CN112204047A - Pd-l1结合黏合素及与其相关的用途 - Google Patents

Pd-l1结合黏合素及与其相关的用途 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及包含PD‑L1结合黏合素多肽序列的蛋白质，编码那些蛋白质的基因表达构建体，表达那些蛋白质的细胞，以及那些蛋白质、基因表达构建体和细胞的药物制剂和在治疗多种人病症(包括癌症)中的用途。

Description

PD-L1结合黏合素及与其相关的用途
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(a)要求2018年4月11日提交的英国申请No.1805963.4的权益，其通过引用整体并入本文。
背景技术
人癌症具有许多遗传和表观遗传学改变，产生了可能可被免疫系统识别的新抗原(Sjoblom et al.，Science 314：268-74(2006))。虽然在临床前模型和患者中观察到对癌症的内源性免疫应答，但是这种应答无效，并且已建立的癌症被视为“自身”并且被免疫系统耐受。导致这种耐受状态的肿瘤可利用数种不同的机制来主动抑制宿主免疫应答(Topalian et al.，J Clin Oncol 29：4828-36(2011)；Mellman et al.，Nature 480：480-489(2011))。在这些机制中，肿瘤可选择通常终止免疫应答以减轻附属组织损伤的内源性“免疫检查点”以逃避免疫破坏。开发特异性免疫检查点途径抑制剂的努力已开始以提供新的免疫治疗方法以用于治疗癌症，包括开发抗CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)以用于治疗患有晚期黑素瘤的患者(Nodi et al.，New Engl J Med 363：711-23(2010))。
程序性死亡1(Programmed Death-1，PD-1)是由活化的T细胞和B细胞表达的关键免疫检查点受体并介导免疫抑制。PD-1是CD28受体家族的成员，该受体家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。已确定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体，程序性死亡配体1(Programmed Death Ligand-1，PD-L1)和程序性死亡配体2(Programmed Death Ligand-2，PD-L2)，它们在抗原呈递细胞以及许多人癌症上表达并且已显示在与PD-1结合之后下调T细胞活化和细胞因子分泌(Freeman et al.，J.Exp.Med.192(7)：1027-34(2000)；Latchman et al.，Nat Immunol 2：261-8(2001))。
PD-1主要在周围组织中起作用，在该周围组织中，活化的T细胞可遇到由肿瘤和/或基质细胞表达的免疫抑制性PD-L1(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(B7-DC)配体(Flieset al.，Yale J Biol Med 84：409-21(2011)；Topalian et al.，Curr Opin Immuno 24：1-6(2012))。
在临床前模型中，PD-1/PD-L1相互作用的抑制介导了强效的抗肿瘤活性(美国专利No.8,008,449和7,943,743)。显示出PD-L1的上调可使癌症逃避宿主免疫系统。对来自患有肾细胞癌的患者的196个肿瘤标本进行的分析发现，PD-L1的高肿瘤表达与肿瘤侵袭性提高和死亡风险提高4.5倍相关(Thompson et al.，Proc Natl Acad Sci USA 101(49)：17174-9(2004))。具有较高PD-L1表达的卵巢癌患者的预后比具有较低表达的那些显著更差。PD-L1表达与上皮内CD8+T淋巴细胞计数呈负相关，表明肿瘤细胞上的PD-L1可抑制抗肿瘤CD8+T细胞(Hamanishi et al.，Proc Natl Acad Sci USA 104(9)：3360-3365(2007))。
PD-L1也与感染性疾病(特别是慢性感染性疾病)有关。细胞毒性CD8 T淋巴细胞(CTL)在控制感染中发挥关键作用。然而，活化的CTL在慢性感染期间通常会丧失效应子功能。B7/CD28家族的PD-1受体及其配体PD-L1作为T细胞共抑制途径发挥作用，并且正在成为在人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、以及能够建立慢性感染的其他细菌、原生动物和病毒病原体的慢性感染期间将效应子CTL转化为耗尽的CTL的主要调节剂。这样的细菌和原生动物病原体可包括大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌属(Staphylococcussp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、贾第虫(Giardia)、疟疾、利什曼原虫(Leishmania)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。重要的是，对PD-1/PD-L1途径的阻断能够使耗尽的CTL恢复功能能力。因此，PD1/PD-L1是开发针对慢性细菌和病毒感染的有效预防性和治疗性疫苗接种的靶标(参见，例如，Hofmeyer et al.，Journal of Biomedicine and Biotechnology，vol.2011，Article ID 451694，9 pages，doi：10.1155/2011/451694)。
最近的研究还表明，全身性免疫抑制可降低进行神经退行性疾病中脑修复所需的保护性、细胞介导的免疫应答的能力。通过使用阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)的小鼠模型，显示出针对程序性死亡1(PD-1)途径的免疫检查点阻断可引起干扰素γ依赖性全身性免疫应答，随后单核细胞来源的巨噬细胞被募集至脑。当在具有确定病理学的小鼠中诱导时，这种免疫应答导致脑淀粉样蛋白β(Aβ)斑块的清除和认知能力改善。这些发现表明，在神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)中可使用针对PD-L1的抗体来治疗性地靶向免疫检查点(参见，例如Baruch et al.，Nature Medicine，January 2016，doi：10.1038/nm.4022)。
已开发了针对PD-L1的特异性抗体作为抗癌剂(参见美国专利No.9,212,224和8,008,449)。PD-1/PD-L1相互作用的Ab抑制剂用于治疗癌症的用途已进入临床试验(Brahmeret al.，J Clin Oncol 28：3167-75(2010)；Flies et al.，Yale J Biol Med 84：409-21(2011)；Topalian et al.，N Engl J Med 366：2443-54(2012)；Brahmer et al.，N Engl JMed 366：2455-65(2012))。然而，需要可用于治疗癌症、感染性疾病和神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病)的另外的PD-L1抑制活性，例如PD-L1抑制剂，其可容易地与提供例如治疗活性或PK/ADME修饰活性的其他多肽序列一起格式化为融合蛋白的一部分。本申请满足了这个需求以及另一些需求。
发明概述
在一些方面中，本公开内容提供了包含PD-L1结合黏合素多肽(PD-L1 bindingaffimer polypeptide)序列的蛋白质，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制与其结合的所述PD-L1与PD-1的相互作用。
在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽结合人PD-L1并且阻断与人PD-1的相互作用。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽结合人PD-L1并且阻断与人CD80的相互作用。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以1×10-7M或更小的Kd、1×10-8M或更小的Kd、1×10-9M或更小的Kd、或者甚至1×10-10M或更小的Kd结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以10-3s-1或更慢、10-4s-1或更慢、或者甚至10-5s-1或更慢的Koff结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以103M-1s-1或更快、104M-1s-1或更快、105M-1s-1或更快、或者甚至106M-1s-1或更快的Kon结合PD-L1。在一些实施方案中，在与人PD-1的竞争性结合测定中，PD-L1结合黏合素多肽结合PD-L1，其中IC50为1μM或更小、100nM或更小、40nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、或者甚至0.1nM或更小。
在一些实施方案中，在与人CD80(B7-1)的竞争性结合测定中，PD-L1结合黏合素多肽结合PD-L1，其中IC50为1μM或更小、100nM或更小、40nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、或者0.1nM或更小。
在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽具有通式(I)所示氨基酸序列
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3(I)
其中：
FR1是MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA(SEQ ID NO：1)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；
FR2是GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL(SEQ ID NO：2)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；
FR3是EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F(SEQ ID NO：3)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；并且
Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基；并且
n和m各自独立地是3至20的整数。
对于一些实施方案，FR1可以是与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。对于一些实施方案，FR2是与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。对于一些实施方案，FR3是与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。
在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽具有以下通式所示氨基酸序列：
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQID NO：4)
其中：
Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基；
n和m各自独立地是3至20的整数；
Xaa1是Gly、Ala、Val、Arg、Lys、Asp或Glu；
Xaa2是Gly、Ala、Val、Ser或Thr；
Xaa3是Arg、Lys、Asn、Gln、Ser、Thr；
Xaa4是Gly、Ala、Val、Ser或Thr；
Xaa5是Ala、Val、Ile、Leu、Gly或Pro；
Xaa6是Gly、Ala、Val、Asp或Glu；并且
Xaa7是Ala、Val、Ile、Leu、Arg或Lys。
对于一些实施方案，Xaa1是Gly、Ala、Arg或Lys，更甚至更优选Gly或Arg。对于一些实施方案，Xaa2是Gly或Ser。对于一些实施方案，Xaa3是Arg Arg、Lys、Asn或Gln，更优选Lys或Asn。对于一些实施方案，Xaa4是Gly或Ser。对于一些实施方案，Xaa5为Ala、Val、Ile、Leu、Gly或Pro，更优选Ile、Leu或Pro，并且甚至更优选Leu或Pro。对于一些实施方案，Xaa6是Ala、Val、Asp或Glu，甚至更优选Ala或Glu。对于一些实施方案，Xaa7是Ile、Leu或Arg，更优选Leu或Arg。
在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽具有以下通式所示氨基酸序列：
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADRVLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQ ID NO：5)
其中Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基；并且n和m各自独立地是3至20的整数。
在上述序列的一些实施方案中，(Xaa)n(“环2”)是通式(II)所示氨基酸序列
-aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6-(II)
其中：
aa1表示具有碱性侧链的氨基酸残基；
aa2表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选具有小的脂肪族侧链、中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基；
aa3表示具有芳香族或碱性侧链的氨基酸残基；
aa4表示具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链，优选中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基；
aa5表示具有中性极性或带电荷(酸性或碱性)或小的脂肪族或芳香族侧链，优选中性极性侧链或带电荷侧链的氨基酸残基；并且
aa6表示具有芳香族或酸性侧链的氨基酸残基。
对于一些实施方案，aa1表示Lys、Arg或His，更优选Lys或Arg。对于一些实施方案，aa2表示Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，更优选Ala、Gln、Asp或Glu。对于一些实施方案，aa3表示Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，优选Phe、Tyr、Trp，更优选His或Tyr、Trp或His。对于一些实施方案，aa4表示Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，更优选Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu。对于一些实施方案，aa5表示Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，更优选Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。对于一些实施方案，aa6表示Phe、Tyr、Trp、Asp或Glu；优选Trp或Asp；更优选Trp。
在上述序列的另一些特定实施方案中，(Xaa)n(“环2”)是通式(III)所示氨基酸序列
-aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp-(III)
其中：
aa1表示具有碱性侧链或芳香族侧链的氨基酸残基；
aa2表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选具有小的脂肪族侧链、中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基；
aa3表示具有芳香族或碱性侧链的氨基酸残基，优选Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，更优选Phe、Tyr、Trp或His，并且甚至更优选Tyr、Trp或His；
aa4表示具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链，优选中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，并且甚至更优选Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu；并且
aa5表示具有中性极性或带电荷(酸性或碱性)或小的脂肪族或芳香族侧链，优选中性极性侧链或带电荷侧链的氨基酸残基，更优选Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，并且甚至更优选Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。
对于一些实施方案，aa1表示Lys、Arg、His、Ser、Thr、Asn或Gln，更优选Lys、Arg、His、Asn或Gln，并且甚至更优选Lys或Asn。对于一些实施方案，aa2表示Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，更优选Ala、Gln、Asp或Glu。对于一些实施方案，aa3表示Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，更优选Phe、Tyr、Trp或His，并且甚至更优选Tyr、Trp或His。对于一些实施方案，aa4表示Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，并且甚至更优选Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu。对于一些实施方案，aa5表示Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，并且甚至更优选Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。
在上述序列的一些实施方案中，(Xaa)n(“环2”)是选自SEQ ID NO：6至41的氨基酸序列，或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，并且更优选与其具有至少85％、90％、95％或甚至98％同源性的氨基酸序列。
在上述序列的一些实施方案中，(Xaa)n(“环2”)是选自SEQ ID NO：6至41的氨基酸序列，或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且更优选与其具有至少85％、90％、95％或甚至98％同一性的氨基酸序列。
在上述序列的一些实施方案中，(Xaa)m(“环4”)是通式(IV)所示氨基酸序列
-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-(IV)
其中：
aa7表示具有中性极性或非极性侧链或者酸性侧链的氨基酸残基；
aa8表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或者芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基；
aa9表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或者芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有中性极性侧链或酸性侧链的氨基酸残基；
aa10表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或者芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基；
aa11表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基；
aa12表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有酸性侧链的氨基酸残基；
aa13表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有酸性侧链的氨基酸残基；
aa14表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基；并且
aa15表示氨基酸残基，优选具有中性极性或中性非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基。
对于一些实施方案，aa7表示Gly、Ala、Val、Pro、Trp、Gln、Ser、Asp或Glu，并且甚至更优选Gly、Ala、Trp、Gln、Ser、Asp或Glu。对于一些实施方案，aa8表示Asp、Glu、Lys、Arg、His、Gln、Ser、Thr、Asn、Ala、Val、Pro、Gly、Tyr或Phe，并且甚至更优选Asp、Glu、Lys、Arg、His或Gln。对于一些实施方案，aa9表示Gln、Ser、Thr、Asn、Asp、Glu、Arg、Lys、Gly、Leu、Pro或Tyr，并且甚至更优选Gln、Thr或Asp。对于一些实施方案，aa10表示Asp、Glu、Arg、His、Lys、Ser、Gln、Asn、Ala、Leu、Tyr、Trp、Pro或Gly，并且甚至更优选Asp、Glu、His、Gln、Asn、Leu、Trp或Gly。对于一些实施方案，aa11表示Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Arg、Lys、His、Val、Ile、Tyr或Gly，并且甚至更优选Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Lys或His。对于一些实施方案，aa12表示Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Asn、Lys、Arg、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr、Phe或Gly，并且甚至更优选Asp、Glu、Ser、Tyr、Trp、Arg或Lys。对于一些实施方案，aa13表示Ser、Thr、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Gly、Pro、Asp、Glu、His、Arg、Trp、Tyr或Phe，并且甚至更优选Ser、Thr、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Gly、Asp或Glu。对于一些实施方案，aa14表示Ala、Ile、Trp、Pro、Asp、Glu、Arg、Lys、His、Ser、Thr、Gln或Asn，并且甚至更优选Ala、Pro、Asp、Glu、Arg、Lys、Ser、Gln或Asn。对于一些实施方案，aa15表示His、Arg、Lys、Asp、Ser、Thr、Gln、Asn、Ala、Val、Leu、Gly或Phe，并且甚至更优选His、Arg、Lys、Asp、Ser、Thr、Gln或Asn。
在上述序列的一些实施方案中，(Xaa)n(“环4”)是选自SEQ ID NO：42至77的氨基酸序列，或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，并且更优选与其具有至少85％、90％、95％或甚至98％同源性的氨基酸序列。
在上述序列的一些实施方案中，(Xaa)n(“环4”)是选自SEQ ID NO：42至77的氨基酸序列，或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且更优选与其具有至少85％、90％、95％或甚至98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽具有选自SEQ ID NO：78至86的氨基酸序列，或者与其具有至少70％同源性并且甚至更优选与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽具有选自SEQ ID NO：78至86的氨基酸序列，或者与其具有至少70％同一性并且甚至更优选与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽具有可由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸具有与SEQ ID NO：87至94之一的第1至336位核苷酸相对应的编码序列，或者与其具有至少70％同一性并且甚至更优选与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的编码序列。
在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽具有可由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸具有在45℃下6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)随后在65℃下0.2×SSC中洗涤的严格条件下与SEQ ID NO：87至94中的任一种杂交的编码序列。
在一些实施方案中，本文中所述的黏合素剂(Affimer Agent)蛋白质通过PD-L1结合黏合素多肽以与通过抗PD-L1抗体阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维单抗(Avelumab)和/或度伐单抗(Durvalumab)的PD-L1结合竞争的方式结合PD-L1。
在一些实施方案中，本文中所述的黏合素剂蛋白质包含与PD-L1形成晶体结构的PD-L1结合黏合素多肽，所述晶体结构包含涉及选自以下的至少10个PD-L1残基的接合面(interface)：Ile-54、Tyr-56、Glu-58、Glu-60、Asp-61、Lys-62、Asn-63、Gln 66、Val-68、Val-76、Val-111、Arg-113、Met-115、Ile-116、Ser-117、Gly-120、Ala-121、Asp-122、Tyr-123和Arg-125。
在一些实施方案中，本文中所述的黏合素剂蛋白质以依赖于与PD-L1结合的PD-L1结合黏合素多肽的方式(a)提高人PBMC中带有某些Vfi链(例如VB3、VB12、VB14和VB17)的T细胞亚群中的T细胞受体信号传导(当用葡萄球菌肠毒素B(staphylococcus enterotoxinB，SEB)处理时)；(b)在SEB测定中提高干扰素γ的产生；和/或(c)在SEB测定中以剂量依赖性方式提高白介素2(IL-2)的产生。
在一些实施方案中，本文中所述的黏合素剂蛋白质以依赖于与PD-L1结合的PD-L1结合黏合素多肽的方式(a)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中提高T细胞增殖；(b)在MLR测定中提高干扰素γ的产生；和/或(c)在MLR测定中提高白介素2(IL-2)的分泌。
在一些实施方案中，黏合素剂是融合蛋白，其除PD-L1结合黏合素多肽之外还可包含(用于举例说明)选自以下的一种或更多种另外的氨基酸序列：分泌信号序列、肽接头序列、亲和标签、跨膜结构域、细胞表面保留序列、用于翻译后修饰的底物识别序列、用于产生通过蛋白质-蛋白质相互作用而聚集的蛋白质的多聚体结构的多聚化结构域、半衰期延长多肽部分、用于改变抗体的组织定位和抗原结合位点的多肽序列，以及结合PD-L1或不同靶标的一个或更多个另外的黏合素多肽序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含例如选自以下的半衰期延长多肽部分：Fc结构域或其部分、白蛋白或其部分、白蛋白结合多肽部分、运铁蛋白或其部分、运铁蛋白结合多肽部分、纤连蛋白或其部分，或者纤连蛋白结合多肽部分。
在融合蛋白包含Fc结构域或其部分的情况下，在一些实施方案中，其是保留FcRn结合的Fc结构域。
在融合蛋白包含Fc结构域或其部分的情况下，在一些实施方案中，Fc结构域或其部分来自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。
在一些实施方案中，融合蛋白具有SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，或者与其具有至少70％同源性并且甚至更优选与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的序列。
在融合蛋白包括Fc结构域或其部分的情况下，在一些实施方案中，Fc结构域或其部分保留选自以下的效应子功能：C1q结合、补体依赖性细胞毒性(complement dependentcytotoxicity，CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)；吞噬作用；B细胞受体的下调，或其组合。
在一些实施方案中，在融合蛋白包含半衰期延长多肽部分的情况下，该部分相对于其不存在于蛋白质中的情况而言使所述蛋白质的血清半衰期提高到至少5倍，例如，10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍或甚至1000倍。
在一些实施方案中，本公开内容的融合蛋白被提供为适用于人患者中之治疗用途的药物制剂，其还包含一种或更多种可药用赋形剂、缓冲剂、盐等。
在本公开内容的另一方面中，提供了重组抗体，其包含形成与靶抗原结合的一个或更多个抗原结合位点的一个或更多个VH和/或VL链，其中所述VH和/或VL链中的至少一个是还包含至少一个PD-L1结合黏合素多肽序列的融合蛋白，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd结合PD-L1并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽结合人PD-L1并且阻断与人PD-1的相互作用。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以1×10-7M或更小的Kd、1×10-8M或更小的Kd、1×10-9M或更小的Kd、或者甚至1×10-10M或更小的Kd结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以10-3s-1或更慢、10-4s-1或更慢、或者甚至10-5s-1或更慢的Koff结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以103M-1s-1或更快、104M-1s-1或更快、105M-1s-1或更快、或者甚至106M-1s-1或更快的Kon结合PD-L1。在一些实施方案中，在与人PD-1的竞争性结合测定中，PD-L1结合黏合素多肽结合PD-L1，其中IC50为1μM或更小、100nM或更小、40nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、或者甚至0.1nM或更小。
在一些实施方案中，VH链包含Fc结构域。
在一些实施方案中，靶抗原是免疫检查点。
在一些实施方案中，靶抗原是免疫共刺激受体，并且嵌合抗体在结合之后激动所述共刺激受体。
在一些实施方案中，靶抗原是血管生成因子或其受体，并且嵌合抗体拮抗所述血管生成因子或其受体。
在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原。
在一些实施方案中，靶抗原是可溶性免疫抑制因子或其受体，并且嵌合抗体抑制所述免疫抑制因子的免疫抑制活性以充当免疫刺激信号。
在一些实施方案中，其中靶抗原选自：PD-1、PD-L2、CTLA-4、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT、CD28、ICOS、CD137、OX40、GITR、CD27、CD30、HVEM、DNAM-1或CD28H、CEACAM-1、CEACAM-5、BTLA、LA1R1、CD160、2B4、TGFR、B7-H3、B7-H4、CD40、CD4OL、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、半乳凝素-9(Galectin-9)、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、LIGHT、MHC I类或II类、NKG2a、NKG2d、OX4OL、PVR、SIRPα、TCR、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、VEGF、VEGF受体、EGFR、Her2/neu、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E或TSLP。
在一些实施方案中，提供了重组黏合素-伊匹单抗抗体融合蛋白，其包含：
具有SEQ ID NO：113的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性(例如，与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性)的序列的黏合素-重链融合蛋白(其中分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)任选地被去除)，以及
具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性(例如，与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性)的序列的轻链蛋白(其中分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)任选地被去除)。
在一些实施方案中，提供了重组黏合素-贝伐单抗抗体融合蛋白，其包含：
具有SEQ ID NO：115或117的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性(例如，与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性)的序列的黏合素-重链融合蛋白(其中分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)任选地被去除)，以及
具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性(例如，与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性)的序列的轻链蛋白(其中分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)任选地被去除)。
在一些实施方案中，本公开内容的重组抗体提供为适用于人患者中之治疗用途的药物制剂，其还包含一种或更多种可药用赋形剂、缓冲剂、盐等。
在本公开内容的另一方面中，提供了重组受体陷阱融合蛋白，其包含(i)受体的配体结合结构域，以及(ii)PD-L1结合黏合素多肽序列，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以1×10-7M或更小的Kd、1×10-8M或更小的Kd、1×10-9M或更小的Kd、或者甚至1×10-10M或更小的Kd结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以10-3s-1或更慢、10-4s-1或更慢、或者甚至10-5s-1或更慢的Koff结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以103M-1s-1或更快、104M-1S-1或更快、105M-1s-1或更快、或者甚至106M-1s-1或更快的Kon结合PD-L1。在一些实施方案中，在与人PD-1的竞争性结合测定中，PD-L1结合黏合素多肽结合PD-L1，其中IC50为1μM或更小、100nM或更小、40nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、或者甚至0.1nM或更小。
在一些实施方案中，结合结构域与以下结合：PGE2、TGF-β、VEGF、CCL2、IDO、CSF1、IL-10、IL-13、IL-23或腺苷。
在一些实施方案中，重组受体陷阱融合蛋白包含诱导所述重组受体陷阱融合蛋白的多聚化(即，在多聚体复合物中包含2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10个重组受体陷阱融合蛋白的复合物)的一个或更多个多聚化结构域。
在一些实施方案中，本公开内容的重组受体陷阱融合蛋白提供为适用于人患者中之治疗用途的药物制剂，其还包含一种或更多种可药用赋形剂、缓冲剂、盐等。
在本公开内容的另一方面中，提供了重组受体配体融合蛋白，其包含(i)多肽配体序列，所述多肽配体序列结合并激动或拮抗其对应(cognate)受体，以及(ii)PD-L1结合黏合素多肽序列，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以1×10-7M或更小的Kd、1×10-8M或更小的Kd、1×10-9M或更小的Kd、或者甚至1×10-10M或更小的Kd结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以10-3s-1或更慢、10-4s-1或更慢、或者甚至10-5s-1或更慢的Koff结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以103M-1s-1或更快、104M-1s-1或更快、105M-1s-1或更快、或者甚至106M-1s-1或更快的Kon结合PD-L1。在一些实施方案中，在与人PD-1的竞争性结合测定中，PD-L1结合黏合素多肽结合PD-L1，其中IC50为1μM或更小、100nM或更小、40nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、或者甚至0.1nM或更小。
在重组受体配体融合蛋白的一些实施方案中，多肽配体是共刺激受体的配体，并且在结合之后激动所述共刺激受体。
例如，多肽配体可选自：B7.1、4-1BBL、OX40L、GITRL或LIGHT。
例如，多肽配体可以是促进抗肿瘤免疫的免疫刺激细胞因子，例如IFN-α2、IL-2、IL-15、IL-21和IL-12。
在一些实施方案中，重组受体配体融合蛋白包含诱导所述重组受体配体融合蛋白的多聚化(即，在多聚体复合物中包含2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10个重组受体配体融合蛋白的复合物)的一个或更多个多聚化结构域。
在一些实施方案中，本公开内容的重组受体配体融合蛋白提供为适用于人患者中之治疗用途的药物制剂，其还包含一种或更多种可药用赋形剂、缓冲剂、盐等。
在本公开内容的另一方面中，提供了多特异性T细胞接合融合蛋白，其包含(i)与T细胞表面上的CD3结合的CD3结合多肽，以及(ii)PD-L1结合黏合素多肽序列，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以1×10-7M或更小的Kd、1×10-8M或更小的Kd、1×10-9M或更小的Kd、或者甚至1×10-10M或更小的Kd结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以10-3s-1或更慢、10-4s-1或更慢、或者甚至10-5s-1或更慢的Koff结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以103M-1s-1或更快、104M-1s-1或更快、105M-1s-1或更快、或者甚至106M-1s-1或更快的Kon结合PD-L1。在一些实施方案中，在与人PD-1的竞争性结合测定中，PD-L1结合黏合素多肽结合PD-L1，其中IC50为1μM或更小、100nM或更小、40nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、或者甚至0.1nM或更小。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性T细胞接合融合蛋白提供为适用于人患者中之治疗用途的药物制剂，其还包含一种或更多种可药用赋形剂、缓冲剂、盐等。
在本公开内容的另一方面中，提供了嵌合受体融合蛋白，其包含(i)包含PD-L1结合黏合素多肽序列的胞外部分，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用；(ii)跨膜结构域；以及(c)包含4-1BB信号传导结构域和CD3ε信号传导结构域以及任选的共刺激信号传导区的胞质结构域。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以1×10-7M或更小的Kd、1×10-8M或更小的Kd、1×10-9M或更小的Kd、或者甚至1×10-10M或更小的Kd结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以10-3s-1或更慢、10-4s-1或更慢、或者甚至10-5s-1或更慢的Koff结合PD-L1。在一些实施方案中，PD-L1结合黏合素多肽以103M-1s-1或更快、104M-1s-1或更快、105M-1s-1或更快、或者甚至106M-1s-1或更快的Kon结合PD-L1。在一些实施方案中，在与人PD-1的竞争性结合测定中，PD-L1结合黏合素多肽结合PD-L1，其中IC50为1μM或更小、100nM或更小、40nM或更小、20nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、或者甚至0.1nM或更小。
在某些实施方案中，本公开内容还提供了细胞，优选淋巴细胞并且甚至更优选T淋巴细胞，其已用编码嵌合受体融合蛋白的基因进行改造，该基因在表达时导致细胞表面上的嵌合受体融合蛋白的呈递。
在本公开内容的另一方面中，提供了核酸，其包含编码黏合素剂(例如以上(和本文中)所述的蛋白质)的编码序列。
在一些实施方案中，编码序列与一个或更多个转录调节序列(例如启动子和/或增强子)可操作地连接。
在一些实施方案中，核酸包含一个或更多个复制起点、微型染色体维持元件(minichromosome maintenance element，MME)和/或核定位元件。
在一些实施方案中，核酸包含与编码序列可操作地连接并一起转录的多腺苷酸化信号序列。
在一些实施方案中，编码序列包含一个或更多个内含子序列。
在一些实施方案中，核酸包含与编码序列一起转录的一个或更多个核糖体结合位点。
在一些实施方案中，核酸是DNA。
在一些实施方案中，核酸是RNA，例如mRNA。
在本公开内容的另一方面中，提供了病毒载体，其包含编码黏合素剂(例如以上(和本文中)所述的蛋白质)的编码序列。
在本公开内容的另一方面中，提供了质粒DNA、质粒载体或微环，其包含编码黏合素剂(例如以上(和本文中)所述的蛋白质)的编码序列。
在本公开内容的另一方面中，本公开内容提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段还包含与所述抗体或其抗原结合片段缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
在本公开内容的另一方面中，本公开内容提供了可溶性受体或其配体结合结构域，所述可溶性受体或其配体结合结构域还包含与所述可溶性受体或其配体结合结构域缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
在本公开内容的另一方面中，本公开内容提供了生长因子、细胞因子或趋化因子其生物活性多肽片段，所述生长因子、细胞因子或趋化因子其生物活性多肽片段还包含与所述生长因子、细胞因子或趋化因子其生物活性多肽片段缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
在本公开内容的另一方面中，本公开内容提供了共刺激激动剂多肽，其还包含与其缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
在本公开内容的另一方面中，本公开内容提供了检查点抑制性多肽，其还包含与其缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
在本公开内容的另一方面中，本公开内容提供了黏合素剂，其包含PD-L1结合黏合素多肽，以及与所述PD-L1结合黏合素多肽缀合的可检测标记、毒素或者一种或更多种治疗剂。
本文中还提供了适用于在人患者中进行治疗性基因递送的药物制剂，其包含本公开内容的核酸、病毒载体、质粒DNA、质粒载体或微环，以及(ii)一种或更多种可药用赋形剂、缓冲剂、盐、转染增强剂、电穿孔增强剂等。
本文中还提供了包括向对象施用本文中所述的蛋白质、重组抗体或核酸(包含与PD-L1结合的黏合素)的方法。
在一些实施方案中，对象包含表达PD-L1的癌细胞，任选地其中所述癌细胞是黑素瘤细胞。
在一些实施方案中，以有效量施用所述蛋白质、重组抗体或核酸以引起混合淋巴细胞反应中通过T细胞的IFNγ之产生提高。
在一些实施方案中，以有效量施用所述蛋白质、重组抗体或核酸以将对象中T细胞的IFNγ之产生相对于仅载剂对照提高到至少2倍。
在一些实施方案中，对象患有包含表达PD-L1的癌细胞的肿瘤，并且肿瘤中PD-L1结合黏合素多肽积聚的水平是施用之后96小时时血浆中所述水平的至少5倍。
在一些实施方案中，对象患有包含表达PD-L1的癌细胞的肿瘤，并且以有效量施用所述蛋白质、重组抗体或核酸以在所述对象中将所述肿瘤的生长抑制至少10％。
在一些实施方案中，所述对象患有黑素瘤。
附图简述
图1.生成黏合素文库：可变的结合环产生独特的结合表面和可选择的黏合素结合剂。
图2.单体黏合素结合。通过流式细胞术对人肺腺癌癌细胞系进行的黏合素结合。
图3.黏合素多聚体在大肠杆菌中易于表达已得到具有高产量和纯度的多种形式(即使在摇瓶产生中也是如此)。
图4A和4B.黏合素多聚体与PD-L1结合，其中动力学表现出超出单体结合结构域的亲合力。
图5A、5B和5C.黏合素Fc融合体提供效应子功能、半衰期延长以及增强的亲和力。
图6A至6C.对PD-1和CD80针对PD-L1抗体基准的竞争ELISA。
图7.黏合素-Fc融合体显示血清半衰期延长。
图8.通过人PBMC刺激测定进行的免疫原性测试表明，核芯黏合素序列在人中具有免疫原性的风险很低。
图9.数据表明，黏合素可在人Fc的多个位点进行格式化，并且因此应翻译为IgG-黏合素融合体。典型的表达产量为400至800mg/l。使用分析型SEC-HPLC评估纯度。
图10.示出了使用Biacore确定的数种PD-L1黏合素Fc形式的KD，其显示出高度灵活的格式化，用于结合动力学的微调以适合治疗靶标。清楚地观察到二价Fc形式的亲合力效应。
图11A至11B.伊匹单抗(生物仿制药)/AVA04-141在Expi293F细胞中瞬时表达，蛋白A纯化之后纯化产量为约160mg/L。
图12A至12C.未经优化的Biacore证明双特异性抗体-黏合素融合体能够接合两个靶标。
图13A至13D.可对在Expi293F细胞中瞬时表达的贝伐单抗(生物仿制药)/AVA04-251进行纯化以得到大于97％的产率，并且Biacore证明，无论所构建的是包含柔性接头[(G4S)3]还是刚性接头[A(EAAAK)3]，双特异性抗体-黏合素融合体都能够使两个靶标接合。已在小鼠的药代动力学研究中对具有刚性接头的构建体进行了测试(图13D)
图14.示出了抗PD-L1黏合素AVA04-261和从蛋白质复合物的结晶来源的人PD-L1的计算出的3维结构。
图15.根据与所来源的人PD-L1结合的抗PD-L1黏合素AVA04-261的晶体来源结构，图15提供了两种蛋白质之间的接触接合面处的氨基酸残基之间的氢键相互作用。
图16.根据与所来源的人PD-L1结合的抗PD-L1黏合素AVA04-261的晶体来源结构，图16提供了涉及两种蛋白质之间的接触接合面的氨基酸残基的列表。
图17A至17B.抗PD-L1黏合素格式化的举例说明性实例，包括Fc融合体(显示二价PD-L1结合体形式和双特异性、二价PD-L1结合体和靶标X结合体形式)、多种形式的内联(inline)抗体融合体、BiTE形式以及抗PD-L1黏合素与受体陷阱结构域的内联融合体。柔性接头(G4S)6对应于SEQ ID NO：106。刚性接头A(EAAAK)6对应于SEQ ID NO：196。
图18A至18B.图18A示出了将AVA04黏合素、刚性或柔性接头、和黏合素XT(AVA03-42)组合的多种克隆组合物。使用分析型SEC-HPLC评估每个克隆的纯度。18B.示出了针对rhPD-1-Fc或huSA的多种黏合素XT的动力学分析结果。
图19. 1μl经纯化变体蛋白质的SDS-PAGE运行。表总结了大肠杆菌产生产量、环4中的氨基酸位置上的AVA04-251丙氨酸扫描、以及每个黏合素的Biacore结合结果。环2序列对应于SEQ ID NO：39。环4序列从顶部至底部对应于SEQ ID NO：187至195。
图20.当在+4℃条件下储存在PBS 1×缓冲液中时，AVA04-251 V.2在九个月时间内的稳定性。在Yarra-3000(Phenomenex)柱上以1ml/分钟在PBS 1×缓冲液中运行的SEC-HPLC分析。
图21.AVA04-251 CG的结构和SEC-HPLC/SDS-PAGE结果。在PBS1×缓冲液中以1ml/分钟在Ultimate 3000 HPLC(Thermo)上运行的SEC-HPLC Yarra-3000柱上，最终AVA04-251CG为＞98％纯。SDS-PAGE图像示出了还原与非还原的AVA04-251 CG之间的kDa差异。
图22.AVA04-251 CF的SEC-HPLC和SDS-PAGE结果。在PBS 1×缓冲液中以1ml/分钟在Ultimate 3000 HPLC(Thermo)上运行的SEC-HPLC Yarra-3000柱上，最终AVA04-251 CF为＞99％纯。SDS-PAGE图像示出了还原与非还原的AVA04-251 CF之间的kDa差异。
图23.AVA04-261 BN形式的纯化和动力学分析的结果。SDS-PAGE图像显示，二聚体物质在非还原条件下通过铰链中的半胱氨酸二聚并且在还原缓冲液中还原为单体，AVA04-261 BN形式与单体AVA04-261相比在PD-1 PD-L1阻断生物测定(Promega)中具有亲合力并且在Biacore上具有59.9pM的KD。
图24.AVA04-251 AZ人(在无接头的hFc1上格式化的AVA04-251)的纯化和动力学分析的结果。在PBS 1×缓冲液中以1ml/分钟在Ultimate 3000 HPLC(Thermo)上运行的SEC-HPLC Yarra-3000柱上，最终蛋白质为＞99％纯。减去空白并拟合于1∶1结合模型的Biacore单循环动力学数据表明KD为31.5pM。PD-1 PD-L1阻断生物测定(Promega)显示与Fc铰链与黏合素之间的(G4S)4(SEQ ID NO：197)接头的V.2形式具有相同的活性。
图25.AVA04-251 AG.3和AVA04-251 BS形式的纯化和动力学分析的结果。使用分析型SEC-HPLC评估每种蛋白质的纯度。减去空白并拟合于1∶1结合模型的Biacore单循环动力学数据表明AVA04-251 AG.3和AVA04-251 BS的KD分别为36.2pM和25.7pM。
图26.PD-L1结合结构域(14kDa)与Fc融合体AVA04-251 V.2或AVA04-236 V(82kDa)的交联质谱，用于分析非共价结合复合物的化学计量。
图27和28.与格式化的AVA04-251 Fc的食蟹猴PD-L1结合的交叉反应性。
图29A至29B.混合淋巴细胞反应中IFNγ的水平，其在AVA04-251_V.2处理之后提高。
图30.在葡萄球菌肠毒素B刺激测定中用AVA04-251_V.2处理之后IL2的提高。
图31.在C57/B16小鼠中，通过ELISA在来自用AVA04-251 XT形式注射的小鼠的血清中作为给药时间的函数的浓度，从而计算出半衰期。
图32A至32B.在带有原位MDA-MB-231肿瘤细胞的人源化NOG小鼠的组织分布实验中，AVA04-251_V.2的体内表征。
图33A至33D.在人源化MC38同基因模型中减缓肿瘤生长的AVA04-251_V.2的体内效力。
图34A至34D.在A375异种移植模型中AVA04-251_V.2的体内效力。
图35A至35B.在小鼠同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，小鼠替代物AVA04-182 V.2的活性。数据表示为单独的反应和平均值±SEM，*P＜0.05，**p＜0.01，使用配对t检验将参考物质与同种型对照进行比较。
图36A至36B.MB49小鼠同基因模型中的肿瘤生长抑制(图36A)；MB49模型中处理之后第21天的肿瘤尺寸(图36B)。
发明详述
I.概述
本公开内容基于黏合素的产生，所述黏合素与PD-L1结合并抑制该分子与PD-1的相互作用，并且因此代表了可用于治疗癌症、化生、瘤形成和某些病毒性和异常细胞(paracytic)感染的检查点抑制剂。
基于天然存在的蛋白质(半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin))并经改造以稳定地展示形成结合表面的两个环，本公开内容的PD-L1结合黏合素多肽提供了超过抗体、抗体片段和其他非抗体结合蛋白的许多优点。
一个是黏合素多肽自身的小尺寸。在其单体形式下，其为约14kDa，或抗体尺寸的1/10。这种较小的尺寸为提高组织渗透提供了更大的潜力，尤其是在较差血管化和/或纤维化靶组织(如肿瘤)中。
黏合素具有简单的蛋白质结构(相对于多结构域抗体)，并且由于黏合素不需要二硫键或其他翻译后修饰来发挥功能，因此包含这些多肽的许多形式实施方案都可以在原核和真核系统中产生。
利用黏合素文库(例如所附实施例中描述的噬菌体展示技术)以及定向诱变(sitedirected mutagenesis)的能力，可以产生具有用于治疗用途的理想范围的可调节的结合动力学的黏合素。例如，黏合素可以对PD-L1具有高亲和力，例如单体黏合素的单数位纳摩尔或更低的KD和在多价形式下的皮摩尔KD和亲合力。可产生与PD-L1具有紧密结合动力学的黏合素，例如10-4至10-5(s-1)范围内的缓慢Koff速率，这有利于靶组织定位。
本公开内容的PD-L1结合黏合素包括具有优异选择性的黏合素。
此外，PD-L1结合黏合素可以很容易地格式化，使得能够容易地产生和制造例如Fc融合体、完整抗体融合体和内联多聚体(in-line multimer)的形式。
不需要二硫键和翻译后修饰也允许通过表达被引入到患者组织内的基因递送构建体以治疗性地递送包括PD-L1结合黏合素(或单体黏合素)在内的蛋白质的许多实施方案，包括其中蛋白质被系统递送(例如从肌肉组织表达)或局部递送(例如通过瘤内基因递送)的形式。
II.定义
为了有助于对本公开内容的理解，下面定义了许多术语和短语。
a.黏合素
术语“Stefin多肽(Stefin Polypeptide)”是指半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的蛋白质的亚组，所述家族是涵盖了包含多个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样序列的蛋白质的家族。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的Stefin亚组是相对较小(约100个氨基酸)的单结构域蛋白质。其没有已知的翻译后修饰，并且缺少二硫键，表明其将能够在广泛的胞外和胞内环境中相同地折叠。Stefin A本身是98个氨基酸的单体单链单结构域蛋白质。Stefin A的结构已解决，有助于Stefin A合理突变为黏合素支架。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的唯一已知生物活性是抑制组织蛋白酶活性，这使得我们能够彻底地测试我们的经改造蛋白质的残留生物活性。
术语“黏合素”(或“黏合素支架(Affimer Scaffold)”或“黏合素多肽(AffimerPolypeptide)”)是指作为Stefin多肽的重组经改造变体的小的高度稳定的蛋白质。黏合素蛋白展示两个肽环和N末端序列，其均可以随机化以与单克隆抗体相似的方式以高亲和力和特异性与期望的靶蛋白结合。Stefin蛋白支架对两个肽的稳定作用限制了肽可以采取的可能构象，与游离肽文库相比，提高了结合亲和力和特异性。这些经改造非抗体结合蛋白被设计成在不同应用中模拟单克隆抗体的分子识别特性。可以进行对Stefin多肽序列其他部分的改变，其中这样的改变改善了这些黏合素试剂的性质，例如提高稳定性，使得其在一定温度和pH等范围内具有鲁棒性。优选地，黏合素包含来源于stefin A的序列，与stefin A野生型序列(例如人Stefin A)具有实质性的同一性。对于本领域技术人员明显的是，可以对支架序列进行修饰而不脱离本公开内容。特别地，黏合素支架可以具有与人Stefin A的相应序列具有至少25％、35％、45％、55％或60％同一性，优选至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％的同一性的氨基酸序列，例如其中序列变异不会不利地影响支架与期望靶标(例如PD-L1)结合的能力，并且例如不会恢复或产生生物学功能，例如野生型stefin A具有但是在本文所述的突变变化中被消除的功能。
“黏合素剂(Affimer Agent)”是指包含黏合素多肽序列并具有任何其他修饰(例如，缀合、翻译后修饰等)的多肽，以代表旨在递送给患者的治疗活性蛋白质。
“程序性死亡配体1”也称为“PD-L1”、“分化簇274”、“CD274”、“B7同系物1”或“B7-H1”，对于人而言，是指由CD274基因编码的蛋白质。人PD-L1是40kDa的1型跨膜蛋白，其在于不同情况下抑制免疫系统中起主要作用。代表性的人PD-L1序列由UniProtKB主登记号Q9NZQ7提供，并包括其其他人同工型。PD-L1与存在于活化T细胞、B细胞和骨髓细胞上的其受体PD-1结合，以调节活化或抑制。PD-L1对共刺激分子CD80(B7-1)也具有明显的亲和力。PD-L1与T细胞上的其受体PD-1(“程序性细胞死亡蛋白1”或“CD279”)的接合递送了抑制TCR介导的IL-2产生的活化和T细胞增殖的信号。在这方面，PD-L1被认为是检查点，并且其在肿瘤中上调的表达导致对T细胞介导的抗肿瘤应答的抑制。尽管通常参考来自多种哺乳动物物种的PD-L1使用PD-L1，但是在整个申请中应理解，对PD-L1的任何提及均包括人PD-L1，并且优选地，是指人PD-L1本身。
“PD-L1黏合素剂”是指具有至少一个黏合素多肽的黏合素剂，其以至少10-6M的解离常数(Kd)与PD-L1、特别是人PD-L1结合。
“编码的黏合素(Encoded Affimer)”是指核酸构建体，当其通过基因递送过程由患者体内的细胞表达时，会在体内产生预期的黏合素剂。
“黏合素连接的缀合物”是指具有与其缀合的一个或更多个部分的黏合素剂，所述缀合通过化学缀合，而不是通过经由包含黏合素多肽序列的黏合素剂的多肽部分的C末端或N末端形成连续的肽键来实现。黏合素连接的缀合物可以是“黏合素-药物缀合物”，其是指包含与其缀合的一个或更多个药理活性部分的黏合素剂。黏合素连接的缀合物也可以是“黏合素-标签缀合物”，其是指包含与其缀合的一个或更多个可检测部分(即，可检测标记)的黏合素剂。
b.多肽
术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任何其他操作或修饰，例如与标记组分的缀合。定义中还包括例如含有一个或更多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
术语“氨基酸残基”和“氨基酸”可互换使用，并且在多肽的情况下，意指参与该多肽的一个或更多个肽键的氨基酸。通常来说，本文中用于指定氨基酸的缩写是基于IUPAC-IUB生物化学命名委员会的建议(参见Biochemistry(1972)11：1726-1732)。例如，Met、Ile、Leu、Ala和Gly分别表示甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸的“残基”。残基意指通过消除羧基的OH部分和α-氨基的H部分而来源于相应α-氨基酸的基团。术语“氨基酸侧链”是不包括--CH(NH2)COOH部分的氨基酸的一部分，如K.D.Kopple，″Peptides and AminoAcids″，W.A.Benjamin Inc.，New York and Amsterdam，1966，第2至33页所定义。
