CN114364704A

CN114364704A - 修饰的piggybac转座酶多肽、编码它们的多核苷酸、引入载体、试剂盒、将靶序列整合到细胞基因组中的方法以及生产细胞的方法

Info

Publication number: CN114364704A
Application number: CN202180005174.5A
Authority: CN
Inventors: 赤星英一; 野崎绘美; 石原美津子
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2022-04-15
Also published as: JP7419168B2; WO2021250966A1; US20220195401A1; JP2021193893A; JP2023171937A; EP4165174A1

Abstract

一般而言，根据一个实施方案，修饰的piggyBac转座酶多肽包括piggyBac转座酶氨基酸序列和核定位信号氨基酸序列。

Description

修饰的PIGGYBAC转座酶多肽、编码它们的多核苷酸、引入载体、试剂盒、将靶序列整合到细胞基因组中的方法以及生产细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请基于并要求2020年6月10日提交的日本专利申请第2020-101013号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

领域

本发明的实施方案涉及修饰的piggyBac转座酶多肽、编码它们的多核苷酸、引入载体、试剂盒、将靶序列整合到细胞基因组中的方法以及生产细胞的方法。

背景

转座子法作为将靶序列整合到细胞基因组中的方法受到关注。在转座子方法中，使用一种称为转座酶的酶。转座酶具有切除两端具有识别序列的靶序列并将该靶序列插入基因组的功能。例如，蛾衍生的piggyBac转座酶是已知的。

将靶序列整合到细胞基因组中的技术已应用于各种领域，例如转基因细胞、转基因动物的生产、基因治疗和再生医学。因此，对整合技术的效率和简化的需求日益增加。

附图简要说明

图1是示例第一实施方案的修饰的piggyBac转座酶的实例的图。

图2是示例实施方案的将靶序列整合到细胞基因组中的方法的实例的流程图。

图3是示例实施方案的供体DNA的实例的图。

图4也是示例使用实施方案的修饰的piggyBac转座酶将靶序列整合到细胞基因组中的过程的实例的示意图。

图5是示例实施方案的各引入载体的实例的剖视图。

图6是示例第二实施方案的修饰的piggyBac转座酶的实例的图。

图7是示例实施例5的实验结果的图表。

图8是示例实施例6的实验结果的图表。

图9是示例实施例7的实验结果的图表。

图10是示例实施例8的实验结果的图表。

实施方案的说明

在下文中，将参照附图描述实施方案。注意，在各实施方案中，对实质上相同的成分标注相同的附图标记，并省略其部分说明。附图为示意图，各部分的厚度与平面尺寸之间的关系、各部分的厚度比例等可能与实际有所不同。

根据实施方案，提供了修饰的piggyBac转座酶。当本文简称为“修饰的piggyBac转座酶”时，它指的是修饰的piggyBac转座酶多肽的形式。根据另一个实施方案，还可以提供编码修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸。

实施方案的修饰的piggyBac转座酶可用于例如将靶序列整合到细胞基因组中。因此，根据进一步的实施方案，还提供了使用修饰的piggyBac转座酶将靶序列整合到细胞基因组中的方法、其中使用的试剂盒以及生产细胞的方法。在下文中，将描述每个实施方案。

(第一实施方案)

-修饰的piggyBac转座酶

如图1所示，第一实施方案的修饰的piggyBac转座酶1包括核定位信号结构域2和piggyBac转座酶结构域3。在下文中，将核定位信号结构域2也称为“NLS结构域”，将piggyBac转座酶结构域3也称为“PB结构域”。

PB结构域3是包含piggyBac转座酶氨基酸序列的结构域。piggyBac转座酶是指来源于作为蛾类的毛毛虫(Trichoplushia ni)的转座酶或其衍生物。例如，可以使用表1所示的野生型piggyBac转座酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)作为PB结构域3。

表1：野生型piggyBac转座酶(SEQ ID NO:1)

或者，PB结构域3的序列不限于上述序列，并且例如，也可以使用具有表1所示的序列中包含的氨基酸的置换、添加、插入、缺失等突变的衍生物。例如，优选使用与表1所示的序列具有90％以上的氨基酸序列同源性的衍生物。也可以使用表2所示的序列(SEQ ID NO:2)，其为野生型piggyBac转座酶的衍生物。SEQ ID NO:2是优选的，因为它具有加下划线的来自SEQ ID NO:1的七个氨基酸置换并且具有更高的转座酶活性。

表2：氨基酸序列-修饰的piggyBac转座酶(SEQ ID NO:2)

NLS结构域2是包括核定位信号(NLS)氨基酸序列的结构域。任何已知的NLS多肽都可以用作NLS结构域2。NLS可以是经典的NLS或非经典的NLS。

例如，可以使用表3中所示的猿猴病毒40(SV40)的大T抗原蛋白的NLS(SEQ ID NO:3)作为经典的NLS。

表3：SV40的大T抗原蛋白的NLS(SEQ ID NO:3)

KKKRKV 6

或者，可以使用核质蛋白、性别决定区Y(SRY)的NLS等作为典型的NLS。

例如，可以使用表4中所示的人免疫缺陷病毒(HIV)的转录反式激活因子(TAT)蛋白(SEQ ID NO:4)作为非经典的NLS。

表4：HIV的TAT蛋白(SEQ ID NO:4)

GRKKRRQRRR 10

或者，可以使用博尔纳病病毒(BDV)p10、磷脂加扰酶1(PLSCR1)、Ty1整合酶、HIV-1Rev、人T细胞白血病1型(HTLV-1)Rex、Ste12、Pho4或Yap1等作为非经典的NLS。

可以单独使用上述NLS之一作为NLS结构域2，或可以将相同或不同类型的多个NLS连接并用作NLS结构域2。例如可以将经典的NLS和非经典的NLS连接并用作NLS结构域2。优选使用如下的序列作为NLS结构域：其中HIV的TAT蛋白和SV40的大T抗原蛋白的NLS从N端开始按该顺序连接。

例如，NLS结构域2和PB结构域3优选从N端侧开始按该顺序连接，但也可以按照PB结构域3、NLS结构域2的顺序连接。

如在本说明书中使用的，术语“连接”是指各结构域以这样的状态结合：其中这些结构域可以执行它们的功能。此外，术语“连接”包括直接结合的状态和通过不同顺序结合的状态。不同的序列可以是对每个结构域的功能没有不利影响的氨基酸或多肽。例如，不同的序列优选为各结构域所衍生的生物体基因组中的结构域周围的序列、GGGGS序列或GS序列、或将这些序列重复1至5次而得到的序列。

(编码修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸)

根据另一个实施方案，提供了编码修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸。例如，多核苷酸是包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或能够构成碱基序列的其他核苷酸的聚合物。多核苷酸可以是例如基因组DNA、cDNA、人工合成的DNA、基因组RNA或人工合成的RNA，其是单链、双链或三链的，或者是其中其位点或末端被化学改性的核酸类似物。多核苷酸可以包括多种类型的核苷酸，并且可以包含桥接核酸(BNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)等。

实施方案的多核苷酸编码修饰的piggyBac转座酶1，并且包括例如编码NLS结构域2的至少一个区域(碱基序列)和编码PB结构域3的区域。

这里，术语“编码”是指包括信息，即可以转录和/或翻译和表达靶多肽的碱基序列。该信息例如通过对应于构成该多肽的各氨基酸的密码子来指定。

下面将描述多核苷酸是RNA的实例。例如，这种RNA被引入细胞并作为信使RNA(mRNA)发挥作用。RNA由细胞内蛋白质合成功能翻译，以将修饰的piggyBac转座酶1提供给细胞。

优选地，根据待引入和使用的细胞的物种对RNA序列进行密码子优化。术语“密码子优化”是指将构成肽的每个氨基酸的密码子改变为在该物种中高频率使用的密码子。然而，术语“密码子优化”并不一定意味着多肽的氨基酸序列中100％的氨基酸的密码子被改变，而是与氨基酸对应的密码子中的至少一个密码子被改变。然而，优选50％或更多的密码子被改变。

例如，在使用人细胞的情况下，优选针对人进行密码子优化。在下文中，针对每个氨基酸显示了在人中使用频率高并且对于人密码子优化而言优选的密码子。

丙氨酸(A)的密码子：使用频率高且优选使用GCU或GCC，但使用频率最高且更优选使用GCC。

半胱氨酸(C)的密码子：使用频率高且优选使用UGC或UGU，但使用频率最高且更优选使用UGC。

天冬氨酸(D)的密码子：使用频率高且优选使用GAC或GAU，但使用频率最高且更优选使用GAC。

谷氨酸(E)的密码子：使用频率高且优选使用GAA或GAG，但使用频率最高且更优选使用GAG。

苯丙氨酸(F)的密码子：使用频率高且优选使用UUC或UUU，但使用频率最高且更优选使用UUC。

甘氨酸(G)的密码子：使用频率高且优选使用GGA或GGC，但使用频率最高且更优选使用GGC。

组氨酸(H)的密码子：使用频率高且优选使用CAC或CAU，但使用频率最高且更优选使用CAC。

异亮氨酸(I)的密码子：使用频率高且优选使用AUC或AUU，但使用频率最高且更优选使用AUC。

赖氨酸(K)的密码子：使用频率高且优选使用AAA或AAG，但使用频率最高且更优选使用AAG。

亮氨酸(L)的密码子：使用频率高且优选使用CUC或CUG，但使用频率最高且更优选使用CUG。

甲硫氨酸(M)的密码子：使用的密码子是一种类型(AUG)，并且不需要被改变。

天冬酰胺(N)的密码子：使用频率高且优选使用AAC或AAU，但使用频率最高且更优选使用AAC。

脯氨酸(P)的密码子：使用频率高且优选使用CCC或CCU，但使用频率最高且更优选使用CCC。

谷氨酰胺(Q)的密码子：使用频率高且优选使用CAA或CAG，但使用频率最高且更优选使用CAG。

精氨酸(R)的密码子：AGA或AGG使用频率高且它们的使用频率相等，AGA和AGG二者都是优选的。

丝氨酸(S)的密码子：使用频率高且优选使用AGC、UCC或UCU，但使用频率最高且更优选使用AGC。使用第二最常用且优选使用UCC。

苏氨酸(U)的密码子：使用频率高且优选使用ACA或ACC，但使用频率最高且更优选使用ACC。

缬氨酸(V)的密码子：使用频率高且优选使用GUC或GUG，但使用频率最高且更优选使用GUG。

色氨酸(W)的密码子：使用的密码子是一种类型(UGG)，并且不需要被改变。

酪氨酸(Y)的密码子：使用频率高且优选使用UAC或UAU，但使用频率最高且更优选使用UAC。

终止子的密码子：使用频率最高且更优选使用UGA。

这里，A是腺嘌呤，U是尿嘧啶，C是胸腺嘧啶，并且G是鸟嘌呤。

然而，当使用频率最高的密码子含量过高时，由于密码子的tRNA耗尽或多肽的GC含量过高等原因，翻译效率反而会降低。因此，优选以一定比例包含第二最常用的密码子。

例如，可以使用被称为piggyBac转座酶mRNA的序列作为编码PB结构域3的区域。或者，优选使用如上所述通过密码子优化该mRNA序列而获得的序列。

可以使用编码上述任意的NLS结构域2的已知RNA序列作为编码NLS结构域2的区域。还优选根据待使用的细胞的物种对NLS结构域2进行密码子优化。

实施方案的RNA可以是RNA加工前的前RNA形式，也可以是加工后的成熟RNA形式。实施方案的RNA除了编码每个结构域的区域外，还可以含有附加序列。附加序列的实例包括起始密码子、终止密码子、5'非翻译区(5'UTR)、3'非翻译区(3'UTR)、5'端前导序列、内部核糖体进入位点(IRES)、例如P2A和T2A的2A序列、转录终止序列、多(A)序列等。

