CN101215577A - 一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法。首先，通过DNA重组技术将具有广谱转化效应的细胞永生化基因——猿猴病毒40大T抗原(SV40T)基因定向插入逆转录病毒载体中，构建重组表达载体；然后，将重组载体与包装质粒pVSV－G共转染GP－293细胞，制备携带SV40T基因的重组泛嗜性逆转录病毒颗粒；所获得的重组泛嗜性逆转录病毒即为通用的整合型细胞永生化载体。该永生化载体能进入所有类型的动物细胞，并将所携带的SV40T基因整合到处于分裂期的靶细胞的基因组中，使其得到可遗传的、稳定的表达，从而保证了靶细胞的高效永生化转化。本发明为各种动物细胞的转基因永生化建系研究提供了一种有效的手段。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法；更具体地说，涉及一种由猿猴病毒40大T抗原(SV40T)基因和泛嗜性逆转录病毒载体构成的重组病毒的制备方法。
背景技术
在生命科学和生物技术领域中，对细胞系存在着广泛的需求。动物细胞的短期培养比较容易，但要建立永生细胞系则有相当的难度。将永生化基因导入体外培养的细胞中表达而诱导其获得无限增殖的能力，是当前普遍采用的一种建系手段。在此过程中，携带并表达永生化基因的载体称为细胞永生化载体。猿猴病毒40大T抗原(SV40T)基因能诱导众多类型细胞发生转化，是目前最为常用和有效的永生化基因之一，已广泛用于人类(杨梅英、叶常青、刘雷华，SV40T介导的人胎儿永生化气管成纤维细胞系的建立，癌变·畸变·突变，1999，11：22-24)、哺乳动物(高峰、田玉科、杨辉等，猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建，中华麻醉学杂志，2005，25：597-600)、昆虫(Tian Jian-xiao，Li Chang-you，Zheng Gui-ling，etal.A new cell clone derived from Trichopusia ni Tn5Bl-4 cells.Entomologia Sinica，2004，11：165-171)和甲壳动物(Tapay，L M，Lu，Y，Brock，J A，et al.Transformation of primary cultures of shrimp(Penaeus stylirostris)lymphoid(oak)organ with Simian virus-40(T)antigen.Proc Exp Biol Med，1995，209：73-78)等细胞的永生化研究中。SV40大T抗原的持续表达对成功诱导靶细胞的永生化表型至关重要。
迄今所使用的永生化载体有两种类型：I类是非整合型载体，II类是逆转录病毒载体；前者通过脂质体转染可进入任何类型的动物细胞，但是所携带的永生化基因只能核外暂时表达而导致永生化效率低下；后者则通过转导作用进入靶细胞，并与细胞基因组整合，从而保证了永生化基因在靶细胞内稳定表达，所以具有较高的永生化效率。然而，病毒侵入靶细胞需由特定的细胞表面受体介导，因此导致II类永生化载体对靶细胞具有选择性，从而限制了它的应用范围。
泛嗜性逆转录病毒载体(Pantropic retroviral vectors)是一类病毒外壳由粘性肺炎病毒外壳糖蛋白(VSV-G)组成的逆转录病毒载体。VSV-G通过与靶细胞的膜脂偶联以及膜融合介导病毒的侵入而无需通过细胞表面的特异蛋白受体介导。因此，泛嗜性逆转录病毒具有极其广泛的寄主范围(Burns，J C，Friedmann，T，Driever，W，et al.Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors：concentration to very high titer and efficient gene transfer intomammalian and nonmammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：8033-8037)，已成为基因转移系统的上佳选择。然而，迄今泛嗜性逆转录病毒载体尚未在细胞转基因永生化研究中得到应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，以克服现有永生化载体的上述缺陷，能较好地解决I类永生化载体的永生化效率低下和II类永生化载体的寄主范围狭窄的问题。
一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其步骤包括：(1)以猿猴病毒40基因组或携带有SV40大T抗原基因的质粒为模板，PCR扩增SV40T基因，SV40T基因序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示；(2)通过DNA重组技术将SV40T基因定向插入逆转录病毒载体的多克隆位点，构建携带SV40T基因的重组逆转录病毒载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体与包装质粒pVSV-G共转染GP-293细胞进行重组泛嗜性逆转录病毒包装，培养48-72小时后收获含有重组病毒颗粒的细胞上清液。
本发明制备的永生化载体的优点是：(1)寄主范围广泛，可进入任何类型的动物细胞；(2)永生化基因可整合到靶细胞基因组中，得到可遗传的、稳定的表达，从而保证了靶细胞的高效永生化转化；(3)具有广谱转化效应，适用于众多类型细胞的永生化研究。
附图说明
图1为一种通用的整合型细胞永生化载体的制备流程。
图2为重组逆转录病毒载体(pLXRN-SV40T)的酶切鉴定图谱。1、分子量标记；2双酶切后产生的载体片段(pLXRN，6.4kb)和SV40T基因片段(2.5kb)；3、重组逆转录病毒载体(pLXRN-SV40T)。
图3为重组泛嗜性逆转录病毒的透射电镜照片。×20000