在大多数情况下，在本公开内容的申请中使用的氨基酸是存在于蛋白质中的那些天然存在的氨基酸，或者是含有氨基和羧基的这样的氨基酸的天然存在的合成代谢或分解代谢产物。特别合适的氨基酸侧链包括选自那些以下氨基酸的侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，以及那些已被鉴定为肽基聚糖(peptidylglycan)细菌细胞壁成分的氨基酸和氨基酸类似物。
具有“碱性侧链”的氨基酸残基包括Arg、Lys和His。具有“酸性侧链”的氨基酸残基包括Glu和Asp。具有“中性极性侧链”的氨基酸残基包括Ser、Thr、Asn、Gln、Cys和Tyr。具有“中性非极性侧链”的氨基酸残基包括Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Pro、Trp和Phe。具有“非极性脂肪族侧链”的氨基酸残基包括Gly、Ala、Val、Ile和Leu。具有“疏水性侧链”的氨基酸残基包括Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr和Trp。具有“小的疏水性侧链”的氨基酸残基包括Ala和Val。具有“芳香族侧链”的氨基酸残基包括Tyr、Trp和Phe。
术语氨基酸残基还包括本文所指的任何特定氨基酸的类似物、衍生物和同类物，例如，本发明黏合素(尤其是如果通过化学合成产生的话)可以包含氨基酸类似物，例如如氰丙氨酸(cyanoalanine)、刀豆氨酸(canavanine)、黎豆氨酸(djenkolic acid)、正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、二羟基苯丙氨酸、5-羟基色氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、二氨基庚二酸、鸟氨酸或二氨基丁酸。适用于本文的其他天然存在的具有侧链的氨基酸代谢物或前体是本领域技术人员所认识的并包括在本公开内容的范围内。
当氨基酸的结构允许立体异构形式时，还包括这样的氨基酸的(D)和(L)立体异构体。本文中氨基酸和氨基酸残基的构型用适当的符号(D)、(L)或(DL)表示，此外，当未指定构型时，氨基酸或残基可以具有构型(D)、(L)或(DL)。应当注意，本公开内容的一些化合物的结构包含不对称碳原子。因此，应理解，由这种不对称性引起的异构体包括在本公开内容的范围内。这样的异构体可以通过经典的分离技术和立体控制的合成以基本上纯的形式获得。为了本申请的目的，除非明确相反地指出，否则命名的氨基酸应被解释为包括(D)或(L)立体异构体二者。
在两个或更多个核酸或多肽的情况下，术语“相同”或百分比“同一性”是指当进行比较和比对(必要时引入缺口)以获得最大的对应性并且不考虑将任何保守氨基酸替换作为序列同一性的一部分的情况下，两个或更多个相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的序列或子序列。百分比同一性可以使用序列比较软件或算法或者通过目视检查来测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的多种算法和软件是本领域中公知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其变化形式。在一些实施方案中，本公开内容的两个核酸或多肽是基本上相同的，意味着如使用序列比较算法或者通过目视检查测量的，当进行比较和比对以获得最大的对应性时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些实施方案中，至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，同一性存在于氨基酸序列的长度为至少约10个残基、至少约20个残基、至少约40至60个残基、至少约60至80个残基或其之间的任何整数值的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于比60至80个残基更长(例如至少约80至100个残基)的区域上，并且在一些实施方案中，所述序列在所比较的序列(例如靶蛋白或抗体的编码区)的全长上基本相同。在一些实施方案中，同一性存在于核苷酸序列的长度为至少约10个碱基、至少约20个碱基、至少约40至60个碱基，至少约60至80个碱基或其之间的任何整数值的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于比60至80个碱基更长(例如至少约80至1000个碱基或更多)的区域上，并且在一些实施方案中，所述序列在所比较的序列(例如编码目的蛋白质的核苷酸序列)的全长上基本相同。
“保守氨基酸替换”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代的替换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被普遍定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸替换酪氨酸是保守的替换。通常来说，本公开内容的多肽、可溶性蛋白质和/或抗体的序列中的保守替换不会消除包含氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白质或抗体与靶结合位点的结合。鉴定不会消除结合的氨基酸保守替换的方法是本领域中公知的。
被“分离”的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是处于自然界中未发现的形式的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已纯化至不再是它们在自然界中存在的形式的程度的那些。在一些实施方案中，分离的多肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文所用，术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。
如本文所用，术语“融合蛋白”或“融合多肽”是指由包含至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白质。
如本文所用，术语“接头”或“接头区域”是指插入在第一多肽(例如，黏合素的拷贝)和第二多肽(例如，另一黏合素、Fc结构域、配体结合结构域等)之间的接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。接头不应不利地影响多肽的表达、分泌或生物活性。优选地，接头不是抗原性的并且不引起免疫应答。
“黏合素-抗体融合体”是指包含黏合素多肽部分和抗体的可变区的融合蛋白。黏合素-抗体融合体包含全长抗体，所述全长抗体具有例如连接至其VH和/或VL链中的一个或更多个的C末端或N末端的一个或更多个黏合素多肽序列，即组装的抗体的至少一条链是具有黏合素多肽的融合蛋白。黏合素-抗体融合体还包括其中一个或更多个黏合素多肽序列作为具有抗体片段的抗原结合位点或可变区的融合蛋白的一部分提供的实施方案。
如本文所用，术语“抗体”是指通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或任何前述物质的组合，其中抗原结合位点通常在免疫球蛋白分子的可变区内。如本文所用，该术语涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体(前提是这些片段已被格式化以包含Fc或其他FcγRIII结合结构域)、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白(被格式化以包含Fc或其他FcγRIII结合结构域)，以及任何其他包含抗原结合位点的经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体表现出期望的生物活性即可。
尽管抗体可以是免疫球蛋白的五种主要类别(IgA、IgD，、IgE、IgG和IgM)或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)中的任一种，基于其重链恒定结构域的同一性，称为α、δ、ε、γ和μ。
术语抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。通常来说，重链和轻链的可变区各自由四个框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)(也称为“高变区”)组成。每个链中的CDR通过框架区紧密保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。有至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat et al.，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Edition，National Institutes of Health，Bethesda Md.)，以及(2)基于对抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al Lazikani et al.，1997，J.Mol.Biol.，273：927-948)。另外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDR。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠)抗体的形式，其是包含最少非人序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常来说，人源化抗体是其中CDR的残基被来自具有期望特异性、亲和力和/或结合能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR的残基替代的人免疫球蛋白。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人物种的抗体中的相应残基替代。可以通过替换Fv构架区内和/或经替代的非人残基内的其他残基进一步修饰人源化抗体，以完善和优化抗体特异性、亲和力和/或结合能力。人源化抗体可包含可变结构域，该可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR，而所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白序列的那些。在一些实施方案中，可变结构域包含人免疫球蛋白序列的框架区。在一些实施方案中，可变结构域包含人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的那些。通常认为人源化抗体不同于嵌合抗体。
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用，是指抗原的能够被特定抗体、特定黏合素或其他特定结合结构域识别并特异性结合的一部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续氨基酸和通过蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸二者形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在蛋白质变性时丢失。在独特的空间构象中，表位通常包含至少3个，更通常至少5、6、7或8至10个氨基酸。
如本文所用，术语“与……特异性结合”或“对……具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，例如靶标与黏合素、抗体或其他结合伴侣之间的结合，其确定在分子(包括生物分子)的异质群体的存在下靶标的存在。例如，与靶标特异性结合的黏合素是与其与其他靶标结合相比，以更大亲和力、亲合力(如果是多聚体格式化)、更容易和/或以更长的持续时间结合该靶标的黏合素。
如本文所用，“缀合物”、“缀合”或其语法变化形式是指通过本领域已知的任何结合或连接方法将两个或更多个化合物结合或连接在一起，导致形成另一化合物。其也可以指通过将两个或更多个化合物结合或连接在一起而产生的化合物。例如，直接或间接地与一个或更多个化学部分或多肽连接的抗PD-L1黏合素是示例性缀合物。这样的缀合物包括融合蛋白，通过化学缀合物产生的那些以及通过任何其他方法产生的那些。
c.核酸
术语“多核苷酸”和“核酸”和“核酸分子”在本文可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶引入到聚合物中的任何底物。
如本文所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指沿着脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷酸链的核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。
当提及核苷酸序列使用时，本文中所用的“序列”、该术语的语法和其他形式可以包含DNA或RNA，并且可以是单链的或双链的。核酸序列可以被突变。核酸序列可以具有任何长度，例如2至000,000或更多个核苷酸(或者上述或之间的任何整数值)，例如长度为约100至约10,000，或约200个核苷酸至约500个核苷酸的核酸。
如本文所用，术语“载体(vector)”意指能够在宿主细胞中递送并且通常表达一个或更多个目的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、黏粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体，以及封装在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
如本文所用，术语“转染”是指进入到真核细胞内的外源核酸。转染可以通过本领域已知的多种方法来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、凝聚胺介导的转染(polybrene-mediated transfection)、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪技术(基因枪)。
如本文所用，术语“载体(carrier)”是包含分离的核酸的分离的核酸，其可用于将组合物递送至细胞内部。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体(vector)”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括促进核酸转移至非质粒和非病毒化合物的细胞中，例如多赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
如本文所用，术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接的表达控制序列和待表达的核苷酸序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件(顺式作用元件)；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域中所有已知的那些，例如黏粒、质粒(例如裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指调节序列与异源核酸序列之间的功能性连接，其连接至导致后者表达的连接。例如，当第一核酸序列和第二核酸序列是所述第一核酸序列和第二核酸序列之间的功能关系时，其可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。通常来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，并根据需要将两个蛋白质编码区连接在同一阅读框中。
如本文所用，术语“启动子”定义为由多核苷酸序列的细胞特异性转录的合成机制所需的合成机制或者由引入的合成机制识别的启动子DNA序列。
如本文所用，术语“组成型表达”是指在生理条件下表达的全部。
如本文所用，术语“诱导型表达”是指在某些条件下表达，所述条件例如胞内信号传导途径的激活(或失活)，或具有表达构建体的细胞与调节基因的表达(或表达程度)的小分子的接触，所述基因与对小分子浓度敏感的诱导型启动子可操作地连接。
术语“电穿孔”是指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观途径(孔)；它们的存在允许生物分子(例如质粒或其他寡核苷酸)从细胞膜的一侧穿过到另一侧。
d.检查点抑制剂、共刺激激动剂和化学治疗
“检查点分子”是指由组织和/或免疫细胞表达并以取决于检查点分子的表达水平的方式降低免疫应答的效力的蛋白质。当这些蛋白质被阻断时，免疫系统上的“刹车”被放开，并且例如T细胞能够更有效地杀伤癌细胞。在T细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白的实例包括PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2、PD-L2、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA和TIGIT。
“检查点抑制剂”是指逆转来自检查点分子的免疫抑制信号传导的药物实体。
“共刺激分子”是指免疫细胞(例如T细胞)同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导共刺激，例如但不限于增殖。共刺激分子是促进有效的免疫应答的除抗原受体或配体以外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHCI分子、BTLA受体和Toll配体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。共刺激分子的实例包括但不限于：CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、LA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
“共刺激激动剂”是指这样的药物实体，其如共刺激配体那样激活(激动)共刺激分子，并产生免疫刺激信号或以其他方式提高免疫应答的效力或功效。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，MARINOL)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；培美曲塞(pemetrexed)；卡利抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；TLK-286；CDP323，经口α-4整合素抑制剂；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，例如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，例如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γI和加利车霉素ω1(参见例如，Nicolaou et al.，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(包括阿霉素(ADRIAMYCIN)、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射剂(DOXIL)和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR)、替加氟(UFTORAL)、卡培他滨(XELODA)、埃博霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)和伊马替尼(imatinib)(2-苯基氨基嘧啶衍生物)，以及其他c-Kit抑制剂；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；乙酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；聚氨酯；长春地辛(ELDISINE，FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替哌；紫杉烷类(taxoids)，例如紫杉醇(TAXOL)、紫杉醇的白蛋白改造纳米粒制剂(ABRAXANE)和多西他塞(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱(VELBAN)；铂；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(ONCOVIN)；奥沙利铂；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(NAVELBINE)；诺安托(novantrone)；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊拜膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；以上任一种的可药用盐、酸或衍生物；以及以上两种或更多种的组合，例如CHOP，其为环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合治疗的缩写，以及FOLFOX，其为与5-FU和亚叶酸组合的奥沙利铂(ELOXATIN)的治疗方案的缩写。
该定义还包括抗激素剂，其用于调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素的作用，且常常是系统或全身治疗的形式。其可以是激素本身。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX tamoxifen)、雷洛昔芬(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂(ERD)；雌激素受体拮抗剂，例如费维司群(FASLODEX)；用于抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，例如乙酸亮丙瑞林(LUPRON和ELIGARD)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(tripterelin)；抗雄激素类，例如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；以及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、乙酸甲地孕酮(MEGASE)、依西美坦(AROMASIN)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(RIVISOR)、来曲唑(FEMARA)和阿那曲唑(ARIMIDEX)。另外，化学治疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，例如氯膦酸盐(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸盐(DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA)、阿伦膦酸盐(FOSAMAX)、帕米膦酸盐(AREDIA)、替鲁膦酸盐(SKELID)或利塞膦酸盐(ACTONEL)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的那些，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如THERATOPE疫苗和基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如勒托替康(LURTOTECAN))；抗雌激素，例如氟维司群(fulvestrant)；Kit抑制剂，例如伊马替尼(imatinib)或EXEL-0862(酪氨酸激酶抑制剂)；EGFR抑制剂，例如厄洛替尼(erlotinib)或西妥昔单抗(cetuximab)；抗VEGF抑制剂，例如贝伐单抗(bevacizumab)；arinotecan；rmRH(例如ABARELIX)；拉帕替尼(lapatinib)和拉帕替尼二甲苯磺酸盐(ErbB-2和EGFR双酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；17AAG(为热休克蛋白(Hsp)90毒物的格尔德霉素衍生物)，以及上述任一种的可药用盐、酸或衍生物。
如本文所用，术语“细胞因子”一般是指由一个细胞群释放的蛋白质，其作为细胞间介导物作用于另一细胞或对产生该蛋白质的细胞具有自分泌作用。这样的细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子；白介素(“IL”)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17A-F、IL-18至IL-29(例如IL-23)、IL-31，包括PROLEUKIN rIL-2；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β、TGF-β1-3；以及其他多肽因子，包括白血病抑制因子(“LIF”)、睫状神经营养因子(“CNTF”)、CNTF样细胞因子(“CLC”)、心肌营养因子(cardiotrophin)(“CT”)和kit配体(“KL”)。
如本文所用，术语“趋化因子”是指具有选择性诱导白细胞的趋化性和活化的能力的可溶性因子(例如，细胞因子)。其也触发血管生成、炎症、伤口愈合和肿瘤发生的过程。趋化因子的实例包括IL-8，鼠角质形成细胞趋化剂(keratinocyte chemoattractant，KC)的人同源物。
e.治疗
如本文所用，术语“功能障碍”还包括难治性或对抗原识别无反应，特别是将抗原识别转化为下游T细胞效应子功能(例如增殖、细胞因子产生(例如IL-2)和/或靶细胞杀伤)的能力受损。
术语“无反应性(anergy)”是指由于通过T细胞受体递送的不完整或不充分的信号(例如在没有ras激活的情况下细胞内Ca+2的提高)而导致的对抗原刺激无反应的状态。在没有共刺激的情况下，抗原刺激也会导致T细胞无反应性，导致即使在共刺激的情况下，细胞也难以被抗原随后激活。无反应状态通常可以被白介素-2的存在所推翻。无反应性T细胞不经历克隆扩增和/或获得效应子功能。
术语“耗竭”是指T细胞耗竭(T cell exhaustion)，是由于在许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导而引起的T细胞功能障碍的状态。其与无反应性的区别在于，其不是通过不完整或不充分的信号传导产生的，而是由于持续信号传导产生的。其由不良的效应子功能、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应子或记忆T细胞的转录状态定义。耗竭阻止对感染和肿瘤的最佳控制。
“增强T细胞功能”意指诱导、引起或刺激T细胞具有持续的或放大的生物学功能，或者更新或再活化耗竭或失活的T细胞。增强T细胞功能的实例包括：相对于干预之前的水平，来自CD8+T细胞的提高的
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扰素分泌，提高的增殖，提高的抗原反应性(例如病毒、病原体或肿瘤清除率)。在一些实施方案中，增强水平为至少50％，或者60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％。测量这种增强的方式是本领域普通技术人员已知的。
“T细胞功能障碍疾病”是以对抗原刺激的响应性降低为特征的T细胞的疾病或病症。在一个特定的实施方案中，T细胞功能障碍疾病是与不适当提高的PD-1水平特别相关的疾病。T细胞功能障碍疾病也可能与肿瘤中不适当提高的PD-L1水平相关，其导致对一种或更多种T细胞抗肿瘤功能的抑制。在另一个实施方案中，T细胞功能障碍疾病是其中T细胞是无反应的或具有降低的分泌细胞因子、增殖或执行细胞溶解活性的能力的疾病。在一个具体方面中，降低的响应性导致对表达免疫原的病原体或肿瘤的无效控制。以T细胞功能障碍为特征的T细胞功能障碍疾病的实例包括未解决的急性感染、慢性感染和肿瘤免疫。
“肿瘤免疫”是指其中肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。因此，作为治疗概念，当减轻这种逃避时，并且肿瘤被免疫系统识别和攻击时，肿瘤免疫被“治疗”。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合、肿瘤缩小和肿瘤清除。
“持续应答”是指在停止治疗之后对降低肿瘤生长的持续作用。例如，与施用阶段开始时的尺寸相比，肿瘤尺寸可能保持相同或更小。在一些实施方案中，持续应答的持续时间为至少与治疗持续时间相同，为治疗持续时间的至少1.5倍、2.0倍、2.5倍或3.0倍的长度。
本文中所用的术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中其中细胞群以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤和血液系统癌症，例如淋巴瘤和白血病。
如本文所用，术语“肿瘤”和“赘生物”是指由良性(非癌性)或恶性(癌性)的过度细胞生长或增殖导致的任何组织块，包括包括癌前病变。肿瘤生长通常是不受控制的和进行性的，不会诱导或抑制正常细胞的增殖。肿瘤可影响多种细胞、组织或器官，包括但不限于选自：膀胱、骨骼、脑、乳房、软骨、神经胶质细胞、食管、输卵管、胆囊、心、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、尿道、输尿管、尿道、子宫、阴道器官或组织或相应细胞。肿瘤包括癌症，例如肉瘤、癌、浆细胞瘤或(恶性浆细胞)。本公开内容的肿瘤可包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性髓样-单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症)、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症、重链疾病和实体瘤，例如肉瘤癌(例如纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮瘤肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌、尼罗河管癌(Nile ductcarcinoma)、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilms′ tumor)、宫领癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌或NSCLC)、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤。优选地，“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌(包括NSCLC)、胃癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和胶质瘤。
如本文所用，术语“转移”是指癌症从原始部位扩散或转移到身体的其他区域并且在新位置发展相似的癌性病变的过程。“转移”或“转移性”细胞是失去与相邻细胞的黏附性接触并通过血流或淋巴从疾病的原发部位迁移以侵袭相邻身体结构的细胞。
术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指来源于癌症或肿瘤或癌前病变的细胞的总群体，包含非致瘤性细胞(其占癌细胞群体的大部分)和致瘤性干细胞(癌干细胞)二者。如本文中所用，当仅指缺少更新和分化能力的那些细胞时，将通过术语“非致瘤性”修饰术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”，以将那些肿瘤细胞与癌干细胞区分开。
如本文所用，术语“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
如本文所用，“完全响应”或“CR”是指所有靶病变的消失。“部分响应”或“PR”是指以基线SLD作为参考，靶病变的最长直径(SLD)之和降低至少30％；并且“稳定疾病”或“SD”是指，以自治疗开始起的最小SLD作为参考，靶病变既未充分缩小以符合PR标准，又未充分提高以符合PD标准。
如本文所用，“无进展存活”(PFS)是指治疗期间和治疗之后被治疗的疾病(例如，癌症)未恶化的时间长度。无进展存活可能包括患者经历完全响应或部分响应的时间量，以及患者经历稳定疾病的时间量。
如本文所用，“总响应率”(ORR)是指完全响应(CR)率和部分响应(PR)率的总和。
如本文所用，“总存活率”是指在特定时间段之后组中可能存活的个体的百分比。
如本文所用，术语“治疗”是指试图改变由细胞的干预引起的临床疾病的过程或治疗的个体，其可以是临床病理的预防性干预过程。包括但不限于治疗以预防疾病的发生或复发，减轻症状，降低任何疾病的直接或间接病理后果，防止转移，减慢疾病进展速度，改善或减轻疾病缓解或改善预后。
术语“对象”是指待作为特定治疗的接受者的任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、犬科动物、猫科动物、啮齿动物等。通常来说，在提及人对象时，术语“对象”和“患者”本文中可互换使用。
本文中所用的术语“激动剂”和“激动”是指能够直接或间接地大幅诱导、激活、促进、提高或增强靶标或靶途径的生物活性的试剂。本文中所用的术语“激动剂”包括部分或完全地诱导、激活、促进、提高或增强蛋白质或其他目的靶标的活性的任何试剂。
本文中所用的术语“拮抗剂”和“拮抗”是指或描述能够直接或间接地、部分或完全地阻断、抑制、降低或中和靶标和/或途径的生物活性的试剂。本文中使用术语“拮抗剂”以包括部分或完全地阻断、抑制、降低或中和蛋白质或其他目的靶标的活性的任何试剂。
如本文所用，术语“调节”是指生物活性的改变或变化。调节包括但不限于刺激活性或抑制活性。调节可以是活性提高或活性降低，结合特性改变，或者与蛋白质、途径、系统或其他生物学目的靶标的活性相关的生物学、功能或免疫学性质的任何其他改变。
如本文所用，术语“免疫应答”包括来自先天性免疫系统和适应性免疫系统二者的应答。其包括细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答二者。其包括T细胞应答和B细胞应答二者，以及来自免疫系统其他细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞等)的应答。
术语“可药用”是指被或可被联邦政府或州政府的监管机构批准或者列在美国药典或其他公认的药典中的可用于动物(包括人)的物质。
术语“可药用赋形剂、载体或辅料”或“可接受的药物载体”是指这样的赋形剂、载体或辅料，其可以与本公开内容的至少一种药剂一起施用给对象并且不会破坏其药理活性，并且当以足以递送治疗效果的剂量施用时是无毒的。通常来说，本领域技术人员和美国FDA将可药用赋形剂、载体或辅料视为任何制剂的惰性成分。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指有效地“治疗”对象(例如哺乳动物)中的疾病或障碍的本文中所述的黏合素剂的量。在癌症或肿瘤的情况下，治疗有效量的PD-L1结合黏合素剂具有治疗效果，并且因此可以增强免疫应答，增强抗肿瘤应答，提高免疫细胞的溶细胞活性，提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤，降低肿瘤细胞的数量；降低致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；降低癌干细胞的数量或频率；降低肿瘤尺寸；降低癌细胞群；抑制或阻止癌细胞向周围器官的浸润，包括例如癌症向软组织和骨骼的扩散；抑制和阻止肿瘤或癌细胞转移；抑制和阻止肿瘤或癌细胞生长；在一定程度上缓解与癌症相关的一种或更多种症状；降低发病率和死亡率；改善生活质量；或这些效果的组合。
术语“治疗”或“减轻”是指以下二者：(1)治愈、减慢已诊断的病理状态或疾病、减轻已诊断的病理状态或疾病的症状和/或停止其进展的治疗措施，以及(2)阻止或减慢靶病理状态或疾病的发展的预防或预防性措施。因此，需要治疗的对象包括已经患有疾病的对象；容易患疾病的对象；以及需要预防疾病的对象。在癌症或肿瘤的情况下，如果患者显示以下中的一种或更多种，则根据本公开内容的方法成功“治疗”了对象：提高的免疫应答，提高的抗肿瘤应答，提高的免疫细胞溶细胞活性，提高的免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤，癌细胞数量降低或完全不存在；肿瘤尺寸降低；抑制或不存在癌细胞向周围器官的浸润，包括癌细胞向软组织和骨骼的扩散；抑制或不存在肿瘤或癌细胞转移；抑制或不存在癌症生长；缓解与特定癌症相关的一种或更多种症状；降低发病率和死亡率；生活质量改善；致瘤性降低；癌干细胞的数量或频率降低；或效果的一些组合。
f.其他
应该理解，无论本文中在何处用语言“包含/括”描述实施方案，也提供了根据“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他情况下的类似实施方案。还应理解，无论本文中在何处用语言“基本上由......组成”描述实施方案，也提供了根据“由......组成”描述的其他情况下的类似实施方案。
如本文中所用，提及“约”或“大约”值或参数时包括(并描述)针对该值或参数的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如在本文中的例如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括：A和B二者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样，如在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
III.PD-L1结合黏合素
黏合素是基于stefin A的支架，意味着其具有来源于stefin A，例如哺乳动物stefin A，例如人stefin A的序列。本申请的一些方面提供了结合PD-L1的黏合素(也称为“抗PD-L1黏合素”)，其包含其中来自野生型stefin A蛋白的一个或更多个溶剂可及的环具有氨基酸序列的黏合素，以提供具有结合PD-L1(优选选择性地，优选以10-6M或更小的Kd)的能力的黏合素。
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素来源于野生型人stefin A蛋白，其具有骨架序列并且其中环2[指定为(Xaa)n]和环4[指定为(Xaa)m]之一或二者被替代环序列(Xaa)n和(Xaa)m代替，以具有通式(i)
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3(I)
其中：
FR1是MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA(SEQ ID NO：1)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；
FR2是GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL(SEQ ID NO：2)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；
FR3是EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F(SEQ ID NO：3)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；并且
Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基，n和m各自独立地是3至20的整数。
在一些实施方案中，FR1是与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，FR1是与SEQ ID NO：1具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列；在一些实施方案中，FR2是与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，FR2是与SEQID NO：2具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列；在一些实施方案中，FR3是与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的多肽序列。在一些实施方案中，FR3是与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的多肽序列。
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素具有以下通式所示氨基酸序列：
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQID NO：4)
其中：
Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基；n和m各自独立地是3至20的整数；Xaa1为Gly、Ala、Val、Arg、Lys、Asp或Glu，更优选Gly、Ala、Arg或Lys，并且更甚至更优选Gly或Arg；Xaa2为Gly、Ala、Val、Ser或Thr，更优选Gly或Ser；Xaa3为Arg、Lys、Asn、Gln、Ser、Thr，更优选Arg、Lys、Asn或Gln，并且甚至更优选Lys或Asn；Xaa4为Gly、Ala、Val、Ser或Thr，更优选Gly或Ser；Xaa5为Ala、Val、Ile、Leu、Gly或Pro，更优选Ile、Leu或Pro，并且甚至更优选Leu或Pro；Xaa6为Gly、Ala、Val、Asp或Glu，更优选Ala、Val、Asp或Glu，并且甚至更优选Ala或Glu；Xaa7为Ala、Val、Ile、Leu、Arg或Lys，更优选Ile、Leu或Arg，并且甚至更优选Leu或Arg。
例如，抗PD-L1黏合素可具有以下通式所示氨基酸序列：
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADRVLTGYQVDKNKDDELTGF
(SEQ ID NO：5)，其中Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基；n和m各自独立地是3至20的整数。
在一些实施方案中，n为3至15、3至12、3至9、3至7、5至7、5至9、5至12、5至15、7至12或7至9。
在一些实施方案中，m为3至15、3至12、3至9、3至7、5至7、5至9、5至12、5至15、7至12或7至9。
在一些实施方案中，Xaa每次出现时单独地是可以通过在原核或真核细胞中重组表达而添加至多肽的氨基酸，并且甚至更优选地为20种天然存在的氨基酸之一。
在上述序列和式的一些实施方案中，(Xaa)n是通式(II)所示氨基酸序列
-aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6-(II)
其中：
aa1表示具有碱性侧链的氨基酸残基，更优选Lys、Arg或His，并且甚至更优选Lys或Arg；
aa2表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链，更优选小的脂肪族侧链、中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基，甚至更优选Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，并且甚至更优选Ala、Gln、Asp或Glu；
aa3表示具有芳香族或碱性侧链的氨基酸残基，优选Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，更优选Phe、Tyr、Trp，并且甚至更优选His或Tyr、Trp或His；
aa4表示具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链，优选中性极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基；更优选Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，并且甚至更优选Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu；
aa5表示具有中性极性或带电荷(酸性或碱性)或小的脂肪族或芳香族侧链，优选中性极性侧链或带电荷侧链的氨基酸残基；更优选Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，并且甚至更优选Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg；并且
aa6表示具有芳香族或酸性侧链的氨基酸残基，优选Phe、Tyr、Trp、Asp或Glu；更优选Trp或Asp；并且甚至更优选Trp。
在上述序列和式的一些实施方案中，(Xaa)n是通式(II)所示氨基酸序列
-aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp-(III)
其中：
aa1表示具有碱性侧链或芳香族侧链的氨基酸残基，优选Lys、Arg、His、Ser、Thr、Ash或Gln，更优选Lys、Arg、His、Asn或Gln，并且甚至更优选Lys或Asn；
aa2表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链，更优选小的脂肪族侧链、中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基，甚至更优选Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，并且甚至更优选Ala、Gln、Asp或Glu；
aa3表示具有芳香族或碱性侧链的氨基酸残基，优选Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，更优选Phe、Tyr、Trp或His，并且甚至更优选Tyr、Trp或His；
aa4表示具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链，优选中性极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基；更优选Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，并且甚至更优选Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu；并且
aa5表示具有中性极性或带电荷(酸性或碱性)或小的脂肪族或芳香族侧链，优选中性极性侧链或带电荷侧链的氨基酸残基；更优选Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，并且甚至更优选Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。
在上述序列和式的一些实施方案中，(Xaa)n是选自SEQ ID NO：6至40的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：6至41的序列具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(Xaa)n是与选自SEQ ID NO：6至41的序列具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的氨基酸序列。
Figure BPA0000294876740000431
Figure BPA0000294876740000441
在上述序列和式的一些实施方案中，(Xaa)m是通式(IV)所示氨基酸序列
-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-(IV)
其中：
aa7表示具有中性极性或非极性侧链或酸性侧链的氨基酸残基；优选Gly、Ala、Val、Pro、Trp、Gln、Ser、Asp或Glu，并且甚至更优选Gly、Ala、Trp、Gln、Ser、Asp或Glu；
aa8表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或芳香族侧链，更优选带电(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选Asp、Glu、Lys、Arg、His、Gln、Ser、Thr、Asn、Ala、Val、Pro、Gly、Tyr或Phe，并且甚至更优选Asp、Glu、Lys、Arg、His或Gln；
aa9表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或芳香族侧链，更优选中性极性侧链或酸性侧链的氨基酸残基，更优选Gln、Ser、Thr、Asn、Asp、Glu、Arg、Lys、Gly、Leu、Pro或Tyr，并且甚至更优选Gln、Thr或Asp；
aa10表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或芳香族侧链，更优选中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基，更优选Asp、Glu、Arg、His、Lys、Ser、Gln、Asn、Ala、Leu、Tyr、Trp、Pro或Gly，并且甚至更优选Asp、Glu、His、Gln、Asn、Leu、Trp或Gly；
aa11表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链，更优选中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基，更优选Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Arg、Lys、His、Val、Ile、Tyr或Gly，并且甚至更优选Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Lys或His；
aa12表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链，更优选酸性侧链的氨基酸残基，更优选Asp、Glu、Ser、Thr、Gln、Asn、Lys、Arg、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr、Phe或Gly，并且甚至更优选Asp、Glu、Ser、Tyr、Trp、Arg或Lys；
aa13表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链，更优选酸性侧链的氨基酸残基，更优选Ser、Thr、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Gly、Pro、Asp、Glu、His、Arg、Trp、Tyr或Phe，并且甚至更优选Ser、Thr、Gln、Asn、Val、Ile、Leu、Gly、Asp或Glu；
aa14表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选Ala、Ile、Trp、Pro、Asp、Glu、Arg、Lys、His、Ser、Thr、Gln或Asn，并且甚至更优选Ala、Pro、Asp、Glu、Arg、Lys、Ser、Gln或Asn；并且
aa15表示氨基酸残基，优选具有中性极性或中性非极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选His、Arg、Lys、Asp、Ser、Thr、Gln、Asn、Ala、Val、Leu、Gly或Phe，并且甚至更优选His、Arg、Lys、Asp、Ser、Thr、Gln或Asn。
在上述序列和式的一些实施方案中，(Xaa)m是选自SEQ ID NO：42至77的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：42至77的序列具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(Xaa)m是与选自SEQ ID NO：42至77的序列具有至少80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的氨基酸序列。
Figure BPA0000294876740000471
Figure BPA0000294876740000481
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素具有选自SEQ ID NO：78至86的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：78至86的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素具有与选自SEQ ID NO：78至86的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性的氨基酸序列。
Figure BPA0000294876740000482
Figure BPA0000294876740000491
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素具有：由具有对应于SEQ ID NO：87至94之一的第1至336位核苷酸之编码序列的核酸编码的氨基酸序列，或可以由具有与SEQ ID NO：87至94之一的第1至336位核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至98％同一性之编码序列的核酸编码的氨基酸序列，或可以由具有在严格条件下(在45℃下6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)的存在下，随后在65℃下0.2×SSC中洗涤)与SEQ ID NO：87至94之一的第1至336位核苷酸杂交之编码序列的核酸编码的氨基酸序列。
Figure BPA0000294876740000492
Figure BPA0000294876740000501
Figure BPA0000294876740000511
此外，较小的修饰还可以包括对本文中公开的stefin A或stefin A衍生序列的上述环2和环4插入片段以外的小缺失或添加，例如相对于stefin A或Stefin A衍生黏合素多肽至多10个氨基酸的添加或缺失。
在一些实施方案中，黏合素剂是具有黏合素多肽部分的PD-L1结合黏合素，其作为单体以约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、或者约0.1nM或更小的解离常数结合人PD-L1。
在一些实施方案中，黏合素剂是具有黏合素多肽部分的PD-L1结合黏合素，其作为单体以通过Biacore测量的约10-3s-1(单位为1/秒)或更慢；约10-4s-1或更慢或者甚至约10- 5s-1或更慢的解离速率常数(Koff)结合人PD-L1。
在一些实施方案中，黏合素剂是具有黏合素多肽部分的PD-L1结合黏合素，其作为单体以通过Biacore测量的至少约103M-1s-1或更快；至少约104M-1s-1或更快；至少约105M-1s-1或更快；或者甚至至少约106M-1s-1或更快的结合常数(Kon)结合人PD-L1。
在一些实施方案中，黏合素剂是具有黏合素多肽部分的PD-L1结合黏合素，其作为单体在与人PD-1的竞争性结合测定中以1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小、或者约0.1nM或更小的IC50结合人PD-L1。
在一些实施方案中，黏合素剂的熔解温度(Tm，即折叠状态和未折叠状态二者同等存在的温度)为65℃或更高，并且优选至少70℃、75℃、80℃或者甚至85℃或更高。熔解温度是蛋白质稳定性的一个特别有用的指标。折叠和未折叠蛋蛋白质的相对比例可以通过本领域技术人员已知的许多技术来确定，包括差示扫描量热法、UV差分光谱、荧光、圆二色性(CD)和NMR(Pace et al.(1997)″Measuring the conformational stability of aprotein″in Protein structure：A practical approach 2：299-321)。
a.融合蛋白-一般
在一些实施方案中，黏合素多肽还可包含调节黏合素多肽的生物活性的另外的插入、替换或缺失。例如，添加、替换或缺失可以调节经修饰的黏合素的一种或更多种性质或活性。例如，添加、替换或缺失可调节黏合素多肽例如与PD-1结合并抑制PD-1的亲和力、调节循环半衰期、调节治疗半衰期、调节黏合素多肽的稳定性、调节通过蛋白酶的切割、调节剂量、调节释放或生物利用度、促进纯化、降低脱酰胺、改善保质期或者改善或改变特定的施用途径。类似地，黏合素多肽可包含蛋白酶切割序列，反应性基团，抗体结合结构域(包括但不限于FLAG或poly-His)或其他基于亲和力的序列(包括但不限于FLAG、poly-His、GST等)或者改善多肽的检测、纯化或其他特性的连接分子(包括但不限于生物素)。
在一些情况下，这些另外的序列以融合蛋白的形式被添加至黏合素多肽的一端和/或另一端。因此，在本公开内容的某些方面中，黏合素剂是具有至少一个黏合素多肽序列和一个或更多个异源多肽序列(本文中的“融合结构域”)的融合蛋白。可以选择融合结构域以赋予期望的性质，例如从细胞分泌或保留在细胞表面(即，对于编码的黏合素)，以用作用于翻译后修饰的底物或其他识别序列，以产生通过蛋白质-蛋白质相互作用而聚集的多聚体结构，以改变(通常是延长)血清半衰期，或以改变组织定位或组织排斥和其他ADME特性，这些仅是一些实例。
例如，一些融合结构域对于例如通过亲和色谱法分离和/或纯化融合蛋白特别有用。促进表达或纯化的这样的融合结构域的公知的实例包括(仅用于举例说明)：亲和标签，例如多组氨酸(即His6标签)、Strep II标签、链霉亲和素结合肽(SBP)标签、钙调蛋白结合肽(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、S标签、HA标签、c-Myc标签、硫氧还蛋白、蛋白A和蛋白G。
为了待分泌的黏合素剂，其通常包含信号序列，所述信号序列指导蛋白质向内质网腔转运并最终被分泌(或者如果具有跨膜结构域或其他细胞表面保留信号，则被保留在细胞表面)。信号序列(也称为信号肽或前导序列)位于新生多肽的N末端。其将多肽靶向至内质网，并将蛋白质分选到它们的目的地，例如分选至细胞器的内部空间、内膜、细胞外膜或通过分泌分选至细胞外部。在蛋白质被转运到内质网后，大多数信号序列会被信号肽酶从蛋白质切割。信号序列从多肽的切割通常发生在氨基酸序列中的特定位点，并且取决于信号序列内的氨基酸残基。
在一些实施方案中，信号肽的长度为约5至约40个氨基酸(例如长度为约5至约7、约7至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、或约25至约30、约30至约35、或约35至约40个氨基酸)。
在一些实施方案中，信号肽是来自人蛋白质的天然信号肽。在另一些实施方案中，信号肽是非天然信号肽。例如，在一些实施方案中，非天然信号肽是来自相应天然分泌的人蛋白质的突变天然信号肽，并且可以包含一个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)替换插入或缺失。
在一些实施方案中，信号肽是来自非IgSF蛋白家族的信号肽或其突变体，例如来自以下的信号肽：免疫球蛋白(例如IgG重链或IgG-κ轻链)、细胞因子(例如白介素-2(IL-2)或CD33)、血清白蛋白(例如HSA或白蛋白)、人天青杀素(azurocidin)前蛋白信号序列、萤光素酶、胰蛋白酶原(例如糜蛋白酶原或胰蛋白酶原)或能够有效从细胞分泌蛋白质的其他信号肽。示例性信号肽包括但不限于：
Figure BPA0000294876740000531
Figure BPA0000294876740000541
Figure BPA0000294876740000551
在分泌的黏合素剂的一些实施方案中，重组多肽在表达时包含信号肽，并且在分泌之后信号肽(或其一部分)被从黏合素剂上切割。
本发明的融合蛋白还可包含分隔异源蛋白序列或结构域的一个或更多个接头。如本文所用，术语“接头”是指插入在第一多肽(例如，黏合素)和第二多肽(例如，第二黏合素、Fc区、受体陷阱、白蛋白等)之间的接头氨基酸序列。研究人员设计的经验性接头根据其结构通常分为三类：柔性接头、刚性接头和体内可切割接头。除了在将功能结构域连接在一起(如在柔性和刚性接头中)或在体内释放游离功能结构域(如在体内可切割接头中)的基本作用外，接头还可为融合蛋白的产生提供许多其他优势，例如提高生物活性，提高表达产量，以及实现期望的药代动力学谱。接头不应不利地影响融合蛋白的表达、分泌或生物活性。接头不应具有抗原性，也不应引起免疫应答。
