательно иммобилизуют на основе или на другой основе.

127. Промышленное изделие по варианту осуществления 126, в котором основа и вторая основа присутствуют в отдельных контейнерах, где указанные различные контейнеры необязательно соединяют по текучей среде друг с другом, что делает возможным прохождение клеточной суспензии через или за пределы одной из основ, за которой следует другая.

128. Промышленное изделие по любому одному из вариантов осуществления с 121 до 127, которое дополнительно содержит вещество, способное разрушать обратимое связывание между одним или несколькими реактивами и одним или несколькими средствами.

129. Промышленное изделие по любому из вариантов осуществления с 122 до 128, в котором основа представляет собой стационарную фазу, которая представляет собой или содержит хроматографическую матрицу, где промышленное изделие дополнительно содержит контейнер, который необязательно представляет собой первый контейнер, который целиком или частично содержит хроматографическую матрицу, этот (первый) контейнер необязательно представляет собой колонку.

130. Промышленное изделие по варианту осуществления 129, в котором:

второй реактив дополнительно содержится в контейнере; и/или

(первое) средство отбора и/или второе средство отбора дополнительно содержатся в контейнере; и/или

промышленное изделие дополнительно содержит второй контейнер, необязательно содержащий (первое) стимулирующее средство и/или второе стимулирующее средство и/или первый реактив.

131. Промышленное изделие по варианту осуществления 130, в котором:

изделие дополнительно содержит третий контейнер, который содержит второе средство отбора и/или третий реактив; и/или

изделие дополнительно содержит четвертый контейнер, который содержит вещество.

132. Устройство, содержащее композицию по любому из вариантов осуществления с 112 до 120 или промышленное изделие по любому из вариантов осуществления 131, и необязательно дополнительно содержащий впуск текучего вещества, соединяемый по текучей среде с композицией или с одним или несколькими компонентами устройства, и/или выпуск текучего вещества, соединяемый по текучей среде с композицией и/или с одним или несколькими компонентами устройства.

133. Устройство, которое содержит:

(b) первый реактив, который способен к обратимому связыванию со стимулирующим средством;

(c) второй реактив;

(d) основу,

134. Устройство по варианту осуществления 133, в котором компоненты в (a)-(e) присутствуют во множестве контейнеров, по меньшей мере некоторые из которых находятся в соединении по текучей среде, необязательно в закрытой или стерильной системе, в соответствии с чем один или несколько компонентов проходят из одного контейнера в другой внутри устройства.

135. Промышленное изделие или устройство по любому из вариантов осуществления 121-134, которые дополнительно содержат выпуск образца, соединенный по текучей среде с одной из по меньшей мере одной стационарной фазы для хроматографии.

136. Промышленное изделие или устройство по любому из вариантов осуществления с 121 до 135, в которых устройство представляет собой функционально закрытую систему.

137. Промышленное изделие или устройство по любому из вариантов осуществления с 121 до 136, которые дополнительно содержат одно или несколько средств управления, способных регулировать или корректировать pH, pO₂, pCO₂, и/или термостатическое средство управления одного или нескольких контейнеров или их компонентов, и необязательно по меньшей мере одной из по меньшей мере одной стационарной фазы для хроматографии.

138. Промышленное изделие или устройство по любому из вариантов осуществления с 121 до 137 до 190, которые дополнительно содержат соединение по текучей среде с контейнером, содержащим среду и/или одно или несколько питательных веществ и/или один или несколько источников углерода, в соответствии с чем соединение позволяет доставлять такую среду, питательные вещества и/или источники углерода к клеткам внутри устройства, необязательно когда указанные клетки иммобилизуют на стационарной фазе для хроматографии.

139. Промышленное изделие или устройство по любому из вариантов осуществления с 121 до 138, в которых по меньшей мере один из перечисленных компонентов и/или контейнер, содержащй его, можно отсоединять от устройства стерильным или асептическим образом.

140. Устройство по любому из вариантов осуществления с 134 до 139, композиция по любому из вариантов осуществления с 112 до 120 или изделие по любому из вариантов осуществления с 121 до 133, которые можно использовать в или способны осуществлять способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 111 или с 142 до 150, где способ необязательно осуществляют автоматизированным образом.

141. Устройство по любому из вариантов осуществления с 134 до 139, композиция по любому из вариантов осуществления с 112 до 120 или изделие по любому из вариантов осуществления с 121 до 133 для использования в способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 111 или с 142 до 150, где способ необязательно осуществляют автоматизированным образом.

142. Способ по любому из вариантов осуществления с 13 до 111, в котором указанную инкубацию осуществляют после указанного объединения и способ дополнительно включает перенос клеток-мишеней композиции в другое окружение, указанное окружение подходит для клеточной культуры или размножения.

143. Способ по варианту осуществления 142, в котором клетки, переносимые таким образом, переносят в закрытой системе или закрытом контейнере в другое окружение; или в котором перенос включает удаление клеток, переносимых таким образом, из первого контейнера и перенос клеток во второй контейнер

144. Способ по варианту осуществления 142 или 143, в котором другое окружение находится внутри инкубатора.

145. Способ по любому из вариантов осуществления с 142 до 144, в котором указанный перенос осуществляют в закрытой системе, где указанный перенос включает перенос стерильно закупоренного контейнера, содержащего клетки, в стерильное окружение или в другое окружение в закупоренном контейнере, и/или в котором указанный перенос осуществляют в стерильном окружении или в стерильных условиях.

146. Способ по варианту осуществления 145, который дополнительно включает, после переноса, открепление клеток от стационарной фазы посредством разрушения указанного обратимого связывания и необязательно удаления указанных клеток из присутствия стационарной фазы.

147. Способ по варианту осуществления 146, который дополнительно включает размножение указанных удаленных клеток.

148. Способ по любому из вариантов осуществления с 1 до 111 и с 142 до 147, в котором температурой, pH, pO₂, pCO₂ и/или температурой управляют во время по меньшей мере части указанной инкубации, необязательно автоматизированным образом.

149. Способ по любому из вариантов осуществления с 142 до 148, в котором питательные вещества подают в клетки, содержащиеся по меньшей мере в одной из по меньшей мере одной стационарной фазы для хроматографии, при этом находящиеся в окружении, подходящем для размножения.

150. Способ по любому из вариантов осуществления с 142 до 149, в котором стационарная фаза присутствует в устройстве по любому из вариантов осуществления с 134 до 141, где перенос для размножения в подходящее окружение включает открепление стационарной фазы от клеток, пока указанная стационарная фаза присутствует в устройстве.

VIII. ПРИМЕРЫ

[0520] Следующие примеры включены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема изобретения.

ПРИМЕР 1 - Создание растворимого мультимеризованного средства, содержащего Fab-фрагменты против CD3 и против CD28, обратимо связанные на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина

[0521] Fab-фрагменты против CD3 и против CD28 мультимеризовали посредством обратимого связывания фрагментов антител с растворимым олигомерным мутеином стрептавидина, который использовали в качестве реактива мультимеризации. Растворимый олигомерный мутеин стрептавидина получали посредством полимеризации мутеина стрептавидина, обозначаемого Strep-tactin^® (гомотетрамер стрептавидина, содержащий аминокислотную последовательность мутеина, приведенную в SEQ ID № 6, см., например, патент США № 6103493 и Voss and Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982), с сульфо-SMCC (сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, продукт №22122 Thermo Scientific) и иминотиоланом (продукт № 26101 Thermo Scientific) по инструкциям производителя (Thermo Scientific). Молекулы олигомерного мутеина стрептавидина отделяли от мономерного (не прореагировавшего) и димерного мутеина стрептавидина посредством эксклюзионной хроматографии.

[0522] Fab-фрагменты против CD3 и против CD28 обратимо связывали с растворимым олигомерным мутеином стрептавидина через партнер связывания пептида стрептавидина, слитый с каждым Fab-фрагментом. Fab-фрагмент против CD3 получали из CD3-связывающего моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией OKT3 (ATCC^® CRL-8001™; см. также патент США № 4361549). Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антитела против CD3 OKT3 описаны в Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996) и приведены в SEQ ID №№ 31 и 32, соответственно. Fab-фрагмент против CD28 получали из антитела CD28.3 (депонированного в виде синтетической одноцепочечной Fv конструкции под номером доступа GenBank AF451974.1; см. также Vanhove et al., BLOOD, 15 июля 2003 года, том 102, № 2, страницы 564-570). Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антитела против CD28 CD28.3 приведены в SEQ ID №№ 33 и 34, соответственно. Оба Fab-фрагмента содержали домен κ CH1 и CL IgG1 человека, и каждый индивидуально слит на карбокси-конце своей тяжелой цепи со связывающей пептид стрептавидина последовательностью, содержащей компоновку последовательней двух стрептавидин-связывающих модулей, имеющих последовательность аминокислот SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK (SEQ ID № 16; коммерчески доступно в виде «Twin-Strep-tag^® в IBA GmbH, Gottingen, Germany). Меченные пептидами Fab-фрагменты получали рекомбинантно в E. coli, как описано в публикациях международной патентной заявки №№ WO 2013/011011 и WO 2013/124474.

[0523] Меченные пептидами Fab-фрагменты против CD3 и против CD28 смешивали приблизительно при комнатной температуре с растворимым олигомерным остовом, тем самым мультимеризуя Fab-фрагменты против CD3 и против CD28 на поверхности растворимого олигомерного остова через взаимодействие между партнером связывания пептида стрептавидина Fab-фрагментов и олигомерным мутеином стрептавидина. В образцовом варианте осуществления приблизительно 0,5 мкг меченного пептидами Fab-фрагмента против CD3 и приблизительно 0,5 мкг меченного пептидами Fab-фрагмента против CD28 добавляли к приблизительно 3 мкг растворимого олигомерного Strep-tactin^® при комнатной температуре. В некоторых случаях, меченные пептидами Fab-фрагменты предварительно смешивали перед обратимым связыванием на растворимом олигомерном остове мутеина стрептавидина, что, в некоторых случаях, может вести к более однородному распределению различных молекул Fab. Получаемое растворимое мультимеризованное средство против CD3/против CD28 использовали непосредственно для того, чтобы стимулировать T-клетки. В случае необходимости, получаемое растворимое мультимеризованное средство против CD3/против CD28 хранили на льду до стимуляции клеток.

ПРИМЕР 2: стимуляция/размножение CD3+ T-клеток-респондентов с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на бусах, покрытых мутеином стрептавидина Strep-tactin^®

[0524] 300000 CD3+CD62L-T-клеток-респондентов (Tresp, выделенных с помощью последовательного магнитного обогащения из не мобилизованного донорского продукта афереза) метили с использованием 3 мкМ CFSE и стимулировали с использованием 5 мкл из 15 мкл препарата бус Streptactin^® (10 мг магнитных частиц/мл, нагруженных 35 мкг бус Streptactin^®/мг), нагруженных с использованием только 0,5 мкг αCD3 Fab-фрагмента, только 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагмента или смеси 0,5 мкг αCD3 Fab-фрагмента и 0,5 мкг αCD28 Fab.

[0525] Используемый αCD3 Fab-фрагмент получали из CD3-связывающего моноклонального антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией OKT3. Гибридомная клеточная линия OKT3 и антитело OKT3 описаны в патенте США 4361549, клеточная линия депонирована под номером доступа ATCC^® CRL-8001™). Используемый αCD28 Fab получали из моноклонального антитела человека против CD28 CD28.3 (Vanhove et al, BLOOD, 15 июля 2003 года, том 102, № 2, страницы 564-570). Нуклеотидная последовательность вариабельных доменов этого антитела CD28.3 депонирована в GenBank в форме синтетической одноцепочечной Fv конструкции scFv28.3 антитела человека против CD28 под номером доступа Genbank AF451974.1).

[0526] Оба Fab-фрагмента получали рекомбинантно в E. coli, как описано в международных публикациях патентных заявок WO2013/011011 и WO 2013/124474, которые несут консенсусную последовательность константных доменов IgG1 (CH1 и Cκ). Тяжелые цепи обоих Fab-фрагментов сливали на карбокси-конце с последовательной компоновкой из двух стрептавидин-связывающих модулей (SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK) (SEQ ID № 16), которые коммерчески доступны в виде «Twin-Strep-tag^®» в IBA GmbH, Gottingen, Germany). αCD3 Fab-фрагмент использовали в качестве первого средства со стрептавидин-связывающим пептидом, служащим в качестве партнера связывания C1, и αCD28 Fab-фрагмент использовали в качестве второго средства со стрептавидин-связывающим пептидом, служащим в качестве партнера связывания C2. (Тетрамерный) мутеин стрептавидина «Strep-tactin^® служит в качестве реактива, на котором обратимо иммобилизовали оба Fab-фрагмента.