具体实施方式
本发明所用的材料：含有SV40T基因(参见Genbank accession no：AF316139，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，大小2.5kb)的质粒pUC SV40-2895-1购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，该SV40T基因内部包含小T抗原编码序列(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示)；质粒pLXRN(6.4kb)、pVSV-G及GP-293细胞购自美国Clontech公司；NIH3T3细胞由中国海洋大学海洋药物研究所李静老师惠赠；限制性内切酶BamH I、Xho I及LA Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司，T4DNA连接酶购自美国Promega公司；DNA产物纯化试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天为时代公司；去内毒素质粒提取缓冲液购自北京博大泰克公司；DMEM培养基购自美国Gibco BRL公司；引物由上海生工生物工程公司合成。
通用的整合型细胞永生化载体的制备流程如图1所示。
1、PCR扩增SV40T基因
以pUCSV40-2895-1质粒为模板，PCR扩增SV40T基因。上游引物SP-5′CGGGATCCACCATGGATAAAGTTTTAAAC3′含BamHI酶切位点(以斜体表示)和起始密码子(以粗体表示)；下游引物AP-5′CCGCTCGAGTTATGTTTCAGGTTCAGGG3′含XhoI酶切位点(以斜体表示)和终止密码子(以粗体表示)。扩增反应体系为：50μl反应体系中含1×GC Buffer I，2.5mM Mg2+，400μM dNTP，0.5μM上/下游引物，0.1μg质粒模板，2.5U LA Taq酶；反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃1min，58℃1min，72℃3min共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测、DNA产物纯化试剂盒纯化后，-20℃保存。PCR产物纯化操作按照DNA产物纯化试剂盒使用说明进行，具体步骤如下：
1)向PCR产物中加入500μl结合液，充分混匀。
2)混合液加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
3)向吸附柱中加入700μl漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
4)向吸附柱中加入500μl漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液。
5)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，并将吸附柱于室温彻底晾干。
6)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl洗脱缓冲液，室温放置2分钟；12000rpm离心
1分钟收集DNA溶液。
2、重组表达载体的构建
用限制性内切酶BamH I和Xho I分别对载体pLXRN和纯化的SV40T基因进行双酶切反应。20ul酶切反应体系含：1×K Buffer，BamH I 12U，Xho I 10U，靶DNA分子1μg；37℃水浴3小时。酶切产物以1％琼脂糖凝胶电泳分离，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明回收SV40T片段和线性载体pLXRN，操作步骤如下：
1)在紫外灯下，用刀片从琼脂糖凝胶中切下目的条带，放入干净的离心管中，称取重量。
2)向胶块中加入3倍体积的溶胶液，50℃水浴10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
3)将上一步所得溶液加入吸附柱中，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
4)向吸附柱中加入700μl漂洗液，13000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5)向吸附柱中加入500μl漂洗液，13000rpm离心30秒，倒掉废液。将吸附柱放回收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，并将吸附柱置于室温彻底晾干。
6)将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl洗脱缓冲液，室温放置2分钟；13000rpm离心1分钟收集DNA溶液。
回收目的片段后，用T4DNA连接酶将插入片段和线性载体(摩尔比为3∶1，共约120ng)于16℃下连接过夜。10μl连接反应体系含：SV40T2μl(约17ng)，pLXRN 5μl(约100ng)，Ligase Buffer 1μl，T4连接酶0.33μl(1U)，双蒸水1.67μl。次日取5μl连接产物转化感受态细胞E.coliDH5α，涂布LB-Amp平板；37℃倒置培养15-18小时后，挑取Amp抗性单菌落于5ml LB液体培养基中，37℃、170rpm振荡培养过夜；TENS法抽提质粒，操作步骤如下：
1)TENS的配制：于100ml TE(pH7.6)中加入0.4g NaOH和0.5gSDS，充分溶解。
2)取1.5ml培养物于1.5ml EP管中，10000r/min离心10秒钟，弃上清。
3)漩涡震荡10秒钟，使菌体重悬，加入300μl TENS溶液，温和振荡5-10秒，静置至微粘稠。