合适的接头是本领域技术人员已知的，并且通常包含甘氨酸和丝氨酸残基的混合物，并且经常包含在空间上不受阻碍的氨基酸。可引入到可用的接头中的其他氨基酸包括苏氨酸和丙氨酸残基。接头的长度可以变化，例如1至50个氨基酸长，1至22个氨基酸长，1至10个氨基酸长，1至5个氨基酸长或1至3个氨基酸长。在一些实施方案中，接头可以包含切割位点。在一些实施方案中，接头可以包含酶切割位点，使得第二多肽可以与第一多肽分离。
在一些实施方案中，接头可以表征为柔性的。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，通常应用柔性接头。其通常由小的非极性(例如，Gly)或极性(例如，Ser或Thr)氨基酸构成。参见，例如，Argos P.(1990)“An investigation of oligopeptideslinking domains in protein tertiary structures and possible candidates forgeneral gene fusion”J Mol Biol.211：943-958。这些氨基酸的小尺寸提供了柔性，并允许连接的功能结构域的移动性。Ser或Thr的引入可以通过与水分子形成氢键来保持接头在水溶液中的稳定性，并且因此降低了接头与蛋白质部分之间的不利相互作用。最常用的柔性接头具有主要由Gly和Ser残基的延伸(stretch)组成的序列(“GS”接头)。最广泛使用的柔性接头的实例具有序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n。通过调节拷贝数“n”，可以优化该GS接头的长度，以实现功能结构域的适当分离，或维持必要的结构域间相互作用。除GS接头外，还为重组融合蛋白设计了许多其他柔性接头。这些柔性接头还富含小的或极性氨基酸，例如Gly和Ser，但可以包含其他氨基酸(例如Thr和Ala)以保持柔性，以及极性氨基酸(例如Lys和Glu)以改善溶解性。
在一些实施方案中，接头可以表征为刚性的。尽管柔性接头具有被动连接功能结构域并允许一定程度的移动的优点，但是在某些融合蛋白的实施方案中，这些接头缺乏刚性可能是限制(例如在表达产量或生物活性中)。在这些情况下，柔性接头的无效归因于蛋白质结构域的无效分离或它们之间相互干扰的降低不足。在这些情况下，已经成功地应用了刚性接头，以保持结构域之间的固定距离并保持其独立功能。
许多天然接头表现出α-螺旋结构。α-螺旋结构是刚性和稳定的，具有段内氢键和紧密堆积的骨架。因此，刚性α-螺旋接头可以充当蛋白质结构域之间的刚性间隔区。Georgeet al.(2002)“An analysis of protein domain linkers：their classification androle in protein folding”Protein Eng.15(11)：871-9。通常来说，刚性接头通过采用α-螺旋结构或通过包含多个Pro残基而表现出相对刚性的结构。在许多情况下，它们比柔性接头更有效地分隔功能结构域。可以通过更改拷贝数来容易地调整接头的长度，以实现结构域之间的最佳距离。结果，当结构域的空间分离对于保持融合蛋白的稳定性或生物活性至关重要时，选择刚性接头。在这方面中，已将具有序列(EAAAK)n(SEQ ID NO：201)的形成α螺旋的接头应用于许多重组融合蛋白的构建。另一类刚性接头具有富含Pro的序列(XP)n，其中X表示任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。
仅出于举例说明，示例性接头包括：
Figure BPA0000294876740000571
可用于本发明融合蛋白中的其他接头包括但不限于SerGly、GGSG(SEQ ID NO：203)、GSGS(SEQ ID NO：204)、GGGS(SEQ ID NO：205)、S(GGS)n(SEQ ID NO：206)(其中n为1至7)、GRA、poly(Gly)、poly(Ala)、GGGSGGG(SEQ ID NO：166)、ESGGGGVT(SEQ ID NO：167)、LESGGGGVT(SEQ ID NO：168)、GRAQVT(SEQ ID NO：169)、WRAQVT(SEQ ID NO：170)和ARGRAQVT(SEQ ID NO：171)。下述Fc融合体的铰链区也可以被认为是接头。
可以采用多种元件将蛋白质锚定在细胞的质膜上。例如，I型(以细胞外的N末端取向)和II型(以细胞质中的N末端取向)整合膜蛋白的跨膜结构域(TM)可用于将嵌合蛋白靶向质膜。也可以通过将GPI(糖磷脂酰肌醇脂质)信号融合至基因的3′端来将蛋白质附着在细胞表面。短羧基端肽的切割允许通过酰胺键联将糖脂连接至新暴露的C末端。参见Udenfriend et al.(1995)“How Glycosylphoshpatidylinositol Anchored MembraneProteins are Made”Annu Rev Biochem 64：563-591。
在一些实施方案中，融合蛋白包含跨膜多肽序列(跨膜结构域)。合适的跨膜多肽的区别性特征包括能够在将要展示黏合素剂的细胞表面表达的能力。在一些实施方案中，其可以是免疫细胞，特别是淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞，并且一旦与PD-L1相互作用，从而指导免疫细胞针对上调了PD-L1的预定的靶肿瘤细胞的细胞应答。跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。跨膜结构域可以来源于任何膜结合或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基，例如α、β、γ或δ，构成CD3复合物的多肽，IL2受体p55(a链)、p75(β链)或γ链，Fc受体的亚基链，特别是Fey受体III或CD蛋白。或者，跨膜结构域可以是合成的，并且可以主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。
在某些另外的实施方案中，黏合素剂是融合蛋白，除了黏合素多肽以外，其还包含为糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的翻译后添加发信号的序列。GPI锚是翻译后添加到许多真核蛋白的C末端的是糖脂结构。对黏合素剂的这种修饰将使其锚定(附着)在其中黏合素剂作为重组蛋白(即，如下所述的编码黏合素)重表达的细胞的细胞膜的胞外表面上。在这些实施方案中，GPI锚结构域在黏合素多肽序列的C末端，并且优选出现在融合蛋白的C末端。
在一些实施方案中，GPI锚结构域是当其为一部分的融合蛋白在真核系统中表达时为GPI锚的翻译后添加发信号的多肽。GPI锚信号序列由以下组成：一组在锚添加位点(ω位点)的小氨基酸，随后是亲水间隔区，并且以疏水延伸结尾(Low，(1989)FASEB J.3：1600-1608)。该信号序列的切割在添加具有保守的中央组分但具有可变的外围部分的锚之前在ER中发生(Homans et al.，Nature，333：269-272(1988))。GPI锚定的蛋白质的C末端通过磷酸乙醇胺桥连接到高度保守的核芯聚糖甘露糖(α1-2)甘露糖(α1-6)甘露糖(α1-4)葡萄糖胺(α1-6)肌醇。磷脂尾将GPI锚附接在细胞膜上。
可以在本发明含黏合素的融合蛋白中使用的示例性GPI锚结构域包括：
Figure BPA0000294876740000591
可以通过在能够进行GPI翻译后修饰的真核系统中表达包含GPI锚结构域的黏合素融合蛋白来实现GPI锚的附着。与跨膜结构域融合蛋白一样，人细胞(包括淋巴细胞和其他参与启动或促进抗肿瘤的细胞)具有如此的能力，并且可以进行改造以表达包含GPI锚结构域的编码的黏合素，以便将表达的包含黏合素的融合体保留在经改造细胞的表面上。
可以对黏合素多肽序列本身或作为融合蛋白的一部分提供的侧翼多肽部分进行的其他修饰是作为通过酶的翻译后修饰的位点的一个或更多个序列。这些可以包括但不限于糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸添加(palmitate addition)、磷酸化、糖脂键联修饰等。
b.改造PK和ADME性质
在一些实施方案中，黏合素剂可能不具有对于施用途径(例如肠胃外治疗给药)而言最佳的半衰期和/或PK谱。术语“半衰期”是指物质(例如本公开内容的黏合素剂)失去其药理或生理活性或浓度的一半所花费的时间量。生物半衰期可受物质的消除、排泄、降解(例如，酶促)或在身体某些器官或组织中的吸收和浓缩的影响。在一些实施方案中，可以通过确定物质的血浆浓度达到其稳态水平一半的时间(“血浆半衰期”)来评估生物半衰期。为了解决该缺点，在其他蛋白质治疗剂的情况下已经采用了多种延长半衰期的通用策略，包括引入半衰期延长部分作为黏合素剂的一部分。
术语“半衰期延长部分”是指与黏合素多肽共价连接(“缀合”或“融合”)以形成本文中所述的黏合素剂的可药用部分、结构域或分子，任选地直接通过非天然编码的氨基酸或通过接头，与比较物例如经修饰的黏合素多肽的未缀合形式相比，其阻止或减轻黏合素多肽的体内蛋白水解降解或其他降低活性的修饰，延长半衰期，和/或改善或改变其他药代动力学或生物物理性质，包括但不限于提高吸收速率、降低毒性、改善溶解性、降低蛋白质聚集、提高经修饰的黏合素多肽的生物活性和/或靶标选择性、提高可制造性和/或降低经修饰的黏合素多肽的免疫原性。术语“半衰期延长部分”包括非蛋白质半衰期延长部分，例如水溶性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或离散的PEG、羟乙基淀粉(HES)、脂质、支链或无支链酰基、支链或无支链C8-C30酰基、支链或无支链烷基以及支链或无支链C8-C30烷基；以及蛋白质半衰期延长部分，例如血清白蛋白、转铁蛋白、adnectins(例如，白蛋白结合或药代动力学延长(PKE)adnectins)、Fc结构域和非结构化多肽，例如XTEN和PAS多肽(例如，由氨基酸Pro、Ala和/或Ser构成的构象紊乱的多肽序列)和前述任一种的片段。对黏合素的晶体结构及其与靶标的相互作用(例如附图中所示的与PD-1的抗PD-L1黏合素复合物)的检查可以表明哪些氨基酸残基具有溶剂完全或部分可及的侧链。
在一些实施方案中，与未与该部分如此缀合的蛋白质(例如相对于单独黏合素多肽)的半衰期相比，半衰期延长部分延长了在哺乳动物血清中循环的所得黏合素剂的半衰期。在一些实施方案中，半衰期延长大于或大于约1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或6.0倍。在一些实施方案中，与没有半衰期延长部分的蛋白质相比，在体内施用之后，半衰期延长超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过96小时或超过1周。
作为进一步例证的手段，可用于产生本公开内容的黏合素剂的半衰期延长部分包括：
·药理学上黏合素序列与天然长半衰期蛋白质或蛋白质结构域的遗传融合体(例如，Fc融合体、转铁蛋白[Tf]融合体或白蛋白融合体。参见例如，Beck et al.(2011)“Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives toantibodies.MAbs.3：1-2；Czajkowsky et al.(2012)“Fc-fusion proteins：newdevelopments and future perspectives.EMBO Mol Med.4：1015-28；Huang et al.(2009)“Receptor-Fc fusion therapeutics，traps，and Mimetibody technology”CurrOpin Biotechnol.2009；20：692-9；Keefe et al.(2013)“Transferrin fusion proteintherapies：acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model.In：Schmidt S，editor.Fusion protein technologies for biopharmaceuticals：applications and challenges.Hoboken：Wiley；p.345-56；Weimer et al.(2013)“Recombinant albumin fusion proteins.In：Schmidt S，editor.Fusion proteintechnologies for biopharmaceuticals：applications and challenges.Hoboken：Wiley；2013.p.297-323；Walker et al.(2013)“Albumin-binding fusion proteins inthe development of novel long-acting therapeutics.In：Schmidt S，editor.Fusionprotein technologies for biopharmaceuticals：applications andchallenges.Hoboken：Wiley；2013.p.325-43。
·药理学上黏合素序列与惰性多肽例如XTEN(也称为重组PEG或“rPEG”)、高氨基酸聚合物(HAP；HAP化)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS；PAS化)或弹性蛋白样肽(ELP；ELP化)的遗传融合体。参见，例如，Schellenberger et al.(2009)“A recombinantpolypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in atunable manner.Nat Biotechnol.2009；27：1186-90；Schlapschy et al.Fusion of arecombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer：effects onbiophysical properties and prolonged plasma half-life.Protein Eng DesSel.2007；20：273-84；Schlapschy(2013)PASylation：a biological alternative toPEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically activeproteins.Protein Eng Des Sel.26：489-501.Floss et al.(2012)“Elastin-likepolypeptides revolutionize recombinant protein expression and theirbiomedical application.Trends Biotechnol.28：37-45.Floss et al.“ELP-fusiontechnology for biopharmaceuticals.In：Schmidt S，editor.Fusion proteintechnologies for biopharmaceuticals：application and challenges.Hoboken：Wiley；2013.p.372-98。
·通过药理学活性肽或蛋白质与重复化学部分(例如与PEG(PEG化)或透明质酸)的化学缀合来提高流体动力学半径。参见，例如Caliceti et al.(2003)“Pharmacokineticand biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates”Adv Drug Delivery Rev.55：1261-77；Jevsevar et al.(2010)PEGylation oftherapeutic proteins.Biotechnol J 5：113-28；Kontermann(2009)“Strategies toextend plasma half-lives of recombinant antibodies”BioDrugs.23：93-109；Kang etal.(2009)“Emerging PEGylated drugs”Expert Opin Emerg Drugs.14：363-80；以及Meroet al.(2013)“Conjugation of hyaluronan to proteins”Carb Polymers.92：2163-70。
·通过聚唾液酸化(polysialylation)显著提高融合药理学活性肽或蛋白质的负电荷；或者，替代地(b)将已知延长天然蛋白质的半衰期的带负电荷的高度唾液酸化的肽(例如羧基末端肽[CTP；绒毛膜促性腺激素(CG)b链的](例如人CGb亚基)与生物药物候选物融合。参见例如Gregoriadis et al.(2005)“Improving the therapeutic efficacy ofpeptides and proteins：a role for polysialic acids”Int J Pharm.2005；300：125-30；Duijkers et al.“Single dose pharmacokinetics and effects on folliculargrowth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation(FSHCTP)in healthy pituitary-suppressed females”(2002)Hum Reprod.17：1987-93；以及Fares et al.“Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to thefollitropin beta subunit”(1992)Proc Natl Acad Sci USA.89：4304-8.35；以及Fares“Half-life extension through O-glycosylation。
·通过肽或蛋白质结合结构域与生物活性蛋白质的连接，非共价地结合至通常长半衰期蛋白质，例如HSA、人IgG、转铁蛋白或纤连蛋白。参见，例如，Andersen et al.(2011)“Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor(FcRn)using a minimal albumin binding domain”J Biol Chem.286：5234-41；O’Connor-Semmes et al.(2014)“GSK2374697，a novel albumin-binding domain antibody(albudAb)，extends systemic exposure of extendin-4：first study in humans-PK/PDand safety”Clin Pharmacol Ther.2014；96：704-12.Sockolosky et al.(2014)“Fusionof a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant proteinsubstantially increases its plasma half-life in mice”PLoS One.2014；9：e102566。
与长期存在的血清蛋白质的经典遗传融合提供了不同于与PEG或脂质化学缀合的替代半衰期延长方法。传统上，两种主要蛋白质被用作融合伴侣：抗体Fc结构域和人血清白蛋白(HSA)。Fc融合体涉及肽、蛋白质或受体外结构域与抗体的Fc部分的融合。Fc融合体和白蛋白融合体二者不仅通过提高肽药物的尺寸延长半衰期，而且二者还利用了体内的天然再循环机制：新生Fc受体FcRn。这些蛋白质与FcRn的pH依赖性结合阻止了融合蛋白在内体内降解。基于这些蛋白质的融合体的半衰期可以为3至16天，比典型的PEG化或脂化肽长得多。与抗体Fc结构域的融合可以改善肽或蛋白质药物的溶解性和稳定性。肽Fc融合体的一个实例是度拉糖肽(dulaglutide)，一种目前处于后期临床试验中的GLP-1受体激动剂。人血清白蛋白(脂肪酰化肽所利用的相同蛋白质)是另一种流行的融合伴侣。阿必鲁肽(albiglutide)是基于该平台的GLP-1受体激动剂。Fc和白蛋白之间的主要区别在于Fc的二聚体性质对比于HSA的单体结构，导致融合肽呈现为二聚体或单体形式(取决于对融合伴侣的选择)。如果肿瘤细胞上的黏合素靶标(例如PD-L1)彼此间隔足够近或本身是二聚体，则黏合素-Fc融合体的二聚性质可产生亲合力效应。取决于靶标，这可能是或不是可期望的。
(i)Fc融合体
在一些实施方案中，黏合素多肽可以是具有免疫球蛋白Fc结构域(“Fc结构域”)或者其片段或变体(例如功能性Fc区)的融合蛋白的一部分。在本文中，Fc融合体(“Fc-融合体”)(例如作为黏合素-Fc融合蛋白产生的黏合素剂)是包含通过肽骨架(直接或间接)与免疫球蛋白的Fc共价连接的一个或更多个黏合素序列的多肽。Fc-融合体可包含例如抗体的Fc区(其促进效应子功能和药代动力学)和作为相同多肽的一部分的黏合素序列。免疫球蛋白Fc区也可以间接连接至一个或更多个黏合素。多种接头是本领域已知的并且可以任选地用于将Fc连接至包含黏合素序列的多肽以产生Fc-融合体。在一些实施方案中，可将Fc-融合体二聚化以形成Fc-融合体同二聚体，或使用不同的Fc结构域以形成Fc-融合体异二聚体。
选择人抗体的Fc区用于产生作为黏合素融合蛋白的本发明黏合素剂有许多原因。基本原理是产生足够大以表现出与抗体的药代动力学相比相似的药代动力学特性的稳定蛋白质，并利用由Fc区赋予的特性；这包括挽救新生FcRn受体途径，涉及内吞后FcRn介导的融合蛋白向细胞表面的再循环，避免溶酶体降解并导致释放回血流中，从而有助于延长血清半衰期。另一个明显的优点是Fc结构域与蛋白A的结合，其可简化黏合素剂产生过程中的下游加工过程，并允许产生高纯度的黏合素剂制剂。
通常来说，Fc结构域将包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体的恒定区。因此，Fc结构域是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包含J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。尽管Fc结构域的边界可能有所不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为包含残基C226或P230至其羧基末端，其中编号根据Kabat中所述的EU索引(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NIH，Bethesda，Md.(1991))。Fc可以是指单独的该区域，或者在完整抗体、抗体片段或Fc融合蛋白情况下的该区域。多态性已经在许多不同的Fc位置观察到，并且也包含作为本文中所用的Fc结构域。
在一些实施方案中，如本文中所用的Fc，“功能性Fc区”是指保留结合FcRn的能力的Fc结构域或其片段。功能性Fc区与FcRn结合，但不具有效应子功能。Fc区或其片段与FcRn结合的能力可以通过本领域已知的标准结合测定来确定。示例性的“效应子功能”包括：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。可以使用本领域已知的用于评价这样的抗体效应子功能的多种测定来评估这样的效应子功能。
在一个示例性实施方案中，Fc结构域来源于IgG1亚类，然而，也可以使用其他亚类(例如IgG2、IgG3和IgG4)。可以使用的人IgG1免疫球蛋白Fc结构域的示例性序列为：
Figure BPA0000294876740000641
在一些实施方案中，融合蛋白中使用的Fc区可包含Fc分子的铰链区。示例性的铰链区包含跨越以上提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的第1至16位(即，DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：178))的核芯铰链残基。在一些实施方案中，部分由于以上提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的铰链区中第6至9位的半胱氨酸残基，含黏合素的融合蛋白可采用多聚体结构(例如，二聚体)。在另一些实施方案中，本文中所用的铰链区还可包括来源于位于以上提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的核芯铰链序列侧翼的CH1和CH2区的残基。在另一些实施方案中，铰链序列可包含GSTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：179)或EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：180)或者由其组成。
在一些实施方案中，铰链序列可包含赋予期望的药代动力学、生物物理学和/或生物学特性的一个或更多个替换。一些示例性铰链序列包括：
Figure BPA0000294876740000651
在一些实施方案中，可以将以上提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的第18位的残基P替代为S以消除Fc效应子功能。这种替代在具有序列EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO：183)、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO：184)和DKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO：186)的铰链中例示。在另一个实施方案中，可以将以上提供的示例性人IgG1免疫球蛋白Fc结构域序列的第1至2位的残基DK替代为GS以去除潜在的剪辑位点(clip site)。这种替代在序列EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO：184)中例示。在另一个实施方案中，可以将人IgG1的重链恒定区的第103位(即结构域CH1-CH3)的C替代为S，以防止在不存在轻链的情况下不正确的半胱氨酸键形成；这种替代由EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS(SEQ ID NO：182)、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO：183)和EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS(SEQ ID NO：184)例示。
在一些实施方案中，Fc是哺乳动物Fc，例如人Fc，包括来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域。Fc区可与天然Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，Fc区可与天然Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约90％的序列同一性。
在一些实施方案中，Fc结构域包含选自SEQ ID NO：95的氨基酸序列，或来自通过SEQ ID NO：96至108提供的实例的Fc序列。应当理解，Fc结构域的C末端赖氨酸是包含Fc结构域的融合蛋白的任选组分。在一些实施方案中，Fc结构域包含选自SEQ ID NO：95至108的氨基酸序列，只是省略了其C末端赖氨酸。在一些实施方案中，Fc结构域包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc结构域包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，只是省略了其C末端赖氨酸。
Figure BPA0000294876740000661
Figure BPA0000294876740000671
Figure BPA0000294876740000681
在实施例和附图中提供了具有Fc的PD-L1结合黏合素的示例性Fc融合体，表明黏合素序列可以被置于Fc结构域的N末端或C末端，并且可以直接连接，或者融合蛋白可具有插入在Fc结构域和黏合素多肽序列之间的其他多肽序列。在示例性实例中，非结构化(柔性)接头(Gly4Ser)n与PD-L1结合黏合素“251”(SEQ ID NO：86)和人IgG1的Fc结构域(SEQ IDNO：95)一起使用，其中铰链区是EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG。所述构建体均包含CD33分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)，其从蛋白质的成熟形式切割。
Figure BPA0000294876740000691
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中分泌的Ig结合到某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上，使这些细胞毒性效应细胞能够与带有抗原的靶细胞特异性结合，并随后用细胞毒素杀伤靶细胞。
在一些实施方案中，融合蛋白包含Fc结构域序列，对于其所得的黏合素剂不具有(或具有降低的)ADCC和/或补体激活或效应子功能。例如，Fc结构域可包含IgG2或IgG4同种型的天然失能的恒定区或突变的IgG1恒定区。合适的修饰的实例在EP0307434中描述。一个实例包括第235至237位丙氨酸残基的替换(EU索引编号)。
在另一些实施方案中，融合蛋白包含Fc结构域序列，对于其所得的黏合素剂将保留一些或全部Fc功能，例如能够具有ADCC和CDC活性中的一种或两种，例如如果融合蛋白包含来自人IgG1或IgG3的Fc结构域的话。效应子功能的水平可以根据已知技术改变，例如通过CH2结构域中的突变，例如其中IgG1 CH2结构域在选自239和332和330的位置具有一个或更多个突变，例如，突变选自S239D和I332E和A330L，以使抗体具有增强的效应子功能，和/或例如改变本公开内容的抗原结合蛋白的糖基化谱，从而降低Fc区的岩藻糖基化。
(ii)白蛋白融合体
在另一些实施方案中，黏合素剂是除至少一个黏合素序列之外还包含白蛋白序列或白蛋白片段的融合蛋白。在另一些实施方案中，除了引入到含黏合素的多肽序列中之外，将黏合素剂通过化学键联与白蛋白序列或白蛋白片段缀合。在一些实施方案中，白蛋白、白蛋白变体或白蛋白片段是人血清白蛋白(HSA)、人血清白蛋白变体或人血清白蛋白片段。可在例如食蟹猴、牛、狗、兔和大鼠中发现与HSA相当的白蛋白血清蛋白。在非人物种中，牛血清白蛋白(BSA)在结构上与HSA最相似。参见例如，Kosa et al.，(2007)J Pharm Sci.96(11)：3117-24。本公开内容预期使用来自非人物种的白蛋白，包括但不限于来源于食蟹猴血清白蛋白或牛血清白蛋白的白蛋白序列。
成熟的HSA是血清半衰期为约20天的585个氨基酸的多肽(约67kDa)，其主要负责维持胶体渗透血压、血液pH以及许多内源和外源配体的运输和分布。该蛋白质具有三个结构同源结构域(结构域I、II和III)，几乎完全处于α-螺旋构象，并通过17个二硫键高度稳定。在一些实施方案中，黏合素剂可以是包含一个或更多个黏合素多肽序列和成熟人血清白蛋白(SEQ ID NO：113)或者其变体或片段的序列的白蛋白融合蛋白，其将成熟白蛋白的PK和/或生物分布特性保持在融合蛋白中期望的程度。
Figure BPA0000294876740000701
可以通过使用如上所述的接头序列将白蛋白序列与黏合素多肽序列或黏合素剂中的其他侧翼序列分开。
尽管除非另有说明，否则本文中提及“白蛋白”或“成熟白蛋白”意在指代HSA。然而，应注意全长HSA具有18个氨基酸的信号肽(MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO：137))，随后是6个氨基酸的原结构域(pro-domain)(RGVFRR)(SEQ ID NO：207)；该24个氨基酸残基的肽可以称为前原结构域(pre-pro-domain)。可以使用重组蛋白编码序列中的HSA前原结构域表达和分泌黏合素-HSA融合蛋白。或者，可以通过包含例如以上所述的其他分泌信号序列来表达和分泌黏合素-HSA融合体。
在替代的实施方案中，血清白蛋白多肽可以通过除骨架酰胺键以外的键共价偶联至含黏合素的多肽，例如通过白蛋白多肽和含黏合素的多肽各自上的氨基酸侧链之间的化学缀合进行交联，而不是作为具有黏合素多肽的融合蛋白的一部分而提供。
(iii)白蛋白结合结构域
在一些实施方案中，黏合素剂可包含血清结合部分-作为具有黏合素多肽序列的融合蛋白的一部分(如果也是多肽)，或通过连续多肽链的一部分以外的位点化学缀合。
在一些实施方案中，血清结合多肽是白蛋白结合部分。白蛋白包含多个疏水性结合口袋，并天然充当多种不同配体(例如脂肪酸和类固醇以及不同的药物)的转运体。此外，白蛋白表面带负电，使其高度水溶性。
本文中所用的术语“白蛋白结合部分”是指能够与白蛋白结合(即具有白蛋白结合亲和力)的任何化学基团。白蛋白与内源配体(例如脂肪酸)结合；然而，其也与外源配体如华法林(warfarin)、青霉素和地西泮(diazepam)相互作用。由于这些药物与白蛋白的结合是可逆的，因此白蛋白-药物复合物充当了药物储库，其可增强药物的生物分布和生物利用度。模仿内源白蛋白结合配体(例如脂肪酸)的组分的引入已被用于增强白蛋白缔合并提高药物效力。
在一些实施方案中，可应用于产生本发明的黏合素剂以提高蛋白质半衰期的化学修饰方法是脂化，其涉及脂肪酸与肽侧链的共价结合。最初构想并开发为延长胰岛素半衰期的方法，脂化具有与PEG化相同的半衰期延长的基本机制，即提高流体动力学半径以降低肾脏滤过。然而，脂质部分本身相对较小，并且该作用通过脂质部分与循环白蛋白的非共价结合而间接地介导。脂化的一个后果是其降低了肽的水溶性，但是对肽和脂肪酸之间的接头的改造可以对此进行调节，例如通过在接头中使用谷氨酸盐或小PEG。接头改造和脂质部分的变化可影响自聚集，其可通过独立于白蛋白来减缓生物分布而延长半衰期。参见，例如Jonassen et al.(2012)Pharm Res.29(8)：2104-14。
用于产生某些黏合素剂的白蛋白结合部分的其他实例包括白蛋白结合(PKE2)adnectins(参见WO2011140086“Serum Albumin Binding Molecules”、WO2015143199“Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains”和WO2017053617“Fast-offrate serum albumin binding fibronectin type iii domains”)、链球菌菌株G148的蛋白G的白蛋白结合结构域3(ABD3)和白蛋白结合结构域抗体GSK2374697(“AlbudAb”)或ATN-103(Ozoralizumab)的白蛋白结合纳米体部分。
(iv)PEG化、XTEN、PAS和其他聚合物
广泛多种大分子聚合物和其他分子可以与本公开内容的含黏合素的多肽连接，以调节所得的黏合素剂的生物学特性，和/或为黏合素剂提供新的生物学特性。这些大分子聚合物可以通过天然编码的氨基酸、通过非天然编码的氨基酸、或者天然或非天然氨基酸的任何功能取代基、或者添加至天然或非天然氨基酸的任何取代基或官能团与含黏合素的多肽连接。聚合物的分子量可以在宽范围内，包括但不限于约100Da至约100,000Da或更高。聚合物的分子量可以为约100Da至约100,000Da，包括但不限于100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施方案中，聚合物的分子量为约100Da至约50,000Da。在一些实施方案中，聚合物的分子量为约100Da至约40,000Da。在一些实施方案中，聚合物的分子量为约1,000Da至约40,000Da。在一些实施方案中，聚合物的分子量为约5,000Da至约40,000Da。在一些实施方案中，聚合物的分子量为约10,000Da至约40,000Da。
为此，已经开发了多种方法，包括PEG化、聚唾液酸化、HES化、糖基化或与柔性和亲水性氨基酸链(500至600个氨基酸)融合的重组PEG类似物(参见Chapman，(2002)Adv DrugDeliv Rev.54.531-545；Schlapschy et al.，(2007)Prot Eng Des Sel.20，273-283；Contermann(2011)Curr Op Biotechnol.22，868-876；Jevsevar et al.，(2012)MethodsMol Biol.901，233-246)。
聚合物的实例包括但不限于聚烷基醚及其烷氧基封端的类似物(例如聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/丙二醇及其甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其是聚氧乙二醇，后者也称为聚乙二醇或PEG)；离散PEG(dPEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚
Figure BPA0000294876740000731
唑啉、聚烷基
Figure BPA0000294876740000732
唑啉和聚羟烷基
Figure BPA0000294876740000733
唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟烷基丙烯酰胺(例如，聚羟丙基甲基丙烯酰胺及其衍生物)；聚羟烷基丙烯酸酯；聚唾液酸及其类似物；亲水肽序列；多糖及其衍生物，包括右旋糖酐和右旋糖酐衍生物，例如羧甲基右旋糖酐、硫酸右旋糖酐、氨基右旋糖酐；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素、羟烷基纤维素；几丁质及其衍生物，例如壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖；透明质酸及其衍生物；淀粉；藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；短梗霉聚糖和羧甲基短梗霉聚糖；聚氨基酸及其衍生物，例如聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，例如：苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；以及前述物质的衍生物。
所选择的聚合物可以是水溶性的，从而使其连接的黏合素剂不会在水性环境(例如生理环境)中沉淀。水溶性聚合物可以是任何结构形式，包括但不限于线性、叉形或支化的。通常来说，水溶性聚合物是聚(亚烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，但是也可以使用其他水溶性聚合物。举例来说，PEG用于描述本公开内容的一些实施方案。对于黏合素剂的治疗用途，聚合物可以是可药用的。
术语“PEG”广泛地用于涵盖任何聚乙二醇分子，而无视PEG的尺寸或末端的修饰，并且可以由下式表示为与含黏合素的多肽连接：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
或
XO-(CH2CH2O)n-
其中n为2至10,000并且X为H或末端修饰，包括但不限于C1-4烷基、保护基或末端官能团。在一些情况下，用于本公开内容的多肽中的PEG在一端以羟基或甲氧基终止，即，X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。
注意，在上式中由末端“——”表示的PEG的另一端可以通过天然存在或非天然编码的氨基酸连接至含黏合素的多肽。例如，连接可以通过与多肽的胺基(包括但不限于赖氨酸的ε胺或N末端)的酰胺、氨基甲酸酯或脲键联。或者，聚合物通过与巯基(包括但不限于半胱氨酸的巯基)的马来酰亚胺键联连接——在连接至黏合素多肽序列本身的情况下，其需要将黏合素序列中的残基更改为半胱氨酸。
可以调节与含黏合素的多肽连接的水溶性聚合物的数量(即PEG化或糖基化的程度)，以为所得黏合素剂提供改变的(包括但不限于，提高的或降低的)的药理学、药代动力学或药效学特性，例如体内半衰期。在一些实施方案中，相对于未经修饰的多肽，所得黏合素剂的半衰期提高到至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、或至少约100倍。
可用于改变所得黏合素剂的PK或其他生物学性质的聚合物体系的另一种变化是使用非结构性亲水氨基酸聚合物，其是PEG的功能类似物，特别是作为具有黏合素多肽序列的融合蛋白的一部分。多肽平台固有的生物降解性使其成为PEG的潜在更加良性替代品具有吸引力。与PEG的多分散性相比，另一个优点是重组分子的精确分子结构。与其中需要维持融合伴侣的三维折叠的HSA和Fc肽融合体不同，与非结构化伴侣的重组融合体在许多情况下可以经受更高的温度或苛刻的条件，例如HPLC纯化。
这类多肽中最先进的一种称为XTEN(Amunix)，长864个氨基酸并且由六种氨基酸(A、E、G、P、S和T)构成。参见Schellenberger et al.“A recombinant polypeptideextends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner”2009 Nat Biotechnol.27(12)：1186-90。由于(enabled by)聚合物的可生物降解特性，其比通常使用的40KDa PEG大得多，并且赋予伴随的更大半衰期延长。XTEN与含黏合素的多肽的融合应导致最终的黏合素剂的半衰期比未经修饰的多肽延长60至130倍。
基于类似概念上的考虑的第二聚合物是PAS(XL-Protein GmbH)。Schlapschy etal.“PASYlation：a biological alternative to PEGylation for extending theplasma half-life of pharmaceutically active proteins”2013 Protein Eng DesSel.26(8)：489-501。由仅三种较小的不带电荷氨基酸脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的甚至更有限的组构成的无规卷曲聚合物。与Fc、HAS和XTEN一样，PAS修饰可以与黏合素多肽序列一起进行遗传编码，从而在表达时产生内联融合蛋白。
c.多特异性融合蛋白
在一些实施方案中，黏合素剂是包含例如第一抗PD-L1黏合素多肽和至少一个另外的结合结构域的多特异性多肽。另外的结合结构域可以是选自以下(用于举例说明)的多肽序列：第二黏合素多肽序列(其可以与第一黏合素多肽序列相同或不同)、抗体或其片段或其他抗原结合多肽、受体的配体结合部分(例如受体陷阱多肽)、受体结合配体(例如细胞因子、生长因子等)、经改造的T细胞受体、酶或其催化片段、或赋予一些的其他多肽序列。
在一些实施方案中，黏合素剂包含也针对PD-L1的一个或更多个另外的黏合素多肽序列。另外的抗PD-L1黏合素可以与第一抗PD-L1黏合素多肽相同或不同(或其混合物)，以产生多特异性黏合素融合蛋白。黏合素剂可以结合PD-L1上相同或重叠的位点，或者可以结合两个不同的位点，使得黏合素剂可以同时结合同一PD-L1蛋白上的两个位点(双互补位(biparatopic))或多于两个位点(多互补位(multiparatopic))。
在一些实施方案中，黏合素剂包含来自抗体的一个或更多个抗原结合位点。所得黏合素剂可以是包含抗PD-L1黏合素和抗原结合位点二者的单链(例如在scFV的情况下)，或可以是多聚体蛋白复合物，例如利用与抗PD-L1抗体的序列融合的重链和/或轻链组装的抗体。这种形式的示例性黏合素/抗体融合体是图11A中所示的伊匹单抗-AVA04-141双特异性抗体，其针对CTLA-4和PD-L1中的每一种是二价的。另一个是图13A中所示的贝伐单抗-AVA04-251双特异性抗体，其针对VEGF-A和PD-L1中的每一种是二价的。
在所举例说明的伊匹单抗-AVA04-141双特异性抗体的情况下，抗PD-L1黏合素多肽以内联融合体提供在抗CTLA-4抗体重链的C末端，其中重链(包含可以被除去的分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)以及Gly4-Ser重复接头)具有以下黏合素融合体序列：
Figure BPA0000294876740000751
Figure BPA0000294876740000761
并且轻链(包含可以被除去的分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)具有天然伊匹单抗抗体的序列：
Figure BPA0000294876740000762
同样地，在所举例说明的贝伐单抗-AVA04-251双特异性抗体的情况下，抗PD-L1黏合素多肽以内联融合体提供在抗VEGF-A抗体的重链的C末端，其中重链(包含可以被除去的分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)以及柔性Gly4-Ser重复接头)具有以下黏合素融合体序列：
Figure BPA0000294876740000763
轻链(包含可以被除去的分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136))具有天然贝伐单抗抗体的序列：
Figure BPA0000294876740000764
为了进一步说明格式化本公开内容提供的黏合素的柔性，还产生了贝伐单抗-AVA04-251双特异性抗体的一种形式，其中轻链与上述相同，但重链在抗体重链和抗PD-L1黏合素之间包含刚性接头，其中重链(包含可以被除去的分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)以及刚性A(EAAAK)3接头)具有以下黏合素融合体序列：
Figure BPA0000294876740000771
如对于本领域技术人员明显的并且在图17中举例说明的，可以将抗PD-L1黏合素多肽序列添加到抗体的重链或轻链的N末端或C末端或其组合/置换。此外，在多聚体黏合素的情况下，如图9所示，任何给定的抗体链可以包含多于一个黏合素序列。
在关于包含全长免疫球蛋白的多特异性黏合素剂的一些实施方案中，黏合素多肽序列与抗体的融合将保留免疫球蛋白Fc区的Fc功能。例如，在一些实施方案中，黏合素剂将能够通过其Fc部分与Fc受体阳性细胞的Fc受体结合。在一些另外的实施方案中，黏合素剂可通过与Fc受体阳性细胞结合而活化Fc受体阳性细胞，从而起始或提高细胞因子和/或共刺激抗原的表达。此外，黏合素剂可通过共刺激抗原和/或细胞因子将T细胞的生理活化所需的至少第二活化信号转移至T细胞。
在一些实施方案中，由于其Fc部分与表达存在于来自免疫系统的效应细胞(例如免疫细胞、肝细胞和内皮细胞)的表面上的Fc受体的其他细胞结合，黏合素剂可具有抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)功能，这是细胞介导的一种免疫防御机制，通过该机制免疫系统的效应细胞主动裂解膜表面抗原已被抗体结合的靶细胞，并且因此通过ADCC引起肿瘤细胞死亡。在一些另外的实施方案中，黏合素剂能够表现出ADCC功能(图5C)。
如上所述，除Fc介导的细胞毒性外，Fc部分还可有助于维持黏合素剂的血清水平，这对于其在体内的稳定性和持久性至关重要。例如，当Fc部分与内皮细胞和吞噬细胞上的Fc受体结合时，黏合素剂可被内化并再循环回血流，从而延长其在体内的半衰期。
另外的黏合素多肽的示例性靶标包括但不限于另一免疫检查点蛋白和免疫共刺激受体(特别是如果另外黏合素可以激动共刺激受体的话)、受体、细胞因子、生长因子或与肿瘤相关的抗原，其仅用于举例说明。
当黏合素剂是黏合素/抗体融合蛋白时，免疫球蛋白部分例如可以是免疫球蛋白，是针对CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、VEGF、VEGF受体、EGFR或Her2/neu的单克隆抗体。这样的免疫球蛋白的一些示例性实例包括以下任一种中包含的抗体：曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、本妥昔单抗(brentuximab)和吉妥珠单抗(gemtuzumab)。
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素多肽是黏合素剂的一部分，所述黏合素剂包含一个或更多个抑制例如在T细胞上表达的免疫检查点分子的结合结构域，所述免疫检查点分子包括但不限于PD-1、PD-L2、CTLA-4、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA或TIGIT。
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素多肽是黏合素剂的一部分，所述黏合素剂包含一个或更多个激动例如在T细胞上表达的免疫共刺激分子的结合结构域，所述免疫共刺激分子包括但不限于CD28、ICOS、CD137、OX40、GITR、CD27、CD30、HVEM、DNAM-1或CD28H。
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素多肽是黏合素剂的一部分，所述黏合素剂包含免疫共刺激分子的一种或更多种配体激动剂，例如CD28、ICOS、CD137、OX40、GITR、CD27、CD30、HVEM、DNAM-1或CD28H的激动剂配体。
通过将抗PD-L1黏合素的PD-L1抑制活性与阻断一种或更多种抑制性免疫检查点和/或激活一种或更多种免疫共刺激途径的结合结构域组合，多特异性黏合素剂可以挽救在其他方面耗竭的抗肿瘤T细胞，增强抗肿瘤免疫力，并且从而在癌症患者中获得阳性应答。在一些另外的实施方案中，黏合素剂对协同表达的免疫检查点蛋白的双重阻断可产生累加或协同的抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素多肽是黏合素剂的一部分，所述黏合素剂包含一个或更多个抑制可溶性免疫抑制分子的结合结构域，例如与可溶性免疫抑制分子结合的结合结构域(例如受体陷阱)或与相应对应受体结合并阻止受体的配体活化的结合结构域，包括但不限于PGE2、TGF-β、VEGF、CCL2、IDO、CSF1、IL-10、IL-13、IL-23、腺苷或STAT3激活剂的拮抗剂。在某些情况下，黏合素剂包含VEGF受体陷阱结构域，例如阿柏西普(Aflibercept)的VEGF结合受体结构域。在另一个实例中，黏合素剂包含TGF-β受体陷阱结构域，例如MSB0011359C的TGF-β结合受体结构域。
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素多肽是黏合素剂的一部分，所述黏合素剂包含一个或更多个与在肿瘤微环境中上调的蛋白质结合的结构域，所述蛋白质即肿瘤相关抗原，例如在肿瘤中的肿瘤细胞或在巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞或其他浸润肿瘤的免疫细胞上上调。
在一些实施方案中，抗PD-L1黏合素多肽是黏合素剂的一部分，所述黏合素剂包含一个或更多个与选自以下的蛋白质结合的结构域：CEACAM-1、CEACAM-5、BTLA、LAIR1、CD160、2B4、TGFR、B7-H3、B7-H4、CD40、CD4OL、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、半乳凝素-9、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、LIGHT、MHC I类或II类、NKG2a、NKG2d、OX4OL、PVR、SIRPα、TCR、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、VEGF、VEGF受体、EGFR、Her2/neu、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E或TSL。
d.缀合物
本发明黏合素剂还可以包含一个或更多个旨在赋予黏合素剂以可检测性或另外的药理活性的功能部分。用于检测的功能部分是可用于检测黏合素剂与体内细胞或组织(例如肿瘤细胞)的缔合的那些。具有药理活性的功能部分是指旨在递送至表达黏合素剂的靶标(在本公开内容的PDL-L1黏合素剂的情况下为PD-L1)的组织并且在这种情况下对所靶向的组织或细胞具有药理结果的那些药剂。
本公开内容提供了黏合素剂，其包含具有广泛多种官能团、取代基或部分的物质与那些功能部分的缀合物，所述功能部分包括但不限于：标记；染料；免疫黏附分子；放射性核素；细胞毒性化合物；药物；亲和标记；光亲和标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖；水溶性树枝状聚合物；环糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米颗粒；自旋标记；荧光团，含金属的部分；放射性部分；新官能团；与其他分子共价或非共价相互作用的基团；光笼部分(photocaged moiety)；光化辐射可激发部分(actinicradiation excitable moiety)；可光异构部分(photoisomerizable moiety)；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；伸长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子密集基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；量子点；纳米发射器(nanotransmitter)；放射性核苷酸；无线电发射器(radiotransmitter)；中子捕获剂；或以上的任何组合，或者任何其他期望的化合物或物质。
(i)标记和可检测部分
当该部分是可检测标记时，其可以是荧光标记、放射性标记、酶标记或技术人员已知的任何其他标记。在一些实施方案中，功能部分是可检测标记，其可以作为缀合物的一部分被包含以形成适合于医学成像的某些黏合素剂。“医学成像”意指用于诊断、研究或治疗目的而使人体或动物体的内部区域可视化的任何技术。例如，可以通过放射性闪烁摄影(radioscintigraphy)、磁共振成像(MRI)、计算机断层摄影术(CT扫描)、核成像、包含金属断层摄影(PET)造影剂的正电子发射、光学成像(例如荧光成像，包括近红外荧光(NIRF)成像)、生物发光成像或其组合来检测(和量化)黏合素剂。功能部分任选地是用于X射线成像的造影剂。可用于增强这样的技术的试剂是能够使体内特定位点、器官或疾病部位可视化和/或导致通过成像技术生成的图像的质量有一些改善，使这些图像改善或更容易解释的那些材料。这样的试剂在本文中称为造影剂，其使用通过提高图像的那些不同区域之间的“对比度”来促进图像的不同部分的区分。因此，术语“造影剂”涵盖用于增强图像(尽管其可以在不存在这样的试剂的情况下生成)的质量的试剂(例如在MRI的情况下)，以及作为生成图像的先决条件的试剂(例如，在核成像的情况下)。
在一些实施方案中，可检测标记包含用于螯合金属的螯合部分，例如用于放射性金属或顺磁性离子的螯合剂。在一些实施方案中，可检测标记是可用于放射治疗或成像程序的放射性核素的螯合剂。在本公开内容中可用的放射性核素包括γ-发射体、正电子发射体、俄歇电子发射体、X射线发射体和荧光发射体，其中β-或α-发射体用于治疗用途。在放射治疗中可用作毒素的放射性核素的实例包括：43K、47Sc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、64Cu、67Ga、67Cu、68Ga、71Ge、75Br、76Br、77Br、77As、81Rb、90Y、97Ru、99mTc、100Pd、101Rh、103Pb、105Rh、109Pd、111Ag、111In、113In、119Sb121Sn、123I、125I、127Cs、128Ba、129Cs、131I、131Cs、143Pr、153Sm、161Tb、166Ho、169Eu、177Lu、186Re、188Re、189Re、191Os、193Pt、194Ir、197Hg、199Au、203Pb、211At、212Pb、212Bi和213Bi。螯合剂将与金属配位的条件在例如Gansow等的美国专利NO：4,831,175、4,454,106和4,472,509中描述。螯合剂的实例包括(仅用于举例说明)：1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)。
可以直接引入到黏合素多肽的氨基酸残基中或以其他方式不需要螯合剂的其他可检测同位素包括3H、14C、32P、35S和36Cl。
也可施用可用于诊断程序的顺磁性离子。顺磁性离子的实例包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)或这些顺磁离子的组合。
荧光标记的实例包括但不限于有机染料(例如花青素、荧光素、罗丹明、AlexaFluors、Dylight fluors、ATTO染料、BODIPY染料等)、生物荧光团(例如绿色荧光蛋白(GFP)、R-藻红蛋白等)和量子点。
可以在本公开内容中使用的非限制性荧光化合物包括Cy5、Cy5.5(也称为Cy5++)、Cy2、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、藻红蛋白、Cy7、荧光素(FAM)、Cy3、Cy3.5(也称为Cy3++)、德克萨斯红、LightCycler-Red 640、LightCycler Red705、四甲基罗丹明(TMR)、罗丹明、罗丹明衍生物(ROX)、六氯荧光素(HEX)、罗丹明6G(R6G)、罗丹明衍生物JA133、Alexa荧光染料(例如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 555和Alexa Fluor 647)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶、AMCA、Spectrum Green、Spectrum Orange、Spectrum Aqua、丽丝胺(Lissamine)和荧光过渡金属络合物，例如铕。可以使用的荧光化合物还包括荧光蛋白，例如GFP(绿色荧光蛋白)、增强型GFP(EGFP)、蓝色荧光蛋白及衍生物(BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青色荧光蛋白及衍生物(CFP、ECFP、Cerulean、CyPet)和黄色荧光蛋白及衍生物(YFP、Citrine、Venus、YPet)。WO2008142571、WO2009056282、WO9922026。
酶标记的实例包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。
另一种公知的标记是生物素。生物素标记通常由生物素基、间隔臂和负责与蛋白质上靶官能团连接的反应基团构成。生物素可用于将标记的蛋白质与包含亲和素部分的其他部分连接。
(ii)黏合素-药物缀合物
在一些实施方案中，黏合素包含一个或更多个治疗剂，例如以形成黏合素-药物缀合物。如本文所用，术语“治疗剂”是指可用于治愈、减轻、治疗或预防人或其他动物中的疾病的物质。这样的治疗剂包括官方美国药典(official United States Pharmacopeia)、官方美国顺势疗法药典(official Homeopathic Pharmacopeia of the United States)、美国官方国家处方集(official National Formulary)或其任何增刊中公认的物质，并且包括但不限于小分子、核苷酸、寡肽、多肽等。可与含黏合素的多肽连接的治疗剂包括但不限于细胞毒性剂、抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、毒素、凋亡剂等，例如DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、长春花生物碱类(vincalkaloids)、紫杉烷类、埃博霉素、酶抑制剂、受体拮抗剂、治疗性抗体、酪氨酸激酶抑制剂、辐射增敏剂和化学治疗联合治疗，例如例证。
DNA烷基化剂的非限制性实例是氮芥，例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺(异环磷酰胺、曲磷胺(Trofosfamide))、苯丁酸氮芥(美法仑、泼尼莫司汀(Prednimustine))、苯达莫司汀、乌拉莫司汀和雌莫司汀；亚硝基脲，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(Lomustine)(司莫司汀(Semustine))、福莫司汀(Fotemustine)、尼莫司汀(Nimustine)、雷莫司汀(Ranimustine)和链脲霉素(Streptozocin)；烷基磺酸盐，例如白消安(甘露舒凡(Mannosulfan)、曲奥舒凡(Treosulfan))；氮丙啶，例如卡波醌(Carboquone)、噻替哌(ThioTEPA)、三亚胺醌(Triaziquone)、三乙撑蜜胺(Triethylenemelamine)；肼类(甲基苄肼(Procarbazine))；三氮烯类，例如达卡巴嗪(Dacarbazine)和替莫唑胺(Temozolomide)；六甲蜜胺(Altretamine)和二溴甘露醇(Mitobronitol)。