实施方案的RNA优选被修饰为具有耐降解性。例如，修饰可以是防止RNA被RNase等降解的已知修饰。修饰的实例包括天然修饰或非天然核苷酸的使用和引入RNA，非天然序列的使用和添加，或天然或非天然CAP结构的添加，或多(A)序列的添加等。

天然修饰的核苷酸的实例包括假尿苷、5-甲基胞苷、1-甲基腺苷等。非天然核苷酸的实例包括BNA、LNA、PNA等。

非天然序列的实例包括人工生产的非天然存在的碱基序列，例如，随机碱基序列或天然或非天然氨基酸和核酸的杂合序列等。优选将非天然序列添加到例如RNA的末端。

天然CAP结构的实例包括CAP0(m7GpppN)、CAP1(m7GpppNm)等。非天然CAP结构的实例包括抗反向帽类似物(ARCA)、LNA-鸟苷等。优选将非天然CAP结构添加到例如RNA的5'末端。

实施方案的RNA可以由下述的修饰piggyBac转座酶的DNA序列通过体外转录法等合成。可以使用市售的试剂盒，例如CUGA(注册商标)7试剂盒等进行体外转录。或者，可以直接人工合成RNA。

随后，将描述其中多核苷酸是DNA的实例。DNA例如在引入细胞后被转录和翻译，并将修饰的piggyBac转座酶1提供给细胞。

第一实施方案的DNA包含编码期望的修饰piggyBac转座酶1的每个结构域(NLS结构域2和PB结构域3)的至少一个区域(碱基序列)。例如，可以使用编码每个结构域的多肽的已知DNA作为编码每个结构域的区域。编码每个结构域的区域可以包括其中RNA序列的尿嘧啶(U)变为胸腺嘧啶(T)的序列或其互补序列(cDNA)。

例如可以使用编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的野生型DNA序列(表5，SEQ ID NO:5)作为编码PB结构域3的区域。

表5：编码SEQ ID NO:1的PB结构域的野生型DNA序列(SEQ ID NO:5)

当在人细胞中使用时，编码PB结构域3的区域例如优选地是使用三联体获得的序列，所述三联体被选择为如上所述针对人提供密码子优化的RNA。使用三联体对DNA序列进行密码子优化，其中对应于上述每个氨基酸的优选密码子的U变为T或其互补序列。例如，优选使用表6中所示的序列(SEQ ID NO:6)作为通过对SEQ ID NO:1的PB结构域3进行密码子优化而获得的DNA序列。

表6：编码SEQ ID NO:1的PB结构域的针对人进行密码子优化的DNA序列(SEQ IDNO:6)

另外，例如，优选使用表7中所示的序列(SEQ ID NO:7)作为通过针对人对SEQ IDNO:2的PB结构域3进行密码子优化而获得的DNA序列。

表7：编码SEQ ID NO:2的PB结构域的针对人进行密码子优化的DNA序列(SEQ IDNO:7)

当使用SEQ ID NO:3的SV40的大T抗原的NLS作为NLS结构域2时，可以使用下表8中所示的DNA序列(SEQ ID NO:8)作为编码NLS结构域2的区域。

表8：SV40的大T抗原的NLS的DNA序列(SEQ ID NO:8)

AAGAAGAAGA GAAAGGTG 18

当使用HIV的TAT蛋白(SEQ ID NO:4)作为NLS结构域2时，可以使用下表9中所示的DNA序列(SEQ ID NO:9)作为编码NLS结构域2的区域。

表9：HIV的TAT蛋白的DNA序列(SEQ ID NO:9)

GGCAGAAAGA AGAGAAGACA GAGAAGAAGA 30

此外，在使用将HIV的TAT蛋白与SV40的大T抗原的NLS连接获得的NLS结构域2的情况下，可以使用下表10中所示的DNA序列(SEQ ID NO:10)

表10：HIV的TAT蛋白+SV40的大T抗原的NLS的DNA序列(SEQ ID NO:10)

也可以使用表5至10中所示的碱基序列中所含的核苷酸具有置换、添加、插入和缺失等突变的序列。例如，当存在这样的突变时，优选使用与表5至10中所示的序列所编码的氨基酸序列具有90％或更高同源性的序列。

实施方案的DNA优选用于其中在该DNA的5'端进一步连接启动子序列、在3'端连接转录终止序列的piggyBac转座酶表达单元的配置。可以使用巨细胞病毒(CMV)的早期增强子/启动子、猿猴病毒40(SV40)的启动子等作为启动子序列。可以使用牛生长激素(BGH)基因的转录终止序列或猿猴病毒40(SV40)的转录终止序列作为转录终止序列。表达单元可以是单链的或双链的，并且可以是线性的或环状的。DNA的两端可以用官能团标记或修饰。此外，可以将表达单元整合到已知质粒载体或病毒载体中，并且可以使用所得到的表达单元。

(将靶序列整合到细胞基因组中的方法和生产细胞的方法)

在下文中，将描述使用第一实施方案的修饰piggyBac转座酶将靶序列整合到细胞基因组中的方法。如图2所示，将靶序列整合到细胞基因组中的方法包括将供体DNA引入具有修饰的piggyBac转座酶1的细胞中(S1：引入步骤)。

首先，将描述供体DNA。如图3所示，供体DNA 20包含靶序列21。供体DNA 20例如是双链DNA，并且可以是线性的或环状的。例如，供体DNA 20可以是其中整合了靶序列21的质粒或病毒载体。

靶序列21是整合到细胞基因组中的DNA碱基序列，根据实施本方法的目的进行选择。靶序列21包括例如编码特定基因或基因的一部分的碱基序列、包含启动子序列、特定基因和转录终止序列的基因表达盒，或者不是基因的天然或非天然碱基序列。或者，靶序列21可以含有编码一个至数个氨基酸的碱基序列、包含三个至数十个核苷酸的序列等。

靶序列21在其两端分别含有第一转座酶识别序列22a和第二转座酶识别序列22b。第一转座酶识别序列22a和第二转座酶识别序列22b是转座酶识别靶序列21位置的序列。第一转座酶识别序列22a和第二转座酶识别序列22b是也称为“反向重复序列(IR)”的序列，其包含相同的反向序列。

靶序列21的除第一转座酶识别序列22a和第二转座酶识别序列22b之外的区域具有例如约3至约20000个碱基的长度。

术语“将修饰的piggyBac转座酶1引入细胞”包括将修饰的piggyBac转座酶1以多肽的形式引入的情况，以及将修饰的piggyBac转座酶1以RNA或DNA的形式引入以在细胞中表达修饰的piggyBac转座酶1的情况。

将参考图4描述当修饰的piggyBac转座酶1以RNA的形式整合时靶序列21被引入细胞基因组的过程的实例。首先，如图4的(a)部分所示，当将供体DNA 20和修饰的piggyBac转座酶1的RNA 30引入细胞40时，修饰piggyBac转座酶1(图中的“PB”)通过如图4的(b)部分所示的细胞40的蛋白质合成功能从RNA 30中表达出来。如图4的(c)部分所示，供体DNA 20和修饰的piggyBac转座酶1可以易位到细胞核41中。

然后，修饰的piggyBac转座酶1与细胞核中的供体DNA 20结合(图4的(d)部分)。例如，两个修饰的piggyBac转座酶1可以分别结合供体DNA 20的第一转座酶识别序列22a和第二转座酶识别序列22b。然后，如图4的(e)部分所示，修饰的piggyBac转座酶1切除供体DNA20的靶序列21，并且靶序列21被整合到细胞40的基因组42中。

在使用修饰的piggyBac转座酶1的DNA的情况下，将DNA引入细胞40之后，DNA被转录和翻译，修饰的piggyBac转座酶1以与图4的(b)部分相似的方式表达，接下来是后续过程。当修饰的piggyBac转座酶1以多肽的形式引入时，它可以直接易位到细胞核41中。

由于实施方案的修饰piggyBac转座酶1具有NLS结构域2，进一步提高了向细胞核41的易位效率，并且靶序列21可以被更有效地整合。

此外，当根据细胞的物种对编码RNA 30的PB结构域3的区域进行密码子优化时，可以更有效地表达修饰的piggyBac转座酶1，并且可以进一步提高整合效率。

可以根据引入方法的类型、可用性等适当地选择其中引入修饰的piggyBac转座酶1的形式。然而，优选使用RNA的形式。在这种情况下，由于与使用DNA形式的情况相比可以省略转录步骤，所以修饰的piggyBac转座酶1可以更快且高效地表达，并且可以提高整合效率。此外，RNA形式的经修饰的piggyBac转座酶1未整合到细胞40的基因组42中，因此这很方便。

可以使用用于将多肽或多核苷酸引入细胞的任何已知方法进行引入步骤(S1)。例如，优选使用脂质体法、脂质体转染法、电穿孔法、声穿孔法、磁转染法等。根据细胞40的类型、靶序列21的类型、引入后细胞40的用途等选择合适的方法作为引入方法。

脂质体法是更优选的引入方法，是指其中将供体DNA 20和修饰的piggyBac转座酶1或编码修饰piggyBac转座酶1的多核苷酸包封在脂质体(脂质颗粒)中并使其与细胞40接触的方法。稍后将详细描述脂质体法的实施方案。

