CN110770348B - 嵌合抗原受体细胞的制备及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述的实施方案涉及包含基因修饰的CAR细胞的组合物及其用于治疗癌症的用途。本公开的一些实施方案涉及用于T细胞应答增强和/或CAR细胞制备的组合物和方法。例如，方法可包括获得包含CAR的细胞，并在所述CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养所述细胞。

Description

嵌合抗原受体细胞的制备及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年3月8日提交的美国临时专利申请号62/640,523，标题为“淋巴细胞系及其用途”、于2017年12月13日提交的美国临时专利申请号62/598,024，标题为“嵌合抗原受体细胞的制备及其用途”、于2017年6月30日提交的美国临时专利申请号62/527,649，标题为“嵌合抗原受体细胞的制备及其用途”、于2017年6月30日提交的美国临时专利申请号62/527,140，标题为“修饰的淋巴细胞系及其用途”以及于2017年6月1日提交的美国临时专利申请号62/513,781，标题为“淋巴细胞系及其用途”的权益，这些临时专利申请特此以引用的方式整体并入。
序列表信息
2018年5月3日左右创建的标题为嵌合抗原受体细胞的制备及其用途的计算机可读文本文件“I071-0029US Sequence Listing.txt”，文件大小为约24.5KB，包含本申请的序列表，并且特此以引用的方式整体并入。
技术领域
本公开涉及修饰的细胞，具体地说，涉及包含修饰的细胞的组合物及其用于治疗疾病和病状的用途。
背景技术
超过25年前，科学家开发了用于在T细胞上表达的嵌合抗原受体(CAR)。嵌合抗原受体(CAR)技术将特定抗体的抗原识别结构域与T细胞受体(TCR)的细胞内结构域结合在一起。经CAR基因修饰以靶向某些恶性肿瘤的T细胞已显示出良好的临床效果。在CAR T细胞疗法期间，医生会抽取患者的血液并收获其细胞毒性T细胞。然后在实验室中对细胞进行再工程化，所以他们可以知悉如何攻击每个患者的特定癌症。通常在CAR T细胞疗法之前或CART细胞疗法期间对患者进行化疗，以清除掉他们现有的一些免疫细胞。但是，化疗可导致患者的T细胞明显减少。尽管大多数患者将在9个月内康复并且其免疫细胞将达到化疗前的水平，但一些患者可能无法产生足够的T细胞用于持续的CAR T细胞疗法。这使这些患者的生命处于危险之中。此外，对于CAR T疗法，患者体内CAR T细胞的长期维持对于肿瘤治疗中患者的预后很重要。例如，如果可以维持CAR T细胞的长期存在，则该技术可以有效减少肿瘤复发。
发明内容
本文描述的实施方案涉及包含基因修饰的CAR细胞的组合物及其用于治疗疾病和病状的用途。
本公开的一些实施方案涉及一种方法，所述方法包括：提供细胞；将编码CAR的核酸序列和编码hTERT、SV40LT或其组合的核酸序列引入细胞中；并且在由CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养细胞，从而产生修饰的CAR细胞。
在一些实施方案中，编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的整合包括编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的基因组整合和hTERT、SV40LT或其组合的组成型表达。在一些实施方案中，hTERT、SV40LT或其组合的表达由诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，所述方法可还包括将编码自杀基因的核酸序列引入细胞中，并以允许自杀基因表达的方式将包含自杀基因的CAR细胞和编码CAR的核酸与核苷类似物一起培养，以使核苷类似物具有细胞毒性。在一些实施方案中，细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域包括选自由以下组成的组的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。
在一些实施方案中，所述试剂是结合CAR的细胞外组分并介导细胞应答的调节化合物、结合CAR的细胞外结构域的配体、CAR的细胞外结构域结合的抗原或CAR的细胞外结构域结合的抗原的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌症抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌症/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。
在一些实施方案中，所述试剂是结合CAR的细胞外结构域的抗体。在一些实施方案中，抗体是人IgG抗体和/或结合人IgG的Fab片段。在一些实施方案中，调节化合物包括CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4的至少一种的细胞外结构域。在一些实施方案中，调节化合物包含氨基酸序列：SEQ ID:41-47的至少一种。在一些实施方案中，调节化合物结合氨基酸序列：SEQ ID:21和48-53的至少一种。在一些实施方案中，CAR细胞包含SEQ ID No:38、35、39和40的至少一种。
在一些实施方案中，与不存在试剂的情况下培养的CAR细胞相比，在存在试剂的情况下培养的CAR细胞表现出细胞生长增加约1.5至2倍。在一些实施方案中，与不存在试剂的情况下培养的CAR细胞相比，在存在试剂的情况下培养的CAR细胞表现出细胞生长增加约1.5至3倍。在一些实施方案中，与不存在试剂的情况下培养的CAR细胞相比，在存在试剂的情况下培养的CAR细胞表现出细胞生长增加约2倍。在一些实施方案中，培养基中CAR细胞的细胞密度是至少约25×104个细胞/mL细胞培养基。在一些实施方案中，培养基中CAR细胞的细胞密度是小于约200×104个细胞/mL细胞培养基。在一些实施方案中，培养基中CAR细胞的细胞密度是在约50×104至约200×104个细胞/mL细胞培养基之间。在一些实施方案中，培养基中CAR细胞的细胞密度是在约50×104至约100×104个细胞/mL细胞培养基之间。
在一些实施方案中，CAR细胞对来自细胞培养基的四环素敏感。在一些实施方案中，CAR细胞包含编码反向四环素反式活化因子(rtTA)的第三核酸序列。在一些实施方案中，hTERT或SV40LT的表达由rtTA调节，使得hTERT或SV40LT在四环素存在下表达。在一些实施方案中，细胞培养基中四环素的浓度是不小于约2μg/ml。在一些实施方案中，四环素选自由以下组成的组：四环素、地美环素、甲氯环素、多西环素、赖甲环素、美他环素、米诺环素、土霉素、罗利环素和金霉素。在一些实施方案中，四环素是多西环素。
在一些实施方案中，CAR细胞包含编码自杀基因的第四核酸序列，使得当CAR细胞在核苷类似物存在下以允许自杀基因表达的方式培养时，使核苷类似物对CAR细胞具有细胞毒性。在一些实施方案中，自杀基因选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒的胸苷激酶、水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶和细菌胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方案中，自杀基因是单纯疱疹病毒的胸苷激酶。在一些实施方案中，核苷类似物选自由以下组成的组：更昔洛韦、阿昔洛韦、比昔洛韦、泛昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、三氟胸苷、1-[2-脱氧,2-氟,β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶、阿糖腺苷(ara-A)、阿糖胸苷(araT)1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶、5-乙基-2'-脱氧尿苷、5-碘-5'-氨基-2,5'-二脱氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脱氧胞苷和AraC。在一些实施方案中，核苷类似物是更昔洛韦。
一些实施方案涉及一种使用本文描述的方法获得的分离的细胞。一些实施方案涉及一种包含分离的细胞群的组合物。一些实施方案涉及一种在受试者中增强T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法，所述方法包括：施用有效量的本文描述的组合物。
一些实施方案涉及一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合，其中编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的整合包括编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的基因组整合和hTERT、SV40LT或其组合的组成型表达。
在一些实施方案中，修饰的细胞是T细胞，并且还包含编码CAR的核酸序列，并且修饰的细胞能够抑制细胞表达CAR识别的抗原。在一些实施方案中，编码CAR的核酸和编码hTERT的核酸、编码SV40LT的核酸或其组合被表达为分开的多肽的基因产物。
在一些实施方案中，编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的表达由诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统，其增加或激活SV40LT基因或hTERT基因或其组合的表达。在一些实施方案中，修饰的细胞包含编码自杀基因的核酸序列。在一些实施方案中，修饰的细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，自杀基因是HSV-TK系统。在一些实施方案中，修饰的细胞是增殖性T细胞。在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且细胞外结构域结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿型AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1或TEM8。在一些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域包括选自由以下组成的组的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。在一些实施方案中，细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，T细胞的TCR基因被破坏，使得内源TCR的表达降低。在一些实施方案中，与TCR基因相关的靶向载体被整合到T细胞的基因组中，使得内源TCR的表达消除。在一些实施方案中，T细胞的CD4基因被破坏，使得内源CD4的表达降低。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合HIV表面上的分子。在一些实施方案中，hTERT具有SEQ ID NO:6的序列，并且SV40LT具有SEQ ID NO:7的序列。
一些实施方案涉及一种生成CAR T细胞的方法，所述方法包括：通过将一个或多个核酸序列转移至T细胞以获得增殖性T细胞来增殖T细胞；并且将编码CAR的核酸序列引入增殖的T细胞中以获得CAR T细胞，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
在一些实施方案中，增殖的T细胞是本文描述的任何修饰的T细胞。在一些实施方案中，一个或多个核酸序列包含Tet诱导型HPV16-E6/E7表达系统。在一些实施方案中，T细胞是从受试者提取的原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞是与响应于T细胞输注的相应野生型T细胞相比具有降低的免疫原性的T细胞。一些实施方案涉及一种治疗疾病或病状的方法，所述方法包括：向人类患者施用包含本文描述的修饰的细胞的药物组合物。在一些实施方案中，疾病或病状是AIDS，并且药物组合物包含细胞，所述细胞包括具有结合HIV表面上的分子的抗原结合结构域的CAR。在一些实施方案中，疾病或病状是癌症，并且药物组合物包含修饰的细胞，所述修饰的细胞包括CAR，其中CAR的抗原结合结构域结合癌细胞上的分子，并且细胞上的内源TCR数减少。在一些实施方案中，编码CAR的核酸被整合到T细胞的基因组中。
一些实施方案涉及一种CAR T细胞，所述CAR T细胞包含：编码CAR的核酸序列，所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域和共刺激分子的信号传导结构域，其中T细胞的TCR基因被破坏，使得TCR的表达降低或消除。在一些实施方案中，CAR T细胞包括本文描述的修饰的T细胞。
一些实施方案涉及一种CAR T细胞，所述CAR T细胞包含：编码CAR的核酸序列，所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域和共刺激分子的信号传导结构域，其中T细胞的CD4基因被破坏，使得内源CD4的表达降低。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合HIV表面上的分子。在一些实施方案中，CAR-T细胞包括本文描述的修饰的T细胞。
一些实施方案涉及一种产生条件增殖性T细胞的方法，所述方法包括：将一个或多个核酸序列转移至T细胞以获得增殖性T细胞，其中一个或多个核酸序列编码肽，使得肽的表达引起T细胞变成增殖性的T细胞，并且所述肽由诱导型表达系统、诱导型自杀系统或其组合调节。在一些实施方案中，肽是hTERT、SV40LT或其组合。在一些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA-TRE系统。在一些实施方案中，诱导型自杀系统是HSV-TK系统或诱导型半胱天冬蛋白酶-9系统。
一些实施方案涉及一种治疗疾病或病状的方法，所述方法包括：使用本文描述的方法制备条件增殖性T细胞；用含有四环素或多西环素的培养基培养条件增殖性T细胞；用不含任何四环素或多西环素的培养基培养条件增殖性T细胞；获得其SV40LT基因或hTERT基因的表达降低的T细胞；并向有需要的受试者施用包含所述T细胞的药物组合物。
一些实施方案涉及一种药物组合物，其包含使用本文描述的方法获得的增殖性T细胞，以用于治疗疾病或病状，所述药物组合物用于治疗疾病或病状的方法包括：使用本文描述的方法制备条件增殖性T细胞；用含有四环素或多西环素的培养基培养条件增殖性T细胞；用不含四环素或多西环素的培养基培养条件增殖性T细胞；获得其SV40LT基因或hTERT基因的表达降低的T细胞；并向受试者施用包含所述T细胞的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法可还包括向响应于某些预定条件的受试者施用更昔洛韦。
一些实施方案涉及一种包含修饰的细胞的T细胞群，其中与修饰的细胞的TCR基因的生物合成或运输途径相关的内源基因被破坏，使得内源TCR的表达降低。
一些实施方案涉及一种包含修饰的细胞的T细胞群，其中与修饰的细胞的PD-1基因的生物合成或运输途径相关的内源基因被破坏，使得PD-1基因的表达降低。在一些实施方案中，修饰的细胞包含编码截短的PD-1的核酸序列，所述截短的PD-1降低了编程性死亡配体1(PD-L1)对人T细胞的抑制作用。
一些实施方案涉及一种方法，所述方法包括：提供包含CAR的细胞，并且在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养细胞以获得CAR细胞。
一些实施方案涉及一种用于体外CAR细胞制备的方法，所述方法包括：提供细胞；将编码CAR的核酸序列引入细胞中以获得CAR细胞；并且在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养CAR细胞以获得CAR细胞。
一些实施方案涉及一种用于富集表达CAR的细胞的方法，所述方法包括：提供细胞；将编码CAR的核酸序列引入细胞中以获得表达CAR的细胞(CAR细胞)和不表达CAR的细胞；并且在结合CAR的细胞外结构域的试剂存在下培养CAR细胞以富集表达CAR的细胞。
一些实施方案涉及一种用于体外CAR细胞制备的方法，所述方法按以下顺序包括以下步骤：(a)将编码CAR的核酸序列引入细胞中以获得CAR细胞；(b)使用第一培养基将CAR细胞培养预定时间；以及(c)使用第二培养基培养CAR细胞，其中第一培养基不包含试剂，第二培养基包含试剂，并且所述试剂结合CAR的细胞外结构域。
在一些实施方案中，所述试剂是结合CAR的细胞外结构域并且介导细胞应答的调节化合物。在一些实施方案中，调节化合物是CAR的细胞外结构域的配体或CAR的细胞外结构域结合的抗原。在一些实施方案中，所述试剂是CAR的细胞外结构域结合的抗原的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌症抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌症/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。在一些实施方案中，调节化合物是结合CAR的细胞外结构域的抗体。在一些实施方案中，抗体是人IgG抗体和/或结合人IgG的Fab片段。在一些实施方案中，调节化合物包括CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4的至少一种的细胞外结构域。在一些实施方案中，调节化合物包含氨基酸序列：SEQ ID:41-47和61-63的至少一种。在一些实施方案中，调节化合物结合氨基酸序列：SEQ ID:55、21、48、49、40、51-53和56-60的至少一种。在一些实施方案中，调节化合物包括GCC、B7-H4、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Rα、her-2、CD19、CD20、CD22、CD123、NY-ES0-1、HIV-IGag、Lewis Y、Mart-I、gplOO、酪氨酸酶、WT-I、h TERI、MUC16、间皮素、MIC-A、MIC-B、雌激素、黄体酮、RON、或ULBP/RAETl家族的一个或多个成员的至少一种。
在一些实施方案中，CAR的共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-L ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-I(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的至少一种。在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域和共刺激分子的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞是NK细胞或T细胞、或其组合。在一些实施方案中，调节化合物是由真核系统或细菌表达系统生成的可溶性抗原。
在一些实施方案中，在用试剂培养CAR细胞之后，试剂的量与CAR细胞的数量之比为1:50至1:5(μg/104个细胞)、1:500至1:5(μg/104个细胞)、或1:5000至10:5(μg/104个细胞)。在一些实施方案中，培养细胞包括使用包含抗CD3珠、抗CD28珠和IL2的至少一种的培养基培养细胞。在一些实施方案中，在用试剂培养CAR细胞之后，试剂的量与CAR细胞的数量之比为1:50至1:5(μg/104个细胞)。在一些实施方案中，在试剂存在下培养的CAR细胞上CAR的拷贝数大于当不具有试剂的情况下培养CAR细胞时的数目。在一些实施方案中，当在试剂存在下培养时表达CAR的细胞数与不表达CAR的细胞数之比大于当不具有试剂的情况下培养细胞时的比率。在一些实施方案中，在试剂存在下培养CAR细胞包括：在试剂存在下培养CAR细胞预定时间段，或在试剂存在下培养CAR细胞至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。在一些实施方案中，预定时间段是从7-100天。在一些实施方案中，当在试剂存在下培养时，产生记忆T细胞表型的CAR细胞数大于当不具有试剂的情况下培养CAR细胞时的数目。在一些实施方案中，当在试剂存在下培养时，由CAR细胞产生的细胞因子的量大于当不具有试剂的情况下培养CAR细胞时由CAR细胞产生的细胞因子的量。
在一些实施方案中，CAR细胞衍生自健康供体，并且具有内源TCR基因和/或HLA I的降低表达。在一些实施方案中，CAR细胞衍生自健康供体且与分离自同一人类供体的原代人T细胞引发的GVHD应答相比，在人类受体中不引发移植物抗宿主疾病(GVHD)应答或引发降低的GVHD应答，并且内源TCR基因和/或HLA I的表达没有降低，或内源TCR基因和/或HLAI的表达没有被破坏，并且内源TCR基因和/或HLA I被正常表达。在一些实施方案中，CAR T细胞是包含编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的T细胞。
在一些实施方案中，CAR细胞包含编码hTERT的核酸序列和编码SV40LT的核酸。在一些实施方案中，hTERT的表达由诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，SV40LT基因的表达由诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA TRE，其增加或激活SV40LT基因、hTERT基因或其组合的表达。在一些实施方案中，CAR细胞包含编码自杀基因的核酸序列。在一些实施方案中，自杀基因是HSV-TK系统。
一些实施方案涉及一种通过上述方法获得的分离的细胞。
一些实施方案涉及一种药物组合物，其包含通过上述方法获得的分离的细胞。
一些实施方案涉及一种用于在受试者中刺激抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的药物组合物。一些实施方案涉及一种药物组合物，以用于治疗癌症，所述药物组合物用于治疗癌症的方法包括向有需要的受试者施用有效量的药物组合物。在一些实施方案中，CAR的间隔域包含SEQ ID NO.:68或69的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含SEQ ID NO.:72或75的氨基酸序列，并且CAR的间隔域包含SEQ ID NO.:68的氨基酸序列。
一些实施方案涉及一种方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用有效量的包含CAR的T细胞，以提供T细胞应答；并且施用有效量的表达可溶性试剂的呈递细胞，所述可溶性试剂为CAR的细胞外结构域可识别的。
一些实施方案涉及一种在受试者中增强T细胞应答的方法，所述方法包括：向受试者施用有效量的包含CAR的T细胞以提供T细胞应答；并且施用有效量的表达可溶性试剂的呈递细胞以增强受试者中的T细胞应答，所述可溶性试剂为CAR的细胞外结构域可识别的。在一些实施方案中，增强受试者中的T细胞应答包括选择性增强包含CAR的T细胞的增殖。
一些实施方案涉及一种使用CAR细胞增强对受试者病状的治疗的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用表达试剂的细胞群和CAR细胞群。在其他实施方案中，所述方法包括向受试者施用衍生自试剂的疫苗和CAR细胞群。CAR细胞包含编码CAR的核酸序列，并且CAR的细胞外结构域识别所述试剂。
一些实施方案涉及一种在患有疾病的受试者中增强CAR细胞增殖的方法。所述方法包括：制备包含CAR的细胞；向受试者施用有效量的CAR细胞；将编码试剂的核酸序列引入细胞中以获得修饰的细胞，所述试剂是CAR的细胞外结构域可识别的，并向受试者施用有效量的修饰的细胞。
在一些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域的配体。在一些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域结合的抗原，并且试剂包括以下的至少一种的细胞外结构域：表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌症抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌症/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4。在一些实施方案中，试剂包含氨基酸序列：SEQID:41-47和61-63的至少一种。在一些实施方案中，试剂结合氨基酸序列：SEQ ID:55、21、48、49、40、51-53和56-60的至少一种。在一些实施方案中，试剂包括GCC、B7-H4、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Rα、her-2、CD19、CD20、CD22、CD123、NY-ES0-1、HIV-IGag、Lewis Y、Mart-I、gplOO、酪氨酸酶、WT-I、h TERI、MUC16、间皮素、MIC-A、MIC-B、雌激素、黄体酮、RON、或ULBP/RAETl家族的一个或多个成员的至少一种。在一些实施方案中，CAR的共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-L ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-I(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的至少一种。在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域和共刺激分子的信号传导结构域。在一些实施方案中，试剂由细胞表达，并且试剂的表达由诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，将CAR细胞与表达试剂的细胞一起培养，并且试剂由所述细胞表达，并且试剂的表达由诱导型自杀基因表达系统调节。在一些实施方案中，所述细胞是与野生型细胞相比对同种异体CAR疗法具有降低的免疫原性的修饰细胞。在一些实施方案中，试剂是可溶性抗原，使得抗原由表达试剂的细胞释放。在一些实施方案中，表达试剂的细胞被减毒为存活的且复制缺陷的。在一些实施方案中，通过γ辐照或化学灭活，表达试剂的细胞被减毒为存活的且复制缺陷的。在一些实施方案中，表达试剂的细胞或分离的修饰细胞获自受试者的外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，表达试剂的细胞是受试者的T细胞。在一些实施方案中，表达试剂的细胞是配制为疫苗的T细胞。在一些实施方案中，表达试剂的细胞是减毒的肿瘤细胞。在一些实施方案中，CAR的间隔域包含SEQ IDNO.:68或69的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR的跨膜结构域包含SEQ ID NO.:72或75的氨基酸序列，并且CAR的间隔域包含SEQ ID NO.:68的氨基酸序列。
一些实施方案涉及一种编码CAR的分离的核酸序列，所述CAR包含细胞外结构域、间隔域、跨膜结构域和细胞内结构域。CAR的细胞外结构域结合肿瘤抗原，并且间隔域包含SEQ ID NO.:67或68的氨基酸序列。
一些实施方案涉及一种编码CAR的分离的核酸序列，所述CAR包含细胞外结构域、间隔域、跨膜结构域和细胞内结构域。CAR的细胞外结构域结合肿瘤抗原；间隔域包含SEQID NO.:69的氨基酸序列；并且跨膜结构域包含SEQ ID NO.:73或74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域包括抗体、配体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段包括Fab或scFv。在一些实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿型AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1或TEM8。在一些实施方案中，CAR的细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域包括选自由以下组成的组的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。在一些实施方案中，CAR的细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。
一些实施方案涉及一种包含上述分离的核酸序列的载体。
一些实施方案涉及一种包含上述分离的核酸序列的细胞。
一些实施方案涉及一种包含T细胞群的组合物，所述T细胞群包含上述分离的核酸序列。
一些实施方案涉及一种用于在受试者中刺激抗肿瘤免疫应答或治疗病状的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的包含人T细胞群的药物组合物，所述人T细胞群包含上述分离的核酸序列。
一些实施方案涉及一种方法，所述方法包括：提供包含上述分离的核酸序列的细胞，并在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养细胞。
一些实施方案涉及一种用于体外CAR细胞制备的方法。所述方法包括：提供细胞；将任何一种上述分离的核酸序列引入细胞中以获得CAR细胞；并且在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养CAR细胞。
一些实施方案涉及一种用于富集表达CAR的细胞的方法。所述方法包括：提供细胞；将任何一种上述分离的核酸序列引入细胞中以获得表达CAR的细胞(CAR细胞)和不表达CAR的细胞；并且在结合CAR的细胞外结构域的试剂存在下培养CAR细胞，以富集表达CAR的细胞。
在一些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域的配体。在一些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域结合的抗原。在一些实施方案中，试剂是抗原的细胞外结构域。在一些实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌症抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌症/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4。在一些实施方案中，试剂是结合CAR的细胞外结构域的抗体。在一些实施方案中，抗体是人IgG抗体。在一些实施方案中，抗体结合人IgG的Fab片段。在一些实施方案中，试剂包括CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4的至少一种的细胞外结构域。在一些实施方案中，试剂包含氨基酸序列：SEQ ID:22和34的至少一种。在一些实施方案中，试剂结合氨基酸序列：SEQ ID:55、21、48、49、40和50-60的至少一种。在一些实施方案中，试剂激活CAR和/或引起细胞的共刺激应答。在一些实施方案中，表达抗原的细胞是NK细胞或T细胞、或其组合。
本发明内容既不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。
附图说明
参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考号指示相似或相同的项目。
图1示出了图解在具有或不具有抗原的情况下培养T细胞的示意图，并示出了显示使用不具有根据本公开的实施方案的试剂的培养基的非转导T细胞和CAR T细胞的细胞扩增结果的直方图。
图2示出了用于比较在具有或不具有抗原的情况下培养的T细胞的具有各种参数的表格。
图3示出了表明CD19维持CAR T 19细胞活性的流式细胞分析的结果。
图4示出了表明CD19刺激和/或诱导CAR T细胞产生记忆细胞表型的流式细胞分析的结果。
图5示出了表明CD19刺激和/或诱导CAR T细胞产生记忆细胞表型的流式细胞分析的结果。分析结果表明，CD19可稳定细胞的状态。图4的402和406分别指示在具有和不具有CD19的情况下培养的细胞的细胞碎片水平。图4的404和408分别指示针对在具有和不具有CD19的情况下培养的细胞的细胞碎片比例。
图6示出了表明CD19可增强释放IFNγ的能力的直方图。
图7示出了表明CD19维持CAR T细胞存在的流式细胞分析的结果。
图8示出了表明TSHR维持CAR T-TSHR细胞活性的流式细胞分析的结果。
图9示出了CART-TSHR细胞的ΔMFI(平均荧光强度)。MFI是指细胞群的平均荧光，并计算为数值。
图10示出了表明TSHR维持CAR T-TSHR细胞活性的另外的流式细胞分析结果。
图11示出了在具有和不具有TSHR的情况下培养的CAR T-TSHR细胞的细胞形态。
图12示出了示例性CAR分子和细胞膜的一部分的结构的示意图。
图13示出了CAR的各种构建体和具有CAR的T细胞的扩增结果。将具有CAR的各种构建体的T细胞分别培养预定时间。在第1天和第15天对培养的T细胞进行流式细胞分析；测量细胞扩增率。直方图示出了具有或不具有CD19细胞外结构域的情况下培养的CAR T细胞的扩增倍数。
图14示出了在如图13所示的四组中CAR T细胞扩增的流式细胞分析。所述CAR T细胞为在不具有CD19细胞外结构域的情况下培养15天。
图15示出了在如图13所示的四组中CAR T细胞扩增的流式细胞分析。所述CAR T细胞为在具有CD19细胞外结构域的情况下培养15天。
图16示出了在如图13所示的四组中CAR T细胞上的CAR表达水平的流式细胞分析。所述CAR T细胞为在不具有CD19细胞外结构域的情况下培养15天。
图17示出了在如图13所示的四组中CAR T细胞上的CAR表达水平的流式细胞分析。所述CAR T细胞为在具有CD19细胞外结构域的情况下培养20天。
图18示出了CAR T细胞中CD4/CD8表型变化的流式细胞分析。
图19示出了CAR T细胞中CD4/CD8表型变化的流式细胞分析。
图20示出了在如图13所示的两组中CAR T细胞的CAR表达水平的流式细胞分析。所述CAR T细胞为在具有CD19细胞外结构域的情况下培养17天。
图21示出了CAR T细胞的杀伤测定的流式细胞分析。
图22示出了CAR T细胞的IFN-g释放的流式细胞分析。
图23示出了多个DNA构建体的示意图。
图24示出了T细胞杀伤作用的荧光照片。
图25示出了T细胞杀伤作用的荧光照片。
图26示出了T细胞杀伤作用的荧光照片。
图27示出了多个永生化单细胞测序测定的图表。
图28示出了多个永生化单细胞测序测定的图表。
图29示出了多个永生化单细胞测序测定的图表。
图30示出了多个永生化单细胞测序测定的图表。
图31示出了多个永生化单细胞测序测定的图表。