拓扑异构酶I抑制剂的非限制性实例包括喜树碱衍生物，包括CPT-11(伊立替康)、SN-38、APC、NPC、喜树碱、托扑替康、甲磺酸依喜替康(exatecan mesylate)、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、勒托替康(lurtotecan)、鲁比替康(rubitecan)、silatecan、吉马替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、依喜替康(extatecan)、BN-80927、DX-8951f和MAG-CPT，如在Pommier Y.(2006)Nat.Rev.Cancer 6(10)：789-802和美国专利公开No.200510250854中描述的；原小檗碱(Protoberberine)生物碱及其衍生物，包括小檗红碱(berberrubine)和甲氧檗因(coralyne)，如在Li et al.(2000)Biochemistry 39(24)：7107-7116和Gatto et al.(1996)Cancer Res.15(12)：2795-2800中描述的；菲咯啉衍生物，包括苯并[i]菲啶、两面针碱(Nitidine)和花椒宁碱(fagaronine)，如在Makhey et al.(2003)Bioorg.Med.Chem.11(8)：1809-1820中描述的；Terbenzimidazole及其衍生物，如在Xu(1998)Biochemistry 37(10)：3558-3566中描述的；以及蒽环类衍生物，包括多柔比星、柔红霉素和米托蒽醌，如在Foglesong et al.(1992)Cancer Chemother.Pharmacol.30(2)：123-]25，Crow et al.(1994)J.Med.Chem.37(19)：31913194，和Crespi et al.(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.136(2)：521-8中描述的。拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于依托泊苷和替尼泊苷。双重拓扑异构酶I和II抑制剂包括但不限于沙托品(Saintopin)和其他萘并萘二酮(Naphthecenedione)、DACA和其他吖啶-4-羧酰胺、茚托利辛(Intoplicine)和其他苯并吡啶并吲哚、TAS-I03和其他7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮、吡唑啉吖啶、XR 11576和其他苯并吩嗪、XR 5944和其他二聚化合物、7-氧代-7H-二苯并[f，ij]异喹啉和7-氧代-7H-苯并[e]咱啶和蒽基-氨基酸缀合物，如在Denny and Baguley(2003)Curr.Top.Med.Chem.3(3)：339-353中描述的。一些药剂抑制拓扑异构酶II并且具有DNA插入活性，例如但不限于蒽环类(阿柔比星(Aclarubicin)、柔红霉素、多柔比星、表柔比星(Epirubicin)、伊达比星(Idarubicin)、氨柔比星(Amrubicin)、吡柔比星(Pirarubicin)、戊柔比星(Valrubicin)、佐柔比星(Zorubicin))和蒽二酮类(米托蒽醌和匹杉琼(Pixantrone))。
内质网应激诱导剂的实例包括但不限于二甲基塞来昔布(DMC)、奈非那韦(nelfinavir)、塞来昔布(celecoxib)和硼放射增敏剂(即硼替佐米(Bortezomib))。
基于铂的化合物的非限制性实例包括卡铂、顺铂、奈达铂(Nedaplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、四硝酸三铂(Triplatin tetranitrate)、赛特铂(Satraplatin)、阿罗铂(Aroplatin)、洛铂(Lobaplatin)和JM-216。(参见McKeage et al.(1997)J.Clin.Oncol.201：1232-1237以及一般地CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM，CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES，in the Series Basic and ClinicalOncology，Angioli et al.Eds.，2004)。
抗代谢物药剂的非限制性实例包括基于叶酸的，即二氢叶酸还原酶抑制剂，例如氨基蝶呤、甲氨蝶呤和培美曲塞；胸苷酸合酶抑制剂，例如雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞(Pemetrexed)；基于嘌呤的，即腺苷脱氨酶抑制剂，例如喷司他丁(Pentostatin)，硫代嘌呤，例如硫鸟嘌呤和巯基嘌呤，卤代/核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨，或鸟嘌呤/鸟苷：硫代嘌呤，例如硫鸟嘌呤；或基于嘧啶的，即胞嘧啶/胞苷：低甲基化剂(hypomethylating agent)，例如阿扎胞苷和地西他滨，DNA聚合酶抑制剂，例如阿糖胞苷，核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如吉西他滨，或胸腺嘧啶/胸腺嘧啶核苷：胸苷酸合酶抑制剂，例如氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU的等同物包括其前药、类似物和衍生物，例如5′-脱氧-5-氟尿苷(doxifluoroidine)、1-四氢呋喃基-5-氟尿嘧啶(fforafur)、卡培他滨(Xeloda)、SI(MBMS-247616，由替加氟和两种调节剂5-氯-2，4-二羟基吡啶和草酸钾(potassiumoxonate)组成)、雷替曲塞(tomudex)、诺拉曲特(no latrexed)(Thymitaq，AG337)、LY231514和ZD9331，如在Papamicheal(1999)The Oncologist 4：478-487中描述的。
长春花生物碱的实例包括但不限于长春碱、长春新碱、长春氟宁、长春地辛和长春瑞滨。
紫杉烷类的实例包括但不限于多西他赛(docetaxel)、拉洛他赛(Larotaxel)、奥他赛(Ortataxel)、紫杉醇和Tesetaxel。埃博霉素的一个实例是iabepilone。
酶抑制剂的实例包括但不限于法尼基转移酶抑制剂(Tipifamib)；CDK抑制剂(Alvocidib、Seliciclib)；蛋白酶体抑制剂(硼替佐米(Bortezomib))；磷酸二酯酶抑制剂(阿那格雷(Anagrelide)；咯利普兰(rolipram))；IMP脱氢酶抑制剂(噻唑呋林(Tiazofurine))；和脂氧合酶抑制剂(马索罗酚(Masoprocol))。受体拮抗剂的实例包括但不限于ERA(阿曲生坦(Atrasentan))；类视黄醇X受体(贝沙罗汀(Bexarotene))；和性类固醇(睾丸内酯)。
治疗性抗体的实例包括但不限于抗HER1/EGFR(西妥昔单抗、帕尼单抗)；抗HER2/neu(erbB2)受体(曲妥珠单抗)；抗EpCAM(卡妥索单抗(Catumaxomab)、依决洛单抗(Edrecolomab))；抗VEGF-A(贝伐单抗)；抗CD20(利妥昔单抗、托西莫单抗(Tositumomab)、替伊莫单抗(Ibritumomab))；抗CD52(阿仑单抗(Alemtuzumab)；和抗CD33(吉妥珠单抗(Gemtuzumab))。美国专利NO：5,776,427和7,601,355。
酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于针对以下的抑制剂：ErbB：HER1/EGFR(厄洛替尼(Erlotinib)、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、舒尼替尼、来那替尼(Neratinib))；HER2/neu(拉帕替尼、来那替尼)；RTK III类：C-kit(阿昔替尼、舒尼替尼、索拉非尼)、FLT3(来他替尼(Lestaurtinib))、PDGFR(阿昔替尼、舒尼替尼、索拉非尼)；和VEGFR(凡德他尼、司马沙尼(Semaxanib)、西地尼布(Cediranib)、阿昔替尼、索拉非尼)；bcr-abl(伊马替尼、尼洛替尼(Nilotinib)、达沙替尼)；Src(博舒替尼(Bosutinib))和Janus激酶2(来他替尼)。
可以连接到本发明的含黏合素的多肽的化学治疗剂还可以包括安吖啶(amsacrine)、曲贝替定(Trabectedin)、类视黄醇(阿利维A酸(Alitretinoin)、维A酸(Tretinoin))、三氧化二砷、天冬酰胺耗竭剂天冬酰胺酶/培门冬酶(Pegaspargase)、塞来昔布、秋水仙胺(Demecolcine)、伊利司莫(Elesclomol)、依沙芦星(Elsamitrucin)、依托格鲁(Etoglucid)、氯尼达明(Lonidamine)、硫蒽酮(Lucanthone)、米托胍腙(Mitoguazone)、米托坦(Mitotane)、奥利默森(Oblimersen)、替西罗莫司(Temsirolimus)和伏立诺他(Vorinostat)。
可以与本公开内容的含黏合素的多肽连接、结合或缔合的特定治疗剂的实例是氟氧头孢(flomoxef)；福提米星(fortimicin(s))；庆大霉素；葡氨苯砜苯丙砜(glucosulfonesolasulfone)；短杆菌肽S；短杆菌肽；格帕沙星(grepafloxacin)；胍甲四环素(guamecycline)；海他西林(hetacillin)；异帕米星(isepamicin)；交沙霉素(josamycin)；卡那霉素；氟氧头孢；福提米星；庆大霉素；葡氨苯砜苯丙砜；短杆菌肽S；短杆菌肽；格帕沙星；胍甲四环素；海他西林；异帕米星；交沙霉素；卡那霉素；杆菌肽；班贝霉素；比阿培南(biapenem)；溴莫普林(brodimoprim)；丁苷菌素(butirosin)；卷曲霉素(capreomycin)；羧苄青霉素(carbenicillin)；卡波霉素(carbomycin)；卡芦莫南(carumonam)；头孢羟氨苄(cefadroxil)；头孢孟多(cefamandole)；头孢曲嗪(cefatrizine)；头孢拉宗(cefbuperazone)；头孢克定(cefclidin)；头孢地尼(cefdinir)；头孢托仑(cefditoren)；头孢吡肟(cefepime)；头孢他美(cefetamet)；头孢克肟(cefixime)；头孢甲肟(cefinenoxime)；cefininox；克拉屈滨(cladribine)；阿帕西林(apalcillin)；阿哌环素(apicycline)；安普霉素(apramycin)；阿贝卡星(arbekacin)；阿扑西林(aspoxicillin)；叠氮氯霉素(azidamfenicol)；氨曲南(aztreonam)；头孢地嗪(cefodizime)；头孢尼西(cefonicid)；头孢哌酮(cefoperazone)；头孢雷特(ceforamide)；头孢噻肟(cefotaxime)；头孢替坦(cefotetan)；头孢替安(cefotiam)；头孢唑兰(cefozopran)；头孢咪唑(cefpimizole)；头孢匹胺(cefpiramide)；头孢匹罗(cefpirome)；头孢丙烯(cefprozil)；头孢沙定(cefroxadine)；头孢特仑(cefteram)；头孢布烯(ceftibuten)；头孢唑南(cefuzonam)；头孢氨苄(cephalexin)；头孢甘氨(cephaloglycin)；头孢菌素C(cephalosporin C)；头孢拉定(cephradine)；氯霉素(chloramphenicol)；金霉素(chlortetracycline)；克林沙星(clinafloxacin)；克林霉素(clindamycin)；氯莫环素(clomocycline)；黏菌素(colistin)；环己西林(cyclacillin)；氨苯砜(dapsone)；地美环素(demeclocycline)；地百里砜(diathymosulfone)；地贝卡星(dibekacin)；二氢链霉素(dihydrostreptomycin)；6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)；硫鸟嘌呤(thioguanine)；卡培他滨(capecitabine)；多西他赛(docetaxel)；依托泊苷(etoposide)；吉西他滨(gemcitabine)；拓扑替康(topotecan)；长春瑞滨(vinorelbine)；长春新碱(vincristine)；长春碱(vinblastine)；替尼泊苷(teniposide)；美法仑(melphalan)；甲氨蝶呤(methotrexate)；2-对-磺胺酰基苯胺基乙醇(2-p-sulfanilyanilinoethanol)；4，4′-亚磺酰基二苯胺(4，4′-sulfinyldianiline)；4-磺酰胺基水杨酸(4-sulfanilamidosalicylic acid)；布托啡诺(butorphanol)；纳布啡(nalbuphine).链脲霉素(streptozocin)；多柔比星(doxorubicin)；柔红霉素(daunorubicin)；普卡霉素(plicamycin)；伊达比星(idarubicin)；丝裂霉素C(mitomycin C)；喷司他丁(pentostatin)；米托蒽醌(mitoxantrone)；阿糖胞苷(cytarabine)；磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)；布托啡诺(butorphanol)；纳布啡.链脲霉素；多柔比星；柔红霉素；普卡霉素；伊达比星；丝裂霉素C；喷司他丁；米托蒽醌；阿糖胞苷；磷酸氟达拉滨；醋地砜(acediasulfone)；乙酰砜(acetosulfone)；阿米卡星(amikacin)；两性霉素B(amphotericin B)；氨苄青霉素(ampicillin)；阿托伐他汀(atorvastatin)；依那普利(enalapril)；雷尼替丁(ranitidine)；环丙沙星(ciprofloxacin)；普伐他汀(pravastatin)；克拉霉素(clarithromycin)；环孢菌素(cyclosporin)；法莫替丁(famotidine)；亮丙瑞林(leuprolide)；阿昔洛韦(acyclovir)；紫杉醇(paclitaxel)；阿奇霉素(azithromycin)；拉米夫定(lamivudine)；布地奈德(budesonide)；沙丁胺醇(albuterol)；茚地那韦(indinavir)；二甲双胍(metformin)；阿仑膦酸钠(alendronate)；尼扎替丁(nizatidine)；齐多夫定(zidovudine)；卡铂；美托洛尔(metoprolol)；阿莫西林(amoxicillin)；双氯芬酸(diclofenac)；赖诺普利(lisinopril)；头孢曲松(ceftriaxone)；卡托普利(captopril)；沙美特罗(salmeterol)；昔萘酸盐(xinafoate)；亚胺培南(imipenem)；西司他丁(cilastatin)；贝那普利(benazepril)；头孢克洛(cefaclor)；头孢他啶(ceftazidime)；吗啡；多巴胺；比拉米可(bialamicol)；氟伐他汀(fluvastatin)；非那米丁(phenamidine)；鬼臼酸2-乙基肼(podophyllinic acid 2-ethylhydrazine)；吖啶黄(acriflavine)；氯脒佐定(chloroazodin)；胂凡纳明(arsphenamine)；双脒苯脲(amicarbilide)；氨喹脲(aminoquinuride)；奎那普利(quinapril)；羟吗啡酮(oxymorphone)；丁丙诺啡(buprenorphine)；氟尿苷(floxuridine)；地红霉素(dirithromycin)；强力霉素(doxycycline)；依诺沙星(enoxacin)；恩维霉素(enviomycin)；依匹西林(epicillin)；红霉素(erythromycin)；柱晶白霉素(leucomycin(s))；林可霉素(lincomycin)；洛美沙星(lomefloxacin)；光明霉素(lucensomycin)；赖甲环素(lymecycline)；甲氯环素(meclocycline)；美罗培南(meropenem)；甲烯土霉素(methacycline)；小诺霉素(micronomicin)；麦迪霉素(midecamycin(s))；米诺环素(minocycline)；拉氧头孢(moxalactam)；莫匹罗星(mupirocin)；那氟沙星(nadifloxacin)；纳他霉素(natamycin)；新霉素(neomycin)；奈替米星(netilmicin)；诺氟沙星(norfloxacin)；夹竹桃霉素(oleandomycin)；土霉素(oxytetracycline)；对-磺胺酰基苄胺(p-sulfanilylbenzylamine)；帕尼培南(panipenem)；巴龙霉素(paromomycin)；帕珠沙星(pazufloxacin)；青霉素N(penicillinN)；匹哌环素(pipacycline)；吡哌酸(pipemidic acid)；多黏菌素(polymyxin)；普利霉素(primycin)；奎那西林(quinacillin)；核糖霉素(ribostamycin)；利福酰胺(rifamide)；利福平(rifampin)；利福霉素SV(rifamycin SV)；利福喷丁(rifapentine)；利福昔明(rifaximin)；瑞斯托霉素(ristocetin)；利替培南(ritipenem)；罗他霉素(rokitamycin)；氢吡四环素(rolitetracycline)；罗沙米星(rosaramycin)；罗红霉素(roxithromycin)；柳氮磺嘧啶(salazosulfadimidine)；山环素(sancycline)；西索米星(sisomicin)；司帕沙星(sparfloxacin)；壮观霉素(spectinomycin)；螺旋霉素(spiramycin)；链霉素(streptomycin)；琥珀氨苯砜(succisulfone)；磺胺柯定(sulfachrysoidine)；磺胺洛西酸(sulfaloxic acid)；磺胺米柯定(sulfamidochrysoidine)；对氨基苯磺酸(sulfanilicacid)；阿地砜(sulfoxone)；替考拉宁(teicoplanin)；替马沙星(temafloxacin)；替莫西林(temocillin)；四氧普林(tetroxoprim)；甲砜霉素(thiamphenicol)；噻唑砜(thiazolsulfone)；硫链丝菌素(thiostrepton)；替卡西林(ticarcillin)；替吉莫南(tigemonam)；妥布霉素(tobramycin)；托氟沙星(tosufloxacin)；甲氧苄啶(trimethoprim)；丙大观霉素(trospectomycin)；曲伐沙星(trovafloxacin)；结核放线菌素(tuberactinomycin)；万古霉素(vancomycin)；重氮丝氨酸(azaserine)；杀念珠菌素(candicidin(s))；氯苯甘油醚(chlorphenesin)；制皮菌素(dermostatin(s))；菲律宾菌素(filipin)；制霉色基素(fungichromin)；美帕曲星(mepartricin)；制霉菌素(nystatin)；寡霉素(oligomycin(s))；培里霉素A(perimycinA)；杀结核菌素(tubercidin)；6-氮杂尿苷(6-azauridine)；6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸；阿克拉霉素(aclacinomycin(s))；安西他滨(ancitabine)；氨茴霉素(anthramycin)；阿扎胞苷(azacitadine)；重氮丝氨酸；博来霉素(bleomycin(s))；双香豆乙酸乙酯(ethyl biscoumacetate)；乙叉双香豆素(ethylidenedicoumarol)；伊洛前列素(iloprost)；拉米非班(lamifiban)；他前列烯(taprostene)；噻氯香豆素(tioclomarol)；替罗非班(tirofiban)；氨普立糖(amiprilose)；布西拉明(bucillamine)；胍立莫司(gusperimus)；龙胆酸(gentisic acid)；葡美辛(glucamethacin)；水杨酸乙二醇酯(glycol salicylate)；甲氯芬那酸(meclofenamicacid)；甲芬那酸(mefenamic acid)；美沙拉嗪(mesalamine)；尼氟灭酸(niflumic acid)；奥沙拉嗪(olsalazine)；奥沙西罗(oxaceprol)；S-腺苷甲硫氨酸(S-enosylmethionine)；水杨酸；双水杨酸酯(salsalate)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；托芬那酸(tolfenamicacid)；卡柔比星(carubicin)；嗜癌霉素A(carzinophillin A)；氯脲菌素(chlorozotocin)；色霉素(chromomycin(s))；二甲叶酸(denopterin)；去氧氟尿苷(doxifluridine)；依达曲沙(edatrexate)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；甲基羟基玫瑰树碱(elliptinium)；依诺他滨(enocitabine)；表柔比星(epirubicin)；甘露醇氮芥(mannomustine)；美诺立尔(menogaril)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；莫哌达醇(mopidamol)；霉酚酸(mycophenolic acid)；诺加霉素(nogalamycin)；橄榄霉素(olivomycin(s))；培洛霉素(peplomycin)；吡柔比星(pirarubicin)；吡曲克辛(piritrexim)；泼尼莫司汀(prednimustine)；甲基苄肼；蝶罗呤(pteropterin)；嘌呤霉素(puromycin)；雷莫司汀(ranimustine)；链黑霉素(streptonigrin)；硫咪嘌呤(thiamiprine)；霉酚酸(mycophenolic acid)；丙考达唑(procodazole)；罗莫肽(romurtide)；雷帕霉素(sirolimus(rapamycin))；他克莫司(tacrolimus)；丁胺卡因(butethamine)；非那可明(fenalcomine)；羟丁卡因(hydroxytetracaine)；纳依卡因(naepaine)；俄妥卡因(orthocaine)；哌啶卡因(piridocaine)；水杨醇(salicyl alcohol)；3-氨基-4-羟基丁酸；醋氯芬酸(aceclofenac)；阿米洛芬(alminoprofen)；氨芬酸(amfenac)；溴芬酸(bromfenac)；溴水杨醇(bromosaligenin)；丁丙二苯肼(bumadizon)；卡洛芬(carprofen)；双氯芬酸(diclofenac)；二氟尼柳(diflunisal)；地他唑(ditazol)；因法来酸(enfenamic acid)；依托度酸(etodolac)；依托芬那酯(etofenamate)；芬度柳(fendosal)；非普地醇(fepradinol)；氟芬那酸(flufenamic acid)；雷替曲塞(Tomudex)(N-[[5-[[(1，4-二氢-2-甲基-4-氧代-6-喹唑啉基)甲基]甲基氨基]-2-噻吩基]羰基]-L-谷氨酸)、三甲曲沙(trimetrexate)、杀结核菌素、乌苯美司、长春地辛、佐柔比星)；阿加曲班(argatroban)；库美香豆素(coumetarol)或双香豆素(dicoumarol)。
在一些实施方案中，黏合素剂包含缀合的细胞毒性因子，例如白喉毒素、铜绿假单胞菌外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-sarcin、油桐(Aleurites fordii)蛋白质和化合物(例如脂肪酸)、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytoiaccaamericana)蛋白质PAPI、PAPII和PAP-S、苦瓜抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制因子、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素。
可以使用本领域已知的用于与抗体和其他蛋白质缀合的任何方法来产生本公开内容的缀合物，包括由以下描述的方法：Hunter，et al.，(1962)Nature 144：945；David，etal.，(1974)Biochemistry 13：1014；Pain，et al.，(1981)J.Immunol.Meth.40：219；以及Nygren，J.，(1982)Histochem.and Cytochem.30：407。用于将肽、多肽以及有机和无机部分与抗体和其他蛋白质缀合的方法是常规的，并且在本领域中是公知的，并且容易适用于产生那些形式的本发明黏合素剂。
当缀合的部分是肽或多肽时，该部分可以与含黏合素的多肽化学交联，或者可以作为具有含黏合素的多肽的融合蛋白的一部分被包含。并且举例说明性实例是白喉毒素-黏合素融合蛋白。在非肽实体的情况下，通常通过与含黏合素的多肽化学缀合的方式(例如通过氨基酸侧链上的官能团或多肽的C末端的羧基或N末端的氨基)添加至含黏合素的多肽。在一些实施方案中，无论是作为融合蛋白还是化学交联的部分，缀合的部分将包含一个或更多个可以被酶切割或以其他方式对环境条件(例如pH)敏感的位点，其允许缀合的部分从含黏合素的多肽释放，例如在肿瘤或其他患病组织中(或如果缀合的部分充当保护健康组织的作用，则在待保护的组织中)。
IV.表达方法和系统
本文中所述的重组黏合素剂蛋白质可通过本领域已知的任何合适方法来产生。这样的方法的范围从直接的蛋白质合成方法到构建编码多肽序列的DNA序列并在合适的宿主中表达那些序列。对于包含进一步修饰(例如化学修饰或缀合)的那些重组黏合素剂蛋白质，可在从宿主细胞分离或化学合成之后对重组黏合素剂蛋白质进行进一步的化学或酶促操作。
本公开内容包括用于重组表达本公开内容的重组黏合素剂蛋白质的重组方法和核酸，其包括(i)将编码所述黏合素剂的氨基酸序列的多核苷酸引入到宿主细胞中，例如，其中所述多核苷酸处于载体中和/或与启动子可操作地连接；(ii)在有利于多核苷酸表达的条件下培养宿主细胞(例如，真核或原核)，以及(iii)任选地，从宿主细胞和/或其中培养宿主细胞的培养基中分离黏合素剂。参见例如，WO 04/041862、WO 2006/122786、WO 2008/020079、WO 2008/142164或WO 2009/068627。
在一些实施方案中，可使用寡核苷酸合成仪通过化学合成来构建编码目的重组黏合素剂蛋白质的DNA序列。可基于期望多肽的氨基酸序列设计寡核苷酸，并选择在其中产生目的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。可应用标准方法来合成编码分离的目的多肽的多核昔酸序列。例如，可使用完整的氨基酸序列来构建反翻译(back-translated)基因。此外，可合成包含编码特定的分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可合成编码期望多肽的部分的数个小寡核苷酸，并随后将其连接。单独的寡核苷酸通常包含5′或3′突出端以用于互补组装。
一旦获得了编码本公开内容的重组黏合素剂蛋白质的核酸序列，就可使用本领域公知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生重组黏合素剂蛋白质的载体。可使用本领域技术人员公知的方法来构建包含重组黏合素剂编码序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。(参见例如以下中描述的技术：Sambrook et al，1990，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，2dEd.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.以及Ausubel etal.eds.，1998，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，NY)。
可通过常规技术(例如电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含重组黏合素剂蛋白质的核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞，并随后通过常规技术培养经转染细胞以产生本公开内容的重组黏合素剂蛋白质。在一些具体实施方案中，重组黏合素剂蛋白质的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
表达载体可包含复制起点，例如可基于用于表达的宿主细胞的类型选择。举例来说，来自质粒pBR322(产品编号303-3s，New England Biolabs，Beverly，Mass.)的复制起点可用于大多数革兰氏阴性细菌，而来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitus virus，VSV)或乳头瘤病毒(例如HPV或BPV)的多种起点可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常来说，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(例如，经常使用SV40起点，因为其包含早期启动子)。
载体可包含一个或更多个选择标记基因，例如，编码对于在选择培养基中培养的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质的遗传元件。典型的选择标记基因编码这样的蛋白质，其(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄青霉素、四环素或用于原核宿主细胞的卡那霉素)产生抗性，(b)补充细胞的营养缺陷型缺陷；或(c)提供无法从复合培养基获得的关键营养物。优选的选择标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。新霉素抗性基因也可用于在原核和真核宿主细胞中进行选择。其他选择基因可用于扩增将要表达的基因。扩增是这样的过程，其中对于产生对生长至关重要的蛋白质需求更大的基因在连续世代的重组细胞的染色体内串联重复。用于哺乳动物细胞的选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和胸苷激酶。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中仅转化体凭借载体中存在的标记独特地适应存活。通过在连续改变培养基中选择剂浓度的条件下培养转化的细胞来施加选择压力，从而导致选择基因和编码重组黏合素剂蛋白质的DNA二者扩增。结果，从扩增的DNA中合成了提高数量的重组黏合素剂蛋白质。
载体还可包含一个或更多个核糖体结合位点，其将被转录到包含重组黏合素剂蛋白质的编码序列的mRNA中。例如，这样的位点的特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件通常位于启动子的3′和待表达多肽的编码序列的5′。Shine-Dalgarno序列是变化的，但通常是多嘌呤(具有高A-G含量)。已经鉴定了许多Shine-Dalgarno序列，其各自可使用上述方法容易地合成并且用于原核载体。
表达载体通常包含启动子，所述启动子被宿主生物体识别并且与编码重组黏合素剂蛋白质的核酸分子可操作地连接。根据用于表达的宿主细胞和期望的产量，可使用天然或异源启动子。
与原核宿主一起使用的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统；碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统；以及杂合启动子，例如tac启动子。其他已知的细菌启动子也是合适的。其序列已经公开，并且可根据需要使用接头或衔接子将其与期望的核酸序列连接以提供限制性位点。
与酵母宿主一起使用的启动子也是本领域已知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子是公知的，并且包括从病毒基因组获得的那些，所述病毒为例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，并且最优选猿猴病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可用于表达本公开内容的选择性结合剂的另外的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon，Nature，290：304-310，1981)；CMV启动子；包含在劳斯肉瘤病毒的3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto et al.(1980)，Cell 22：787-97)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner et al.(1981)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-5)；金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al，Nature，296；39-42，1982)；原核表达载体，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75；3727-373l，1978)；或tac启动子(DeBoer，et al.(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-5)。还感兴趣的是表现出组织特异性并且已在转基因动物中使用的以下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift et al.(1984)，Cell 38：639-46；Ornitz et al.(1986)，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald(1987)，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan(1985)，Nature 315：115-22)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl et al.(1984)，Cell 38；647-58；Adames et al.(1985)，Nature 318；533-8；Alexander et al.(1987)，Mol.Cell.Biol.7：1436-44)；在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder et al.(1986)，Cell 45：485-95)；在肝中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert et al.(1987)，Genes and Devel.1：268-76)；在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf et al.(1985)，MoI.Cell.Biol.5：1639-48；Hammer et al.(1987)，Science，235：53-8)；在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey et al.(1987)，Genes and Devel.1：161-71)；在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram et al.，Nature，315338-340，1985；Kollias et al.(1986)，Cell 46：89-94)；在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead et al.(1987)，Cell，48：703-12)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani(1985)，Nature，314：283-6)；以及在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason et al.(1986)，Science 234：1372-8)。
可将增强子序列插入到载体中以提高在真核宿主细胞中的转录。可从哺乳动物基因获得的数种增强子序列是已知的(例如，球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示例性增强元件。
尽管增强子可在多肽编码区的5′或3′位置处剪接到载体中，但其通常位于启动子的5′位点。
用于表达核酸的载体包括与细菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞相容的那些。这样的载体尤其包括pCRII、pCR3、以及pcDNA3.1(Invitrogen Company，San Diego，Calif.)、pBSII(Stratagene Company，La Jolla，Calif.)、pET15(Novagen，Madison，Wis.)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，Calif.)、pETL(BlueBacII；Invitrogen)、pDSR-alpha(PCT公布No.WO90/14363)和pFastBacDual(Gibco/BRL，Grand Island，N.Y.)。
另外可能的载体包括但不限于黏粒、质粒或经修饰病毒，但载体系统必须与所选宿主细胞相容。这样的载体包括但不限于质粒例如
Figure BPA0000294876740000931
质粒衍生物(高拷贝数的基于ColE1的噬菌粒，Stratagene Cloning Systems Inc.，La Jolla Calif.)、设计成用于克隆Taq扩增的PCR产物的PCR克隆质粒(例如，TOPOTM.TA
Figure BPA0000294876740000932
Kit，PCR2.1质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，Calif.)，以及哺乳动物、酵母或病毒载体例如杆状病毒表达系统(pBacPAK质粒衍生物，Clontech，Palo Alto，Calif.)。可通过转化、转染、感染、电穿孔或其他已知技术将重组分子引入到宿主细胞中。
真核和原核宿主细胞，包括作为用于表达本文中公开的重组黏合素剂蛋白质的宿主的哺乳动物细胞是本领域公知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得的永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(babyhamster kidney，BHK)细胞、猴肾细胞(monkey kidney cell，COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichiatrehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、有抱毕赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母属(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、白念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusariumgramineum)、镶片镰孢霉(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉胞霉(Neurospora crassa.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、任何酵母属、多形汉逊酵母、任何克鲁维酵母属、白念珠菌、任何曲霉属、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、任何镰刀菌属、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脉胞霉。
可利用多种宿主表达载体系统来表达本公开内容的重组黏合素剂蛋白质。这样的宿主表达系统代表可通过其产生并随后纯化重组黏合素剂蛋白质的编码序列的载剂，但是也代表了当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本公开内容的重组黏合素剂蛋白质的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用包含黏合素剂蛋白质编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用包含黏合素剂蛋白质编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces pichia))；用包含黏合素剂蛋白质编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CμMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染或用包含黏合素剂蛋白质编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者具有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、293T、3T3细胞、淋巴细胞(参见美国专利No.5,807,715)、Per C.6细胞(由Crucell开发的大鼠视网膜细胞))，所述重组表达构建体包含来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。
在细菌系统中，可根据表达的重组黏合素剂蛋白质的预期用途来有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这样的蛋白质时，为了产生重组黏合素剂蛋白质的药物组合物，可期望指导易于纯化的高水平融合蛋白产物的表达的载体。这样的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.(1983)″Easy Identification Of cDNAClones，″EMBO J.2：1791-1794)，其中黏合素剂蛋白质编码序列可与lac z编码区框内单独连接到载体中以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye et al.(1985)″Up-PromoterMutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli，″Nucleic Acids Res.13：3101-3110；Van Heeke et al.(1989)″Expression Of Human Asparagine Synthetase InEscherichia coli，″J.Biol.Chem.24：5503-5509)；等。pGEX载体也可用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)的融合蛋白。一般来说，这样的融合蛋白是可溶的，并且可通过吸附并结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠随后在存在游离谷胱甘肽的情况下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体被设计成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得可从GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)被用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。黏合素剂蛋白质编码序列可单独克隆到病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可将目的黏合素剂蛋白质编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物(例如，晚期启动子和三联体前导序列)连接。然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入在病毒基因组的非必需区(例如，区E1或E3)将产生活的并且能够在被感染的宿主中表达免疫球蛋白分子的重组病毒(参见，例如，参见Logan et al.(1984)″Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs LateAfter Infection，″Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)81：3655-3659)。为了有效翻译插入的黏合素剂蛋白质编码序列，可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框同相(in phase)以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有多种来源，包含天然和合成二者。可通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高表达的效率(参见Bitter etal.(1987)″Expression And Secretion Vectors For Yeast，″Methods in Enzymol.153：516-544)。
另外，可选择调节插入序列的表达或者以期望的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这样的修饰(例如，糖基化)和加下(例如，切割)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特定机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外来蛋白质的正确修饰和加工。为此，可使用具有用于适当加工基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、CRL7030和Hs578Bst。
为了长期高产量地产生重组蛋白质，考虑了稳定表达。例如，可对稳定表达本公开内容的抗体的细胞系进行改造。可使用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和选择标记控制的DNA转化宿主细胞，而不是使用包含病毒复制起点的表达载体。引入外来DNA之后，可使经改造细胞在富集培养基中生长1至2天，并随后转换至选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长以形成灶(foci)，其进而可被克隆并扩增到细胞系中。该方法可有利地用于改造表达本公开内容的重组黏合素剂蛋白质的细胞系。这样的经改造细胞系可特别地用于筛选和评价与重组黏合素剂蛋白质直接或间接相互作用的化合物。
可使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.(1977)″Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To CulturedMouse Cells，″Cell 11：223-232)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska etal.(1962)″Genetics Of Human Cess Line.IV.DNA-Mediated HeritableTransformation Of A Biochemical Trait，″Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)48：2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.(1980)″Isolation Of TransformingDNA：Cloning The Hamster Aprt Gene，″Cell 22：817-823)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。另外，抗代谢物抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler et al.(1980)″Transformation Of Mammalian Cells With An AmplfiableDominant-Acting Gene，″Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77：3567-3570；O′Hare et al.(1981)″Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By ARecombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase，″Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78：1527-1531)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan etal.(1981)″Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli GeneCoding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase，″Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78：2072-2076)；Neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Tachibana et al.(1991)″Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma CellsTransfected By pSV.2-Neo Gene，″Cytotechnology 6(3)：219-226；Tolstoshev(1993)″Gene Therapy，Concepts，Current Trials And Future Directions，″Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)″The Basic Science Of GeneTherapy，″Science 260：926-932；以及Morgan et al.(1993)″Human gene therapy，″Ann.Rev.Biochem.62：191-217)。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel et al.(eds.)，1993，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，NY；Kriegler，1990，GENE TRANSFER AND EXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY；以及在第12和13章，Dracopoli et al.(eds)，1994，CURRENTPROTOCOLS IN HUMAN GENETICS，John Wiley&Sons，NY.；Colbere-Garapin et al.(1981)″A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells，″J.Mol.Biol.150：1-14中；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre et al.(1984)″Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance AsDominant-Selection Markers In Mouse L Cells，″Gene 30：147-156)。
可通过载体扩增来提高重组黏合素剂蛋白质的表达水平(有关综述，参见Bebbington and Hentschel，″The Use Of Vectors Based On Gene Amplification ForThe Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells，″in DNA CLONING，Vol.3.(Academic Press，New York，1987))。当表达重组黏合素剂蛋白质的载体系统中的标记是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的提高将提高标记基因的拷贝数。由于扩增区域与重组黏合素剂蛋白质的核苷酸序列相关，因此重组黏合素剂蛋白质的产生也将提高(Crouse et al.(1983)″Expression And Amplification Of Engineered MouseDihydrofolate Reductase Minigenes，″Mol.Cell.Biol.3：257-266)。
当黏合素剂是黏合素抗体融合体或其他多蛋白复合物时，可用两种表达载体共转染宿主细胞，所述两种表达载体例如第一种载体编码重链和第二种载体编码轻链来源的多肽，其中一种或两种包含黏合素多肽编码序列。两种载体可包含相同的选择标记，其能够使重链和轻链多肽相等表达。或者，可使用编码重链和轻链多肽二者的单载体。在这样的情况下，应将轻链放置在重链之前，以避免过量的毒性游离重链(Proudfoot(1986)″ExpressionAnd Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes，″Nature 322：562-565；Kohler(1980)″Immunoglobulin Chain Loss In HybridomaLines，″Proc.Nat1.Acad.Sci.(U.S.A.)77：2197-2199)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一般来说，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有在该细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白特征性的糖基化模式。因此，重组黏合素剂蛋白质的特定糖基化模式将取决于用于产生该蛋白质的特定细胞系或转基因动物。在黏合素/抗体融合体的一些实施方案中，包含仅非岩藻糖基化N-聚糖的糖基化模式可能是有利的，因为在抗体的情况下，已在体外和体内两种情况下显示出这通常表现出比岩藻糖基化对应物更强效的效力(参见例如，Shinkawa et al.，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美国专利No：6,946,292和7,214,775)。
此外，可使用多种已知技术增强来自生产细胞系的黏合素剂的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。结合欧洲专利No：0216846、0256055和0323997以及欧洲专利申请No.89303964.4，整体或部分地讨论了GS系统。因此，在本公开内容的一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞(例如，CHO)缺乏谷氨酰胺合成酶基因并且在培养基中在没有谷氨酰胺的情况下培养，然而其中编码免疫球蛋白链的多核苷酸包含谷氨酰胺合成酶基因，其补充了宿主细胞中基因的缺乏。包含本文中讨论的结合剂或多核苷酸或载体的这样的宿主细胞以及用于使用这样的宿主细胞制备结合剂的本文中讨论的表达方法是本公开内容的一部分。
重组蛋白质在昆虫细胞培养系统(例如，杆状病毒)中的表达也提供了用于产生正确折叠和具有生物学功能的蛋白质的稳健方法。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统是本领域技术人员公知的。
可根据任何合适的方法对由转化的宿主产生的重组黏合素剂蛋白质进行纯化。标准方法包括色谱(例如，离子交换色谱、亲和色谱和尺寸柱色谱)、离心、差异溶解度，或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。可将亲和标签例如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外壳序列(influenza coat sequence)和谷胱甘肽-S-转移酶与蛋白质连接以使得能够通过穿过合适的亲和柱容易地纯化。分离的蛋白质还可使用如蛋白酶解、质谱(MS)、核磁共振(NMR)、高效液相色谱(HPLC)和X射线晶体学这样的技术进行物理表征。
在一些实施方案中，可例如通过初始从细胞沉淀物提取，随后进行一个或更多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤分离细菌培养物中产生的重组黏合素剂蛋白质。HPLC可用于最终的纯化步骤。可通过任何方便的方法(包括冻融循环、声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂)破坏用于表达重组蛋白质的微生物细胞。
V.用于体内递送的编码的黏合素
递送治疗性黏合素剂蛋白质(例如，PD-L1黏合素剂)的替代方法是将治疗性多肽的产生留给身体自身。大量的临床研究已经举例说明了使用多种不同的递送系统将体内基因转移到细胞中的效用。体内基因转移的目的是向患者施用编码的黏合素核苷酸序列，而不是黏合素剂。这允许患者的身体在延长的时间段产生目的治疗性黏合素剂，并根据产生部位全身或局部分泌。基于基因的编码的黏合素可为多肽形式的黏合素剂的常规生产、纯化和施用提供具有劳动和成本效益的替代物。已经在体内寻求了可适于递送编码的黏合素的许多抗体表达平台：这些包括病毒载体、裸DNA和RNA。编码的黏合素基因转移不仅可通过降低商品和生产的成本来节省成本，而且可还能够降低药物施用频率。总体而言，通过表达编码的黏合素的治疗性黏合素剂的延长的体内产生可有助于(i)在价格敏感的条件下进行黏合素剂的更广泛的治疗性或预防性应用，(ii)在发达国家和发展中国家两者中改善治疗的可及性，以及(iii)更有效和负担得起的治疗方式。除体内基因转移之外，还可从宿主(或供体)中收获细胞，将其用编码的黏合素序列进行改造以产生黏合素剂并重新施用给患者。
肌内抗体基因施用已得到最广泛的评价(在Deal et al.(2015)“Engineeringhumoral immunity as prophylaxis or therapy”Curr Opin Immunol.35：113-22.中进行了综述)，并且当应用于编码的黏合素时还具有最高的临床可译性和应用。实际上，骨骼肌固有的解剖、细胞和生理特性使其成为用于编码的黏合素的长期表达和全身循环的稳定环境。骨骼肌易于接近，使得能够多次或重复施用。丰富的血管供应为分泌的治疗性黏合素剂进入循环提供了有效的运输系统。肌肉纤维的合胞性质允许核苷酸从有限的渗透位点分散到纤维内的大量相邻核。骨骼肌纤维也是终末分化细胞，并且纤维内的核是有丝分裂期后的。因此，整合入宿主基因组不是获得延长的mAb表达的先决条件。肝脏是常用于临床前抗体基因转移的另一个位点，并且通常通过i.v.注射转染，并且也可以是编码的黏合素的基因转移位点，以用于局部递送黏合素剂(例如治疗肝癌和/或化生)或用于产生分泌到血管中以进行全身循环的黏合素剂。该器官具有多种生理功能，包括合成血浆蛋白质。该器官可特别很好地适合于编码的黏合素的体内表达。