[0527] В эксперименте по размножению, клетки Tresp, стимулированные с использованием пустых бус (без Fab), служили в качестве отрицательного контроля. Клетки Tresp высевали в трех повторениях в 48-луночные планшеты наряду с 300000 CD3 клеток аутологических клеток-кормушек (облучали с использованием 30 Гр) в 3 мл полной клеточной культуральной среды (RPMI (Gibco) с добавлением 10% (об./об.) эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина, b-меркаптоэтанола, HEPES, пенициллина, стрептомицина и гентамицина) с добавлением 10 Ед/мл интерлейкина 2 (IL-2). Клетки инкубировали при 37°C без замены среды и анализировали после 4 суток с помощью FACS анализа. FACS окрашивание и анализ выполняли после 10 мин инкубации с 100 мкМ D-биотина. Один репрезентативный график для каждого условия представлен на фиг. 7A. Графики показывают живые CD3+ клетки, которые окрашивали йодидом пропидия (PI) для различения живых/погибших. На фиг. 7B представлена гистограмма, показывающая распределение размеров (прямое рассеяние) стимулированных клеток. На фиг. 7B показано, что конкретную популяцию клеток из Tresp клеток стимулировали и размножали (увеличение размера/числа по сравнению с не стимулированным контролем «только бусы»), при инкубации в присутствии бус, на которых иммобилизовали смесь 0,5 мкг αCD3 Fab-фрагмента и 0,5 мкг αCD28 Fab, после стимуляции in vitro αCD3/αCD28 Fab-фрагментами, которые обратимо иммобилизовали на бусах, покрытых мутеином стрептавидина Strep-tactin^®. На фиг. 7B изображены гистограммы разведения пролиферационного красителя CFSE, представляющие степень пролиферации в соответствии с числом клеток на клеточное деление (указано вверху на фиг. 7B, 0 обозначает клетки без деления; 5 обозначает клетки, которые прошли через по меньшей мере 5 делений). На фиг. 7B можно видеть, что популяция T-клеток, стимулированная бусами, на которых иммобилизовали смесь 0,5 мкг αCD3 Fab-фрагмента и 0,5 мкг αCD28 Fab, прошла главным образом через три клеточных делений и представляет более однородный паттерн пролиферации, чем при использовании только одного стимула (небольшое число клеток в не делившемся пике «0»). Увеличенное абсолютное количество пролиферации (больше клеток пролиферировало единообразно после 4 суток стимуляции с использованием бус, функционализированых αCD3 и αCD28) также представлено более интенсивным потреблением сред, как показывает изменение цвета индикатора на желтый (изображено в виде более светлой жидкости в лунках на фиг. фиг. 7C).

ПРИМЕР 3: стимуляция/размножение CD3+ T-клеток-респондентов с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимом Strep-tactin

[0528] В этом примере CD3+ T-клетки-респонденты (выделенные с помощью магнитного отбора из образца свежих PBMC, полученных из градиента Ficoll) размножали после стимуляции in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном Strep-tactin^®, действующем в качестве растворимого реактива. Олигомерный мутеин стрептавидина получали посредством полимеризации Strep-tactin^® с сульфо-SMCC (сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, продукт № 22122 Thermo Scientific) и иминотиоланом (продукт № 26101 Thermo Scientific) в соответствии с протоколом производителя (Thermo Scientific). Олигомерные мутеины стрептавидина отделяли мономерных (не прореагировавших) и димерных мутеинов стрептавидина посредством эксклюзионной хроматографии, и полученную таким образом фракцию олигомерного мутеина стрептавидина (n≥3) использовали в качестве растворимого реактива.

[0529] Для размножения in vitro 300000 CD3+ T-клеток-респондентов (Tresp) метили с использованием 2 мкМ сложного сукцинимидилового эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE) и стимулировали различными количествами препарата растворимого олигомерного мутеина стрептавидина, на котором иммобилизовали комбинацию описанного выше αCD3 OKT3 Fab-фрагмента и αCD28 Fab-фрагмента антитела 28.3 (оба несут указанный выше Twin-Strep-tag^® в качестве стрептавидин-связывающего пептида на тяжелой цепи). («1×» соответствует 3 мкг олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного с использованием 0,5 мкг αCD3- и 0,5 мкг αCD28 мономерного Fab-фрагмента, числа «0,5×», «2×» и «5×» обозначают соответствующее n-кратное количество «1×»). Клетки Tresp или оставляли не стимулированными или стимулировали пустым олигомерным мутеином стрептавидина (без Fab), который служил в качестве отрицательного контроля. Клетки Tresp высевали в двух повторениях в 48-луночные планшеты вместе с 300000 CD3-отрицательными аутологическими клетками-кормушками (облучали с использованием 30 Гр) в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 20 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C без замены среды и анализировали пролиферацию в соответствии с разведением CFSE после 5 суток посредством FACS анализа. На фиг. 8A представлено увеличение распределения размеров пролиферирующих клеток после 5 суток в культуре по сравнению с отрицательными контролями. На фиг. 8B показано, что CD3+ клетки Tresp должным образом стимулировали и подвергались энергичной пролиферации при инкубации с растворимым олигомерным мутеином стрептавидина (по сравнению с твердыми магнитными частицами Streptactin в примере 2 и на фиг. 7A-C), на котором иммобилизовали смесь αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагментов. Результаты на фиг. 8A и фиг. 8B показывают, что при этих условиях in vitro большинство CD3+ T-клеток-респондентов, делившихся (от 2 до 5 клеточных делений) после вовлечения поверхностного CD28 и комплекса TCR/CD3 с использованием αCD3 и αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина. После размножения in vitro растворимые мультимеризованные средства диссоциировали и удаляли после обработки D-биотином. Диссоциацию и удаление мономерных Fab-фрагментов анализировали проточной цитометрией посредством повторного окрашивания клеток фикоэритриновой меткой Strep-Tactin^®) (ST-PE). Репрезентативная гистограмма (темно-серая гистограмма) представлена в сравнении с подходящим отрицательным контролем только с ST-PE (светло-серая гистограмма). На фиг. 8C можно видеть, что оба Fab-фрагмента полностью диссоциировали и полностью были удалены из размноженных клеток. На фиг. 8D представлено абсолютное число живых (отрицательных по трипановому синему) клеток после 5 суток. Число подсчитывали с использованием счетной камеры Neubauer и наносили на график в зависимости от соответствующих условий стимуляции. Медиана числа клеток представлена на фиг. 8D; планки ошибки показывают стандартное отклонение (SD). На фиг. 8D показано, что все эти смеси αCD3 Fab-фрагментов и αCD28 Fab-фрагментов, которые иммобилизовали на растворимом реактиве олигомерного мутеина стрептавидина, в равной мере эффективны при размножении CD3+ клеток и приводили приблизительно к 4-кратному увеличению абсолютного числа клеток.

ПРИМЕР 4: кинетика пролиферации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro обратимыми αCD3/αCD28 Fab-мультимерами Streptamer без замены среды

[0530] В этом примере исследовали кинетику размножения при пролиферации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp), которые стимулировали in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимых олигомерных мутеинах стрептавидина. С этой целью, растворимый олигомерный мутеин Strep-tactin^® двух различных размеров служил в качестве растворимого реактива. Олигомерный Strep-tactin^® первого типа представлял собой фракцию олигомерного мутеина стрептавидина (n≥3), полученную в примере 3 (также обозначаемую в настоящем описании как «стандартный остов олигомерного мутеина стрептавидина», проиллюстрированный символом треугольника верхушкой вверх на фиг. 9A-B). Олигомерный мутеин стрептавидина второго типа, используемый в качестве растворимого реактива, представлял собой олигомерный мутеин стрептавидина (n≥3), который использовали в реакции с биотинилированным сывороточным альбумином человека (также обозначаемый в настоящем описании как «большой остов олигомерного мутеина стрептавидина).

[0531] В этом примере 500000 очищенных CD4+ или CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp) отдельно стимулировали этими двумя различными мультимерами Streptamer, как изложено выше, т. е. или с использованием остова олигомерного мутеина стрептавидина из примера 3 (используя раствор с концентрацией 1 мг олигомерного мутеина стрептавидина/мл) или с использованием большого остова олигомерного мутеина стрептавидина (0,1 мг/мл). 3 мкл обоих различных остовов нагружали комбинацией 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab, которую использовали в предыдущих примерах, которые несли стрептавидин-связывающий пептид SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK (SEQ ID № 16) на C-конце тяжелой цепи Fab-фрагмента. Кроме того, 4,5 мкл стандартного остова олигомерного мутеина стрептавидина загружали с использованием 0,5 мкг αCD3 Fab-фрагмента, 0,5 мкг αCD8 Fab-фрагмента (IBA GmbH Gottingen, который также несет на C-конце Fab-фрагмента стрептавидин-связывающий пептид SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK (SEQ ID № 16) и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагмента. Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля и клетки Tresp, стимулированные коммерчески доступными бусами против CD3/против CD28 (бусы, на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28) в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в двух повторениях в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды (RPMI 1640 (Gibco) с добавлением 10% (об./об. эмбриональной телячьей сыворотки, 0,025% (масс./об.) L-глутамина, 0,025% (масс./об.) L-аргинина, 0,1% (масс./об.) HEPES, 0,001% (масс./об.) гентамицина, 0,002% (масс./об.) стрептомицина, 0,002% (масс./об.) пенициллина) с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C без замены среды и число клеток анализировали после 1, 3 и 6 суток. В экспериментах с фиг. 9A-B размножение осуществляли без замены среды. Результаты для CD4+ T-клеток-респондентов представлены на фиг. фиг. 9A, результаты для CD8+ T-клеток-респондентов представлены на фиг. 9B, где графики представляют степень пролиферации в соответствии с числом клеток, собранных на момент времени, для CD4+ Tresp (фиг. 9A) и для CD8+ Tresp на фиг. 9B.

[0532] Как можно видеть на фиг. 9A, «меньший» растворимый реактив, на котором обратимо иммобилизовали αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагменты, обеспечивал то же количество размножения CD4+ T-клеток, что и бусы против CD3/против CD28 (которые являются до сих пор стандартным реактивом для размножения T-клеток), тогда как «большее» растворимое мультимеризованное средство обеспечивало даже более хорошее размножение по сравнению с Dynabead. Это усовершенствование может быть обусловлено растворимым «большим» мультимером, который способен к связыванию с большим числом T-клеток одновременно, чем «меньшее» мультимеризованное средство, и тем самым способен стимулировать больше CD4+ T-клеток, чем «меньшее» мультимеризованное средство.

[0533] Как видно на фиг. 9B, используя растворимые мультимеризованные средства, раскрытые в настоящем описании, можно размножать CD8+ T-клетки в первые 3 суток по меньшей мере также эффективно, как и в случае бус против CD3/против CD28. Стоит отметить, что в этот период времени эксперимент по размножению, в котором использовали растворимый реактив, который в дополнение к αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагментам (в качестве первого и второго средства) нес обратимо иммобилизованный на нем αCD8 Fab-фрагмент, показал наилучшую степень размножения при этих условиях культивирования. Это указывает на то, что возможно, используя стимул, который специфичен для конкретной субпопуляции клеток (здесь αCD8 Fab-фрагмент), увеличивать или модулировать избирательность размножения и тем самым можно получать более высокие количества (суб)популяции желаемых клеток.

[0534] Таким образом, резюмируя изложенное выше, в примере 4 показано, что функциональность растворимого мультимеризованного средства в отношении запуска размножения T-клеток сравнима с существующими стандартными способами с использованием бус против CD3/против CD28 с этой целью. Однако, поскольку стимуляцией можно управлять (и прерывать, по желанию) посредством добавления конкурента, такого как биотин, в случае обратимого взаимодействия, основанного на стрептавидине, между первым и вторым средством и реактивом, композиции и способы, описанные в настоящем описании, обеспечивают значимое преимущество над технологией бус против CD3/против CD28, поскольку условия размножения можно оптимизировать (например, возможно останавливать стимуляцию в эксперименте на фиг. 9B после 3 суток). Кроме того, поскольку растворимый реактив можно легко удалять из реакции (например, посредством иммобилизации реактива на биотинилированной колонке после реакции размножения), способы размножения, раскрытые в настоящем описании, можно осуществлять и автоматизировать в закрытых системах, которые, например, необходимы для GMP производства клеток для терапевтических целей, не имея дела с удалением бус, таких как бусы против CD3/против CD28.