4)加入150μl 3M NaAc(pH5.2)混匀，4℃下12000r/min离心10min。
5)取上清(约400μl)至另一EP管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃下静置10min，4℃下12000r/min离心10min。
6)弃上清，70％乙醇清洗两遍，自然干燥。
7)重悬沉淀于30μl TE中，加入1.5μl RNaseA(10mg/ml)混匀，-20℃保存。
对所制备的质粒进行BamH I/Xho I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳分析(图2)，并对阳性重组子进行测序验证，测序工作委托英骏生物技术有限公司进行。这样构建的重组载体命名为pLXRN-SV40T。
3、泛嗜性逆转录病毒的包装与滴度测定
振荡培养阳性重组子后，以下述方法抽提重组质粒pLXRN-SV40T。
1)溶液的配制。溶液I：葡萄糖1.982g，1M Tris-HCl(pH8.0)5ml，0.5M EDTA 4ml，双蒸水定容至200ml，高压灭菌15min，4℃保存；溶液II：1M NaOH 20ml，10％SDS 10ml，双蒸水定容至100ml，室温保存，现配现用；溶液III：5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸水定容至100ml，室温保存。
2)收集3ml菌液的沉淀于1.5ml Eppendorf离心管中，加入100μl溶液I，震荡至彻底悬浮。
3)加入200μl溶液II，立即温和颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管放置于冰上1-2分钟。
4)加入150μl溶液III，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12000rpm离心10分钟。
5)转移上清至另一EP管中，加入等体积的饱和酚混匀，室温下12000rpm离心5分钟。
6)小心吸取上清，转移至另一EP管中，勿将蛋白吸出。加入300μl去内毒素缓冲液抽提两次，12000rpm离心5分钟。
7)加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次，12000rpm离心5分钟。
8)转移上清至另一EP管中，加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃静置30min。
9)12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇清洗一次，自然干燥。
10)加TE(pH8.0)30μl，溶解沉淀；加RNaseA(10mg/ml)3.5μl，混匀。
11)紫外分光光度计检测质粒浓度约为40μg/ml，-20℃保存。
采用磷酸钙沉淀法将重组载体pLXRN-SV40T和包装质粒pVSV-G共转染GP-293细胞，包装重组泛嗜性逆转录病毒，操作步骤如下：
1)缓冲液的配制。2×HEPES缓冲盐溶液(HBS)：NaCl 1.600g，KCl 0.074g，Na2HP04.2H2O 0.027g，Glucose 0.200g，HEPES1.000g，加双蒸水至100ml，用0.5mol/L NaOH调pH值至7.05，0.22μm过滤除菌，-20℃保存；PBS缓冲液：KCl 0.42g，KH2P040.20g，NaCl 8.00g，Na2HP04.7H2O 2.16g，加三蒸水至1000mI，调pH值至7.2，高压灭菌，室温贮存。
2)转染前24小时，将GP-293以1-2×105cell/cm2的密度接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中37℃培养。
3)每转染一瓶单层细胞，需制备如下磷酸钙-DNA共沉淀物：将220μl DNA(110μl pLXRN-SV40T和110μl pVSV-G)与250μl2×HEPES缓冲盐溶液混于灭菌1.5ml EP管中，缓慢加入31μl2mol/L CaCl2，温和混合30秒左右。于室温温育30min，其间将形成细小沉淀。温育结束时，用吸液管将混合液吹打一次，使沉淀物复悬。
4)吸出培养GP-293细胞的DMEM培养液，将磷酸钙-DNA悬液加至细胞单层上，于室温下温育15min；然后再将原DMEM培养液加回到培养瓶中，37℃、CO2培养箱中继续培养24小时。
5)弃掉培养液，PBS清洗细胞单层一次，加入5ml预加温的新鲜培养液，放入培养箱中继续培养24小时。
6)收集培养液上清，0.45μm醋酸纤维膜过滤，分装后-80℃保存。另取1ml病毒液测定病毒滴度，测定方法如下：
1)在实验的前一天将NIH3T3接种于6孔板中，每孔细胞密度为0.5-1×105cell/cm2，置于CO2培养箱中37℃培养。
2)感染前，将病毒液作10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6倍稀释。除去NIH3T3的培养液，分别吸取1ml病毒稀释液，感染NIH3T3细胞，同时加入凝聚胺(polybrene)，使其终浓度为8μg/ml。
3)感染48小时后进行G418(400μg/ml)抗性筛选，筛选时间为1周。
4)按如下公式计算病毒滴度：病毒滴度(cfu/ml)＝最大稀释倍数的培养基中出现的克隆数目×稀释倍数
这样制备的泛嗜性逆转录病毒(图3)即为通用的整合型细胞永生化载体，它的滴度为4-10×106cfu/ml，适合于后续的细胞转基因永生化研究使用。
4、泛嗜性逆转录病毒的浓缩
如要制备更高滴度的病毒液，可将收获的病毒上清液于4℃下20,000rpm离心1.5小时，将所得沉淀溶于1/100至1/200倍原上清液体积的无血清DMEM培养基中，4℃静置3小时，重悬后分装，-80℃保存。这样制备的泛嗜性逆转录病毒的滴度可高达0.4-2×109cfu/ml。