肿瘤为通过i.v.或直接注射/电穿孔靶向的编码的黏合素转移提供了另一位点。实际上，肿瘤内编码的黏合素表达可允许局部产生治疗性黏合素剂，而无需高的全身性黏合素剂水平，否则这可能是渗透和影响实体瘤所需的。类似原理也适用于脑，其在抗体基因转移的情况下经常被靶向以避免血脑屏障运输的困难并且同样是递送编码的黏合素的靶标。参见例如Beckman et al.(2015)“Antibody constructs in cancer therapy：proteinengineering strategies to improve exposure in solid tumors”Cancer 109(2)：170-9；Dronca et al.(2015)“Immunomodulatory antibody therapy of cancer：the closer，the better”Clin Cancer Res.21(5)：944-6；以及Neves et al.(2016)“Antibodyapproaches to treat brain diseases”Trends Biotechnol.34(1)：36-48。
非病毒和病毒基因转移载体的改进极大驱动了基因治疗的成功。已经使用了一系列物理和化学非病毒方法将DNA和mRNA转移至哺乳动物细胞，并且这些中的很多已被开发为用于离体和体内二者的基因治疗的临床阶段技术，并且很容易适应于递送本公开内容的编码的黏合素。为了举例说明，可使用阳离子脂质体技术，其基于具有带正电荷的头部集团和疏水性脂质尾部的两亲性脂质与带负电荷的DNA或RNA结合并形成通常通过内吞作用进入细胞的颗粒的能力。一些阳离子脂质体还包含被认为增强哺乳动物细胞对脂质体的摄取的中性共脂质(co-lipid)。参见例如Felgner et al.(1987)Lipofection：a highlyefficient，lipid-mediated DNA-transfection procedure.MNAS 84：7413-7417；San etal.(1983)“Safety and short term toxicity of a novel cationic lipidformulation for human gene therapy”Hum.Gene Ther.4：781-788；Xu et al.(1996)“Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in celltransfection”Biochemistry 35，：5616-5623；以及Legendre et al.(1992)“Delivery ofplasmid DNA into mammalian cell lines using pH-sensitive liposomes：comparisonwith cationic liposomes”Pharm.Res.9，1235-1242。
类似地，其他聚阳离子(例如聚-1-赖氨酸和聚乙烯亚胺)可用于递送编码的黏合素。这些聚阳离子通过电荷相互作用与核酸形成复合物，并有助于将DNA或RNA缩合成纳米粒，其然后成为内体介导的摄取的底物。这些阳离子核酸复合物技术中的数个已被开发成潜在的临床产品，包括与质粒DNA、寡脱氧核苷酸和各种形式的合成RNA的复合物。经修饰的(和未经修饰的或“裸露的”)DNA和RNA也显示在许多情况下介导成功的基因转移，并且也可用作递送编码的黏合素的系统。这些包括通过直接肌内注射使用质粒DNA，使用质粒DNA的瘤内注射。参见，例如，Rodrigo et al.(2012)“De novo automated design of small RNAcircuits for engineering synthetic riboregulation in living cells”PNAS 109：15271-15276；Oishi et al.(2005)“Smart polyion complex micelles for targetedintracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containingacid-labile linkages”Chembiochem.6：718-725；Bhatt et al.(2015)“Microbeadsmediated oral plasmid DNA delivery using polymethacrylate vectors：aneffectual groundwork for colorectal cancer”Drug Deliv.22：849-861；Ulmer et al.(1994)Protective immunity by intramuscular injection of low doses ofinfluenza virus DNA vaccines”Vaccine 12：1541-1544；以及Heinzerling et al.(2005)“Intratumoral injection of DNA encoding human interleukin 12 intopatients with metastatic melanoma：clinical efficacy”Hum.Gene Ther.16：35-48。
病毒载体目前在绝大多数临床前和临床基因治疗试验中以及在第一个被批准的定向基因治疗中被用作递送载剂。参见Gene Therapy Clinical Trials Worldwide 2017(abedia.com/wiley/)。其主要驱动力是其出色的基因递送效率，这反映了自然的进化发展；病毒载体系统对基因递送具有吸引力，因为病毒已进化出通过感染穿透细胞膜从而将核酸(例如编码的黏合素)递送至靶细胞的能力。在腺病毒系统的引领下，病毒载体介导的抗体基因转移领域在过去的数十年中取得了显著的进步。众多成功评价的施用途径、临床前模型和疾病适应证充分展示了抗体基因转移的能力，通过其技术人员将能够容易地确定和改编用于体内递送编码的黏合素构建体的抗体基因转移系统和技术。肌肉已成为延长的mAb表达的首选施用部位，并且类似地是延长的黏合素剂表达的合适靶组织。在用载体的肿瘤内编码的黏合素基因转移的情况下，溶瘤病毒具有明显的优势，因为其可特异性地靶向肿瘤细胞，增强黏合素剂表达并放大例如对PD-L1黏合素剂的治疗反应。
也可通过使用非病毒载体(例如表达质粒)来完成编码的黏合素的体内基因转移。非病毒载体容易产生，并且未显示出诱导特异性免疫应答。肌肉组织最常被用作转染的靶组织，因为肌肉组织血管化良好且易于接近，并且肌细胞是长寿的细胞。裸质粒DNA的肌内注射导致一定百分比的肌细胞转染。使用这种方法，已在体内引入了编码细胞因子和细胞因子/IgG1嵌合蛋白的质粒DNA，并且其对(自身免疫)疾病的结局有积极影响。
在一些情况下，为了通过所谓的血管内递送提高转染效率，其中通过在静脉中诱导短暂的暂时高压来实现基因递送和表达水平的提高。特殊的血压袖带可通过暂时提高血管压力来促进局部摄取，并且可适合用于此类型基因递送的人患者。参见，例如，Zhang etal.(2001)“Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limbmuscles of nonhuman primates”Hum.Gene Ther.，12：427-438。
也可通过其他技术(例如其中通过使用化学载体(阳离子聚合物或脂质)或通过物理方法(基因枪递送或电穿孔)来改善核酸的递送)来获得提高的效率。参见Tranchant etal.(2004)“Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationiclipids”J.Gene Med.，6(Suppl.1)：S24-S35；以及Niidome et al.(2002)“Gene therapyprogress and prospects：nonviral vectors”Gene Ther.，9：1647-1652。电穿孔尤其被认为是用于非病毒基因递送的有趣技术。Somiari，et al.(2000)“Theory and in vivoapplication of electroporative gene delivery”Mol.Ther.2：178-187；以及Jaroszeski et al.(1999)“In vivo gene delivery by electroporation”Adv.DrugDelivery Rev.，35：131-137。通过电穿孔，将脉冲电流施加到局部组织区域以增强细胞通透性，从而导致基因在整个膜上转移。研究表明，与不使用电穿孔相比，使用电穿孔可使体内基因传递的效率高至少10至100倍。参见例如Aihara et al.(1998)“Gene transferinto muscle by electroporation in vivo”Nat.Biotechnol.16：867-870；Mir，et al.(1999)“High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated byelectric pulses”PNAS 96：4262-4267；Rizzuto，et al.(1999)“Efficient andregulated erythropoietin production by naked DNA injection and muscleelectroporation”PNAS 96：6417-6422；以及Mathiesen(1999)“Electropermeabilizationof skeletal muscle enhances gene transfer in vivo”Gene Ther.，6：508-514。
编码的PD-L1结合黏合素可通过通常用于基因治疗的多种基因递送系统(包括病毒、非病毒或物理)来递送。参见，例如Rosenberg et al.，Science，242：1575-1578，1988，以及Wolff et al.，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 86：9011-9014(1989)。用于基因治疗的方法和组合物的讨论包括：Eck et al.，in Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basisof Therapeutics，Ninth Edition，Hardman et al.，eds.，McGraw-Hill，New York，(1996)，Chapter 5，pp.77-101；Wilson，Clin.Exp.Immunol.107(Suppl.1)：31-32，1997；Wivel et al.，Hematology/Oncology Clinics of North America，Gene Therapy，S.L.Eck，ed.，12(3)：483-501，1998；Romano et al.，Stem Cells，18：19-39，2000，以及其中引用的参考文献。美国专利No.6,080,728也提供了多种基因递送方法和组合物的讨论。递送途径包括例如全身施用和原位施用。
编码的黏合素的有效基因转移方法必须针对需要它的特定组织/细胞，并且产生的转基因表达应处于适合特定应用的水平。启动子是载体基因组设计中的主要顺式作用元件，其可决定表达的整体强度以及细胞特异性。
表1.示例性遍在和细胞特异性启动子。
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在一些情况下，期望编码的黏合素构建体在所有细胞类型中遍在表达。可使用组成型启动子(例如人延伸因子1α亚基(EF1α)、立即早期巨细胞病毒(CMV)、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)或泛素C(UBC))促进编码的黏合素构建体在大多数组织中的表达。通常来说，CBA和CAG在组成型启动子中促进更大的表达；然而，与CMV(约0.8kb)或EF1α(约1.2kb)相比，其约1.7kb的尺寸可能会限制在具有包装限制的载体(例如AAV)中的使用，特别是在通过编码的黏合素构建体表达产生的黏合素剂较大的情况下。GUSB或UBC启动子可分别以378bp和403bp的较小尺寸提供遍在基因表达，但它们比CMV或CBA启动子弱得多。因此，已经进行了对组成型启动子的修饰以减小其尺寸而不影响其表达，并且一些实例例如CBh(约800bp)和miniCBA(约800bp)可促进在所选组织中可比较的以及甚至更高的表达(Gray et al.，Hum Gene Ther.201122：1143-1153)。
当应将编码的黏合素构建体的表达限于器官内的某些细胞类型时，可使用启动子来介导这种特异性。例如，在神经系统内，启动子已被用于将表达限制于神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。在神经元中，神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子比遍在启动子驱动更强的表达。此外，血小板源性生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(Syn)和甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子可以以比NSE更低的水平驱动神经元特异性表达。在星形胶质细胞中，胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，2.2kb)启动子的680bp长的缩短版本[gfaABC(1)D]可以以与GFAP启动子相同的星形胶质细胞特异性赋予更高的表达水平。靶向少突胶质细胞也可通过选择髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子来实现，该启动子的表达仅限于该神经胶质细胞；然而，其1.9kb的尺寸和低表达水平限制了其应用。
在骨骼肌细胞中表达编码的黏合素构建体的情况下，基于肌肉肌酸激酶(musclecreatine kinase，MCK)和结蛋白(1.7kb)的示例性启动子已显示出高的特异性率(在肝中表达最少，如果期望的话)。与其他肌肉启动子相比，α-肌球蛋白重链(α-myosin heavychain，α-MHC；1.2kb)的启动子已显示出显著的心脏特异性(Lee et al.，2011JCardiol.57(1)：115-22)。在造血干细胞中，分别与EF1α和CMV启动子相比，合成的MND启动子(Li et al.，2010J Neurosci Methods.189(1)：56-64)和2AUCOE(遍在染色质开放元件(ubiquitous chromatin opening element))中所包含的启动子已显示出在所有细胞谱系中驱动更高的转基因表达(Zhang et al.，2007 Blood.110(5)：1448-57；Koldej 2013 HumGene Ther Clin Dev.24(2)：77-85；Dighe et al.，2014 PLoS One.9(8)：e104805)。相反，已表明，在载体介导的基因转移之后使用启动子将表达限制于仅肝脏肝细胞会降低系统中具有风险的转基因特异性免疫应答，并且甚至诱导对表达的蛋白质的免疫耐受(Zhang etal.，2012 Hum Gene Ther.23(5)：460-72)，这对于某些黏合素剂可能是有益的。α1-抗胰蛋白酶(hAAT；347bp)和甲状腺素结合球蛋白(TBG；约400bp)启动子驱动的基因表达限于肝脏，而对其他组织的侵袭最小(Yan et al.，2012 Gene.506(2)：289-94；Cunningham etal.，2008 Mol Ther.16(6)：1081-8)。
在一些实施方案中，通常期望控制体内编码的黏合素表达的持续时间和量的机制。有多种诱导型启动子可适合用于基于用病毒载体和基于质粒DNA的编码的黏合素基因转移。参见Fang et al.(2007)“An antibody delivery system for regulatedexpression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo”Mol Ther.5(6)：1153-9；以及Perez et al.(2004)“Regulatable systemic production ofmonoclonal antibodies by in vivo muscle electroporation”Genet Vaccines Ther.2(1)：2。当前处于临床评价中的示例性可调节机制是由小分子配体活化的基于蜕皮激素的基因开关。Cai et al.(2016)“Plasma pharmacokinetics of veledimex，a small-molecule activator ligand for a proprietary gene therapy promoter system，inhealthy subjects”Clin Pharmacol Drug Dev.2016。
在编码的黏合素构建体的一些实施方案中，可使用病毒转录后调节元件(post-transcriptional regulatory element，PRE)；这些顺式作用元件是无内含子病毒RNA的核输出所必需的(Huang and Yen，1994J Virol.68(5)：3193-9；和1995Mol Cell Biol.15(7)：3864-9)。实例包括HPRE(乙型肝炎病毒PRE，533bp)和WPRE(土拨鼠肝炎病毒PRE，600bp)，其在某些情况下可将转基因表达水平提高近10倍(Donello et al.，1998 JVirol.72(6)：5085-92)。为了进一步举例说明，使用慢病毒和AAV载体，发现WPRE提高CMV启动子驱动的转基因表达，而且提高PPE、PDGF和NSE启动子驱动的转基因表达。WPRE的另一个作用可以是保护编码的黏合素构建体转基因免于沉默(Paterna et al.，2000 GeneTher.7(15)：1304-11；Xia et al.，2007 Stem Cells Dev.2007 Feb；16(1)：167-76)。
转录的编码的黏合素转录物的多腺苷酸化对核输出、翻译和mRNA稳定性也很重要。因此，在一些实施方案中，编码的黏合素构建体将包含多腺苷酸化信号序列。已有多个研究确定了不同的polyA信号对基因表达和mRNA稳定性的作用。示例性的多腺苷酸化信号序列包括SV40晚期或牛生长激素polyA(bGHpA)信号序列以及最小的合成polyA(SPA)信号(Levitt et al.，1989 Genes Dev.3(7)：1019-25；Yew et al.，1997 Hum Gene Ther.19978(5)：575-84)。通过置于其他polyA信号上游的SV40晚期polyA信号上游增强子(USE)提高了多腺苷酸化的效率(Schek et al.，1992 Mol Cell Biol.12(12)：5386-93)。在一些实施方案中，仅为了举例说明，编码的黏合素构建体包含SV40晚期+2xUSE polyA信号。
表2：示例性多腺苷酸化信号
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在一些实施方案中，可期望编码的黏合素构建体包含一个或更多个调节增强子，即，除了任何启动子序列之外。CMV增强子在CMV启动子的上游-598至-68处(Boshart etal.，1985Cell.41(2)：521-30)(约600bp)并包含转录结合位点。在一些实施方案中，构建体中可包含CMV增强子以提高例如使用ANF(心房钠尿因子)启动子、CC10(棒状细胞10)启动子、SP-C(表面蛋白C)启动子、或PDGF-β(血小板源性生长因子-β)启动子(仅作为实例)时组织特异性启动子驱动的转基因表达。总而言之，CMV增强子在不同细胞特异性启动子和不同细胞类型下提高转基因表达，使其成为了提高转基因表达水平的广泛适用的工具。在肌肉中，例如，在AAV表达系统中，将CMV增强子与肌肉特异性启动子一起使用进行转基因表达可提高由转基因编码的蛋白质的表达水平，因此在本公开内容中对于从被引入到患者肌细胞中的编码的黏合素构建体表达黏合素剂特别有用。
本主题的编码的黏合素构建体还可包含一个或更多个内含子序列。mRNA中内含子或间插序列的存在最初在体外被描述为对于mRNA加工和提高的转基因表达是重要的(Huang and Gorman，1990 Mol Cell Biol.10(4)：1805-10；Niwa et al.，1990 GenesDev.4(9)：1552-9)。内含子可位于黏合素剂的编码序列内和/或可位于启动子与转基因之间。在使用AAV2的小鼠中，比较了位于启动子与转基因之间的多种内含子(表3)的肝转基因表达(Wu et al.，2008)。MVM(小鼠细小病毒)内含子比测试的任何其他内含子都更加提高转基因表达，并且比无内含子高超过80倍(Wu et al.，2008)。然而，在使用AAV表达盒培养的神经元中，与WPRE相比，在转基因与polyA信号之间具有嵌合内含子(人β-球蛋白供体和免疫球蛋白重链接受体)的CaMPKII启动子下的转基因表达较少(Choi et al.，2014)。总之，内含子可以是包含在表达盒中以提高转基因表达的有价值的元件。
表3：示例性内含子
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在游离型载体(episomal vector)的情况下，本主题的编码的黏合素构建体还可包含一个或更多个复制起点、微型染色体维持元件(minichromosome maintenanceelement，MME)和/或核定位元件。本公开内容的游离型载体包含编码复制起点(ori)的病毒基因组DNA的一部分，该复制起点是此类载体自复制并因此在宿主细胞中持续数代所必需的。另外，本公开内容的游离型载体还可包含编码复制所需的病毒蛋白(即，复制子蛋白质)的一个或更多个基因。任选地，在包含本公开内容的自复制游离型表达载体的宿主细胞中，帮助启动复制的复制子蛋白质可在另一DNA分子上，例如在另一个载体上或在宿主基因组DNA上反式表达。优选的本公开内容的自复制游离型含LCR的表达载体不包含对于在真核宿主细胞中长期稳定维持不需要的病毒序列，例如编码会产生感染性病毒颗粒的核心或衣壳蛋白的病毒基因组DNA区域，或者可存在于全长病毒基因组DNA分子中的病毒致癌序列。本文中的术语“稳定维持”是指本公开内容的自复制游离型表达载体在不进行连续选择的非分裂细胞或分裂细胞的后代细胞中持续或维持二、三、四或五或更多代而没有载体拷贝数的显著损失(例如，＞50％)的能力。在一些实施方案中，载体将维持超过10至15或更多的细胞世代。相反，质粒在宿主细胞中的“瞬时”或“短期”持久性是指载体无法以稳定方式在宿主细胞中复制和分离(segregate)；也就是说，载体将在一至两代之后丢失，或者在连续世代之间将损失其拷贝数的＞51％。
下文进一步描述了可用于本公开内容的情况的数种代表性的自复制的含LCR的游离型载体。自复制功能可作为替代地由一种或更多种哺乳动物序列提供，所述序列例如由Wohlge uth et al.，1996，Gene Therapy3：503；Vos et al.，1995，Jour.Cell.Biol.，Supp.21A，433；以及Sun et al.，1994，Nature Genetics 8：33所描述的，任选地与核保留可能所需的一个或更多个序列组合。使用哺乳动物尤其是人序列来提供自复制功能的优点是不需要可能具有毒性或致癌特性的外来活化因子。本领域技术人员将理解，本公开内容不限于任一种复制起点或任一种游离型载体，而是涵盖游离型载体中LCR的组织限制性控制的组合。另见WO1998007876“Self-replicating episomal expression vectorsconferring tissue-specific gene expression”以及美国专利7790446“Vectors，celllines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication ofhybrid plasmids and expression of gene products”。
基于EB病毒(Epstein-Barr Virus)的自复制游离型表达载体。来自EB病毒(EBV)的潜在起点oriP描述于Yates et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3806-3810(1984)；Yates et al.，Nature 313：812-815(1985)；Krysan et al.，Mol.Cell.Biol.9：1026-1033(1989)；James et al..Gene 86：233-239(1990)，Peterson and Legerski，Gene 107：279-284(1991)；以及Pan et al.，Som.Cell Molec.Genet.18：163-177(1992))中。根据本公开内容可用的基于EBV的游离型载体可包含在EBV的2.61kb片段上携带的EBV的oriP区域以及在EBV的2.18kb片段上携带的EBNA-1基因。EBNA-1蛋白是支持含oriP的载体的反式游离型复制所必需的唯一病毒基因产物，其可在相同的含oriP的游离型表达载体上提供。还应理解，与已知支持病毒质粒的反式复制所需的任何蛋白质(例如EBNA-1)一样，基因也可在另外的DNA分子(例如不同的DNA载体)上表达。
基于乳头瘤病毒的自复制游离型表达载体。本公开内容的游离型表达载体还可基于乳头瘤病毒家族(包括但不限于牛乳头瘤病毒(BPV)和人乳头瘤病毒(HPV))的复制功能。BPV和HPV作为哺乳动物细胞中稳定维持的质粒而持续存在。还已经鉴定了由BPV和HPV编码的-S反式作用因子，即E1和E2，其对于通过最小复制起点介导许多细胞类型中的复制是必需的和充分的(Ustav et al.，EMBO J.10：449-457(1991)；Ustavet al.，EMBO J.10：4231-4329，(1991)；Ustav et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：898-902(1993))。
根据本公开内容可用的游离型载体是在Piirsoo et al.，EMBO J.，15：1(1996)中和在WO 94/12629中描述的BPV-I载体系统。Piirsoo等中描述的BPV-1载体系统包含具有BPV-1复制起点(最小起点加上染色体外维持元件(extrachro osomal maintenanceelement))以及任选地E1和E2基因的质粒。BPV-1 E1和E2基因对于BPV游离型载体的稳定维持是必需的。这些因素确保了质粒复制至每个细胞多至30个拷贝的稳定拷贝数，而与细胞周期状态无关。因此，基因构建体在分裂细胞和非分裂细胞二者中稳定存在。这使得能够在细胞(例如造血干细胞和更定向的前体细胞)中维持基因构建体。
BPV复制起点已被定位在包含E1和E2复制因子结合位点的60个碱基对(bp)DNA片段(核苷酸(nt)7914-7927)的上游调节区的31末端。HPV的最小复制起点也已经被表征并且定位在HPV的URR片段(nt 7022-7927)中(参见，例如Chiang et al.，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 89：5799-5803(1992))。如本文中所用的，“E1”是指由BPV亚型1的核苷酸(nt)849-2663或由HPV亚型11的nt 832-2779编码的蛋白质，其他乳头瘤病毒的等同E1蛋白，或者乳头瘤病毒E1蛋白的功能片段或突变体，即，具有E1的复制特性的E1片段或突变体。
如本文中所用的，“E2H是指由BPV亚型1的nt 2594-3837或由HPV亚型11的nt2723-3823编码的蛋白质，其他乳头瘤病毒的等同E2蛋白，或者乳头瘤病毒E2蛋白的功能片段或突变体，即，具有E2的复制特性的E2片段或突变体。“微型染色体维持元件”(MME)是指乳头瘤病毒基因组的染色体外维持元件，乳头瘤病毒复制所必需的病毒或人蛋白质与之结合，该区域对于宿主细胞中乳头瘤病毒MO的稳定的游离维持是必需的，如Piirsoo et al.(同上)中所述。优选地，MME是包含转录激活因子E2的多个结合位点的序列。BPV中的MME在本文中定义为位于上游调节区内的BPV区，其包含至少约六个连续的E2结合位点，并且其以约十个连续的E2结合位点提供最佳的稳定维持。E2结合位点9是该位点的示例性序列，如下文中所述，其中连续位点被约4至10个核苷酸并且最佳6个核苷酸的间隔区隔开。E1和E2也可如WO 94/12629中和Piirsoo et al.(同上)中所述以顺式或以反式提供给质粒。
“E2结合位点”是指与E2蛋白结合的乳头瘤病毒双链DNA的最小序列。E2结合位点可包含序列5*ACCGTTGCCGGT 3′(SEQ ID NO：208)，其为BPV-1 URR的高亲和力E2结合位点9；或者，E2结合位点可包含结合位点9的排列，该排列见于URR内，并且落在通用的E2结合序列5′ACCN6GGT 3′(SEQ ID NO：209)内。在大多数乳头瘤病毒中，一个或更多个转录激活因子E2结合位点位于上游调节区中，如在BPV和HPV中。根据本公开内容还可用的载体可包含BPV基因图上6959-7945/1-470之间的BPV区域(如WO 94/12629中所述)，该区域包含复制起点、与目的基因有效缔合的第一启动子、与第二启动子有效缔合以驱动E1基因的转录的BPVE1基因；以及与第三启动子有效缔合以驱动E2基因转录的BPV E2基因。
来自BPV的E1和E2将复制包含BPV起点或许多HPV亚型的起点的载体(Chiang etal.，同上)。来自HPV的E1和E2将通过BPV起点以及通过许多HPV亚型的起点复制载体(Chiang et al.，同上)。与本公开内容的所有载体一样，本公开内容的基于BPV的游离型表达载体必须持续宿主细胞的2至5次或更多次分裂。
还参见美国专利7790446和Abroi et al.(2004)“Analysis of chromatinattachment and partitioning functions of bovine papillomavirus type 1 E2protein.Journal of Virology 78：2100-13，其显示BPV1 E2蛋白依赖性MME和EBV EBNA1依赖性FR分离/分配活性独立于质粒的复制而起作用。EBNA1/FR和E2/MME的稳定维持功能可用于确保对细胞复制起点的长期游离维持。
基于乳多空病毒(Papovavirus)的自复制游离型表达载体。本公开内容的载体还可来源于人乳多空病毒BK基因组DNA分子。例如，可用限制性酶EcoRI和BamHI消化BK病毒基因组以产生包含BK病毒复制起点序列的5千碱基(kb)的片段，其可赋予载体稳定的维持(参见例如De Benedetti and Rhoads，Nucleic Acids Res.19：1925(1991)，3.2kb的BK病毒片段也可如此(Cooper and Miron，Human Gene Therapy 4：557(1993))。
本公开内容的编码的黏合素构建体可作为环状或线性核酸提供。环状和线性核酸能够指导黏合素剂编码序列在合适的对象细胞中表达。用于表达黏合素剂的一种或更多种核酸系统可以是嵌合的，意味着其组分中的至少一种相对于其其他组分中的至少一种是异源的。
a.病毒载体
易于适用于本公开内容的一些示例性病毒基因治疗系统包括质粒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)等。优选的病毒载体基于非致细胞病变真核病毒，其中非必需基因已被携带编码表位的核酸序列和目的靶序列的核酸构建体替代。
为了进一步举例说明，编码的黏合素可使用腺病毒和腺相关病毒(AAV)(其是已经被批准用于人基因治疗用途的双链DNA病毒)在体内递送。
腺病毒载体
用于在体内递送一个或更多个核酸序列的一种举例说明性方法涉及使用腺病毒(“AdV”)表达载体。AdV是既不会整合在宿主基因组中也不会在细胞分裂期间进行复制的无包膜的双链DNA病毒。AdV介导的抗体基因转移已在进入临床的多种不同疾病模型中显示出治疗效力。全身性mAb表达主要通过s.c.并且尤其是i.v.和肌内AdV注射进行。参见Wold etal.(2013)“Adenovirus vectors for gene therapy，vaccination and cancer genetherapy”Curr Gene Ther.13(6)：421-33；和Deal et al.“Engineering humoralimmunity as prophylaxis or therapy”2015 Curr Opin Immunol.35：113-22。另一些递送途径集中于更多的局部mAb产生，例如通过鼻内、气管内或胸膜内施用编码AdV。将AdV用作溶瘤载体是特别地用于在肿瘤部位产生编码抗体的流行方法。由当前的腺病毒基因递送系统递送的外来基因是游离的，并因此对宿主细胞的遗传毒性低。因此，使用腺病毒基因递送系统的基因治疗可相当安全。本公开内容具体地考虑通过表达以腺病毒载体和递送系统的形式递送的编码的黏合素构建体来递送黏合素剂。
腺病毒由于其中等尺寸的基因组、易于操作、高效价、宽靶细胞范围和高感染性而通常被用作基因递送载体。病毒基因组的两端均包含100至200bp的ITR(反向末端重复序列)，其是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和数个细胞基因的转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)编码负责病毒DNA复制的蛋白质。在迄今为止开发的腺病毒载体中，通常使用具有缺失的E1区的复制缺陷型腺病毒，并且所述腺病毒代表了用于产生本公开内容的编码的黏合素构建体的AdV的一种示例性选择。腺病毒载体中缺失的E3区可为转基因提供插入位点(Thimmappaya，B.et al.，Cell，31：543-551(1982)；和Riordan，J.R.et al.，Science，245：1066-1073(1989))。
“腺病毒表达载体”意指包括包含腺病毒序列的那些构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持该构建体的包装和(b)表达编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括黏合素剂，例如PD-L1结合黏合素(编码的黏合素序列)。在一些实施方案中，可将编码的黏合素的序列插入到DA启动子区中。根据一个示例性实施方案，重组腺病毒包含缺失的E1B和E3区，并且将编码的黏合素的核苷酸序列插入到缺失的E1B和E3区中。
腺相关病毒载体(AAV)
AAV(或“rAAV”，对于重组AAV)是能够感染分裂和非分裂细胞二者的无包膜的小单链DNA病毒。类似于AdV，基于AAV的载体在细胞核中仍保持游离状态并且显示出有限的整合风险。与AdV介导的基因转移的通常有限的持久性相比，在肌内重组AAV(rAAV)载体递送之后，转基因表达可持续数年。
Alipogene tiparvovec(GlyberaTM)是一种编码人脂蛋白脂肪酶基因的rAAV，于2012年被批准为在欧洲的首个基因治疗产品。自那时起，多种基于rAAV的基因治疗产品目前正在临床评价中。在抗体基因转移的情况下，许多报道表明在肌内注射编码mAb的rAAV之后，在小鼠中在体内产生了抗人免疫缺陷病毒(HIV)mAb。还已表明用于组合治疗的rAAV载体的潜能，即通过表达两种mAb。类似于AdV，最经常进行肌内和i.v.rAAV施用。在Deal etal.“Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy”2015 Curr OpinImmunol.35：113-22中进行了综述。还已表明了实现更多的局部治疗作用的多种另外的递送部位，包括颅内、鼻内、玻璃体内、鞘内、胸膜内和腹膜内途径。利用已证明的用于抗体基因转移的rAAV的效用，本公开内容还具体地考虑了rAAV系统用于在体内递送编码的黏合素序列和由于rAAV构建体的表达而在患者的身体中产生黏合素剂的用途。
AAV的一个重要特征是这些基因转移病毒能够感染非分裂细胞和多种类型的细胞，从而使其可用于构建本公开内容的编码的黏合素递送系统。对于使用和制备示例性AAV载体的详细描述见于例如美国专利NO：5,139,941和4,797,368，以及LaFace et al，Viology，162：483486(1988)，Zhou et al.，Exp.Hematol.(NY)，21：928-933(1993)，Walshet al，J.Clin.Invest.，94：1440-1448(1994)和Flotte et al.，Gene Therapy，2：29-37(1995)中。AAV由于其安全性(即，遗传改造(重组)不整合到宿主基因组中)是递送载剂的良好选择。同样，AAV不是致病性的并且不与任何疾病相关。病毒编码序列的去除使对病毒基因表达的免疫反应最小化，并因此，重组AAV不会引起炎性应答。
通常来说，重组AAV病毒通过共转染包含侧翼为两个AAV末端重复序列的目的基因(即，黏合素剂的编码序列)的质粒(McLaughlin et al.，J.Virol.，62：1963-1973(1988)；Samulski et al.，J.Virol.，63：3822-3828(1989))以及包含无末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒(McCarty et al.，J.Virol.，65：2936-2945(1991))来制得。通常来说，包含编码的黏合素构建体的病毒载体由编码包含黏合素的多肽的多核苷酸、合适的调节元件以及介导细胞转导的编码的黏合素的表达所必需的元件来组装。在一些实施方案中，采用腺相关病毒(AAV)载体。在一个更具体的实施方案中，AAV载体是AAV1、AAV6或AAV8。
具有由AAV ITR限制的编码的黏合素序列的AAV表达载体可通过将所选择的序列直接插入到已从中切除了主要AAV开放阅读框(open reading frame，“ORF”)的AAV基因组中来构建。
对于真核细胞，表达控制序列通常包含启动子、增强子(例如来源于免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的启动子/增强子(参见上文))以及可包含剪接供体和接受体位点的多腺苷酸化序列。多腺苷酸化序列通常在转基因序列之后和3’ITR序列之前插入。
这些以及其他常见载体和调节元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的。参见，例如Sambrook et al.及其中在例如第3.18-3.26页和第16.17-16.27页引用的参考文献，以及Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1989)。当然，并非所有的载体和表达控制序列都将同样良好地发挥作用来表达本公开内容的所有转基因。然而，本领域技术人员可在这些表达控制序列中进行选择而不脱离本公开内容的范围。合适的启动子/增强子序列可由本领域技术人员使用由本申请提供的指导来选择。这样的选择是常规事项，而不是分子或构建体的限制。
逆转录病毒载体
可用于递送编码的黏合素构建体的情况的非致细胞病变病毒包括逆转录病毒，其生命周期涉及基因组病毒RNA逆转录成DNA以及随后的前病毒整合到宿主细胞DNA中。逆转录病毒已被批准用于人基因治疗试验。最有用的是复制缺陷型的那些逆转录病毒(即，能够指导期望蛋白质的合成，但是不能制造感染性颗粒)。这样的经遗传改变的逆转录病毒表达载体对于体内基因的高效转导具有一般效用。用于产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括以下步骤：将外源遗传物质并入到质粒中，用所述质粒转染包装细胞系，通过所述包装细胞系产生重组逆转录病毒，从组织培养基中收集病毒颗粒，以及用所述病毒颗粒感染靶细胞)是本领域技术人员已知的。
为了构建逆转录病毒载体，将黏合素剂编码序列插入到病毒基因组中代替某些病毒序列以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建包含gag、pol和env基因但不含LTR(长末端重复序列)和psi(□)组件的包装细胞系(Mann et al.，Cell，33：153-159(1983))。当将包含细胞因子基因、LTR和psi的重组质粒引入到该细胞系中时，psi序列使得重组质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，其然后被分泌到培养基中(Nicolas and Rubinstein″Retroviral vectors，″In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors andtheir uses，Rodriguez and Denhardt(eds.)，Stoneham：Butterworth，494-513(1988))。然后收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩并用于基因递送系统。
已经报道了使用这样的第二代逆转录病毒载体进行的成功的基因转移。Kasaharaet al.(Science，266：1373-1376(1994))制备了莫洛尼鼠白血病病毒的变体，其中将EPO(红细胞生成素)序列插入在包膜区的位置中，因此产生了具有新的结合特性的嵌合蛋白。可能地，可根据第二代逆转录病毒载体的构建策略来构建本发明的基因递送系统。
在一些实施方案中，逆转录病毒是“γ逆转录病毒”，其是指逆转录病毒科(retroviridae)科的属。示例性γ逆转录病毒包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮组织增殖病病毒。
在一些实施方案中，用于本公开内容的逆转录病毒载体是慢病毒载体，其是指能够感染分裂细胞和非分裂细胞并且通常产生高病毒效价的逆转录病毒属。慢病毒的数个实例包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括HIV 1型和HIV 2型)；马感染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus，FIV)；牛免疫缺陷病毒(bovine immune deficiencyvirus，BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)。
可用于递送和表达编码的黏合素的另一类广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MuLV)、长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemiavirus，GaLV)及其组合的那些(参见，例如，Buchscher et al.，J.Virol.66：2731-2739，1992；Johann et al.，J.Virol.66：1635-1640，1992；Sommerfelt et al.，Virol.176：58-59，1990；Wilson et al.，J.Virol.63：2374-2378，1989；Miller et al.，J.Virol.65：2220-2224，1991；以及PCT/US94/05700)。
还可用于本公开内容的另一些逆转录病毒载体包括，例如基于人泡沫病毒(humanfoamy virus，HFV)或泡沫病毒属(Spumavirus)属中的其他病毒的载体。泡沫病毒(Foamyvirus，FV)是当今已知的最大的逆转录病毒，并且广泛分布于不同哺乳动物中，包括所有非人灵长类物种，然而在人中却不存在。这种完全的无致病性(apathogenicity)使FV载体具有作为在人中用于遗传治疗的理想基因转移载剂的资格，并清楚地将作为基因递送系统的FV载体与HIV来源的载体以及γ逆转录病毒来源的载体区分开。
用于本文中的合适的逆转录病毒载体描述于例如美国专利NO：5,399,346和5,252,479中；以及描述于WIPO公布WO 92/07573、WO 90/06997、WO 89/05345、WO 92/05266和WO 92/14829中，其提供了对使用这样的逆转录病毒载体将核酸有效引入到人细胞中的方法的描述。另一些逆转录病毒载体包括例如小鼠乳腺肿瘤病毒载体(例如，Shackleford etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：9655-9659，1998)、慢病毒等。
可容易地适于递送编码PD-L1黏合素剂的转基因的另外的逆转录病毒递送系统仅包括举例说明已公布的PCT申请WO/2010/045002、WO/2010/148203、WO/2011/126864、WO/2012/058673、WO/2014/066700、WO/2015/021077、WO/2015/148683、WO/2017/040815-其中每一个的说明书和附图均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体包含包装和整合病毒基因组所必需的所有顺式作用序列，即，(a)在载体的每个末端的长末端重复序列(LTR)或其部分；(b)用于负链和正链DNA合成的引物结合位点；以及(c)将基因组RNA并入到病毒体中所必需的包装信号。关于逆转录病毒载体的更多细节可见于Boesen，et al.，1994，Biotherapy 6：291-302；Clowes，et ai，1994，J.Clin.Invest.93：644-651；Kiem，et al.，1994，Blood 83：1467-1473；Salmons and Gunzberg，1993，Human Gene Therapy 4：129-141；Miller，et al.，1993，Meth.Enzymol.217：581-599；以及Grossman and Wilson，1993，Curr.Opin.inGenetics and Devel.3：110-114中。
在一些实施方案中，逆转录病毒是具有重组复制能力的逆转录病毒，其包含：编码逆转录病毒GAG蛋白的核酸序列；编码逆转录病毒POL蛋白的核酸序列；编码逆转录病毒包膜的核酸序列；癌瘤逆转录病毒(oncoretroviral)多核苷酸序列，其在癌瘤逆转录病毒多核苷酸序列的5’和3’端包含长末端重复序列(Long-Terminal Repeat，LTR)序列；包含与黏合素剂(例如PD-L1黏合素剂)的编码序列可操作地连接的内部核糖体进入位点(internalribosome entry site，IRES)的盒，其中所述盒位于3’LTR的U3区的5’和编码逆转录病毒包膜的序列的3’；以及用于在靶细胞中逆转录、包装和整合的顺式作用序列。
在一些实施方案中，逆转录病毒是具有重组复制能力的逆转录病毒，其包含：逆转录病毒GAG蛋白；逆转录病毒POL蛋白；逆转录病毒包膜；逆转录病毒多核苷酸，其在逆转录病毒多核苷酸序列的3’端包含长末端重复序列(LTR)序列，在逆转录病毒多核苷酸的5’端包含启动子序列，该启动子适合于在哺乳动物细胞中表达；gag核酸结构域；pol核酸结构域和env核酸结构域；包含编码的黏合素序列的盒，其中所述盒位于3’LTR的5’，并且可操作地连接，以及编码逆转录病毒包膜的env核酸结构域的3’；以及在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用序列。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的一些实施方案中，包膜选自兼向性、多嗜性、异嗜性、10A1、GALV、狒狒内源性病毒、RD114、弹状病毒、甲病毒、麻疹或流感病毒包膜中的一种。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的一些实施方案中，逆转录病毒多核苷酸序列从选自以下的病毒中改造：鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)、猫白血病病毒(Feline leukemia virus，FeLV)、狒狒内源性逆转录病毒(Baboon endogenous retrovirus，BEV)、猪内源性病毒(porcine endogenous virus，PERV)、猫来源逆转录病毒RD114、松鼠猴逆转录病毒(squirrel monkey retrovirus)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic murineleukemia virus-related virus，XMRV)、禽网状内皮组织增殖病病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)或长臂猿白血病病毒(GALV)。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的一些实施方案中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的一些实施方案中，存在第二盒，其包含第二治疗蛋白(例如另一检查点抑制剂多肽、共刺激多肽和/或免疫刺激细胞因子(仅作为实例))的编码序列，例如，在盒的下游。在某些情况下，第二盒可包含与第二治疗蛋白的编码序列可操作地连接的内部核糖体进入位点(IRES)或微型启动子或polIII启动子。
在具有重组复制能力的逆转录病毒的一些实施方案中，其是非裂解性、兼向性逆转录病毒复制载体，其优选地选择性地感染肿瘤微环境的细胞并在该细胞中复制。
作为表达构建体的另一些病毒载体
在用载体的瘤内编码的黏合素基因转移的情况下，溶瘤病毒具有独特的优点，因为其可特异性地靶向肿瘤细胞、加强治疗性黏合素剂表达，并放大抗肿瘤治疗应答。与上述某些病毒系统重叠的溶瘤病毒通过选择性肿瘤细胞杀伤和诱导全身性抗肿瘤免疫来促进抗肿瘤应答。作用机制尚未完全阐明，但可能取决于所转化细胞内的病毒复制、对原代细胞死亡的诱导、与肿瘤细胞抗病毒元件的相互作用以及固有和适应性抗肿瘤免疫的启动。在Kaufman et al.2015“Oncolytic viruses：a new class of immunotherapy drugs”NatRev Drug Discov.14(9)：642-62中进行了综述。当前在临床中的许多溶瘤病毒对由癌细胞异常表达的细胞表面蛋白具有天然嗜性。迄今为止，AdV、痘病毒、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、呼肠孤病毒等已进入早期临床试验。在2015年，FDA和EMA批准了talimogenelaherparepvec(T-VEC，ImlygicTM)，其是用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)的基因武装的溶瘤疱疹病毒。溶瘤病毒的自身永久存在性质使其成为本公开内容的编码的黏合素基因转移的有吸引力平台，因为转基因产物可与病毒复制一起扩增，从而使治疗作用最大化。Liu et al.2008“Oncolyticadenoviruses for cancer gene therapy”Methods Mol Biol.433：243-58。
在作为大的融合蛋白(即，其除单黏合素结构域之外还包含其他蛋白质结构域)的黏合素剂的情况下，局部瘤内表达可提供有吸引力的策略来克服在实体瘤中的不良渗透(如果以及可能存在问题的情况下)。Beckman et al.(2007)“Antibody constructs incancer therapy：protein engineering strategies to improve exposure in solidtumors”Cancer 109(2)：170-9；和Dronca et al.2015“Immunomodulatory antibodytherapy of cancer：the closer，the better”Clin Cancer Res.21(5)：944-6。同样，编码的黏合素构建体的瘤内递送和黏合素剂的伴随局部表达可产生更好的治疗指数，其中当全身递送(或表达)黏合素剂时，剂量限制性毒性可能以其他方式阻止达到效力的有效瘤内浓度。
在本公开内容的PD-L1黏合素剂的情况下，这些黏合素的免疫调节性质与溶瘤病毒的使用非常相关。确实，对于溶瘤病毒治疗，可期望超越免疫检查点抑制剂网络并且从而在癌症内创造促炎环境。目前正在进行许多临床试验以评价溶瘤病毒与常规免疫调节mAb施用的组合。Kaufman et al.2015“Oncolytic viruses：a new class of immunotherapydrugs”Nat Rev Drug Discov.14(9)：642-62；和Lichty et al.2014“Going viral withcancer immunotherapy”Nat Rev Cancer.14(8)：559-67。然而，用检查点阻断性mAb进行的全身性治疗可导致严重的免疫相关不良作用，这对于本主题的PD-L1黏合素剂的一些实施方案也可能是一个问题，突出了局部治疗的机会，例如通过编码的黏合素武装的溶瘤病毒。不同的研究都采用这种方法并且可容易地适于与本主题的编码的黏合素一起使用。Diaset al.armed a replication-deficient and-competent oncolytic AdV with an anti-human CTLA-4 mAb。Dias et al.2012“Targeted cancer immunotherapy with oncolyticadenovirus coding for a fully human monoclonal antibody specific for CTLA-4”Gene Ther.19(10)：988-98。最近描述的另一系统(并且可适于与本公开内容的编码的黏合素一起使用)涉及具有抗鼠程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)Fab、scFv或全长mAb的经武装的溶瘤牛痘病毒。反映病毒复制，取决于肿瘤模型，肿瘤中的mAb水平在以9或30μg/ml进行瘤内注射之后3至5天达到峰值。血清mAb水平遵循相同的趋势，尽管降低了三倍或更多，尽管在5天之后丧失了mAb检出。与瘤内注射抗PD-1mAb蛋白相比，瘤内表达的mAb持续时间更长，其中随访限于注射之后的11天。未报道Fab和scFv表达。用抗PD-1scFv或mAb武装的病毒的抗肿瘤应答优于未经武装的病毒，并且同未经武装的病毒与全身性抗PD-1 mAb蛋白注射剂的组合一样有效。Kleinpeter et al.2016“Vectorization in an oncolytic vaccinia virus of an antibody，a Fab and a scFvagainst programmed cell death-1(PD-1)allows their intratumoral delivery andan improved tumor-growth inhibition”Oncoimmunology.5(10)：e1220467(在线)。同样最近，用抗PD-L1微型抗体(scFv CH2-CH3融合蛋白)武装的溶瘤AdV与辅助-依赖性AdV的组合的瘤内施用改善了嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞治疗在小鼠中的抗肿瘤作用。通过抗PD-L1 IgG输注加上CAR T细胞和共施用未经武装的AdV无法实现局部产生的抗PD-L1微型抗体的益处。Tanoue et al 2017“Armed oncolytic adenovirusexpressing PD-L1 mini-body enhances anti-tumor effects of chimeric antigenreceptor T-cells in solid tumors”Cancer Res.77(8)：2040-51。还考虑了将特别是与CAR-T细胞治疗组合的该系统用于将编码的黏合素递送至靶肿瘤的用途。
其他病毒载体可用作本公开内容中的基因递送系统。来源于病毒，例如牛痘病毒(Puhlmann M.et al.，Human Gene Therapy，10：649-657(1999)；Ridgeway，″Mammalianexpression vectors，″In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors andtheir uses.Rodriguez and Denhardt，eds.Stoneham：Butterworth，467-492(1988)；Baichwal and Sugden，″Vectors for gene transfer derived from animal DNAviruses：Transient and stable expression of transferred genes，″In：KucherlapatiR，ed.Gene transfer.New York：Plenum Press，117-148(1986)以及Coupar et al.，Gene，68：1-10(1988))、慢病毒(Wang G.et al.，J.Clin.Invest.，104(11)：R55-62(1999))、单纯疱疹病毒(Chamber R.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，92：1411-1415(1995))、痘病毒(GCE，NJL，Krupa M，Esteban M.，The poxvirus vectors MVA and NYVAC as genedelivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer CurrGene Ther 8(2)：97-120(2008))、呼肠孤病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒和脊髓灰质炎病毒的载体可用于本发明的递送系统以用于将目的基因转移到细胞中。它们为多种哺乳动物细胞提供了数个有吸引力的特征。还包括乙型肝炎病毒。
b.非病毒载体
在1990年，Wolff et al.展示了裸质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)向小鼠骨骼肌中的注射是如何导致编码蛋白的局部表达的，从而开启了基于DNA的治疗领域。参见Wolff etal.1990“Direct gene transfer into mouse muscle in vivo”Science.247(4949 Pt1)：1465-8。使用“pDNA”递送本公开内容的编码的黏合素无需作为生物载体的病毒，并且提供了有吸引力的编码的黏合素基因转移平台。与病毒载体相比，pDNA被认为是低免疫原性的(允许例如重复给药)，对于产生、运输和储存是便宜的，并且具有长得多的保质期。在进入细胞核中之后，pDNA保持非复制非整合的游离状态，并且在有丝分裂时核被膜破裂期间丢失。与病毒载体相比，pDNA对转基因的尺寸没有明确的限制，并且其模块性质允许直接进行分子克隆，使得其易于操作和设计以用于治疗用途。Hardee et al.2017“Advances innon-viral DNA vectors for gene therapy”Genes.8(2)：65。在约17％的正在进行或已完成的基因治疗临床试验中使用了质粒，并且其显示出良好的耐受性和安全性。
DNA施用方法可极大地影响转基因表达。体内DNA介导的编码的黏合素基因转移可利用这样的用于抗体基因转移的物理转染方法，例如电穿孔或流体动力学注射。电穿孔表示电场在组织内的传播，其引起细胞膜通透性的瞬时提高。DNA的电转移是多步骤过程，涉及(i)DNA向质膜的电泳迁移，(ii)DNA积聚和与质膜的相互作用，以及(iii)DNA到细胞核的胞内运输，在此之后基因表达可开始。Heller LC.2015“Gene electrotransfer clinicaltrials”Adv Genet.89：235-62。肌内、瘤内和皮内施用已在临床试验中进行了评价，并且也是用于编码的黏合素构建体电穿孔的合适靶组织。
基于流体动力学的转染利用i.v.注射高体积的pDNA，驱使DNA分子离开血液循环并进入组织中。另一些潜在的较小侵入性的物理递送方法包括声穿孔和磁转染。还可通过将分子与化学递送载剂(例如，阳离子脂质或聚合物和脂质纳米粒)复合来改善DNA摄取。这样的技术也可应用于体内DNA介导的编码的黏合素基因转移。
除对递送方法的选择之外，还可通过改进pDNA构建体的组成来改善编码的黏合素转基因表达。参见，例如，Hardee et al.2017“Advances in non-viral DNA vectors forgene therapy”Genes 8(2)：65；和Simcikova et al.2015“Towards effective non-viralgene delivery vector”Biotechnol Genet Eng Rev.31(1-2)：82-107。常规的pDNA由转录单元和细菌骨架组成。转录单元携带编码的黏合素序列以及调节元件。细菌骨架包含这样的元件，如抗生素抗性基因、复制起点、未甲基化的CpG基序和潜在的隐蔽表达信号。这些序列中的一些是产生质粒DNA所需的。然而，一般而言，对于治疗性的编码的黏合素基因治疗，细菌骨架的存在将可能会适得其反。然而，有多种不同类型的可用最小载体可以选择，包括已经用于抗体基因转移并且可容易地适合于编码的黏合素基因转移的微环DNA(minicircle DNA，mcDNA)。微环是不含细菌序列的质粒分子，其通过重组、限制和/或纯化的过程产生。Simcikova et al.2015同上。消除细菌骨架已在多种组织中显示出更高的转染效率和延长的转基因表达。