ПРИМЕР 5: кинетика пролиферации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro обратимыми aCD3/aCD28 Fab-мультимерами Streptamer с заменой среды

[0535] В этом примере исследовали кинетику размножения при пролиферации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp), которые стимулировали in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимых олигомерных мутеинах стрептавидина. С этой целью, растворимый олигомерный мутеин Strep-tactin^® различных размеров служил в качестве растворимого реактива. Олигомерный Strep-tactin^® первого типа представлял собой фракцию олигомерного мутеина стрептавидина (n≥3), полученную в примере 3 (также обозначаемую в настоящем описании как «стандартный остов олигомерного мутеина стрептавидина», который проиллюстрирован символом треугольника верхушкой вниз на фиг. 9A-B). Олигомерный мутеин стрептавидина второго типа, используемый в качестве растворимого реактива, получали посредством реакции олигомерного Strep-tactin (n≥3), полученного в примере 3, с биотинилированным сывороточным альбумином человека. Этот растворимый олигомерный реактив также обозначают в настоящем описании как «большой остов олигомерного мутеина стрептавидина»

[0536] В этом примере 400000 очищенных CD4+ или CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp) отдельно стимулировали этими двумя различными олигомерными мутеинами стрептавидина, как изложено выше, т. е. с использованием или остова олигомерного мутеина стрептавидина из примера 3 (1,0 мг/мл) или большого остова олигомерного мутеина стрептавидина (0,1 мг/мл). 3 мкл обоих различных остовов нагружали комбинацией из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагментов, описанных выше. Кроме того, 4,5 мкл остова олигомерного мутеина стрептавидина из примера 3 нагружали с использованием 0,5 мкг αCD3, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагмента, как описано выше. Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и клетки Tresp стимулировали бусами против CD3/против CD28 (на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28) в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в двух повторениях в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C с заменой среды в сутки 3, и число клеток анализировали после 1, 3 и 6 суток. Результаты для CD4+ T-клеток-респондентов представлены на фиг. 10A, результаты для CD8+ T-клеток-респондентов представлены на фиг. 10B, где графики представляют степень пролиферации в соответствии с числом клеток, собранных на момент времени, для CD4+ Tresp (фиг. 10A) и для CD8+ Tresp на фиг. 10B.

[0537] Как можно видеть на фиг. 10A, растворимые реактивы, на которых обратимо иммобилизовали αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагменты (мультимеризованные средства), обеспечивали более хорошее размножение CD4+ T-клеток, чем бусы против CD3/против CD28.

[0538] Как видно на фиг. 10B, используя мультимеризованные средства, CD8+ T-клетки можно размножать в пределах первых 6 суток по меньшей мере также эффективно, как и в случае бус против CD3/против CD28. Стоит отметить, что в этот период времени, эксперимент по размножению, в котором использовали больший растворимый реактив, который нес αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагменты (в качестве первого и второго средства), показывал наилучшую степень размножения при этих условиях культивирования. Это также может быть обусловлено растворимым «большим» мультимеризованным средством, способным к связыванию большим числом T-клеток одновременно, чем «меньшее» мультимеризованное средство, тем самым способным стимулировать больше CD4+ T-клеток, чем «меньшее» мультимеризованное средство.

ПРИМЕР 6: кинетика размножения очищенных CD4+ и CD8+ T-клеточных культур с заменой среды или без нее

[0539] В этом примере комбинированные данные из примеров 4 и 5 нормализовали по входному числу клеток для «меньшего» мультимеризованного средства и положительного и отрицательного контроля. Нормализованные данные не получали для «большего» мультимеризованного средства. Как изложено в примерах 4 и 5, от 400000 до 500000 CD4+ или CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp) стимулировали с использованием 3 мкл препарата мультимеризованного средства (1 мг/мл; на котором иммобилизовали 0,5 мкг αCD3 Fab-фрагмента и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагмента). Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля и клетки Tresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28 в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в двух повторениях в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C с заменой среды (прямые линии на фиг. 11A-B) или без замены среды (штриховые линии на фиг. 11A-B) в сутки 3, и анализировали число клеток после 1, 3 и 6 суток. Как видно из нормализованных данных с фиг. 11A, «меньший» растворимый реактив, на котором обратимо иммобилизовали αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагменты, давал приблизительно 2,5-кратное размножение CD4+ T-клеток, тогда как размножение с использованием бус против CD3/против CD28 давало приблизительно 1,8-кратный уровень размножения. Таким образом, использование мультимеризованного средства даже обеспечивает усовершенствование размножения CD4+ T-клеток по сравнению с бусами против CD3/против CD28. Аналогичным образом, фиг. 11B подтверждает, что CD8+ T-клетки можно размножать с использованием мультимеризованных средств в первые 3 суток по меньшей мере также эффективно, как и в случае бус против CD3/против CD28.

ПРИМЕР 7: кинетика размножения и фенотип поликлональных активированных/размноженных не сортированных CD3+ центральных T-клеток памяти (T_CM)

[0540] В этом примере 500000 CD3+CD62L+CD45RA- T_CM клеток-респондентов (Tresp) стимулировали с использованием 3 мкл препарата растворимого олигомерного мутеина стрептавидина из примера 3 (1 мг/мл), который нагружали комбинацией из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Кроме того, 4,5 мкл препарата олигомерного мутеина стрептавидина, нагруженного с использованием 0,5 мкг αCD3, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab, использовали в качестве дополнительного условия стимуляции. Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и клетки Tresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28 (на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28) в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением только 30 Ед/мл IL-2 или 30 Ед/мл IL-2 и 5 нг/мл IL-15. Клетки инкубировали при 37°C с заменой среды каждые 3 суток и анализировали число клеток после 7 и 14 суток. Графики представляют степень пролиферации в соответствии с числом клеток, собранных на момент времени, на фиг. 12A среды с добавлением только IL-2 и на фиг. 12B среды с добавлением IL-2 и IL-15. Как можно видеть как на фиг. фиг.12A и фиг.12B, растворимый реактив, который имеет обратимо связанный с ним αCD3 Fab-фрагмент и αCD28 Fab-фрагмент, дает более хорошее размножение клеток, чем бусы против CD3/против CD28. Как дополнительно показано с помощью проточного цитометрического анализа поверхностной экспрессии CD62L и CD127 после 14 суток культуры в различных цитокиновых средах с фиг. 12C, экспериментальные подходы с использованием мультимеризованных средств сохраняют, при обоих условиях, выбранных здесь, более высокое содержащие CD127-экспрессирующих долгоживущих T-клеток памяти, чем размножение с использованием бус против CD3/против CD28. Это иллюстрирует дополнительное преимущество способов для данных композиций и способов, описанных в настоящем описании.

ПРИМЕР 8: выход и фенотип размноженных CD8+ T-клеток - вариация размера растворимого реактива и добавление αCD8-Fab для стимуляции

[0541] В этом примере исследовали размножение очищенных CD8+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимых олигомерных мутеинах стрептавидина. Кроме того, исследовали эффект добавления αCD8-Fab к реактиву для увеличения специфичности размножения для CD8+ T-клеток.

[0542] С этой целью, 300000 очищенных CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp) отдельно стимулировали двумя различными реактивами, основанными на Streptactin, а именно или малым мультимеризованным средством из примера 3 (1 мг/мл) или большим мультимеризованным средством, описанным выше (0,1 мг/мл). 3 мкл обоих остовов реактивов олигомерного мутеина стрептавидина нагружали комбинацией из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагментов, описанных выше, чтобы формировать мультимеризованные средства. Кроме того, 4,5 мкл меньшего остова олигомерного мутеина стрептавидина нагружали с использованием 0,5 мкг αCD3, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагментов, описанных выше. Кроме того, использовали 3 мкл «меньшего» остова олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного только с использованием 0,5 мкг одного αCD3 Fab-фрагмента или 0,5 мкг одного αCD28 Fab-фрагмент. Не стимулированные клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и Tresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28, служили в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в двух повторениях в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C с заменой среды после 3 суток и анализировали после 6 суток. На 13A изображена степень пролиферации в соответствии с числом клеток, собранных в сутки 6, по сравнению с отрицательными контролями и нормализованная по положительному контролю. На фиг. 13A показано, что размножение CD8+ T-клеток с использованием мультимеризованных средств ведет к более высокому выходу CD8+ T-клеток, чем размножение с использованием бус против CD3/против CD28. FACS анализ поверхностной экспрессии CD8 и поверхностной экспрессии CD45RO (фиг. 13B) после клеточной культуры показывает, что один и тот же фенотип CD8+ T-клеток размножали с помощью или мультимеризованных средств или бус против CD3/против CD28 (различные стимулирующие условия сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и не обнаруживали значимые различия (n.s.)). Усовершенствованный выход CD8+ клеток при использовании способов размножения, раскрытых в настоящем описании, по сравнению с бусами против CD3/против CD28 может быть обусловлен тем фактом, что растворимые мультимеризованные средства могут лучше достигать своих рецепторов-мишеней на клеточной поверхности, чем антитела, которые иммобилизуют на бусах против CD3/против CD28. Этот усовершенствованный выход может быть очень благоприятным при размножении популяции редких клеток из начального образца.

[0543] Кроме того, сравнивая выход размножения, которого достигали с использованием реактива, на котором совместно иммобилизовали 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагментов (вторая колонка слева на фиг. 13B) с выходом с использованием двух реактивов, которые функционализировали только с использованием одного αCD3 Fab-фрагмента или одного αCD28 Fab-фрагмент (третья колонка слева на фиг. 13B), можно видеть, что оба эксперимента имели одинаковую эффективность размножения. Таким образом, эти эксперименты показывают, что использование одного реактива, на котором совместно иммобилизуют первое средство и второе средство, функционально эквивалентно использованию для размножения двух отдельных реактивов, которые нагружали только первым средством и вторым средством, соответственно.

ПРИМЕР 9: Выход и фенотип размноженных CD8+ T-клеток - титрование отдельных растворимых реактивов с различными соотношениями αCD3- и αCD28 Fab-фрагмента, иммобилизованного на них

[0544] В этом примере исследовали выход и фенотип размноженных CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp), которые стимулировали in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали в различных количествах на растворимых олигомерных мутеинах стрептавидина.

[0545] С этой целью 300000 CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp) стимулировали различными количествами смеси препаратов «малых» олигомерных мутеинов стрептавидина (1 мг/мл), функционализированных с использованием только αCD3 Fab и только αCD28 Fab («1×» соответствует 1,5 мкг олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного с использованием 0,5 мкг только αCD3, и 1,5 мкг олигомерного мутеина стрептавидина, функционализированного 0,5 мкг только αCD28 Fab-фрагмента), или 3 мкл препарата олигомерного мутеина стрептавидина, нагруженного с использованием 0,5 мкг αCD3 и α0,5 мкг CD28 Fab, или 4,5 мкл препарата олигомерного мутеина стрептавидина, нагруженного с использованием 0,5 мкг αCD3, 0,5 мкг strep-меченного αCD8 и 0,5 мкг αCD28 Fab. Необработанные клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и Tresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28, в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C без замены среды и анализировали после 5 суток. На фиг. 14A изображена степень пролиферации в соответствии с числом клеток, собранных в сутки 5, по сравнению с отрицательными контролями, и нормализованных по положительному контролю. На фиг. 14A показано, что размножение CD8+ T-клеток с использованием различных мультимеризованных средств ведет к более высокому выходу CD8+ T-клеток, чем размножение с использованием бус против CD3/против CD28 (в частности, кумулятивное общее количество реактива в условии 5× вело к оптимальному размножению клеток, в частности, с течением времени/увеличению всех клеток посредством начального клеточного деления). FACS анализ поверхностной экспрессии CD8 и поверхностной экспрессии CD45RO (фиг. 14B) после клеточной культуры показывает, что тот же фенотип CD8+ T-клеток размножали с помощью или мультимеризованных средств или с помощью коммерчески доступных бус против CD3/против CD28.