脂质体转染法是指例如使供体DNA 20和与脂质复合的形式的修饰的piggyBac转座酶1与细胞40接触的方法。

优选引入供体DNA 20和RNA 30中的每一种的约1至100个分子。

细胞40优选是体外细胞。体外细胞40可以是例如分离的细胞、培养的细胞或组织或已建立的细胞系。细胞40优选为哺乳动物细胞，更优选为人细胞。

可以使用体外细胞40通过将靶序列整合到实施方案的细胞基因组中的方法生产其中将靶序列21整合到基因组中的细胞。因此，根据实施方案，提供包括引入步骤(S1)的生产细胞的方法。生产细胞的方法可以进一步包括在引入步骤(S1)之后在适于存活的条件下培养细胞40的步骤。此外，该方法还可包括在培养后筛选靶序列21所整合到的靶细胞的步骤。

在实施方案的生产细胞的方法中，通过修饰的piggyBac转座酶1提高了整合效率，使得能够更有效地生产靶细胞。实施方案的生产细胞的方法可以用于例如含有靶细胞的药物组合物的生产、生产物质的细胞的生产等，但不限于此。

或者，细胞40可以是体内细胞。在这种情况下，可以通过将供体DNA 20和修饰的piggyBac转座酶1施用于活体来进行引入步骤(S1)。例如，可以通过静脉内、皮下、肌内、动脉内、硬膜外、脑脊髓、胸部、腹膜内或局部病灶内注射或输注来进行施用。

(脂质体法)

在下文中，将描述使用修饰的piggyBac转座酶1的RNA的脂质体法的实施方案的实例。然而，在脂质体法中，并不总是需要使用RNA形式的修饰的piggyBac转座酶1。可以使用DNA的形式和其他形式：多核苷酸的形式或多肽的形式。然而，优选多核苷酸的形式。

图5的(a)部分示例了通过将供体DNA 20和修饰piggyBac转座酶1的RNA 30包封在脂质颗粒50中获得的引入载体51的实例。将引入载体51与细胞40接触，由此脂质颗粒50和细胞膜可以通过例如内吞作用融合，并且供体DNA 20和RNA 30可以释放到细胞40中。

图5的(b)部分示例了通过将供体DNA 20和RNA 30分别包封在分开的脂质颗粒50中获得的引入载体52和53的实例。引入载体52和53一起使用。这些引入载体52和53可以同时与细胞40接触，或者它们中的任何一个可以首先接触。

脂质颗粒50是包括通过非共价键排列多个脂质分子而获得的脂质膜的近似球形的中空体。供体DNA 20和/或RNA 30被包封在中空体的中央腔中。脂质颗粒50可以是脂质单层膜或脂质双层膜。此外，脂质颗粒50可以包括单层膜或多层膜。

可以使用以下例示的基础脂质作为脂质颗粒50的材料。例如，可以使用其为生物膜的主要成分的脂质作为基础脂质。基础脂质是磷脂或鞘脂，例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂或脑苷脂，或它们的组合。基础脂质易于与细胞膜融合。特别是在使用二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺的情况下，脂质颗粒50的结构和粒径容易控制，基础脂质容易与细胞膜融合，因此优选。脂质中的酰基的烃链优选具有C10至C20的长度。该烃链可以是饱和烃基或不饱和烃基。

作为基础脂质，优选使用1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烷基-3-三甲铵丙烷(DOTMA)、1,2-二油酰-3-二甲铵丙烷(DODAP)、1,2-二肉豆蔻酰-3-二甲铵丙烷(14:0DAP)、1,2-二棕榈酰-3-二甲铵丙烷(16:0DAP)、1,2-二硬脂酰-3-二甲铵丙烷(18:0DAP)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙烷(DOBAQ)、1,2-二油酰-3-三甲铵丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)或胆固醇，或任何这些基础脂质的组合。特别优选使用阳离子脂质或中性脂质作为基础脂质，可以通过阳离子脂质或中性脂质的含量来调整脂质颗粒50的酸解离常数。优选使用DOTAP作为阳离子脂质，并且优选使用DOPE作为中性脂质。

可以以接近脂质颗粒50中所含的总脂质分子的100％的量包含基础脂质。优选地，除了基础脂质之外，进一步包含如下例示的第一脂质化合物和/或第二脂质化合物。当包含这些脂质化合物时，优选以相对于总脂质分子为约30％至约80％(摩尔比)的量包含基础脂质。

例如，第一脂质化合物是可生物降解的。第一脂质化合物可由式Q-CHR₂表示。

(其中Q是含有两个或多个叔氮但不含氧的含氮脂肪族基团，并且

每个R独立地为C12至C24的脂肪族基团，条件是至少一个R在其主链或侧链中具有选自-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-O-C(＝O)-O-、-S-C(＝O)-、-C(＝O)-S-、-C(＝O)-NH-和-NHC(＝O)-的连接基团LR。)

当脂质颗粒50含有第一脂质化合物时，脂质颗粒50的表面变为非阳离子，因此可以减少细胞引入中的障碍并且可以提高包封物质的引入效率。

例如，当具有由下式表示的结构的脂质用作第一脂质化合物时，引入效率更优异，并且因此是优选的。

特别地，脂质颗粒50优选含有式(1-01)的脂质化合物和/或式(1-02)的脂质化合物作为其构成成分。

例如，第二脂质化合物是可生物降解的。第二脂质化合物可由式P-[X-W-Y-W'-Z]2表示。

(其中P是在主链中具有一个或多个醚键的亚烷基氧基，

每个X独立地是具有叔胺结构的二价连接基团，

每个W独立地是C1至C6亚烷基，

每个Y独立地为选自单键、醚键、羧酸酯键、硫代羧酸酯键、硫酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键和脲键的二价连接基团，

每个W'独立地为单键或C₁至C₆亚烷基，并且

每个Z独立地是脂溶性维生素残基、甾醇残基或C12至C22脂肪烃基团。)

当包含第二脂质化合物时，脂质颗粒50中包封的核酸的量可能很大。

例如，当使用具有以下结构的第二脂质化合物时，核酸的包封量更优异，并且因此是优选的。

当使用含有上述第一脂质化合物和第二脂质化合物的脂质颗粒50时，可以增加包封量并提高引入效率。此外，可以减少引入细胞的细胞死亡。特别是使用式(1-01)、(1-02)和/或(2-01)的化合物时，包封量和引入效率特别优异，并且因此是优选的。

优选相对于脂质颗粒50的总材料，以约20％至约70％(摩尔比)的量包含第一脂质化合物和第二脂质化合物。

还优选脂质颗粒50包含防止脂质颗粒50聚集的脂质。例如，防止聚集的脂质优选进一步包含PEG修饰的脂质，例如聚乙二醇(PEG)二肉豆蔻基甘油(DMG-PEG)、衍生自ω-氨基(低聚乙二醇)链烷酸单体的聚酰胺低聚物(US 6,320,017)或单唾液酸神经节苷脂。优选相对于脂质颗粒50的总材料，以约1％至约5％(摩尔比)的量包含此类脂质。

脂质颗粒50可以含有用于调节毒性的相对低毒性的脂质等脂质；具有将配体与脂质颗粒50结合的官能团的脂质；以及用于抑制诸如甾醇(例如胆固醇)的封装物质的泄漏的脂质。特别地，优选含有胆固醇。

通过考虑待靶向的脂质颗粒50的酸解离常数(pKa)、脂质颗粒50的尺寸、包封物质的类型、待引入细胞的稳定性等而选择用于脂质颗粒50的脂质的类型和组成。酸解离常数(pKa)优选在6.5至8.0的范围内。当酸解离常数为在该范围内的值时，可以提高引入效率。

例如，当脂质颗粒50含有式(1-01)或式(1-02)的化合物和/或式(2-01)的化合物、DOPE和/或DOTAP、胆固醇和DMG-PEG时，核酸的包封量和核酸的导入效率特别优异，并且因此是优选的。

如有必要，可以将附加组分封装于引入载体中。附加组分的实例包括pH调节剂、渗透压调节剂、基因激活剂或针对T细胞肿瘤细胞的其他治疗剂、其他诊断剂等。pH调节剂的实例包括有机酸如柠檬酸及其盐。渗透压调节剂的实例包括糖、氨基酸等。稍后将描述基因激活剂。

例如可以使用Bangham法、有机溶剂提取法、表面活性剂除去法、冷冻解冻法等用于将小分子包封在脂质粒子中的已知方法来生产引入载体。例如，制备通过将脂质颗粒50的材料以所需比例浸渍在诸如醇等有机溶剂中而获得的脂质混合物和含有待封装成分的缓冲水溶液，并将缓冲水溶液加入到脂质混合物中。将所得混合物搅拌并悬浮以形成引入载体。

可以用核酸凝缩肽60以凝缩状态包封供体DNA 20和RNA 30。核酸凝缩肽60是具有将核酸凝缩成小颗粒的功能的肽。通过使用核酸凝缩肽60，可以将大量的核酸包封在脂质颗粒50中，并且可以减小脂质颗粒50的粒径。此外，减少了残留在脂质颗粒50外部的核酸的量，从而防止了引入载体的聚集。结果，可以提高核酸的递送效率。

优选的核酸凝缩肽60例如是含有45％或更多的总阳离子氨基酸的肽。更优选的核酸凝缩肽60在一端具有序列RRRRRR(第一氨基酸序列)，而在另一端具有序列RQRQR(第二氨基酸序列)。没有或者RRRRRR或RQRQR的一个或多个中间序列包含在第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间。此外，第一氨基酸序列、第二氨基酸序列和中间序列的两个相邻序列之间包含两个或更多个中性氨基酸。中性氨基酸例如是G或Y。或者，另一端可以具有序列RRRRRR(第一氨基酸序列)而不是第二氨基酸序列。

上述核酸凝缩肽优选具有以下氨基酸序列：

RQRQRYYRQRQRGGRRRRRR(SEQ ID NO:11)；

RQRQRGGRRRRRR(SEQ ID NO:12)；和

RRRRRRYYRQRQRGGRRRRRR(SEQ ID NO:13)。

此外，具有以下氨基酸序列的核酸凝缩肽可以与任何上述核酸凝缩肽组合使用。该肽可以进一步凝缩由上述核酸凝缩肽凝缩形成的核酸聚集体。

GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY

(M9)(SEQ ID NO:14)