本文中还提供了线性核酸或线性表达盒(linear expression cassette，“LEC”)，其能够通过电穿孔有效地递送至对象并表达其中包含的编码的黏合素序列。LEC可以是不含任何磷酸骨架的任何线性DNA。LEC可包含启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。编码的黏合素编码序列的表达可由启动子控制。
质粒载体
在一些实施方案中，本主题的编码的黏合素构建体作为质粒载体递送。质粒载体已在本领域中广泛描述，并且是本领域技术人员公知的。参见例如上文引用的Sambrook etal.，1989。在最近数年中，已将质粒载体用作用于在体内将抗原编码基因递送至细胞的DNA疫苗。它们对此特别有利，因为相对于其他载体，它们降低了安全问题。然而，具有与宿主细胞相容的启动子的这些质粒可表达由质粒内的核酸编码的肽表位。其他质粒是本领域普通技术人员公知的。另外，质粒可使用限制酶和连接反应以去除和添加特定的DNA片段来定制设计。质粒可通过多种的肠胃外、黏膜和表面(topical)途径递送。例如，DNA质粒可通过肌内、皮内、皮下或其他途径来注射。其也可通过鼻内喷剂或滴剂、直肠栓剂和经口来施用。也可使用基因枪将其施用到表皮或黏膜表面中。质粒可在水溶液中给予，将其干燥到金颗粒上，或者与另外的DNA递送系统(包括但不限于脂质体、树状聚合物、脂质卷(cochleate)和微囊化)缔合。
为了扩大使用质粒DNA在体内将编码的黏合素构建体递送至组织的应用和效率，可基于现有技术报道中产生更高mAb表达或总体效力的原理来寻求不同的方法。第一策略仅依赖于给予多个或重复的pDNA剂量。Kitaguchi et al.2005“Immune deficiencyenhances expression of recombinant human antibody in mice after nonviral invivo gene transfer”Int J Mol Med16(4)：683-8；和Yamazaki et al.2011“Passiveimmune-prophylaxis against influenza virus infection by the expression ofneutralizing anti-hemagglutinin monoclonal antibodies from plasmids”Jpn JInfect Dis.64(1)：40-9。另一方法涉及递送辅助剂的使用。可通过用透明质酸酶(瞬时分解透明质酸的酶)预处理肌肉，降低胞外基质的黏度并促进DNA扩散来增强pDNA电转移。Yamazaki et al.2011，同上；以及McMahon et al.2001“Optimisation ofelectrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment withhyaluronidase：increased expression with reduced muscle damage”Gene Ther.8(16)：1264-70。对于抗体基因转移，这导致mAb表达提高约3.5倍，在30μg pDNA下达到3.5μg/ml的血浆峰值效价，并且本领域技术人员可使其适于编码的黏合素基因转移。另一策略专注于抗体或盒改造。在密码子、RNA和前导序列优化之后，通过肌内电转移“经优化的”pDNA得到峰值血清mAb或Fab效价。参见，例如，Flingai et al.2015“Protection againstdengue disease by synthetic nucleic acid antibody prophylaxis/immunotherapy”Sci Rep.5：12616。
质粒的目的是将核酸序列有效地递送至细胞或组织并在所述细胞或组织中表达治疗性黏合素剂。特别地，质粒的目的可以是获得高拷贝数，避免质粒不稳定性的潜在原因，并提供用于质粒选择的方式。至于表达，核酸盒包含用于表达盒内的编码的黏合素的必要元件。表达包括用质粒对插入基因、核酸序列或核酸盒的有效转录。因此，在一些方面中，质粒被提供用于表达编码的黏合素构建体，该构建体包括包含黏合素剂的编码序列的表达盒；也称为转录单元。当将质粒置于适合于表位表达的环境中时，转录单元将表达黏合素剂和构建体中编码的任何其他物质。转录单元包含转录控制序列，其与细胞免疫应答元件编码序列转录连接。转录控制序列可包含启动子/增强子序列，例如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子/增强子序列，例如上文所述。然而，本领域技术人员将认识到适合在哺乳动物细胞包括人患者细胞中表达的多种其他启动子序列是已知的，并且可类似地用于本文中公开的构建体中。黏合素剂的表达水平将取决于相关的启动子以及相关增强子元件的存在和激活。
在一些实施方案中，可将编码的黏合素序列(编码期望的黏合素剂)克隆到表达质粒中，该表达质粒包含用于转录、翻译、RNA稳定性和复制的调节元件(即，包含转录控制序列)。这样的表达质粒是本领域公知的，并且普通技术人员将能够设计用于在体内产生重组黏合素剂的合适的表达构建体。
微环
基于微环(mcDNA)的抗体基因转移也可适于在体内将编码的黏合素递送至组织。在某些情况下，用于非病毒基因递送的质粒DNA可引起不可接受的炎性应答。在发生这样的情况下，免疫毒性应答很大程度上是由于在质粒DNA的细菌繁殖之后，质粒上存在未甲基化的CpG基序及其相关的刺激序列。体外DNA的简单甲基化可足以降低炎性应答，但可能导致降低的基因表达。通过克隆去除(cloning out)进行的CpG岛的去除或非必需序列的消除已成为用于降低炎性应答的成功技术。Yew et al.2000“Reduced inflammatory responseto plasmid DNA vectors by elimination and inhibition of immunostimulatory CpGmotifs”Mol Ther 1(3)，255-62。
由于细菌DNA包含比哺乳动物DNA多平均4倍的CpG岛，因此好的解决方案是在质粒产生过程期间从基因递送载体中完全消除细菌控制区，例如复制起点和抗生素抗性基因。因此，将“亲本”质粒重组为通常包含待递送基因(在这种情况下，为编码的黏合素编码序列)和适合其表达的控制区的“微环”，以及通常包含亲本质粒的其余部分的微质粒(miniplasmid)。
使用最小的可能切除位点，细菌序列的去除需要是高效的，同时产生超螺旋DNA微环，该微环在适当的情况下仅由基因表达元件--优选哺乳动物--控制区组成。用于微环产生的一些技术使用细菌噬菌体λ(λ)整合酶介导的重组来产生微环DNA。参见，例如，Darquet，et al.1997 Gene Ther 4(12)：1341-9；Darquet et al.1999 Gene Ther 6(2)：209-18；和Kreiss，et al.1998 Appl Micbiol Biotechnol 49(5)：560-7)。
因此，本文中所述的核酸构建体的一些实施方案可以以微环DNA的形式加工。微环DNA属于小(2至4kb)环形质粒衍生物，其已经从所有原核载体部分中释放出来。由于微环DNA载体不包含细菌DNA序列，因此其不太可能被视为外来的且被破坏。作为结果，与某些常规质粒相比，这些载体可表达更长的时间段。微环的较小尺寸还扩展了其克隆能力并促进了其向细胞中的递送。用于产生微环DNA的试剂盒是本领域已知的，并且可商购获得(System Biosciences，Inc.，Palo Alto，Calif.)。有关微环DNA的信息提供于Dietz etal.，Vector Engineering and Delivery Molecular Therapy(2013)；21 8，1526-1535和Hou et al.，Molecular Therapy-Methods&Clinical Development，文章编号：14062(2015)doi：10.1038/mtm.2014.62中。更多有关微环的信息提供于Chen Z Y，He C Y，Ehrhardt A，Kay M A.Mol Ther.2003 September；8(3)：495-500和Minicircle DNAvectors achieve sustained expression reflected by active chromatin andtranscriptional level.Gracey Maniar L E，Maniar J M，Chen Z Y，Lu J，Fire A Z，KayM A.Mol Ther.2013 January；21(1)：131-8中。
作为一个非限制性实例，微环DNA载体可如下产生。包含编码的黏合素编码序列以及用于其表达的调节元件的表达盒侧接重组酶的连接位点。编码重组酶的序列位于表达盒的外部并且包含用于诱导型表达的元件(例如，如诱导型启动子)。在诱导重组酶表达时，载体DNA被重组，产生两个独特的环状DNA分子。一个环状DNA分子相对较小，形成包含编码的黏合素的表达盒的微环；该微环DNA载体不含任何细菌DNA序列。第二个环状DNA序列包含其余的载体序列，包括细菌序列和编码重组酶的序列。然后可单独地分离和纯化包含编码的黏合素序列的微环DNA。在一些实施方案中，可使用类似于pBAD.φ.C31.hFIX和pBAD.φ.C31.RHB的质粒产生微环DNA载体。参见，例如，Chen et al.(2003)Mol.Ther.8：495-500。
可用于产生微环DNA载体的示例性重组酶包括但不限于链霉菌属(Streptomyces)噬菌体φ31整合酶、Cre重组酶以及λ整合酶/DNA拓扑异构酶IV复合物。这些重组酶中的每一个均催化独特位点之间的重组。例如，φ31整合酶催化相应的attP与attB位点之间的重组，Cre重组酶催化loxP位点之间的重组，以及λ整合酶/DNA拓扑异构酶IV复合物催化噬菌体λattP与attB位点之间的重组。在一些实施方案中，例如如在不存在λ蛋白的情况下用φ31整合酶或用λ整合酶，重组酶介导不可逆反应以产生独特的环状产物群，并因此获得高产率。在另一些实施方案中，例如如在存在λ蛋白的情况下用Cre重组酶或用λ整合酶，重组酶介导可逆反应以产生环状产物的混合物，并因此获得较低产率。通过Cre重组酶的可逆反应可通过使用突变loxP71和loxP66位点来操纵，所述位点以高效率重组以在微环分子上产生功能受损的P71/66位点，以及在微环分子上产生野生型loxP位点，从而使平衡移向产生微环DNA产物。
已公布的美国申请20170342424也描述了利用亲本质粒的系统，该亲本质粒暴露于在重组位点引起重组的酶，从而形成(i)包含编码的黏合素序列的微环和(ii)包含亲本质粒的其余部分的微质粒。一个重组位点在5’端被修饰，使得其与酶的反应比野生型位点效率更低，并且另一个重组位点在3’端被修饰，使得其与酶的反应比野生型位点效率更低，并且另一个重组位点在3’端被修饰，使得其与酶的反应比野生型位点效率更低，在重组之后两个经修饰位点均位于微环中。这有利于微环的形成。
c.RNA介导的编码的黏合素基因转移
本公开内容的编码的PD-L1黏合素剂的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(threose nucleic acid、TNA)、乙二醇核酸(glycol nucleic acid，GNA)、肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、锁核酸(lockednucleic acid，LNA，包括具有β-D-ribo构型的LNA、具有a-L-ribo构型的a-LNA(LNA的非对映体)、具有2’-氨基官能化的2’-氨基-LNA以及具有2’-氨基官能化的2’-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ethylene nucleic acid，ENA)、环己烯基核酸(cyclohexenyl nucleic acid，CeNA)或杂交体或者其组合。
mRNA提供了用于抗体基因转移的新兴平台，本领域技术人员可使其适于递送本公开内容的编码的黏合素构建体。尽管目前的结果差异很大，但在某些情况下，就产生的血清mAb效价而言，mRNA构建体显示出能够与病毒载体匹敌。在mRNA施用之后数小时内，水平处于治疗相关范围内，与DNA相比，速度显著改变。脂质纳米粒(LNP)用于mRNA转染而不是DNA通常所需的物理方法的应用可在一些实施方案中对应用范围提供显著的优势。
Wolff et al.(1990，同上)在其1990年的研究中发现，除pDNA之外，肌内注射体外转录的(IVT)mRNA还导致编码蛋白质的局部表达。mRNA由于其低稳定性在当时并不像DNA那样被积极地探索。经过过去数年的进展使得mRNA能够赶上DNA和病毒载体作为基因转移的工具。在Sahin et al.(2014)“mRNA-based therapeutics：developing a new class ofdrugs”Nat Rev Drug Discov.13(10)：759-80中进行了综述。从概念上讲，这些表达平台存在数个差异。mRNA无需进入细胞核中即可发挥功能。一旦其到达细胞质，mRNA即刻翻译。基于mRNA的治疗剂与DNA或病毒载体介导的基因转移相比更加瞬时地表达，并且不会在宿主基因组中引起插入诱变的风险。mRNA产生相对简单且便宜。就施用而言，可使用电穿孔增强mRNA摄取。Broderick et al.2017“Enhanced delivery of DNA or RNA vaccines byelectroporation”Methods Mol Biol.2017；1499：193-200。然而，大多数焦点都集中在非物理转染方法上。事实上，已经开发了多种mRNA复合制剂，包括脂质纳米粒(LNP)，其已被证明对于在多种组织中施用和i.v施用是安全且非常有效的mRNA载体。Pardi et al.2015“Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipidnanoparticles to mice by various routes”J Control Release 217：345-51。与该进展一致，IVT mRNA已达到临床评价的阶段。
Beissert et al.WO2017162266“RNA Replicon for Versatile and EfficientGene Expression”描述了适合于有效表达本公开内容的黏合素的试剂和方法，例如适合于预防和治疗肿瘤的免疫治疗性治疗的试剂和方法。例如，可将黏合素剂编码序列提供为包含5’复制识别序列(例如来自甲病毒的5’复制识别序列)的RNA复制子。在一些实施方案中，RNA复制子包含(经修饰的)5’复制识别序列和编码黏合素剂的开放阅读框，所述开放阅读框特别地位于所述5’复制识别序列的下游使得所述5’复制识别序列与所述开放阅读框不重叠，例如5’复制识别序列不包含功能性起始密码子并且在一些实施方案中不包含任何起始密码子。最优选地，编码黏合素剂的开放阅读框的起始密码子位于RNA复制子的5’→3’方向上。
在一些实施方案中，为了防止免疫活化，可将经修饰的核苷并入到体外转录的mRNA中。在一些实施方案中，IVT RNA可以是5’加帽的，例如m7G5’ppp5’G2’-O-Met加帽的IVT。通过去除双链RNA可确保经修饰mRNA的有效翻译。此外，可对5’和3’UTR以及poly(A)尾进行优化以提高胞内稳定性和翻译效率。参见，例如，Stadler et al.(2017)NatureMedicine 23：815-817和Kariko et al.WO/2017/036889“Method for ReducingImmunogenicity of RNA”。
在一些实施方案中，编码PD-L1黏合素剂的mRNA可包含至少一种本文中所述的化学修饰。作为一个非限制性实例，化学修饰可以是1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶或者1-甲基假尿苷和5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，仅使用体外转录(IVT)酶合成方法制备的编码一种或更多种本公开内容的PD-L1黏合素剂的线性多核苷酸被称为“IVT多核苷酸”。制备IVT多核苷酸的方法是本领域已知的，并且描述于PCT申请WO2013/151666中，其内容通过引用整体并入本文。
在另一个实施方案中，编码本公开内容的PD-L1黏合素剂的多核苷酸具有在尺寸和/或化学修饰模式、化学修饰位置、化学修饰百分比或化学修饰群方面不同的部分或区域，并且前述的组合被称为“嵌合多核苷酸”。根据本公开内容的“嵌合体”是具有两个或更多个不一致或异质的部分或区域的实体。本文中使用的多核苷酸的“部分”或“区域”被定义为小于多核苷酸全长的多核苷酸的任何部分。这样的构建体教导于例如PCT申请WO2015/034928中。
在又一个实施方案中，为环状的本公开内容的多核苷酸被称为“环状多核苷酸”或“circP”。本文中使用的“环状多核苷酸”或“circP”意指基本上类似于RNA发挥作用并具有RNA的特性的单链环状多核苷酸。术语“环状”还意指涵盖circP的任何二级或三级构型。这样的构建体教导于例如PCT申请WO2015/034925和WO2015/034928中，其中每一个的内容均通过引用整体并入本文。
可用于编码本公开内容的PD-L1黏合素剂的示例性mRNA(和另一些多核苷酸)包括可从例如以下的说明书和附图中改编的那些：PCT公布WO2017/049275、WO2016/118724、WO2016/118725、WO2016/011226、WO2015/196128、WO/2015/196130、WO/2015/196118、WO/2015/089511、和WO2015/105926(后者的标题为“Polynucleotides for the In vivoProduction Of Antibodies”)，其各自通过引用并入本文。
如下所述，电穿孔是用于将mRNA或其他多核苷酸引入到细胞中的一种示例性方法。
含脂质的纳米粒组合物已被证明有效地作为多种RNA(和本文中所述的相关多核昔酸)进入细胞和/或胞内区室的运输载剂。这些组合物通常包含一种或更多种“阳离子的”和/或可电离的脂质，磷脂包括多不饱和脂质，结构脂质(例如，固醇)和包含聚乙二醇的脂质(PEG脂质)。阳离子的和/或可电离的脂质包括，例如可容易地质子化的含胺脂质。
d.编码的黏合素构建体向靶细胞中的递送
基因递送系统向宿主细胞中的引入可通过本领域技术人员已知的多种方法进行。
在基于病毒载体构建来构建本发明的基因递送系统的情况下，递送可如本领域已知的常规感染方法进行。
增强递送病毒和非病毒编码的黏合素构建体二者的物理方法包括电穿孔(Neumann，E.et al.，EMBO J.，1：841(1982)；和Tur-Kaspa et al.，Mol.Cell Biol.，6：716-718(1986))；基因轰击(bombardment)(Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：9568-9572(1990))，其中将DNA加载到(例如，金)颗粒上并迫使实现DNA向细胞中的渗透；声穿孔；磁转染；流体动力学递送等，所有这些均是本领域技术人员已知的。
电穿孔
在过去的数年中，用于体内产生蛋白质的质粒DNA递送技术有了很大的进步。这包括密码子优化以在人细胞中表达，RNA优化以提高mRNA稳定性以及在核糖体水平上更有效的翻译，特定前导序列的添加以增强翻译效率，合成插入物的创建以进一步增强体内产生和改进的自适应电穿孔(electroporation，EP)递送方案的使用以改善体内递送。EP通过产生使DNA更高效地进入细胞中的电场来协助质粒DNA的递送。体内电穿孔是已成功地用于将质粒DNA有效递送至许多不同组织的基因递送技术。Kim et al.“Gene therapy usingplasmid DNA-encoded anti-HER2 antibody for cancers that overexpress HER2”(2016)Cancer Gene Ther.23(10)：341-347教导了用于质粒的肌内注射和体内电穿孔的载体和电穿孔系统，其导致血清中高且持续的抗体表达；Kim et al.的质粒和电穿孔系统可容易地适于用于表达本公开内容的编码的PD-L1结合黏合素的质粒的体内递送。
因此，在本公开内容的特定的一些实施方案中，通过电穿孔将编码的黏合素构建体引入到靶细胞中。
通过电穿孔进行的组合物的施用可使用电穿孔装置完成，该电穿孔装置可配置成向哺乳动物的期望组织递送有效地引起在细胞膜中形成可逆孔的能量脉冲，并且优选地，所述能量脉冲是类似于由使用者输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置可包含电穿孔组件和电极装置或手柄装置。电穿孔组件可包含并并入电穿孔装置的多种元件中的一个或更多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报道元件、通信端口、存储器组件(memory component)、电源和电源开关。电穿孔可使用体内电穿孔装置，例如CELLECTRA EP系统(VGX Pharmaceuticals，Blue Bell，Pa.)或Elgen电穿孔仪(Genetronics，San Diego，Calif.)来完成以促进质粒对细胞的转染。
电穿孔组件可作为电穿孔装置的一个元件发挥作用，而其他元件是与电穿孔组件连通的分开的元件(或组件)。电穿孔组件可作为电穿孔装置的多于一个元件发挥作用，其可与与电穿孔组件分开的电穿孔装置的另一些元件连通。作为一种机电或机械装置的一部分而存在的电穿孔装置的元件可不受限制，因为所述元件可作为一个装置或作为彼此连通的分开的元件发挥作用。电穿孔组件可能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包含反馈机构(feedback mechanism)。电极装置可包含在空间布置中具有多个电极的电极阵列，其中所述电极装置接收来自电穿孔组件的能量脉冲并通过电极将其递送至期望组织。多个电极中的至少一个在能量脉冲的递送期间是中性的，并且测量期望组织中的阻抗并将阻抗传达至电穿孔组件。反馈机构可接收所测量的阻抗并且可调节由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
多个电极可以以分散化模式递送能量脉冲。多个电极可在程序序列下通过控制电极以分散化模式递送能量脉冲，并且由使用者将程序序列输入至电穿孔组件。程序序列可包含按顺序递送的多个脉冲，其中所述多个脉冲中的每个脉冲由至少两个活性电极与测量阻抗的一个中性电极一起递送，并且其中所述多个脉冲中的后续脉冲通过至少两个活性电极中的另一个与测量阻抗的一个中性电极一起递送。
反馈机构可通过硬件或软件来执行。反馈机构可通过模拟闭环电路执行。反馈每50微秒、20微秒、10微秒或1微秒发生，但在一些实施方案中是实时反馈或瞬时的(即，基本上是瞬时的，如通过用于确定响应时间的可用技术所确定的)。中性电极可测量期望组织中的阻抗并将阻抗传达至反馈机构，并且反馈机构响应于阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持在类似于预设电流的值。反馈机构可在能量脉冲的递送期间连续且瞬时地维持电流恒定。
可有助于对本公开内容的编码的黏合素构建体的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的一些实例包括描述于以下中的那些：美国专利NO：7,245,963；6,302,874；5,676,646；6,241,701；6,233,482；6,216,034；6,208,893；6,192,270；6,181,964；6,150,148；6,120,493；6,096,020；6,068,650和5,702,359，其内容通过引用整体并入本文。电穿孔可通过微创装置进行。
在一些实施方案中，电穿孔使用微创电穿孔装置(minimally invasiveelectroporation device，“MID”)进行。该装置可包含空心针、DNA盒和流体递送部件，其中所述装置适于在使用中致动流体递送部件以便在将针插入到体组织中期间同时(例如，自动地)将编码的黏合素核酸构建体注射到体组织中。这样做的优点是，在插入针的同时逐渐地注射DNA和相关流体的能力会导致通过体组织的流体更加均匀地分布。由于所注射的DNA在较大区域上分布，因此可减轻注射期间所经历的疼痛。
MID可在不使用针的情况下将编码的黏合素核酸构建体注射到组织中。MID可以以使得核酸刺穿组织表面并进入下面的组织和/或肌肉这样的力，将编码的黏合素核酸构建体作为小流或射流(jet)注射。小流或射流后面的力可通过在顷刻(a fraction of asecond)内使压缩气体(例如二氧化碳)通过微孔的膨胀来提供。微创电穿孔装置及其使用方法的一些实例描述于以下中：公布的美国专利申请No.20080234655；美国专利No.6,520,950；美国专利No.7,171,264；美国专利No.6,208,893；美围专利No.6,009,347；美国专利No.6,120,493；美国专利No.7,245,963；美国专利No.7,328,064；和美国专利No.6,763,264，其中每一个的内容均通过引用并入本文。
MID可包含注射器，该注射器产生无痛地刺穿组织的高速液体射流。这样的无针注射器是可商购获得的。可在本文中使用的无针注射器的一些实例包括描述于美国专利NO：3,805,783；4,447,223；5,505,697；和4,342,310中的那些，其中每一个的内容均通过引用并入本文。
可使用无针注射器，通常通过以足以引起核酸渗透到组织中的力使组织表面与注射器接触以便致动对药剂射流的递送来将适合于直接或间接电转运形式的期望的编码的黏合素核酸构建体引入(例如，注射)到待治疗的组织中。例如，如果待治疗的组织是黏膜、皮肤或肌，则分别将足以引起药剂渗透通过角质层并进入真皮层中，或者进入下面的组织和肌的力向黏膜或皮肤表面投射药剂。无针注射器非常适合将编码的黏合素核酸构建体递送至所有类型的组织，包括进入肿瘤中(瘤内递送)。
MID可具有电穿孔组织的针电极。通过在例如以矩形或方形图案设置的多电极阵列中的多个电极对之间产生脉冲，提供了与在一个电极对之间产生脉冲相比改进的结果。例如在标题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利No.5,702,359中公开了一种针阵列，其中在治疗性治疗期间可对多个针对进行脉冲。在那个申请(其通过引用并入本文，如同完全阐述一样)中，针以环状阵列布置，但是具有连接器和切换装置，其能够在相对的针电极对之间产生脉冲。可使用用于将编码的黏合素核酸构建体递送至细胞的针电极对。这样的装置和系统描述于美国专利No.6,763,264中，其内容通过引用并入本文。或者，可使用单针装置，该单针装置允许用类似于正常注射针的单针注射DNA并进行电穿孔，以及施加比通过当前使用的装置递送的脉冲更低电压的脉冲，从而降低患者所经历的电感觉。
MID可包含一个或更多个电极阵列。所述阵列可包含相同直径或不同直径的两个或更多个针。所述针可均匀或不均匀地间隔开。所述针可以为0.005英寸至0.03英寸，0.01英寸至0.025英寸；或0.015英寸至0.020英寸。所述针的直径可以为0.0175英寸。所述针可以以0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更大的距离间隔开。
MID可由脉冲发生器和两个或更多个针疫苗注射器组成，它们可在单步骤中递送编码的黏合素核酸构建体和电穿孔脉冲。脉冲发生器可允许通过闪存卡操作的个人计算机对脉冲和注射参数进行灵活的编程，以及全面记录和存储电穿孔和患者数据。脉冲发生器可在短时间段期间递送多个伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送3个持续时间为100毫秒的15伏特脉冲。这样的MID的一个实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统，其描述于美国专利No.7,328,064中，其内容通过引用并入本文。
MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Plymouth Meeting，PA)装置和系统，其是模块化电极系统，其有助于将大分子(例如编码的黏合素核酸构建体)引入到身体中的所选择组织的细胞中。模块化电极系统可包含多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒定电流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；以及电源。操作者可抓住安装在支持结构上的多个针电极并将其牢固地插入到身体或植物中的所选择组织中。然后通过皮下注射针将核酸递送到所选择组织中。可编程恒定电流脉冲控制器被激活，并且将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲有助于将核酸引入到多个电极之间的细胞中。通过借助于恒定电流脉冲限制组织中的功率耗散使由于细胞过热引起的细胞死亡最小化。Cellectra装置和系统描述于美国专利No.7,245,963中，其内容通过引用并入本文。
MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包含提供空心针的装置；以及流体递送部件，其中仪器适于在使用中致动所述流体递送部件以在将针插入到所述体组织中期间，同时(例如自动)将流体(本文中所述的编码的黏合素核酸构建体)注射到体组织中。优点是在插入针的同时逐渐地注射流体的能力会导致通过体组织的流体更加均匀地分布。还认为由于所注射流体的体积在较大区域上分布，因此减轻了注射期间所经历的疼痛。
另外，流体的自动注射有助于对所注射流体的实际剂量进行自动监测和登记。该数据可由控制单元存储以用于记录目的，如果期望的话。
将理解的是，注射速率可以是线性的或非线性的，并且注射可在将针插入穿过待治疗对象的皮肤之后并且在将它们进一步插入到体组织中时进行。
可通过本公开内容的装置向其中注射流体的合适组织包括肿瘤组织、皮肤和其他上皮组织、肝组织和肌组织，仅作为一些实例。
所述装置还包含用于引导针插入到体组织中的针插入部件。流体注射的速率由针插入的速率控制。这具有的优点是，可控制针插入和流体注射二者使得插入速率可与所期望的注射速率匹配。这也使得所述装置对于使用者来说更易于操作。如果期望的话，可提供用于将针自动插入到体组织中的部件。
使用者可选择何时开始注射流体。然而，理想地，当针的尖端已到达靶组织时开始注射，并且所述装置可包含用于感测何时针已插入至足够的深度以开始进行流体注射的部件。这意味着，当针已到达所期望的深度(其通常将是肌组织开始处的深度)时，可提示自动开始流体的注射。肌组织开始处的深度可例如被认为是预设的针插入深度，例如4mm的值，这将被认为足以使针穿过皮层。
感测部件可包含超声探头。感测部件可包含用于感测阻抗或电阻的变化的部件。在这种情况下，所述部件本身可能不记录针在体组织中的深度，而是会适于感测当针从不同类型的体组织移动到肌中时阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个均提供了相对准确且易于操作的感测可开始注射的部件。如果期望的话，可还记录针的插入深度，并且可将其用于控制流体注射使得当记录针插入的深度时确定待注射流体的体积。
所述装置可还包含：用于支持针的基底；以及用于将基底接纳在其中的壳体，其中基底可相对于壳体移动使得当基底处于相对于壳体的第一向后位置时，针缩回壳体内，并且当基底处于壳体内的第二向前位置时，针伸出壳体。这对于使用者是有利的，因为可将壳体对准在患者的皮肤上，并随后可通过将壳体相对于基底移动而将针插入到患者的皮肤中。
如上所述，可期望实现受控制的流体注射速率使得在将针插入到皮肤中时流体在针的整个长度上均匀地分布。流体递送部件可包含适于以受控制速率注射流体的活塞驱动部件。活塞驱动部件可例如由伺服电机致动。然而，活塞驱动部件可通过基底相对于壳体在轴向上移动来致动。将理解的是，可提供用于流体递送的替代部件。因此，例如，可在注射器和活塞系统的位置处提供可以以受控制或不受控制的速率被挤压用于流体递送的密闭容器。
上述装置可用于任何类型的注射。然而，预想其特别地可用于电穿孔领域，并因此其还可包含用于向针施加电压的部件。这使得针不仅待用于注射，而且在电穿孔期间用作电极。这是特别有利的，因为这意味着将电场施加至与所注射流体相同的区域。传统上，关于电穿孔存在的问题在于很难将电极与先前注射的流体精确对准，并因此使用者倾向于在更大区域上注射比所需更大的流体体积并在更高的区域上施加电场以尝试确保所注射物质与电场之间重叠。使用本公开内容，在实现电场与流体之间的良好配合的同时，可减小所注射流体的体积和所施加电场的大小二者。
Draghia-Akli，et al.的美国专利No.7,245,963描述了模块化电极系统及其用于促进将生物分子引入到身体或植物中所选择组织的细胞中的用途。模块化电极系统可包含多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒定电流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；以及电源。操作者可抓住安装在支持结构上的多个针电极并将其牢固地插入到身体或植物中的所选择组织中。然后通过皮下注射针将生物分子递送到所选择组织中。可编程恒定电流脉冲控制器被激活，并且将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲有助于将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利No.7,245,963的全部内容在此通过引用并入。
由Smith，et al.提交的美国专利公布2005/0052630描述了可用于有效促进生物分子向身体或植物中所选择组织的细胞中的引入的电穿孔装置。电穿孔装置包含电动力学装置(electro-kinetic device，“EKD装置”)，其操作由软件或固件指定。EKD装置基于使用者控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列的可编程恒定电流脉冲图形，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有针电极阵列的可更换电极盘，用于注射针的中央注射通道，以及可移除的引导盘(guide disk)。美国专利公布2005/0052630的全部内容在此通过引用并入。
描述于美国专利No.7,245,963和美国专利公布2005/0052630中的电极阵列和方法可适于不仅深穿透到组织(例如肌)而且深穿透到其他组织或器官中。由于电极阵列的配置，还将注射针(用于递送选择的生物分子)完全插入到靶器官中，并且在由电极预先划定的区域中垂直于靶组织施用注射。描述于美国专利No.7,245,963和美国专利公布2005/005263中的电极为例如20mm长以及为21号。
体内电穿孔的使用增强了肿瘤组织中质粒DNA摄取，导致在肿瘤内的表达，并将质粒递送至肌组织，导致分泌蛋白(例如细胞因子)的全身性表达(参见，例如，US8026223)。用于在体内将PD-L1黏合素剂转基因电穿孔到细胞中的另外的示例性技术、载体和装置包括PCT公布WO/2017/106795、WO/2016/161201、WO/2016/154473、WO/2016/112359和WO/2014/066655。
通常来说，体内细胞电穿孔所需的电场的大小通常类似于体外细胞所需的场。在一些实施方案中，电场的大小为约10V/cm至约1500V/cm、300V/cm至1500V/cm、或1000V/cm至1500V/cm。或者，较低的场强(约10V/cm至100V/cm，并且更优选约25V/em至75V/cm)，脉冲长度长。例如，当标称电场为约25至75V/cm时，优选的是脉冲长度为约10毫秒。
脉冲长度可为约10秒至约100毫秒。可存在任何期望数目的脉冲，通常是1至100个脉冲/秒。脉冲组之间的延迟可以是任何期望的时间，例如1秒。波形、电场强度和脉冲持续时间还可取决于细胞的类型和经由电穿孔进入细胞的分子的类型。
还涵盖了并入电化学阻抗谱(electrochemical impedance spectroscopy，“EIS”)的电穿孔装置。这样的装置提供了关于体内的实时信息，特别是瘤内电穿孔效率，使得能够对条件进行优化。并入EIS的电穿孔装置的一些实例可见于例如WO2016/161201中，其通过引用在此并入。
本公开内容的编码的黏合素核酸构建体的摄取还可通过也称为雪崩转染(avalanche transfection)的等离子体电穿孔来增强。简单地说，微秒放电在电极表面产生空化微泡(cavitation microbubble)。与与常规电穿孔相关的扩散介导的运输相比，由与磁场组合的塌陷的微泡产生的机械力有助于提高跨细胞膜的运输效率。等离子体电穿孔技术描述于美国专利NO：7,923,251和8,283,171中。该技术也可在体内用于细胞转化。Chaiberg，et al(2006)Investigative Ophthalmology&Visual Science 47：4083-4090；Chaiberg，et al美国专利No 8,101 169，发布于2012年1月24日。
还考虑了另一些替代电穿孔技术。体内核酸递送也可使用冷等离子体进行。等离子体是物质的四种基本状态之一，其他状态是固体、液体和气体。等离子体是未结合的正负粒子的电中性介质(即，等离子体的总电荷为约零)。等离子体可通过加热气体或使其受到强电磁场(通过激光或微波发生器施加)来产生。这降低或提高了电子数目，产生了称为离子的带正电荷或带负电荷的粒子(Luo，et al.(1998)Phys.Plasma 5：2868-2870)，并伴随着分子键的解离(如果存在的话)。
冷等离子体(即，非热等离子体)通过将脉冲的高压信号递送至合适的电极来产生。冷等离子体装置可采取气体喷射装置或介质阻挡放电(dielectric barrierdischarge，DBD)装置的形式。低温等离子体凭借其在相对低的气体温度下提供等离子体而引起了极大的热情和兴趣。在这样的温度下提供等离子体是多种应用感兴趣的，所述应用包括创伤愈合、抗菌过程、多种其他医学治疗和灭菌。如前所述，冷等离子体(即，非热等离子体)通过将脉冲的高压信号递送至合适的电极来产生。冷等离子体装置可采取气体喷射装置、介质阻挡放电(DBD)装置或多频富谐波电源供应器(power supply)的形式。
介质阻挡放电装置依赖于不同的过程来产生冷等离子体。介质阻挡放电(DBD)装置包含被介质层覆盖的至少一个导电电极。电返回路径由接地形成，所述接地可由经受冷等离子体处理的靶基底或者通过为电极提供内置接地来提供。用于介质阻挡放电装置的能量可由高压电源供应器，例如上述的电源供应器来提供。更一般地，能量以脉冲的DC电压的形式输入至介质阻挡放电装置，以形成等离子体放电。借助于介质层，使放电与导电电极分离，并且降低了电极刻蚀和气体加热。脉冲的DC电压可在幅度和频率上变化以实现变化的运行方案。并入了这样的冷等离子体产生原理的任何装置(例如，DBD电极装置)均落入本公开内容的多个实施方案的范围内。
已将冷等离子体用于用外来核酸转染细胞。特别地，肿瘤细胞的转染(参见，例如，Connolly，et al.(2012)Human Vaccines&Immune-therapeutics 8：1729-1733；以及Connolly et al(2015)Bioelectrochemistry 103：15-21)。
在某些举例说明性实施方案中，本公开内容的编码PD-L1黏合素剂的转基因构建体使用电穿孔装置来递送，所述电穿孔装置包含：施加器；从施加器延伸的多个电极，所述电极与覆盖区域相关联；与电极电连通的电源供应器，所述电源供应器配置成向覆盖区域内的细胞产生一个或更多个电穿孔信号；与电极连接的引导构件，其中所述引导构件配置成调节电极的覆盖区域。电极的至少一部分可以以锥形布置定位在施加器内。一个或更多个电穿孔信号可各自与电场相关联。所述装置可还包含与电源供应器和电极连接的电位差计。电位差计可配置成将电场基本上维持在预定范围内。
一个或更多个电穿孔信号可各自与电场相关联。所述装置可还包含与电源供应器和电极连接的电位差计。电位差计可配置成将电场维持在预定范围内，以便显著地阻止覆盖区域内细胞的永久性损伤和/或使疼痛显著地最小化。例如，电位差计可配置成将电场维持在约1300V/cm。
电源供应器可向第一电极提供第一电信号，并向第二电极提供第二电信号。第一电信号和第二电信号可组合以产生具有拍频的波。第一电信号和第二电信号可各自具有单极波形和双极波形中的至少一个。第一电信号可具有第一频率和第一幅度。第二电信号可具有第二频率和第二幅度。第一频率可与第二频率不同或相同。第一幅度可与第二幅度不同或相同。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗患有肿瘤的对象的方法，所述方法包括：用有效剂量的编码PD-L1黏合素剂的质粒注射肿瘤；以及对肿瘤施用电穿孔治疗。在一些实施方案中，电穿孔治疗还包括在约100微秒至约20毫秒的脉冲宽度上施用至少一个为约200V/cm至约1500V/cm的电压脉冲。
在一些实施方案中，质粒(或第二电穿孔质粒)还编码例如选自编码IL-12、IL-15以及IL-12与IL-15的组合的组的至少一种免疫刺激细胞因子。
转染增强制剂
也可将编码的黏合素核酸构建体包封在脂质体中，优选阳离子脂质体(Wong，T.K.et al.，Gene，10：87(1980)；Nicolau and Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190(1982)；以及Nicolau et al.，Methods Enzymol.，149：157-176(1987))或聚合物囊泡(polymersome)(合成脂质体)中，其可与细胞膜相互作用并融合或经历内吞作用以实现核酸向细胞中的转移。DNA还可与聚合物(聚合复合物(polyplex))或与树状聚合物(其可将其负载物直接释放到细胞的细胞质中)形成复合物。
可用于这方面的举例说明性载体包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素、右旋糖酐等的微粒。另一些举例说明性载体包括超分子生物载体，其包含非液体亲水性核(例如，交联的多糖或寡糖)，以及任选地，包含两亲性化合物(例如磷脂)的外层(参见，例如，美围专利No.5,151,254和PCT申请WO 94/20078、WO/94/23701和WO 96/06638)。持续释放制剂内所包含的活性剂的量取决于植入部位、释放的速率和预期持续时间以及待治疗或预防的病症的性质。
可生物降解微球(例如，聚乳酸聚乙醇酸酯)可用作组合物的载体。合适的可生物降解微球公开于例如美国专利NO：4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344；5,407,609和5,942,252中。经修饰的乙型肝炎核心蛋白载体系统(例如WO/99 40934以及其中引用的参考文献中所述的)也可用于许多应用。另一个举例说明性的载体/递送系统采用包含微粒-蛋白质复合物的载体，例如描述于美国专利No.5,928,647中的那些，其在瘤内用于递送PD-L1黏合素的编码序列时可具有提高的益处。
可生物降解的聚合物纳米粒有助于非病毒核酸转移至细胞。小的(约200nm)、带正电荷的(约10mV)颗粒通过阳离子、可水解降解的聚(β-氨基酯)和质粒DNA的自组装形成。
也可通过直接显微注射、暂时的细胞透化(例如，阻遏物和/或激活物与细胞透化剂的共施用)、与膜转位肽的融合等将多核苷酸施用于细胞。
在体外和体内，脂质介导的核酸递送和外来核酸(包括mRNA)的表达已经非常成功。基于脂质的非病毒制剂提供了病毒基因治疗的替代方案。当前的体内脂质递送方法使用皮下、皮内、瘤内或颅内注射。脂质制剂的进展已提高了体内基因转移的效率(参见PCT申请WO 98/07408)。例如，由等摩尔比的1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)和胆固醇构成可显著地增强全身性体内基因转移。DOTAP：胆固醇脂质制剂形成称为“夹心脂质体(sandwich liposome)”的独特结构。据报道，该制剂是内陷双层或“瓶(vase)”结构之间“夹心”DNA。这些脂质结构的有益特征包括正p、由胆固醇导致的胶体稳定性、二维核酸包装和提高的血清稳定性。
阳离子脂质体技术基于具有带正电荷头部集团和疏水性脂质尾部的两亲性脂质与带负电荷的DNA或RNA结合并形成通常通过内吞作用进入细胞的颗粒的能力。一些阳离子脂质体还包含被认为增强哺乳动物细胞对脂质体的摄取的中性共脂质。类似地，另一些聚阳离子(例如聚-1-赖氨酸和聚乙烯亚胺)通过电荷相互作用与核酸复合，并且帮助将DNA或RNA缩合成纳米粒，其随后成为内体介导的摄取的底物。已将这些阳离子-核酸复合物技术中的数种开发为潜在的临床产品，包括与质粒DNA(pDNA)、寡脱氧核苷酸和多种形式的合成RNA的复合物，并将其用作用于本公开内容的编码的黏合素核酸构建体的递送系统的一部分。
本文中公开的编码的黏合素核酸构建体可与用于增强向细胞中的摄取的聚阳离子分子缔合。将核酸构建体与聚阳离子分子复合也有助于包装所述构建体，使得其尺寸减小，这被认为有助于细胞摄取。一旦在内体中，复合物由于较低的pH而解离，并且聚阳离子分子可破坏内体的膜以有助于DNA在其可被降解之前逃逸到细胞质中。初步数据表明，当与聚阳离子分子聚赖氨酸或聚乙烯亚胺复合时，一些核酸构建体实施方案具有与DC相比的向SC中的摄取增强。
可用于与核酸构建体复合的聚阳离子分子的一个实例包括细胞穿透肽(cellpenetrating peptide，CPP)，一些实例包括聚赖氨酸(上文所述)、聚精氨酸和Tat肽。细胞穿透肽(CPP)是小肽，其可与DNA结合并且一旦释放便会穿透细胞膜以促进DNA从内体逃逸至细胞质。CPP的另一个实例涉及称为MPG的27个残基的嵌合肽，不久前已显示其以稳定的方式结合ss-和ds-寡核苷酸，从而形成非共价复合物，该复合物保护核酸免于被DNA酶(DNase)降解并且在体外将寡核苷酸有效地递送至细胞(Mahapatro A，et al.，JNanobiotechnol，2011，9：55)。当检查不同的肽：DNA比例，以及10∶1和5∶1的比例(分别为150nm和1um)时，复合物形成约150nm至1um的小颗粒。另一个CPP涉及经修饰的四肽[包含胍基羰基吡咯(guanidinocarbonylpyrrole，GCP)基团的四赖氨酸(TL-GCP)]，据报道该肽以高亲和力与6.2kb质粒DNA结合，产生700至900nm的带正电荷的聚集体(Li et al.，AgnewChem Int Ed Enl 2015；54(10)：2941-4)。RNA也可被这样的聚阳离子分子复合以用于体内递送。
可与本文中所述的核酸构建体复合的聚阳离子分子的另一些实例包括可商购获得的聚阳离子聚合物，如
Figure BPA0000294876740001411
和体内JET(Polypus-transfection，S.A.，Illkirch，France)。
在一些实施方案中，本公开内容考虑了通过施用包含以下的纳米粒组合物将编码PD-L1黏合素剂的mRNA(或其他多核苷酸)f递送至患者细胞的方法：(i)包含式(I)化合物的脂质组分、磷脂、结构脂质和PEG脂质；以及(ii)mRNA(或其他多核苷酸)f，所述施用包括使所述哺乳动物细胞与所述纳米粒组合物接触，由此将所述mRNA(或其他多核苷酸)f递送至所述细胞。
在一些示例性实施方案中，PEG脂质选自：经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、经PEG修饰的磷脂酸、经PEG修饰的神经酰胺、经PEG修饰的二烷基胺、经PEG修饰的二酰基甘油和经PEG修饰的二烷基甘油。在一些示例性实施方案中，结构脂质选自：胆固醇、粪甾醇(fecosterol)、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽固醇、番茄碱、乌苏酸和α-生育酚。在一些实施方案中，结构脂质是胆固醇。
在一些示例性实施方案中，磷脂包括选自以下的部分：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱，和鞘磷脂。在一些实施方案中，磷脂包括选自以下的一种或更多种脂肪酸部分：月桂酸、豆蔻酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、花生酸、花生四烯酸、植酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。在一些实施方案中，磷脂选自：1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-双十一酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-0-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 1 6.0 PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)，和鞘磷脂。在一些实施方案中，磷脂是DOPE或DSPC。
为了进一步举例说明，磷脂可以是DOPE，并且所述组分可包含约35mol％至约45mol％所述化合物、约10mol％至约20mol％DOPE、约38.5mol％至约48.5mol％结构脂质，以及约1.5mol％PEG脂质。脂质组分可以是约40mol％所述化合物、约15mol％磷脂、约43.5mol％结构脂质，以及约1.5mol％PEG脂质。
在一些实施方案中，脂质组分与PD-L1黏合素剂编码mRNA(或其他多核苷酸)的wt/wt比为约5∶1至约50∶1，或约10∶1至约40∶1。
在一些实施方案中，所述纳米粒组合物的平均尺寸为约50nm至约150nm，或约80nm至约120nm。
在一些实施方案中，所述纳米粒组合物的多分散性指数为约0至约0.18，或约0.13至约0.17。
在一些实施方案中，纳米粒组合物的ζ电势为约-10至约+20mV。
在一些实施方案中，纳米粒组合物还包含选自以下的阳离子和/或可电离的脂质：3-(双十二烷基氨基)-N1，N1，4-三-十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、14，25-双十三烷基-15，18，21，24-四氮杂-八-三十烷(KL25)、1，2-二亚油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1，2-二油烯基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DODMA)，以及(2R)-2-({8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N，N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))。
VI.使用方法和药物组合物
本公开内容的黏合素剂可用于多种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，例如用于癌症的免疫治疗。在一些实施方案中，本文中所述的黏合素剂可用于激活、促进、提高和/或增强免疫应答、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、诱导肿瘤消退、提高肿瘤细胞凋亡和/或降低肿瘤的致瘤性。在一些实施方案中，本公开内容的多肽或药剂也可用于针对病原体(例如病毒)的免疫治疗。在一些实施方案中，本文中所述的黏合素剂可用于抑制病毒感染、降低病毒感染、提高病毒感染的细胞凋亡和/或提高对病毒感染的细胞的杀伤。使用方法可以是体外、离体或体内方法。
本公开内容提供了用于使用黏合素剂在对象中激活免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于使用本文中所述的黏合素剂在对象中促进免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于使用黏合素剂在对象中提高免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于使用黏合素剂在对象中增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高细胞介导免疫。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高Th1型应答。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高T细胞活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高CD4+T细胞活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高CD8+T细胞活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高CTL活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高NK细胞活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高T细胞活性和提高NK细胞活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高CU活性和提高NK细胞活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含抑制或降低Treg细胞的抑制活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含抑制或降低MDSC的抑制活性。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高记忆T细胞百分比的数目。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高长期免疫记忆功能。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答包含提高长期记忆。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答不包含实质性副作用和/或基于免疫的毒性的证据。在一些实施方案中，激活、促进、提高和/或增强免疫应答不包含细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)或细胞因子风暴的证据。在一些实施方案中，免疫应答是抗原刺激的结果。在一些实施方案中，抗原刺激是肿瘤细胞。在一些实施方案中，抗原刺激是癌症。在一些实施方案中，抗原刺激是病原体。在一些实施方案中，抗原刺激是病毒感染的细胞。
用于确定黏合素剂是否激活或抑制免疫应答的体内和体外测定是本领域已知的。
在一些实施方案中，在对象中提高免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的黏合素剂，其中所述黏合素剂结合人PD-L1。在一些实施方案中，在对象中提高免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的黏合素剂，其中所述黏合素剂是含黏合素的抗体或受体陷阱融合多肽，包括与PD-L1特异性结合的黏合素多肽。在一些实施方案中，在对象中提高免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的编码的黏合素，其中所述编码的黏合素当在患者中表达时产生重组黏合素剂多肽，包括抗PD-L1黏合素多肽。
在本文中所述方法的一些实施方案中，激活或增强对肿瘤的持久或长期免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的结合人PD-L1的黏合素剂。在一些实施方案中，激活或增强对肿瘤的持久免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的黏合素剂，其中所述黏合素剂是含黏合素的抗体或受体陷阱融合多肽，包括与PD-L1特异性结合的黏合素多肽。在一些实施方案中，激活或增强对肿瘤的持久免疫应答的方法包括向对象施用治疗有效量的编码的黏合素，其中所述编码的黏合素当在患者中表达时产生重组的黏合素剂多肽，包括抗PD-L1黏合素多肽。
在本文中所述方法的一些实施方案中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持久或长期免疫的方法包括向对象施用治疗有效量的结合人PD-L1的黏合素剂。在一些实施方案中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持续免疫的方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的黏合素剂，其中所述黏合素剂是含黏合素的抗体或受体陷阱融合多肽，包括与PD-L1特异性结合的黏合素多肽。在一些实施方案中，诱导抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的持续免疫的方法包括向对象施用治疗有效量的编码的黏合素，其中所述编码的黏合素当在患者中表达时产生重组的黏合素剂多肽，包括抗PD-L1黏合素多肽。
在本文中所述方法的一些实施方案中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包括向对象施用治疗有效量的结合人PD-L1的黏合素剂。在一些实施方案中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的黏合素剂，其中所述黏合素剂是含黏合素的抗体或受体陷阱融合多肽，包括与PD-L1特异性结合的黏合素多肽。在一些实施方案中，抑制肿瘤复发或肿瘤再生长的方法包括向对象施用治疗有效量的编码的黏合素，其中所述编码的黏合素当在患者中表达时产生重组的黏合素剂多肽，包括抗PD-L1黏合素多肽。
在一些实施方案中，肿瘤表达或过表达由黏合素剂中提供的另外的结合实体以及抗PD-L1黏合素多肽靶向的肿瘤抗原，即，其中所述黏合素剂是双特异性或多特异性剂。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括向对象施用治疗有效量的本文中所述的黏合素剂。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象患有肿瘤，或者对象的肿瘤已被去除。
在一些实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤是选自以下的肿瘤：结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠道肿瘤、黑素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤和头颈肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是结直肠肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是肺肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是胰腺肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是膀胱肿瘤。
为了进一步举例说明，本主题的黏合素剂可用于治疗患有例如以下癌症的患者：骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、维尔姆斯癌(Wilm’s cancer)、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如，小细胞或非小细胞肺癌)、胃癌、结直肠癌、宫领癌、滑膜肉瘤、头领癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤(rhabdoid tumor of the kidney)、尤因肿瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤(primitive neuroectodermal tumor)、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多、血小板增多、特发性肌纤维化(idiopathic myelfibrosis)、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在本公开内容的一些实施方案中，癌症是例如上述种类的转移癌。
在一些实施方案中，癌症是血液学癌症。在一些实施方案中，癌症选自：急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、多发性骨髓瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)和皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)。