ПРИМЕР 10: Выход и композиция подмножества размноженных CD3+ T-клеток с добавлением αCD8-Fab для стимуляции

[0546] Эксперимент показывает размножение очищенных CD3+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro с использованием αCD3/αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали на растворимых олигомерных мутеинах стрептавидина из примера 3, которые служили в качестве растворимого реактива. В одном эксперименте, в дополнение к αCD3/αCD28 Fab-фрагментам, αCD8 Fab-фрагмент, коммерчески доступный в IBA GmbH, Gottingen, Germany (№ по каталогу 6-8000-203), иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина для того, чтобы тестировать, возможно ли предпочтительно стимулировать конкретную субпопуляцию T-клеток in vitro с использованием обратимых αCD3/αCD28 мультимеризованных средств. Более подробно, 500000 очищенных CD3+ T-клеток-респондентов (Tresp) стимулировали с использованием 3 мкл препарата олигомерных мутеинов стрептавидина (1 мг/мл), нагруженных комбинацией из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. В качестве альтернативного подхода, 4,5 мкл олигомерных мутеинов стрептавидина нагружали с использованием 0,5 мкг αCD3, 0,5 мкг strep-меченного αCD8 Fab и 0,5 мкг strep-меченного αCD28 Fab. Не стимулированные клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и Tresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28 (бусы, на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28), служили в качестве положительного контроля. Как можно видеть на фиг. 15A, реактив, который обратимо нагружали αCD3 Fab-фрагментом, αCD28 Fab-фрагментом и также αCD8 Fab-фрагментом, обеспечивал самое высокое число размноженных CD3+ T-клеток. При использовании приблизительно 1×10⁶, выход числа размноженных клеток составлял приблизительно на 30% выше, чем для размножения этих T-клеток с использованием коммерчески доступных бус против CD3/против CD28. Вдобавок и, что более важно, как показано на фиг. 15B, при использовании этого реактива, который несет αCD3 Fab-фрагмент, αCD28 Fab-фрагмент и αCD8 Fab-фрагмент, количество CD8+ T-клеток было самым высоким, по сравнению как с размножением с использованием бус против CD3/против CD28, так и растворимого реактива, который несет только αCD3 Fab-фрагмент и αCD28 Fab-фрагмент в качестве первого и второго средства, как раскрыто в настоящем описании. Таким образом, также этот эксперимент показывает такое преимущество композиций и способов, описанных в настоящем описании, что в дополнение к первому средству, которое обеспечивает первичный сигнал активации для желаемой популяции клеток, и необязательно второму средству, которое обеспечивает костимулирующий сигнал, дополнительное средство, которое специфично для активации желаемой популяции клеток, можно иммобилизовать на реактиве. Таким образом, поступая так, композиции и способы, описанные в настоящем описании, предусматривают возможность предпочтительного размножения или избирательного обогащения любой желаемой популяции или субпопуляции клеток из образца, который, например, содержит множество различных субпопуляций.

ПРИМЕР 11: культура иммобилизованных T-клеток на колонке с использованием стационарной фазы, основанной на мутеине стрептавидина, с множеством сайтов связывания, обратимо функционализированных первым и вторым рецептор-связывающими средствами (αCD3 и αCD28 Fab-фрагментами)

[0547] Осуществляли исследование, демонстрирующее успешное размножение иммобилизованных T-клеток посредством инкубации клеток, в присутствии стационарной фазы, в хроматографической колонке, с мультимеризованными стимулирующими средствами. Средства обратимо связывали с реактивом, имеющим множество сайтов связывания для каждого из средств. Процесс включал инкубацию T-клеток, иммобилизованных на стационарной фазе, в присутствии мультимеризованных средств, что вело к их активации и размножению. Затем клетки удаляли из стационарной фазы посредством разрушения связывания.

[0548] В этом исследовании, PBMC-содержащие образцы человека выделяли из крови здорового донора человека, посредством разделения в градиенте фиколла. PBMC, в некоторых случаях, метили сложным сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) для оценки клеточного деления после инкубации. Колоночную аффинную хроматографию использовали для обогащения образцов PBMC по конкретным популяциям (CD3+ клетки, CD4+ и/или CD8+ клетки). Средства отбора со специфичностью к таким клеткам обратимо иммобилизовали на стационарной фазе внутри колонки. В частности, чтобы создавать колонки со стационарными фазами, 1,2 мл кончики предварительно заполняли стационарной фазой (200 мкл агарозной смолы), на которой иммобилизовали реактив, имеющий множество сайтов связывания для средств отбора (олигомер мутеина стрептавидина, «m1»). Шесть (6) микрограммов каждого из индивидуальных средств отбора (Fab-фрагментов, способных к специфическому связыванию с CD3, CD4 и CD8, соответственно), каждое из которых содержит партнер связывания (последовательность Twin-Strep-tag, приведенную в SEQ ID № 16 (SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK), способную к обратимому связыванию с сайтом связывания на реактиве отбора, добавляли и позволяли обратимо связываться с реактивом, иммобилизованным на колонке, тем самым иммобилизуя средства на стационарной фазе (агарозная смола), через реактив, создавая реактив отбора, иммобилизованный на стационарной фазе. Используя электронную пипетку, различные образцы и буферы добавляли в колонки и манипулировали ими.

[0549] PBMC-содержащие образцы (1×10⁷ клеток, 2×10⁷ клеток и 4,5×10⁷ клеток для обогащения CD3+, CD4+ и CD8+ популяций клеток-мишеней, соответственно) пропускали через колонку(и) для отбора подходящей популяции. Эта стадия содействовала специфическому связыванию T-клеток в образце, экспрессирующем релевантный селективный маркер(ы) (CD3, CD4 и/или CD8), с соответствующим средством(ами) отбора на стационарной фазе. Колонки промывали. Клетки, не экспрессирующие релевантный маркер в целом удаляли через этот процесс.

[0550] Затем отобранные клетки-мишени культивировали (инкубировали), пока они находились в колонках, в присутствии стационарной фазы, при различных условиях. Таким образом, клетки иммобилизовали на стационарной фазе во время всего культивирования или его части. В частности, чтобы сделать возможной дополнительную культуру иммобилизованных T-клеток на стационарной фазе, D-биотин не добавляли для разрушения обратимого связывания со смолой, пока не осуществляли после инкубации. Точнее, каждую из колонок (кончики), содержащих стационарную фазу и иммобилизованные отобранные клетки, переносили в 15 мл коническую пробирку для центрифуги. Клетки инкубировали на колонках (в присутствии 1 мл среды с добавлением IL-2), внутри соответствующих конических пробирок, на каждой свободно сидела крышка, и содержали внутри увлажненного CO₂ инкубатора. Клетки инкубировали на колонках, нетронутыми, в течение шести (6) суток после отбора.

[0551] Для размножения клеток, эту инкубацию осуществляли в присутствии мультимеризованных стимулирующих средств, способных доставлять активирующий и костимулирующий сигнал в T-клетки (против CD3, против CD28). Перед этой инкубацией, реактив мультимеризации (олигомеризованный мутеин стрептавидина, m1) обратимо связывали с двумя различными Fab-фрагментами, которые специфически связывались с CD3 и CD28, соответственно, и индивидуально содержали Twin-Strep-tag с SEQ ID № 16. В частности, 0,5 мкг каждого Fab-фрагмента смешивали с 3 мкг олигомеризованного мутеина. Получаемый комплекс мультимерного стимулирующего реактива добавляли в колонки для инкубации, служащий в качестве поликлонального активатора T-клеток. В определенных (не стимулированных) контрольных образцах, инкубацию осуществляли без добавления этого поликлонального активирующего реактива.

[0552] Затем, после инкубации, клетки элюировали из колонок посредством добавления среды, содержащей 1 мМ D-биотин. После элюирования оценивали число клеток, поверхностную экспрессию различных маркеров поверхности и пролиферацию (измеряли по разведению CFSE). Результаты представлены на фиг. 6A, фиг. 6B и фиг. 6C

[0553] Увеличенное число клеток (фиг. 6A) и разведение CFSE (данные не представлены) наблюдали после инкубации различных популяций T-клеток в колонках, в присутствии мультимеризованных стимулирующих средств (CD3/CD28 Fab), что указывает на размножение клеток при этих условиях.

[0554] Дополнительно, после инкубации с мультимеризованными стимулирующими средствами, наблюдали увеличенную процентную долю CD45RO+ клеток (фиг. 6B), что говорит о дифференцировке из наивного состояния в состояние, похожее на память. Увеличенная поверхностная экспрессия CD69 и поддерживаемые уровни экспрессии CD62L (фиг. 6C) соответствовала условиям, способствующим образованию и/или персистенции активированной, не окончательно дифференцированной, популяции клеток. Визуальное наблюдение культур показывало возникновение сдвига pH в образцах, которые инкубировали с мультимеризованными стимулирующими средствами, на основании цвета среды, что соответствовало сдвигу в метаболизме, ассоциированному с закислением внеклеточной среды.

ПРИМЕР 12: Анализ дифференциальной мобилизации внутриклеточного кальция в клетках Jurkat

[0555] Здесь реальном времени исследовали проточный цитометрический анализ дифференциальной мобилизации внутриклеточного кальция, заключенного в клетках Jurkat, которые метили с использованием αCD3 антитела клона OKT3 или Fab-фрагментов OKT3, мультимеризованных с использованием Strep-tactin^®.

[0556] С этой целью, клетки Jurkat нагружали кальций-чувствительным красителем Indo-1-AM и высвобождение кальция запускали посредством инъекции моноклонального антитела αCD3 OKT3 (продуцируемого гибридомной клеточной линией OKT3, см. выше, черные квадраты) или αCD3 Fab-фрагментов (полученных из родительской клеточной линии OKT3), которые мультимеризовали посредством обратимого связывания этого стрептавидин-связывающего пептида с растворимым Strep-Tactin, флуоресцентно конъюгированным с фикоэритрином. В случае интактных мультимерных OKT3 Fab-Strep-Tactin комплексов, высвобождение кальция запускали через идентичный период времени, как и в случае исходного клона антитела (темные серые треугольники). Активации клеток можно полностью избегать посредством инъекции обработанных D-биотином, предварительно диссоциированных Fab-Strep-Tactin комплексов (светлые серые круги), идентичной инъекции PBS отрицательного контроля (перевернутые белые треугольники). Применение иономицина служило в качестве положительного контроля для притока кальция. Мониторинг изменений внутриклеточной концентрации Ca²⁺ с разрешением по времени осуществляли посредством проточной цитометрии на основании изменения соотношения FL6/FL7. На фиг. 16A можно видеть, что как исходное антитело OKT3, так и мультимеризованный одновалентный Fab-фрагмент OKT3 вызывали высвобождение кальция, что обозначает, что мультимеризованный одновалентный Fab-фрагмент OKT3 по существу так же функционален, как и исходное антитело. Стоит отметить, что мультимерный OKT3 Fab-фрагмент не был способен запускать высвобождение кальция, если биотин добавляли к Strep-tactin, на котором иммобилизовали OKT3 Fab-фрагмент перед добавлением Streptactin-OKT3 Fab-фрагмента. В этом случае, биотин нарушал обратимую связь, образуемую между Strep-tactin в качестве средства мультимеризации и OKT3 Fab-фрагментом. Следовательно, одновалентный Fab-фрагмент вымещали из средства мультимеризации, и после диссоциации он не был способен запускать высвобождение кальция посредством связывания с CD3 клеток Jurkat.

[0557] В экспериментах, представленных на фиг. 16B, Indo-1-AM-меченные клетки Jurkat активировали с помощью полученных из OKT3 αCD3 Fab-Strep-Tactin-комплексов, как описано на фиг. 16A. Инъекция интактных (верхний график) или предварительно диссоциированных комплексов (нижний график) служила в качестве положительного или отрицательного контролей, соответственно. Кроме того, стимуляция клеток интактными Fab-Strep Tactin-комплексами, за которой следовала последующая инъекция D-биотина (около пиковой активации в t=140 с), вела к неожиданному нарушению передачи сигнала αCD3 Fab-мультимера (средний график). Инъекция иономицина в группе предварительно диссоциированного Fab комплекса служила в качестве положительного контроля. Данные представляют три различных эксперимента. Что важно, на фиг. 16B показано, что добавление D-биотина к образцу быстро вымещает Fab-фрагмент из средства мультимеризации Strep-tactin, тем самым эффективно прерывая высвобождение кальция даже при продолжающейся кальциевой стимуляции и демонстрируя, что диссоциированный OKT3 Fab-фрагмент более биологически не активен. Аналогичным образом, мультимерный OKT3 Fab-фрагмент также не способен запускать высвобождение кальция при добавлении биотина в мультимер Strep-tactin-OKT3 Fab-фрагмента перед добавлением образца Streptactin-OKT3 Fab в клетки Jurkat.