例如，可以通过在包封在脂质颗粒50中之前将核酸与核酸凝缩肽60搅拌和混合来凝缩核酸。供体DNA 20和RNA 30可以一起凝缩或分开凝缩。

因为可以获得上述效果，优选使用核酸凝缩肽60。但是，根据所使用的核酸的类型、细胞的类型等，不一定必须使用核酸凝缩肽60。

(试剂盒)

根据实施方案，提供了一种用于将靶序列21整合到细胞基因组中的试剂盒。试剂盒包括修饰的piggyBac转座酶1或编码修饰的piggyBac转座酶1的多核苷酸中的至少一种。

例如，修饰的piggyBac转座酶1或编码修饰的piggyBac转座酶1的多核苷酸可以作为包含在合适载体中的组合物提供。或者，修饰的piggyBac转座酶1或编码修饰的piggyBac转座酶1的多核苷酸可以作为包含在合适载体中的组合物以引入载体的形式提供。合适载体的实例包括水、盐水例如生理盐水、甘氨酸水溶液或缓冲液等。

组合物可以通过常规方法进行灭菌。此外，组合物还可以作为液体或作为干粉提供。例如，粉末组合物可以通过溶解在合适的液体中来进行使用。

试剂盒还可以包括提高组合物储存稳定性的物质。对于提高保存稳定性的物质没有限定，其实例包括：例如白蛋白、脂蛋白、载脂蛋白、球蛋白的糖蛋白；pH调节剂、缓冲剂、张力调节剂等；使药物组合物更接近生理状态的药学上可接受的和相关的试剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙；抑制自由基损伤的亲脂性自由基猝灭剂，例如α-生育酚；以及用于抑制脂质的过氧化损伤并提高储存稳定性的脂质保护剂，例如水溶性螯合剂，例如铁氧胺。这些物质可以包含在组合物中或者可以与组合物分开包含在试剂盒中。

试剂盒可以进一步包括供体DNA 20，除非该试剂盒包括其中包封供体DNA的引入载体。

(第二实施方案)

根据第二实施方案，提供了一种修饰的piggyBac转座酶，该转座酶还包括促进细胞分裂的结构域。如图6的(a)部分所示，第二实施方案的修饰的piggyBac转座酶10进一步包括在例如核定位信号结构域2和piggyBac转座酶结构域3之间的细胞分裂促进结构域4。

细胞分裂促进结构域4包括具有促进细胞分裂功能的肽的氨基酸序列。可以使用已知具有这种功能的任何已知肽作为细胞分裂促进结构域4。例如，优选使用如表11所示的具有SV40的大T抗原蛋白的N端区域至133个氨基酸的序列(SEQ ID NO:15)。该序列包含J结构域和Rb家族结合基序。

表11：包括SV40的大T抗原蛋白的J结构域和Rb家族结合基序的促进细胞分裂的结构域(SEQ ID NO:15)

细胞分裂促进结构域4不限于上述结构，例如可以使用属于人多瘤病毒的JC病毒或BK病毒的大T抗原蛋白的促进细胞分裂的结构域。

当包括细胞分裂促进结构域4时，如图6的(a)部分所示，每个结构域连接的顺序是例如从N端侧起，NLS结构域2、细胞分裂促进结构域4和PB结构域3。但是，结构域的顺序不限于上述。例如，细胞分裂促进结构域4、NLS结构域2、PB结构域3可以从N端侧依次连接。或者，结构域可以以另一种顺序连接。

第二实施方案还提供了编码修饰的piggyBac转座酶10的多核苷酸。当使用SEQ IDNO:15的氨基酸序列作为细胞分裂促进结构域4时，优选使用例如表12中所示的序列(SEQID NO:16)作为编码氨基酸序列的DNA序列。

表12：编码SEQ ID NO:15的细胞分裂促进结构域的DNA序列(SEQ ID NO:16)

作为表11和表12所示的氨基酸序列或DNA序列，也可以使用具有置换、添加、插入、缺失等突变的序列。例如，当存在这样的突变时，优选使用具有编码与表11和12中所示的序列编码的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列的碱基序列的序列。

也可以作为与第一实施方案中描述的引入载体类似的引入载体提供第二实施方案的修饰的piggyBac转座酶10。此外，与第一实施方案类似，修饰的piggyBac转座酶10可以用于将靶序列整合到细胞基因组中的方法和生产细胞的方法中。

然而，当将第二实施方案的修饰的piggyBac转座酶10引入细胞40时，由于细胞分裂促进结构域4的细胞分裂促进功能，细胞40的分裂可能暂时得到促进。在细胞40的细胞分裂过程中发生的核膜丢失可以进一步促进修饰的piggyBac转座酶10和供体DNA 20易位到细胞核41中。因此，根据第二实施方案的修饰piggyBac转座酶10，可以进一步提高靶序列21的整合效率。

根据另一个实施方案，细胞分裂促进结构域4不一定必须包含在修饰的piggyBac转座酶中。如图6的(b)部分所示，第一实施方案的修饰的piggyBac转座酶1和含有从修饰的piggyBac转座酶1分离的细胞分裂促进结构域4的多肽可以一起使用。此时，含有细胞分裂促进结构域4的多肽还可以含有NLS结构域2。

实施例

在下文中将描述生产和使用实施方案的修饰的piggyBac转座酶的实施例。

实施例1修饰piggyBac转座酶的DNA序列合成

-PB结构域DNA序列的合成

合成了野生型piggyBac转座酶基因的DNA序列(WtPB,SEQ ID NO:1)(SEQ ID NO:5)和其中SEQ ID NO:5的DNA序列针对人进行了密码子优化的人密码子优化PB(HuPB)的DNA序列(SEQ ID NO:6)。此外，合成了具有修饰的氨基酸序列的高活性PB(HyPB)的DNA序列(SEQ ID NO:7)。

-NLS结构域DNA序列的合成

使用HIV的TAT蛋白的核转运信号(TAT NLS，SEQ ID NO:4)和SV40的大T抗原蛋白的核转运信号(SV40 NLS，SEQ ID NO:3)作为NLS结构域。合成了针对人进行了密码子优化的TAT NLS的DNA序列(SEQ ID NO:9)、针对人进行了密码子优化的SV40 NLS的DNA序列(SEQID NO:8)，以及其中TAT NLS和SV40 NLS通过接头序列(TAT-SV40 NLS，SEQ ID NO:10)依次连接的DNA序列。

-细胞分裂促进结构域DNA序列的合成

使用包含SV40的大T抗原蛋白的J结构域和Rb结构域的N端133个氨基酸序列(LT-J/Rb，SEQ ID NO:15)作为细胞分裂促进结构域。合成了编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列的DNA序列(SEQ ID NO:16)。

-第一实施方案的修饰的piggyBac转座酶的DNA序列的合成

生产了T-HyPB(SEQ ID NO:17)，其中TAT NLS的DNA序列通过接头序列添加到HyPB的N端，以及TS-HyPB(SEQ ID NO:18)，其中接头序列与TAT-SV40 NLS相连并添加到HyPB的N端。这些序列分别显示在表13和14中。

表13：T-HyPB(SEQ ID NO:17)

表14：TS-HyPB(SEQ ID NO:18)

这些修饰的piggyBac转座酶的DNA序列是通过化学合成TAT NLS或TAT-SV40 NLS和HyPB的N端DNA序列，然后将所得合成DNA序列连接到已经从其去除合成的N端序列的HyPB的DNA序列而生产的。

-第二实施方案的修饰的piggyBac转座酶的DNA序列的合成

将其中TAT-SV40 NLS(SEQ ID NO:10)和LT-J/Rb(SEQ ID NO:16)相连的表15所示的DNA序列(SEQ ID NO:19)通过接头序列添加到HyPB的N端，从而生产表16所示的TS-LTJ/Rb-HyPB(SEQ ID NO:20)。

表15：添加TAT-SV40LT-NLS的T-J/Rb(SEQ ID NO:19)

表16：TS-LTJ-HyPB(SEQ ID NO:20)

TS-LTJ/Rb-HyPB是通过化学合成TAT-SV40 NLS、LTJ/Rb、接头序列和HyPB的N端DNA序列，然后将所得序列连接到已经从其去除合成的N端序列的HyPB的DNA序列而生产的。此外，生产了表17所示的DNA序列(TS-LTJ/Rb，SEQ ID NO:21)作为不与PB连接的单独的细胞分裂促进结构域的多肽。

表17：TS-LTJ/Rb(SEQ ID NO:21)

TS-LTJ/Rb是通过在TAT-SV40 NLS和LT-J/Rb的DNA序列末端添加一个终止密码子，通过化学合成而生产的。

实施例2质粒的生产

生产了其中将实施例1获得的PB(WtPB,HuPB,HyPB,T-HyPB,TS-HyPB和TS-LTJ/Rb-HyPB)的DNA序列整合到pGEM-GL-pA中的质粒作为用于修饰的PB的RNA制备的模板DNA。

pGEM-GL-pA是通过将人β-珠蛋白的前导序列(Globin leader)和pSP64 pA载体(Promega Corporation)的多(A)序列插入含有T7启动子和多(A)序列的用于RNA合成的市售质粒DNA：pGEM(注册商标)-4Z(Promega Corporation)而生产的。将实施例1中获得的PB的DNA序列整合到人β-珠蛋白前导序列和pGEM-GL-pA的多(A)序列之间。

另外，生产了与PB结构域不连接的细胞分裂促进结构域(TS-LTJ/Rb)的用于RNA制备的模板DNA。该模板DNA质粒是通过在人β-珠蛋白前导序列和pGEM-GL-pA的多(A)序列之间整合TS-LTJ/Rb DNA序列而生产的。

实施例3mRNA的合成

实施例2中获得的pGEM-GL-pA用于如下所述合成mRNA。首先，将质粒DNA用限制酶EcoRI切割并纯化，然后制备20μL含有1.0μg模板DNA的体外转录反应液，并在37℃恒温浴中反应2小时。向体外转录反应液中添加CUGA(注册商标)7试剂盒中提供的三种核苷酸(ATP、CTP和GTP)和核苷酸类似物ψUTP(Jena Bioscience GmbH)。按照CUGA(注册商标)7试剂盒的方案进行RNA合成程序。

反应完成后，用MEGAclear^TM转录Clean-Up试剂盒(Invitrogen Corporation)纯化合成RNA。按照试剂盒的程序进行RNA的纯化。

纯化后，分别在RNA的5'-UTR和3'-UTR上添加Cap结构和多(A)结构，以形成mRNA。使用ScriptCapTM m7G Capping System(CellScript)和ScriptCap^TM 2'-O-甲基转移酶试剂盒(CellScript)添加Cap结构和多(A)结构。按照试剂盒说明书如下进行操作。