图32示出了永生化T细胞中CAR表达的流式细胞结果。上图中的两个纵坐标表示CAR的表达。横坐标是CD279(PD1)的表达。左边是同种型对照，而右边是CAR抗体。使用包含ef1a-TK-IRES-rtTa-TRE-hTERT的DNA的载体和包含编码hCD19 CAR的DNA的载体感染T细胞。在培养期间，添加CD19肽以刺激T细胞的生长。可以看出细胞CAR的表达为82.87％。定性+定量结果。下表示出了CAR的拷贝数实验。可以看出，CAR T细胞中每1μg的gDNA存在224,1151个CAR拷贝，这诱导了hCD19在表达系统中的表达，这是定量的结果。“dt混合物”是指包含仅用ef1a-TK-IRES-rtTA-TRE-hTERT转导而不具有编码抗CD19 CAR的DNA的细胞的对照组。
图33示出了表明细胞是双开关T细胞CD8+单克隆细胞(Dox浓度为2μg/mL)的图表。rTetR用于构建抗CD19 CAR增殖性T细胞。因此，当将多西环素(Dox)添加至培养物时，hTERT被表达。当不添加Dox时，hTERT不被表达，并且细胞逐渐开始死亡。
图34示出了指示双重安全性T/CAR T细胞1+/-TK(更昔洛韦)的图表。
图35示出了指示双重安全性T/CAR T细胞1+/-TK(更昔洛韦)的流式细胞分析结果。
图36示出了指示双重安全性T/CAR T细胞1+/-TK(更昔洛韦)的流式细胞分析结果。实验细胞：CD8+CZY-1SDS-T和NT细胞；TK用法：每24小时注射一次，成人体内浓度为71.45ng/ml/5000ng/kg。体外实验浓度梯度：357.2ng/ml、142.9ng/ml、71.45ng/ml、35.725ng/ml、14.28ng/ml、3.6ng/ml。作为实例，图36示出了在对照和实验中使用35.725ng/ml。以200w的50w/ml的细胞密度培养起始细胞。
图37示出了浓度梯度培养功能测试，所述测试示出了CD8+双开关CAR T细胞。
图38示出了最佳培养浓度：50w/ml至100w/ml，并且低浓度或高浓度可抑制双开关T细胞的生长。W/ml是指每毫升1万。
图39示出了双开关CART细胞杀伤测定结果。
图40示出了细胞杀伤分析的结果。
图41示出了细胞杀伤分析的结果。图26和27是杀伤分析的结果(敲除原代t细胞cd3的结果)。敲除并转染CAR和hTERT后，制成通用CART。流程图：左边的32.17％是cd3敲除的cd3细胞，左边的79.16％也是这样。从明显的一组峰中可以看出测序峰图，以证明已被敲除。
图42示出了使用ZFN获得并用CD3微珠纯化的CD3阴性细胞。纯化后，用APC-CD3抗体接种CD3阴性细胞，并且流式细胞术的结果表明敲除成功，其中99.7％的细胞为CD3-。然后，用双开关hTERT和CAR的慢病毒拷贝将这些CD3阴性细胞转染到这些细胞的基因组中。
图43示出了各种CAR T细胞的存活和生长。在第1组(hTert CD19 CAR)中，用编码CD19 CAR的核酸序列和编码hTERT的核酸序列转导获自健康供体的原代T细胞。在第2组(CD19 CAR)中，用编码CD19 CAR的核酸序列转导原代T细胞。包含编码hTERT的核酸序列的CAR T细胞示出了长期存活。在这些CAR T细胞中，使用含有CD19 ECD的细胞培养基培养的细胞比使用不含CD19 ECD的细胞培养基培养的细胞具有更高的细胞生长速率。不包含编码hTERT的核酸序列的CAR T细胞，在用编码CAR的核酸序列转导细胞后约20天后开始死亡。
图44示出了在不同条件下各组CAR T细胞的细胞生长。A：第1组(hTERT+DOX+CD19)：在含有ECD CD19和Dox的培养基中培养增殖性CD19 CAR T细胞(hTERT)。第2组(hTERT+DOX)：在含有Dox但不具有ECD CD19的培养基中培养增殖性CD19 CAR T细胞(hTERT)。第3组(无hTERT CD19CAR-T)：在不具有Dox和ECD CD19的培养基中培养CD19 CART细胞。B：第1组：在不含有ECD CD19和Dox的培养基中培养CD19 CAR T细胞(h19CAR)。第2组：在含有Dox但不含ECD CD19的培养基中培养具有双开关(双开关h19CAR+dox)的增殖性CD19 CAR T细胞。第3组：在含有Dox和ECD CD19的培养基中培养具有双开关(双开关h19CAR+dox+cd19)的增殖性CD19 CAR T细胞。这些结果表明试剂和/或增殖性修饰有助于体外CART细胞的长期维持。
图45示出了指示抗TSHR CAR分子在T细胞上的表达的流式细胞分析(由单个活细胞门控)。构建抗TSHR CAR T细胞，并通过流式细胞术检测CAR分子的表达。与未转导的T细胞相比，观察到CAR分子的表达。
图46示出了指示TSHR在T细胞上的过表达的流式细胞分析(由单个活细胞门控)。慢病毒载体用于构建抗原过度表达的T细胞(TSHR)。观察到TSHR分子在T细胞表面上的表达(左边为IgG，而右边为抗TSHR FITC)。
图47示出了小鼠外周血中的细胞因子释放(IL-2)。
图48示出了小鼠外周血中的细胞因子释放(IFN-γ)。
图49示出了小鼠外周血中的细胞因子释放(IL-4)。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管可在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但还是描述了优选的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。
本文使用冠词“一个/种(a/an)”是指一个或多于一个(即，至少一个)物品的语法对象。举例来说，“一种要素”意指一种要素或多于一种要素。
“大约”意指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
如本文所用，术语“激活”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞状态。激活也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。
术语“抗体”的使用范围最广，是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性或功能即可。本公开中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如，抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“Fv”是指包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠，产生了六个高变环(每3个环各自来自H和L链)，其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予了对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。
如本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，诸如例如由噬菌体表达的抗体。所述术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而生成的抗体。使用本领域可用和众所周知的技术来获得合成DNA。
术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可涉及抗体产生或特异性免疫能力细胞的激活或两者。抗原包括任何大分子，所述大分子包括所有蛋白质或肽，或衍生自重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引发免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。抗原可以从生物样品中生成、合成或衍生自生物样品，所述生物样品包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减小、肿瘤细胞数减少、转移数减少、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加或与癌性病状相关的各种生理症状改善相关的生物作用。首先，也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤发生方面的能力来表现出“抗肿瘤作用”。
术语“自体抗原”是指被免疫系统误认为是外来的抗原。自体抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
术语“自体的”用于描述衍生自受试者的材料，其随后被重新引入同一受试者中。
术语“同种异体的”用于描述衍生自相同物种的不同受试者的移植物。作为实例，供体受试者可以是相关或不相关的或受体受试者，但是供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标志物。
术语“异种的”用于描述衍生自不同物种的受试者的移植物。作为实例，供体受试者与受体受试者来自不同的物种，并且供体受试者和受体受试者可以是遗传学和免疫学上不相容的。
术语“癌症”用于指特征在于异常细胞快速且不受控制的生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”、“包括(includes)”和“包括(including)”将被理解为暗示包括所述步骤或要素或步骤或要素的组合，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组合。
短语“由......组成”意指包括并且限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”指示所列出的要素是必需或强制性的，并且可不存在其他要素。
短语“基本上由......组成”意指包括在短语之后列出的任何要素，并且可以包括不干扰或有助于本公开中针对所列要素所指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由......组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的，并且取决于它们是否影响所列要素的活动或动作，可以存在或可以不存在。
术语“互补的”和“互补”是指通过碱基配对规则关联在一起的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可存在“完全”或“全部”的互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著影响。
术语“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。
术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外的一种信号，所述信号介导T细胞应答，包括增殖、激活、分化和其他细胞应答的至少一种。共刺激配体可以包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，诸如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及特异性结合CD83的配体。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。
术语“共刺激信号”是指与主要信号(诸如TCR/CD3连接)结合，导致T细胞增殖和/或关键分子上调或下调的信号。术语“疾病”和“病状”可以互换使用，或可以不同，因为特定的疾病或病状可能没有已知的致病物(因此病因尚未得到解决)，因此它还不是公认的疾病，但仅是一种不良病状或综合症，其中临床医生已鉴定出或多或少的特定症状的集合。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有得到改善，则受试者的健康继续恶化。相比之下，受试者的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但是其中动物的健康状态要比没有病症的情况下不利。如果不及时治疗，病症不一定会导致动物健康状态进一步下降。
术语“有效”是指足以实现期望的、预期的或意图的结果。例如，在治疗背景下的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。
术语“编码”是指多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中的特定核苷酸序列在生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述生物过程具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同(除了用“U”代替“T”以外)并且通常提供在序列表中，编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链可被称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
术语“外源的”是指并非天然存在于野生型细胞或生物体中，但通常通过分子生物学技术引入细胞中的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。同样，通过分子生物学技术从第一生物体分离并转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，例如，以产生原本天然存在的多核苷酸序列的一个或多个其他拷贝，从而促进编码多肽的过表达。
术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用要素；用于表达的其他要素可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的并入重组多核苷酸的所有载体，诸如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“同源的”是指当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，例如，如果两个DNA分子中的每个中的一个位置被腺嘌呤占据，则分子在所述位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列享有的匹配或同源位置数除以所比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。当比对两个序列时进行比较，以得到最大同源性。
术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指用作抗体的一类蛋白质。包括在此类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的一抗，诸如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物和呼吸道与泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。在大多数受试者中，IgM是初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且对于防御细菌和病毒很重要。IgD是不具有已知抗体功能但可以充当抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过暴露于过敏原时，引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
术语“分离的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。所述材料可以是细胞或大分子，诸如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已从以天然存在状态的方式位于其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如已从通常与片段相邻的序列中去除的DNA片段。或者，如本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从其天然细胞环境以及从其与细胞的其他组分的缔合中体外分离和/或纯化肽或多肽分子。
术语“基本上纯化的”是指基本上不含在其天然状态下通常与其缔合的组分的材料。例如，基本上纯化的细胞是指已从以其天然存在或天然状态的方式通常缔合的其他细胞类型中分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语简单地是指已从以其天然状态的方式与其天然缔合的细胞中分离的细胞。在一些实施方案中，细胞在体外培养。在其他实施方案中，细胞不在体外培养。
在本公开的上下文中，使用了以下常见存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可以包括内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可以包含一个或多个内含子。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的手段。
术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的情况下受试者中的反应水平相比，和/或与其他相同但未治疗的受试者中的反应水平相比，介导受试者中反应水平的可检测的增加或降低。所述术语涵盖干扰和/或影响天然信号或反应，从而在受试者、优选人中介导有益的治疗反应。
当核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，所述核酸是“可操作连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。
术语“在转录控制下”是指启动子可操作地连接至多核苷酸并相对于多核苷酸并处于正确的位置和方向，以控制由RNA聚合酶进行的转录开始和多核苷酸表达。
术语“过度表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过度表达”旨在指示相对于来自特定组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自患者的所述组织或器官中的疾病区域(例如实体瘤)的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定患有特征在于肿瘤抗原过表达的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、胸骨内注射或输注技术。
术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文可互换使用，并且是指适用于本文描述的方法的任何人、动物或活生物体。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在一些实施方案中，术语“受试者”旨在包括在其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物，诸如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。
需要治疗或其有需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病状或病症的受试者。其中有需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病状或病症的受试者。
术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。所述术语通常是指长度至少为10个碱基的聚合形式核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或修饰形式的任一类型核苷酸。所述术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。
术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖通过添加、缺失或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸区分开的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸代替的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和替换，从而使改变后的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物功能或活性或相对于参考多核苷酸具有增加的活性(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与本文描述的参考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％以及其间的所有整数百分比，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。
“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，诸如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。在一些实施方案中，多肽可以包括酶促多肽或“酶”，其通常催化(即，增加其速率)各种化学反应。
术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或替换至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分开的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过一个或多个替换而与参考多肽区分开，所述一个或多个替换可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守替换，并且就这一点而言，在本领域中众所周知，可以将一些氨基酸改变为具有大致相似特性的其他氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还涵盖其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基代替的多肽。
术语“启动子”是指由细胞的合成机制识别或引入合成机制，开始多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。术语“表达控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
术语“结合(bind)”、“结合(binds)”或“与......相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中特定第二分子但基本上不识别或粘附于样品中其他结构无关分子的分子。如本文所用关于抗体的术语“特异性结合”，是指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specificbinding)”或“特异性结合(specifically binding)”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，意味着相互作用取决于化学物种上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是结合任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在包含标记“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离、未标记的A)的分子将减少与抗体结合的标记A的量。
“统计学上显著的”意指结果不太可能是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。常用的显著性度量包括p值，所述p值是在虚假设为真时观察到的事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝虚假设。在简单情况下，显著性水平被定义为0.05或更小的p值。“减少”或“降低”或“较少”的量通常是“统计学上显著的”或生理上显著的量，并且可包括约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括介于1和大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)本文描述的量或水平的减少量。
术语“刺激”是指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合从而介导信号转导事件，诸如经由TCR/CD3复合物进行的信号转导而诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子表达的改变，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织。
术语“刺激分子”是指T细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的分子。例如，来源于刺激分子的功能性信号传导结构域是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。
术语“刺激配体”是指以下配体，所述配体当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突状细胞、B细胞等)上时，可以与细胞例如T细胞上的同源结合配偶体(本文称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初次应答，包括激活、免疫反应的开始、增殖和相似过程。刺激配体在本领域中是众所周知的，并且尤其涵盖载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。
术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态的症状可获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指本发明的化合物的量，其将引发研究人员、兽医、医生或另外临床医生所寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应。术语“治疗有效量”包括当施用时足以防止所治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状的发展或在某种程度上对其减轻的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。
术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。
“载体”是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。在本领域中已知许多载体，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体是通过多重减毒HIV毒力基因生成的，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，从而使得载体具有生物安全性。
范围：在整个本公开中，可以以范围格式来呈现本公开的各个方面。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不可改变的限制。因此，对范围的描述应被认为已明确公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围的描述诸如从1到6应被认为已明确公开了子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及所述范围内的单个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
本公开涉及分离的核酸序列、包含分离的核酸序列的载体、修饰的细胞以及使用这些细胞治疗癌症的方法。
本公开的一些方面涉及令人惊讶的发现，即使用试剂体外培养CAR细胞可以增强CAR细胞的功效和/或CAR细胞制备的效率，实现CAR细胞的长期体外维持，和/或诱导CAR T细胞产生记忆T细胞表型。在这些情况下，由CAR细胞表达的CAR识别和/或结合试剂。在一些实施方案中，所述试剂是结合CAR的细胞外组分和/或激活CAR的信号传导途径从而刺激表达CAR的T细胞的调节化合物。例如，调节化合物可以结合T细胞的CAR并介导T细胞应答，包括激活、免疫应答的开始和/或增殖。
本公开的一些方面涉及可以生长多次的修饰的T细胞/CAR T细胞(即，增殖性细胞或长寿细胞)。此类增殖性细胞保持正常T细胞/CAR T细胞的功能，诸如细胞治疗功能。在一些实施方案中，可以设计双开关来调节增殖性T细胞/CAR T细胞的生长。本文的实施方案设计了一种包括一个或两个控制开关的机构。第一开关包括rtTA-TRE-hTERT/SV40LT。rtTA-TRE是真核细胞诱导的调节基因表达。通过添加四环素以诱导hTERT(人端粒酶逆转录酶)或SV40LT(SV40大T抗原)的表达，可以产生永生化表型。第二调节开关是EF1a-TK。TK基因是自杀基因。在添加更昔洛韦的情况下，该试剂将使自杀基因发挥功能来调节细胞自身死亡。在一些实施方案中，具有一个或两个控制开关的CAR T细胞可使CAR T细胞存活更长的时间并保留相关的生物功能，同时保持有效和安全。此外，除了慢病毒之外，还可以使用本发明中包括的各种其他方法来生成T细胞，诸如将基因组插入另一个基因组的敲入方法以及使用其他载体(例如，逆转录病毒载体)。
本公开的实施方案涉及用于使用嵌合抗原受体(CAR)细胞治疗病状的组合物和方法。术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指包含至少细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，细胞质结构域)的重组多肽构建体。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)或彼此不连续(例如，在不同多肽链中)。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包括衍生自如上所述的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括衍生自主要信号传导结构域(例如，CD3-ζ的主要信号传导结构域)的功能性信号传导结构域。在其他实施方案中，细胞内信号传导结构域还包括一个或多个衍生自至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。共刺激信号传导区是指CAR的一部分，其包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。
在CAR的细胞外结构域与跨膜结构域之间，可以并入间隔域(即，铰链结构域)。如本文所用，术语“间隔域”是指起到将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或细胞质结构域的作用的任何寡肽或多肽。间隔域可以包含高达300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸，并且最优选地25至50个氨基酸。
CAR的细胞外结构域可包括靶向特定肿瘤标志物(例如，肿瘤抗原)的抗原结合结构域(例如，scFv、单域抗体或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的引发免疫应答的蛋白质，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺特异性蛋白(prostein)、PSMA、Her2/neu、存活素端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。例如，如果肿瘤抗原是CD19，则其CAR可以被称为CD19 CAR，并且相应的CAR细胞可以被称为CD19 CAR细胞(例如，CD19 CAR T细胞)。
在一些实施方案中，细胞外配体结合结构域包含scFv，其包含通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区。通过使用短连接肽连接轻链可变区和/或重链可变区来制备单链可变区片段(Bird等人,Science 242:423-426,1988)。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID:76)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已设计并使用了其他序列的接头(Bird等人,1988,同上)。通常，接头可以是短的柔性多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。反过来，可以对接头进行修饰以实现另外的功能，诸如药物附接或固体支持物的附接。单链变体可以重组或合成产生。针对scFv的合成产生，可以使用自动合成仪。针对scFv的重组产生，可以将合适的含有编码scFv的多核苷酸的质粒引入合适的宿主细胞中，所述宿主细胞可以是真核生物，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或者可以是原核生物，诸如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可以通过常规操作诸如多核苷酸的连接来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。
在一些实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿型AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1、TEM8或由肿瘤表达的病毒相关抗原。在一些实施方案中，CAR的结合元件可以包括任何抗原结合部分，所述抗原结合部分在与其同源抗原结合时会影响肿瘤细胞，使得肿瘤细胞无法生长，或被促进死亡或减少。
在一些实施方案中，涉及一种基因修饰的细胞。在一些实施方案中，修饰的细胞可包含编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合。在某些实施方案中，修饰的细胞可包含编码hTERT的第一核酸序列和/或编码SV40LT的第二核酸序列。例如，编码hTERT的核酸序列具有SEQ ID NO:6的序列，并且编码SV40LT的核酸序列具有SEQ ID NO:7的序列。