ПРИМЕР 13: Обратимое окрашивание клеток с помощью CD3 Fab-мультимеров

[0558] В этом примере исследуют обратимое окрашивание клеток с помощью αCD3 Fab-мультимеров. Свежие выделенные PBMC окрашивали с использованием или αCD3 моноклонального антитела клона OKT3 (левая точечная диаграмма, родительский клон для Fab-мультимеров) или когнатных меченных фикоэритрином (PE) OKT3 Fab-мультимеров и анализировали или до (вторая точечная диаграмма слева) или после обработки D-биотином (средняя точечная диаграмма). Затем остающиеся Fab мономеры обнаруживали после последующих стадий промывания с использованием свежего PE-меченного Strep-Tactin^® (вторая точечная диаграмма справа). Вторичное окрашивание Fab-мультимером обратимо окрашиваемых клеток служило в качестве контроля (правая точечная диаграмма). Только живые CD3 клетки, которые являются отрицательными по окрашиванию йодидом пропидия (PI), для различения живых/погибших, представлены на фиг. 17. Числа на точечных диаграммах показывают процентную долю клеток в гейтах. Этот эксперимент показывает, что окрашивание CD3+ PBMC Fab-фрагментом против CD3, мультимеризованным с использованием Streptactin в качестве реактива мультимеризации, полностью обратимо посредством добавления D-биотина и что отдельно одновалентный Fab-фрагмент не связывается с молекулой CD3, присутствующей на PBMC.

ПРИМЕР 14: Обратимое выделение клеток с помощью CD28 Fab-мультимеров

[0559] В этом примере показано выделение клеток посредством обратимого связывания Fab-фрагментов против CD28, мультимеризованных с использованием магнитных частиц Strep-Tactin^® (магнитные частицы доступны в IBA GmbH Gottingen, Germany). Fab-фрагменты, полученные из антитела CD28.3, описанного выше в примере 7, использовали с этой целью. Клетки CD28+ отбирали/выделяли с помощью магнитного отбора клеток с Fab-мультимером из свежих выделенных PMBC, как по существу описано в международной публикации патентной заявки № WO2013/011011. Результаты представлены на фиг. 22. Перед отбором осуществляли контрольное окрашивание клеток или когнатными флуоресцентными αCD28-мультимерами (левая точечная диаграмма) или антителом, направленным против легкой цепи κ иммуноглобулина (вторая точечная диаграмма слева, α-Ig κ mAb) в качестве контрольного окрашивания. После отбора, CD28+ клетки обрабатывали D-биотином и впоследствии промывали для того, чтобы удалять магнитные бусы и Fab-мономеры. Высвобожденные CD28+ клетки впоследствии (повторно) окрашивали с использованием или αCD28 Fab-мультимеров (вторая точечная диаграмма справа) или α-Igκ mAb (правая точечная диаграмма), чтобы обнаруживать потенциально остающиеся Fab-мономеры. Показаны только живые (PI-отрицательные) CD3+ клетки. Числа на точечных диаграммах показывают процентную долю клеток в гейтах. На фиг. 18 показано, что CD28+ клетки можно выделять из PMBC с использованием такого мультимеризованного Fab-фрагмента против CD28 и что все реактивы для выделения, в том числе Fab-мономеры против CD28, можно удалять после отбора.

ПРИМЕР 15: Раннее формирование кластера после активации очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro с использованием обратимых aCD3/aCD28 Fab-мультимеров Streptamer

[0560] В этом примере 400000 CD4+ или CD8+ T-клеток-респондентов (Tresp) стимулировали с использованием 3 мкл препарата олигомерного реактива мультимеризации Streptactin (1 мг/мл), нагруженного комбинацией из 0,5 мкг αCD3- и 0,5 мкг αCD28 Fab. Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и клетки Tresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28, в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в двух повторениях в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C и анализировали под микроскопом после 1 и 2 суток. Стимуляция CD4+ Tresp (фиг. 19A) и CD8+ Tresp (фиг. 19B) показана для бус против CD3/против CD28 (средний ряд) и мультимеризованного средства (нижний ряд), соответственно. Фотографии представляют степень формирования кластера: для лучшей видности образцовые кластеры обозначены кругами для стимуляции растворимыми олигомерами мутеина стрептавидина на фиг. 19A и фиг. 19B. Кластеры для стимуляции Dynabead легко виды по накоплению темных стимулирующих частиц. Как видно, и для CD4+ и для CD8+ T-клеток ранние кластеры сформировались при использовании способа размножения по изобретению, в котором используют растворимый олигомерный реактив мультимеризации.

ПРИМЕР 16: Избирательное антиген-специфическое размножение Tcm клеток-респондентов из не сортированных CD3+ центральных T-клеток памяти (кинетика и фенотип)

[0561] В этом примере исследовали кинетику и фенотип избирательного антиген-специфического (Аг-специфического) размножения из очищенных CD3+CD62L+CD45RA- Tcm клеток-респондентов.

[0562] Более подробно, CD3+CD62L+CD45RA- Tcm клетки-респонденты стимулировали in vitro с использованием как комплекса пептид:молекула MHC (который выполняет функцию первого средства, которое обеспечивает первичный сигнал активации клеток), так и αCD28 Fab-фрагмента (который выполняет функцию второго реактива, который стимулирует вспомогательную молекулу на поверхности клеток). Комплекс антиген-специфического пептида с молекулой MHC и αCD28 Fab-фрагмент обратимо иммобилизовали на растворимом олигомерном мутеине стрептавидина (с n≥3), описанном в примере 3. Пептид, который использовали для антиген-специфического размножения, представлял собой пептид CRVLCCYVL (SEQ ID № 38), аминокислоты 309-317 предраннего белка 1 (описано в Ameres et al, PLOS Pathogens, май 2013 года, том 9, выпуск 5, e1003383), которые представляют эпитоп HLA-C7/IE-1, который специфичен для цитомегаловируса (CMV). Молекула MHCI, которая представляет пептид, несет на C-конце α цепи (тяжелой цепи) стрептавидин-связывающий пептид (SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK, (SEQ ID № 16), который коммерчески доступен в «Twin-Strep-tag^®» из IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[0563] С этой целью, 500000 CD3+CD62L+CD45RA- Tcm клеток-респондентов (Tresp) стимулировали Аг-специфически с использованием 3 мкл препарата растворимого олигомерного реактива мультимеризации Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг комплексов пептидов:MHC класса I, оснащенных стрептавидин-связывающим пептидом, и 0,5 мкг αCD28 Fab, описанного выше. В качестве альтернативы, 4,5 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin нагружали с использованием 0,5 мкг этих комплексов пептидов:MHC класса I, 0,5 мкг CD8 αFab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Для сравнения, поликлональную стимуляцию осуществляли, используя 3 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin (1 мг/мл), нагруженного комбинацией из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Снова, в качестве альтернативных условий стимуляции, описанных выше, использовали 4,5 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin, обратимо нагруженного с использованием 0,5 мкг αCD3 Fab, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и клетки Tresp, стимулированные поликлонально бусами против CD3/против CD28 (бусами, на которых необратимо иммобилизованы моноклональные антитела αCD3 и αCD28), в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2 и 5 нг/мл IL-15. Клетки инкубировали при 37°C с заменой среды каждые 3 суток и анализировали число клеток после 7 и 14 суток. Образцовый проточный цитометрический анализ для фракции Аг-специфических клеток, которые стимулировали/размножали через растворимый олигомер strept-tactin, на котором иммобилизовали комплекс пептид:MHC-I для эпитопа HLA-C7/IE-1 (для CMV) (фиг. 20A), показывает, что эти антиген-специфические T-клетки размножались специфически. Графики на фиг. с 20B до 20E (которые представляют степень размножения отдельных Аг-специфичностей в соответствии с числом положительных по пептиду:MHCI и мультимеру клеток, собранных на момент времени, по аналогии с экспериментом по размножению, представленным на фиг. 20A) показывают, что реактив мультимеризации, который использует соответствующий комплекс Аг-специфического пептида и молекулы MHC 1 обеспечивал самое высокое число размноженных клеток (в диапазоне от двадцатикратного увеличения числа клеток для Аг-специфических клеток, которые распознают эпитоп pp65 из CMV (аминокислоты 341-350 (QYDPVAALF, (SEQ ID № 39)), ограниченный с помощью HLA-A2402) (см. фиг. 20B) до 98-кратного увеличения числа Аг-специфических клеток, которые распознают эпитоп HLA-B7/IE-1309-317 (CRVLCCYVL (SEQ ID № 38)) из CMV (см. фиг. 20E), тем самым показывая, что способ размножения по настоящему изобретению полностью применим к размножению Аг-специфических клеток. Наконец, образцовый проточный цитометрический анализ поверхностной экспрессии CD62L и CD127 после 14 суток культуры для эпитопа HLA-B7/Hexon5 (для аденовируса), представленный на фиг. 20F, дополнительно подтверждает, что экспериментальные подходы с использованием растворимых реактивов мультимеризации по настоящему изобретению сохраняют более высокое содержание CD127-экспрессирующих долгоживущих T-клеток памяти в поликлональных и Аг-специфических стимулирующих условиях.

ПРИМЕР 17: кинетика избирательного Аг-специфического размножения и фенотип не сортированных центральных T-клеток памяти

[0564] В этом примере исследуют кинетику избирательного Аг-специфического размножения из очищенных CD3+CD62L+CD45RA-Tcm клеток-респондентов, которое стимулировали in vitro с использованием a) антиген-специфических пептидных комплексов MHCI и b) αCD28 Fab-фрагментов, которые обратимо иммобилизовали в качестве первого и второго средства на растворимых олигомерных мутеинах стрептавидина.

[0565] С этой целью 500000 CD3+CD62L+CD45RA- Tcm клеток-респондентов (Tresp) стимулировали Аг-специфически с использованием 3 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг комплексов пептидов:MHC класса I, оснащенных стрептавидин-связывающим пептидом (специфичный пептид представляет аминокислоты 114-124 (CPYSGTAYNSL, SEQ ID № 41) белка гексон 5 аденовируса), ограниченные с помощью HLA-B07) и 0,5 мкг αCD28 Fab. В качестве альтернативы, 4,5 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin, нагруженного с использованием 0,5 мкг этого комплекса пептида:MHC класса I, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Для сравнения, поликлональную стимуляцию осуществляли, с использованием 3 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin (1 мг/мл), нагруженного комбинацией из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Снова, в качестве альтернативных условий стимуляции, описанных выше, использовали 4,5 мкл препарата мультимеров Streptactin, нагруженных с использованием 0,5 мкг αCD3 Fab, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служили в качестве отрицательного контроля, и клетки Tresp, стимулированные поликлонально бусами против CD3/против CD28, в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевали в 48-луночных планшетах в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2 и 5 нг/мл IL-15. Клетки инкубировали при 37°C с заменой среды каждые 3 суток и анализировали число клеток после 7 и 14 суток. Изображения, приведенные на фиг. 21, представляют степень формирования кластера в сутки 5, образцовая Аг-специфическая стимуляция проиллюстрирована для HLA-B7/эпитопа гексона 5 аденовируса. Как можно видеть на фиг. 21, такие клетки, специфичные к антигену аденовируса, можно специфически размножать из исходной популяции CD3+CD62L+CD45RA-Tcm респондентов.

ПРИМЕР 18: Активация внутриклеточных сигнальных каскадов после стимуляции aCD19-CAR трансдуцированных клеток Jurkat мультимерами Streptamer

[0566] В этом примере исследовали активацию внутриклеточных сигнальных каскадов трансдуцированных клеток Jurkat, которые модифицировали для того, чтобы экспрессировать опухолеспецифичный химерный антигенный рецептор (CAR), а именно здесь CD19, и которые стимулировали с использованием олигомерного Strep-tactin^® из примера 3 в качестве растворимого реактива мультимеризации.

[0567] С этой целью, 300000 клеток-респондентов Jurkat (Jresp) стимулировали (A) различными количествами смеси препаратов реактива мультимеризации Streptactin (1 мг/мл), функционализированного с использованием αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагментов, описанных здесь («×1» соответствует 3 мкг реактива мультимеризации Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг αCD3- и 0,5 мкг αCD28 Fab - это обеспечивает «поликлональный реактив мультимеризации, основанный на Streptactin»), или (B) 3 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг (×1) или 1 мкг (×2) внеклеточного домена (ECD) CD19 (естественный лиганд для αCD19-CAR - это обеспечивает «CAR-специфический реактив мультимеризации, основанный на Streptactin»), или 3 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin, нагруженного с использованием 0,5 мкг (×1) или 1 мкг (×2) αIgG, распознающего спейсер IgG4 в αCD19-CAR - это также обеспечивает «CAR-специфический реактив мультимеризации, основанный на мутеине стрептавидина). ECD из CD19, который оснащен гексагистидиновой меткой, получали из Sino Biological/Life Technologies (SEQ ID № 49) и функционализировали для связывания с реактивом мультимеризации, основанном на стрептавидине, посредством смешивания ECD из CD19 с адаптерной молекулой His-STREPPER (IBA GmbH, Germany, номер заказа 2-0920-005) в молекулярном соотношении 1:1 и инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре. Адаптерная молекула His-STREPPER содержит хелатирующую часть, которая связывается с гексагистидиновой меткой, и стрептавидин-связывающий пептид, тем самым временно предоставляя молекулу-мишень, здесь ECD из CD19 со стрептавидин-связывающим пептидом, которая может обратимо связываться с реактивом мультимеризации, основанным на мутеине стрептавидина. Jresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28 (бусами, имеющими необратимо иммобилизованные на них αCD3- и αCD28- моноклональные антитела) или PMA и иономицином, служили в качестве положительных контролей. Клетки Jresp высевали в 1,5 мл пробирки Eppendorf в 200 мкл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубировали при 37°C и помещали на лед и лизировали после 0-20 мин стимуляции. Обнаружение фосфорилированного ERK указывает активную MAPK передачу сигналов, окрашивание β-актина домашнего хозяйства указывает на загрузку равных количеств общего белка на условие и момент времени. Как можно видеть из сравнения фиг. 22A, где представлена активация клеток Jurkat через «поликлональный реактив мультимеризации Streptactin», и фиг. 22B, где представлена активация клеток Jurkat через два «CAR-специфических реактива мультимеризации, основанных на Streptactin», клетки Jurkat можно активировать/размножать через связывание внеклеточного домена CD19 с CD19-специфическим химерным антигенным рецептором. Поскольку последующую генетическую обработку T-клеток выполняли почти исключительно на предварительно отобранных популяциях клеток, родовая активация через сшивку введенных CAR через домен спейсера IgG4 (это сохраняли в различных CAR с различными специфичностями) расширяет применимость для обратимой стимуляции/размножения клеток в этих ситуациях обработки клеток in vitro.