SEQUENCE LISTING
<110>中国海洋大学
<120>一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法
<130>000
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>2127
<212>DNA
<213>猿猴病毒40(SV40)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2127)
<223>SV40大T抗原基因CDS
<400>1
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<211>2473
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<213>猿猴病毒40(SV40)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(2473)
<223>SV40大T抗原基因
<400>2
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ggctgagttt gctcaaagta ttcagagcag aattgtggag tggaaagaga gattggacaa 2160
agagtttagt ttgtcagtgt atcaaaaaat gaagtttaat gtggctatgg gaattggagt 2220
tttagattgg ctaagaaaca gtgatgatga tgatgaagac agccaggaaa atgctgataa 2280
aaatgaagat ggtggggaga agaacatgga agactcaggg catgaaacag gcattgattc 2340
acagtcccaa ggctcatttc aggcccctca gtcctcacag tctgttcatg atcataatca 2400
gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga 2460
acctgaaaca taa 2473
<210>3
<211>525
<212>DNA
<213>猿猴病毒40(SV40)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(525)
<223>SV40小t抗原基因
<400>3
atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60
aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120
tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180
aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240
actgaggtat ttgcttcttc cttaaatcct ggtgttgatg caatgtactg caaacaatgg 300
cctgagtgtg caaagaaaat gtctgctaac tgcatatgct tgctgtgctt actgaggatg 360
aagcatgaaa atagaaaatt atacaggaaa gatccacttg tgtgggttga ttgctactgc 420
ttcgattgct ttagaatgtg gtttggactt gatctttgtg aaggaacctt acttctgtgg 480
tgtgacataa ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaa 525
Claims (4)
1.一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其步骤包括：(1)以猿猴病毒40基因组或携带有SV40大T抗原基因的质粒为模板，PCR扩增SV40T基因，SV40T基因序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；(2)通过DNA重组技术将SV40T基因定向插入逆转录病毒载体的多克隆位点，构建携带SV40T基因的重组逆转录病毒载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体与包装质粒pVSV-G共转染GP-293细胞，培养48-72小时后收获含有重组病毒颗粒的细胞上清液。
2.按权利要求1所述的通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其特征在于所述步骤(1)、(2)中的SV40T基因序列的内部还可以包含如序列表中SEQ ID NO.3所示的SV40小T抗原基因序列；在此种情况下，SV40T基因序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
3.按权利要求1所述的通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的逆转录病毒载体为pLXRN、pLNHX、pLXSN、pLNCX、pLPCX、pLHCX、Retro-XTM Q Vector系列和MSCV Retroviral Vector系列中的任一逆转录病毒载体。
4.按权利要求1所述的通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其特征在于步骤(3)之后，还包括对所收获的含有重组病毒颗粒的细胞上清液进行超速离心而制备高滴度的病毒液。
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