在一些实施方案中，修饰的细胞是T细胞或NK细胞。在某些实施方案中，修饰的细胞是增殖性T细胞。增殖性细胞是指比野生型细胞具有更高增殖能力的基因修饰的细胞。可以实施几种技术来获得增殖性细胞。例如，可以将hTERT、SV40LT和/或其他基因转移至细胞以获得增殖性细胞。在一些实施方案中，可以将mRNA编码构建体(例如，hTERT和/或SV40LT)注入细胞中以在这些细胞中实现瞬时基因表达。在其他实施方案中，可以将编码构建体(例如，hTERT和/或SV40LT)的载体引入细胞中以获得增殖性细胞。例如，载体的至少一部分可以被整合到细胞的基因组中。在这些情况下，编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的整合可包括编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的基因组整合和hTERT、SV40LT或其组合的组成型表达。
如上所述，一些实施方案涉及一种增殖能力的多步控制。例如，真核细胞诱导的表达系统可以用于调节T细胞的增殖能力。通过持续将“四环素”添加至这些细胞，可以表达hTERT和/或SV40LT；然而，如果终止四环素的提供，则可能不会表达hTERT和/或SV40LT。因此，可以终止该扩增。在一些实施方案中，Ef1α和TK自杀基因可用于调节增殖能力。由于TK自杀基因功能是一种试剂敏感基因，因此用该系统转移的细胞可在试剂存在的情况下死亡。因此，可以以安全有效的方式调节T细胞的增殖能力。
在一些实施方案中，编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的表达由诱导型表达系统调节。例如，诱导型表达系统是rTTA TRE，其增加或激活SV40LT基因、hTERT基因或其组合的表达。诱导型表达系统允许基因的时间和空间控制的激活和/或表达。例如，四环素控制的转录激活是诱导型基因表达的方法，其中转录在抗生素四环素或其一种衍生物(例如多西环素)存在下被可逆地开启或关闭。例如，诱导型自杀基因表达系统允许时间和空间控制的自杀基因的激活和/或表达，这导致细胞通过细胞凋亡杀死自身。
在一些实施方案中，修饰的细胞可包含编码自杀基因的核酸序列。例如，自杀基因是HSV-TK系统。
在一些实施方案中，修饰的细胞可包含编码CAR的核酸序列。例如，CAR可包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且细胞外结构域结合肿瘤抗原。在某些实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿型AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1或TEM8。在某些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域可包括选自由以下组成的组的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。例如，细胞内结构域可包含CD3ζ信号传导结构域。在某些实施方案中，编码CAR的核酸、编码hTERT的核酸、编码SV40LT的核酸或其组合被表达为作为分开的多肽的基因产物。
在一些实施方案中，T细胞的TCR基因被破坏，使得内源TCR的表达降低。在某些实施方案中，与TCR基因相关的靶向载体被整合到T细胞的基因组中，使得内源TCR的表达消除。
在一些实施方案中，T细胞的CD4基因被破坏，使得内源CD4的表达降低。在某些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合HIV表面上的分子。
一些实施方案涉及一种用于制备具有CAR的修饰细胞(CAR细胞)的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括提供细胞；并将编码CAR的核酸序列和编码hTERT、SV40LT或其组合的核酸序列引入细胞中。在一些实施方案中，编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的整合包括编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的基因组整合和hTERT、SV40LT或其组合的组成型表达。在一些实施方案中，编码hTERT、SV40LT或其组合的核酸序列的表达由诱导型表达系统调节。在一些实施方案中，所述方法可还包括在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养CAR细胞。
在一些实施方案中，所述方法可还包括将编码自杀基因的核酸序列引入细胞中。在某些实施方案中，试剂是结合CAR的细胞外组分并且介导细胞应答的调节化合物。例如，调节化合物是CAR的细胞外结构域的配体或CAR的细胞外结构域结合的抗原。在某些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域结合的抗原的细胞外结构域。例如，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌症抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌症/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。在某些实施方案中，试剂是结合CAR的细胞外结构域的抗体。例如，抗体是人IgG抗体和/或结合人IgG的Fab片段。在某些实施方案中，调节化合物包括CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4的至少一种的细胞外结构域。在一些情况下，调节化合物包含氨基酸SEQ ID:41-47的至少一种。在一些情况下，调节化合物结合氨基酸序列：SEQ ID:21和48-53的至少一种。在一些情况下，CAR细胞可包含SEQ ID No:38、35、39和40的至少一种序列。
在一些实施方案中，与不具有试剂的情况下培养的CAR细胞相比，所述CAR细胞表现出细胞生长增加约1.5至2倍。在某些实施方案中，与不具有试剂的情况下培养的CAR细胞相比，所述CAR细胞表现出细胞生长增加约1.5至3倍。在某些实施方案中，与不具有试剂的情况下培养的CAR细胞相比，所述CAR细胞表现出细胞生长增加约2倍。
在一些实施方案中，培养基中CAR细胞的细胞密度是至少25万个细胞/ml细胞培养基。在某些实施方案中，CAR细胞的细胞密度是小于200×104个细胞/ml细胞培养基。在某些实施方案中，CAR细胞的细胞密度是在50×104至200×104个细胞/ml细胞培养基之间。在某些实施方案中，CAR细胞的细胞密度是在50×104至100×104个细胞/ml细胞培养基之间。
在一些实施方案中，CAR细胞对细胞培养基中的四环素敏感。例如，CAR细胞包含编码反向四环素反式活化因子(rtTA)的第三核酸序列。在某些实施方案中，hTERT、SV40LT的表达由rtTA调节，使得hTERT、SV40LT在四环素存在下表达。例如，四环素选自以下的组：四环素、地美环素、甲氯环素、多西环素、赖甲环素、美他环素、米诺环素、土霉素、罗利环素和金霉素。在具体实施方案中，四环素是多西环素。在某些实施方案中，细胞培养基中四环素的浓度是不小于2μg/ml。
在一些实施方案中，CAR细胞可包含编码自杀基因的第四核酸序列，使得CAR细胞与核苷类似物以允许自杀基因表达的方式培养，从而使核苷类似物具有细胞毒性。例如，自杀基因选自由以下组成的组：单纯疱疹病毒的胸苷激酶、水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶和细菌胞嘧啶脱氨酶。在具体实施方案中，自杀基因是单纯疱疹病毒的胸苷激酶。在某些实施方案中，核苷类似物选自由以下组成的组：更昔洛韦、阿昔洛韦、比昔洛韦、泛昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、三氟胸苷、1-[2-脱氧,2-氟,β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶、阿糖腺苷(ara-A)、阿糖胸苷(araT)1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶、5-乙基-2'-脱氧尿苷、5-碘-5'-氨基-2,5'-二脱氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脱氧胞苷和AraC。在具体实施方案中，核苷类似物是更昔洛韦。
一些实施方案涉及一种使用上述方法获得的分离的细胞。在一些实施方案中，提供了一种包含分离的细胞群的组合物。在一些实施方案中，一种在受试者中增强T细胞应答和/或治疗受试者的肿瘤的方法可包括施用有效量的组合物。
在一些实施方案中，涉及一种生成CAR T细胞的方法。所述方法可包括：通过将一个或多个核酸序列转移至T细胞以获得增殖性T细胞来增殖T细胞；并且将编码CAR的核酸序列引入增殖的T细胞中以获得CAR T细胞，其中CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，所述一个或多个核酸序列包含Tet诱导型HPV16-E6/E7表达系统。
在一些实施方案中，T细胞是从受试者提取的原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞是与响应于T细胞输注的相应野生型T细胞相比具有降低的免疫原性的T细胞。
一些实施方案涉及一种治疗疾病或病状的方法。所述方法可包括向人类患者施用本文描述的药物组合物(例如，修饰的T细胞群)。在某些实施方案中，疾病或病状是AIDS，并且CAR的抗原结合结构域结合HIV表面上的分子。在某些实施方案中，疾病或病状是癌症，并且CAR的抗原结合结构域结合癌细胞上的分子，并且内源TCR数减少。
一些实施方案涉及一种CAR T细胞，所述CAR T细胞包含编码CAR的核酸序列，所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域和共刺激分子的信号传导结构域，其中T细胞的TCR基因被破坏，使得TCR的表达消除。
一些实施方案涉及一种CAR T细胞，所述CAR T细胞包含编码CAR的核酸序列，所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域和共刺激分子的信号传导结构域，其中T细胞的CD4基因被破坏，使得内源CD4的表达降低。例如，CAR的抗原结合结构域结合HIV和/或肿瘤细胞表面上的分子。
一些实施方案涉及一种产生条件增殖性T细胞的方法。所述方法可包括将一个或多个核酸序列转移至T细胞以获得增殖性T细胞，其中一个或多个核酸序列编码肽，使得肽的表达引起T细胞变成增殖性的T细胞，并且所述肽由诱导型表达系统、诱导型自杀系统或其组合调节。在一些实施方案中，肽是hTERT、SV40LT或其组合。在某些实施方案中，诱导型表达系统是rtTA TRE。在某些实施方案中，诱导型自杀系统是HSV-TK系统或诱导型半胱天冬蛋白酶-9系统。
一些实施方案涉及一种治疗疾病或病状的方法。所述方法包括使用本文描述的方法制备条件增殖性T细胞；用含有四环素或多西环素的培养基培养条件增殖性T细胞；用不含任何四环素或多西环素的培养基培养条件增殖性T细胞，以获得其SV40LT基因或hTERT基因的表达降低的T细胞；并向受试者施用包含所获得的T细胞的药物组合物。
一些实施方案涉及一种使用本文描述的方法获得的药物组合物，以用于治疗疾病或病状，所述药物组合物用于治疗疾病或病状的方法包括使用所述方法制备条件增殖性T细胞；用含有四环素或多西环素的培养基培养条件增殖性T细胞；用不含四环素或多西环素的培养基培养条件增殖性T细胞以获得其SV40LT基因或hTERT基因的表达降低的T细胞；并向受试者施用包含所获得的T细胞的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法可还包括响应于某些预定条件向受试者施用更昔洛韦。
在一些实施方案中，与修饰的细胞的TCR基因的生物合成或运输途径相关的内源基因被破坏，使得内源TCR的表达降低。
一些实施方案涉及一种包含本文描述的修饰细胞的T细胞群。在一些实施方案中，与修饰的细胞的PD-1基因的生物合成或运输途径相关的内源基因被破坏，使得内源PD-1的表达降低。在某些实施方案中，修饰的细胞包含编码截短的PD-1的核酸序列，所述截短的PD-1降低了编程性死亡配体1(PD-L1)对人T细胞的抑制作用。
在一些实施方案中，涉及一种用于制备修饰的细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括获得包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞；并在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养所述细胞。在一些实施方案中，所述方法可实施用于体外CAR细胞制备。所述方法可包括提供细胞；将编码CAR的核酸序列引入细胞中以获得CAR细胞；并且在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养CAR细胞。在一些实施方案中，所述方法可实施以富集表达CAR的细胞。所述方法可包括提供细胞；将编码CAR的核酸序列引入细胞中以获得表达CAR的细胞(CAR细胞)和不表达CAR的细胞；并且在结合CAR的细胞外结构域的试剂存在下培养CAR细胞以富集表达CAR的细胞。在一些实施方案中，所述方法可实施用于体外CAR细胞制备。所述方法可按以下顺序包括以下步骤：(a)将编码CAR的核酸序列引入细胞以获得CAR细胞；(b)使用第一培养基将CAR细胞培养预定时间；以及(c)使用第二培养基培养CAR细胞，其中第一培养基不包含试剂；第二培养基包含试剂，并且所述试剂结合CAR的细胞外结构域。
一些实施方案涉及通过上述方法获得的分离的细胞以及包含分离的细胞的药物组合物。一些实施方案涉及一种用于在受试者中刺激抗肿瘤免疫应答的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的药物组合物。一些实施方案涉及药物组合物，以用于治疗癌症，所述药物组合物用于治疗癌症的方法包括向受试者施用有效量的药物组合物。
在一些实施方案中，试剂是结合CAR的细胞外组分并且介导细胞应答的调节化合物。在某些实施方案中，调节化合物是CAR的细胞外结构域的配体或CAR的细胞外结构域结合的抗原。在某些实施方案中，调节化合物是结合CAR的细胞外结构域的抗体。在一些情况下，抗体是人IgG抗体和/或结合人IgG的Fab片段。在某些实施方案中，调节化合物可包括CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4的至少一种的细胞外结构域。在某些实施方案中，调节化合物包含氨基酸序列：SEQ ID:41-47和61-63的至少一种。在某些实施方案中，调节化合物结合氨基酸序列：SEQ ID:55、21、48、49、40、51-53和56-60的至少一种。在某些实施方案中，调节化合物包括GCC、B7-H4、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Rα、her-2、CD19、CD20、CD22、CD123、NY-ES0-1、HIV-I Gag、Lewis Y、Mart-I、gplOO、酪氨酸酶、WT-I、h TERI、MUC16、间皮素、MIC-A、MIC-B、雌激素、黄体酮、RON、或ULBP/RAETl家族的一个或多个成员的至少一种。在某些实施方案中，调节化合物是由真核系统或细菌表达系统生成的可溶性抗原。
在一些实施方案中，“可溶性抗原”是不与细胞膜结合的多肽。可溶性抗原最通常是缺少跨膜结构域和胞质结构域的配体结合多肽(例如受体)。可溶性抗原可包括另外的氨基酸残基，诸如提供多肽纯化或提供将多肽附着于底物或免疫球蛋白恒定区序列的位点的亲和标签。当可溶性抗原多肽缺乏足够的跨膜和细胞内多肽区段部分以分别提供膜锚定或信号转导时，据说可溶性抗原多肽基本上不含有这些区段部分。例如，许多细胞表面受体是天然存在的，而可溶对应物是通过蛋白水解产生的。
在一些实施方案中，所述试剂是CAR的细胞外结构域结合的抗原的细胞外结构域。在某些实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌症抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌症/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5、B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。
在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域和共刺激分子的信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR的共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-L ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-I(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的至少一种。
在一些实施方案中，细胞是NK细胞、T细胞或其组合。例如，细胞是衍生自从健康供体或受试者中获得的原代T细胞的T细胞。
在一些实施方案中，在用试剂培养CAR细胞之后，试剂的量与CAR细胞的数量之比为1:50至1:5(μg/104个细胞)、1:500至1:5(μg/104个细胞)、或1:5000至1:5(μg/104个细胞)。在某些实施方案中，试剂的量与CAR细胞的数量之比为1:50至1:5(μg/104个细胞)。
在一些实施方案中，培养基包含抗CD3珠、抗CD28珠和IL2的至少一种。
在一些实施方案中，CAR细胞上CAR的拷贝数大于当不具有试剂的情况下培养CAR细胞时的数目。在某些实施方案中，表达CAR的细胞与不表达CAR的细胞的数量比大于当不具有试剂的情况下培养细胞时的比率。
在一些实施方案中，可在试剂存在下培养CAR细胞预定时间段，或在试剂存在下培养CAR细胞至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。例如，预定时间段是7-100天。在其他实施方案中，可以在将包含编码CAR的核酸序列的载体引入细胞中之后，在不具有试剂的情况下培养CAR细胞至少8、9、10、11、12或13天，然后用试剂培养。在具体实施方案中，可以在将包含编码CAR的核酸序列的载体引入细胞中之后，在不具有试剂的情况下培养CAR细胞约10天，然后用试剂培养。在某些实施方案中，在试剂存在下培养T细胞包括在将包含编码CAR的核酸序列的载体引入T细胞中之后，在具有或不具有试剂的情况下培养T细胞至少8天，然后在所述至少8天后用试剂培养T细胞。在某些实施方案中，在试剂存在下培养T细胞包括在将包含编码CAR的核酸序列的载体引入T细胞中之后，在具有或不具有试剂的情况下培养T细胞至少10天，然后在所述至少10天后用试剂培养T细胞。
在一些实施方案中，当在试剂存在下培养时，产生记忆T细胞表型的CAR细胞数大于当不具有试剂的情况下培养CAR细胞时的数目。
在一些实施方案中，当不具有试剂的情况下培养CAR细胞时，由CAR细胞产生的细胞因子的量大于由CAR细胞产生的细胞因子的量。
在一些实施方案中，CAR细胞衍生自健康供体，并且具有内源TCR基因和/或HLA I的降低表达。在某些实施方案中，CAR细胞衍生自健康供体且与分离自同一人类供体的原代人T细胞引发的GVHD应答相比，在人类受体中不引发移植物抗宿主疾病(GVHD)应答或引发降低的GVHD应答，并且内源TCR基因和/或HLA I的表达没有降低，或内源TCR基因和/或HLAI的表达没有被破坏，并且内源TCR基因和/或HLA I被正常表达。
在一些实施方案中，CAR T细胞是包含编码hTERT的核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的T细胞。在某些实施方案中，CAR T细胞可包含编码hTERT的核酸序列和编码SV40LT的核酸。在某些实施方案中，hTERT的表达由诱导型表达系统调节。在某些实施方案中，SV40LT基因的表达由诱导型表达系统调节。在某些实施方案中，诱导型表达系统是rtTATRE，其增加或激活SV40LT基因、hTERT基因或其组合的表达。
在一些实施方案中，CAR细胞可包含编码自杀基因的核酸序列。在某些实施方案中，自杀基因是HSV-TK系统。
一些实施方案涉及一种体内细胞扩增的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的包含CAR的T细胞，以提供T细胞应答；并且施用有效量的表达可溶性试剂的呈递细胞，所述可溶性试剂为CAR的细胞外结构域可识别的。在一些实施方案中，所述方法可实施以增强受试者中的T细胞应答。所述方法可包括向受试者施用有效量的包含CAR的T细胞以提供T细胞应答，并且施用有效量的表达可溶性试剂的呈递细胞以增强受试者中的T细胞应答，所述可溶性试剂为CAR的细胞外结构域可识别的。在某些实施方案中，呈递细胞是T细胞、树突状细胞和/或抗原呈递细胞。在某些实施方案中，增强受试者中的T细胞应答包括选择性增强包含CAR的T细胞的增殖。在一些实施方案中，所述方法可用于使用CAR细胞增强对受试者病状的治疗。所述方法可包括施用表达试剂的细胞群或被配制成疫苗的试剂。在这些情况下，CAR细胞可包含编码CAR的核酸序列，并且CAR的细胞外结构域可识别所述试剂。在一些实施方案中，所述方法可实施以在患有疾病的受试者中增强CAR细胞的增殖。所述方法可包括制备包含CAR的细胞；向受试者施用有效量的CAR细胞；将编码试剂的核酸序列引入细胞中，所述试剂是CAR的细胞外结构域可识别的，并向受试者施用有效量的细胞。
受试者中的T细胞应答是指与辅助、杀伤、调节和其他类型的T细胞相关的细胞介导免疫。例如，T细胞应答可以包括诸如在免疫过程中协助其他白细胞以及鉴定和破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞的活动。受试者中的T细胞应答可通过各种指标进行测量，诸如T细胞杀伤的许多病毒感染细胞和/或肿瘤细胞，与病毒感染细胞和/或肿瘤细胞共同培养时T细胞释放的细胞因子的量、受试者中T细胞的增殖水平、T细胞的表型改变(例如记忆T细胞改变)以及受试者中T细胞的长寿或寿命水平。
在一些实施方案中，可通过将CAR T细胞与抗原阳性细胞共同培养来测量CAR T细胞的杀伤效力来进行体外杀伤测定。通过显示与不表达相应抗原的对照细胞相比，与CAR T细胞共同培养的相应抗原阳性细胞的数量减少以及IFNγ、TNFα等的释放增加，可以认为CAR T细胞对相应抗原阳性细胞具有杀伤作用。此外，可以测试CAR t细胞的体内抗肿瘤活性。例如，可以使用本文描述的抗原在免疫缺陷小鼠中建立异种移植模型。在过去的二十年中，将人癌细胞或肿瘤活检组织异种移植到免疫缺陷的啮齿动物(异种移植模型)中，构成了开发新型癌症治疗剂的主要临床前筛选(Song等人,Cancer Res.PMC 2014Aug 21和Morton等人,Nature Protocols,2,-247-250(2007))。为了评估CAR T细胞在体内的抗肿瘤活性，可将携带肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠用于评估CAR T的抗肿瘤活性(例如，小鼠肿瘤和小鼠血液IFNγ、TNFα等的减少和/或CAR T在小鼠的骨髓/外周血/脾中保留时间的减少)。
在一些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域的配体。在某些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域结合的抗原。在某些实施方案中，试剂包括以下的至少一种的细胞外结构域：表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌症抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌症/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4。在某些实施方案中，试剂包含氨基酸序列：SEQ ID:41-47和61-63的至少一种。在某些实施方案中，试剂结合氨基酸序列：SEQ ID:55、21、48、49、40、51-53和56-60的至少一种。在某些实施方案中，试剂包括GCC、B7-H4、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Rα、her-2、CD19、CD20、CD22、CD123、NY-ES0-1、HIV-I Gag、Lewis Y、Mart-I、gplOO、酪氨酸酶、WT-I、h TERI、MUC16、间皮素、MIC-A、MIC-B、雌激素、黄体酮、RON、或ULBP/RAETl家族的一个或多个成员的至少一种。
在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域和共刺激分子的信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR的共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-L ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-I(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3的至少一种。
在一些实施方案中，细胞或分离的细胞是NK细胞、T细胞、或其组合。在某些实施方案中，细胞被减毒为存活的且复制缺陷的。在某些实施方案中，通过γ辐照或化学灭活，细胞被减毒为存活的且复制缺陷的。在某些实施方案中，细胞或分离的修饰细胞获自受试者的外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施方案中，细胞是受试者或健康供体的T细胞。在某些实施方案中，细胞是被配制为疫苗的T细胞。在某些实施方案中，细胞是减毒的肿瘤细胞。在某些实施方案中，细胞是与野生型细胞相比对同种异体CAR疗法具有降低的免疫原性的修饰细胞。
在一些实施方案中，试剂由细胞表达，并且试剂的表达由诱导型表达系统调节。在某些实施方案中，试剂由细胞表达，并且试剂的表达由诱导型自杀基因表达系统调节。在某些实施方案中，试剂是可溶性抗原，使得抗原由细胞释放。
一些实施方案涉及一种编码具有间隔域的CAR的分离核酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸序列可以编码具有细胞外结构域、间隔域、跨膜结构域和细胞内结构域的CAR，其中细胞外结构域结合肿瘤抗原，并且间隔域包含SEQ ID NO.:68或69的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸序列可以编码具有细胞外结构域、间隔域、跨膜结构域和细胞内结构域的CAR，其中细胞外结构域结合肿瘤抗原，间隔域包含SEQ ID NO.:68的氨基酸序列，并且跨膜结构域包含SEQ ID NO.:72或75的氨基酸序列。
一些实施方案涉及一种包含分离核酸序列的载体，并且涉及一种包含分离核酸序列的细胞。例如，细胞可以是NK细胞、T细胞或其组合。一些实施方案涉及一种包含T细胞群的组合物，所述T细胞群具有分离的核酸序列。
一些实施方案涉及一种用于制备具有CAR的细胞的方法及其用途。在一些实施方案中，所述方法可以实施用于在受试者中刺激抗肿瘤免疫应答或治疗病状。所述方法可包括向受试者施用有效量的包含人T细胞群的药物组合物，所述人T细胞群包含分离的核酸序列。在一些实施方案中，所述方法可包括获得包含分离核酸序列的细胞；并在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养所述细胞。在一些实施方案中，所述方法可实施用于体外CAR细胞制备。所述方法可包括提供细胞；将分离的核酸序列引入细胞中以获得CAR细胞；并且在CAR的细胞外结构域识别的试剂存在下培养CAR细胞。在一些实施方案中，所述方法可实施用于富集表达CAR的细胞。所述方法可包括提供细胞；将分离的核酸序列引入细胞中以获得表达CAR的细胞(CAR细胞)和不表达CAR的细胞；并且在结合CAR的细胞外结构域的试剂存在下培养CAR细胞以富集表达CAR的细胞。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括抗体、配体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗原结合片段包括Fab或scFv。在某些实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素、TAG72、PSMA、NKG2D配体、B7-H6、IL-13受体α2、IL-11受体α、MUC1、MUC16、CA9、GD2、GD3、HMW-MAA、CD171、Lewis Y、G250/CAIX、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ESO-1、PSC1、叶酸受体-α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿型AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1或TEM8。在某些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包括选自由以下组成的组的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。在某些实施方案中，细胞内结构域包含CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域的配体。在某些实施方案中，试剂是CAR的细胞外结构域结合的抗原。在某些实施方案中，试剂是抗原的细胞外结构域。在某些实施方案中，抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素(MSLN)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、白介素-13Ra2(IL13Rα2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、碳酸酐酶IX(CAIX)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、癌症抗原125(CA125)、分化簇133(CD133)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、癌症/睾丸抗原1B(CTAG1B)、粘蛋白1(MUC1)、叶酸受体α(FR-α)、CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc 17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4。在某些实施方案中，试剂是结合CAR的细胞外结构域的抗体。在某些实施方案中，抗体是人IgG抗体。例如，抗体结合人IgG的Fab片段。在某些实施方案中，试剂包括CD19、FZD10、TSHR、PRLR、Muc17、GUCY2C、CD207、CD3、CD5或CD4的至少一种的细胞外结构域。在某些实施方案中，试剂包含氨基酸SEQ ID:22和34的至少一种。在某些实施方案中，试剂结合氨基酸SEQ ID:55、21、48、49、40和50-60的至少一种。在某些实施方案中，试剂激活CAR和/或引起细胞的共刺激应答。
可以使用本领域已知的重组方法来获得编码所需分子的核酸序列，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含基因的载体中衍生所述基因，或通过使用标准技术，直接从包含它们的细胞和组织中分离。或者，感兴趣的基因可以合成产生，而不是克隆。
本公开的实施方案还涉及其中插入本公开的DNA的载体。衍生自逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自诸如鼠白血病病毒等的致癌逆转录病毒的载体具有更多的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。
编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至一个或多个启动子并将构建体并入表达载体中来实现。载体可适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体包含有用于调节所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
美国专利号US8,906,682提供了与表达编码CAR的合成核酸和基因转移到哺乳动物细胞中相关的另外信息，所述美国专利以引用的方式整体并入。
实施方案还涉及用于治疗患者疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本公开的工程化细胞。可以根据本发明的方法治疗各种疾病，包括癌症，诸如卵巢癌、乳癌、结肠癌、多形性胶质母细胞瘤、前列腺癌和白血病。在一些实施方案中，所述方法包括向人类患者施用药物组合物，所述药物组合物包含抗肿瘤有效量的人T细胞群，其中所述细胞群中的人T细胞包括包含本公开所述的核酸序列的人T细胞。
一些实施方案涉及用于治疗T细胞白血病的组合物和方法。修饰的细胞可包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列和与分化分子簇(CD)相关的基因的一个或多个外显子的破坏。在这些情况下，CAR的细胞外结构域识别CD分子。在某些实施方案中，CD分子包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52。在其他实施方案中，修饰的细胞是CAR NK细胞或CAR T细胞。
T细胞白血病包括影响T细胞的几种不同类型的淋巴白血病：大颗粒性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、T细胞前淋巴细胞白血病。例如，成人T细胞白血病/淋巴瘤通常是侵袭性(快速生长)的T细胞淋巴瘤，其可以在血液(白血病)、淋巴结(淋巴瘤)、皮肤或身体的多个区域中发现。嵌合抗原受体T(CAR T)细胞疗法是一种新开发的过继性抗肿瘤治疗，并已被证明可有效治疗某些白血病(例如，B细胞淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病)。然而，由于互相杀伤(fratricide)的问题，CAR T靶向的常规技术会损害包括CAR T细胞在内的T细胞。一些实施方案使用基因编辑技术来修饰T/NK细胞的某些基因。例如，可以修饰某些分化(CD)基因簇或相关基因，使得修饰的细胞可以杀伤T细胞肿瘤并避免CAR T/NK细胞相互攻击。
在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域；细胞外结构域结合抗原。在某些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包括选自由以下组成的组的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。