[0568] Таким образом, этот эксперимент показывает, что в принципе любую популяцию клеток, которую активируют посредством связывания средства (лиганда), который обеспечивает первичный сигнал активации для популяции клеток, можно размножать с использованием первого средства, обратимо иммобилизованного на реактиве мультимеризации, как описано здесь.

ПРИМЕР 19: Параллельное антиген-специфическое размножение Tcm клеток-респондентов из одного пула

[0569] В этом примере исследуют кинетику параллельного антиген-специфического (Аг-специфического) размножения из одного пула T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro несколькими обратимыми мультимерами Streptamer пептид:MHC/αCH28 Fab.

[0570] 500000 CD3+CD62L+CD45RA- Tcm клеток-респондентов (Tresp) одновременно стимулируют по нескольким Аг-специфичностям, используя для каждой специфичности 3 мкл мультимеров Streptactin, функционализированных с использованием 0,5 мкг соответствующих комплексов пептидов:MHC класса I, которые несут стрептавидин-связывающий пептид, и 0,5 мкг αCD28 Fab, который также несет стрептавидин-связывающий пептид. В качестве альтернативного подхода, как описано здесь, для каждой специфичности используют 4,5 мкл реактива мультимеризации, основанного на Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг комплексов пептидов:MHC класса I, несущего стрептавидин-связывающий пептид, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Для сравнения осуществляют поликлональную стимуляцию с использованием 3 мкл препарата реактива мультимеризации, основанного на Streptactin (1 мг/мл), обратимо нагруженного комбинацией из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab. Также, в качестве альтернативных условий стимуляции, описанных выше, можно использовать 4,5 мкл препарата реактива мультимеризации, основанного на Streptactin, обратимо нагруженного с использованием 0,5 мкг αCD3 Fab, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab (каждый из них несет стрептавидин-связывающий пептид. Не обработанные (не стимулированные) клетки Tresp служат в качестве отрицательного контроля, и клетки Tresp, стимулированные поликлонально бусами против CD3/против CD28 (бусами, покрытыми αCD3- и αCD28- mAb), в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевают в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2 и 5 нг/мл IL-15. Клетки инкубируют при 37°C с заменой среды каждые 3 суток и число клеток анализируют после 7 и 14 суток.

ПРИМЕР 20: Предпочтительная пролиферация CD8+ T-клеток среди CD3+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro реактивами мультимеризации, основанными на стрептавидине, которые обратимо функционализированы αCD3/αCD8/αCD28 Fab-фрагментами

[0571] 300000 CD3+ T-клеток-респондентов (Tresp) стимулируют с использованием 3 мкл препарата мультимеризации Streptactin (1 мг/мл) или препарата реактива мультимеризации с использованием большого остова Streptactin (0,1 мг/мл), нагруженного с использованием комбинации из 0,5 мкг αCD3 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab, или 4,5 мкл препарата реактив мультимеризации, основанного на Streptactin, нагруженного с использованием 0,5 мкг αCD3, 0,5 мкг αCD8 Fab и 0,5 мкг αCD28 Fab, или 3 мкл смеси препаратов реактива мультимеризации, основанного на Streptactin, с 0,5 мкг только αCD3 Fab и 0,5 мкг толко αCD28 Fab (каждый Fab-фрагмент также несет стрептавидин-связывающий пептид). Необработанные клетки Tresp служат в качестве отрицательного контроля, и Tresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28 (бусами, покрытыми αCD3- и αCD28- mAb), в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевают в двух повторениях в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубируют при 37°C с заменой среды после 3 суток и анализируют после 6 суток.

ПРИМЕР 21: Предпочтительная пролиферация CD8+ T-клеток среди CD3+ T-клеток-респондентов, стимулированных in vitro реактивами мультимеризации, основанными на стрептавидине, которые обратимо функционализированы с использованием αCD3 Fab и αCD28 Fab-фрагментов

[0572] 300000 CD3+ T-клеток-респондентов (Tresp) стимулируют различными количествами смеси препаратов реактива мультимеризации, основанного на Streptactin (1 мг/мл), функционализированного с использованием отдельно αCD3 Fab-фрагмента и отдельно αCD28 Fab-фрагмент (1,5 мкг реактива мультимеризации, основанного на Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг только αCD3 Fab-фрагмента, и 1,5 мкг реактива мультимеризации, основанного на Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг только αCD28 Fab-фрагмента), или различными количествами смеси препаратов реактива мультимеризации, основанного на Streptactin, функционализированного с использованием αCD3 Fab-фрагмента и αCD28 Fab-фрагмента с αCD8 Fab-фрагментом или без него (каждый Fab-фрагмент также несет стрептавидин-связывающий пептид) (3 мкг реактива мультимеризации, основанного на Streptactin, функционализированного с использованием 0,5 мкг αCD3- и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагмента - без αCD8 Fab-фрагмента, или 4,5 мкл препарата реактива мультимеризации Streptactin, нагруженного с использованием 0,5 мкг αCD3 Fab-фрагмента, 0,5 мкг αCD8 Fab-фрагмента и 0,5 мкг αCD28 Fab-фрагмента, где Fab-фрагмент также несет стрептавидин-связывающий пептид). Необработанные клетки Tresp служат в качестве отрицательного контроля, и Tresp, стимулированные бусами против CD3/против CD28 (бусами, покрытыми αCD3- и αCD28- mAb), в качестве положительного контроля. Клетки Tresp высевают в 48-луночные планшеты в 1 мл клеточной культуральной среды с добавлением 30 Ед/мл IL-2. Клетки инкубируют при 37°C с заменой среды после 3 суток и анализируют после 6 суток.

[0573] Не предусмотрено, что объем настоящего изобретения ограничен конкретными раскрытыми вариантами осуществления, которые предоставлены, например, чтобы иллюстрировать различные аспекты изобретения. Различные модификации в описанных композициях и способах будут видны из описания и положений в настоящем описании. Такие вариации можно осуществлять на практике, не отступая от истинных объема и сущности раскрытия, и они предназначены для того, чтобы входить в объем настоящего раскрытия.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

№	Последовательность	Описание
1	DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ	Стрептавидин Вид: Streptomyces avidinii UniProt № P22629
2	EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS	Минимальный стрептавидин Вид: Streptomyces avidinii
3	DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ	Мутеин стрептавидина Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ Вид: Streptomyces avidinii
4	EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS	Мутеин стрептавидина Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ Вид: Streptomyces avidinii
5	DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYIGARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ	Мутеин стрептавидина Ile⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ Вид: Streptomyces avidinii
6	EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYIGARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS	Мутеин стрептавидина Ile⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ Вид: Streptomyces avidinii
7	Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly	Стрептавидин-связывающий пептид, Strep-tag®
8	WSHPQFEK	Strep-tag® II
9	His-Pro-Xaa	Стрептавидин-связывающий пептид Xaa выбирают из Gln, Asp и Met
10	His-Pro-Gln-Phe	Стрептавидин-связывающий пептид
11	Xaa₁-Xaa₂-His-Pro-Gln-Phe-Xaa₃-Xaa₄	Стрептавидин-связывающий пептид Xaa₁ представляет собой Trp, Lys или Arg; Xaa₂ представляет собой любую аминокислоту; Xaa₃ представляет собой Gly или Glu Xaa₄ представляет собой Gly, Lys или Arg
12	-Trp-Xaa₁-His-Pro-Gln-Phe-Xaa₂-Xaa₃-	Стрептавидин-связывающий пептид Xaa₁ представляет собой любую аминокислоту; Xaa₂ представляет собой Gly или Glu Xaa₃ представляет собой Gly, Lys или Arg
13	Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Xaa)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-	Последовательные модули стрептавидин-связывающего пептида Xaa представляет собой любую аминокислоту; n представляет собой 8 или 12
14	Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys	Последовательные модули стрептавидин-связывающего пептида n представляет собой 2 или 3
15	SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK	Twin-Strep-tag
16	SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK	Twin-Strep-tag
17	WSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK	Twin-Strep-tag
18	WSHPQFEKGGGSGGGSWSHPQFEK	Twin-Strep-tag
19	WSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK	Twin-Strep-tag
20	Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala	HA-метка
21	Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys	VSV-G-метка
22	Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp	HSV-метка
23	Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly	Эпитоп T7
24	Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp	Эпитоп HSV
25	Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu	Эпитоп Myc
26	Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr	V5-метка
27	EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEENAGYSTLVGHDTFTKVKPSAAS	Мутеин стрептавидина Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ и Glu¹¹⁷, Gly¹²⁰, Try¹²¹ (мутеин m1-9) Вид: Streptomyces avidinii
28	DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEENAGYSTLVGHDTFTKVKPSAAS	Мутеин стрептавидина Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ и Glu¹¹⁷, Gly¹²⁰, Try¹²¹ (мутеин m1-9) Вид: Streptomyces avidinii
29	AMQVQLKQSG PGLVQPSQSL SITCTVSGFS LTTFGVHWVR QSPGKGLEWL GVIWASGITD YNVPFMSRLS ITKDNSKSQV FFKLNSLQPD DTAIYYCAKN DPGTGFAYWG QGTLVTVSAG STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCGSAWSHPQ FEKGGGSGGG SGGSAWSHPQ FEK	Вариабельная тяжелая цепь Fab-фрагмента m13B8.2
30	AMDIQMTQSP ASLSASVGET VTFTCRASEM IYSYLAWYQQ KQGKSPQLLV HDAKTLAEGV PSRFSGGGSG TQFSLKINTL QPEDFGTYYC QAHYGNPPTF GGGTKLEIKR GIAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGECGS	Вариабельная легкая цепь Fab-фрагмента m13B8.2
31	Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser	Вариабельная тяжелая цепь антитела против CD3 OKT3
32	Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn	Вариабельная легкая цепь антитела против CD3 OKT3
33	Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val	Вариабельная тяжелая цепь антитела против CD28 CD28.3
34	Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg	Вариабельная легкая цепь антитела против CD28 CD28.3
35	His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys	MAT-метка
36	Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser	αCD16 антитело 3G8 VH
37	Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys	αCD16 антитело 3G8 VL
38	CRVLCCYVL	Антиген-специфический пептид
39	QYDPVAALF	Эпитоп pp65 из CMV (аминокислоты 341-350)
40	RPHERNGFTV	Эпитоп pp65 из CMV (аминокислоты 265-274)
41	CPYSGTAYNSL	Эпитоп гексона 5 аденовируса (аминокислоты 114-124)
42	Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys	HLA-A*2402
43	Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly His Asp Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Asp Lys Leu Glu Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys	HLA-B*0702
44	Met Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Cys Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Asp Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Gly Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Lys Tyr Lys Arg Gln Ala Gln Ala Asp Arg Val Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser His Thr Leu Gln Arg Met Ser Gly Cys Asp Leu Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Leu Glu Ala Ala Arg Ala Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Leu Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Met Gln His Glu Gly Leu Gln Glu Pro Leu Thr Leu Ser Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys	HLA-C*0702
45	Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met	β₂ микроглобулин
46	YTDIEMNRLGK	Метка VSV-G
47	WREPGRMELN	Метка из 10 аминокислот из коллаген-связывающего домена фактора фон Виллебранда
48	GGGS	Линкерный пептид
49	PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKAHHHHHHHHHH	Внеклеточный домен CD19 человека с His-меткой