将得到的RNA在65℃孵育10分钟，然后立即置于冰上以破坏RNA的二级结构。制备含有60μg该RNA的100μL加帽反应液，并在37℃恒温浴中反应1小时，以将Cap结构添加到RNA的5'-UTR。将A-PlusTM Poly(A)Polymerase Tailing试剂盒(CellScript)添加到相同的溶液中，并将混合物在37℃的恒温浴中反应2小时，以将多(A)结构添加到3'-UTR。反应完成后，根据试剂盒说明书，采用醋酸铵沉淀法纯化反应液中的mRNA。使用分光光度计(BioSpec-mini，Shimadzu Corporation)测量吸光度(A260)，RNA浓度计算为OD1.0＝40.0μg/mL RNA。

实施例4包封mRNA的脂质体的制备

将1/20量的mRNA溶液(1.6μg/mL)加入100μL乙醇脂质溶液(FFT20(上式(1-02)的化合物)/DOTAP/DOPE/胆固醇/PEG-DMG＝37/10.5/5.25/60/4(摩尔比))以制备105μL含RNA的脂质溶液，然后轻轻加入695μL 10mM HEPES(pH 7.3)，以形成脂质体溶液。制备四组该脂质体溶液，并使用离心超滤管：Amicon Ultra 0.5mL，Ultracel-50K(MilliporeCorporation)通过以14,000×g离心浓缩这些溶液。浓缩后，通过添加400μL 10mM HEPES(pH 7.3)进行缓冲液交换和浓缩，并将最终体积调整至100μL。通过QuantiFluor^TM RNASystem(Promega Corporation)测量脂质体中所含的RNA量。

实施例5WtPB、HuPB和HyPB的转座子切除活性的测量

使用用于测量转座子(TP)切除活性的质粒DNA：pMSCV-SpNL测量上述每种修饰的piggyBac转座酶的TP切除活性。

NanoLuc(注册商标)基因(Promega Corporation)(深海虾(Oplophorusgracilirostris)来源的萤光素酶)，其编码序列一分为二；将N端部分和C端部分整合到pMSCV-SpNL中，并且在分开的NanoLuc(注册商标)基因之间插入具有piggyBac转座酶识别序列(转座子末端序列，5'-IR和3'-IR)的TP。将小鼠干细胞病毒(MSCV)启动子连接到分开的NanoLuc(注册商标)RNA基因(Split-NLuc)的N端侧(NLuc-N)的上游，以及将牛生长激素(BGH)基因的多(A)添加信号序列连接到C端侧(NLuc-C)的下游。

在pMSCV-SpNL中，作为萤光素酶的NanoLuc(注册商标)基因通过插入TP被分成两部分；N端部分和C端部分。在这种状态下，活性NanoLuc(注册商标)在细胞中不表达。但引入细胞后，TP被转座酶切除，NanoLuc(注册商标)的N端和C端通过细胞的DNA修复机制连接，从而形成活性NanoLuc(注册商标)基因。结果，活性NanoLuc(注册商标)在细胞中表达并且细胞发光。

因此，细胞的发光强度与转座酶的TP切除活性相关。因此，pMSCV-SpNL可用于将PB的TP切除活性定量为细胞的发光强度。

人急性白血病细胞：Jurkat(ATCC)用作细胞。将在TexMACS(Miltenyi Biotec)中培养的Jurkat细胞以5.0×10⁶个细胞/mL的密度悬浮在培养基中，并将50μL所得悬浮液添加到96孔培养板的孔中。

将50μL TexMACS添加到孔中并轻轻混合。然后，加入实施例4中生产的包封WtPB-mRNA的脂质体、包封HuPB-mRNA的脂质体或包封HyPB-mRNA的脂质体(0.5μg/孔)和pMSCV-SpNL(0.5μg/孔)，并且将细胞在37℃、5％CO₂气氛的培养箱中培养。72小时后，将培养板从培养箱中取出，吹吸细胞并悬浮，然后将50μL细胞悬浮液转移至96孔黑色板(ThermoFisher Scientific)。向板中等量添加NanoLuc(注册商标)测定溶液(Nano-Glo(注册商标)萤光素酶测定系统，Promega Corporation)。在室温混合5分钟后，用光度计(Infinite(注册商标)F200PRP，Tecan Group Ltd.)测量黑色板的孔的发光强度。

结果示于图7中。HuPB的TP切除活性约为WtPB的3倍，HyPB的TP切除活性约为WtPB的11倍。因此，表明HuPB和HyPB具有优异的TP切除活性。

实施例6T-HyPB和TS-HyPB的TP切除活性的测量

使用包封T-HyPB-mRNA的脂质体和包封TS-HyPB-mRNA的脂质体，并通过实施例5中描述的方法测量TP切除活性。

结果示于图8中。T-HyPB的TP切除活性约为单独HyPB活性的1.4倍，TS-HyPB的TP切除活性约为单独HyPB活性的3倍。此外，T-HyPB的TP切除活性约为WtPB活性的16倍，TS-HyPB的TP切除活性约为WtPB活性的36倍。这表明T-HyPB和TS-HyPB都具有优异的TP切除活性。

实施例7TS-LTJ/Rb-HyPB的TP切除活性的测量

通过实施例5中描述的方法使用包封TS-LTJ/Rb-HyPB-mRNA的脂质体测量TP切除活性。

结果示于图9中。添加了细胞分裂促进肽的TS-LTJ/Rb-HyPB的TP切除活性是TS-HyPB的约16倍和WtPB的约570倍。因此，表明通过进一步添加细胞分裂促进结构域获得了更优异的TP切除活性。

实施例8使用WtPB、TS-HyPB和TS-LTJ/Rb-HyPB生产CAR-T

使用实施例4中生产的WtPB-mRNA的脂质体、包封TS-HyPB-mRNA的脂质体和包封TS-LTJ/Rb-HyPB-mRNA的脂质体，通过如下所述的转座子方法生产嵌合抗体结合T细胞(CAR-T)。

使用含有CAR转座子的质粒DNA(pIRII-CAR.CD19(CD28))作为供体DNA。根据实施例4中描述的脂质体制备方法制备包封质粒DNA的脂质体。人外周血单核细胞(PBMC)用作细胞。

通过以200×g离心10分钟收集过夜培养的PBMC，然后悬浮在补充有细胞因子(IL-7,10ng/mL；IL-15,5ng/mL)的TexMACS中以制备2.0×10⁶个细胞/mL细胞悬液。将500μL细胞悬液接种在包被有CD3/CD28抗体的48孔培养板上，并在37℃、5％CO₂气氛中培养。将150μL用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释100倍的CD3/CD28抗体溶液添加到48孔培养板(非组织培养处理,Nunc)的每个孔中，然后让溶液在37℃、5％CO₂气氛中放置2小时或更长时间。

PBMC接种24小时后，加入包封质粒DNA的脂质体(4.0μg/孔)和包封PB-mRNA的脂质体(4.0μg/孔)，并在37℃、5％CO₂气氛中培养细胞。

两周后，将PBMC从培养箱中取出，并使用如下所述的荧光激活细胞分选仪(FACS)检查CAR-T生产率。BD Biosciences FACS Verse用于FACS。收集PBMC，然后用PBS洗涤一次，将细胞悬浮在50μL PBS中。向悬浮液中加入2μL抗人IgG(H+L)抗体[FITC F(ab')2片段山羊抗人IgG(H+L)抗体,The Jackson Laboratory]，然后抗原抗体反应在4℃进行15分钟。反应完成后，用PBS洗涤细胞一次，将细胞悬浮于50μL PBS中，加入2μL抗CD3抗体(V450小鼠抗人CD3,Clone UCHT1,BD Biosciences)。在4℃进行15分钟的抗原抗体反应后，将细胞用PBS洗涤一次，然后悬浮在1％BSA/PBS中以制备用于FACS分析的样品。在FACS中，检测到表达CAR的细胞的绿色荧光(FITC)和表达CD3的T细胞的蓝色荧光(V450)。CAR-T细胞是绿色荧光和蓝色荧光共阳性的细胞(CAR阳性细胞和CD3阳性细胞)。CAR-T生产率是CAR-T细胞相对于所有检测到的细胞的比率。

结果示于图10中。在WtPB中，CAR-T细胞是Q2区域的细胞。在TS-HyPB和TS-LTJ/Rb-HyPB中，CAR-T细胞是位于UR区(CAR/CD3共阳性区)的细胞。如图10的图表，所示WtPB中的CAR-T生产率为约5％。相比之下，TS-HyPB中的CAR-T生产率约为20％，约为WtPB中的4倍。此外，TS-LTJ/Rb-HyPB中的CAR-T生产率约为50％，约为WtPB中的10倍。

因此，根据实施方案的修饰piggyBac转座酶，表明细胞生产效率大大提高。

尽管已经描述了某些实施方案，但这些实施方案仅以示例的方式呈现，并不旨在限制本发明的范围。实际上，本文所述的新实施方案可以多种其他形式体现；此外，在不脱离本发明的精神的情况下，可以对本文描述的实施方案的形式进行各种省略、替换和改变。所附权利要求及其等同物旨在覆盖落入本发明范围和精神内的这些形式或修改。

序列表

<110> 株式会社东芝

<120> 修饰的PIGGYBAC转座酶多肽、编码它们的多核苷酸、引入载体、试剂盒、将靶序列整合到细胞基因组中的方法以及生产细胞的方法

<130> 20S0359PCT

<150> JP2020-101013

<151> 2020-6-10

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 594

<212> PRT

<213> 粉纹夜蛾（Trichoplushia ni）

<400> 1

Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln

1 5 10 15

Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp

20 25 30

His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile

35 40 45

Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu

50 55 60

Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn

65 70 75 80

Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His

85 90 95

Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu

100 105 110

Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile

115 120 125

Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile

130 135 140

Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg

145 150 155 160

Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile

165 170 175

Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn

180 185 190

His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr

195 200 205

Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu

210 215 220

Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val

225 230 235 240

Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile

245 250 255

Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu

260 265 270

Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro

275 280 285

Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys

290 295 300

Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn

305 310 315 320

Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val

325 330 335

His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile

340 345 350

Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val

355 360 365

Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn

370 375 380

Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro

385 390 395 400

Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu

405 410 415

Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys

420 425 430

Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr

435 440 445

Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg

450 455 460

Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn

465 470 475 480

Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val

485 490 495

Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser

500 505 510

Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu

515 520 525

Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser

530 535 540

Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr

545 550 555 560

Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys

565 570 575

Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser

580 585 590

Cys Phe

<210> 2

<211> 594

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PB结构域

<400> 2

Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln

1 5 10 15

Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp

20 25 30

His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile

35 40 45

Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu

50 55 60

Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn

65 70 75 80

Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His

85 90 95

Cys Trp Ser Thr Ser Lys Pro Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu

100 105 110

Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile

115 120 125

Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile

130 135 140

Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg

145 150 155 160

Glu Ser Met Thr Ser Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile

165 170 175

Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn

180 185 190

His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr

195 200 205

Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu

210 215 220

Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val

225 230 235 240

Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile

245 250 255

Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu

260 265 270

Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Val Tyr Ile Pro Asn Lys Pro

275 280 285

Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys

290 295 300

Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn

305 310 315 320

Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val

325 330 335

His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile

340 345 350

Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val

355 360 365

Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn

370 375 380

Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro

385 390 395 400

Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu

405 410 415

Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys

420 425 430

Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr

435 440 445

Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg

450 455 460

Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn

465 470 475 480

Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val

485 490 495

Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Gly Leu Thr Ser

500 505 510

Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu

515 520 525

Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Lys Glu Val Pro Gly Thr Ser

530 535 540

Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr

545 550 555 560

Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Ser Ala Ser Cys Lys Lys

565 570 575

Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser

580 585 590

Cys Phe

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> SV40

<400> 3

Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> HIV

<400> 4

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 1785

<212> DNA

<213> 粉纹夜蛾

<400> 5

atgggtagtt ctttagacga tgagcatatc ctctctgctc ttctgcaaag cgatgacgag 60

cttgttggtg aggattctga cagtgaaata tcagatcacg taagtgaaga tgacgtccag 120

agcgatacag aagaagcgtt tatagatgag gtacatgaag tgcagccaac gtcaagcggt 180

agtgaaatat tagacgaaca aaatgttatt gaacaaccag gttcttcatt ggcttctaac 240

agaatcttga ccttgccaca gaggactatt agaggtaaga ataaacattg ttggtcaact 300

tcaaagtcca cgaggcgtag ccgagtctct gcactgaaca ttgtcagatc tcaaagaggt 360

ccgacgcgta tgtgccgcaa tatatatgac ccacttttat gcttcaaact attttttact 420

gatgagataa tttcggaaat tgtaaaatgg acaaatgctg agatatcatt gaaacgtcgg 480

gaatctatga caggtgctac atttcgtgac acgaatgaag atgaaatcta tgctttcttt 540

ggtattctgg taatgacagc agtgagaaaa gataaccaca tgtccacaga tgacctcttt 600

gatcgatctt tgtcaatggt gtacgtctct gtaatgagtc gtgatcgttt tgattttttg 660

atacgatgtc ttagaatgga tgacaaaagt atacggccca cacttcgaga aaacgatgta 720

tttactcctg ttagaaaaat atgggatctc tttatccatc agtgcataca aaattacact 780

ccaggggctc atttgaccat agatgaacag ttacttggtt ttagaggacg gtgtccgttt 840

aggatgtata tcccaaacaa gccaagtaag tatggaataa aaatcctcat gatgtgtgac 900

agtggtacga agtatatgat aaatggaatg ccttatttgg gaagaggaac acagaccaac 960

ggagtaccac tcggtgaata ctacgtgaag gagttatcaa agcctgtgca cggtagttgt 1020

cgtaatatta cgtgtgacaa ttggttcacc tcaatccctt tggcaaaaaa cttactacaa 1080

gaaccgtata agttaaccat tgtgggaacc gtgcgatcaa acaaacgcga gataccggaa 1140

gtactgaaaa acagtcgctc caggccagtg ggaacatcga tgttttgttt tgacggaccc 1200

cttactctcg tctcatataa accgaagcca gctaagatgg tatacttatt atcatcttgt 1260

gatgaggatg cttctatcaa cgaaagtacc ggtaaaccgc aaatggttat gtattataat 1320

caaactaaag gcggagtgga cacgctagac caaatgtgtt ctgtgatgac ctgcagtagg 1380

aagacgaata ggtggcctat ggcattattg tacggaatga taaacattgc ctgcataaat 1440

tcttttatta tatacagcca taatgtcagt agcaagggag aaaaggttca aagtcgcaaa 1500

aaatttatga gaaaccttta catgagcctg acgtcatcgt ttatgcgtaa gcgtttagaa 1560

gctcctactt tgaagagata tttgcgcgat aatatctcta atattttgcc aaatgaagtg 1620

cctggtacat cagatgacag tactgaagag ccagtaatga aaaaacgtac ttactgtact 1680

tactgcccct ctaaaataag gcgaaaggca aatgcatcgt gcaaaaaatg caaaaaagtt 1740

atttgtcgag agcataatat tgatatgtgc caaagttgtt tctga 1785

<210> 6

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PB结构域

<400> 6

atgggctcct ccctcgatga cgagcacatt ctgtccgctc tgctgcagtc cgacgatgag 60

ctggtcggag aagacagcga tagcgagatc agcgaccacg tctccgagga cgacgtccaa 120

agcgacacag aggaggcctt tatcgacgag gtccatgaag tgcagcccac atccagcggc 180

agcgagattc tggacgagca gaacgtgatc gaacagcccg gcagctccct cgccagcaat 240

agaattctga cactgcccca gagaaccatt agaggcaaga acaagcactg ttggagcacc 300

agcaagagca caagaagatc cagagtcagc gccctcaaca ttgtgagaag ccagaggggc 360

cctacaagaa tgtgtagaaa catctatgac cctctgctgt gtttcaagct gttcttcacc 420

gacgagatca tcagcgagat cgtgaagtgg accaacgctg agatctctct gaagaggaga 480

gaaagcatga ccggcgccac ctttagggac accaacgagg acgaaatcta tgcttttttt 540

ggaattctgg tgatgacagc cgtgaggaaa gacaaccaca tgtccacaga tgatctgttt 600

gatagatctc tgtccatggt gtatgtgagc gtcatgtcca gagatagatt cgatttcctc 660

attagatgtc tgaggatgga cgataagtcc atcagaccca cactgagaga gaacgacgtc 720

tttacccccg tgagaaaaat ctgggacctc ttcatccacc agtgcatcca aaattataca 780

cccggcgctc acctcaccat cgacgagcag ctcctcggct tcagaggaag atgccccttt 840

agaatgtaca ttcccaacaa gccctccaag tacggcatca agatcctcat gatgtgtgac 900

agcggcacca agtacatgat caacggcatg ccctatctgg gaagaggcac ccagaccaac 960

ggagtgcccc tcggcgaata ttacgtgaag gaactgagca aacccgtgca cggcagctgc 1020

agaaatatta catgcgataa ctggttcacc agcatccctc tggccaaaaa tctgctgcaa 1080

gagccttaca agctcacaat cgtgggaacc gtgaggagca acaagaggga gattcccgag 1140

gtgctcaaaa actctagatc tagacccgtg ggaacctcca tgttctgttt cgacggccct 1200

ctgacactcg tctcctataa gcccaagccc gccaagatgg tgtatctgct cagcagctgc 1260

gacgaagacg ccagcatcaa tgaatccacc ggcaagcccc agatggtcat gtactacaac 1320

cagaccaagg gaggcgtcga tacactggac cagatgtgtt ccgtcatgac atgctctaga 1380

aagaccaata gatggcccat ggctctgctg tacggcatga tcaacatcgc ttgcattaac 1440

tcctttatca tttactccca taacgtcagc tccaagggcg agaaggtgca gagcagaaag 1500

aaattcatga gaaatctgta catgagcctc accagcagct tcatgagaaa gaggctggag 1560

gcccccacac tgaaaagata tctgagagat aatatctcca acattctgcc taacgaggtc 1620

cccggcacaa gcgatgatag cacagaggag cccgtgatga agaagagaac atactgcaca 1680

tactgcccca gcaagattag aaggaaggcc aacgccagct gcaagaagtg caagaaggtc 1740

atctgcagag agcacaacat cgacatgtgc cagagctgtt tttga 1785

<210> 7

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PB结构域

<400> 7

atgggcagca gcctggacga cgagcacatc ctgagcgccc tgctgcagag cgacgacgag 60

ctggtcggcg aggacagcga cagcgaggtg agcgaccacg tgagcgagga cgacgtgcag 120

tccgacaccg aggaggcctt catcgacgag gtgcacgagg tgcagcctac cagcagcggc 180

tccgagatcc tggacgagca gaacgtgatc gagcagcccg gcagctccct ggccagcaac 240

aggatcctga ccctgcccca gaggaccatc aggggcaaga acaagcactg ctggtccacc 300

tccaagccca ccaggcggag cagggtgtcc gccctgaaca tcgtgagaag ccagaggggc 360

cccaccagga tgtgcaggaa catctacgac cccctgctgt gcttcaagct gttcttcacc 420

gacgagatca tcagcgagat cgtgaagtgg accaacgccg agatcagcct gaagaggcgg 480

gagagcatga cctccgccac cttcagggac accaacgagg acgagatcta cgccttcttc 540

ggcatcctgg tgatgaccgc cgtgaggaag gacaaccaca tgagcaccga cgacctgttc 600

gacagatccc tgagcatggt gtacgtgagc gtgatgagca gggacagatt cgacttcctg 660

atcagatgcc tgaggatgga cgacaagagc atcaggccca ccctgcggga gaacgacgtg 720

ttcacccccg tgagaaagat ctgggacctg ttcatccacc agtgcatcca gaactacacc 780

cctggcgccc acctgaccat cgacgagcag ctgctgggct tcaggggcag gtgccccttc 840

agggtctata tccccaacaa gcccagcaag tacggcatca agatcctgat gatgtgcgac 900

agcggcacca agtacatgat caacggcatg ccctacctgg gcaggggcac ccagaccaac 960

ggcgtgcccc tgggcgagta ctacgtgaag gagctgtcca agcccgtcca cggcagctgc 1020

agaaacatca cctgcgacaa ctggttcacc agcatccccc tggccaagaa cctgctgcag 1080

gagccctaca agctgaccat cgtgggcacc gtgagaagca acaagagaga gatccccgag 1140

gtcctgaaga acagcaggtc caggcccgtg ggcaccagca tgttctgctt cgacggcccc 1200

ctgaccctgg tgtcctacaa gcccaagccc gccaagatgg tgtacctgct gtccagctgc 1260

gacgaggacg ccagcatcaa cgagagcacc ggcaagcccc agatggtgat gtactacaac 1320

cagaccaagg gcggcgtgga caccctggac cagatgtgca gcgtgatgac ctgcagcaga 1380

aagaccaaca ggtggcccat ggccctgctg tacggcatga tcaacatcgc ctgcatcaac 1440

agcttcatca tctacagcca caacgtgagc agcaagggcg agaaggtgca gagccggaaa 1500

aagttcatgc ggaacctgta catgggcctg acctccagct tcatgaggaa gaggctggag 1560

gcccccaccc tgaagagata cctgagggac aacatcagca acatcctgcc caaagaggtg 1620

cccggcacca gcgacgacag caccgaggag cccgtgatga agaagaggac ctactgcacc 1680

tactgtccca gcaagatcag aagaaaggcc agcgccagct gcaagaagtg taagaaggtc 1740

atctgccggg agcacaacat cgacatgtgc cagagctgtt tctga 1785

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> SV40

<400> 8

aagaagaaga gaaaggtg 18

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> HIV

<400> 9

ggcagaaaga agagaagaca gagaagaaga 30

<210> 10

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> NSL结构域

<400> 10

ggcagaaaga agagaagaca gagaagaaga ccccccgccg gcaccagcgt gagcctgaag 60

aagaagagaa aggtgccccc cgcc 84

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 核酸凝缩肽

<400> 11

Arg Gln Arg Gln Arg Tyr Tyr Arg Gln Arg Gln Arg Gly Gly Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg

20

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 核酸凝缩肽

<400> 12

Arg Gln Arg Gln Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 13

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 核酸凝缩肽

<400> 13

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr Arg Gln Arg Gln Arg Gly Gly Arg

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Arg

20

<210> 14

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 核酸凝缩肽

<400> 14

Gly Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly

1 5 10 15

Gly Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys

20 25 30

Pro Arg Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210> 15

<211> 132

<212> PRT

<213> SV40

<400> 15

Asp Lys Val Leu Asn Arg Glu Glu Ser Leu Gln Leu Met Asp Leu Leu

1 5 10 15

Gly Leu Glu Arg Ser Ala Trp Gly Asn Ile Pro Leu Met Arg Lys Ala

20 25 30

Tyr Leu Lys Lys Cys Lys Glu Phe His Pro Asp Lys Gly Gly Asp Glu

35 40 45

Glu Lys Met Lys Lys Met Asn Thr Leu Tyr Lys Lys Met Glu Asp Gly

50 55 60

Val Lys Tyr Ala His Gln Pro Asp Phe Gly Gly Phe Trp Asp Ala Thr

65 70 75 80

Glu Ile Pro Thr Tyr Gly Thr Asp Glu Trp Glu Gln Trp Trp Asn Ala

85 90 95

Phe Asn Glu Glu Asn Leu Phe Cys Ser Glu Glu Met Pro Ser Ser Asp

100 105 110

Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys

115 120 125

Arg Lys Val Glu

130

<210> 16

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 细胞分裂促进结构域

<400> 16

atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60

aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120

tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180

aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240

actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300

gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360

caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaa 399

<210> 17

<211> 1824

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 修饰的pibbyBac转座酶

<400> 17

atgggcggca gaaagaagag aagacagaga agaagacccc ccgcctcctc cctcgatgac 60

gagcacattc tgtccgctct gctgcagtcc gacgatgagc tggtcggaga agacagcgat 120

agcgagatca gcgaccacgt ctccgaggac gacgtccaaa gcgacacaga ggaggccttc 180

atcgacgagg tgcacgaggt gcagcctacc agcagcggct ccgagatcct ggacgagcag 240

aacgtgatcg agcagcccgg cagctccctg gccagcaaca ggatcctgac cctgccccag 300

aggaccatca ggggcaagaa caagcactgc tggtccacct ccaagcccac caggcggagc 360

agggtgtccg ccctgaacat cgtgagaagc cagaggggcc ccaccaggat gtgcaggaac 420

atctacgacc ccctgctgtg cttcaagctg ttcttcaccg acgagatcat cagcgagatc 480

gtgaagtgga ccaacgccga gatcagcctg aagaggcggg agagcatgac ctccgccacc 540

ttcagggaca ccaacgagga cgagatctac gccttcttcg gcatcctggt gatgaccgcc 600

gtgaggaagg acaaccacat gagcaccgac gacctgttcg acagatccct gagcatggtg 660

tacgtgagcg tgatgagcag ggacagattc gacttcctga tcagatgcct gaggatggac 720

gacaagagca tcaggcccac cctgcgggag aacgacgtgt tcacccccgt gagaaagatc 780

tgggacctgt tcatccacca gtgcatccag aactacaccc ctggcgccca cctgaccatc 840

gacgagcagc tgctgggctt caggggcagg tgccccttca gggtctatat ccccaacaag 900

cccagcaagt acggcatcaa gatcctgatg atgtgcgaca gcggcaccaa gtacatgatc 960

aacggcatgc cctacctggg caggggcacc cagaccaacg gcgtgcccct gggcgagtac 1020

tacgtgaagg agctgtccaa gcccgtccac ggcagctgca gaaacatcac ctgcgacaac 1080

tggttcacca gcatccccct ggccaagaac ctgctgcagg agccctacaa gctgaccatc 1140

gtgggcaccg tgagaagcaa caagagagag atccccgagg tcctgaagaa cagcaggtcc 1200

aggcccgtgg gcaccagcat gttctgcttc gacggccccc tgaccctggt gtcctacaag 1260

cccaagcccg ccaagatggt gtacctgctg tccagctgcg acgaggacgc cagcatcaac 1320

gagagcaccg gcaagcccca gatggtgatg tactacaacc agaccaaggg cggcgtggac 1380

accctggacc agatgtgcag cgtgatgacc tgcagcagaa agaccaacag gtggcccatg 1440

gccctgctgt acggcatgat caacatcgcc tgcatcaaca gcttcatcat ctacagccac 1500

aacgtgagca gcaagggcga gaaggtgcag agccggaaaa agttcatgcg gaacctgtac 1560

atgggcctga cctccagctt catgaggaag aggctggagg cccccaccct gaagagatac 1620

ctgagggaca acatcagcaa catcctgccc aaagaggtgc ccggcaccag cgacgacagc 1680

accgaggagc ccgtgatgaa gaagaggacc tactgcacct actgtcccag caagatcaga 1740

agaaaggcca gcgccagctg caagaagtgt aagaaggtca tctgccggga gcacaacatc 1800

gacatgtgcc agagctgttt ctga 1824

<210> 18

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 修饰的pibbyBac转座酶

<400> 18

atgggcggca gaaagaagag aagacagaga agaagacccc ccgccggcac cagcgtgagc 60

ctgaagaaga agagaaaggt gccccccgcc tcctccctcg atgacgagca cattctgtcc 120

gctctgctgc agtccgacga tgagctggtc ggagaagaca gcgatagcga ggtgagcgac 180

cacgtctccg aggacgacgt ccaaagcgac acagaggagg ccttcatcga cgaggtgcac 240

gaggtgcagc ctaccagcag cggctccgag atcctggacg agcagaacgt gatcgagcag 300

cccggcagct ccctggccag caacaggatc ctgaccctgc cccagaggac catcaggggc 360

aagaacaagc actgctggtc cacctccaag cccaccaggc ggagcagggt gtccgccctg 420

aacatcgtga gaagccagag gggccccacc aggatgtgca ggaacatcta cgaccccctg 480

ctgtgcttca agctgttctt caccgacgag atcatcagcg agatcgtgaa gtggaccaac 540

gccgagatca gcctgaagag gcgggagagc atgacctccg ccaccttcag ggacaccaac 600

gaggacgaga tctacgcctt cttcggcatc ctggtgatga ccgccgtgag gaaggacaac 660

cacatgagca ccgacgacct gttcgacaga tccctgagca tggtgtacgt gagcgtgatg 720

agcagggaca gattcgactt cctgatcaga tgcctgagga tggacgacaa gagcatcagg 780

cccaccctgc gggagaacga cgtgttcacc cccgtgagaa agatctggga cctgttcatc 840

caccagtgca tccagaacta cacccctggc gcccacctga ccatcgacga gcagctgctg 900

ggcttcaggg gcaggtgccc cttcagggtc tatatcccca acaagcccag caagtacggc 960

atcaagatcc tgatgatgtg cgacagcggc accaagtaca tgatcaacgg catgccctac 1020

ctgggcaggg gcacccagac caacggcgtg cccctgggcg agtactacgt gaaggagctg 1080

tccaagcccg tccacggcag ctgcagaaac atcacctgcg acaactggtt caccagcatc 1140

cccctggcca agaacctgct gcaggagccc tacaagctga ccatcgtggg caccgtgaga 1200

agcaacaaga gagagatccc cgaggtcctg aagaacagca ggtccaggcc cgtgggcacc 1260

agcatgttct gcttcgacgg ccccctgacc ctggtgtcct acaagcccaa gcccgccaag 1320

atggtgtacc tgctgtccag ctgcgacgag gacgccagca tcaacgagag caccggcaag 1380

ccccagatgg tgatgtacta caaccagacc aagggcggcg tggacaccct ggaccagatg 1440

tgcagcgtga tgacctgcag cagaaagacc aacaggtggc ccatggccct gctgtacggc 1500

atgatcaaca tcgcctgcat caacagcttc atcatctaca gccacaacgt gagcagcaag 1560

ggcgagaagg tgcagagccg gaaaaagttc atgcggaacc tgtacatggg cctgacctcc 1620

agcttcatga ggaagaggct ggaggccccc accctgaaga gatacctgag ggacaacatc 1680

agcaacatcc tgcccaaaga ggtgcccggc accagcgacg acagcaccga ggagcccgtg 1740

atgaagaaga ggacctactg cacctactgt cccagcaaga tcagaagaaa ggccagcgcc 1800

agctgcaaga agtgtaagaa ggtcatctgc cgggagcaca acatcgacat gtgccagagc 1860

tgtttctga 1869

<210> 19

<211> 486

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 修饰的pibbyBac转座酶

<400> 19

atgggcggca gaaagaagag aagacagaga agaagacccc ccgccggcac cagcgtgagc 60

ctgaagaaga agagaaaggt gccccccgcc gataaagttt taaacagaga ggaatctttg 120

cagctaatgg accttctagg tcttgaaagg agtgcctggg ggaatattcc tctgatgaga 180

aaggcatatt taaaaaaatg caaggagttt catcctgata aaggaggaga tgaagaaaaa 240

atgaagaaaa tgaatactct gtacaagaaa atggaagatg gagtaaaata tgctcatcaa 300

cctgactttg gaggcttctg ggatgcaact gagattccaa cctatggaac tgatgaatgg 360

gagcagtggt ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct 420

agtgatgatg aggctactgc tgactctcaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag 480