在一些实施方案中，修饰的细胞包含与CD2、CD3/TCR、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52基因的生物合成或运输途径相关的内源基因破坏。在某些实施方案中，与CD分子相关的基因是CD3/TCR基因，并且修饰的细胞具有减少量的TCR亚基或CD3亚基的至少一种，诸如CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ亚基。CD3的另外信息和CD3亚基表达的破坏可在“A PCR-Based Methodto Genotype Mice Knocked Out for All Four CD3 Subunits,the Standard RecipientStrain for Retrogenic TCR/CD3 Bone Marrow Reconstitution Technology,”Alejandro Ferrer,Adam G.Schrum和Diana Gil,BioResearch Open Access 2013 2:3,222-226中找到，所述参考文献以引用的方式整体并入。在某些实施方案中，与CD分子相关的基因是CD3/TCR基因，并且修饰的细胞具有减少量的TRAC、CD3γ、CD3δ或CD3ε亚基的至少一种。在某些实施方案中，与CD分子相关的基因是CD3/TCR基因，并且修饰的细胞具有降低的TRAC、CD3γ、CD3δ和CD3ε亚基的表达。在某些实施方案中，CAR的细胞外结构域结合CD3或TCR，并且与包含CAR的细胞引发的T细胞应答相比，修饰的细胞在受试者中引发减少量或不引发由另一种修饰细胞引起的T细胞应答，所述CAR的细胞外结构域结合CD3或TCR并且不破坏内源CD3/TCR。在某些实施方案中，CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:57。在某些实施方案中，CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:88和/或89。在某些实施方案中，CD分子是CD3，并且CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:57、88或89。
在一些实施方案中，实施方案1-16中任一项的修饰细胞，其中修饰细胞包含分离的锌指核酸酶(ZFN)，所述锌指核酸酶包含：与T细胞受体α恒定(TRAC)基因(或核酸序列)上的第一靶位点结合的第一锌指蛋白(ZFP)，第一ZFP包含三个或更多个锌指结构域；与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二ZFP，第二ZFP包含三个或更多个锌指结构域；和切割域。在一些情况下，第一ZFP包含从第一ZFP的N端至第一ZFP的C端排序的氨基酸序列SEQ IDNOS.:78、77、80、79、78和87，并且第二ZFP包含从第二ZFP的N端至第二ZFP的C端排序的氨基酸序列SEQ ID NOS.:82、83、86和84。在其他情况下，第一ZFP包含从第一ZFP的N端至第一ZFP的C端排序的氨基酸序列SEQ ID NOS.:26、25、26、27和28，并且第二ZFP包含从第二ZFP的N端至第二ZFP的C端排序的氨基酸序列SEQ ID NOS.:30、31、26、32。在一些情况下，第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO:81，并且第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO:85。在其他情况下，第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，并且第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。
在一些实施方案中，CD分子是CD4，并且CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:58、90或91。在一些实施方案中，CD分子是CD4，并且CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:59、92或93。在一些实施方案中，CD分子是CD5，并且CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:94、95或96。
在一些实施方案中，修饰的细胞可以包括编码CAR的核酸序列和与CD3/TCR复合物相关的一个或多个基因的破坏，所述CAR结合CD3/TCR复合物的一个或多个亚基。例如，CD3/TCR复合物包括多个亚基或链，诸如CD3γ、CD3δ、CD3ε、TCRα和TCRβ。在某些实施方案中，CAR的细胞外结构域结合CD3亚基(例如，CD3γ、CD3δ和CD3ε亚基)，并且修饰的细胞包括减少量的TRAC表达或不表达。在一些情况下，CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:57、58、59或95。在一些情况下，修饰的细胞包含靶向TRAC的锌指核酸酶并且包括减少量的TRAC表达或不表达。
在一些实施方案中，制备上述修饰细胞的方法可以包括将编码CAR的核酸序列引入细胞以获得修饰的细胞；并破坏细胞或修饰细胞的基因的一个或多个外显子。
在一些实施方案中，药物组合物包含上述的修饰细胞群。
在一些实施方案中，治疗T细胞白血病的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的上述修饰的细胞。在一些实施方案中，T细胞白血病包括大颗粒性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤或T细胞前淋巴细胞白血病的至少一种。
在一些实施方案中，治疗表达CD分子的癌症的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的上述修饰的细胞。
在一些实施方案中，减少表达CD分子的细胞数的方法可以包括破坏与包含CAR的细胞的CD分子相关的基因的一个或多个外显子以获得破坏的CAR细胞；并使包含CD分子的细胞与有效量的破坏的CAR细胞接触，其中与CAR细胞相比，破坏的CAR细胞的增殖和/或存活水平增加。在一些实施方案中，破坏的CAR细胞是上述修饰的细胞。
在一些实施方案中，减少表达CD分子的细胞数的方法可以包括使细胞与有效量的上述修饰的细胞接触。
在一些实施方案中，抑制表达CD分子的细胞的增殖或活性的方法可以包括使细胞与有效量的上述修饰的细胞接触。
可以治疗的癌症包括未血管化或尚未充分血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或可以包括实体瘤。待用本公开的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌瘤、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌瘤和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红血球性白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合症、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤根据形成它们的细胞类型而命名(诸如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌瘤的实例包括纤维肉瘤、粘肉肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴性恶性肿瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS(中枢神经系统)肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形胶质细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
例如，肾细胞癌是常见恶性肿瘤之一。对患有早期肾细胞癌的患者的治疗可通过手术切除达到90％的五年存活率。然而，具有晚期扩散和转移的晚期患者的五年存活率仅为约10％，参考(National Cancer Institute:SEER Stat Fact Sheets:Kidney andRenal Pelvis Cancer.Bethesda,MD:National Cancer Institute.在线可获得。上次访问时间：2017年11月2日)。胰腺癌是消化道恶性肿瘤，其是非常恶性且难以诊断和治疗的。尽管在过去的二十年中医疗技术已极大地改善，但是在胰腺癌的诊断和治疗中仍然存在许多问题。由于初始诊断率低，胰腺癌在发现其时通常已发生转移。因此，少于20％的患者通过手术切除且平均5年的存活率小于10％。(American Cancer Society:Cancer Facts andFigures 2018.Atlanta,Ga:American Cancer Society,2018.在线可获得。上次访问时间：2018年1月5日)。尿道癌是从泌尿系统中的尿道上皮细胞演变而来的癌症，并且是一种相对罕见的恶性肿瘤。虽然尿路上皮癌早期诊断率高，并且早期治疗有效，但其仍是一种复发率高、容易进展和预后差的恶性肿瘤。子宫内膜癌是指起源于子宫内膜的一组上皮恶性肿瘤。子宫内膜癌是女性生殖道中三大恶性肿瘤之一。早期患者的5年存活率是62％-84％，但晚期患者的疗效较差。乳癌是一种常见的恶性肿瘤，多见于女性，发病率很高，由于医学手段的不断完善，乳腺癌的存活机会已有明显提高，五年存活率可达到90％。但是对于三阴性乳癌，治疗仍然很棘手，肿瘤细胞侵袭力强，预后差。前列腺癌是男性生殖系统中最常见的癌症，多数是男性老年患者，是美国第二大致命性癌症，据统计，早期前列腺癌的5年存活率可达到90％，但晚期前列腺癌患者5年存活率仅为30％。食道癌是由食道引起的癌症，近几十年来食道癌的发病率上升。预后差的主要原因是大多数患者在诊断时通常已经局部晚期或已发生远处转移。大多数卵巢癌患者(60％)被诊断患有晚期疾病，其5年存活率为29％。卵巢癌的总体5年相对存活率较低(47％)。结肠直肠癌是常见的恶性肿瘤。除遗传因素外，结肠直肠癌还与高脂肪、高蛋白和低纤维饮食习惯密切相关。在诸如美国的国家中，结肠直肠癌的发病率很高，并且5年相对存活率为约60％。总结这些癌症的当前状态，似乎癌症的治疗还有很长的路要走，并且迫切需要开发治疗这些癌症的新方法。
如本文所述激活和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损的个体中发生的疾病。具体地说，本公开的工程化细胞可用于治疗癌症。在某些实施方案中，本公开的细胞可用于治疗有发展癌症风险的患者。因此，本公开提供了用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本公开的修饰T细胞。
本公开的修饰T细胞可以单独或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合施用。简而言之，本公开的药物组合物可以包含与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的本文所述的修饰T细胞群。此类组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本公开内容的组合物优选配制用于静脉内施用。
本公开的药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是施用的数量和频率将由诸如患者的病状以及患者疾病的类型和严重程度等因素来确定。
当指示“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的病状的个体差异确定待施用的本公开的组合物的精确量。可以说包含本文描述的T细胞的药物组合物可以104至109个细胞/kg体重的剂量施用，优选地105至106个细胞/kg体重的剂量，包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以这些剂量施用多次。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见，例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病病征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在某些实施方案中，可需要向受试者施用激活的T细胞，然后再抽血(或进行单采)，收集激活的和扩增的T细胞，并向患者再注入这些激活的和扩增的T细胞。此过程可以每几周进行多次。在某些实施方案中，可以从10cc至400cc的抽血中激活T细胞。在某些实施方案中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中激活T细胞。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次再输注的方案可以选择出某些T细胞群。
本文描述的药物组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文描述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或或腹膜内向患者施用。在一些实施方案中，本公开的T细胞组合物通过皮内或皮下注射向患者施用。在另一个实施方案中，本公开的T细胞组合物优选地通过静脉内施用。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
在本公开的某些实施方案中，结合任何数量的相关治疗方法(例如，在之前、同时或之后)，向患者施用使用本文描述的方法或其中将T细胞扩增至治疗水平的本领域已知的其他方法激活和扩增的细胞，所述任何数量的相关治疗方法包括但不限于使用试剂的治疗诸如抗病毒疗法、针对MS患者的西多福韦和白介素-2、阿糖孢苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗治疗，或针对牛皮癣患者的依法珠单抗治疗或针对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方案中，本公开的T细胞可与化学疗法、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消除剂(诸如CAM PATH)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达立滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun 73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun 5:763-773,1993；Isoniemi(同上))。在一些实施方案中，将本公开的细胞组合物与骨髓移植、T细胞消融疗法(使用诸如氟达拉滨的化学治疗剂)、外部束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)结合(例如在之前、同时或之后)向患者施用。在其他实施方案中，本公开的细胞组合物在B细胞消融疗法(诸如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗)之后施用。例如，在一些实施方案中，受试者可以经历高剂量化学疗法的标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植之后，受试者接受输注本公开的扩增免疫细胞。在其他实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
待向患者施用的上述治疗的剂量将随所治疗病状的确切性质和治疗接受者而变化。可以根据各种因素由医师根据本领域公认的实践来进行用于人类施用的剂量缩放比例。
美国专利号US8,906,682提供了关于使用工程化或修饰的T细胞进行癌症治疗的方法的另外信息，所述美国专利以引用的方式整体并入。
一些实施方案涉及一种用于制备修饰的细胞的体外方法。所述方法可以包括从受试者中获得细胞样品。例如，样品可以包括T细胞或T细胞祖细胞。所述方法可以还包括用编码至少一种CAR的DNA转染细胞，在选择性增强表达CAR的T细胞增殖的培养基中离体培养CAR细胞群。在一些实施方案中，样品是冷冻保存的样品。在一些实施方案中，细胞样品来自脐带血。在一些实施方案中，细胞样品是来自受试者的外周血样品。在一些实施方案中，细胞样品通过单采术获得。在一些实施方案中，细胞样品通过静脉穿刺获得。在一些实施方案中，细胞样品是T细胞亚群。在一些实施方案中，与内源T细胞受体和/或内源HLA相关的CAR细胞的基因被破坏，使得CAR细胞的免疫原性降低。
示例性实施方案
以下是示例性实施方案
1、一种修饰的细胞，包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列和与分化分子簇(CD)相关的基因的一个或多个外显子的破坏，其中CAR的细胞外结构域识别CD分子。
2、根据实施方案1所述的修饰的细胞，其中与CD分子相关的基因包括CD2、CD3/TCR、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52基因。
3、根据实施方案1或2所述的修饰的细胞，其中修饰的细胞是CAR NK细胞或CAR T细胞。
4、根据实施方案1-3中任一项所述的修饰的细胞，其中CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外结构域结合抗原。
5、根据实施方案1-4中任一项所述的修饰的细胞，其中细胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区包括选自由以下组成的组的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及其任何组合。
6、根据实施方案1-5中任一项所述的修饰的细胞，其中修饰的细胞具有与CD2、CD3/TCR、CD4、CD5、CD7、CD8或CD52基因的生物合成或运输途径相关的破坏的内源基因。
7、根据实施方案1-6中任一项所述的修饰的细胞，其中与CD分子相关的基因是CD3/TCR基因，并且修饰的细胞具有减少量的TCR亚基的至少一种，或CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ亚基的至少一种。
8、根据实施方案1-7中任一项所述的修饰的细胞，其中与CD分子相关的基因是CD3/TCR基因，并且修饰的细胞具有减少量的TRAC、CD3γ、CD3δ或CD3ε亚基的至少一种。
9、根据实施方案1-7中任一项所述的修饰的细胞，其中与CD分子相关的基因是CD3/TCR基因，并且修饰的细胞具有降低的TRAC、CD3γ、CD3δ和CD3ε亚基的表达。
10、根据实施方案1-9中任一项所述的修饰的细胞，其中细胞外结构域结合CD3或TCR，并且与包含CAR的细胞引发的T细胞应答相比，修饰的细胞在受试者中引发减少量或不引发由另一种修饰细胞引起的T细胞应答，所述CAR的细胞外结构域结合CD3或TCR并且不具有与CD3/TCR相关的基因的一个或多个外显子的破坏。
11、根据实施方案1-10中任一项所述的修饰的细胞，其中CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
12、根据实施方案1-11中任一项所述的修饰的细胞，其中CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID NO:88和/或89。
13、根据实施方案1-12中任一项所述的修饰的细胞，其中与CD分子相关的基因是CD3/TCR基因，并且CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:57、88或89。
14、根据实施方案1-13中任一项所述的修饰的细胞，其中CD分子是CD4，并且CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:58、90或91。
15、根据实施方案1-14中任一项所述的修饰的细胞，其中CD分子是CD4，并且CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:59、92或93。
16、根据实施方案1-15中任一项所述的修饰的细胞，其中CD分子是CD5，并且CAR的细胞外结构域包含氨基酸序列ID:94、95或96。
17、根据实施方案1-16中任一项所述的修饰的细胞，其中修饰的细胞包含分离的锌指核酸酶(ZFN)，所述锌指核酸酶包含：与T细胞受体α恒定(TRAC)分子中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白(ZFP)，第一ZFP包含三个或更多个锌指结构域；与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二ZFP，第二ZFP包含三个或更多个锌指结构域；和切割域，其中第一ZFP包含从第一ZFP的N端至第一ZFP的C端排序的氨基酸序列SEQ ID NOS.:78、77、80、79、78和87，并且第二ZFP包含从第二ZFP的N端至第二ZFP的C端排序的氨基酸序列SEQ ID NOS.:82、83、86和84，第一ZFP包含从第一ZFP的N端至第一ZFP的C端排序的氨基酸序列SEQ ID NOS.:26、25、26、27和28，并且第二ZFP包含从第二ZFP的N端至第二ZFP的C端排序的氨基酸序列SEQID NOS.:30、31、26、32，第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO:81，并且第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，或第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，并且第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。
18、一种制备根据实施方案1-17中任一项所述的修饰的细胞的方法，所述方法包括：将编码CAR的核酸序列引入细胞以获得修饰的细胞；并破坏细胞或修饰的细胞的基因的一个或多个外显子。
19、一种包含根据实施方案1-17中任一项所述的修饰的细胞群的药物组合物。
20、一种治疗T细胞白血病的方法，所述方法包括：
向受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的修饰的细胞，其中T细胞白血病包括大颗粒性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤或T细胞前淋巴细胞白血病的至少一种。
21、一种治疗表达CD分子的癌症的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的修饰的细胞。
22、一种减少表达CD分子的细胞数的方法，所述方法包括：破坏与包含CAR的细胞的CD分子相关的基因的一个或多个外显子以获得破坏的CAR细胞；并使包含CD分子的细胞与有效量的破坏的CAR细胞接触，其中与CAR细胞相比，破坏的CAR细胞的增殖和/或存活水平增加。
23、根据实施方案22所述的方法，其中破坏的CAR细胞是根据实施方案2-17中任一项所述的修饰的细胞。
24、一种减少表达CD分子的细胞数的方法，所述方法包括：使细胞与有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的修饰的细胞接触。
25、一种抑制表达CD分子的细胞的增殖或活性的方法，所述方法包括：使细胞与有效量的根据实施方案1-17中任一项所述的修饰的细胞接触。
实施例
通过参考以下实施例进一步描述本公开。提供这些实施例仅出于说明的目的，除非另有说明，否则它们不意图构成限制。因此，本公开绝不应被解释为限于以下实施例，而应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
CAR在HEK293T和K562细胞上的表达
生成编码CD19 CAR或TSHR CAR的慢病毒载体(参见Chimeric ReceptorsContaining CD137 Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of TCells and Increased Antileukemic Efficacy,In Vivo Molecular Therapy，第17卷第8期，1453–1464，2009年8月，所述参考文献以引用的方式并入本文)。
从患者中获得原代T细胞。用慢病毒载体转导所获得的原代T细胞以获得修饰的T细胞。进行流式细胞术并分析以确定CAR在原代T细胞中的表达。与细胞培养、慢病毒载体构建和流式细胞术相关的技术可在Control of large,established tumor xenograftswith genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains,PNAS 2009年3月3日，第106卷第9期，3360-3365中找到，所述参考文献以引用的方式并入本文。
使用含有抗CD3/CD28珠但无CD19 ECD的培养基培养T细胞。观察到未转导的T细胞和CD19 CAR T细胞的细胞扩增速率，并在图1中示出。
在CD19细胞外结构域(ECD)存在下CAR T细胞的刺激和扩增
在第1天，用编码CD19 CAR的慢病毒载体转导原代T细胞以获得修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包括表达抗CD19的CAR T细胞(以下称为“CAR T19细胞”)。将修饰的T细胞分为两组并分别培养。第1组的CAR T19细胞用抗CD3和CD28珠，以及IL2培养，而第2组的CAR T19细胞用可溶性CD19(例如，CD19的细胞外结构域(ECD)，SEQ ID:41)、抗CD3和CD28珠，以及IL2培养。对于第2组，在开始时用2微克可溶性CD19培养500,000个CAR T19细胞，并在CART19细胞生长后使用4微克可溶性CD19。测量细胞数，并通过流式细胞术观察CAR+细胞与修饰的T细胞群之间的比率。测量细胞群中CAR拷贝数。
例如在22天，观察到CAR T细胞和不表达CAR的T细胞具有不同程度的生长。如图2的第5列所示，第2组中的CAR T19细胞拷贝数高于第2组基于qPCR分析的那些。如图2的第6列所示，第2组中的CAR T19细胞和T细胞的比率高于第1组使用流式细胞术分析的比率。如图3所示，纵轴表示抗scFv PE，并且方框中的区域指示CAR T19细胞。出人意料的是，对于在培养基中添加CD19 ECD的响应，与在早期(所述早期是从约第3天至第10天)不具有CD19ECD培养相比，未转导的T细胞和CD19 CAR T细胞均未表现出明显的细胞扩增增加。在此时期之后，CD19 CAR T细胞的细胞扩增速率高于不具有CD19 ECD存在下培养的那些细胞扩增速率。这些结果表明，CD19在体外刺激或增强了CAR T19细胞的长期维持，而对于短期维持(例如，少于10天)没有示出明显的增强。
在TSHR ECD存在下CAR T细胞的刺激和扩增
用编码TSHR CAR的慢病毒载体转导原代T细胞以获得修饰的T细胞，所述修饰的T细胞包括表达抗TSHR的CAR T细胞(以下称为“CAR T-TSHR细胞”)。将修饰的T细胞冷冻并保存30天。与冷冻T细胞和解冻冷冻T细胞相关的技术可以在Levine等人,MolecularTherapy-Methods&Clinical Development,Molecular Therapy，第4卷，2017年3月17日中找到。
将修饰的T细胞解冻并分为两组，分别培养。第1组的CAR T-TSHR细胞用抗CD3和CD28珠，以及IL2培养10天，而第2组的CAR T-TSHR细胞用各种浓度的可溶性TSHR(例如，TSHR的细胞外结构域，SEQ ID:34)、抗CD3和CD28珠，以及IL2培养。对于第2组，将500,000个CAR T-TSHR细胞与10、125、500ng/ml的可溶性TSHR ECD培养14天。通过流式细胞术观察到T细胞群(图8和图9)，并且在显微镜下观察到T细胞群的细胞形态(图10)。
如图8所示，随着TSHR ECD浓度的增加，低SSC-A可分散FSC群减少。如图8所示，当向第2组的细胞添加500ng/ml可溶性TSHR ECD时，CAR+细胞和CAR T-TSHR细胞的比率(P1)显著增加。如图9和图10所示，随着添加抗原(TSHR-ECD)的比例增加，细胞碎片减少，这表明与不具有TSHR ECD的情况下培养相比，细胞保持在更好的状态。MFI(平均荧光强度)是指细胞群的平均荧光位置，并计算为数值。如图10所示，在500ng抗原刺激下，CAR荧光(下水平轴)移至细胞群的右侧。CAR阳性细胞比例增加，强度增加，并且MFI值增加。这些结果表明TSHR在体外刺激或增强了CAR T-TSHR细胞的长期维持。
T细胞表型的观察
进一步观察到T细胞表型。在开始之后的第30天，第2组中的CAR T19细胞和T细胞的比率继续上升(参见图4中的P4方框)。分析CAR+和CAR-细胞上的记忆细胞标志物CD62L，以确定培养的T细胞群的表型。在第2组的CAR T19细胞中，T细胞群的全部或大多数细胞显示出记忆细胞的表型(例如，CD62L hi)。图5的上图示出了CAR+细胞分析，并且下图示出了CAR-细胞分析。这些数据表明CD19诱导CAR T细胞产生记忆T细胞的表型。
第1组和第2组中CAR T19的功能分析
使用上述方案分别将第1组和第2组的CAR T19细胞培养约1-3周。然后洗涤CART19细胞，并放入不含CD19的培养物中。将这些CAR T19细胞与K562-CD19(E:T 1:1或1:10)共培养。在24小时、48小时和72小时之后，收集培养物的上清液，并测量由细胞释放的IFN-γ以确定CAR T19细胞的功能。
第1组和第2组均观察到IFN-γ。如图6所示，在24小时后，第2组中的IFN-γ明显高于第1组。似乎第1组中的CAR T细胞处于较低的能量消耗状态(例如，记忆T细胞状态)，并且需要一定的时间使细胞变为活性的(参见图6)。这些数据表明，用CD19培养CAR T细胞增强了CAR T细胞释放IFN-γ的能力。
CD19去除对CAR T19细胞的影响
将CAR T19细胞与CD19培养15天以上，然后分为第3组和第4组。第3组中的CAR T19细胞用可溶性CD19连续培养，而第4组中的CAR T19细胞在不具有CD19的情况下培养。如图7所示(例如，第27天)，第4组中的CAR+细胞数相对低于第3组。这些数据表明CD19有助于维持CAR T19细胞的存在。
促进CAR T细胞扩增的CAR和铰链结构域的另外氨基酸的构建
通过分别连接信号肽(SEQ ID NO:38)、抗原特异性单链可变片段(scFv)(SEQ IDNO:55或21)、铰链结构域(SEQ ID NO:68、69、70或71)、跨膜结构域(SEQ ID NO:72、73、74或75)、一个或多个共刺激结构域(SEQ ID NO:3)、CD3-ζ(SEQ ID NO:40)和EGFP构建各种CAR(A、B、C和D)(参见图12和13)。
原代T细胞是从志愿者的外周血中获得的。使用来自Miltenyi Biotec公司的Pan-T试剂盒进行磁珠阴性选择，以从外周血中收集T细胞。在原代T细胞分离之后的第二天，将收集的T细胞分别用含有A、B、C和D CAR的慢病毒(即Lenti-CARs-IRES-EGFP)感染，以制备CAR T细胞。
感染后第14天，收集每组15,000个CAR T细胞，并用1000ng/ml CD 19抗原(即重组人CD19蛋白)进行培养。在刺激15天之后，CD19的浓度变化为400ng/ml。在刺激20天之后，CD19的浓度变化为200ng/ml并且维持直到约130天。
在刺激开始时的第2天、第15天(图14-17)、第17天(图20)、第65天和第130天，使用流式细胞术观察CAR的表达和细胞形态。抗F(ab2)'-生物素和PE-链霉亲和素抗体的组合用于检测CAR表达。FITC通道用于检测EGFP的表达，并且细胞碎片和细胞存活率的检测参数为SSC/FSC。
在第130天，使用K562-RFP-CD19、K562-RFP和Nalm6细胞检查通过上述方案维持的CAR T细胞的功能。其中，K562-RFP-CD19和Nalm6是CD19阳性细胞，而K562-RFP是CD19阴性细胞。通过测量杀伤作用(例如红色荧光)和细胞因子释放(例如IFN-g)来评估CAR T细胞功能。并且我们检查了CAR分子的拷贝数。
图14和图15示出了CAR T细胞在具有或不具有CD19共培养之前或之后的流式细胞结果。观察到CAR T细胞中EGFP表达的变化。CAR分子是带有EGF的CAR-IRES-EGFP。因此，在刺激CAR之后，与未刺激的CAR相比，绿色荧光更强。如图14和图15所示，在EGFP-FITC的水平轴上可以找到P8方框中EGFP表达的强度。图14示出了刺激前(第B/D组)和不具有平行刺激的组(第A/C组)，并且图15示出了刺激后(第B/D组)和具有平行刺激的组(第A/C组)。
图16和图17示出了CAR T细胞在具有或不具有CD19共培养之前或之后的进一步流式细胞结果。观察到CAR T细胞中EGFP表达的变化。CAR分子是带有EGF的CAR-IRES-EGFP。因此，在刺激CAR之后，与未刺激的CAR相比，绿色荧光更强。如图16和图17所示，垂直轴是CAR-PE，并且水平轴是EGFP-FITC，并且CAR分子是带有EGFP的(例如，CAR-IRES-EGFP)。此外，在Q3-UR(左上角)方框中示出了CAR+EGFP+表达的强度。图16进一步示出了接受CD19刺激后的表型(第B/D组)和无刺激的平行培养中的表型(第A/C组)。图20(类似于图16和图17)示出了第17天的第A和D组的流式细胞结果。这些结果表明，CAR+EGFP+细胞的比例增加，并且这些细胞继续生长。
这些结果表明，CD19刺激可以用于维持抗CD19 CAR T细胞的生长(参见图12和图13)，CD19刺激可以富集或特异性刺激CAR+的T细胞(参见图14-16)，并且在体外CD19蛋白可用于激活T细胞以连续生长和富集CAR阳性细胞。
图18和图19示出了CAR T细胞中CD4/CD8表型变化。这两张图片示出了相同的实验，即在用CD19刺激之前或之后，具有或不具有不同铰链的CAR T细胞的CD8和CD4比率的变化。先前已观察到在抗原持久性存在下培养的CAR T细胞逐渐变化为主要为CD4细胞。图18示出了第A和C组中平行的未处理的CAR T细胞表型的流式细胞结果。垂直轴是CD8，并且水平轴是CD4。左上区域是CD8+T细胞，而右下区域是CD4+T细胞。图19是CD19刺激的细胞的流式细胞结果，并且示出了CD4细胞的百分比增加。这些结果表明抗CD19和其他抗原刺激可以改变T细胞的组成。