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Juno Therapeutics GmbH

Lothar GERMEROTH

Christian STEMBERGER

Patricia GRAEF

<120> СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И НАБОРЫ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ НИХ

<130> 735042002740

<140> Не присвоено

<141> Параллельно с данной

<150> 62/245,249

<151> 2015-10-22

<160> 49

<170> FastSEQ для Windows версии 4.0

<210> 1

<211> 159

<212> Белок

<213> Streptomyces avidinii

<220>

<223> Стрептавидин

<300>

<308> UniProt No. P22629

<309> 1991-08-01

<400> 1

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 2

<211> 126

<212> Белок

<213> Streptomyces avidinii

<220>

<223> Минимальный стрептавидин

<400> 2

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser

20 25 30

Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 159

<212> Белок

<213> Streptomyces avidinii

<220>

<223> Мутеин стрептавидина Val44-Thr45-Ala46-Arg47

<400> 3

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 4

<211> 126

<212> Белок

<213> Streptomyces avidinii

<220>

<223> Мутеин стрептавидина Val44-Thr45-Ala46-Arg47

<400> 4

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 5

<211> 159

<212> Белок

<213> Streptomyces avidinii

<220>

<223> Мутеин стрептавидина Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

<400> 5

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 6

<211> 126

<212> Белок

<213> Streptomyces avidinii

<220>

<223> Мутеин стрептавидина Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

<400> 6

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Стрептавидин-связывающий пептид, Strep-tag

<400> 7

Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Strep-tag II

<400> 8

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 9

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Стрептавидин-связывающий пептид

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)...(3)

<223> Xaa представляет собой Gln, Asp или Met

<400> 9

His Pro Xaa

1

<210> 10

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Стрептавидин-связывающий пептид

<400> 10

His Pro Gln Phe

1

<210> 11

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Стрептавидин-связывающий пептид

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)...(1)

<223> Xaa представляет собой Trp, Lys или Arg

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)...(2)

<223> Xaa представляет собой любую аминокислоту

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)...(7)

<223> Xaa представляет собой Gly или Glu

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (8)...(8)

<223> Xaa представляет собой Gly, Lys или Arg

<400> 11

Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Стрептавидин-связывающий пептид

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)...(2)

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)...(7)

<223> Xaa представляет собой Gly или Glu

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (8)...(8)

<223> Xaa представляет собой Gly, Lys или Arg

<400> 12

Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 13

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательные модули стрептавидин-связывающего пептида

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (9)...(9)

<220>

<221> ПОВТОР

<222> (9)...(9)

<223> Повторяется 8 или 12 раз

<400> 13

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

1 5 10 15

Lys

<210> 14

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПОВТОР

<222> (9)...(12)

<223> Повторяется 2 или 3 раза

<400> 14

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro

1 5 10 15

Gln Phe Glu Lys

20

<210> 15

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 15

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 16

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 16

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 17

<211> 28

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 17

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 18

<211> 24

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 18

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20

<210> 19

<211> 28

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 19

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 20

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HA-tag

<400> 20

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 21

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VSV-G-метка

<400> 21

Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HSV-метка

<400> 22

Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп T7

<400> 23

Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп HSV

<400> 24

Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп Myc

<400> 25

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 26

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> V5-метка

<400> 26

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr

1 5 10

<210> 27

<211> 126

<212> Белок

<213> Streptomyces avidinii

<220>

<223> Мутеин стрептавидина Val44-Thr45-Ala46-Arg47 и

Glu117, Gly120, Try121 (мутеин m1-9)

<400> 27

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 28

<211> 139

<212> Белок

<213> Streptomyces avidinii

<220>

<223> Мутеин стрептавидина Val44-Thr45-Ala46-Arg47 и

Glu117, Gly120, Try121 (мутеин m1-9)

<400> 28

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

130 135

<210> 29

<211> 253

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная тяжелая цепь Fab-фрагмента m13B8.2

<400> 29

Ala Met Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr

20 25 30

Thr Phe Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Val Pro

50 55 60

Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val

65 70 75 80

Phe Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Lys Asn Asp Pro Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser

210 215 220

Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

245 250

<210> 30

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная легкая цепь Fab-фрагмента m13B8.2

<400> 30

Ala Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Glu Met Ile Tyr

20 25 30

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu

35 40 45

Leu Val His Asp Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Thr Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala His Tyr Gly Asn

85 90 95

Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ile

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser

210 215

<210> 31

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная тяжелая цепь антитела против CD3 OKT3

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная легкая цепь антитела против CD3 OKT3

<400> 32

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

100 105

<210> 33

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная тяжелая цепь антитела против CD28 CD28.3

<400> 33

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His

20 25 30

Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe

35 40 45

Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys

50 55 60

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu

65 70 75 80

Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg

85 90 95

Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val

115

<210> 34

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная легкая цепь антитела против CD28 CD28.3

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 35

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Метка MAT

<400> 35

His Asn His Arg His Lys His Gly Gly Gly Cys

1 5 10

<210> 36

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH антитела против CD16 3G8

<400> 36

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Gln Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL антитела против CD16 3G8

<400> 37

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> антиген-специфичный пептид

<400> 38

Cys Arg Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп pp65 из CMV (аминокислоты 341-350)

<400> 39

Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe

1 5

<210> 40

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп pp65 из CMV (аминокислоты 265-274)

<400> 40

Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val

1 5 10

<210> 41

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп гексона 5 аденовируса (аминокислоты 114-124)

<400> 41

Cys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu

1 5 10

<210> 42

<211> 314

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HLA-A*2402

<400> 42

Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro

1 5 10 15

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr

20 25 30

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro

35 40 45

Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu

50 55 60

Thr Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu

85 90 95

Gln Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg

100 105 110

Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys

115 120 125

Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr

130 135 140

Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly

165 170 175

Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His

180 185 190

His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp

210 215 220

Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly

225 230 235 240

Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr

260 265 270

Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro

275 280 285

Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

290 295 300

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

305 310

<210> 43

<211> 314

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HLA-B*0702

<400> 43

Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro

1 5 10 15

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr

20 25 30

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro

35 40 45

Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn

50 55 60

Thr Gln Ile Tyr Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg

65 70 75 80

Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu

85 90 95

Gln Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg

100 105 110

Gly His Asp Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn

115 120 125

Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr

130 135 140

Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly

165 170 175

Lys Asp Lys Leu Glu Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His

180 185 190

His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp

210 215 220

Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg

225 230 235 240

Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr

260 265 270

Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro

275 280 285

Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

290 295 300

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

305 310

<210> 44

<211> 321

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HLA-C*0702

<400> 44

Met Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Cys Ser His Ser Met Arg Tyr Phe

1 5 10 15

Asp Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser

20 25 30

Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala

35 40 45

Ala Ser Pro Arg Gly Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly

50 55 60

Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Lys Tyr Lys Arg Gln Ala Gln

65 70 75 80

Ala Asp Arg Val Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser

85 90 95

Glu Asp Gly Ser His Thr Leu Gln Arg Met Ser Gly Cys Asp Leu Gly

100 105 110

Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly

115 120 125

Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala

130 135 140

Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu

165 170 175

Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Glu Pro

180 185 190

Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Leu Ser Asp His Glu Ala Thr

195 200 205

Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr

210 215 220

Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu

225 230 235 240

Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val

245 250 255

Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Met Gln His Glu

260 265 270

Gly Leu Gln Glu Pro Leu Thr Leu Ser Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro

275 280 285

Thr Ile Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

305 310 315 320

Lys

<210> 45

<211> 100

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> B2 микроглобулин

<400> 45

Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala

1 5 10 15

Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His

20 25 30

Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu

35 40 45

Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr

50 55 60

Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala

65 70 75 80

Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp

85 90 95

Asp Arg Asp Met

100

<210> 46

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Метка VSV-G

<400> 46

Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

1 5 10

<210> 47

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Метка из 10 аминокислот из коллаген-связывающего домена фактора

фон Виллебранда

<400> 47

Trp Arg Glu Pro Gly Arg Met Glu Leu Asn

1 5 10

<210> 48

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерный пептид

<400> 48

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 49

<211> 283

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Внеклеточный домен CD19 человека с His-меткой

<400> 49

Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr

20 25 30

Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe

50 55 60

Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val

85 90 95

Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu

210 215 220

Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr

245 250 255

Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys

260 265 270

Ala His His His His His His His His His His

275 280

<---

Claims

1. Способ стимулирования Т-клеток, причем способ включает инкубацию композиции, содержащей Т-клетки, в присутствии первого стимулирующего средства и второго стимулирующего средства, каждый из которых обратимо связываются с растворимым реактивом, где:

по меньшей мере множество Т-клеток обратимо иммобилизуют на хроматографической матрице, содержащейся в хроматографической колонке, во время по меньшей мере части инкубации;

первое стимулирующее средство содержит (i) антитело против CD3 или фрагмент антитела и (ii) стрептавидин-связывающй пептид;

второе стимулирующее средство содержит (i) антитело против CD8 или фрагмент антитела и (ii) стрептавидин-связывающй пептид;

растворимый реагент содержит мутеин стрептавидина, который обратимо связывается со стрептавидин-связывающими пептидами первого и второго стимулирующих средств; и

инкубация вызывает стимуляцию Т-клеток и осуществляется в условиях, в соответствии с которыми (i) первое стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD3, экспрессируемой на поверхности Т-клеток, тем самым индуцируя первичный сигнал активации в Т-клетках, и (ii) второе стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD28, экспрессируемой на поверхности Т-клеток, тем самым индуцируя костимулирующий сигнал в Т-клетках.

2. Способ по п. 1, где по меньшей мере часть инкубации проводится в присутствии средства отбора, которое непосредственно или опосредованно иммобилизовано на хроматографической матрице;

где специфическое связывание с помощью средства отбора с селективным маркером, экспрессируемым по меньшей мере множеством Т-клеток, вызывает обратимую иммобилизацию указанного по меньшей мере множества Т-клеток на хроматографической матрице.

3. Способ по п. 2, где средство отбора связывают со вторым реактивом, который является иммобилизованным на хроматографической матрице, где средство отбора содержит партнера связывания, и второй реактив содержит множество сайтов связывания средства отбора, каждый способен к связыванию с партнером связывания.

4. Способ по п. 1, дополнительно включающий объединение:

(a) по меньшей мере множества Т-клеток;

(b) средства отбора, которое (i) специфически связывается с селективным маркером, экспрессируемым по меньшей мере множеством Т-клеток, и (ii) является иммобилизованным непосредственно или опосредованно на хроматографической матрице; и

(c) хроматографической матрицы;

в соответствии с чем одну или несколько Т-клеток из по меньшей мере множества иммобилизуют на хроматографической матрице через средство отбора.

5. Способ по п. 4, в котором

указанную инкубацию инициируют перед указанным объединением.

6. Способ по п. 4, где указанную инкубацию инициируют после указанного объединения.

7. Способ по любому из пп. 4-6, в котором указанное объединение осуществляют во время по меньшей мере части указанной инкубации.

8. Способ по любому из пп. 4-7, где иммобилизация средства отбора с хроматографической матрицей является опосредованной и происходит через связывание средства отбора со вторым реактивом, который иммобилизуют на хроматографической матрице, где средство отбора содержит партнер связывания, и второй реактив содержит множество сайтов связывания средства отбора, каждый способен к связыванию с партнером связывания.

9. Способ по п. 8, в котором второй реактив и средство отбора связывают вместе в комплекс во время указанного объединения, где объединение осуществляют посредством объединения клеток с комплексом.

10. Способ по п. 8, в котором второй реактив и средство отбора не находятся в комплексе во время указанного объединения, где объединение осуществляют посредством отдельного добавления клеток и средства отбора.

11. Способ стимуляции Т-клеток, который включает:

(1) объединение (a) композиции, содержащей Т-клетки, (b) средства отбора, которое (i) специфически связывается с селективным маркером, экспрессируемым по меньшей мере множеством Т-клеток, и (ii) является непосредственно или опосредованно иммобилизованным на хроматографической матрице, содержащейся в хроматографической колонке, и (c) хроматографической матрицы, в соответствии с чем одну или несколько Т-клеток из по меньшей мере множества Т-клеток обратимо иммобилизуют на хроматографической матрице через специфическое связывание средства отбора с селективным маркером; и

(2) инкубацию по меньшей мере множества иммобилизованных Т-клеток в присутствии первого стимулирующего средства и второго стимулирующего средства, каждый из которых обратимо связан с растворимым реактивом, где:

инкубация вызывает стимуляцию по меньшей мере множества иммобилизованных Т-клеток и осуществляется в условиях, в соответствии с которыми (a) первое стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD3, экспрессируемой на поверхности по меньшей мере множества иммобилизованных Т-клеток, тем самым индуцируя первичный сигнал активации в по меньшей мере множестве иммобилизованных Т-клеток, и (b) второе стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD28, экспрессируемой на поверхности по меньшей мере множества иммобилизованных Т-клеток, тем самым индуцируя костимулирующий сигнал в по меньшей мере множестве иммобилизованных Т-клеток.