本公开内容还提供了药物组合物，其包含本文中所述的黏合素剂以及可药用载剂。在一些实施方案中，药物组合物可用于免疫治疗。在一些实施方案中，药物组合物可用于免疫肿瘤学。在一些实施方案中，所述组合物可用于抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，药物组合物可用于在对象(例如，人患者)中抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，所述组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，药物组合物可用于在对象(例如，人患者)中治疗癌症。
通过将本公开内容的经纯化黏合素剂与可药用载剂(例如，载体或赋形剂)组合来制备制剂以用于储存和使用。本领域技术人员通常将可药用载体、赋形剂和/或稳定剂视为制剂或药物组合物的非活性成分。
在一些实施方案中，将本文中所述的黏合素剂冻干和/或以冻干形式储存。在一些实施方案中，将包含本文中所述黏合素剂的制剂冻干。
合适的可药用载剂包括但不限于无毒缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和另一些有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反荷离子，例如钠；金属络合物，例如锌蛋白络合物；以及非离子表面活性剂，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，22.sup.nd Edition，2012，Pharmaceutical Press，London.)。
本公开内容的药物组合物可以以用于局部或全身治疗的许多种方式施用。可通过表皮或经皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷剂、液体剂和粉末剂表面施用；通过吸入或吹入粉末剂或气雾剂(包括通过雾化器、气管内和鼻内)肺施用；经口施用；或肠胃外施用，包括静脉内、动脉内、瘤内、皮下、腹膜内、肌内(例如，注射或输注)或颅内(例如，鞘内或室内)施用。
治疗制剂可以是单位剂型。这样的制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、水或非水性介质中的溶液剂或混悬剂，或者栓剂。在固体组合物例如片剂中，主要活性成分与药用载体混合。常规的压片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及稀释剂(例如，水)。这些可用于形成固体预制剂组合物，其包含本公开内容的化合物或其无毒可药用盐的均匀混合物。然后将该固体预制剂组合物细分为上述类型的单位剂型。可将制剂或组合物的片剂、丸剂等进行包衣或以其他方式复配以提供具有延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含被外部组分覆盖的内部组合物。此外，所述两种组分可由肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗崩解并允许内部组分完整地通过胃或延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括多种聚合物酸以及聚合物酸与如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的这样的材料的混合物。
也可将本文中所述的黏合素剂包载(entrap)在微胶囊中。这样的微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒和纳米囊)或在粗乳剂中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊，如在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，22.sup.ndEdition，2012，Pharmaceutical Press，London中所述。
在一些实施方案中，药物制剂包含与脂质体复合的本公开内容的黏合素剂。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可通过用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine，PEG-PE)的脂质组合物进行逆相蒸发来产生。可将脂质体通过限定孔尺寸的滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。
在一些实施方案中，可产生包含本文中所述黏合素剂的持续释放制剂。合适的持续释放制剂实例包括包含黏合素剂的固体疏水聚合物的半透性基质，其中所述基质为成形制品的形式(例如，膜剂或微胶囊剂)。持续释放基质的一些实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯、L-谷氨酸与7L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOT.TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)构成的可注射微球))、乙酸异丁酸蔗糖酯，以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。
在一些实施方案中，除施用本文中所述黏合素剂之外，所述方法或治疗还包括施用至少一种另外的免疫应答刺激剂。在一些实施方案中，另外的免疫应答刺激剂包括但不限于集落刺激因子(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony stimulating factor，G-CSF)、干细胞因子(stem cell factor，SCF))、白介素(例如，IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、检查点抑制剂、阻断免疫抑制功能的抗体(例如，抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体)、toll样受体(例如，TLR4、TLR7、TLR9)或B7家族成员(例如，CD80、CD86)。所述另外的免疫应答刺激剂可在黏合素剂的施用之前、同时和/或之后施用。还提供了包含黏合素剂和免疫应答刺激剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述免疫应答刺激剂包含1、2、3或更多种免疫应答刺激剂。
在一些实施方案中，除施用本文中所述的黏合素剂之外，所述方法或治疗还包括施用至少一种另外的治疗剂。所述另外的治疗剂可在黏合素剂的施用之前、同时和/或之后施用。还提供了包含黏合素剂和另外的治疗剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂包含1、2、3或更多种另外的治疗剂。
用两种或更多种治疗剂进行的组合治疗通常使用通过不同作用机制发挥作用的药剂，尽管这不是必需的。使用具有不同作用机制的药剂进行组合治疗可产生累加或协同作用。组合治疗可使得每种药剂的剂量低于单一治疗中使用的剂量，从而降低了毒副作用和/或提高了黏合素剂的治疗指数。组合治疗可降低将产生抗性癌细胞的可能性。在一些实施方案中，组合治疗包含影响免疫应答(例如，增强或激活应答)的治疗剂和影响(例如，抑制或杀伤)肿瘤/癌细胞的治疗剂。
在本文中所述方法的一些实施方案中，本文中所述黏合素剂与至少一种另外的治疗剂的组合产生累加或协同结果。在一些实施方案中，组合治疗导致黏合素剂的治疗指数提高。在一些实施方案中，组合治疗导致另外的治疗剂的治疗指数提高。在一些实施方案中，组合治疗导致黏合素剂的毒性和/或副作用降低。在一些实施方案中，组合治疗导致另外的治疗剂的毒性和/或副作用降低。
可用的治疗剂种类包括，例如抗微管蛋白剂、奥瑞他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学治疗敏化剂、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、lexitropsin、亚硝基脲、顺铂(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、辐射敏化剂、甾体、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在一些实施方案中，第二治疗剂是烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可与本文中所述黏合素剂组合施用的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方案中，所述方法或治疗涉及与化学治疗剂组合或与化学治疗剂的混合物(cocktail)组合施用本公开内容的黏合素剂。用黏合素剂进行的治疗可在化学治疗剂的施用之前、同时或之后进行。组合施用可包括以单药物制剂或使用分开的制剂共施用，或者以任一种顺序但通常在一定时期内连续施用，使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。这样的化学治疗剂的制备和给药方案可根据制造商的说明来使用或由技术人员凭经验确定。这样的化学治疗剂的制备和给药方案还描述于The Chemotherapy Source Book，4.sup.th Edition，2008，M.C.Perry，Editor，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa中。
可用于本公开内容的化学治疗剂包括但不限于烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌、卡波醌、美妥替派和乌瑞替哌；乙撑亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(tfimethylolmelamime)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素类，例如阿克拉霉素、放线菌素、Authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素(Caminomycin)、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、多西氟尿啶、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类，例如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素(anti-adrenal)，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝斯布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西左非兰(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他塞(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨(XELODA)；以及任何上述的可药用盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括对调节或抑制激素对肿瘤的作用发挥作用的抗激素剂，例如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、考昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮、和托瑞米芬(FARESTON)；以及抗雄激素类，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的可药用盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，另外的治疗剂是顺铂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是卡铂。
在本文中所述方法的一些实施方案中，化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶酶(例如，拓扑异构酶I或II)的作用的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊苷、盐酸拓扑替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康，以及这些中的任一个的可药用盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，另外的治疗剂是伊立替康。
在一些实施方案中，化学治疗剂是抗代谢物。抗代谢物是具有类似于正常生物化学反应所需的代谢物的结构，但差异足以干扰细胞的一种或更多种正常功能(例如细胞分裂)的化学物质。抗代谢物包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、替加氟、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷(5-azacytidine)、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨、和克拉屈滨，以及这些中的任一个的可药用盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，另外的治疗剂是吉西他滨。
在本文中所述方法的一些实施方案中，化学治疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是紫杉烷。在一些实施方案中，所述药剂是紫杉醇或多西他塞，或者紫杉醇或多西他塞的可药用盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述药剂是紫杉醇(TAXOL)、多西他塞(TAXOTERE)、白蛋白结合紫杉醇(nab-紫杉醇；ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代实施方案中，抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨或长春地辛，或者其可药用盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或者有丝分裂激酶的抑制剂例如Aurora A或Plk1。在一些实施方案中，另外的治疗剂是紫杉醇。在一些实施方案中，另外的治疗剂是nab-紫杉醇。
在本文中所述方法的一些实施方案中，另外的治疗剂包含药剂，例如小分子。例如，治疗可涉及本公开内容的黏合素剂与用作针对肿瘤相关抗原的抑制剂的小分子，包括但不限于EGFR、HER2(ErbB2)和/或VEGF的组合施用。在一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与选自以下的蛋白激酶抑制剂组合施用：吉非替尼(IRESSA)、厄洛替尼(TARCEVA)、舒尼替尼(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(RECENTIN)、索拉非尼(NEXAVAR)和帕唑帕尼(pazopanib)(GW786034B)。在一些实施方案中，另外的治疗剂包含mTOR抑制剂。
在本文中所述方法的一些实施方案中，另外的治疗剂是抑制癌症干细胞途径的小分子。在一些实施方案中，另外的治疗剂是Notch途径的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是Wnt途径的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是BMP途径的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是Hippo途径的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是mTOR/AKR途径的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是RSPO/LGR途径的抑制剂。
在本文中所述方法的一些实施方案中，另外的治疗剂包含生物分子，例如抗体。例如，治疗可涉及本公开内容的黏合素剂与针对肿瘤相关抗原的抗体，包括但不限于结合EGFR、HER2/ErbB2和/或VEGF的抗体的组合施用。在一些实施方案中，另外的治疗剂是对癌症干细胞标志物具有特异性的抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是结合Notch途径的组分的抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是结合Wnt途径的组分的抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抑制癌症干细胞途径的抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是Notch途径的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是Wnt途径的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是BMP途径的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抑制β-联蛋白信号传导的抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是作为血管生成抑制剂的抗体(例如，抗-VEGF或VEGF受体抗体)。在一些实施方案中，另外的治疗剂是贝伐单抗(AVASTIN)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、帕妥珠单抗(OMNITARG)、帕尼单抗(VECTIBIX)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(ERBITUX)。
在本文中所述方法的一些实施方案中，另外的治疗剂是调节免疫应答的抗体。在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体或抗TIGIT抗体。
此外，用本文中所述黏合素剂进行的治疗可包括与另一些生物分子，例如一种或更多种细胞因子(例如，淋巴因子、白介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)的组合治疗，或者可伴随有手术去除肿瘤、去除癌细胞或治疗医生认为必要的任何其他治疗。在一些实施方案中，另外的治疗剂是免疫应答刺激剂。
在本文中所述方法的一些实施方案中，可将黏合素剂与选自以下的生长因子组合：肾上腺髓质素(adrenomedullin，AM)、血管生成素(angiopoietin，Ang)、BMP、BDNF、EGF、红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、FGF、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、迁移刺激因子、肌生成抑制蛋白(GDF-8)、NGF、神经营养蛋白、PDGF、血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、P1GF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。
在本文中所述方法的一些实施方案中，另外的治疗剂是免疫应答刺激剂。在一些实施方案中，免疫应答刺激剂选白：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素3(IL-3)、白介素12(IL-12)、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配体、抗CD3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体、抗LAG-3抗体和抗TIM-3抗体。
在本文中所述方法的一些实施方案中，免疫应答刺激剂选自：PD-1活性的调节剂、PD-L2活性的调节剂、CTLA-4活性的调节剂、CD28活性的调节剂、CD80活性的调节剂、CD86活性的调节剂、4-1BB活性的调节剂、OX40活性的调节剂、KIR活性的调节剂、Tim-3活性的调节剂、LAG3活性的调节剂、CD27活性的调节剂、CD40活性的调节剂、GITR活性的调节剂、TIGIT活性的调节剂、CD20活性的调节剂、CD96活性的调节剂、IDO1活性的调节剂、细胞因子、趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的成员以及免疫刺激寡核苷酸。
在本文中所述方法的一些实施方案中，免疫应答刺激剂选自：PD-1拮抗剂、PD-L2拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、CD80拮抗剂、CD86拮抗剂、KIR拮抗剂、Tim-3拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIGIT拮抗剂、CD20拮抗剂、CD96拮抗剂和/或IDO1拮抗剂。
在本文中所述方法的一些实施方案中，PD-1拮抗剂是特异性结合PD-1的抗体。在一些实施方案中，结合PD-1的抗体是KEYTRUDA(MK-3475)、皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、纳武单抗(nivolumab)(OPDIVO、BMS-936558、MDX-1106)、MEDI0680(AMP-514)、REGN2810、BGB-A317、PDR-001或STI-A1110。在一些实施方案中，结合PD-1的抗体描述于PCT公布WO 2014/179664中，例如，被标识为APE2058、APE1922、APE1923、APE1924、APE 1950或APE1963的抗体，或者包含这些抗体中的任一种的CDR区的抗体。在另一些实施方案中，PD-1拮抗剂是包含PD-L2的融合蛋白，例如AMP-224。在另一些实施方案中，PD-1拮抗剂是肽抑制剂，例如AUNP-12。
在一些实施方案中，CTLA-4拮抗剂是特异性结合CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗(YERVOY)或曲美木单抗(tremelimumab)(CP-675，206)。在一些实施方案中，CTLA-4拮抗剂是CTLA-4融合蛋白，例如KAHR-102。
在一些实施方案中，LAG3拮抗剂是特异性结合LAG3的抗体。在一些实施方案中，结合LAG3的抗体是IMP701、IMP731、BMS-986016、LAG525和GSK2831781。在一些实施方案中，LAG3拮抗剂包括可溶性LAG3受体，例如，IMP321。
在一些实施方案中，KIR拮抗剂是特异性结合KIR的抗体。在一些实施方案中，结合KIR的抗体是立鲁单抗(lirilumab)。
在一些实施方案中，免疫应答刺激剂选自：CD28激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD27激动剂、CD80激动剂、CD86激动剂、CD40激动剂和GITR激动剂。在一些实施方案中，OX40激动剂包含OX40配体或其OX40结合部分。例如，OX40激动剂可以是MEDI6383。在一些实施方案中，OX40激动剂是特异性结合OX40的抗体。在一些实施方案中，结合OX40的抗体是MEDI6469、MEDI0562或MOXR0916(RG7888)。在一些实施方案中，OX40激动剂是能够表达OX40配体的载体(例如，表达载体或病毒，例如腺病毒)。在一些实施方案中，OX40表达载体是Delta-24-RGDOX或DNX2401。
在一些实施方案中，4-1BB(CD137)激动剂是结合分子，例如抗运载蛋白(anticalin)。在一些实施方案中，抗运载蛋白是PRS-343。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是特异性结合4-1BB的抗体。在一些实施方案中，结合4-1BB的抗体是PF-2566(PF-05082566)或乌瑞芦单抗(urelumab)(BMS-663513)。
在一些实施方案中，CD27激动剂是特异性结合CD27的抗体。在一些实施方案中，结合CD27的抗体是伐立鲁单抗(varlilumab)(CDX-1127)。
在一些实施方案中，GITR激动剂包含GITR配体或其GITR结合部分。在一些实施方案中，GITR激动剂是特异性结合GITR的抗体。在一些实施方案中，结合GITR的抗体是TRX518、MK-4166或INBRX-110。
在一些实施方案中，免疫应答刺激剂包括但不限于细胞因子，例如趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子以及肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员。在一些实施方案中，免疫应答刺激剂包括免疫刺激寡核苷酸，例如CpG二核苷酸。
在一些实施方案中，免疫应答刺激剂包括但不限于抗PD-1抗体、抗PD-L2抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗4-1BB抗体、抗OX40抗体、抗KIR抗体、抗Tim-3抗体、抗LAG3抗体、抗CD27抗体、抗CD40抗体、抗GITR抗体、抗TIGIT抗体、抗CD20抗体、抗CD96抗体或抗IDO1抗体。
在一些实施方案中，本文中公开的Affime剂可单独使用或与放射治疗联合使用。
在一些实施方案中，本文中公开的Affime剂可单独使用或与靶向治疗联合使用。靶向治疗的一些实例包括：激素治疗；信号转导抑制剂(例如，EGFR抑制剂，例如西妥昔单抗(Erbitux)和厄洛替尼(Tarceva))；HER2抑制剂(例如，曲妥珠单抗(Herceptin)和帕妥珠单抗(Perjeta))；BCR-ABL抑制剂(例如，伊马替尼(Gleevec)和达沙替尼(Sprycel))；ALK抑制剂(例如，克唑替尼(crizotinib)(Xalkori)和色瑞替尼(Ceritinib)(Zykadia))；BRAF抑制剂(例如维莫非尼(Zelboraf)和达拉非尼(Tafinlar))；基因表达调节剂；凋亡诱导剂(例如，硼替佐米(Velcade)和卡非佐米(carfilzomib)(Kyprolis))；血管生成抑制剂(例如，贝伐单抗(Avastin)和雷莫芦单抗(Cyramza)；与毒素连接的单克隆抗体(例如本妥昔单抗(brentuximab vedotin)(Adcetris)和曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumabemtansine)(Kadcyla))。
在一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂可与抗癌治疗剂或免疫调节药物(例如免疫调节受体抑制剂，例如与受体特异性结合的抗体或其抗原结合片段)组合使用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的Tim-3途径拮抗剂联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的Vista途径拮抗剂联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的BTLA途径拮抗剂联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的LAG-3途径拮抗剂联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的TIGIT途径拮抗剂联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与抗PDL1抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗CTLA4抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗CS1抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR2DL1/2/3抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗CD137抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗GITR抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗PD-L2抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ILT1抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ILT2抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ILT3抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ILT4抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ILT5抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ILT6抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ILT7抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ILT8抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗CD40抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如，作为药物组合物的一部分的抗OX40抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR2DL1抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR2DL2/3抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR2DL4抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR2DL5A抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR2DL5B抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR3DL1抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR3DL2抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗KIR3DL3抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗NKG2A抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗NKG2C抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗ICOS抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗SIRP.α.抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗CD47抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗4-1 BB抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗IL-10抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗TSLP抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的IL-10或PEG化的IL-10联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗APRIL抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或其抗原结合片段与例如作为药物组合物的一部分的抗CD27抗体联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与例如作为药物组合物的一部分的STING激动剂一起施用。环状二核苷酸(cyclic-di-nucleotide，CDN)环状二AMP(由单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)和其他细菌产生)及其类似物环状二GMP和环状GMP-AMP被宿主细胞识别为病原体相关分子模式(pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)，其与称为干扰素基因刺激剂(Stimulator of INterferonGene，STING)的病原体识别受体(pathogen recognition receptor，PRR)结合。STING是宿主哺乳动物细胞的细胞质中的衔接蛋白质，其激活TANK结合激酶(TANK binding kinase，TBK1)-IRF3和NF-κB信号传导轴，导致对IFN-β以及强烈激活固有免疫的其他基因产物的诱导。现在已经认识到，STING是宿主胞质监视途径的组分，所述胞质监视途径感测在细胞胞内病原体的感染并作为应答诱导IFN-α的产生，导致由抗原特异性CD4+和CD8+T细胞二者以及病原体特异性抗体组成的适应性保护性病原体特异性免疫应答的发生。美国专利NO：7,709,458和7,592,326；PCT公布NO：WO2007/054279、WO2014/093936、WO2014/179335、WO2014/189805、WO2015/185565、WO2016/096174、WO2016/145102、WO2017/027645、WO2017/027646和WO2017/075477；以及Yan et al.，Bioorg.Med.Chem Lett.18：5631-4，2008。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与Akt抑制剂联合施用。一些示例性AKT抑制剂包括GDC0068(也称为GDC-0068、帕他色替(ipatasertib)和RG7440)、MK-2206、哌立福辛(perifosine)(也称为KRX-0401)、GSK690693、AT7867、曲西立滨(triciribine)、CCT128930、A-674563、PHT-427、Akti-1/2、afuresertib(也称为GSK2110183)、AT13148、GSK2141795、BAY1125976、优普色替(uprosertib)(akaGSK2141795)、Akt抑制剂VIII(1，3-二氢-1-[1-[[4-(6-苯基-1H-咪唑并[4，5-g]喹喔啉-7-基)苯基]m-乙基]-4-哌啶基]-2H-苯并咪唑-2-酮)、Akt抑制剂X(2-氯-N，N-二乙基-10H-吩
Figure BPA0000294876740001601
嗪-10-丁胺，单盐酸盐)、MK-2206(8-(4-(1-氨基环丁基)苯基)-9-苯基-[1，2，4]三唑并[3，4-f][-1，6]萘啶-3(2H)-酮)、优普色替(N-((S)-1-氨基-3-(3，4-二氟苯基)丙烷-2-基)-5-氯-4-(4-氯-1--甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酰胺)、帕他色替((S)-2-(4-氯苯基)-1-(4-((5R，7R)-7-羟基-5-甲基-6，7-二氢-5H-环戊烯并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-(异丙基氨基)丙烷-1-酮)-、AZD 5363(4-哌啶甲酰胺、4-氨基-N-[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羟丙基]-1-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基))、哌立福辛、GSK690693、GDC-0068、曲西立滨(tricirbine)、CCT128930、A-674563、PF-04691502、AT7867、米替福新(miltefosine)、PHT-427、和厚朴酚(honokiol)、磷酸曲西立滨和KP372-1A(10H-茚并[2，1-e]四唑并[1，5-b][1，2，4]三嗪-10-酮)、Akt抑制剂IX(CAS98510-80-6)。另外的Akt抑制剂包括：ATP竞争性抑制剂，例如异喹啉-5-磺酰胺(例如，H-8、H-89、NL-71-101)、氮杂环庚烷(azepane)衍生物(例如，(-)-巴拉诺(balanol)衍生物)、氨基呋咱(aminofurazan)(例如，GSK690693)、杂环环(例如，7-氮杂吲哚、6-苯基嘌呤衍生物、吡咯并[2，3-d]嘧啶衍生物、CCT128930、3-氨基吡咯烷、苯胺三唑衍生物、螺吲哚啉(spiroindoline)衍生物、AZD5363、A-674563、A-443654)、苯基吡唑衍生物(例如，AT7867、AT13148)、噻吩甲酰胺衍生物(例如，Afuresertib(GSK2110183)、2-嘧啶基-5-酰胺基噻吩衍生物(DC120)、优普色替(GSK2141795)；变构抑制剂，例如2，3-二苯基喹喔啉类似物(例如，2，3-二苯基喹喔啉衍生物、三唑并[3，4-f][1，6]萘啶-3(2H)-酮衍生物(MK-2206))、烷基磷脂(例如，依地福新(Edelfosine)(1-O-十八烷基-2-O-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱、ET-18-OCH3)伊莫福新(ilmofosine)(BM41.440)、米替福新(十六烷基磷酸胆碱，HePC)、哌立福辛(D-21266)、芥酸磷酸胆碱(erucylphosphocholine，ErPC)、erufosine(ErPC3、芥酸磷酸高胆碱)、吲哚-3-甲醇类似物(例如，吲哚-3-甲醇、3-氯乙酰基吲哚、二吲哚基甲烷、6-甲氧基-5，7-二氢吲哚并[2，3-b]咔唑-2，10-二甲酸二乙酯(SR13668)、OSU-A9)、磺酰胺衍生物(例如，PH-316、PHT-427)、硫脲衍生物(例如，PIT-1、PIT-2、DM-PIT-1、N-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)羰基]-N’-(3-溴苯基)-硫脲)、嘌呤衍生物(例如，曲西立滨(TCN、NSC154020)、单磷酸曲西立滨活性类似物(TCN-P)、4-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶衍生物API-1、3-苯基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶衍生物、ARQ 092)、BAY 1125976、3-甲基-黄嘌呤、喹啉-4-甲酰胺、2-[4-(环己-1，3-二烯-1-基)-1H-吡唑-3-基]苯酚、3-氧代-甘遂酸、3.α.-和3.β.-乙酰氧基-甘遂酸、乙酰氧基-甘遂酸；以及不可逆抑制剂，例如天然产物、抗生素、乳醌霉素(Lactoquinomycin)、富伦菌素B(Frenolicin B)、卡拉芬净(kalafungin)、曼得尔霉素(medermycin)、Boc-Phe-乙烯基酮、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)、1，6-萘啶酮衍生物和咪唑并-1，2-吡啶衍生物。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与MEK抑制剂联合施用。一些示例性MEK抑制剂包括AZD6244(司美替尼(Selumetinib))、PD0325901、GSK1120212(曲美替尼(Trametinib))、U0126-EtOH、PD184352、RDEA119(Rafametinib)、PD98059、BIX02189、MEK162(比美替尼(Binimetinib))、AS-703026(Pimasertib)、SL-327、BIX02188、AZD8330、TAK-733、考比替尼(cobimetinib)和PD318088。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与蒽环类例如多柔比星和环磷酰胺二者(包括聚乙二醇化脂质体多柔比星)联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与抗CD20抗体和抗CD3抗体二者或者双特异性CD20/CD3结合剂(包括CD20/CD3BiTE)联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与CD73抑制剂、CD39抑制剂或二者联合施用。这些抑制剂可以是抑制外核苷酸酶活性的CD73结合剂或CD39结合剂(例如抗体、抗体片段或抗体模拟物)。所述抑制剂可以是小分子的外核苷酸酶活性抑制剂，例如6-N，N-二乙基-β-γ-二溴亚甲基-D-腺苷-5’-三磷酸三钠盐水合物、PSB069、PSB06126，
Figure BPA0000294876740001621
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与抑制剂聚ADP核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase，PARP)联合施用。一些示例性PARP抑制剂包括奥拉帕尼(Olaparib)、尼拉帕尼(Niraparib)、卢卡帕尼(Rucaparib)、他拉唑帕尼(Talazoparib)、维利帕尼(Veliparib)、CEP9722、MK4827和BGB-290。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与溶瘤病毒联合施用。一种示例性溶瘤病毒是Talimogene Laherparepvec。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与CSF-1拮抗剂(例如与CSF-1或CSF1R结合并抑制CSF-1与巨噬细胞上的CSF1R相互作用的药剂)联合施用。示例性CSF-1拮抗剂包括Emactuzumab和FPA008。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与抗CD38抗体联合施用。一些示例性抗CD39抗体包括达雷木单抗(Daratumumab)和伊沙妥昔单抗(Isatuximab)。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与抗CD40抗体联合施用。一些示例性抗CD40抗体包括Selicrelumab和达西珠单抗(Dacetuzumab)。
在本公开内容的一些实施方案中，将本公开内容的黏合素剂与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)的抑制剂联合施用。一些示例性ALK抑制剂包括艾乐替尼(Alectinib)、克唑替尼和色瑞替尼。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与抑制选自VEGFR、PDGFR和FGFR的家族成员中的一种或更多种的多重激酶抑制剂或者抗血管生成抑制剂联合施用。示例性抑制剂包括阿西替尼、西地尼布、利尼伐尼(Linifanib)、莫特塞尼(Motesanib)、尼达尼布(Nintedanib)、帕唑帕尼、帕纳替尼(Ponatinib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、索拉非尼、舒尼替尼、替沃扎尼(Tivozanib)、瓦他拉尼(Vatalanib)、LY2874455或SU5402。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与旨在刺激对一种或更多种预定抗原的免疫应答的一种或更多种疫苗联合施用。抗原可直接施用于个体，或者可由例如以下在个体内表达：可以是自体或同种异体的肿瘤细胞疫苗(例如，GVAX)、树突细胞疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、基于病毒的疫苗、细菌或酵母菌疫苗(例如，单核细胞增多性李斯特菌或酿酒酵母)等。参见，例如，Guo et al.，Adv.Cancer Res.2013；119：421-475；Obeidet al.，Semin Oncol.2015 August；42(4)：549-561。靶抗原也可以是包含表格中所列出抗原的免疫活性部分的片段或融合多肽。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与一种或更多种镇吐药(antiemetic)联合施用，所述镇吐药包括但不限于：卡索匹坦(casopitant)(GlaxoSmithKline)、奈妥匹坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)和另一些NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(palonosetron)(由MGI Pharma作为Aloxi出售)、阿瑞匹坦(aprepitant)(由Merck and Co.；Rahway，N.J.作为Emend出售)、苯海拉明(diphenhydramine)(由Pfizer；New York，N.Y.作为Benadryl出售)、羟嗪(hydroxyzine)(由Pfizer；New York，N.Y.作为Atarax出售)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(由AH Robins Co.；Richmond，Va.作为Reglan出售)、劳拉西泮(lorazepam)(由Wyeth；Madison，N.J.作为Ativan出售)、阿普唑仑(alprazolam)(由Pfizer；New York，N.Y.作为Xanax出售)、氟哌啶醇(haloperidol)(由Ortho-McNeil；Raritan，N.J.作为Haldol出售)、氟哌利多(droperidol)(Inapsine)、屈大麻酚(dronabinol)(由Solvay Pharmaceuticals，Inc.；Marietta，Ga.作为Marinol出售)、地塞米松(dexamethasone)(由Merck and Co.；Rahway，N.J.作为Decadron出售)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)(由Pfizer；New York，N.Y.作为Medrol出售)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park，N.C.作为Compazine出售)、格拉司琼(granisetron)(由Hoffmann-La Roche Inc.；Nutley，N.J.作为Kytril出售)、昂丹司琼(ondansetron)(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park，N.C.作为Zofran出售)、多拉司琼(dolasetron)(由Sanofi-Aventis；New York，N.Y.作为Anzemet出售)、托烷司琼(tropisetron)(由Novartis；East Hanover，N.J.作为Navoban出售)。
癌症治疗的另一些副作用包括红细胞和白细胞缺乏。因此，在本公开内容的一些实施方案中，黏合素剂与治疗或预防这样的缺乏症的药剂(例如如非格司亭(filgrastim)、PEG-非格司亭、红细胞生成素、阿法依泊汀(epoetin alfa)或阿法达贝泊汀(darbepoetinalfa))联合施用。
在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的黏合素剂与抗癌放射治疗联合施用。例如，在本公开内容的一些实施方案中，放射治疗是外部束治疗(external beamtherapy，EBT)：用于将高能X射线束递送至肿瘤位置的方法。所述束在患者外部产生(例如，通过线性加速器)，并靶向肿瘤部位。这些X射线可破坏癌细胞，并且精心的治疗计划使得周围的正常组织能够幸免。不将放射源置于患者身体内部。在本公开内容的一些实施方案中，放射治疗是质子束治疗：用质子而不是X射线轰击病变组织的适形治疗的一种类型。在本公开内容的一些实施方案中，放射治疗是适形外部束放射治疗：使用先进技术来调整放射治疗使其适应个体的身体结构的操作。在本公开内容的一些实施方案中，放射治疗是近距离治疗：放射性物质在身体内暂时放置，其通常用于向区域给予额外剂量--或加强--的辐射。
在本文中所述方法的一些实施方案中，治疗涉及本公开内容的黏合素剂与抗病毒治疗的组合施用。用黏合素剂进行的治疗可在抗病毒治疗的施用之前、同时或之后进行。组合治疗中使用的抗病毒药物将取决于对象所感染的病毒。
组合施用可包括以单药物制剂或使用分开的制剂共施用，或者以任一种顺序但通常在一定时期内连续施用，使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。
将理解的是，本文中所述黏合素剂与至少一种另外的治疗剂的组合可以以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，将黏合素剂施用于先前已经历用第二治疗剂进行治疗的患者。在特定的另一些实施方案中，黏合素剂和第二治疗剂将基本上同时或同时施用。例如，可在对象经历用第二治疗剂(例如，化学治疗)进行治疗的过程的同时给予其黏合素剂。在一些实施方案中，将在用第二治疗剂进行的治疗的1年内施用黏合素剂。在某些替代实施方案中，将在用第二治疗剂进行的任何治疗的10、8、6、4或2个月内施用黏合素剂。在特定的另一些实施方案中，将在用第二治疗剂进行的任何治疗的4、3、2或1周内施用黏合素剂。在一些实施方案中，将在用第二治疗剂进行的任何治疗的5、4、3、2或1天内施用黏合素剂。还将认识到，可在约数小时或数分钟内(即，基本上同时)向对象施用两种(或更多种)药剂或治疗。
对于对疾病的治疗，本公开内容的黏合素剂的合适剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的响应性、施用黏合素剂是出于治疗还是预防目的、先前治疗、患者的临床病史等，所有这些均由治疗医生判定。可将黏合素剂一次或在持续数天至数月的一系列治疗中，或者直至实现治愈或实现疾病状态减弱(例如，肿瘤尺寸减小)为止施用。最佳给药方案可根据对患者身体中药物蓄积的测量进行计算，并且将根据单独药剂的相对效力而变化。施用医生可确定最佳剂量、给药方法和重复率。在一些实施方案中，剂量是0.01μg至100mg/kg体重、0.1μg至100mg/kg体重、1μg至100mg/kg体重、1mg至100mg/kg体重、1mg至80mg/kg体重、10mg至100mg/kg体重、10mg至75mg/kg体重或10mg至50mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约0.1mg至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约0.1mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约0.25mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约0.5mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约1mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约1.5mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约2mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约2.5mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约5mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约7.5mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约10mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约12.5mg/kg体重。在一些实施方案中，黏合素剂的剂量为约15mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量可每天、每周、每月或每年一次或更多次给予。在一些实施方案中，黏合素剂每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次给予。
在一些实施方案中，黏合素剂可以以初始较高“负荷”剂量随后是一个或更多个较低剂量施用。在一些实施方案中，施用频率也可变化。在一些实施方案中，给药方案可包括施用初始剂量，随后每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用另外的剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可包括施用初始负荷剂量，随后每周施用例如初始剂量的一半的维持剂量。或者给药方案可包括施用初始负荷剂量，随后每隔一周施用例如初始剂量的一半的维持剂量。或者给药方案可包括施用三个初始剂量持续3周，随后每隔一周施用例如相同量的维持剂量。
如本领域技术人员已知的，任何治疗剂的施用都可能导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性如此严重以至于不能以治疗有效剂量施用特定药剂。在一些情况下，必须中断药物治疗，并可尝试其他药剂。然而，同一治疗种类中的许多药剂经常表现出相似的副作用和/或毒性，这意味着患者要么必须停止治疗，要么(如果可能的话)遭受与治疗剂相关的使人不愉快的的副作用。
在一些实施方案中，给药方案可限于特定数目的施用或“周期”。在一些实施方案中，将黏合素剂施用3、4、5、6、7、8或更多个周期。例如，黏合素剂每2周施用，持续6个周期，黏合素剂每3周施用，持续6个周期，黏合素剂每2周施用，持续4个周期，黏合素剂每3周施用，持续4个周期等。给药方案可由本领域技术人员决定并随后进行修改。
因此，本公开内容提供了向对象施用本文中所述的多肽或药剂的方法，其包括使用用于施用一种或更多种药剂的间歇给药策略，这可降低与黏合素剂、化学治疗剂等的施用相关的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于在人对象中治疗癌症的方法包括向对象施用与治疗有效剂量的化学治疗剂组合的治疗有效剂量的黏合素剂，其中根据间歇给药策略施用一种或两种药剂。在一些实施方案中，所述间歇给药策略包括向对象施用初始剂量的黏合素剂，以及约每2周一次施用后续剂量的黏合素剂。在一些实施方案中，所述间歇给药策略包括向对象施用初始剂量的黏合素剂，以及约每3周一次施用后续剂量的黏合素剂。在一些实施方案中，所述间歇给药策略包括向对象施用初始剂量的黏合素剂，以及约每4周一次施用后续剂量的黏合素剂。在一些实施方案中，黏合素剂使用间歇给药策略来施用，并且化学治疗剂每周施用。
在一些实施方案中，本公开内容还提供了用于使用本公开内容的黏合素剂治疗对象的方法，其中所述对象患有病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染是选自以下的病毒的感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒或虫媒病毒性脑炎病毒(arboviral encephalitis virus)。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于使用本公开内容的其黏合素剂治疗对象的方法，其中所述对象患有细菌感染。在一些实施方案中，细菌感染是选自以下的细菌的感染：衣原体属(Chlamydia)、立克次体属(rickettsial)细菌、分枝杆菌属(mycobacteria)、葡萄球菌属(staphylococci)、链球菌属(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙雷氏菌属(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团菌属(Legionella)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙门氏菌属(Salmonella)、杆菌纲(bacilli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、破伤风梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽杆菌(Bacillusanthricis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)和博氏杆菌(Borriella)。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于使用本公开内容的黏合素剂治疗对象的方法，其中所述对象患有真菌感染。在一些实施方案中，真菌感染是选自以下的真菌的感染：假丝酵母属(Candida)(白念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉属(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、属毛霉目(Mucorales)(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于使用本公开内容的黏合素剂治疗对象的方法，其中所述对象患有寄生物感染。在一些实施方案中，寄生物感染是选自以下的寄生物的感染：溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidiumcoli)、福氏耐格里阿米巴原虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、兰氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)。
实施例
实施例1：从噬菌体展示文库中选择PD-L1结合黏合素
本公开内容的肽，例如PD-L1结合组分，可通过从具有两个随机环的黏合素文库中进行选择来确定，所述随机环例如通常但不排他性地具有相同长度的9个氨基酸。
如上所述，本公开内容的PD-L1结合肽通过从噬菌体展示文库中进行选择来确定，所述噬菌体展示文库包含在基于Stefin A的序列的恒定黏合素框架骨架中展示的长度为9个氨基酸的随机环序列。这样的选择操作是公知的。根据这样的操作，将噬菌体的悬浮液与靶抗原(在链霉亲和素珠上捕获的经生物素化抗原或在板上捕获的未经生物素化抗原)一起孵育。然后将未结合的噬菌体洗掉，并随后通过将抗原与低pH溶液、随后是高pH溶液一起孵育来洗脱结合的噬菌体。然后用释放的、pH中和的噬菌体溶液感染大肠杆菌，并获得第一轮噬菌体的制备物。该循环重复进行例如两次或三次，并且为了对靶向噬菌体进行富集，可在随后的数轮选择中提高严格条件，例如通过提高洗涤步骤的数目、降低抗原浓度以及用经封闭的链霉亲和素珠或包被有封闭剂的孔进行预选择。
在通过连续数轮的噬菌体扩增进行选择之后，通过可溶性黏合素ELISA鉴定PD-L1结合克隆。简单地说，从噬菌粒载体中过表达黏合素，将细菌细胞裂解并将裂解物用于ELISA，检测在具有针对黏合素上His6标签的缀合抗体的板上固定的与PD-L1结合的黏合素。对显示特异性结合的克隆进行测序以鉴定环序列。
为了举例说明，使用约1×1012个噬菌体如下所述进行从黏合素文库中选择PD-L1结合噬菌体，从大小约6×1010多样性的文库中添加。
在M280链霉亲和素或中性亲和素珠(Thermo Scientific)上捕获的经生物素化抗原。抗原由R&D以Fc切割的形式提供，并使用EZ Link Sulfo-NHS-LC Biotin试剂盒(Pierce)在内部进行生物素化。
实施例2：抗PD-L1黏合素与表达PD-L1的人癌细胞系的结合亲和力(图2)