图21示出了对已使用CD19蛋白培养130天的第D组的CAR T细胞的杀伤测定。将K562-RFP/K562 CD19-RFP细胞分别与CAR T细胞共培养，并在第130天检查其杀伤作用。如图21所示，右边的三列示出了在1:1和10:1处K562 CD19-RFP细胞的明显杀伤，如方框所示。考虑到CD19对CAR T细胞的背景刺激，在实验开始之前将CD19蛋白去除，并用不含CD19的肉汤代替。图21的这些结果表明，与CD19共培养的CAR T细胞维持了杀伤功能。此外，检查了第D组的这些CAR T细胞的干扰素γ(IFN-g)释放。图22示出了第D组的CAR T细胞的IFN-g释放的流式细胞结果，并计算了拷贝数。将第D组的CAR T细胞与CD19阳性细胞(K562-RFP-CD19，nalm-6)共培养，并测量细胞因子释放。如图22所示，使用CD19共培养130天的CAR T细胞释放出针对CD19+细胞的IFN-g(参见图22的左图)。在右上图上，流式细胞结果表明了这些CART细胞的CAR表达。横轴是用于检测EGFP的FITC，纵轴是用于检测CAR分子的PE，并且Q3-UR示出了CAR+EGFP+细胞比率。右下图示出了使用qPCR测量的CAR T细胞的拷贝数。这些结果表明，CD19刺激的CAR T细胞释放出针对CD19+细胞的IFN-g。此外，这些CAR T细胞在第130天维持了CAR阳性细胞表型。同样，CD19在第130天继续刺激CAR T细胞生长。当CAR+接近完全阳性时，拷贝数小于4。
CAR-Jurkat T细胞杀伤测定
使Jurkat T细胞引入具有编码CD19-CAR的核酸序列。进行杀伤测定，并且观察到没有或有弱的杀伤功能。分析T细胞标志物的进一步表达。当表达CD3时，CAR-Jurkat T细胞示出了CD4的低表达和CD8的不表达。这些结果表明，在抑制肿瘤细胞的生长方面，包含编码hTERT和/或SV40LT的核酸序列的增殖性T细胞优于CAR-Jurkat T细胞。
修饰的细胞的制备
从最初的健康人T细胞(第0天)的分离开始，在第1天用单独hTERT(“单独”意指仅此一种)、单独SV40LT、hTERT+SV40LT、hTERT+小鼠CD19CAR、SV40LT+小鼠CD19CAR、hTERT+SV40LT+小鼠CD19CAR感染人T细胞(参见图23)。总共测试了6组。
通过FACS多次检测CD3、CD4、CD8、CD279、mCAR的表达。然后培养细胞；在第92天，分析细胞以检测mCAR(小鼠CAR)。在第92天，再次转移mCAR。在第95天，以E:T：1:1、3:1、10:1、30:1的比率进行共培养(肿瘤和效应子共培养)(单位百万细胞)。
通过收集荧光信号来测量4h和24h的杀伤作用。24小时后，收集上清液(共培养物)，并测量IFN-g的释放。m19CAR(是)是指在感染开始时已感染m19CAR的情况。
图24、图25和图26是示出多个T细胞杀伤作用的荧光照片。K562-CD19是通过在k562细胞表面上过表达CD19蛋白(E:T：30:1和10:1的比率)构建的细胞系。结果示出了24小时的杀伤作用。永生化的T细胞在3天之前被慢病毒感染，使得永生化的T细胞与大鼠来源的CAR一起转移，从而允许永生化的T细胞表达CAR。然后将这些转移的细胞与肿瘤细胞共培养以用于杀死和测量IFN-g释放。
在图24中，单独K562-CD19代表k562-CD19自身的细胞状态(仅肿瘤自身而不添加其他细胞)。在阴性对照10:1中，将野生型T细胞和肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出没有杀伤作用(E:T：10:1的比率)。在阴性对照30:1中，将野生型T细胞和肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出没有杀伤作用(E:T：30:1的比率)。在阳性对照m19CAR(1101)：30:1中，将CAR T细胞(用mCAR感染的T细胞)和肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出显著比例的杀伤作用(E:T：30:1的比率)。
图25示出了关于永生化细胞的有效性验证。关于单独Sv40LT+m19CAR(是)10:1，永生化的T细胞用鼠mCAR病毒感染(与sv40LT一起转移)并与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了一定的杀伤作用(E:T：10份单独Sv40lt+m19CAR T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。关于单独Sv40LT+m19CAR(是)30:1，永生化的T细胞用mCAR病毒感染(与sv40LT一起转移)并与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了良好的杀伤作用(E:T：30:1：30份Sv40lt+m19CAR T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。关于Sv40LT+hTERT+m19CAR(是)10:1，永生化的T细胞用小鼠mCAR病毒感染(与sv40LT和hTERT一起转移)并与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了很少的杀伤作用(E:T：10:1：10份Sv40LT+hTERT+m19CAR T细胞和1份肿瘤的比率)。关于Sv40lt+hTERT+m1 9CAR(是)30:1，永生化的T细胞用mCAR病毒感染(与sv40LT和hTERT一起转移)并与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了杀伤作用(E:T：30份Sv40LT+hTERT+m19CAR T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。
图26示出了关于永生化细胞的安全性验证。关于单独Sv40LT 10:1，不具有CAR病毒感染(与sv40LT一起转移)的永生化T细胞与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了无杀伤作用(E:T：10份单独Sv40LT T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。关于单独Sv40LT 30:1，不具有CAR病毒感染(与sv40LT一起转移)的永生化T细胞与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了无杀伤作用(E:T：30份单独Sv40lt T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。关于单独hTERT 10:1，永生化T细胞(与hTERT一起转移)与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了无杀伤作用(E:T：10份单独hTERT T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。关于单独hTERT30:1，不具有CAR病毒感染(与sv40LT一起转移)的永生化T细胞与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了无杀伤作用(E:T：30份单独hTERT T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。关于hTERT+SV40LT 10:1，不具有CAR病毒感染(与hTERT和SV40LT一起转移)的永生化T细胞与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了无杀伤作用(E:T：10份hTERT+SV40LT T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。关于hTERT+SV40lt 30:1，不具有CAR病毒感染(与hTERT和SV40LT一起转移)的永生化T细胞与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养，示出了无杀伤作用(E:T：30份hTERT+SV40LT T细胞和1份肿瘤细胞的比率)。
图27-31是示出多个永生化单细胞测序测定的图。分析表明，某些与T细胞杀伤功能相关的基因表达增加，因此这些T细胞的细胞毒性得到改善。例如，与野生型T细胞相比，永生化T细胞中GAMA的表达显著增加。
表1概括了上述实验中涉及的DNA和/或蛋白质多肽序列。
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如图1所示，用编码CD19 CAR(SEQ ID NO:21)的慢病毒载体和包含序列1或6的慢病毒载体(ef1a-TK-IRES-rtTA-TRE-hTERT：以5'至3'顺序的SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6或ef1a-rtTA-TRE-hTERT：以5'至3'顺序的SEQ ID No:1、4、5和6)转导获自健康供体的原代T细胞以获得转导的T细胞，所述T细胞包括在第一天表达抗CD19 CAR的永生化T细胞(以下称为“抗CD19 CAR增殖性T细胞”)。将抗CD19 CAR增殖性T细胞分为各个组，并在不同的培养基中培养：在存在各种浓度的多西环素(Dox)、CD19细胞外结构域(ECD)和/或更昔洛韦(GCV)的情况下。在一些组中，将CD19 ECD(SEQ ID NO:22)添加至培养基(1mg/250,000个CAR T细胞)，表达CD19 CAR的细胞百分比增加。
在第一组中，从第1天起，将转导的细胞培养在含有Dox(2μg/ml)的培养基中。在第42天，将CD19 ECD添加至培养基((500,000个CAR T细胞/2微克可溶性CD19)。在第90天，对转导的细胞进行流式细胞术分析。图32示出了永生化T细胞中CAR表达的流式细胞结果。
在第二组中，使用含有Dox(2μg/ml)的培养基将转导的细胞培养约92天，并分成两个子组。在第92天，将Dox从第1子组中去除，并且将Dox维持在第2子组中。观察到这两个子组中的细胞生长，并且结果提供在图33中。
在第三组中，使用含有Dox(2μg/ml)和CD19 ECD(1mg/250,000个CAR T细胞)的培养基培养转导的细胞(ef1a-TK-IRES-rtTA-TRE-hTERT)。在第90天，将各种浓度的GCV添加至转导的细胞。观察到这两个子组中的细胞生长，并且结果提供在图34-36中。NT代表非转导的T细胞，并在存在GCV的情况下继续生长。DTT细胞代表转导的T细胞，并在存在GCV的情况下生长较差。
在第四组中，使用含有Dox(2μg/ml)和CD19 ECD(1mg/250,000个CAR T细胞)的培养基，在不同的细胞浓度下培养转导的细胞。在第90天测量细胞生长，并且结果提供在图37和图38以及图44中。
在第五组中，使用含有Dox(2μg/ml)和CD19 ECD(1mg/250,000个CAR T细胞)的培养基培养转导的细胞。在第90天对这些细胞进行杀伤测定，并且结果提供在图39中。
在第六组中，使转导的细胞引入具有TRAC特异性ZFN，所述TRAC特异性ZFN被构建以实现在TRAC基因处的位点引入特异性突变。设计了各种ZFN并且将其并入质粒载体中，实质上如Urnov等人(2005)Nature 435(7042):646-651，Lombardo等人(2007年11月)NatBiotechnol.25(11):1298-306以及美国专利公布号为2008/0131962的文件中所述。ZFN包括锌指结合结构域(例如ZFN左和ZFN右结合结构域)的各种组合，这些组合列于表1和表2以及表3中。ZFN的切割域包含工程化的FokI切割域(SEQ ID NOS.:23或24)。将编码一对ZFN的mRNA(参见表2)引入转导的细胞中，以修饰与TCR的α链相关的靶基因组基因座。测量CD3的表达，并且结果提供在图40-42中。
调查研究了试剂(例如，ECD CD19)和/或增殖性修饰(例如，hTERT)的贡献。图44示出了在不同条件下各组CAR T细胞的细胞生长。A：第1组：在含有ECD CD19和Dox的培养基中培养增殖性CD19 CAR T细胞(hTERT)。第2组：在含有Dox但不具有ECD CD19的培养基中培养增殖性CD19 CAR T细胞(hTERT)。第3组：在不含有Dox和ECD CD19的培养基中培养CD19 CART细胞。B：第1组：在不含有ECD CD19和Dox的培养基中培养CD19 CAR T细胞(h19CAR)。第2组：在含有Dox但不含ECD CD19的培养基中培养具有双开关(双开关h19CAR+dox)的增殖性CD19 CAR T细胞。第2组：在含有Dox和ECD CD19的培养基中培养具有双开关(双开关h19CAR+dox+cd19)的增殖性CD19 CAR T细胞。这些结果表明试剂和/或增殖性修饰有助于体外CART细胞的长期维持。
表2
表3
抗原表达的K562细胞系的构建
用包含编码各种抗原的核酸序列的慢病毒转导K562细胞(图39)以建立靶肿瘤细胞系(K562-CD19肿瘤细胞)。慢病毒包含IRES-mCherry(红色)构建体，所述构建体编码红色荧光以确认抗原表达。从这些细胞系中观察到红色荧光信号，从而表明成功建立了靶实体瘤细胞系(图39)。细胞系构建的技术可在“Chimeric Receptors Containing CD137Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells andIncreased Antileukemic Efficacy,”In Vivo Molecular Therapy，第17卷第8期，1453–1464，2009年8月中找到，所述参考文献以引用的方式并入本文。K562细胞获自美国模式培养物保藏所(ATCC)。
CAR T细胞的构建
用包含各种CAR的慢病毒转导原代T细胞，以建立靶向表1所列不同抗原的不同CART细胞系。在一些实验中，慢病毒可以包含如图23所示的核酸序列1-4或6。这些细胞获自健康的人类供体。慢病毒分别包含编码CAR分子的核酸序列，并且还包含IRES-mCherry(绿色)构建体，所述构建体编码绿色荧光以确认CAR表达。测量CAR的表达以确认CAR T细胞系表达特异性抗抗原分子。与细胞培养、慢病毒载体构建和流式细胞术相关的技术可在“Treatment of Advanced Leukemia in Mice with mRNA-Engineered T Cells,”HumanGene Therapy,22:1575–1586(2011年12月)中找到，所述参考文献以引用的方式并入本文。
T细胞杀伤测定
进行CAR T细胞杀伤测定以测量CAR T细胞的有效性。从健康人类供体的血液样品中获得原代T细胞。如图23(图24-26和图39)所示，用编码CAR的核酸序列和核酸序列1-4或6转导这些T细胞，并使用流式细胞技术测量T细胞上的CAR表达。
用编码相应人抗原的核酸序列分别转导K562细胞，并使用流式细胞技术测量抗原表达。用编码荧光蛋白(RFP)的核酸序列转导另外的抗原表达K562细胞以用于杀伤测定分析。将各种CAR T细胞与相应的K562细胞以各种E:T比率(30:1、10:1、3:1、1:1)孵育24小时，并观察到来自共培养细胞的红色荧光信号。
体内抗肿瘤活性
在过去的二十年中，将人癌细胞或肿瘤活检组织异种移植到免疫缺陷的啮齿动物(异种移植模型)中，构成了开发新型癌症治疗剂的主要临床前筛选(Song等人,CancerRes.PMC2014年8月21日,2159–2169和Morton等人,Nature Protocols,2,247-250(2007))。为了评估CAT T细胞的体内抗肿瘤活性，将携带肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠用于评估CAR T的抗肿瘤活性。
K562-CD19-RFP细胞用于建立携带CD19肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠。在第120天，将K562-PRLR-RFP细胞注射到免疫缺陷小鼠的尾静脉中。在第122或第123天，以2Gy对免疫缺陷小鼠进行辐照。在第三天，观察到免疫缺陷小鼠中肿瘤细胞的形成。
在第123天，将抗CD19人CAR T细胞(即抗CD19 CAR T)输注至免疫缺陷小鼠，并在免疫缺陷小鼠中观察到抗肿瘤活性。通过本公开中描述的方案制备抗CD19 CAR T细胞。在输注后三或四周之后，通过流式细胞术使用免疫缺陷小鼠的外周血评估K562-CD19-RFP细胞的存在。在对照中，将缓冲液输注至免疫缺陷小鼠，并且免疫缺陷小鼠在四至六周内死亡。对于用抗CD19 CAR T输注的免疫缺陷小鼠，未观察到K562-CD19-RFP细胞，并且免疫缺陷小鼠表现正常。在免疫缺陷小鼠中进一步观察到人CD3细胞(图43)。结论是，CAR增殖性T细胞在小鼠中具有抗肿瘤活性。下表4提供了关于所述方案的另外信息。
表4
肿瘤细胞 K562-CD19 RFP细胞
移植的肿瘤细胞 5×105个细胞/小鼠
辐照 2Gy
注入的CAR T细胞 1×107个细胞/小鼠
CAR/抗原在原代T细胞上的表达
从患者中获得原代T细胞。将所获得的原代T细胞分为两组。用包含编码抗TSHRCAR的核酸序列(SEQ ID:49)的慢病毒载体转导第1组中的原代T细胞。用包含编码TSHR的核酸序列(SEQ ID:43)的慢病毒载体转导第2组中的原代T细胞。进行流式细胞术并分析以分别确定CAR和TSHR在原代T细胞中的表达(图45和图46)。与细胞培养、慢病毒载体构建和流式细胞术相关的技术可在“Control of large,established tumor xenografts withgenetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains,”3360–3365PNAS2009年3月3日，第106卷第9期中找到，所述参考文献以引用的方式并入本文。
体内细胞因子释放测定
将第1组和第2组的原代T细胞注入小鼠中(实验组)。作为对照，将单独第1组的原代T细胞或缓冲液注入小鼠中(第1对照组和第2对照组)。下表5提供了关于细胞注入的几个参数。辐照NPG小鼠，并将一定数量的CAR T细胞和相应的对照剂注入小鼠中。对于第2对照组，将缓冲液连续返回给小鼠三次。对于第1对照组，不表达抗原的T细胞连续返回三次。对于实验组，表达抗原的T细胞连续输注三次。输注完成之后，收集来自角膜缘静脉的血液以分析小鼠外周血中的T细胞和因子释放。然后处死小鼠，并收集每个器官的T比率/CAR T细胞比率/CAR T拷贝和其他数据。然后进行细胞因子释放测定。对于实验组和对照组，测量了小鼠外周血中的各种细胞因子(例如，IFNg、IL4、IL2)。如图47-49所示，实验组中释放的细胞因子量大于对照组。这些结果表明，注入表达抗原的细胞可增强相应的CAR T细胞的T细胞应答。下表6提供了体内分析的时间表。
表5
表6
如上所述，本文描述的治疗方法可以容易地适用于其他物种或受试者，诸如人类。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指示以引用的方式并入。尽管已根据各种实施方案描述了前述内容，但是本领域技术人员将理解，可以在不脱离其精神的情况下进行各种修改、替换、省略和改变。
序列表
<110> 上海斯丹赛生物技术有限公司
<120> 嵌合抗原受体细胞的制备及其用途
<130> I180334PCT
<150> US62,513,781
<151> 2017-06-01
<150> US62,527,649
<151> 2017-06-30
<150> US62,527,140
<151> 2017-06-30
<150> US62,598,024
<151> 2017-12-13
<150> US62,640,523
<151> 2018-03-08
<160> 96
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 60
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tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 180
agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac a 231
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<212> DNA
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atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcccggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc ccacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240
gtacccgagc cgatgactta ctggcgggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300
tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360
atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420
cctcatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480
ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540
agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600
acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660
cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720
ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780
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cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900
aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960
cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020
ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 3399
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg 360
ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg 420
ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtaca 480
catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg 540
acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aatatggcca caaccatgca gatcccacag 600
gcgccctggc cagtcgtctg ggcggtgcta caactgggct ggcggccagg atggttctta 660
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<210> 10
<211> 9354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 2280
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<210> 13
<211> 11052
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg 1500
acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 1560
ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 1620
cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 1680
gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 1740
catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 1800
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 1860
aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 1920
acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt 1980
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 2040
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 2100
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 2160
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 2220
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 2280
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 2340
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 2400
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agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 2880
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 2940
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 3000
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tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt 4260
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ggagcagctg cggccctcct tcctactcag ctctctgagg cccagcctga ctggcgctcg 7500
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ctggcaggtg tacggcttcg tgcgggcctg cctgcgccgg ctggtgcccc caggcctctg 7860
gggctccagg cacaacgaac gccgcttcct caggaacacc aagaagttca tctccctggg 7920
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gcgggagctg tcggaagcag aggtcaggca gcatcgggaa gccaggcccg ccctgctgac 8280
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ctctgtgctg ggcctggacg atatccacag ggcctggcgc accttcgtgc tgcgtgtgcg 8520
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agccaacccg gcactgccct cagacttcaa gaccatcctg gactgatcta gaggcgcgcc 9840
<210> 16
<211> 9354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg 60
cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga 120
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ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtaca 480
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acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aatatggcca caaccatgca gatcccacag 600
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ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggga cgtacccaat tcgccctata 1320
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<210> 19
<211> 7914
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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cggaggagga ggatcccagg tgcagctgca gcagagcgga ccaggactgg tgaagccctc 6900
ccagaccctg tctctgacat gtgccatcag cggcgattcc gtgagctcca acagcgccgc 6960
ctggaattgg atccggcagt ctcccagcag aggactggag tggctgggaa ggacctacta 7020
tcgctccaag tggtacaacg attatgccgt gtctgtgaag agccggatca ccatcaaccc 7080
tgacacatct aagaatcagt tcagcctgca gctgaattcc gtgaccccag aggacacagc 7140
cgtgtactat tgtgcaaggg aggtgaccgg cgacctggag gatgcctttg acatctgggg 7200
ccagggcacc atggtgacag tgtctagcac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc 7260
ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc 7320
ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc 7380
cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg 7440
gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac 7500
tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact 7560
gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct 7620
ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agaggcgtgg 7680
ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa 7740
tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg 7800
ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac 7860
ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa tctagaggcg cgcc 7914
<210> 20
<211> 7899
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtcgacacta gtaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 60
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 120
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 180
tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 240
gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 300
ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 360
ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 420
ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 480
ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 540
cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 600
cctgccgcgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga 660
tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag 720
acaagatctg ctttttgctt gtactgagtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga 780
gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct 840
tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt 900
ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt 960
ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa 1020
tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 1080
ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc 1140
ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 1200
catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 1260
ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggga cgtacccaat tcgccctata 1320
gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 1380
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 1440
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg 1500
acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 1560
ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 1620
cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 1680
gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 1740
catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 1800
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 1860
aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 1920
acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt 1980
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 2040
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 2100
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 2160
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 2220
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 2280
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 2340
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 2400
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 2460
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 2520
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 2580
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 2640
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 2700
aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 2760
tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggctctcgcg gtatcattgc 2820
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 2880
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 2940
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 3000
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 3060
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 3120
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 3180
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 3240
cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 3300
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 3360
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 3420
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 3480
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 3540
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 3600
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 3660
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 3720
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 3780
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 3840
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 3900
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 3960
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 4020
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 4080
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa ttaaccctca 4140
ctaaagggaa caaaagctgg agctgcaagc ttaatgtagt cttatgcaat actcttgtag 4200
tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt 4260
gcatgccgat tggtggaagt aaggtggtac gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg 4320
ggtctgacat ggattggacg aaccactgaa ttgccgcatt gcagagatat tgtatttaag 4380
tgcctagctc gatacataaa cggctctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 4440
tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 4500
gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 4560
tcagtgtgga aaatctctag cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac 4620
cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg 4680
ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg 4740
ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt 4800
taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc 4860
tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac 4920
tgggacagct acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata 4980
cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt 5040
tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg 5100
atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat 5160
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ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct 5340
ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg 5400
caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac 5460
ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact 5520
gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg 5580
acctggatgg agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt 5640
gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg 5700
gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata 5760
atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat 5820
agagttaggc agggatattc accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga 5880
cccgacaggc ccgaaggaat agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt 5940
cgattagtga acggatctcg acggtatcga tcacgagact agcctcgaca caaatggcag 6000
tattcatcca caattttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa 6060
tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa 6120
ttcaaaattt tcgggtttat tacagggaca gcagaaatcc actttggctc gagaagcttg 6180
atatcggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 6240
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 6300
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 6360
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggatc 6420
cgccaccatg gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc 6480
cgccaggccg cggatcgtga tgacccagtc tccaggcaca ctgtctgtga gcccaggaga 6540
gaccgccaca ctgtcctgcc gggcctccca gtctttcagc aacatgctgg cctggtacca 6600
gcagaagtcc ggccagcccc ctagactgct gatctatggc gtgtctacca gggcagcagg 6660
agtgccagca agattctccg gatctggaag cggcacagag tttaccctga caatctccaa 6720
tctgcagtct gaggacttcg ccgtgtacta ttgccagcag tacggcgatt ggcctaggta 6780
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atccggcggc ggcggctctg aggtgcagct ggtgcagagc ggaggaggag tggtgaggcc 6900
tggaggatct ctgcgcctgc catgtgcagc aagcggcttc acctttgacg attacggaat 6960
gagctgggtg aggcaggcac caggcaaggg actggagtgg gtgtccggca tcaactggaa 7020
tggaggaagc accggatacg cagactccgt gaagggccgg ttcacaatct ctagagataa 7080
cgccaagaat agcctgtatc tgcagatgaa ctccctgatc gccgaggaca ccgccctgta 7140
ccactgtgca aggggaggcg actatgatgc ctttgatatc tggggccagg gcaccatggt 7200
gacagtgagc tccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc 7260
gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca 7320
cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg 7380
tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact 7440
cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg 7500
ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag 7560
caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa 7620
tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagagg cgtggccggg accctgagat 7680
ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga 7740
taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg 7800
gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca 7860
catgcaggcc ctgccccctc gctaatctag aggcgcgcc 7899
<210> 21
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 22
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr
20 25 30
Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu
210 215 220
Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly
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<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His
1 5 10 15
Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala
20 25 30
Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe
35 40 45
Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg
50 55 60
Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg
100 105 110
Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser
115 120 125
Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn
130 135 140
Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly
145 150 155 160
Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys
165 170 175
Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly
180 185 190
Glu Ile Asn Phe
195
<210> 24
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His
1 5 10 15
Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala
20 25 30
Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe
35 40 45
Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg
50 55 60
Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Lys Glu Asn Gln Thr Arg
100 105 110
Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser
115 120 125
Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn
130 135 140
Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Lys Thr Asn Cys Asn Gly
145 150 155 160
Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys
165 170 175
Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly
180 185 190
Glu Ile Asn Phe
195
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Trp Arg Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
His Lys Trp Val Leu Arg Gln
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Cys Pro Ser Asn Leu Arg Arg
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gactttgcat gtgca 15
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Glu Arg Gly Thr Leu Ala Arg
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Thr Ser Gly Ala Leu Thr Arg
1 5
<210> 33
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gttgctccag gcc 13
<210> 34
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His
20 25 30
Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro
35 40 45
Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu
50 55 60
Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg
65 70 75 80
Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser
85 90 95
Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg
100 105 110
Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Lys Phe Leu Gly Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu
130 135 140
Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys
165 170 175
Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val
180 185 190
Gln Gly Tyr Ala Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val
210 215 220
Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn
245 250 255
Thr Trp Thr Leu Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu
260 265 270
Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn
275 280 285
Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser
290 295 300
Ser Met Gln Ser Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser
305 310 315 320
Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly
325 330 335
Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr
340 345 350
Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln
355 360 365
Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala
370 375 380
<210> 35
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 36
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 37
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 38
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 39
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 40
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 41
<211> 272
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr
20 25 30
Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu
210 215 220
Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys
260 265 270
<210> 42
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Ile Ser Ser Met Asp Met Glu Arg Pro Gly Asp Gly Lys Cys Gln Pro
1 5 10 15
Ile Glu Ile Pro Met Cys Lys Asp Ile Gly Tyr Asn Met Thr Arg Met
20 25 30
Pro Asn Leu Met Gly His Glu Asn Gln Arg Glu Ala Ala Ile Gln Leu
35 40 45
His Glu Phe Ala Pro Leu Val Glu Tyr Gly Cys His Gly His Leu Arg
50 55 60
Phe Phe Leu Cys Ser Leu Tyr Ala Pro Met Cys Thr Glu Gln Val Ser
65 70 75 80
Thr Pro Ile Pro Ala Cys Arg Val Met Cys Glu Gln Ala Arg Leu Lys
85 90 95
Cys Ser Pro Ile Met Glu Gln Phe Asn Phe Lys Trp Pro Asp Ser Leu
100 105 110
Asp Cys Arg Lys Leu Pro Asn Lys Asn Asp Pro Asn Tyr Leu Cys Met
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Asn Gly Ser Asp Glu Pro Thr Arg Gly Ser Gly Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Leu Phe Arg Pro Gln Arg Pro His Ser Ala Gln Glu His
145 150 155 160
Pro Leu Lys Asp Gly Gly Pro Gly Arg Gly Gly Cys Asp Asn Pro Gly
165 170 175
Lys Phe His His Val Glu Lys Ser Ala Ser Cys Ala Pro Leu Cys Thr
180 185 190
Pro Gly Val Asp Val Tyr Trp Ser Arg Glu Asp Lys Arg
195 200 205
<210> 43
<211> 393
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His Gln Glu Glu Asp
1 5 10 15
Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro
20 25 30
Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu Arg Thr Ile Pro
35 40 45
Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser
50 55 60
Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu
65 70 75 80
Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr
85 90 95
Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Gly
100 105 110
Ile Phe Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu Thr Lys Val Tyr
115 120 125
Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met
130 135 140
Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys Asn Glu Thr Leu
145 150 155 160
Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val Gln Gly Tyr Ala
165 170 175
Phe Asn Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn Lys Asn Lys Tyr
180 185 190
Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val Tyr Ser Gly Pro
195 200 205
Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala Leu Pro Ser Lys
210 215 220
Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn Thr Trp Thr Leu
225 230 235 240
Lys Lys Leu Pro Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu Thr Arg Ala Asp
245 250 255
Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn Gln Lys Lys Ile
260 265 270
Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser Ser Met Gln Ser
275 280 285
Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser Pro Leu His Gln
290 295 300
Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly Tyr Lys Glu Lys
305 310 315 320
Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr Tyr Val Phe Phe
325 330 335
Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln Glu Leu Lys Asn
340 345 350
Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His Tyr Asp Tyr Thr
355 360 365
Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro Lys Ser Asp Glu
370 375 380
Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly
385 390
<210> 44
<211> 210
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Gln Leu Pro Pro Gly Lys Pro Glu Ile Phe Lys Cys Arg Ser Pro Asn
1 5 10 15
Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp Arg Pro Gly Thr Asp Gly Gly Leu
20 25 30
Pro Thr Asn Tyr Ser Leu Thr Tyr His Arg Glu Gly Glu Thr Leu Met
35 40 45
His Glu Cys Pro Asp Tyr Ile Thr Gly Gly Pro Asn Ser Cys His Phe
50 55 60
Gly Lys Gln Tyr Thr Ser Met Trp Arg Thr Tyr Ile Met Met Val Asn
65 70 75 80
Ala Thr Asn Gln Met Gly Ser Ser Phe Ser Asp Glu Leu Tyr Val Asp
85 90 95
Val Thr Tyr Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Leu Glu Leu Ala Val Glu
100 105 110
Val Lys Gln Pro Glu Asp Arg Lys Pro Tyr Leu Trp Ile Lys Trp Ser
115 120 125