gtagaa 486

<210> 20

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 修饰的pibbyBac转座酶

<400> 20

atgggcggca gaaagaagag aagacagaga agaagacccc ccgccggcac cagcgtgagc 60

ctgaagaaga agagaaaggt gccccccgcc gataaagttt taaacagaga ggaatctttg 120

cagctaatgg accttctagg tcttgaaagg agtgcctggg ggaatattcc tctgatgaga 180

aaggcatatt taaaaaaatg caaggagttt catcctgata aaggaggaga tgaagaaaaa 240

atgaagaaaa tgaatactct gtacaagaaa atggaagatg gagtaaaata tgctcatcaa 300

cctgactttg gaggcttctg ggatgcaact gagattccaa cctatggaac tgatgaatgg 360

gagcagtggt ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct 420

agtgatgatg aggctactgc tgactctcaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag 480

gtagaaggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttcttcct ccctcgatga cgagcacatt 540

ctgtccgctc tgctgcagtc cgacgatgag ctggtcggag aagacagcga tagcgaggtg 600

agcgaccacg tctccgagga cgacgtccaa agcgacacag aggaggcctt tatcatcgac 660

gaggtgcacg aggtgcagcc taccagcagc ggctccgaga tcctggacga gcagaacgtg 720

atcgagcagc ccggcagctc cctggccagc aacaggatcc tgaccctgcc ccagaggacc 780

atcaggggca agaacaagca ctgctggtcc acctccaagc ccaccaggcg gagcagggtg 840

tccgccctga acatcgtgag aagccagagg ggccccacca ggatgtgcag gaacatctac 900

gaccccctgc tgtgcttcaa gctgttcttc accgacgaga tcatcagcga gatcgtgaag 960

tggaccaacg ccgagatcag cctgaagagg cgggagagca tgacctccgc caccttcagg 1020

gacaccaacg aggacgagat ctacgccttc ttcggcatcc tggtgatgac cgccgtgagg 1080

aaggacaacc acatgagcac cgacgacctg ttcgacagat ccctgagcat ggtgtacgtg 1140

agcgtgatga gcagggacag attcgacttc ctgatcagat gcctgaggat ggacgacaag 1200

agcatcaggc ccaccctgcg ggagaacgac gtgttcaccc ccgtgagaaa gatctgggac 1260

ctgttcatcc accagtgcat ccagaactac acccctggcg cccacctgac catcgacgag 1320

cagctgctgg gcttcagggg caggtgcccc ttcagggtct atatccccaa caagcccagc 1380

aagtacggca tcaagatcct gatgatgtgc gacagcggca ccaagtacat gatcaacggc 1440

atgccctacc tgggcagggg cacccagacc aacggcgtgc ccctgggcga gtactacgtg 1500

aaggagctgt ccaagcccgt ccacggcagc tgcagaaaca tcacctgcga caactggttc 1560

accagcatcc ccctggccaa gaacctgctg caggagccct acaagctgac catcgtgggc 1620

accgtgagaa gcaacaagag agagatcccc gaggtcctga agaacagcag gtccaggccc 1680

gtgggcacca gcatgttctg cttcgacggc cccctgaccc tggtgtccta caagcccaag 1740

cccgccaaga tggtgtacct gctgtccagc tgcgacgagg acgccagcat caacgagagc 1800

accggcaagc cccagatggt gatgtactac aaccagacca agggcggcgt ggacaccctg 1860

gaccagatgt gcagcgtgat gacctgcagc agaaagacca acaggtggcc catggccctg 1920

ctgtacggca tgatcaacat cgcctgcatc aacagcttca tcatctacag ccacaacgtg 1980

agcagcaagg gcgagaaggt gcagagccgg aaaaagttca tgcggaacct gtacatgggc 2040

ctgacctcca gcttcatgag gaagaggctg gaggccccca ccctgaagag atacctgagg 2100

gacaacatca gcaacatcct gcccaaagag gtgcccggca ccagcgacga cagcaccgag 2160

gagcccgtga tgaagaagag gacctactgc acctactgtc ccagcaagat cagaagaaag 2220

gccagcgcca gctgcaagaa gtgtaagaag gtcatctgcc gggagcacaa catcgacatg 2280

tgccagagct gtttctga 2298

<210> 21

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 细胞分裂促进结构域 + NLS结构域

<400> 21

atgggcggca gaaagaagag aagacagaga agaagacccc ccgccggcac cagcgtgagc 60

ctgaagaaga agagaaaggt gccccccgcc gataaagttt taaacagaga ggaatctttg 120

cagctaatgg accttctagg tcttgaaagg agtgcctggg ggaatattcc tctgatgaga 180

aaggcatatt taaaaaaatg caaggagttt catcctgata aaggaggaga tgaagaaaaa 240

atgaagaaaa tgaatactct gtacaagaaa atggaagatg gagtaaaata tgctcatcaa 300

cctgactttg gaggcttctg ggatgcaact gagattccaa cctatggaac tgatgaatgg 360

gagcagtggt ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct 420

agtgatgatg aggctactgc tgactctcaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag 480

gtagaatga 489

Claims

1.修饰的piggyBac转座酶多肽，其包含：

piggyBac转座酶氨基酸序列；和

核定位信号氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述piggyBac转座酶氨基酸序列具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列和SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述核定位信号氨基酸序列是其中人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT(转录反式激活因子)蛋白的核定位信号与猿猴病毒40(SV40)的大T抗原蛋白的核定位信号相连接的肽。

4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述核定位信号氨基酸序列是其中SEQ ID NO:4的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相连接的肽。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其进一步包含促进细胞分裂的肽的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述促进细胞分裂的肽的氨基酸序列具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列。

7.编码修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸，其包含：

编码piggyBac转座酶的碱基序列；和

编码核定位信号的碱基序列。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA或RNA。

9.根据权利要求7或8所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA并且所述编码piggyBac转座酶的碱基序列具有SEQ ID NO:5的序列。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的多核苷酸，其中与构成所述修饰的piggyBac转座酶的氨基酸相对应的密码子中的至少一个密码子针对人进行了优化。

11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中“针对人进行了优化”是针对下述每个氨基酸使用以下密码子：

丙氨酸(A)的密码子为GCU或GCC；

半胱氨酸(C)的密码子为UGC或UGU；

天冬氨酸(D)的密码子为GAC或GAU；

谷氨酸(E)的密码子为GAA或GAG；

苯丙氨酸(F)的密码子为UUC或UUU；

甘氨酸(G)的密码子为GGA或GGC；

组氨酸(H)的密码子为CAC或CAU；

异亮氨酸(I)的密码子为AUC或AUU；

赖氨酸(K)的密码子为AAA或AAG；

亮氨酸(L)的密码子为CUC或CUG；

甲硫氨酸(M)的密码子为AUG；

天冬酰胺(N)的密码子为AAC或AAU；

脯氨酸(P)的密码子为CCC或CCU；

谷氨酰胺(Q)的密码子为CAA或CAG；

精氨酸(R)的密码子为AGA或AGG；

丝氨酸(S)的密码子为AGC、UCC或UCU；

苏氨酸(U)的密码子为ACA或ACC；

缬氨酸(V)的密码子为GUC或GUG；

色氨酸(W)的密码子为UGG；

酪氨酸(Y)的密码子为UAC或UAU；和

终止子的密码子为UGA；

其中A是腺嘌呤，U是尿嘧啶，C是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，并且当所述多核苷酸是DNA时，U变为胸腺嘧啶(T)。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA并且所述编码piggyBac转座酶的碱基序列具有SEQ ID NO:6或7的序列。

13.根据权利要求7至12中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA并且所述编码核定位信号的碱基序列具有SEQ ID NO:8、9或10的序列。

14.根据权利要求7至13中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:17或18的碱基序列。

15.根据权利要求7至14中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含编码促进细胞分裂的肽的碱基序列。

16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中所述多肽是DNA，并且所述编码促进细胞分裂的肽的碱基序列具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

17.根据权利要求15或16所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:20的碱基序列。

18.用于将靶序列整合到细胞基因组中的引入载体，其包含：

脂质颗粒；和

封装在脂质颗粒中的修饰的piggyBac转座酶多肽或编码所述修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸，

其中所述修饰的piggyBac转座酶多肽包括piggyBac转座酶氨基酸序列和核定位信号氨基酸序列，

编码所述修饰的piggyBac转座酶的多核苷酸包括编码piggyBac转座酶的碱基序列和编码核定位信号的碱基序列。

19.根据权利要求18所述的引入载体，

其中所述多肽进一步包括促进细胞分裂的肽的氨基酸序列，和

所述多核苷酸进一步包括编码所述促进细胞分裂的肽的碱基序列。

20.根据权利要求18或19所述的引入载体，其中含有靶序列的供体DNA进一步包封在脂质颗粒中。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的引入载体，其中所述脂质颗粒含有式(1-01)所示的脂质化合物和/或式(1-02)所示的脂质化合物作为构成成分：

22.用于将靶序列整合到细胞基因组中的试剂盒，所述试剂盒包含：

根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或根据权利要求7至17中任一项所述的多核苷酸；和

含有所述靶序列的供体DNA。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述多肽或所述多核苷酸和所述供体DNA包封在脂质颗粒中。

24.将靶序列整合到细胞基因组中的方法，其包括将含有靶序列的供体DNA引入具有修饰的piggyBac转座酶多肽或编码所述修饰的piggyBac转座酶多肽的多核苷酸的细胞，

其中所述修饰的piggyBac转座酶多肽包括piggyBac转座酶氨基酸序列和核定位信号氨基酸序列，和

25.根据权利要求24所述的方法，

26.根据权利要求24或25所述的方法，其中使用脂质体法、脂质体转染法、电穿孔法、声穿孔法或磁转染法进行引入。

27.根据权利要求26所述的方法，

其中通过脂质体法进行引入，和

使脂质颗粒、包封在所述脂质颗粒中的供体DNA和多肽或多核苷酸与所述细胞接触。

28.生产细胞的方法，其包括将含有靶序列的供体DNA引入具有修饰的piggyBac转座酶多肽或编码所述修饰的piggyBac转座酶多肽的多核苷酸的细胞，

29.根据权利要求28所述的方法，

30.根据权利要求28或29所述的方法，其中使用脂质体法、脂质体转染法、电穿孔法、声穿孔法或磁转染法进行引入。

31.根据权利要求30所述的方法，

其中通过脂质体法进行引入，和