12. Способ по любому из пп. 4-11, который дополнительно включает, после указанного объединения, отделение и/или удаление других клеток композиции от иммобилизованных Т-клеток.

13. Способ по п. 12, в котором указанное отделение и/или указанную стадию промывания осуществляют перед инициацией указанной инкубации.

14. Способ по любому из пп. 2-13, где иммобилизация средства отбора на хроматографической матрице является обратимой.

15. Способ по любому из пп. 11-14, в котором средство отбора связывают со вторым реактивом, который является иммобилизованным на хроматографической матрице, где средство отбора содержит партнер связывания, и второй реактив содержит множество сайтов связывания средства отбора, каждый из которых способен обратимо связываться с партнером связывания.

16. Способ по любому из пп. 3, 8-10 и 12-15, где средство отбора обратимо связывают со вторым реактивом.

17. Способ по любому из пп. 3, 8-10 и 12-16, в котором:

партнер связывания средства отбора содержит биотин, аналог биотина или стрептавидин-связывающй пептид; и

второй реактив содержит стрептавидин или мутеин стрептавидина, который связывается с биотином, аналогом биотина или со стрептавидин-связывающим пептидом средства отбора.

18. Способ по п. 17, где стрептавидин или мутеин стрептавидина обратимо связываются с биотином, аналогом биотина или стрептавидин-связывающим пептидом средства отбора.

19. Способ по любому из пп. 2-18,

в котором

средство отбора специфически связывается с селективным маркером одновалентным образом.

20. Способ по любому из пп. 2-19, в котором константа диссоциации (K_D) для связывания между средством отбора и селективным маркером имеет значение в диапазоне от приблизительно 10⁻³ до приблизительно 10⁻⁷ M.

21. Способ по любому из пп. 2-20, в котором средство отбора представляет собой или содержит средство, выбранное из группы, состоящей из антител, фрагментов антител, белковых связывающих молекул с иммуноглобулиноподобными функциями, молекул, содержащих домены Ig, цитокинов, хемокинов, аптамеров, молекул MHC, комплексов MHC-пептид, лигандов рецепторов и связывающих фрагментов любого из указанных.

22. Способ по любому из пп. 2-21, где средство отбора содержит антитело или фрагмент антитела.

23. Способ по любому из пп. 2-22, где средство отбора содержит фрагмент антитела.

24. Способ по п. 23, где:

фрагмент антитела представляет собой двухвалентный фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из (Fab)₂'-фрагментов и двухвалентных одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов; или

средство отбора представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из Fab-фрагментов, Fv-фрагментов и scFv.

25. Способ по п. 23, где фрагмент антитела представляет собой Fab.

26. Способ по любому из пп. 2-21, где средство отбора содержит белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, выбранную из группы, состоящей из аптамеров, мутеинов, основанных на полипептиде семейства липокалина, глутел, белков, основанных на анкириновом каркасе, белков, основанных на кристаллиновом каркасе, аднектинов и авимеров.

27. Способ по любому из пп. 2-26, в котором

селективный маркер представляет собой элемент комплекса антигенного рецептора T-клетки.

28. Способ по любому из пп. 2-27, где селективный маркер представляет собой корецептор Т-клетки.

29. Способ по любому из пп. 2-28, где селективный маркер представляет собой CD3, CD4 или CD8.

30. Способ по любому из пп. 2-29, где селективный маркер представляет собой ζ-цепь CD3.

31. Способ по любому из пп. 2-30, где специфическое связывание между средством отбора и селективным маркером не индуцирует стимуляторный или активирующий или пролиферативный сигнал в Т-клетках.

32. Способ по любому одному из пп. 1-31, где

первое стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD3 одновалентным образом.

33. Способ по любому из пп. 1-32, в котором константа диссоциации (K_D) для связывания между первым стимулирующим средством и молекулой CD3 имеет значение в диапазоне от приблизительно 10⁻³ до приблизительно 10⁻⁷ M.

34. Способ по любому из пп. 1-33, где первое стимулирующее средство содержит фрагмент антитела.

35. Способ по п. 34, где:

36. Способ по п. 34, где фрагмент антитела представляет собой Fab.

37. Способ по любому из пп. 1-36, в котором

второе стимулирующее средство специфически связывается с молекулой CD28 одновалентным образом.

38. Способ по любому из пп. 1-37, в котором константа диссоциации (K_D) для связывания между вторым стимулирующим средством и молекулой CD28 имеет значение в диапазоне от приблизительно 10⁻³ до приблизительно 10⁻⁷ M.

39. Способ по любому из пп. 1-38, где второе стимулирующее средство содержит фрагмент антитела.

40. Способ по п. 39, где:

41. Способ по п. 39, где фрагмент антитела представляет собой Fab.

42. Способ по любому из пп. 1-41, где первое стимулирующее средство содержит Fab-фрагмент против CD3, и второе стимулирующее средство содержит Fab-фрагмент против CD8.

43. Способ по любому из пп. 1-42, в котором константа диссоциации (K_D) для обратимого связывания между первым стимулирующим средством и/или вторым стимулирующим средством и растворимым реактивом имеет значение в диапазоне от 10⁻² до приблизительно 10⁻¹³ M.

44. Способ по любому из пп. 1-43, в котором обратимое связывание между первым стимулирующим средством и растворимым реактивом и/или обратимое связыванием между вторым стимулирующим средством и растворимым реактивом можно разрушать посредством добавления вещества к Т-клеткам.

45. Способ по п. 44, в котором вещество содержит конкурентное средство.

46. Способ по п. 44 или 45, в котором вещество не является вредоносным для Т-клеток или для большинства Т-клеток; и/или в котором добавление вещества к Т-клеткам в количестве, достаточном для того, чтобы вызывать указанное разрушение, не снижает процентную долю выживающих Т-клеток до меньше чем или приблизительно 90%, 80%, 70%, 60% или 50% в сравнимых или тех же условиях без вещества.

47. Способ по любому из пп. 44-46, в котором

вещество содержит биотин, аналог биотина или стрептавидин-связывающий пептид.

48. Способ по любому из пп. 44-47, в котором вещество содержит D-биотин.

49. Способ по любому из пп. 1-48, в котором Т-клетки содержат антиген-специфическую T-клетку или ее популяцию, T-хелперную клетку или ее популяцию, цитотоксическую T-клетку или ее популяцию, T-клетку памяти или ее популяцию, или регуляторную T-клетку или ее популяцию.

50. Способ по любому из пп. 1-49, где инкубация увеличивает пролиферацию, экспрессию цитокинов, цитотоксическую активность или одну или более других функциональных активностей Т-клеток; и/или

инкубация изменяет дифференцировку Т-клеток.

51. Способ по любому из пп. 1-50, в котором инкубация увеличивает экспрессию одного или более цитокинов в Т-клетках, где один или более цитокинов выбирают из IL-2, IFN-γ и IL-4.

52. Способ по любому из пп. 1-51, в котором растворимый реактив является гибким, не содержит металлическую или магнитную сердцевину, полностью или в первую очередь состоит из органического мультимера, не является сферическим, не является по существу сферическим или однородным по геометрической форме и/или не является жестким.

53. Способ по любому из пп. 1-52, в котором растворимый реактив содержит олигомер или полимер мутеина стрептавидина.

54. Способ по п. 53, в котором олигомер или полимер сшивают с помощью полисахарида или бифункционального линкера.

55. Способ по п. 53 или 54, в котором олигомер или полимер содержит три или более тетрамеров мутеина стрептавидина.

56. Способ по любому из пп. 1-55, в котором

стрептавидин-связывающий пептид первого стимулирующего средства и/или второго стимулирующего средства содержит аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 7, 8 и 15-19.

57. Способ по любому из пп. 1-56, в котором

мутеин стрептавидина содержит аминокислотную последовательность Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ или lle⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.

58. Способ по любому из пп. 1-57, где мутеин стрептавидина содержит последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 3-6, 27 и 28.

59. Способ по любому из пп. 1-58, в котором мутеин стрептавидина содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6.

60. Способ по любому из пп. 1-59, который дополнительно включает

разрушение связывания между первым стимулирующим средством и растворимым реактивом и/или между вторым стимулирующим средством и растворимым реактивом.

61. Способ по п. 60, в котором указанное разрушение инициируют после инициации указанной инкубации.

62. Способ по п. 60 или 61, в котором указанное разрушение осуществляют посредством введения вещества, которое разрушает взаимодействие между первым стимулирующим средством и/или вторым стимулирующим средством и растворимым реактивом.

63. Способ по п. 62, где вещество содержит биотин, аналог биотина или стрептавидин-связывающий биотин.

64. Способ по п. 62 или 63, где вещество содержит биотин.

65. Способ по любому из пп. 60-64, в котором указанное разрушение вызывает

завершение или уменьшение стимуляции, активации или размножения Т-клеток.

66. Способ по любому из пп. 1-65, который дополнительно включает, перед указанной инкубацией, размножение Т-клеток, содержащихся в популяции Т-клеток, или где Т-клетки, содержащиеся в популяции Т-клеток, размножены in vitro перед указанной инкубацией.

67. Способ по любому одному из пп. 1-66, где способ дополнительно включает замену среды или добавление вещества по меньшей мере один раз во время указанной инкубации.

68. Способ по любому одному из пп. 1-67, который дополнительно включает повторение одной или нескольких стадий способа итеративным образом, в соответствии с чем Т-клетки одной или нескольких популяций последовательно выделяют и размножают по меньшей мере в двух циклах.

69. Способ по п. 68, где способ включает приведение в контакт Т-клеток в популяции с по меньшей мере двумя различными средствами отбора, в каждой из двух различных стадий приведения в контакт, соответственно, которые специфически связываются с двумя различными селективными маркерами, в котором по меньшей мере часть указанной инкубации осуществляют между приведением в контакт с двумя различными средствами отбора.

70. Способ по любому из пп. 1-69, который дополнительно включает введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты в Т-клетки композиции, эта нуклеиновая кислота кодирует рекомбинантный белок, в соответствии с чем Т-клетки экспрессируют рекомбинантный белок.

71. Способ по п. 70, в котором указанное введение осуществляют после или во время указанной инкубации.

72. Способ по п. 70 или 71, где указанное введение осуществляют, пока Т-клетки иммобилизованы на хроматографической матрице.

73. Способ по любому из пп. 1-72, в котором Т-клетки, во время по меньшей мере части инкубации, экспрессируют рекомбинантный белок, введенный ex vivo.

74. Способ по любому из пп. 70-73, в котором введение нуклеиновой кислоты осуществляют между множеством из по меньшей мере двух стадий приведения в контакт.

75. Способ по любому из пп. 70-74, в котором одно из по меньшей мере двух средств отбора специфически связывается с рекомбинантным белком.

76. Способ по любому из пп. 1-75, в котором после указанной инкубации способ дополнительно включает перенос Т-клеток композиции в другое окружение, указанное окружение подходит для клеточной культуры или размножения.

77. Способ по п. 73, в котором Т-клетки, переносимые таким образом, переносят в закрытой системе или закрытом контейнере в другое окружение; или перенос включает удаление Т-клеток, переносимых таким образом, из первого контейнера и перенос Т-клеток во второй контейнер

78. Способ по п. 76 или 77, в котором другое окружение находится в инкубаторе.

79. Способ по любому из пп. 76-78, в котором указанный перенос осуществляют в закрытой системе, где указанный перенос включает перенос стерильно закупоренного контейнера, содержащего Т-клетки, в стерильное окружение или в другое окружение внутри закупоренного контейнера, и/или указанный перенос осуществляют в стерильном окружении или в стерильных условиях.

80. Способ по любому из пп. 76-79, который дополнительно включает, после переноса, открепление Т-клеток от хроматографической матрицы посредством разрушения указанного обратимого связывания и удаления указанных клеток из присутствия хроматографической матрице.

81. Способ по п. 80, который дополнительно включает размножение указанных удаленных Т-клеток.

82. Способ по любому из пп. 1-81, в котором pH, pO₂, pCO₂ и/или температурой управляют во время по меньшей мере части указанной инкубации.

83. Способ по п. 82, где pH, pO₂, pCO₂ и/или температурой управляют автоматизированным образом.

84. Способ по любому из пп. 76-83, где питательные вещества подают к Т-клеткам, при этом они находятся в окружении, подходящем для размножения.