Pro Pro Thr Leu Ile Asp Leu Lys Thr Gly Trp Phe Thr Leu Leu Tyr
130 135 140
Glu Ile Arg Leu Lys Pro Glu Lys Ala Ala Glu Trp Glu Ile His Phe
145 150 155 160
Ala Gly Gln Gln Thr Glu Phe Lys Ile Leu Ser Leu His Pro Gly Gln
165 170 175
Lys Tyr Leu Val Gln Val Arg Cys Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser
180 185 190
Ala Trp Ser Pro Ala Thr Phe Ile Gln Ile Pro Ser Asp Phe Thr Met
195 200 205
Asn Asp
210
<210> 45
<211> 660
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Glu Gln Asp Leu Ser Val Asn Arg Ala Val Trp Asp Gly Gly Gly Cys
1 5 10 15
Ile Ser Gln Gly Asp Val Leu Asn Arg Gln Cys Gln Gln Leu Ser Gln
20 25 30
His Val Arg Thr Gly Ser Ala Ala Asn Thr Ala Thr Gly Thr Thr Ser
35 40 45
Thr Asn Val Val Glu Pro Arg Met Tyr Leu Ser Cys Ser Thr Asn Pro
50 55 60
Glu Met Thr Ser Ile Glu Ser Ser Val Thr Ser Asp Thr Pro Gly Val
65 70 75 80
Ser Ser Thr Arg Met Thr Pro Thr Glu Ser Arg Thr Thr Ser Glu Ser
85 90 95
Thr Ser Asp Ser Thr Thr Leu Phe Pro Ser Ser Thr Glu Asp Thr Ser
100 105 110
Ser Pro Thr Thr Pro Glu Gly Thr Asp Val Pro Met Ser Thr Pro Ser
115 120 125
Glu Glu Ser Ile Ser Ser Thr Met Ala Phe Val Ser Thr Ala Pro Leu
130 135 140
Pro Ser Phe Glu Ala Tyr Thr Ser Leu Thr Tyr Lys Val Asp Met Ser
145 150 155 160
Thr Pro Leu Thr Thr Ser Thr Gln Ala Ser Ser Ser Pro Thr Thr Pro
165 170 175
Glu Ser Thr Thr Ile Pro Lys Ser Thr Asn Ser Glu Gly Ser Thr Pro
180 185 190
Leu Thr Ser Met Pro Ala Ser Thr Met Lys Val Ala Ser Ser Glu Ala
195 200 205
Ile Thr Leu Leu Thr Thr Pro Val Glu Ile Ser Thr Pro Val Thr Ile
210 215 220
Ser Ala Gln Ala Ser Ser Ser Pro Thr Thr Ala Glu Gly Pro Ser Leu
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ala Pro Ser Gly Gly Ser Thr Pro Leu Thr Arg Met Pro
245 250 255
Leu Ser Val Met Leu Val Val Ser Ser Glu Ala Ser Thr Leu Ser Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Ala Thr Asn Ile Pro Val Ile Thr Ser Thr Glu Ala Ser
275 280 285
Ser Ser Pro Thr Thr Ala Glu Gly Thr Ser Ile Pro Thr Ser Thr Tyr
290 295 300
Thr Glu Gly Ser Thr Pro Leu Thr Ser Thr Pro Ala Ser Thr Met Pro
305 310 315 320
Val Ala Thr Ser Glu Met Ser Thr Leu Ser Ile Thr Pro Val Asp Thr
325 330 335
Ser Thr Leu Val Thr Thr Ser Thr Glu Pro Ser Ser Leu Pro Thr Thr
340 345 350
Ala Glu Ala Thr Ser Met Leu Thr Ser Thr Leu Ser Glu Gly Ser Thr
355 360 365
Pro Leu Thr Asn Met Pro Val Ser Thr Ile Leu Val Ala Ser Ser Glu
370 375 380
Ala Ser Thr Thr Ser Thr Ile Pro Val Asp Ser Lys Thr Phe Val Thr
385 390 395 400
Thr Ala Ser Glu Ala Ser Ser Ser Pro Thr Thr Ala Glu Asp Thr Ser
405 410 415
Ile Ala Thr Ser Thr Pro Ser Glu Gly Ser Thr Pro Leu Thr Ser Met
420 425 430
Pro Val Ser Thr Thr Pro Val Ala Ser Ser Glu Ala Ser Asn Leu Ser
435 440 445
Thr Thr Pro Val Asp Ser Lys Thr Gln Val Thr Thr Ser Thr Glu Ala
450 455 460
Ser Ser Ser Pro Pro Thr Ala Glu Val Asn Ser Met Pro Thr Ser Thr
465 470 475 480
Pro Ser Glu Gly Ser Thr Pro Leu Thr Ser Met Ser Val Ser Thr Met
485 490 495
Pro Val Ala Ser Ser Glu Ala Ser Thr Leu Ser Thr Thr Pro Val Asp
500 505 510
Thr Ser Thr Pro Val Thr Thr Ser Ser Glu Ala Ser Ser Ser Ser Thr
515 520 525
Thr Pro Glu Gly Thr Ser Ile Pro Thr Ser Thr Pro Ser Glu Gly Ser
530 535 540
Thr Pro Leu Thr Asn Met Pro Val Ser Thr Arg Leu Val Val Ser Ser
545 550 555 560
Glu Ala Ser Thr Thr Ser Thr Thr Pro Ala Asp Ser Asn Thr Phe Val
565 570 575
Thr Thr Ser Ser Glu Ala Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ala Glu Gly Thr
580 585 590
Ser Met Pro Thr Ser Thr Tyr Ser Glu Arg Gly Thr Thr Ile Thr Ser
595 600 605
Met Ser Val Ser Thr Thr Leu Val Ala Ser Ser Glu Ala Ser Thr Leu
610 615 620
Ser Thr Thr Pro Val Asp Ser Asn Thr Pro Val Thr Thr Ser Thr Glu
625 630 635 640
Ala Thr Ser Ser Ser Thr Thr Ala Glu Gly Thr Ser Met Pro Thr Ser
645 650 655
Thr Tyr Thr Glu
660
<210> 46
<211> 407
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu
20 25 30
Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn
35 40 45
Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly
50 55 60
Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala Gln Arg Met Gly Cys Val Leu
85 90 95
Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr
100 105 110
Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys
115 120 125
Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu
130 135 140
Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys
145 150 155 160
Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr
165 170 175
Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr
180 185 190
Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu
195 200 205
Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile
210 215 220
Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala
225 230 235 240
Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln
245 250 255
Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu
260 265 270
Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser
275 280 285
Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn
290 295 300
Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly
305 310 315 320
Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr
325 330 335
Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val
340 345 350
Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr
355 360 365
Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val
370 375 380
Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp
385 390 395 400
Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gln
405
<210> 47
<211> 264
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiensHomo sapiens)
<400> 47
Pro Arg Phe Met Gly Thr Ile Ser Asp Val Lys Thr Asn Val Gln Leu
1 5 10 15
Leu Lys Gly Arg Val Asp Asn Ile Ser Thr Leu Asp Ser Glu Ile Lys
20 25 30
Lys Asn Ser Asp Gly Met Glu Ala Ala Gly Val Gln Ile Gln Met Val
35 40 45
Asn Glu Ser Leu Gly Tyr Val Arg Ser Gln Phe Leu Lys Leu Lys Thr
50 55 60
Ser Val Glu Lys Ala Asn Ala Gln Ile Gln Ile Leu Thr Arg Ser Trp
65 70 75 80
Glu Glu Val Ser Thr Leu Asn Ala Gln Ile Pro Glu Leu Lys Ser Asp
85 90 95
Leu Glu Lys Ala Ser Ala Leu Asn Thr Lys Ile Arg Ala Leu Gln Gly
100 105 110
Ser Leu Glu Asn Met Ser Lys Leu Leu Lys Arg Gln Asn Asp Ile Leu
115 120 125
Gln Val Val Ser Gln Gly Trp Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Tyr Tyr
130 135 140
Phe Ser Leu Ile Pro Lys Thr Trp Tyr Ser Ala Glu Gln Phe Cys Val
145 150 155 160
Ser Arg Asn Ser His Leu Thr Ser Val Thr Ser Glu Ser Glu Gln Glu
165 170 175
Phe Leu Tyr Lys Thr Ala Gly Gly Leu Ile Tyr Trp Ile Gly Leu Thr
180 185 190
Lys Ala Gly Met Glu Gly Asp Trp Ser Trp Val Asp Asp Thr Pro Phe
195 200 205
Asn Lys Val Gln Ser Val Arg Phe Trp Ile Pro Gly Glu Pro Asn Asn
210 215 220
Ala Gly Asn Asn Glu His Cys Gly Asn Ile Lys Ala Pro Ser Leu Gln
225 230 235 240
Ala Trp Asn Asp Ala Pro Cys Asp Lys Thr Phe Leu Phe Ile Cys Lys
245 250 255
Arg Pro Tyr Val Pro Ser Glu Pro
260
<210> 48
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala
115 120 125
Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
130 135 140
Gly Phe Asn Ile Asn Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro
145 150 155 160
Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn
165 170 175
Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp
180 185 190
Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ser Arg Phe
210 215 220
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
225 230 235
<210> 49
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu
85 90 95
Gly Ile Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Gln Ser Leu Lys
130 135 140
Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Asp Asn Trp Ile Gly
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile
165 170 175
Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln
180 185 190
Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp
195 200 205
Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Gly Leu
210 215 220
Asp Trp Asn Tyr Asn Pro Leu Arg Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 50
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Gly Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gly
85 90 95
Glu Leu Pro Pro Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 51
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Glu Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr
165 170 175
Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr
210 215 220
Gly Thr Asn Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 52
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Thr Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Ala Val Phe Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Arg
165 170 175
Gly Asn Thr Asn Asp Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ala Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Gly Tyr Thr
210 215 220
Tyr Gly Asn Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 53
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Arg Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gln Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
130 135 140
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Tyr Asn Glu Asn
180 185 190
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala
195 200 205
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Thr Tyr Tyr Asn Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ala
245
<210> 54
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His
1 5 10 15
Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala
20 25 30
Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe
35 40 45
Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg
50 55 60
Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Gly Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg
100 105 110
Asn Lys His Leu Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser
115 120 125
Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn
130 135 140
Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly
145 150 155 160
Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys
165 170 175
Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly
180 185 190
Glu Ile Asn Phe
195
<210> 55
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
195 200 205
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 56
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu
20 25 30
Ser Ser Glu Met Phe Ser Glu Phe Asp Lys Arg Tyr Thr His Gly Arg
35 40 45
Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His Thr Ser Ser Leu Ala
50 55 60
Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln Ala Gln Gln Met Asn Gln Lys Asp Phe
65 70 75 80
Leu Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Arg Ser Trp Asn Glu Pro Leu Tyr
85 90 95
His Leu Val Thr Glu Val Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile
100 105 110
Leu Ser Lys Ala Val Glu Ile Glu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Leu Glu
115 120 125
Gly Met Glu Leu Ile Val Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn
130 135 140
Glu Ile Tyr Pro Val Trp Ser Gly Leu Pro Ser Leu Gln Met Ala Asp
145 150 155 160
Glu Glu Ser Arg Leu Ser Ala Tyr Tyr Asn Leu Leu His Cys Leu Arg
165 170 175
Arg Asp Ser His Lys Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg
180 185 190
Ile Ile His Asn Asn Asn Cys
195
<210> 57
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
130 135 140
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
145 150 155 160
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
210 215 220
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 58
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Met Asn Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Gly Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Glu Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ala
35 40 45
Ile Asp Ala Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser
85 90 95
Arg Pro Gln Val Asp Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met
130 135 140
Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Leu Ile Phe Pro Ser Cys Val
145 150 155 160
Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro
165 170 175
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Thr
180 185 190
Ser Asn Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
195 200 205
Trp Met Gly Val Ile Trp Ser Asn Gly Asp Ala Asp Tyr Asn Ser Ala
210 215 220
Ile Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
225 230 235 240
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe
245 250 255
Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Phe Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
260 265 270
Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
275 280
<210> 59
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val
20 25 30
Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
35 40 45
Ser Ile Ser Ser His Asp Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Ser Lys Asp Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Leu Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile
145 150 155 160
Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
165 170 175
Val Gln Pro Gly Arg Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
180 185 190
Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys
195 200 205
Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Thr Tyr
210 215 220
Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala
225 230 235 240
Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
245 250 255
Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe
260 265 270
Asp Phe Trp Gly Pro Gly Ile Met Val Thr Val Ser Ser
275 280 285
<210> 60
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Cys Glu Asn Cys
100
<210> 61
<211> 371
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn
20 25 30
Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro
35 40 45
Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln
50 55 60
Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu
85 90 95
Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln
100 105 110
Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val
115 120 125
Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu
130 135 140
Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr
145 150 155 160
Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val
165 170 175
Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu
180 185 190
Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr
195 200 205
Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys
210 215 220
Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg
225 230 235 240
Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His
245 250 255
Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu
260 265 270
Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn
275 280 285
Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu
290 295 300
Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu
305 310 315 320
Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu
325 330 335
Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln
340 345 350
Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro
355 360 365
Val Gln Pro
370
<210> 62
<211> 348
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
Arg Leu Ser Trp Tyr Asp Pro Asp Phe Gln Ala Arg Leu Thr Arg Ser
1 5 10 15
Asn Ser Lys Cys Gln Gly Gln Leu Glu Val Tyr Leu Lys Asp Gly Trp
20 25 30
His Met Val Cys Ser Gln Ser Trp Gly Arg Ser Ser Lys Gln Trp Glu
35 40 45
Asp Pro Ser Gln Ala Ser Lys Val Cys Gln Arg Leu Asn Cys Gly Val
50 55 60
Pro Leu Ser Leu Gly Pro Phe Leu Val Thr Tyr Thr Pro Gln Ser Ser
65 70 75 80
Ile Ile Cys Tyr Gly Gln Leu Gly Ser Phe Ser Asn Cys Ser His Ser
85 90 95
Arg Asn Asp Met Cys His Ser Leu Gly Leu Thr Cys Leu Glu Pro Gln
100 105 110