使用流式细胞术确定AVA04黏合素多肽对人肺腺癌细胞系的结合亲和力。将在包含10％的FBS(Gibco)以及青霉素(100U/ml，Hyclone)和链霉素(100μg/ml，Hyclone)的RPMI-2640(Sigma)中培养的表达PD-L1的H441细胞与使用DPBS洗涤的组织培养物分离。通过在300rpm下离心5分钟来收集细胞。将细胞重悬于PBS中，并且将50000个细胞/孔分派在圆底96孔板中。用PBS洗涤细胞。将黏合素和对照一式两份在染色缓冲液(R&D)中进行稀释并添加在细胞上以用于在4±1℃下染色约60分钟。洗涤细胞，并且将二级抗Cystatin A(R&D)在染色缓冲液(R&D)中以1∶15进行稀释并添加在细胞上以用于在4±1℃下染色约40分钟。洗涤细胞，并且将检测抗体A488抗山羊(Biolegend)在染色缓冲液(R&D)中以1∶100进行稀释并添加在细胞上以用于在4±1℃下染色约30分钟。最后，洗涤细胞，在4±1℃下使用在染色缓冲液中稀释的L/D染色剂Zombie Aqua(Biolegend)对活细胞和死细胞进行染色10分钟。洗涤细胞，并在4±1℃下向每个孔添加固定缓冲液(R&D)，持续10分钟，然后添加含EDTA的PBS(Lonza)，然后在流式细胞仪(Guava 12 HT，Millipore)上读取板。将死细胞排除并获取荧光绿色通道(488nm/525/30)。使用Incyte对结果进行分析，并使用graphpad绘制数据。
AVA04黏合素多肽的一些实例提供于表4A、4B和5中。
表4A：示例性PD-L1黏合素多肽的环序列
AVA04克隆 环2 SEQ ID NO： 环4 SEQ ID NO：
269 KEYGPEEWW 8 GDYEQVLIH 44
261 HAYGPRDWD 9 PADHVLEEA 45
211 KDWGPSNWW 21 VDDKTLSKD 57
227 KDHGPIAWW 10 EDTNTDGAL 46
228 KPYGPRDWD 7 EPQLDTSPI 43
251 REGRQDWVL 39 WVPFPHQQL 75
236 KEHGPDSWW 15 QEKNQWVEE 51
231 NTWFPESFW 18 DDNQERQEH 54
179 YNHFPEYMW 41 PPRFPHEPF 77
141 AAHFPEHFW 38 QPADMSAEF 74
表4B：示例性PD-L1黏合素多肽的完整氨基酸序列
Figure BPA0000294876740001711
表5：示例性PD-L1黏合素多肽序列
Figure BPA0000294876740001721
Figure BPA0000294876740001731
实施例3：黏合素多聚体在大肠杆菌中的表达(图3)
使用制造商的方案将200ng表达质粒pD861(Atum)转化到BL21大肠杆菌细胞(Millipore)中。将总转化细胞混合物平板接种到包含50ug/ml卡那霉素(AppliChem)的LB琼脂板上，并在37℃下孵育过夜。
接下来，将转化大肠杆菌的菌苔转移至1×肉汤培养基(Melford)&50ug/ml卡那霉素的无菌烧瓶中，并在30℃下以250rpm摇动孵育。一旦细胞达到OD600为0.8至1.0，用10mMRhamnose(Alfa Aesar)诱导表达，在此之后将培养物在37℃下孵育5小时。通过在4,500rpm下离心1小时收获细胞。
对于培养物体积＜500ml，大肠杆菌细胞沉淀物通过重悬于补充有0.5ml 10×BugBuster/克湿细胞糊(Millipore)、溶菌酶(Applichem)和Benzonase(Millipore)的1∶10NPI20缓冲液(50mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑(Sigma))中来裂解。将细胞在室温下在瓶滚筒(bottle roller)上裂解1小时。对于培养物体积＞500ml，将细胞沉淀物以1∶10重悬于补充的NPI20中，并进行声处理2分钟(1.0秒开/关循环)。在裂解之后，将溶液在4℃下以20,000xg离心1小时。
使用镍琼脂糖亲和树脂(Super-NiNTA500；Generon)从澄清的上清液中对经His标记的蛋白质进行分批结合亲和纯化。
将合适体积的NiNTA树脂(结合容量1mL/20mg蛋白质)用5柱体积(column volume，CV)水洗涤以去除存储溶液，随后在StEPTM柱(Thompson)中利用重力流(gravity flow)用5CV NPI20缓冲液进行平衡。将树脂与澄清的大肠杆菌溶液在室温下一起孵育1小时。然后，使溶液通过重力流通过StEPTM柱，并用5CV NPI20缓冲液洗涤树脂。用5CV的NPI400(50mM磷酸钠、0.5M NaCl、0.4M咪唑(Sigma))从树脂洗脱掉结合的蛋白质。使用Centripure柱(empBiotech GmbH)将洗脱的蛋白质脱盐到1×PBS中。使用Nanodrop(Thermo)A280读数估算蛋白质产量。使用在AKTA Xpress(GE)上以2.6ml/分钟流量在PBS 1×中运行的HiLoad 26/600 Superdex 200pg(GE)进行制备型SEC。将洗脱的蛋白质样品在95℃下在200V下的NovexTM 20X BoltTM MES SDS运行缓冲液(Thermo)以及还原样品缓冲液中的SDS-PAGEBolt Bis Tris plus 4至12％凝胶(Thermo)上运行10分钟。用Quick Coommassie(Generon)对凝胶上的蛋白质带进行染色。将经PageRuler预染色的蛋白质分子量标记物(Thermo)在凝胶上运行以估算融合蛋白的分子量。
实施例4：竞争性ELISA测定和PDL-1结合Biacore(图4A和图4B)PD-L1/PD-1竞争性ELISA(图4A)
通过酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)评价黏合素多聚体的竞争性抑制。将hu PD-1-Fc(R&D Systems)以0.5μg/ml包被在板上。将板用板洗涤器用150ul的洗涤缓冲液(PBS，吐温200.1％)洗涤2次，并在室温(25±1℃)下用PBS中的Casein 5％(Sigma)饱和90分钟。将板如前所述进行洗涤。然后将黏合素和对照(hu PD-1-Fc，R&D Systems，空白)一式两份进行稀释，并与30ng/ml的huPD-L1-Fc(R&D Systems)一起预孵育30分钟，然后将其在室温(25±1℃)下加载在板上，持续90分钟。将板如前所述洗涤3次。然后将经生物素化的多克隆抗体抗hu PD-L1(R&D Systems)在稀释缓冲液中进行稀释，并在室温(25±1℃)下孵育90分钟。将板如前所述洗涤3次，并将链霉亲和素HRP在室温(25±1℃)下孵育30分钟。将板洗涤，并向板中添加底物(TMB，Pierce Thermo-Scientific)，持续10分钟。使用酸性溶液终止反应，并在450至630nm下读取板。然后使用插值非线性四参数标准曲线计算IC 50。
PD-L1结合Biacore(图4B)
使用运行缓冲液HBS-EP+(GE)以及使用胺偶联试剂(GE)在10mM乙酸钠pH 4.0(GE)中用PD-L1-Fc(R&D Systems)固定的系列S传感器CM5芯片对Ava04-141内联融合体(in-line fusion，ILF)形式进行Biacore T200动力学分析。将黏合素单体的浓度滴定作为分析物运行，其中缔合时间为150秒，随后解离时间为300秒，流量为30μl/分钟。将黏合素二聚体、三聚体和四聚体融合蛋白作为分析物运行，其中缔合时间为300秒，随后解离时间为600秒，流量为30μl/分钟。用5mM NaOH(GE)以20μl/分钟流量使经PD-L1-Fc固定的表面再生，持续20秒。减去数据空白并将其拟合于1∶1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)(BIAcore评价软件；GE)以计算表观KD值。
实施例5：黏合素Fc融合体和效应物功能(ADCC)的表征
SEC-HPLC(图5A)
使用Expifectamine试剂(Thermo)按照制造商方案用表达载体pD2610v14(Atum)进行悬浮HEK细胞(Expi293F细胞系；Thermo)转染。在转染之后7天，通过在10,000×g下离心1小时来收获上清液，并将其使用0.45μm滤纸进行过滤。使用AKTA Xpress(GE)上的mabSelect Sure HiTrap柱对蛋白质进行纯化。将树脂用5柱体积(CV)水洗涤，用5CV PBS 1×进行平衡。然后，使上清液以5ml/分钟的流量运行通过，随后用10CV PBS 1×洗涤。将结合的蛋白质在5CV 0.1M甘氨酸pH 2.8中洗脱，使用Centripure脱盐柱(empBiotech GmbH)将缓冲液更换为PBS 1×。之后，如实施例3中所述进行制备型SEC。使用在PBS 1×中以0.8ml/分钟在Ultimate 3000 HPLC(Thermo)上运行的MAbPac SEC-1柱(Thermo)进行分析型SEC。
Biacore动力学(图5B)
如实施例4中所述进行Biacore动力学分析，其中缔合时间为700秒并且解离时间为1200秒。对于低浓度，用3.5nM NaOH以20μl/分钟的流量(GE)进行表面再生，持续20秒。对于高浓度，将时间提高至30秒。
ADCC报道生物测定(图5C)
ADCC报道生物测定是来自Promega Corp.的生物发光报道测定，用于在ADCC作用机制(MOA)测定中对治疗性抗体药物对途径激活的生物活性进行量化。在功能性IgG1 Fc上格式化的AVA04-251能够显示ADCC功能，其中EC50为≥1nM。
简单地说，将靶细胞H441细胞(表达huPD-L1)以密度20000个细胞/孔以100ul接种在96孔板中，并在湿润的CO2培养箱中孵育20小时。第二天，将样品和对照一式两份在ADCC缓冲液(Promega)中稀释。同时，将效应细胞解冻(Jurkat FCgRIIIa报道NFAT细胞，Promega)，并将630ul的初始细胞悬液在3.6ml的ADCC缓冲液中稀释。从板中移除95ul的培养基，并在每孔中添加25ul的ADCC缓冲液、25ul的样品稀释液或对照以及25ul的效应细胞。将板在湿润的CO2培养箱中孵育6小时。然后将板在室温下平衡，并在每个反应孔中添加75ul的BioGLo萤光素酶测定试剂(Promega)，并在室温下孵育5至10分钟。然后使用读板仪(Clariostar，BMG)测量发光。使用Graphpad将结果绘制为诱导倍数＝f(log浓度)。
实施例6：竞争性ELISA测定(图6A至6C)
PD-L1/PD-1竞争ELISA(图6A)
在如图4A所述的竞争性ELISA中测试在_V.2上格式化的多种黏合素多肽。所有受试的格式化黏合素均具有竞争性，IC50为0.26至24.6nM。对照抗体(29E2A3，Biolegend)具有竞争性，IC50与格式化的黏合素相当(IC50＝0.18nM)。
PD-L1/CD80竞争ELISA(图6B)
在竞争性ELISA中测试在_V.2上格式化的多种黏合素多肽。
所有受试的格式化黏合素与CD80竞争，IC50为0.41至12.77nM。对照抗体(29E2A3，Biolegend)具有竞争性，IC50与格式化的黏合素相当(IC50＝0.31nM)。
简单地说，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评价竞争性抑制。将hu CD80-Fc(R&DSystems)以1ug/ml包被在板上。将板用板洗涤器用150ul的洗涤缓冲液(PBS，吐温200.1％)洗涤2次，并在室温(25±1℃)下用PBS中的Casein 5％(Sigma)饱和90分钟。将板如前所述进行洗涤。然后将黏合素和对照(mAb抗huPD-L129E.2A3，Biolegend；hu PD-L1-Fc，R&DSystems，空白)一式两份进行稀释，并与1.6nM的huPD-L1-Fc(R&D Systems)一起预孵育30分钟，然后将其在室温(25±1℃)下加载在板上，持续90分钟。将板如前所述洗涤3次。然后将经生物素化的多克隆抗体抗hu PD-L1(R&D Systems)在稀释缓冲液中进行稀释，并在室温(25±1℃)下孵育90分钟。将板如前所述洗涤3次，并将链霉亲和素HRP在室温(25±1℃)下孵育30分钟。将板洗涤，并向板中添加底物(TMB，Pierce Thermo-Scientific)，持续10分钟。使用酸性溶液终止反应，并在450至630nm下读取板。然后使用插值非线性四参数标准曲线计算IC 50。
基准抗体竞争ELISA(图6C)
在针对阿维单抗、阿特珠单抗和度伐单抗的竞争性ELISA中测试AVA04-25_V.2。AVA04-251_V.2与每种基准抗体均具有竞争性，IC50为0.29至1.71nM。
简单地说，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评价与基准抗体的竞争性抑制。将阿维单抗、阿特珠单抗和度伐单抗以0.5ug/ml包被在板上。将板用板洗涤器用150ul的洗涤缓冲液(PBS，吐温200.1％)洗涤2次，并在室温(25±1℃)下用PBS中的Casein 5％(Sigma)饱和90分钟。将板如前所述进行洗涤。然后将黏合素和对照(基准抗体，空白)一式两份进行稀释，并与0.07nM的huPD-L1-Fc(R&D Systems)一起预孵育60分钟，然后将其在室温(25±1℃)下加载在板上，持续90分钟。将板如前所述洗涤3次。然后将经生物素化的多克隆抗体抗hu PD-L1(R&D Systems)在稀释缓冲液中进行稀释，并在室温(25±1℃)下孵育90分钟。将板如前所述洗涤3次，并将链霉亲和素HRP在室温(25±1℃)下孵育30分钟。将板洗涤，并向板中添加底物(TMB，Pierce Thermo-Scientific)，持续10分钟。使用酸性溶液终止反应，并在450至630nm下读取板。然后使用插值非线性四参数标准曲线计算IC 50。
实施例7：黏合素半衰期延长(图7)和组织分布(图30)的药代动力学研究
将AVA04-251_V.2以10mg/kg静脉内(IV)注射至C57BL/6小鼠。对6只小鼠进行注射并收集9个时间点(0小时、0.25小时、6小时、24小时、72小时、120、168小时、336小时和480小时)。将每个时间点的血清样品合并，并使用注射的分子作为参考标准通过夹心ELISA对其进行分析。结果表示为在15分钟时初始剂量的百分比。
用于该药代动力学研究的AVA04-251_V.2使用如实施例5中所述的Expifectamine转染从Expi293F中产生。使用Endosafe Nexgen-PTSTM阅读仪(Charles River)进行LAL测定以确定蛋白质样品中的内毒素水平为0.01EU/mg。使用HEK293HCP第2代ELISA(Cygnus)，使用制造商的方案对哺乳动物宿主细胞蛋白质进行量化。样品包含每mg蛋白质5ug/ml HCP。
对在向带有原位MDA-MB-231肿瘤细胞的人源化NOG小鼠静脉内施用125I-黏合素和125I-阿维单抗之后的总放射性的组织分布进行评价(图32A)。将小鼠针对其肿瘤尺寸进行随机化，并用阿维单抗或AVA04-251_V.2进行IV注射(n＝5/组和时间点)。在8和96小时时处死小鼠。采集血液和器官并将其移出和称重。使用设计成用于检测和定量测量γ辐射的RIASTAR A5410多检测器γ计数器(Packard)来确定生物样品中包含的总放射性。将经称重的样本的等分试样引入到5mL聚丙烯管中。然后，将管加载到计数盘中以进行直接γ检测。图31B示出了血浆/肿瘤比例。
总体而言，AVA04-251_V.2具有类似于阿维单抗的组织分布。
实施例9：通过人PBMC刺激测定进行的免疫原性测试(图8)
如实施例5中所述进行黏合素亲本HEK细胞转染和mabSelectSure纯化，外加使用SP高性能柱(GE)并使用20mM乙酸钠pH4缓冲液的阳离子交换纯化步骤。使用运行缓冲液和0.1％Triton 114x(Sigma)的10CV洗涤液去除带负电荷的内毒素。用20mM乙酸钠pH4&2MNaCl洗脱结合的蛋白质。如实施例3中所述进行制备型SEC。使用Endosafe Nexgen-PTSTM阅读仪(Charles River)进行LAL测定以确定蛋白质样品中的内毒素水平为0.04EU/mg。使用HEK293HCP量化试剂盒(Cygnus)，使用制造商的方案对宿主细胞蛋白质进行量化。样品包含每mg蛋白质30ng/ml HCP。
从低温存储器中取回分离自每个健康供体的PBMC并在无血清细胞培养基中解冻，并将其接种到经组织培养物处理的96孔圆底微板中。将所有受试产物在无血清细胞培养基中进行稀释并以50μg/ml的终浓度添加至孔，以25μg/ml测试StefinA。将细胞保持在培养物中持续7天。通过测量5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)并入来评估CD4+T细胞增殖。在第6天，将PBMC培养物用EdU进行脉冲约16小时。在第7天，对细胞进行针对T细胞表面标志物(CD3、CD4和CD8)的荧光染色，固定并使其透性化，并用荧光叠氮化物对并入的EdU进行染色。将刺激指数计算为针对缓冲液的比例。SI＞2被认为是正响应。对每个受试分子绘制响应物的％。
总体而言，在7天的处理之后，仅阳性对照KLH能够刺激T细胞增殖。
实施例10：在Fc上不同位点处的黏合素格式化(图9)
对AVA04-236-A(EAAAK)6(SEQ ID NO：196)hlgG1 Fc(AR)、AVA04-236-A(EAAAK)6(SEQ ID NO：196)hlgG1 Fc C端黏合素(AQ)，和hlgG1 Fc上的AVA04-236二聚体(AG)，如实施例5中所述进行Expi293F转染和一期mabSelect Sure纯化。使用MAbPac SEC-1(Thermo)进行分析型SEC，并在PBS 1×流动相中以0.8ml/分钟在Ultimate 3000 HPLC(Thermo)上运行。AVA04-236-A(EAAAK)6(SEQ ID NO：196)hlgG1Fc、AVA04-236-A(EAAAK)6(SEQ ID NO：196)hlgG1 Fc C端黏合素和hlgG1 Fc上的AVA04-236二聚体的结果分别为96％、97％和92％。
实施例11：动力学分析(图10)
对单体黏合素、N端hlgG1 Fc刚性接头(AR)、N端二聚体hlgG1 Fc(AG)、C端hlgG1柔性接头(AQ)和N端hlgG1柔性接头(V.2)如实施例4中所述进行Biacore动力学分析。分析使用了500秒的缔合时间和800秒的解离时间。用3mM NaOH(GE)以20ul/分钟进行再生，持续20秒。单体黏合素、N端hlgG1 Fc刚性接头、N端二聚体hlgG1 Fc、C端hlgG1柔性接头和N端hlgG1柔性接头的KD结果分别为6.4nM、0.89nM、0.19nM、2.01nM和0.63nM。
实施例12：伊匹单抗(生物仿制药)融合分析(图11A至11B)
对伊匹单抗和伊匹单抗-AVVA04-141以1∶1比例的重链：轻链载体pD2610v14(Atum)进行Expi293F转染。如实施例5中所述进行亲和色谱和分析型SEC HPLC。如实施例3中所述运行制备型SEC以及还原和非还原SDS-PAGE QC。
实施例13：动力学分析(图12A至12C)
使用实施例4中所述的方案进行Biacore动力学分析。在10mM乙酸钠pH 4缓冲液(GE)中使用胺偶联将伊匹单抗-141融合蛋白固定在CM5芯片表面上。对PD-L1-Fc或CTLA4-Fc抗原(R&D Systems)进行滴定，对于PD-L1-Fc，缔合时间为300秒并且解离时间为600秒；以及对于CTLA4-Fc为700秒缔合时间和1200秒解离时间。使用3mM NaOH(GE)以20μl/分钟进行再生，持续20秒。
实施例14：双特异性贝伐单抗(生物仿制药)-PD-L1黏合素表征(图13A至13C)以及通过药代动力学分析进行的半衰期确定(图13D)
使用1∶1 VH∶Vk质粒pD2610v14(Atum)的转染率如实施例5中所述产生贝伐单抗-AVA04-251双特异性Af-mAb。使用胺偶联用10mM乙酸钠pH 5.0(GE)，将具有刚性或柔性接头的贝伐单抗-AVA04-251双特异性Af-mAb固定在CM5芯片表面上。hPDL1-Fc(R&D Systems)作为分析物运行，其中缔合时间为300秒并且解离时间为600秒，用3mM NaOH(GE)以20μl/分钟再生，持续20秒(图13B)。
使用胺偶联分别用10mM乙酸钠pH 4.5和5.5(GE)，将贝伐单抗-AVA04-251双特异性Af-mAb或贝伐单抗(生物仿制药，抗VEGF，Invivogen)固定在CM5芯片表面上。hVEGF(Peprotech)作为分析物运行，并作为单循环动力学进行分析，以700秒的缔合时间和解离时间1200秒运行x5浓度，用3.5mM NaOH(GE)以20μl/分钟进行再生，持续20秒。减去数据空白并用1∶1朗缪尔结合模型BIAcore评价软件；GE)进行分析以计算表观KD值。
图13D：在C57/B16小鼠中进行的药代动力学研究：如图7所述，以10mg/kg对小鼠进行静脉内(IV)注射。对6只小鼠进行注射并收集9个时间点(0小时、0.25小时、6小时、24小时、72小时、120、168小时和336小时)。将每个时间点的血清样品合并，并使用注射的分子作为参考标准通过夹心ELISA对其进行分析。结果表示为在15分钟时初始剂量的百分比。在β阶段估算黏合素Af-mAb半衰期，为约127小时)，其与Fc格式化的黏合素(AVA04-251_AQ.2)相当。
实施例15：晶体学的蛋白质产生(图14至16)
hPD-L1结合结构域(N端IgV结构域第18至134位)在大肠杆菌中表达为包涵体。将细胞沉淀物溶解在tris缓冲盐水(tris buffered saline，TBS)中，并在4℃下补充8M尿素，持续16小时。使用如图3中所述的NiNTA用洗脱缓冲液TBS、8M尿素和400mM咪唑，对经His标记的抗原进行纯化。通过向1L重折叠缓冲液(refolding buffer)(补充有0.5M精氨酸的100mM Tris pH 8)逐滴添加约100mg蛋白质来使蛋白质重折叠。然后将0.25mM谷胱甘肽(还原型和氧化型)和蛋白酶抑制剂片剂(不含EDTA；Roche)在4℃下搅拌过夜。然后通过切向流过滤(tangential flow filtration，TTF)浓缩蛋白质，并将缓冲液更换成TBS&10％甘油。使用Hiload 26/600 Superdex 75pg，使用在TBS&10％甘油运行缓冲液中以2.6ml/分钟运行的AKTA Xpress(GE)对蛋白质进行纯化。使AVA04-261表达并使用TBS运行缓冲液如实施例3中所述对其进行纯化。将洗脱的蛋白质以2mg/ml在-20℃下储存，随后将AVA04-261与hPD-L1抗原以等摩尔量混合。然后如上所述运行制备型SEC。将洗脱的级分浓缩至68mg/ml。
为了进行晶体学，使用坐滴蒸汽扩散(sitting drop vapor diffusion)方法，使用0.1μl蛋白质和0.1μl储存溶液(reservoir solution)建立数个商业筛选。将它们在室温下放置过夜，并从许多不同的缓冲液中获得六方晶。收集在25％Jeffamine SD-2001、100mMMES pH 5.5和100mM丙二酸二钠盐(Sodium Malonate dibasic)中获得的晶体的衍射数据。将晶体在母液中在液氮中快速冷却。在Diamond light source，UK收集数据。使用CCP4套件，使用分子置换，使用来源于pdb结构3KSE、4N6T和5C3T的模型，求解AVA04-261/hPD-L1结合结构域蛋白质复合物结构，将衍射收集至
Figure BPA0000294876740001811
主要相互作用表面是疏水的，其中AVA04-261的环2与hD-L1抗原相互作用。hPD-L1结合表面非常类似于结合PD-L1的蛋白质的一些文献实例(1.Lee，J.et al.(2016)Nature Communications 7，13354，2.Zak，K.et al.(2016)Oncotarget，7，30323，3.Zhang F.et al(2017)Cell Discovery，3，17004.)
实施例16：半衰期延长的抗人PD-L1二聚体黏合素内联融合体(ILF)：具有刚性或柔性遗传接头的示意图和XT命名(图17A至17B)
如实施例3中详细描述的产生黏合素ILF。在制备型SEC之后，如实施例3中所述在SEC-HPLC上运行蛋白质，对于所有融合蛋白＞95％纯度。参见图17A。
Biacore动力学分析表明，抗人PD-L1和抗人血清白蛋白黏合素二者在遗传融合的同时能够接合靶蛋白，AVA04黏合素在2至6倍亲和力内结合人PD-L1，而HSA黏合素以5倍亲和力结合HSA(如实施例4中所述进行实验)。使用运行缓冲液HBS-EP+(GE)对血清白蛋白进行Biacore T200动力学分析，并使用胺偶联试剂(GE)用10mM乙酸钠pH 5.0(GE)中的人血清白蛋白(Sigma；A37812)将系列S传感器CM5芯片固定在表面Fc2上。黏合素单体的浓度滴定作为分析物以30μl/分钟的流量运行。减去动力学数据空白，并将其拟合于1∶1朗缪尔结合模型(BIAcore评价软件；GE)以计算KD值。参见图17B。
实施例17：具有半衰期延长的ILF三聚体(图18A、B和图31)
在A、B或C位置中具有半衰期延长黏合素的ILF AVA04-251三聚体：Biacore动力学分析显示，黏合素在遗传融合的同时能够接合靶蛋白。AVA04黏合素二聚体以251ILF二聚体(形式BH)的2倍内与人PD-L1结合，并且另一个黏合素接合HSA。针对PD-L1如实施例4中并且针对HSA结合如实施例4中所述进行Biacore。
图31：ILF黏合素XT的药代动力学：具有半衰期延长的ILF AVA04-251三聚体已在C57/B16小鼠中的药代动力学研究中进行测试。如图7所述，以10mg/kg对小鼠进行静脉内(IV)注射。对6只小鼠进行注射并收集9个时间点(0小时、0.25小时、6小时、24小时、72小时、120、168小时和336小时)。将每个时间点的血清样品合并，并使用注射的分子作为参考标准通过夹心ELISA对其进行分析。结果表示为在15分钟时初始剂量的百分比。不具有半衰期延长的黏合素ILF(BH)具有快速清除率(t1/23.2h)，但ILF AVA04-251 XT形式没有，并且在β阶段估算半衰期，为23.8至24.2小时)。
实施例18：靶结合序列的分析(图19)
在环4中x9氨基酸位置中的AVA04-251丙氨酸扫描。降低1μl经纯化变体蛋白质的SDS-PAGE运行，对于所有变体，大肠杆菌产生产量为约150mg/L。hPD-L1 Biacore动力学分析以50nM浓度运行，确定了环4的1和4位置对靶标结合至关重要。
实施例19：稳定性(图20)
为了测试AVA04-251 V.2的稳定性，每个月在以1ml/分钟在PBS 1×缓冲液中运行的Yarra-3000(Phenomenex)柱上进行SEC-HPLC分析，持续9个月。将样品在+4℃下储存。单体纯度降低了3％至5％。
实施例20：(图21)
使AVA04-251 CG，抗PDL1黏合素连接具有铰链S228P突变和(G4S)4(SEQ ID NO：197)接头的IgG4 Fc融合蛋白。该蛋白质如实施例5中所述从瞬时Expi293F细胞中产生。使用在100mM柠檬酸钠pH 3.5缓冲液中洗脱的PrismA(GE)蛋白A亲和树脂对融合蛋白进行纯化。然后如实施例3中所述进行制备型SEC。使用在PBS 1×缓冲液中以1ml/分钟在Ultimate3000 HPLC(Thermo)上运行的SEC-HPLC Yarra-3000柱评估纯度。最终蛋白质为＞98％纯。
实施例21：(图22)
AVA04-251 CF是具有用于降低ADCC的L153A、L154A Fc CH1突变的IgG1 Fc融合体。该蛋白质从瞬时Expi293F细胞中产生，并如实施例5中所述进行纯化。使用在PBS 1×缓冲液中以1ml/分钟在Ultimate 3000 HPLC(Thermo)上运行的SEC-HPLC Yarra-3000柱评估纯度。最终蛋白质为＞99％纯。
实施例22：(图23)
将AVA04-261黏合素与Fc的IgG1铰链区遗传融合，并从大肠杆菌中产生(BN形式)。如实施例3中所述对蛋白质进行纯化。运行SDS-PAGE显示，二聚体物质在非还原条件下通过铰链中的半胱氨酸二聚并且在还原缓冲液中还原为单体物质。根据制造商的说明一式两份进行PD-1 PD-L1阻断生物测定(Promega)测定，并且显示，当与单体AVA04-261相比时，AVA04-261 BN形式具有亲合力。AVA04-261 BN形式的Biacore产生59.9pM KD。
实施例23：(图24)
在AVA04-251 AZ人IgG1 Fc融合蛋白中，黏合素与Fc铰链区直接融合。该蛋白质从瞬时Expi293F细胞中产生，并如实施例5中所述进行纯化。使用在PBS 1×缓冲液中以1ml/分钟在Ultimate 3000 HPLC(Thermo)上运行的SEC-HPLC Yarra-3000柱评估纯度。最终蛋白质为＞99％纯。减去Biacore单循环动力学数据空白，并将其拟合于1∶1结合模型，并表明KD为31.5pM。PD-1 PD-L1阻断生物测定(Promega)表明与Fc铰链与黏合素之间的(G4S)4(SEQ ID NO：197)接头的V.2形式具有相同的活性。
实施例24：(图25)
将具有4个抗人PD-L1黏合素的人IgG1 Fc融合体在Fc的N或C端融合。AVA04-251AG.3、AVA04-251 BS形式从Expi293F细胞中产生，并使用mabselect sure树脂进行纯化。然后，如图5A中所述进行制备型SEC。在PD-1 PD-L1阻断生物测定(Promega)中，两种形式均显示对于PD-L1与PD-1结合的阻断。减去Biacore单循环期动力学数据空白，并将其拟合于1∶1结合模型，显示AVA04-251 AG.3和AVA04-251 BS的KD分别为36.2pM和25.7pM。
实施例25：(图26)
进行PD-L1结合结构域(14KDa)与Fc融合体AVA04-251 V.2或AVA04-236 V(82kDa)的交联质谱以对非共价结合复合物进行分析。使用专门开发的交联混合物将黏合素Fc融合体与过量的人PD-L1结构域混合(Bich，C et al.Anal.Chem.，2010，82(1)，pp 172-179)。将溶液在+4℃下混合并保持过夜。高质量检测系统在0至1500kDa的高质量范围内表征相互作用。线性模式和阳性模式二者的MS参数，离子源1：20kV离子源2：17kV。其中透镜12kVPulse，离子提取400nsHM4，增益电压：3.14kV以及加速电压为20kV。使用高质量MALDI质谱和化学交联检测单独的AVA04-Fc融合蛋白，结合一个PD-L1(+14kDa)和两个PD-L1(+28kDa)蛋白的物质确定化学计量为1∶1和2∶1的物质的存在。
实施例28：食蟹猴交叉反应性(图27和28)
使用如图4中所述进行的Biacore示例了AVA04-251 V.2和CG形式的交叉反应性(图27)。与人和食蟹猴PD-L1 Fc抗原(R&D Systems)的亲和力在2倍之内，为26至47pM。
通过ELISA进行的多种_V.2格式化的黏合素的交叉反应性(图28)。所有受试的格式化黏合素均以0.085至0.375nM的EC50与食蟹猴PD-L1结合。类似于最佳格式化的黏合素，在EC50＝0.044nM处检出基准抗体。
简单地说，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评价交叉反应性。将食蟹猴PD-L1His标签(Sino Biological)以2ug/ml包被在板上。将板用板洗涤器用150ul的洗涤缓冲液(PBS，吐温200.1％)洗涤2次，并在室温(25±1℃)下用PBS中的Casein 5％(Sigma)饱和90分钟。将板如前所述进行洗涤。然后将黏合素和对照(阿特珠单抗和空白)一式两份进行稀释，并在室温(25±1℃)下孵育90分钟。将板如前所述洗涤3次。然后将多克隆抗体HRP抗hu Fc(Abcam)在稀释缓冲液中进行稀释，并在室温(25±1℃)下孵育90分钟。将板如前所述洗涤3次，并向板中添加底物(TMB，Pierce Thermo-Scientific)，持续10分钟。使用酸性溶液终止反应，并在450至630nm下读取板。然后使用插值非线性四参数标准曲线计算EC 50。
实施例29：混合的淋巴细胞反应(图29A和29B)
在MLR测定中测试hFcl格式化的黏合素(图29A)。简单地说，从培养7天的CD14+单核细胞制备来源于单核细胞的树突细胞(dendritic cell，DC)。在第7天使用未成熟的DC，并将其与同种异体T细胞(阴性分离)和参考物质或载剂对照一起培养。将细胞培养4天，并在培养期结束时通过ELISA在上清液中测量IFN-γ。数据表示为平均值+/-S.E.M.pg/ml(左)或相对于载剂对照归一化(右)，(n＝6)。**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001，使用双因素ANOVA和Dunnett事后检验(Dunnett’s post-test)，将受试物质与相应浓度的SQTGly V.2对照进行比较。虚线表示平均载剂(RPMI-10)值。AVA04-251_V.2确实以与基准抗体(阿维单抗)相当的方式使IFNγ的水平提高＞2倍。
在如先前所述的MLR测定中测试XT格式化的黏合素(图29A)，AVA04-251 XT14和XT16作为ILF形式确实提高了IFNγ的水平(图29B)。
实施例30：对PBMC进行的葡萄球菌肠毒素B刺激(图30)
在测定开始时，将来自健康人供体(N＝5)的PBMC与以低浓度(10和100nM)的AVA04-251_V.2或对照抗体一起与固定浓度的葡萄球菌肠毒素B(staphylococcalenterotoxin B，SEB；Toxin Technology)培养96小时。通过HTRF分析(Cisbio)测量培养上清液中的IL-2水平，并将其与不含受试项(单独的SEB)的基础水平进行比较。AVA04-251_V.2以剂量依赖性方式提高白介素2(IL-2)的产生。
实施例31：AVA04-251 Fc在带有原位MDA-MB-231肿瘤细胞的人源化NOG小鼠中的组织分布(图32A)
通过IV途径以10mg/kg(500μCi/kg)用125I-AVA04 Fc或125I-阿维单抗对小鼠(5只/组)进行注射。在8小时或96小时时处死小鼠，并且将器官移出并称重。使用RIASTARA5410(Packard)测量生物样品中包含的总放射性。将每个器官的结果均表示为初始剂量的百分比(ID％)。血浆相对于肿瘤的比率(图32B)显示肿瘤中的蓄积在96小时之后是血浆中水平的≥5倍，并且与阿维单抗相等。
实施例32：在C57/Bl6小鼠同基因模型中的人源化PD-L1 MC38中用AVA04-251_V.2处理之后的肿瘤生长抑制(图33A至33D)
将小鼠(n＝8)用人源化PD-L1 MC38肿瘤细胞系(其具有被hPD-L1替代的小鼠PD-L1胞外部分)在右胁腹区域中进行皮下接种。一旦肿瘤≥80mm3，则注射产品和对照。以10mg/kg(AVA04-251_V.2及其对照SQT_V.2)或5mg/kg(对照抗体阿特珠单抗和同种型对照)的剂量每周2次给予处理，持续3周。总体而言，两种处理均显示出肿瘤生长抑制(图33A)。与对照相比，用AVA04-251_V.2处理的所有小鼠具有减小的肿瘤尺寸(图33B)。在1500mm3处的存活曲线显示，在随机化之后22天，50％的经AVA04-25_V.2注射的小鼠仍然存活(图33C)。同样，对照抗体(阿特珠单抗)的存活曲线(图33D)显示在D22时50％的小鼠存活。
实施例33：在NCG小鼠中进行的皮下A375人黑素瘤人源化模型的处理中之体内效力研究中，用AVA04-251_V.2处理的组中的肿瘤生长抑制(图34A至34D)。
从两名健康供体中分离PBMC。分离总T细胞，并将其在补充有IL-2的完全培养基中在A375细胞上扩增两轮，持续7至10天。将小鼠(n＝10)用0.2ml PBS中的A375肿瘤细胞和活化的T细胞在右胁腹区域进行皮下接种以用于肿瘤发生。在细胞接种之后1小时开始处理。一周2次给予AVA04-251_V.2，持续3周。总体而言，当与对照相比时，两种处理均显示出肿瘤生长抑制(图34A)。与对照相比，用AVA04-251_V.2处理的小鼠中多于70％具有减小的肿瘤尺寸(图34B)。在800mm3处的存活曲线显示，在随机化之后的32天之后用AVA04-25_V.2处理的所有小鼠达到800mm3，这样的情况对于对照组为24天(图33C)。同样，对照抗体(阿特珠单抗)的存活曲线(图34D)显示，在随机化之后的32天之后用对照抗体处理的组中所有小鼠均同样地达到800mm3的肿瘤尺寸。
实施例34：小鼠替代物AVA04-182 V.2在小鼠同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)测定中的活性
拮抗小鼠PD-L1的小鼠替代物黏合素AVA04-182 V.2表明了使用从C57/Black6小鼠制备的骨髓树突细胞(bone marrow dendritic cell，BMDC)的作用机制。收获BMDC并将其与从Balb/C小鼠的脾中分离的CD4+T细胞混合。将BMDC和CD4+T细胞与70nM的阿维单抗和同种型对照mAb以及7、70和700nM的AVA04-182 V.2和SQT Gly V.2的受试分子中的每一种共培养4天。通过ELISA测量上清液中小鼠IFN-γ(图35A)和IL-2(图35B)水平。
实施例35：使用拮抗小鼠PD-L1的小鼠替代物黏合素AVA04-182 V.2进行的肿瘤生长抑制。使用AVA04-182 V.2和阿维单抗的体内MB49小鼠膀胱癌同基因模型(图36A至36B)。
将MB49肿瘤细胞系皮下接种在小鼠的右胁腹中。当肿瘤达到50mm3时开始处理，并通过IP途径每两周一次施用，持续3周(n＝10)。受试分子是同种型mab对照hIgG1(10mg/kg)、黏合素对照SQT-Gly V.2(10和20mg/kg)、小鼠PD-L1拮抗剂AVA04-182 V.2(10和20mg/kg)、阿维单抗(10mg/kg)以及载剂对照(PBS)。在实验过程中测量并绘制肿瘤的生长曲线(图36A)。显示，与载剂和统计学上显著的黏合素对照(SQT-GlyV.2)相比，AVA04-182 V.2能够在10和20mg/kg二者处显著降低肿瘤生长速率(图36B)。
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Claims (71)

1.包含PD-L1结合黏合素多肽序列的蛋白质，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10- 6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制与其结合的PD-L1与PD-1的相互作用。
2.权利要求1所述的蛋白质，其中所述PD-L1结合黏合素多肽具有通式(I)所示氨基酸序列
FR1-(Xaa)n-FR2-(Xaa)m-FR3(I)，
其中：
FR1是MIPGGLSEAK PATPEIQEIV DKVKPQLEEK TNETYGKLEA VQYKTQVLA(SEQ ID NO：1)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；
FR2是GTNYYIKVRA GDNKYMHLKV FKSL(SEQ ID NO：2)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；
FR3是EDLVLTGYQV DKNKDDELTG F(SEQ ID NO：3)所示多肽序列或与其具有至少70％同源性的多肽序列；并且
Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基；并且
n和m各自独立地是3至20的整数。
3.权利要求2所述的蛋白质，其中所述PD-L1结合黏合素多肽具有以下通式所示氨基酸序列：
MIP-Xaa1-GLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-Xaa2-TNYYIKVRAGDNKYMHLKVF-Xaa3-Xaa4-Xaa5-(Xaa)m-Xaa6-D-Xaa7-VLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQID NO：4)
其中：
Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基；
n和m各自独立地是3至20的整数；
Xaa1是Gly、Ala、Val、Arg、Lys、Asp或Glu；
Xaa2是Gly、Ala、Val、Ser或Thr；
Xaa3是Arg、Lys、Asn、Gln、Ser、Thr；
Xaa4是Gly、Ala、Val、Ser或Thr；
Xaa5是Ala、Val、Ile、Leu、Gly或Pro；
Xaa6是Gly、Ala、Val、Asp或Glu；并且
Xaa7是Ala、Val、Ile、Leu、Arg或Lys。
4.权利要求2所述的蛋白质，其中所述PD-L1结合黏合素多肽具有以下通式所示氨基酸序列：
MIPRGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVLA-(Xaa)n-STNYYIKVRAGDNKYMHLKVFNGP-(Xaa)m-ADRVLTGYQVDKNKDDELTGF(SEQ ID NO：5)
其中：
Xaa每次出现时单独地是氨基酸残基；并且
n和m各自独立地是3至20的整数。
5.权利要求2、3或4所述的蛋白质，其中(Xaa)n是通式(II)所示氨基酸序列
-aa1-aa2-aa3-Gly-Pro-aa4-aa5-Trp-aa6-(II)，
其中：
aa1表示具有碱性侧链的氨基酸残基；
aa2表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选具有小的脂肪族侧链、中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基；
aa3表示具有芳香族或碱性侧链的氨基酸残基；
aa4表示具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链，优选中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基；
aa5表示具有中性极性或带电荷(酸性或碱性)或小的脂肪族或芳香族侧链，优选中性极性侧链或带电荷侧链的氨基酸残基；并且
aa6表示具有芳香族或酸性侧链的氨基酸残基。
6.权利要求2、3或4所述的蛋白质，其中(Xaa)n是通式(III)所示氨基酸序列
-aa1-aa2-aa3-Phe-Pro-aa4-aa5-Phe-Trp-(III)，
其中：
aa1表示具有碱性侧链或芳香族侧链的氨基酸残基；
aa2表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选具有小的脂肪族侧链、中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基；
aa3表示具有芳香族或碱性侧链的氨基酸残基，优选Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg或His，更优选Phe、Tyr、Trp或His，并且甚至更优选Tyr、Trp或His；
aa4表示具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链，优选中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基，更优选Ala、Pro、Ile、Gln、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His，并且甚至更优选Gln、Lys、Arg、His、Asp或Glu；并且
aa5表示具有中性极性或带电荷(酸性或碱性)或小的脂肪族或芳香族侧链，优选中性极性侧链或带电荷侧链的氨基酸残基，更优选Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg或His，并且甚至更优选Ser、Asn、Gln、Asp、Glu或Arg。
7.权利要求2、3或4中任一项所述的蛋白质，其中(Xaa)n是选自SEQ ID NO：6至41的氨基酸序列，或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
8.权利要求2、3或4中任一项所述的蛋白质，其中(Xaa)n是选自SEQ ID NO：6至41的氨基酸序列，或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
9.权利要求2至8中任一项所述的蛋白质，其中(Xaa)m是通式(IV)所示氨基酸序列
-aa7-aa8-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-(IV)，
其中：
aa7表示具有中性极性或非极性侧链或者酸性侧链的氨基酸残基；
aa8表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或者芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基；
aa9表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或者芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有中性极性侧链或酸性侧链的氨基酸残基；
aa10表示氨基酸残基，优选具有中性极性或非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链或者芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基；
aa11表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有中性极性侧链或者碱性或酸性侧链的氨基酸残基；
aa12表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有酸性侧链的氨基酸残基；
aa13表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链或非极性脂肪族侧链或芳香族侧链的氨基酸残基，更优选具有酸性侧链的氨基酸残基；
aa14表示氨基酸残基，优选具有中性极性侧链或带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基；并且
aa15表示氨基酸残基，优选具有中性极性或中性非极性侧链或者带电荷(酸性或碱性)侧链的氨基酸残基。
10.权利要求2至8中任一项所述的蛋白质，其中(Xaa)m是选自SEQ ID NO：42至77的氨基酸序列，或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。
11.权利要求2至8中任一项所述的蛋白质，其中(Xaa)m是选自SEQ ID NO：42至77的氨基酸序列，或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
12.前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述PD-L1结合黏合素多肽具有选自SEQ ID NO：78至86的氨基酸序列，或与其具有至少70％同源性的氨基酸序列。
13.前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述PD-L1结合黏合素多肽具有选自SEQ ID NO：78至86的氨基酸序列，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
14.前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述PD-L1结合黏合素多肽具有可由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸具有与SEQ ID NO：87至94之一的第1至336位核苷酸相对应的编码序列，或与其具有至少70％同一性的编码序列。
15.前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述PD-L1结合黏合素多肽具有可由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸包含在45℃下6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)随后在65℃下0.2×SSC中洗涤的严格条件下与SEQ ID NO：87至94中的任一种杂交的编码序列。
16.前述权利要求中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质与PD-L1之间的结合结合与抗PD-L1抗体阿特珠单抗、阿维单抗和/或度伐单抗与PD-L1之间的结合相竞争。
17.前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述PD-L1结合黏合素多肽与PD-L1形成晶体结构，所述晶体结构包含涉及选自以下的至少10个PD-L1残基的接合面：Ile-54、Tyr-56、Glu-58、Glu-60、Asp-61、Lys-62、Asn-63、Gln 66、Val-68、Val-76、Val-111、Arg-113、Met-115、Ile-116、Ser-117、Gly-120、Ala-121、Asp-122、Tyr-123和Arg-125。
18.前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其与PD-L1的结合(a)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，提高T细胞增殖；(b)在MLR测定中，提高干扰素γ的产生；和/或(c)在MLR测定中，提高白介素2(IL-2)的分泌。
19.前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其是包含选自以下的一种或更多种另外的氨基酸序列的融合蛋白：分泌信号序列、肽接头序列、亲和标签、跨膜结构域、细胞表面保留序列、用于翻译后修饰的底物识别序列、用于产生通过蛋白质-蛋白质相互作用而聚集的蛋白质的多聚体结构的多聚化结构域、半衰期延长多肽部分、用于改变抗体的组织定位和抗原结合位点的多肽序列，以及结合PD-L1或不同靶标的一个或更多个另外的黏合素多肽序列。
20.权利要求19所述的蛋白质，其是包含选自以下的半衰期延长多肽部分的融合蛋白：Fc结构域或其部分、白蛋白或其部分、白蛋白结合多肽部分、运铁蛋白或其部分、运铁蛋白结合多肽部分、纤连蛋白或其部分，或者纤连蛋白结合多肽部分。
21.权利要求20所述的蛋白质，其中所述Fc结构域或其部分保留FcRn结合。
22.权利要求20所述的蛋白质，其中所述Fc结构域或其部分来自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。
23.权利要求20所述的蛋白质，其中所述Fc结构域或其部分保留选自以下的效应子功能：C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；B细胞受体的下调，或其组合。
24.权利要求20所述的蛋白质，其中所述半衰期延长多肽部分相对于其不存在于所述蛋白质中的情况而言使所述蛋白质的血清半衰期提高到至少5倍。
25.权利要求22所述的蛋白质，其包含SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：113的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性的序列。
26.重组抗体，其包含形成与靶抗原结合的一个或更多个抗原结合位点的一个或更多个VH和/或VL链，其中所述VH和/或VL链中的至少一个是还包含至少一个PD-L1结合黏合素多肽序列的融合蛋白，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd结合PD-L1并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用。
27.权利要求26所述的重组抗体，其中所述VH链包含Fc结构域。
28.权利要求26所述的重组抗体，其中所述靶抗原是免疫检查点。
29.权利要求26所述的重组抗体，其中所述靶抗原是免疫共刺激受体，并且所述嵌合抗体在结合之后激动所述共刺激受体。
30.权利要求26所述的重组抗体，其中所述靶抗原是血管生成因子或其受体，并且所述嵌合抗体拮抗所述血管生成因子或其受体。
31.权利要求26所述的重组抗体，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
32.权利要求26所述的重组抗体，其中所述靶抗原是可溶性免疫抑制因子或其受体，并且所述嵌合抗体抑制所述免疫抑制因子的免疫抑制活性以充当免疫刺激信号。
33.权利要求26所述的重组抗体，其中所述靶抗原选自：PD-1、PD-L2、CTLA-4、NKG2A、KIR、LAG-3、TIM-3、CD96、VISTA、TIGIT、CD28、ICOS、CD137、OX40、GITR、CD27、CD30、HVEM、DNAM-1或CD28H、CEACAM-1、CEACAM-5、BTLA、LAIR1、CD160、2B4、TGFR、B7-H3、B7-H4、CD40、CD4OL、CD47、CD70、CD80、CD86、CD94、CD137、CD137L、CD226、半乳凝素-9、GITRL、HHLA2、ICOS、ICOSL、LIGHT、MHC I类或II类、NKG2a、NKG2d、OX4OL、PVR、
Figure FPA0000294876730000071
TCR、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、VEGF、VEGF受体、EGFR、Her2/neu、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT6、ILT7、ILT8、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKG2C、NKG2E或TSLP。
34.重组黏合素-伊匹单抗抗体融合蛋白，其包含：
(i)具有SEQ ID NO：112的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性的序列的黏合素-重链融合蛋白(其中分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)任选地被去除)，以及
(ii)具有SEQ ID NO：113的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性的序列的轻链蛋白(其中分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)任选地被去除)。
35.重组黏合素-贝伐单抗抗体融合蛋白，其包含：
(i)具有SEQ ID NO：116或118的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性的序列的黏合素-重链融合蛋白(其中分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)任选地被去除)，以及
(ii)具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性的序列的轻链蛋白(其中分泌信号序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO：136)任选地被去除)。
36.重组受体陷阱融合蛋白，其包含(i)受体的配体结合结构域，以及(ii)PD-L1结合黏合素多肽序列，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用。
37.权利要求36所述的重组受体陷阱融合蛋白，其中所述结合结构域与以下结合：PGE2、TGF-β、VEGF、CCL2、IDO、CSF1、IL-10、IL-13、IL-23或腺苷。
38.权利要求36所述的重组受体陷阱融合蛋白，其还包含诱导所述重组受体陷阱融合蛋白的多聚化的多聚化结构域。
39.重组受体配体融合蛋白，其包含(i)多肽配体序列，所述多肽配体序列结合并激动或拮抗其对应受体，以及(ii)PD-L1结合黏合素多肽序列，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用。
40.权利要求39所述的重组受体配体融合蛋白，其中所述多肽配体是共刺激受体的配体，并且在结合之后激动所述共刺激受体。
41.权利要求40所述的重组受体配体融合蛋白，其中所述多肽配体选自：B7.1、4-1BBL、OX40L、GITRL或LIGHT。
42.权利要求39所述的重组受体配体融合蛋白，其还包含诱导所述重组受体配体融合蛋白的多聚化的多聚化结构域。
43.权利要求39所述的重组受体配体融合蛋白，其中所述多肽配体是促进抗肿瘤免疫的免疫刺激细胞因子。
44.权利要求43所述的重组受体配体融合蛋白，其中所述多肽配体选自：IFN-α2、IL-2、IL-15、IL-21和IL-12。
45.多特异性T细胞接合融合蛋白，其包含(i)与T细胞表面上的CD3结合的CD3结合多肽，以及(ii)PD-L1结合黏合素多肽序列，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用。
46.嵌合受体融合蛋白，其包含(i)包含PD-L1结合黏合素多肽序列的胞外部分，所述PD-L1结合黏合素多肽序列以1×10-6M或更小的Kd与PD-L1结合并且抑制PD-1与其所结合的PD-L1的相互作用；(ii)跨膜结构域；以及(c)包含4-1BB信号传导结构域和CD3ε信号传导结构域以及任选的共刺激信号传导区的胞质结构域。
47.核酸，其包含编码权利要求1至46中任一项所述的蛋白质的编码序列。
48.权利要求47所述的核酸，其中所述编码序列与一个或更多个转录调节序列例如启动子和/或增强子可操作地连接。
49.权利要求47所述的核酸，其包含一个或更多个复制起点、微型染色体维持元件(MME)和/或核定位元件。
50.权利要求47所述的核酸，其包含与所述编码序列可操作地连接并一起转录的多腺苷酸化信号序列。
51.权利要求47所述的核酸，其中所述编码序列包含一个或更多个内含子序列。
52.权利要求47所述的核酸，其包含与所述编码序列一起转录的一个或更多个核糖体结合位点。
53.权利要求47所述的核酸，其是DNA。
54.权利要求47所述的核酸，其是RNA。
55.病毒载体，其包含权利要求47所述的核酸。
56.质粒DNA、质粒载体或微环，其包含权利要求47所述的核酸。
57.抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段还包含与所述抗体或其抗原结合片段缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
58.可溶性受体或其配体结合结构域，所述可溶性受体或其配体结合结构域还包含与所述可溶性受体或其配体结合结构域缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
59.生长因子、细胞因子或趋化因子其生物活性多肽片段，所述生长因子、细胞因子或趋化因子其生物活性多肽片段还包含与所述生长因子、细胞因子或趋化因子其生物活性多肽片段缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
60.共刺激激动剂多肽，其还包含与其缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
61.检查点抑制性多肽，其还包含与其缀合的PD-L1结合黏合素多肽。
62.黏合素剂，其包含PD-L1结合黏合素多肽，以及与所述PD-L1结合黏合素多肽缀合的可检测标记、毒素或者一种或更多种治疗剂。
63.适用于人患者中之治疗用途的药物制剂，其包含(i)权利要求1至25中任一项所述的重组蛋白，权利要求26至35中任一项所述的重组抗体，权利要求36至38中任一项所述的重组受体陷阱融合蛋白，权利要求39至44中任一项所述的重组受体配体融合物，权利要求45所述的多特异性T细胞接合融合蛋白，权利要求46所述的嵌合受体融合蛋白，权利要求57所述的抗体，权利要求58所述的可溶性受体，权利要求59所述的生长因子、细胞因子或趋化因子，权利要求60所述的共刺激激动剂多肽，权利要求61所述的检查点抑制性多肽或权利要求62所述的黏合素剂，以及(ii)一种或更多种可药用赋形剂、缓冲剂、盐等。
64.适用于在人患者中进行治疗性基因递送的药物制剂，其包含权利要求47至54中任一项所述的核酸，权利要求55所述的病毒载体或者权利要求56所述的质粒DNA、质粒载体或微环，以及(ii)一种或更多种可药用赋形剂、缓冲剂、盐、转染增强剂、电穿孔增强剂等。
65.包括向对象施用前述权利要求中任一项所述的蛋白质、重组抗体或核酸的方法。
66.权利要求65所述的方法，其中所述对象包含表达PD-L1的癌细胞，任选地其中所述癌细胞是黑素瘤细胞。
67.权利要求65或66所述的方法，其中以有效量施用所述蛋白质、重组抗体或核酸以引起混合淋巴细胞反应。
68.权利要求67所述的方法，其中以有效量施用所述蛋白质、重组抗体或核酸以将所述对象中T细胞的IFNγ之产生相对于仅载剂对照提高到至少2倍。
69.权利要求66至68中任一项所述的方法，其中所述对象患有包含表达PD-L1的癌细胞的肿瘤，并且所述肿瘤中PD-L1结合黏合素多肽积聚的水平是施用之后96小时时血浆中所述水平的至少5倍。
70.权利要求66至68中任一项所述的方法，其中所述对象患有包含表达PD-L1的癌细胞的肿瘤，并且以有效量施用所述蛋白质、重组抗体或核酸以在所述对象中将所述肿瘤的生长抑制至少10％。
71.权利要求65至70中任一项所述的方法，其中所述对象患有黑素瘤。
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