Lys Thr Thr Pro Pro Thr Thr Arg Pro Pro Pro Thr Thr Thr Pro Glu
115 120 125
Pro Thr Ala Pro Pro Arg Leu Gln Leu Val Ala Gln Ser Gly Gly Gln
130 135 140
His Cys Ala Gly Val Val Glu Phe Tyr Ser Gly Ser Leu Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ile Ser Tyr Glu Ala Gln Asp Lys Thr Gln Asp Leu Glu Asn Phe Leu
165 170 175
Cys Asn Asn Leu Gln Cys Gly Ser Phe Leu Lys His Leu Pro Glu Thr
180 185 190
Glu Ala Gly Arg Ala Gln Asp Pro Gly Glu Pro Arg Glu His Gln Pro
195 200 205
Leu Pro Ile Gln Trp Lys Ile Gln Asn Ser Ser Cys Thr Ser Leu Glu
210 215 220
His Cys Phe Arg Lys Ile Lys Pro Gln Lys Ser Gly Arg Val Leu Ala
225 230 235 240
Leu Leu Cys Ser Gly Phe Gln Pro Lys Val Gln Ser Arg Leu Val Gly
245 250 255
Gly Ser Ser Ile Cys Glu Gly Thr Val Glu Val Arg Gln Gly Ala Gln
260 265 270
Trp Ala Ala Leu Cys Asp Ser Ser Ser Ala Arg Ser Ser Leu Arg Trp
275 280 285
Glu Glu Val Cys Arg Glu Gln Gln Cys Gly Ser Val Asn Ser Tyr Arg
290 295 300
Val Leu Asp Ala Gly Asp Pro Thr Ser Arg Gly Leu Phe Cys Pro His
305 310 315 320
Gln Lys Leu Ser Gln Cys His Glu Leu Trp Glu Arg Asn Ser Tyr Cys
325 330 335
Lys Lys Val Phe Val Thr Cys Gln Asp Pro Asn Pro
340 345
<210> 63
<211> 7902
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gtcgacacta gtaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 60
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 120
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 180
tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 240
gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 300
ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 360
ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 420
ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 480
ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 540
cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 600
cctgccgcgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga 660
tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag 720
acaagatctg ctttttgctt gtactgagtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga 780
gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct 840
tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt 900
ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt 960
ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa 1020
tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 1080
ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc 1140
ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 1200
catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 1260
ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggga cgtacccaat tcgccctata 1320
gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 1380
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 1440
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg 1500
acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 1560
ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 1620
cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 1680
gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 1740
catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 1800
gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 1860
aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 1920
acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt 1980
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 2040
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 2100
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 2160
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 2220
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 2280
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 2340
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 2400
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 2460
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 2520
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 2580
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 2640
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 2700
aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 2760
tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggctctcgcg gtatcattgc 2820
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 2880
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 2940
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 3000
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 3060
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 3120
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 3180
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 3240
cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 3300
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 3360
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 3420
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 3480
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 3540
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 3600
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 3660
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 3720
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 3780
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 3840
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 3900
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 3960
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 4020
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 4080
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa ttaaccctca 4140
ctaaagggaa caaaagctgg agctgcaagc ttaatgtagt cttatgcaat actcttgtag 4200
tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt 4260
gcatgccgat tggtggaagt aaggtggtac gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg 4320
ggtctgacat ggattggacg aaccactgaa ttgccgcatt gcagagatat tgtatttaag 4380
tgcctagctc gatacataaa cggctctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 4440
tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 4500
gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 4560
tcagtgtgga aaatctctag cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac 4620
cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg 4680
ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg 4740
ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt 4800
taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc 4860
tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac 4920
tgggacagct acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata 4980
cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt 5040
tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg 5100
atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat 5160
aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg 5220
cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca 5280
ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct 5340
ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg 5400
caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac 5460
ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact 5520
gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg 5580
acctggatgg agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt 5640
gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg 5700
gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata 5760
atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat 5820
agagttaggc agggatattc accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga 5880
cccgacaggc ccgaaggaat agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt 5940
cgattagtga acggatctcg acggtatcga tcacgagact agcctcgaca caaatggcag 6000
tattcatcca caattttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa 6060
tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa 6120
ttcaaaattt tcgggtttat tacagggaca gcagaaatcc actttggctc gagaagcttg 6180
atatcggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 6240
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 6300
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 6360
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggatc 6420
cgccaccatg gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc 6480
cgccaggccg gatatccaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggtga 6540
tcgcgtgacc attacctgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca 6600
gcagaaaccg ggtaaagcgc cgaaactgtt aatttatcat acatcaagat tacactcagg 6660
cgtgccgtcg cgttttagcg gctcgggttc gggcaccgat tttaccctga ccatctcgag 6720
cttgcagccg gaggacttcg ccacctacta ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac 6780
gttcggtcag ggcaccaaag tggagatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc 6840
gggtggcggc ggatctgagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg 6900
ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggagtgtcc ctgcctgatt atggcgtgtc 6960
ctgggtccgc caggctccag ggaaggggct ggagtgggtt tcagtgatct ggggcagcga 7020
gacaacctac tacaacagcg ccctgaagtc ccgattcacc atctccagag acaatgccaa 7080
gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg 7140
tgcgaagcac tactactacg gcggcagcta cgctatggac tactggggcc aaggaaccct 7200
ggtcaccgtg tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat 7260
cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt 7320
gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac 7380
ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa 7440
actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga 7500
tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt 7560
cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct 7620
caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag aggcgtggcc gggaccctga 7680
gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa 7740
agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa 7800
ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct 7860
tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaatc tagaggcgcg cc 7902
<210> 64
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr
65
<210> 65
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 66
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
50 55 60
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
65 70
<210> 67
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
50 55 60
Ser Leu Val Ile Thr
65
<210> 68
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
Ile Tyr
50
<210> 69
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
Ile Tyr
50
<210> 70
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 71
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 72
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 73
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr
<210> 74
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr
<210> 75
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Gln Trp Gly Thr Arg Tyr Arg
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Glu Arg Gly Thr Leu Ala Arg
1 5
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
gttgctccag gccacagca 19
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Trp Arg Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Gln Ser Gly Ser Leu Thr Arg
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Asp Arg Ser Asn Leu Thr Arg
1 5
<210> 85
<211> 12
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
gactttgcat gt 12
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
His Lys Trp Val Leu Arg Gln
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Thr Ser Gly Ala Leu Thr Arg
1 5
<210> 88
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln
85 90 95
Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 89
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Met Asn Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Gly Gly Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Glu Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ala
35 40 45
Ile Asp Ala Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser
85 90 95
Arg Pro Gln Val Asp Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 91
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Leu Ile Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu
35 40 45
Thr Ser Asn Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Val Ile Trp Ser Asn Gly Asp Ala Asp Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Ala Ile Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
Phe Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Phe Pro Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 92
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val
20 25 30
Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
35 40 45
Ser Ile Ser Ser His Asp Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Phe Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Asp Pro Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Ser Lys Asp Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Leu Lys
130
<210> 93
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Arg
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Lys Ser
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Glu Gln Tyr Ser Ser Trp Tyr Phe Asp Phe
115 120 125
Trp Gly Pro Gly Ile Met Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 94
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr Asn Ser Tyr Asn Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp
145 150 155 160
Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala His Ile Trp
165 170 175
Trp Asp Asp Asp Val Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Ile Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asp Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser
195 200 205
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Arg Ala
210 215 220
Thr Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 95
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr Asn Ser Tyr Asn Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Val Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asp Gln Val
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Arg Arg Ala Thr Gly Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (11)

1.一种方法，包括：
提供包含嵌合抗原受体（CAR）的细胞；
将编码CAR的核酸序列和编码hTERT或SV40LT或其组合的核酸序列引入所述细胞中，所述编码hTERT或SV40LT或其组合的核酸序列的表达由rtTA-TRE诱导型表达系统调节；
在一种试剂存在的情况下培养所述细胞以获得CAR细胞，所述试剂为CD19蛋白或TSHR-ECD的细胞外结构域，所述试剂结合CAR的细胞外结构域并介导包含CAR的细胞的应答；在存在所述试剂的情况下培养所述细胞时，表达CAR的细胞与不表达CAR的细胞的数量比大于当不存在所述试剂的情况下培养所述细胞时的比率；
并且将编码自杀基因的核酸序列引入所述CAR细胞中，所述自杀基因是HSV-TK系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在用所述试剂培养之后，所述试剂的量与所述CAR细胞的数量之比为1: 5000至1: 5（µg/104个细胞）。
3.根据权利要求1所述的方法，其中培养基中所述试剂的浓度为2至104 ng/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其中编码hTERT的所述核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的整合包括编码hTERT的所述核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的基因组整合和hTERT、编码SV40LT的核酸或其组合的组成型表达。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述CAR包含细胞外结构域、间隔域、跨膜结构域和细胞内结构域。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述CAR的间隔域包含SEQ ID NO: 68或69的氨基酸序列，或所述CAR的跨膜结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO: 72或75并且所述CAR的间隔域包含SEQ ID NO: 68的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞或自然杀伤（NK）细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中提供包含所述CAR的所述T细胞包括在将包含编码所述CAR的核酸序列的载体引入所述T细胞中之后，在不具有所述试剂的情况下培养所述T细胞至少8天，并且在所述试剂存在下培养所述T细胞包括在所述至少8天之后培养所述T细胞。
9.一种药物组合物，包含通过根据权利要求1-8中任一项所述的方法获得的所述CAR细胞。
10.一种修饰的T细胞，包含编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸或其组合，其中将编码hTERT的所述核酸序列或编码SV40LT的核酸或其组合整合到所述修饰的T细胞的基因组中，并且所述修饰的T细胞组成型表达hTERT、SV40LT或其组合；
编码hTERT的所述核酸序列、编码SV40LT的核酸或其组合的表达由诱导型表达系统调节，并且所述修饰的T细胞包含编码自杀基因的核酸序列，所述诱导型表达系统为rtTA-TRE诱导型表达系统，所述自杀基因是HSV-TK系统。
11.根据权利要求10所述的修饰的T细胞，其中：
所述修饰的T细胞还包含编码CAR的核酸序列；
所述修饰的T细胞能够抑制表达所述CAR结合的抗原的细胞；并且
所述CAR和编码hTERT或SV40LT的所述核酸序列或其组合被表达为作为分开的多肽的基因产物。
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